CN110747222A - 通过基因编辑创制广谱抗细条病作物新种质的方法及其应用 - Google Patents

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罗同平
李振经
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Abstract

本发明公开一种通过基因编辑创制广谱抗细条病作物新种质的方法及其应用，对水稻OsMPK6基因全长cDNA进行克隆，利用CRISPR/Cas9技术对OsMPK6进行编辑，构建转基因载体，利用农杆菌介导法进行转基因，获得T0转基因阳性苗，通过测序和野生型的目的片段进行比对确定所得转基因阳性苗目的基因已被编辑，种植T0转基因苗，利用分子标记辅助选择，获得基因型纯合的T1代转基因苗，对T1、T2代转基因苗进行人工接种鉴定，若表现出广谱细条病抗性，则获得了广谱抗细条病的水稻新种质。本发明利用基因编辑技术，对细条病抗性主效基因BLS1(OsMPK6)进行修饰，创制广谱抗细条病新种质，可以大大提高这一种重要资源的利用效率。

Description

通过基因编辑创制广谱抗细条病作物新种质的方法及其应用
【技术领域】
本发明涉及基因编辑技术进行农作物育种技术领域，尤其是一种通过基因编辑创制广谱抗细条病作物新种质的方法及其应用。
【背景技术】
细菌性条斑病(简称细条病)由病原菌Xanthomonas oryze pv.Oryzicola(Xoc)引起，是一种重要的水稻病害。该病害在爆发流行年份可导致水稻产量损失32％。栽培措施和农药使用是防治细条病的有效办法。但是，利用抗性资源培育抗性品种是防治该病害最为经济有效的办法。以优良抗性基因资源为对象，利用基因编辑等分子生物技术来提高育种效率有重要意义。目前关于利用基因编辑创制广谱抗细条病新种质的研究尚很少见。
稻种中抗细条病资源较丰富，但多数抗源主要来自热带地区，且大都是一些古老的地方品种，农艺性状比较差，因此，单靠常规育种方法改良，周期长，资源利用效率低。此外，对抗源开发力度不足，也是造成抗细条病育种进展缓慢的原因之一。细条病抗源中，主效基因控制的抗性是一种重要的抗源类型。
【发明内容】
鉴于上述内容，本申请提供了一种通过基因编辑创制广谱抗细条病作物新种质的方法及其应用，对细条病抗性主效基因BLS1(OsMPK6)进行修饰，创制广谱抗细条病新种质，可以大大提高这一种重要资源的利用效率。
为达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：
一种通过基因编辑创制广谱抗细条病新种质的方法，对水稻OsMPK6基因全长cDNA进行克隆，利用CRISPR/Cas9技术对基因OsMPK6进行编辑，构建转基因载体，利用农杆菌介导法进行转基因，将获得的T0转基因阳性苗，通过测序和野生型的目的片段进行比对确定所得转基因阳性苗目的基因已被编辑，种植T0转基因苗，利用分子标记辅助选择，获得基因型纯合的T1代转基因苗，对T1、T2代转基因苗进行人工接种鉴定，若表现出广谱细条病抗性，则获得了广谱抗细条病的水稻新种质。
进一步说明，对水稻OsMPK6基因全长cDNA进行克隆步骤中，反转录cDNA，使用的引物序列如：左端引物序列cagtggtctcacaacatggacgccggggcgcagcc，左端引物序列：cagtgg tctcatacactggtaatcagggttgaacg。
进一步说明，构建的转基因载体，设计的载体构建靶标引物分别如下：
(1)第1靶标引物：
7082-Y+：cagtggtctca ggca ctggatgaacctcccgcca；
7082-Y-：cagtggtctca aaac tggcgggaggttcatccag；
(2)第2靶标引物：
7082-B+：cagtggtctca ggca agccccccatcctccccat；
7082-B-：cagtggtctca aaac atggggaggatggggggct。
进一步说明，通过基因编辑创制广谱抗细条病新种质的方法，包括以下步骤：
(1)定位候选基因：将BLS1定位在RM19400和RM510之间21-kb的物理范围内，登录Rice Genome Annotation Project网站(http://rice.plantbiology.msu.edu/)，查询定位区域(Chr.6 2810860-2831635)，得到精细定位区域包含OsMPK6基因(LOC_Os06g06090)、二氢新喋呤醛缩酶(LOC_Os06g06100)、转座子(LOC_Os06g06110)和未知基因 (LOC_Os06g06115)4个候选基因；
