CN114045296A

CN114045296A - 一种蛋白质及其相关产品和用途

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Publication number: CN114045296A
Application number: CN202111152048.0A
Authority: CN
Inventors: 周鹏; 安渊; 张钰靖; 刘思妍; 徐蕊; 莫鑫
Original assignee: Shanghai Jiaotong University
Current assignee: Shanghai Jiaotong University
Priority date: 2021-09-29
Filing date: 2021-09-29
Publication date: 2022-02-15
Anticipated expiration: 2041-09-29
Also published as: CN114045296B

Abstract

本发明公开了一种蛋白质及其相关产品和用途，所述蛋白质为如下(1)或(2)的蛋白：(1)由如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(2)将如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由(1)衍生的蛋白质。本发明的MsGSTU21蛋白及其相关产品与植物的抗逆性相关，可用于提高植物的抗逆能力，尤其是植物的耐酸、铝性或耐干旱性，能增加植物的经济效益。

Description

一种蛋白质及其相关产品和用途

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，特别是涉及一种蛋白质及其相关产品和用途。

背景技术

紫花苜蓿(Medicago sativa.)是非常重要的饲用草种，为豆科多年生草本植物，具有发达的根茎和匍匐茎，生长速度快、再生能力强、耐热、耐践踏、质地纤细、色泽好，适口性好，蛋白质含量高等优点，作为一种优质的植物性蛋白资源，因其独特的氮素利用方式，与禾谷类作物相比它可以大大提高粗蛋白的产出，是解决奶业发展中蛋白饲料资源短缺的重要途径和有效方法。

谷胱甘肽S-转移酶(Glutathione S-transferases,GSTs,EC2.5.1.18)可催化谷胱甘肽(Glutamyl-cysteinyl-glycine，GSH)转移至含有亲电子中心的底物上，形成极性产物，降低亲电活性，从而起到解毒作用。在植物体内，谷胱甘肽S-转移酶在清除因逆境胁迫产生的氧化损伤中起到重要作用，并参与植物的生长发育、次生代谢物运输和信号转导等调节过程。

谷胱甘肽S-转移酶编码的基因已从多种植物中克隆出来，包括：拟南芥、蒺藜苜蓿、水稻、玉米、大豆等。紫花苜蓿中报道了MsGSTU8，被证明可提高植物耐盐的功能。但在紫花苜蓿中可提高植物耐铝、耐旱能力的GSTs基因，尚未见到相关报道。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种蛋白质及其相关产品和用途，进而解决现有技术中的问题。

本发明的目的之一在于提供一种蛋白质，所述蛋白质为如下(1)或(2)的蛋白：

(1)由如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(2)将如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由(1)衍生的蛋白质。

本发明的目的之二在于提供一种多核苷酸，所述多核苷酸编码如上述所述的蛋白质。

根据本申请的技术方案，所述多核苷酸的序列包括如SEQ ID NO：1所示序列。

本发明的目的之三在于提供一种重组表达载体，所述重组表达载体含有上述所述的多核苷酸。

本发明的目的之四在于提供一种生物工程菌，所述生物工程菌含有如上述所述的重组表达载体或其基因组内整合有如上述所述的多核苷酸。

本发明的目的之五在于提供如上述所述的蛋白质或上述所述的多核苷酸或上述所述的重组表达载体或者上述所述的生物工程菌在培育抗逆性植物中的用途。

根据本申请的技术方案，所述抗逆性包括耐酸性、耐铝性或耐干旱性中的一种或多种。

本发明的目的之六在于提供一种用于检测如上述所述的多核苷酸的探针，所述探针的核苷酸序列包括如SEQ IDNO：3所示序列。

本发明的目的之七在于提供一种提高植物抗逆能力的方法，包括如下步骤：

(a)将如上述所述的多核苷酸导入植物；

或，(b)将上述所述的重组表达载体导入植物。

根据本申请的技术方案，所述步骤(b)包括如下步骤：

将上述所述的重组表达载体转化于农杆菌；

将含有所述重组表达载体的农杆菌转化于所述植物。

根据本申请的技术方案，上述所述的用途或上述所述的方法中，所述植物包括双子叶植物或单子叶植物。

较佳的，所述双子叶植物包括拟南芥和紫花苜宿。

本发明具有以下有益效果：

本发明从紫花苜蓿中获得一个对酸、铝强响应的基因MsGSTU21，该基因与拟南芥谷胱甘肽S-转移酶(AT3G09270)基因具有较高的同源性，将该基因导入模式植物拟南芥中获得转基因拟南芥，经酸、铝胁迫实验证明，该转基因拟南芥具有明显的耐酸、耐铝的能力；经干旱胁迫实验证明，该转基因拟南芥具有明显的耐干旱能力。因此，MsGSTU21蛋白及其相关产品与植物的抗逆能力相关，可用于提高植物的抗逆能力，尤其是植物的耐酸性、耐铝性或耐干旱性，能增加植物的经济效益。