(2)候选基因表达分析：以抗感亲本和后代植株为材料，分别接种细条病菌后，在不同时间点取样提取RNA，逆转录成cDNA，对定位区域内的候选基因进行表达分析，选择出与细条病抗性有关的基因；
(3)精细定位区域测序：使用Agilent捕获平台，将水稻材料DP3、9311、708-2和810进行精细定位区域及侧翼200kb范围进行测序，获得目标区段大量的数据供生物信息学分析，利用IGV软件对精细定位测序结果进行对比分析，发现在OsMPK6基因区域抗感亲本和抗感后代单株之间存在丰富的基因结构差异；
(4)候选基因cDNA克隆：利用设计的引物反转录cDNA，对候选基因OsMPK6全长cDNA进行克隆，获得抗病植株DP3和708-2和感病植株9311和810的序列；
(5)利用CRISPR/Cas9基因编辑构建转基因载体：选择对细条病的抗性介于普通DP3 和9311之间的基因编辑材料708-2，然后通过PCR扩增、酶切连接、测序分析构建转基因载体；
(6)转基因苗获得：利用农杆菌介导法转基因，得到23个株系的T0阳性苗；提取T0阳苗的基因组DNA，用目标基因引物对T0阳性苗进行PCR检测，对扩增的PCR产物进行测序，将测序结果和野生型的目的片段进行比对确定所得转基因苗目的基因已被编辑，种植 T0转基因苗，利用目标基因引物检测，获得基因型纯合的T1代转基因苗；
所述目标基因引物：7082-6200+：cacctgctcccccgtctc，7082-6633-：cctccactttcccttccc；
(7)广谱多抗细条病新种质创制：通过人工接种鉴定，从T1代转基因苗中，筛选获得比野生型708-2表现出更好的抗性的株系E136-27-1。功能互补实验说明OsMPK6基因(LOC_Os06g06090)就是目的基因BLS1。利用蛋白质免疫印迹(Western Blot,WB)技术对E136-27-1的后代V902(T2)进行检测，发现V902与野生型708-2相比目标蛋白OSMPK6翻译量大大减少。利用细条病菌I型菌(菌株号为QC-1)、II型菌(菌株号为HG-3)和III型菌(菌株号为JZ-8)对V902与野生型708-2进行接种鉴定，发现V902比野生型708-2具有广谱细条病抗性，证明获得了广谱抗细条病创新种质材料。
如上所述的通过基因编辑创制广谱抗细条病水稻新种质中的应用。
本发明具有以下有益效果：
1、本发明利用基因编辑技术，对细条病抗性主效基因BLS1(OSMPK6)进行修饰，创制抗细条病新种质，可以大大提高这一种重要资源的利用效率。
2、通过本发明提供的一种通过基因编辑创制广谱抗细条病作物新种质能对现有抗细菌性条斑病水稻育种材料进行有力补充。
【附图说明】
图1为近等基因系F2分离群体单株病斑长度分布图；
图2为BLS1基因第6染色体初步定位图；
附图标记：利用MapQTL5软件，通过整合F2群体的基因型和表型数据，计算出图谱遗传距离、LOD值和PEV值；LOD值和PEV值分别对应Y轴的左边和右边；分子标记在X轴，遗传单位距离为10kb；LOD值显著水平设为3.0；曲线深色和曲线浅色分别表示LOD值和 PEV值；
图3为BLS1基因精细定位图；
附图标记：a表示确认BLS1位于RM19391和RM510之间；b表示将BLS1在RM510和RM19400之间21-kb的范围内；遗传图a、b上排数字表示分子标记间的遗传距离，遗传图a、 b下排数据表示分子标记与BLS1之间的遗传重组单株；小写字母n表示检测的单株数；c 表示精细定位区域基因型纯合重组单株检测；
图4为精细定位区域包含的基因；
图5为OsMPK6基因表达分析；
备注：DP3-抗病野生稻；9311-感病亲本；708-2-抗病后代；810-感病后代；
图6为氨基酸突变图；
图7为CRISPR/Cas9基因编辑转基因载体；
图8为T0阳性苗示意图；
图9为OsMPK6基因编辑苗与708-2序列对比图；
图10为V902的OsMPK6蛋白质免疫印迹检测结果图。
【具体实施方式】
本说明书中公开的所有特征，或公开的所有方法或过程中的步骤，除了互相排斥的特征和 /或步骤以外，均可以以任何方式组合。
本说明书(包括任何附加权利要求、摘要)中公开的任一特征，除非特别叙述，均可被其他等效或具有类似目的的替代特征加以替换。即，除非特别叙述，每个特征只是一系列等效或类似特征中的一个例子而已。
实施例1：
1、定位分离群体的构建：
抗细条病普通野生稻DP3作为供体，感细条病籼稻品种93-11为受体，通过杂交、回交和多代自交构建近等基因系；通过抗性鉴定，从近等基因系中筛选出抗病单株，与93-11杂交，获得F1杂交种，杂交种自交收获F2代种子，再种植获得定位分离群体近等基因系F2。
2、抗性鉴定：
在水稻分蘖期，采用广泛分布于广西的优势致病型细菌性条斑病代表菌株JZ28(Ⅲ型) 接种。菌株在NA培养基上培养48h后，用无菌水配成3×108cfu/ml悬浮液。采用针刺法进行接种：把2根针距为0.8cm的大头针固定在橡皮上灭菌备用；用直径9cm、厚度2cm的无菌海绵碟吸足菌液后置于培养皿内；选择生长一致的完全展开叶片，将叶片中部平置于海绵碟上，用插入橡皮的大头针刺透稻叶后(稻叶中脉间隔2个针孔)，轻摁压海绵挤出菌液每株接菌3张叶片，每叶6个针刺点，期间注意补充菌液。接种20天后，测量病斑长度，按照以下标准对病情进行分级：0级，免疫(I)，伤口无症状或仅有褐点；1级，高抗(HR)，病斑长0.1-0.5cm；3级，抗(R)，病斑长0.6-1.0cm；5级，中抗(MR)，病斑长1.1-1.5cm；7 级，感病(S)，病斑长1.6-2.5cm；9级，高感(HS)，病斑长度大于2.5cm。抗性鉴定结果表明：普通野生稻DP3抗细条病，平均抗病指数为0.8；93-11感细条病，平均抗性指数为9.0；近等基因系F2分离群体单株病斑长度呈双峰分布(图1)，说明细条病抗性为主效基因/QTL 与微效基因/QTLs互作控制。
3、BLS1基因初步定位：
采用CTAB法提取水稻叶片基因组DNA进行SSR分子标记分析。采用混合分组分析法(bulked.segregant analysis,BSA)对分离群体进行分析，对抗性基因进行初步定位。利用MapQTL 5.0软件绘制连锁遗传图谱。
在前期研究中，我们把抗水稻细菌性条斑病主效基因BLS1定位于水稻第6染色体SSR 标记RM584和RM587之间4.0厘摩(cM)的范围。为进一步确定该结果，利用分布于水稻12条染色体上，在亲本DP3和93-11间具有多态性的150个SSR标记进行BSA分析，结果表明只有连续分布在同一区域的3个标记RM510、RM587和RM584在抗感池间表现出多态性，说明BLS1分布于该区域。为了进一步缩小BLS1的定位区域，利用6个在亲本间表现出多态性的标记，对146个近等基因系F2分离群体单株进行分析，通过MapQTL 5.0软件绘制连锁遗传图谱，将BLS1基因定位在RM19382和RM510之间的区域(图2)。BLS1能够解释细条病抗性变异的81.3％(图2)。
4、BLS1紧密连锁标记开发：
为了开发获得与细条病抗性主效基因BLS1紧密连锁的分子标记，新合成2个位于RM19382和RM510之间的多态性SSR引物RM19391和RM19400，检测364个极端抗性单株(抗性强于或等于抗性亲本DP3)。RM510能检测到1株重组单株，RM19382能检测到5 株(图3a)。在5株RM19382能检测到的单株中，RM19391有3株，RM19400没检测到重组单株(图3a)。经分析364个极端抗性单株，BLS1定位范围缩小到RM19391和RM510 之间的范围(图3a)。为了更进一步精细定位BLS1，在RM19391和RM510之间再开发2 个多态性标记RM19400和RM19402，检测由1021株极端抗性单株构成的大群体(图3b)。 RM510检测到1个重组单株，RM19391检测到4株，19400检测到2株，RM19402检测到0 株(图3b)。RM19402与BLS1共分离。分析结果将BLS1定位在RM19400和RM510之间 21-kb的物理范围内(Chr.6 2810860-2831635)。
登录Rice Genome Annotation Project网站(http://rice.plantbiology.msu.edu/)，查询定位区域(Chr.6 2810860-2831635)，发现精细定位区域包含OsMPK6基因(LOC_Os06g06090)、二氢新喋呤醛缩酶(LOC_Os06g06100)、转座子(LOC_Os06g06110)和未知基因 (LOC_Os06g06115)4个候选基因(图4)。研究表明OsMPK6能够磷酸化并激活WRKY45，使水稻对稻病害产生抗性(Ueno et al.2015)。而转录因子WRKY45能介导水稻对细条病的抗性(Tao et al.2009)。由此可见精细定位区域内OsMPK6基因(LOC_Os06g06090)极有可能是候选基因。