附图说明

图1显示为本发明实施例1中的紫花苜蓿“WL-525HQ”在酸、铝胁迫下得到的cRNA与探针杂交后，探针的表达量变化图。

图2显示为本发明实施例3中的紫花苜蓿“WL-525HQ”MsGSTU21基因与拟南芥(AT3G09270)基因的核苷酸序列的同源比较结果图。

图3显示为本发明实施例3中的紫花苜蓿“WL-525HQ”MsGSTU21蛋白与拟南芥(AT3G09270)蛋白的氨基酸序列的同源比较结果图。

图4显示为本发明实施例4中的转化载体PHB-MsGSTU21转化于农杆菌后的单克隆菌落的PCR产物的电泳图。

图5显示为本发明实施例5中的野生型拟南芥和转基因MsGSTU21拟南芥在酸、铝胁迫下的表型观察结果图。

图6显示为本发明实施例5中的野生型拟南芥和转基因MsGSTU21拟南芥在酸、铝胁迫下的根长长度图。

图7显示为本发明实施例5中的野生型拟南芥与转基因MsGSTU21拟南芥在干旱胁迫下的表型观察图。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；theseries METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS INENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。

本发明实施例的目的在于填补紫花苜蓿“WL-525HQ”MsGSTU21基因的克隆、表达模式分析以及基因的功能分析的空白。

本发明的第一方面，提供了一种蛋白质，所述蛋白质为如下(1)或(2)的蛋白：(1)由如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(2)将如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由(1)衍生的蛋白质。

SEQ ID NO：2所示序列具体为：

MATNQEHVKLLGATGSPFVCRVQIALKLKGIEYEFVEENLATKSEQLLKYNPVHKKVPVFVHNEKPISESLVILEYIDEVWKQNPILPSDPHQRALARFWSKFIDDKIVSASFKSVFSLDEKEREKNIEEATEALHFLENELKDKYFGGEEFNFVDIAAVFVAFWVPLVQDITELQLFTAEKFPKLYNWSQEFLDHPIVKETLPPREPLFAFFKGRYESLLAASK。

本发明第二方面，还提供了一种多核苷酸，所述多核苷酸编码如第一方面所述的蛋白质。本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。在本发明的一个具体实施例中，所述多核苷酸的序列包括如SEQ ID NO：1所示序列。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO:1中的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO:2所示序列的蛋白，但与SEQ ID NO:1中的编码区序列有差别的核酸序列。在本发明的一个具体实施例中，所述多核苷酸从紫花苜蓿“WL-525HQ”的组织中提取出来。所述多核苷酸具体为MsGSTU21基因。

SEQ ID NO：1所示序列具体为：

ATGGCTACAAATCAAGAACATGTGAAACTTTTGGGAGCTACAGGAAGCCCATTTGTTTGCAGGGTACAGATTGCTCTAAAGTTGAAGGGAATTGAATATGAATTTGTTGAAGAAAATTTAGCCACCAAGAGTGAACAACTTCTCAAATATAATCCAGTTCATAAGAAGGTTCCAGTTTTTGTTCACAATGAGAAGCCTATATCAGAATCCCTTGTGATTCTTGAGTACATTGATGAGGTTTGGAAGCAAAACCCTATTTTGCCTTCTGATCCACACCAAAGAGCCTTGGCCCGATTTTGGTCGAAATTCATCGATGACAAGATTGTGTCCGCGTCATTTAAATCTGTTTTTTCGCTTGATGAGAAAGAGCGTGAGAAGAATATTGAAGAAGCAACCGAGGCTCTTCACTTTCTTGAGAATGAGCTGAAGGACAAGTACTTTGGAGGAGAAGAGTTTAACTTTGTCGATATTGCTGCTGTTTTCGTAGCATTTTGGGTCCCTCTAGTTCAAGACATTACCGAGCTGCAATTGTTCACTGCTGAAAAGTTTCCAAAGCTTTACAATTGGAGTCAAGAATTTCTTGACCATCCTATTGTGAAAGAAACTCTTCCTCCAAGAGAGCCTCTTTTCGCCTTTTTTAAAGGTCGTTATGAAAGCCTTCTTGCTGCTTCAAAGTAG。

本发明通过在酸、铝胁迫下，对紫花苜蓿基因进行分析，获得一种对酸、铝强响应的基因，具体为MsGSTU21基因。MsGSTU21基因与拟南芥谷胱甘肽S-转移酶(AT3G09270)的基因相似性极高，表明该基因编码谷胱甘肽S-转移酶。转化拟南芥的实验结果证明，该基因能提高拟南芥的耐酸、铝或耐干旱的能力，由此显示了该基因在紫花苜蓿“WL-525HQ”的耐酸、铝胁迫或耐干旱胁迫的过程中起到了重要的作用。

在本发明中，紫花苜蓿“WL-525HQ”的MsGSTU21基因的多核苷酸全长序列或其片段可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明的实施例记载的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

此外，可以根据本发明实施例记载的紫花苜蓿“WL-525HQ”的MsGSTU21核苷酸序列，在核酸同源性的基础上，筛选紫花苜蓿“WL-525HQ”的MsGSTU21相关同源基因。

当获得了有关序列后，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

在本发明一个具体实施例中，所述SEQ ID NO：1所示的多核苷酸通过包括如下步骤的方法获得：以紫花苜蓿的cDNA为模板进行PCR扩增，所述PCR扩增的上游引物如序列SEQID NO：4所示，具体为：5'-ATGGCTACAAATCAAGAACATGTGA-3'；所述PCR扩增的下游引物如序列SEQ ID NO：5所示，具体为5'-CTACTTTGAAGCAGCAAGAAG-3'。

在本发明一个具体实施例中，可以用探针与MsGSTU21的cRNA的PCR产物进行杂交，然后分析组织中基因的差异表达分析。在本发明的一个具体实施例中，提供了苜蓿基因芯片(Medicago基因表达4×44K；安捷伦，圣克拉拉，加利福尼亚州，美国；http://www.genomics.agilent.com)的探针信息(探针编号：A_27_P104331，EST序列编号：TC178077)，TC178077的序列信息SEQ ID NO：3所示序列。

SEQ ID NO：3所示序列具体为：

GGCACGAGGCAAAGTCATAGAAAATTTAAGTGTTGCAATGGCTACAAATCAGGAACATGTGAAACTTTTGGGAGCTACTGGAAGCCCATTTGTGTGCAGGGTACAGATTGCTCTAAAGTTGAAGGGAATTGAATATGAATTTCTTGAAGAAAATTTGGCCACAAAGAGTGAACTTCTTCTTAAATATAATCCAGTTCATAAGAAGGTTCCAGTTTTTGTTCACAATGATAAGCCCATTTCAGAATCTCTTGTGATTCTTGAGTACATTGATGAGGTTTGGAAGCAAAACCCCATTTTGCCAACTGATCCACACCAAAGAGCCTTGGCTCGATTTTGGTCGAAATTCATCGATGACAAGATTGTGTCCGCATCATCCAAATCCGTTTTTACACTTGATGAGAAAGAGCGCGAGAAGAATGTCGAAGAAACAACTGAGGCTCTTCAGTTTCTTCAGAATGAGCTGAAGGGTAAGTACTTTGGAGGAGAAGAGTTTAACTTTGTGGATATTGCTGCTGTTTTCGTAGCATTCTGGATCCCTCTAGTTCAAGACATAATAGGGTTGCAATTGTTCACAGCTGAAAAGTTTCCAAAGCTTTACAATTGGAGTCAAGAATTTCTTGACCATCCTGTTGTGAAGGAAACTATTCCTCCAAGAGAGCCTCTTTTCGCCTTTTTTAAAGGTCGCTATGAGAGCCTTCTTGCTGCTTCAAAATAGATCAATGTACTGCTGATATAGAATATCGAGAGTCAGAATTTTATGTTTATGAATTCTTATCTGTTATTGAGTTCTTGTTGTTAGGATTTCATTTCTGAATAATATTTTATAATGTGAGATTTCTCCATGTGAAATCTAAGGATATTGTTGTCATAGCTCTGATTTTGCAATGCTTGTAATCAACTTTTGTTTCGGATAACAAAGATATGTAAATTCTTTTGTAATCTGATTTTTTATC。

需要说明的是，在本发明实施例中，“多核苷酸”可以是指，该多核苷酸已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，也可以指该多核苷酸已经与天然状态下伴随核酸的组分分开，而且已经与在细胞中相伴随的蛋白质分开。

本发明第三方面，提供了一种重组表达载体，包含如第二方面所述的多核苷酸。本发明中，编码所述蛋白的多核苷酸序列可插入到表达载体中形成重组表达载体中。术语“表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。本发明中的表达载体不局限于下述实施例中提到的pMD18-T Simple vector和PHB。本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含抗逆蛋白编码的核苷酸序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

本发明第四方面，提供了一种生物工程菌，所述生物工程菌含有如第三方面所述的重组表达载体或基因组内整合有如第二方面所述的多核苷酸。生物工程菌以使其能够表达蛋白质。生物工程菌可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌；真菌细胞如酵母；植物细胞等。不局限于本申请中所采用的农杆菌GV3101。

用重组DNA技术转化生物工程菌时，可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当生物工程菌为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。转化植物也可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如叶盘法、幼胚转化法等。对于转化的植物细胞、组织或器官可以用常规方法再生成植株，从而获得性状发生改变的植物。

本发明第五方面，提供了如第一方面所述的蛋白质、第二方面所述的多核苷酸、第三方面所述的重组表达载体或者第四方面所述的生物工程菌在培育抗逆性植物中的用途。在本发明的一个具体实施例中，所述抗逆性包括耐酸性、耐铝性或耐干旱性中的一种或多种。

本发明中，对于适用于本发明的植物没有特别的限制，只要其适合进行基因的转化操作既可以。所述的植物不限于双子叶植物或单子叶植物。更具体地，所述植物包括拟南芥和紫花苜宿。在本发明的一个具体实施例中，所述植物优选拟南芥。