新开发的与BLS1紧密连锁的标记序列为：
1)标记引物RM19381，左端引物序列aacgggagatcacaggaatttgc，右边引物序列gtgttcgactcgtctccatttcg；
2)标记引物RM19382，左端引物序列ctgttctagtgttctggtatggaacg，右端引物序列gggtagtgaatggaatgctaagacc；
3)标记引物RM19391，左端引物序列gctttgtgttacaggatgtgctgtcc，右端引物序列caaagcttggtacctgcaagacg；
4)标记引物RM19400，左端引物序列actcccactgcattcagactgg，右端引物序列tgatgtcacaagccacaactagc；
5)标记引物RM19402，左端引物序列accatttgtcagtgaactaccc，右端引物序列atcagagcacctaacacatagc。
5、候选基因表达分析：
以抗感亲本和后代植株为材料，接种细条病菌后，在不同时间点取样提取RNA，逆转录成 cDNA，对定位区域内的候选基因进行表达分析，结果表明只有OsMPK6基因与细条病抗性有关，其他3个基因表达量与细条病抗性相关不明显。对于所有时间点，在抗病亲本和抗病单株708-2中，OsMPK6基因表达量比感病亲本9311和感病单株810的高，说明OsMPK6基因与细条病抗性有关，是最理想的候选基因(图5)。
6、精细定位区域测序：
使用Agilent捕获平台，DP3(CY1)、9311、708-2和810等16份材料，进行精细定位区域及侧翼200kb范围进行测序，获得目标区段大量的数据供生物信息学分析(表1)。利用IGV软件对精细定位测序结果进行对比分析，发现在OsMPK6基因区域抗感亲本和抗感后代单株之间存在丰富的基因结构差异(表1)。
表1目标区段测序SNPS总表
Figure RE-GDA0002303008180000061
Figure RE-GDA0002303008180000071
7、候选基因cDNA克隆分析：
反转录cDNA，设计引物
(+):cagtggtctcacaacatggacgccggggcgcagcc，
(-):cagtggtctcatacactggtaatcagggttgaacg，
对候选基因OsMPK6全长cDNA进行克隆，获得抗病植株(DP3和708-2)和感病植株(9311 和810)的序列分别为SEQ ID NO.1、和SEQ ID NO.2。研究发现抗感基因间存在多个突变位点，抗病基因缺失4个甘氨酸(G)，但在29位点多出1个甘氨酸，一个脯氨酸残基(P，抗病植株)突变为丝胺酸残基(S，感病植株)(图6)。
8、利用CRISPR/Cas9基因编辑构建转基因载体：
(1)、材料选择：经多年观察研究，708-2对细条病的抗性介于普通DP3(CY1)和9311之间是较为理想的基因编辑材料。
(2)、设计载体构建靶标引物：
1)第1靶标引物：
7082-Y+：cagtggtctca ggca ctggatgaacctcccgcca；
7082-Y-：cagtggtctca aaac tggcgggaggttcatccag；
2)第2靶标引物：
7082-B+：cagtggtctca ggca agccccccatcctccccat；
7082-B-：cagtggtctca aaac atggggaggatggggggct。
(3)、通过PCR扩增、酶切连接、测序分析构建转基因载体(图7)。
9、转基因苗获得：
利用农杆菌介导法转基因，得到23个株系的T0阳性苗(图8)。提取T0阳性苗的基因组 DNA，用目标基因引物：
7082-6200+：cacctgctcccccgtctc，
7082-6633-:cctccactttcccttccc；
对阳性苗进行检测，扩增的PCR产物送去测序，阳性苗扩增产物大小为406bp(不包括引物序列)，对野生型(708-2)进行PCR扩增片段大小为398bp(不包括引物序列)，把测序结果(SEQ ID NO.3)和野生型的(SEQ ID NO.4)目的片段进行比对确定所得转基因苗目的基因已被编辑(图9)。种植T0转基因苗，获得基因型纯合的T1代转基因苗。
10、广谱多抗细条病新种质创制：