本发明六方面，提供了一种提高植物抗逆能力的方法，包括如下步骤：(a)将如第二方面的多核苷酸导入植物，得到转基因植物；或，(b)将第三方面的重组表达载体导入植物，得到转基因植物；然后采用任何适当的常规手段，将含有该基因的植物细胞或组织再培育成植株。在一个具体实施例中，所述步骤(b)包括如下步骤：将所述重组表达载体转化于农杆菌；将含有所述重组表达载体的农杆菌转化所述植物。本发明将第二方面所述的多核苷酸整合至所述植物的基因组中的方法，也可以采用现有技术常用的DNA重组技术实现。

本发明中，培育后的抗逆植物优选进行抗酸胁迫、铝胁迫和抗干旱胁迫能力验证。所述验证方法为：将培育后的抗逆植物自交纯合3代，获得纯合转化株，收获种子；将所述种子播种后，在22℃转化生长二周，得到转基因培养皿小苗；将野生型和转基因培养皿小苗分别进行抗酸、铝胁迫和抗干旱胁迫实验。转基因MsGSTU21拟南芥和野生型植株在表型上有很大的差异。在铝胁迫下的结果显示，在pH值为4.5和1.2mM氯化铝的胁迫下，野生型拟芥南生长明显受到抑制，根系平均长度为5.2cm，叶片稀少，而转基因株系平均根长6.1cm，抑制较小，说明MsGSTU21明显提高了拟南芥的抗铝能力。在干旱胁迫下的结果显示，停止浇水后33天，野生型拟芥南生长明显受到抑制，植株枯萎变黄，而转基因拟南芥的枝叶依然是绿色，生长茂盛，说明MsGSTU21明显提高了拟南芥的抗干旱能力。

紫花苜蓿“WL-525HQ”中编码谷胱甘肽S-转移酶的MsGSTU21基因在拟南芥的铝、酸胁迫或干旱胁迫中的表达量的变化，为今后利用基因工程技术对MsGSTU21基因表达的时空特性进行调控，从而为提高植物耐酸、铝胁迫或耐干旱胁迫能力与育种工作提供了理论依据，具有很大的应用价值。

紫花苜蓿“WL-525HQ”作为常用饲草，应用极为广泛，其市场需求也很大。本发明首次克隆紫花苜蓿“WL-525HQ”在铝胁迫过程中的保护性蛋白MsGSTU21的氨基酸序列，并公开芯片分析法分析MsGSTU21基因的不同酸、铝胁迫下表达模式，为今后利用基因工程技术调控MsGSTU21基因的时空表达，从而为提高饲草抗旱性、新品种选育方面提供了理论依据，具有很大的应用价值。

本发明所用的试验材料及其来源如下：

紫花苜蓿WL-525HQ，国审品种登记号：377。

农杆菌菌株GV3101，购买于唯地公司，货号CAT#:AC1001。

pMD18-T Simple vector载体，TaKaRa，货号CAT#:D101A。

YEP固体培养基的配方为：1wt％蛋白胨、1wt％酵母粉、0.5wt％氯化钠，加水至250mL，调节pH值至7.0。

MS培养基配方为：将0.44g MS粉溶于100mL水中。MS粉购买于索莱宝公司，货号:M8520。

实施例1紫花苜蓿在酸、铝胁迫下的考察

本实施例，对紫花苜蓿在铝胁迫下进行考察研究，包括如下：

1.1材料的获得

将紫花苜蓿“WL-525HQ”的种子，分为四组，分别铺到垫有两层无菌滤纸的平皿中。在1/2Hoagland营养液中加AlCl₃使得终浓度分别为0mM AlCl₃、0mM AlCl₃、0.8mM AlCl₃和3.2mM AlCl₃，同时分别用1M盐酸和1M氢氧化钠调节营养液使得pH分别为6.0、4.5、4.5和4.5，即分别为0mM AlCl₃+pH 6.0、0mM AlCl₃+pH 4.5、0.8mM AlCl₃+pH 4.5和3.2mM AlCl₃+pH 4.5。将四组的种子浸泡在上述不同pH值和不同铝浓度的营养液中萌发60小时，萌发条件为25℃和400μmol/(m²·s)光强，然后获取幼苗作为样品。

将上述样品分别用铝铂纸包好后立刻投入液氮中，接着转入-80℃冰箱中贮存待用。

1.2总RNA的提取

利用RNA prep pure植物总RNA提取(北京全式金)；提取上述样品组织中的总RNA。

用胶浓度为1.2％，电泳缓冲液为0.5×TBE，于150v进行琼脂糖凝胶电泳15min，检测RNA的完整性。电泳条带中最大rRNA亮度应为第二条rRNA亮度的1.5～2.0倍，否则表示rRNA样品的降解；纯度较好的RNA，A260/A280以及A260/A230约为2.0左右，用分光光度计测定OD值并计算RNA含量。

1.3cDNA的获得

以500ng步骤1.2)获得的总RNA为模板，按照宝生物公司TaKaRa PrimeScriptTMRT reagent Kit Perfect Real Time试剂盒的操作说明，进行反转录，获得cDNA备用。

1.4用探针筛选MsGSTU21基因

将步骤1.3)反转录得到的cDNA进一步转录成cRNA，并使用安捷伦低RNA输入荧光线性扩增试剂盒(安捷伦科技公司，美国加利福尼亚州圣克拉拉市)对cRNA进行荧光标记。

然后，0.5μg上述荧光标记后的cRNA样品，与杂交缓冲液混合，并与寡核苷酸微阵列杂交(Medicago基因表达4×44K；安捷伦，圣克拉拉，加利福尼亚州，美国；http://www.genomics.agilent.com)在65℃下持续17小时。寡核苷酸微阵列的设计基于RefSeq(版本32)、UniGene(构建33)、TIGR植物转录物组合(版本2)和TIGR基因指数(版本9)，总共包含43803个寡核苷酸探针(60个片段)，序列如SEQ ID NO：3所示序列。

杂交后，使用基因表达洗涤缓冲试剂盒(安捷伦)清洗前述cRNA和寡核苷酸微阵列杂交后的产物，并使用Genepix 400B(美国加利福尼亚州福斯特市Axon Instruments)扫描。使用特征提取软件9.5版(安捷伦)计算荧光强度，并使用GeneSpring GX软件11.0版(安捷伦)分析数据。整个实验在生物学上重复三次，微阵列数据用GeneSpring GX 11.0标准化。

将铝胁迫下生长的幼苗在特定的统计截止点(倍变化[FC])之间差异超过两倍的转录本≥2.0和P<0.05(根据t检验)被定义为差异表达基因，筛选出具有酸、铝响应的基因。

图1为本实施例中的紫花苜蓿“WL-525HQ”在酸、铝胁迫下得到的cRNA与探针杂交后，探针的表达量变化图。

从图1可知，与对照组相比，当pH值降低时，探针的表达量升高。在相同pH值下，随着铝的浓度增加，基因的表达量适当下降，但是与对照组相比，探针的表达量依然呈显著增加。在酸、铝胁迫下的考察研究，说明了MsGSTU21基因对酸、铝具有强响应。

实施例2紫花苜蓿MsGSTU21基因的克隆

本实施例中，进行紫花苜蓿MsGSTU21基因的克隆，包括如下：

2.1植物材料的获得

取紫花苜蓿“WL-525HQ”的叶片组织，用于提取RNA。

2.2RNA的抽提

用北京全式金生物公司的植物总RNA提取试剂盒抽提总RNA，用甲醛变性胶电泳鉴定RNA的完整性，然后在分光光度计(Thermo Scientific NANODROP1000Spectrophotometer)上测定RNA的纯度及浓度。

2.3基因的全长克隆

根据实施例1中步骤1.4)的紫花苜蓿“WL-525HQ”在酸、铝胁迫下得到的cRNA与寡核苷酸微阵列杂交结果，分离得到的EST序列及蛋白功能注释结果，获得紫花苜蓿“WL-525HQ”MsGSTU21基因片段。蒺藜苜蓿的基因组已经测序，根据两者之间的相似性，直接PCR获得cDNA全长。

将提取的RNA进行反转录(Prime ScriptⅡ1st Strand cDNA Synthesis Kit:宝生物工程大连有限公司)，以第一链cDNA为模板，引物如下：

MsGSTU21-F：5'-ATGGCTACAAATCAAGAACATGTGA-3'(SEQ ID NO：4)

MsGSTU21-R：5'-CTACTTTGAAGCAGCAAGAAG-3'(SEQ ID NO：5)

进行PCR扩增，得到长度为678bp的MsGSTU21基因片段，序列如SEQ ID NO：1所示。

回收MsGSTU21基因片段并连接到pMD18-T Simple vector载体上，然后转化于大肠杆菌DH5α。

用RV-M和M13-47作为通用引物，进行测序，测序结果通过在NCBI网站进行BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)比对已有的数据库(GenBank)。经比较可知，MsGSTU21基因的核酸序列及编码蛋白与已知的拟南芥、蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)的谷胱甘肽S-转移酶的基因同源性很高，可以初步认为扩增得到的MsGSTU21基因是一个编码谷胱甘肽S-转移酶的基因。

MsGSTU21基因和拟南芥(Arabidopsis thaliana)(AT3G09270)基因的核苷酸序列的同源比较结果如图所示。

实施例3紫花苜蓿MsGSTU21基因的序列信息与同源性分析

本实施例，对紫花苜蓿MsGSTU21基因进行序列信息与同源性分析，包括如下：

紫花苜蓿MsGSTU21基因全长开放读码框序列为678bp，详细序列见SEQ ID NO：1所示序列。根据开放读码框序列推导出紫花苜蓿MsGSTU21蛋白的氨基酸序列，共225个氨基酸残基，分子量为26.10kDa，等电点(pI)为5.21，详细序列见SEQ ID NO：2所示序列。