T1代转基因苗，通过人工接种鉴定，23个株系中发现有3个基因编辑株系E136-27-1、 E136-27-2和E136-42-2比野生型708-2表现出更好的抗性，接近普通野生稻DP3(表2)。OsMPK6基因(LOC_Os06g06090)就是目的基因BLS1。说明BLS1负调控稻株对细菌性条斑病的抗性。利用蛋白质免疫印迹(Western Blot,WB)技术对E136-27-1的后代V902(T2 代转基因苗)进行检测，表明V902(T2代转基因苗)与野生型708-2相比目标蛋白OSMPK6 翻译量大大减少(图10)。
表2基因编辑株系对细条病抗性反应
Figure RE-GDA0002303008180000081
注：E136系为708-2基因编辑材料
利用细条病菌I型菌(菌株号为QC-1)、II型菌(菌株号为HG-3)和III型菌(菌株号为JZ-8) V902与野生型708-2进行接种鉴定。每个材料种5盘，每盘3株。结果如表3所示，对于QC-1， V902平均病斑长度为13.1mm(中抗)，而野生型708-2为26.4mm(高感)；对于HG-3，V902 平均病斑长度为6.7mm(抗)，而野生型708-2为26.9mm(高感)；对于JZ-8，V902平均病斑长度为4.4mm(高抗)，而野生型708-2为16.6mm(中感)。
表3 V902和708-2对不同细条病菌型的抗性反应(单位：mm)
Figure RE-GDA0002303008180000082
可见，本研究利用基因编辑技术，对抗细条病主效基因BLS1(OsMPK6)进行编辑，获得了广谱抗细条病水稻材料V902。
上述说明是针对本发明较佳可行实施例的详细说明，但实施例并非用以限定本发明的专利申请范围，凡本发明所提示的技术精神下所完成的同等变化或修饰变更，均应属于本发明所涵盖专利范围。
序列表
<110> 广西壮族自治区农业科学院
<120> 通过基因编辑创制广谱抗细条病作物新种质的方法及其应用
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1206
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 1
atggacgccg gggcgcagcc gccggacacg gagatggcgg aggccggcgg cggcggcggc 60
ggcgggcagc agccgcctgc tgcggctgcg tcggcggcgg gggcgggggc ggggatgatg 120
gagaacatcc aggcgacgct gagccatggc gggaggttca tccagtacaa catcttcggg 180
aacgtgttcg aggtcaccgc caagtacaag ccccccatcc tccccatcgg caagggcgcc 240
tacggcatcg tctgctcggc gctcaactcg gagacggggg agcaggtggc gatcaagaag 300
atcgccaacg cgttcgacaa caagatcgac gccaagcgca cgctcaggga gatcaagctg 360
ctccgccata tggaccacga gaatattgtt gccataaggg atatcatacc tcctccacaa 420
aggaattcat tcaatgacgt ttatattgca tatgaattga tggatactga tctgcatcaa 480
attattcgct caaatcaagc attgtcagag gagcactgcc agtatttcct ttatcagatt 540
ctccgtggct tgaagtatat acattcagca aatgtccttc accgagactt gaagcccagc 600
aacctacttt tgaatgcaaa ttgtgatctc aaaatttgtg attttggact tgctcgtacc 660
acctcagaaa ccgattttat gactgagtac gttgtcacaa gatggtatag ggcaccggaa 720
cttctgttga attcctctga atatactgca gcaattgatg tgtggtccgt gggctgtatt 780
tttatggaac tcatggatcg taaacctttg tttcctggaa gagatcatgt ccatcaatta 840
cgtctactaa tggagctcat tggaacgcca aatgaagctg atctggattt tgtaaatgaa 900