将紫花苜蓿MsGSTU21的开放读码框序列及其编码蛋白的氨基酸序列用BLAST程序在Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundant GenBank CDS translations+PDB+SwissProt+Superdate+PIR数据库中进行核苷酸和蛋白质同源性检索。

图2为本实施例的紫花苜蓿MsGSTU21基因与拟南芥谷胱甘肽S-转移酶基因(AT3G09270)的核苷酸序列的同源比较结果图。

从图2可知，紫花苜蓿MsGSTU21基因与拟南芥谷胱甘肽S-转移酶基因在核苷酸水平上具有64％的相同性。

图3为本实施例的紫花苜蓿MsGSTU21蛋白与拟南芥谷胱甘肽S-转移酶(AT3G09270)的氨基酸序列的同源比较结果图。其中，相同的氨基酸在两个序列之间用氨基酸单字符标出。

从图3可知，在氨基酸水平上，紫花苜蓿MsGSTU21蛋白与拟南芥谷胱甘肽S-转移酶也具有51％的相似性。

从图2和图3可知，紫花苜蓿MsGSTU21与拟南芥谷胱甘肽S-转移酶(AT3G09270)无论从核酸还是蛋白水平上都存在较高的同源性。

实施例4紫花苜蓿MsGSTU21基因转化于模式植物拟南芥

本实施例中，将实施例2得到的MsGSTU21基因转化于模式植物拟南芥中，包括如下：

4.1构建转化载体

根据实施例2得到的MsGSTU21基因分别从起始密码子和终止密码子处设计特异性引物，引物如下：

MsGSTU21-BaF：5′-CGGGATCCATGGCTACAAATCAAGAACATG-3′(SEQ ID NO：6)

MsGSTU21-SpR：5′-GGACTAGTCTTTGAAGCAGCAAGAAGGCTTTC-3′(SEQ ID NO：7)

在基因全长序列两侧分别引入Bam HI与Spe I酶切位点，以实施例1中步骤1.3得到的cDNA为模板进行PCR扩增。

回收PCR扩增产物与经上述Bam HI与Spe I酶双酶酶切后的pMD18-T Simplevector载体相连。挑取单克隆菌斑进行PCR验证。提取阳性克隆菌液质粒，标记为pMD18-TSimple vector-MsGSTU21。

将重组质粒pMD18-T Simple vector-MsGSTU21与PHB载体分别进行Bam HI与SpeI双酶切，回收酶切后的PHB载体与MsGSTU21片段，利用T4连接酶在16℃水浴中将MsGSTU21与PHB载体连接过夜构建转化载体PHB-MsGSTU21，并将载体转化于农杆菌GV3101。

转化后的农杆菌GV3101涂布于含50mg/L卡那霉素和15g/L琼脂粉的YEP固体培养基，培养后，对单克隆进行菌落PCR，挑选阳性单克隆菌落。

图4为本实施例中的转化载体PHB-MsGSTU21转化于农杆菌后的单克隆菌落PCR的电泳图。

从图4可知，目的基因片段大小为500bp，1、4、5和6号菌落呈强阳性，证明转化成功。

4.2将MsGSTU21基因转化于模式植物拟南芥

1)预摇农杆菌

挑上述的阳性单克隆菌落至25mL含有50mg/L卡那霉素、50mg/L庆大霉素、25mg/L利福平的YEP液体培养基中，于28℃和200rpm摇菌24h，获得农杆菌菌液。

2)扩培农杆菌

将上述预摇的农杆菌菌液以体积比为1:100扩培至400mL含有50mg/L卡那霉素的YEP液体培养基中，于28℃和200rpm培养13-16h，培养至吸光度OD600达到1.5-2.0之间，于23℃、5000rpm和8min收菌。

3)转化于模式植物拟南芥中

配制500mL含5wt％蔗糖的1/2MS溶液，用少量MS溶液将上述扩陪后的农杆菌重悬，摇匀，向剩余的1/2MS溶液中加入0.04v/v％的Silwet L-77与10μL的1mg/mL的6-BA，搅匀。

将野生型拟南芥的茎部及花序浸泡在菌液中50s，取出沥干菌液，放入一次性塑料袋中，罩上黑盒子，避光培养24h。

培养结束，取出植株，将植株直立放置，浇水培养，保证植株水分充足。

4.3转基因阳性株系的筛选

转化后的植株继续培养，待角果全部成熟后收种子，在垫有滤纸的干燥培养皿中室温放置一周，使种子全部干燥，之后用50目的不锈钢筛过滤种子，除去角果，收集转基因T0代种子并播种于穴盘中，用0.05v/v％草甘膦进行幼苗抗性筛选，获得T1代转基因植株，持续筛选直至获得T3代纯合体转基因植株，标记为转基因MsGSTU21拟南芥。

实施例5转基因MsGSTU21拟南芥在酸、铝胁迫以及干旱胁迫下的考察

本实施例中，以实施例4获得的转基因MsGSTU21拟南芥为研究对象，分别进行酸、铝胁迫考察和干旱胁迫考察，包括如下：

5.1野生型拟南芥和转基因MsGSTU21拟南芥在酸、铝胁迫条件下的考察研究

将野生型拟南芥的种子点在pH值为4.5的培养基中；将编号分别为MsGSTU21-1、MsGSTU21-4、MsGSTU21-5、MsGSTU21-7和MsGSTU21-9(对应标记为1、4、5、7和9)的转基因拟南芥的种子点在pH值为4.5和1.2mM氯化铝的培养基中。然后分别于气温22℃、光强6000勒克斯、光周期16小时光照/8小时黑暗的人工气候箱中培养14天，进行表型观察。

图5为本实施例中的野生型拟南芥和转基因MsGSTU21拟南芥的植株在酸、铝胁迫下的表型观察结果图。

从图5可知，与野生型WT拟南芥的植株相比，编号分别为MsGSTU21-1、MsGSTU21-4、MsGSTU21-5、MsGSTU21-7和MsGSTU21-9的转基因拟南芥的植株的表型具有显著性差异。

图6为本实施例中的野生型拟南芥和转基因MsGSTU21拟南芥在酸、铝胁迫下的根长长度图。

从图6可知，在酸、铝胁迫下，野生型拟南芥植株的根长长度显著低于MsGSTU21转基因植株的根长长度。

从图5和图6可知，转基因MsGSTU21拟南芥具有更好的耐酸、耐铝性。需要说明的是，根长长度为观测植株是否酸和铝胁迫的直观数据，根长越长表示耐酸和铝的能力越强。

5.2野生型拟南芥和转基因MsGSTU21拟南芥在干旱胁迫条件下的考察研究

将野生型拟南芥的种子点在MS培养基；将转基因MsGSTU21拟南芥的种子点在MS培养基。分别于气温22℃、光强6000勒克斯、光周期16小时光照/8小时黑暗的人工气候箱中培养。

14天后，挑选生长一致的幼苗，分别移栽到含有基质的小花盆，基质为由蛭石和营养土按照质量比为1：1混合获得。每盆4株，饱和浇水后放置人工气候箱中培养，停止浇水33天，进行表型观察。

图7为本实施例中野生型拟南芥与转基因MsGSTU21拟南芥在干旱胁迫下的表型观察图。

从图7可知，野生型拟南芥与转基因MsGSTU21拟南芥的植株表型具有显著性差异；野生型拟南芥的植株经干旱胁迫后，枝叶变稀少也变枯黄，而转基因MsGSTU21拟南芥植株的枝叶仍然为绿色，并且长势旺盛，尤其是转基因MsGSTU21-1的植株。野生型拟南芥生长状况明显不如转基因MsGSTU21拟南芥的植株，证明转基因MsGSTU21拟南芥具有很好的抗旱性。

以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法、组合物的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。

序列表

<110> 上海交通大学

<120> 一种蛋白质及其相关产品和用途

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 678

<212> DNA

<213> SEQ ID NO：1(Artificial Sequence)

<400> 1

atggctacaa atcaagaaca tgtgaaactt ttgggagcta caggaagccc atttgtttgc 60

agggtacaga ttgctctaaa gttgaaggga attgaatatg aatttgttga agaaaattta 120

gccaccaaga gtgaacaact tctcaaatat aatccagttc ataagaaggt tccagttttt 180

gttcacaatg agaagcctat atcagaatcc cttgtgattc ttgagtacat tgatgaggtt 240

tggaagcaaa accctatttt gccttctgat ccacaccaaa gagccttggc ccgattttgg 300

tcgaaattca tcgatgacaa gattgtgtcc gcgtcattta aatctgtttt ttcgcttgat 360

gagaaagagc gtgagaagaa tattgaagaa gcaaccgagg ctcttcactt tcttgagaat 420

gagctgaagg acaagtactt tggaggagaa gagtttaact ttgtcgatat tgctgctgtt 480

ttcgtagcat tttgggtccc tctagttcaa gacattaccg agctgcaatt gttcactgct 540

gaaaagtttc caaagcttta caattggagt caagaatttc ttgaccatcc tattgtgaaa 600

gaaactcttc ctccaagaga gcctcttttc gcctttttta aaggtcgtta tgaaagcctt 660

cttgctgctt caaagtag 678

<210> 2

<211> 225

<212> PRT

<213> SEQ ID NO：2(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Ala Thr Asn Gln Glu His Val Lys Leu Leu Gly Ala Thr Gly Ser

1 5 10 15

Pro Phe Val Cys Arg Val Gln Ile Ala Leu Lys Leu Lys Gly Ile Glu

20 25 30

Tyr Glu Phe Val Glu Glu Asn Leu Ala Thr Lys Ser Glu Gln Leu Leu

35 40 45

Lys Tyr Asn Pro Val His Lys Lys Val Pro Val Phe Val His Asn Glu

50 55 60

Lys Pro Ile Ser Glu Ser Leu Val Ile Leu Glu Tyr Ile Asp Glu Val

65 70 75 80

Trp Lys Gln Asn Pro Ile Leu Pro Ser Asp Pro His Gln Arg Ala Leu

85 90 95

Ala Arg Phe Trp Ser Lys Phe Ile Asp Asp Lys Ile Val Ser Ala Ser

100 105 110

Phe Lys Ser Val Phe Ser Leu Asp Glu Lys Glu Arg Glu Lys Asn Ile

115 120 125

Glu Glu Ala Thr Glu Ala Leu His Phe Leu Glu Asn Glu Leu Lys Asp

130 135 140

Lys Tyr Phe Gly Gly Glu Glu Phe Asn Phe Val Asp Ile Ala Ala Val

145 150 155 160

Phe Val Ala Phe Trp Val Pro Leu Val Gln Asp Ile Thr Glu Leu Gln

165 170 175

Leu Phe Thr Ala Glu Lys Phe Pro Lys Leu Tyr Asn Trp Ser Gln Glu

180 185 190

Phe Leu Asp His Pro Ile Val Lys Glu Thr Leu Pro Pro Arg Glu Pro

195 200 205

Leu Phe Ala Phe Phe Lys Gly Arg Tyr Glu Ser Leu Leu Ala Ala Ser

210 215 220

Lys

225

<210> 3

<211> 953

<212> DNA

<213> SEQ ID NO：3(Artificial Sequence)

<400> 3

ggcacgaggc aaagtcatag aaaatttaag tgttgcaatg gctacaaatc aggaacatgt 60

gaaacttttg ggagctactg gaagcccatt tgtgtgcagg gtacagattg ctctaaagtt 120

gaagggaatt gaatatgaat ttcttgaaga aaatttggcc acaaagagtg aacttcttct 180

taaatataat ccagttcata agaaggttcc agtttttgtt cacaatgata agcccatttc 240

agaatctctt gtgattcttg agtacattga tgaggtttgg aagcaaaacc ccattttgcc 300

aactgatcca caccaaagag ccttggctcg attttggtcg aaattcatcg atgacaagat 360

tgtgtccgca tcatccaaat ccgtttttac acttgatgag aaagagcgcg agaagaatgt 420

cgaagaaaca actgaggctc ttcagtttct tcagaatgag ctgaagggta agtactttgg 480

aggagaagag tttaactttg tggatattgc tgctgttttc gtagcattct ggatccctct 540

agttcaagac ataatagggt tgcaattgtt cacagctgaa aagtttccaa agctttacaa 600

ttggagtcaa gaatttcttg accatcctgt tgtgaaggaa actattcctc caagagagcc 660

tcttttcgcc ttttttaaag gtcgctatga gagccttctt gctgcttcaa aatagatcaa 720

tgtactgctg atatagaata tcgagagtca gaattttatg tttatgaatt cttatctgtt 780

attgagttct tgttgttagg atttcatttc tgaataatat tttataatgt gagatttctc 840

catgtgaaat ctaaggatat tgttgtcata gctctgattt tgcaatgctt gtaatcaact 900

tttgtttcgg ataacaaaga tatgtaaatt cttttgtaat ctgatttttt atc 953

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> SEQ ID NO：4(Artificial Sequence)

<400> 4

atggctacaa atcaagaaca tgtga 25

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> SEQ ID NO：5(Artificial Sequence)

<400> 5

ctactttgaa gcagcaagaa g 21

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> SEQ ID NO：6(Artificial Sequence)

<400> 6

cgggatccat ggctacaaat caagaacatg 30

<210> 7

<211> 32

<212> DNA

<213> SEQ ID NO：7(Artificial Sequence)

<400> 7

ggactagtct ttgaagcagc aagaaggctt tc 32

Claims

1.一种蛋白质，其特征在于，所述蛋白质为如下(1)或(2)的蛋白：

(1)由如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

2.一种多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码如权利要求1所述的蛋白质。

3.如权利要求2所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸的序列包括如SEQ ID NO：1所示序列。

4.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体含有如权利要求2或3所述的多核苷酸。

5.一种生物工程菌，其特征在于，所述生物工程菌含有如权利要求4所述的重组表达载体或其基因组内整合有如权利要求2或3所述的多核苷酸。

6.如权利要求1所述的蛋白质或如权利要求2或3所述的多核苷酸或如权利要求4所述的重组表达载体或如权利要求5所述的生物工程菌在培育抗逆性植物中的用途。

7.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述抗逆性包括耐酸性、耐铝性或耐干旱性中的一种或多种。

8.一种用于检测如权利要求2或3所述的多核苷酸的探针，其特征在于，所述探针的核苷酸序列包括如SEQ ID NO：3所示序列。

9.一种提高植物抗逆能力的方法，其特征在于，包括：

(a)将如权利要求2所述的多核苷酸导入植物；

或，(b)将如权利要求4所述的重组表达载体导入植物。

10.如权利要求6或7所述的用途或如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述植物包括双子叶植物或单子叶植物。