aatgcaagaa gatacattcg ccaacttcct agacatgcaa ggcagtcctt tcctgaaaaa 960
tttccgcatg ttcatccttt agcaattgat ctggttgaaa agatgctgac atttgatcct 1020
agacagagaa taacagttga aggtgccctt gcacatcctt acctggcatc gctgcatgac 1080
ataagtgatg agccagtctg ctcatcaccc ttcagctttg acttcgagca gcatgcattg 1140
tccgaggaac aaatgaagga tctaatctac caagaaggcc ttgcgttcaa ccctgattac 1200
cagtag 1206
<210> 2
<211> 1197
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 2
atggacgccg gggcgcagcc gccggacacg gagatggcgg aggccggcgg cgggcagcag 60
ccgcctgctg cggctgcggc ggcgggggcg ggggcagggg cggggatgat ggagaacatc 120
caggcgacgc tgagccatgg cgggaggttc atccagtaca acatcttcgg gaacgtgttc 180
gaggtcaccg ccaagtacaa gccccccatc ctccccatcg gcaagggcgc ctacggcatc 240
gtctgctcgg cgctcaactc ggagacgggg gagcaggtgg cgatcaagaa gatcgccaac 300
gcgttcgaca acaagatcga cgccaagcgc acgctcaggg agatcaagct gctccgccac 360
atggaccacg agaatattgt tgccataagg gatatcatac ctcctccaca aaggaattca 420
ttcaatgacg tttatattgc atatgaattg atggatactg atctgcatca aattattcgc 480
tcaaatcaag cattgtcaga ggagcactgc cagtatttcc tttatcagat tctccgtggc 540
ttgaagtata tacattcagc aaatgtcctt caccgagact tgaagcccag caacctactt 600
ttgaatgcaa attgtgacct caaaatttgt gattttggac ttgctcgtac cacctcagaa 660
accgatttta tgactgagta tgttgtcaca agatggtata gggcaccgga acttctgttg 720
aattcctctg aatatactgc agcaattgat gtgtggtctg tgggctgtat ttttatggaa 780
ctcatggatc gtaaaccttt gtttcctgga agagatcatg tccatcaatt acgtctacta 840
atggagctca tcggaacgcc aaatgaggct gatctggatt ttgtaaatga aaatgcaaga 900
agatacattc gccaacttcc tagacatgca aggcagtcct ttcctgaaaa atttccacat 960
gttcatcctt tagcaattga tctggttgaa aagatgctga catttgatcc tagacagaga 1020
ataacagttg aaggtgccct tgcacatcct tacctggcat cactgcatga cataagtgat 1080
gagccagtct gctcatcacc cttcagcttt gacttcgagc agcatgcatt gtccgaggaa 1140
caaatgaagg atctaatcta ccaagaaggc cttgcgttca accctgatta ccagtag 1197
<210> 3
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<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 3
gaggtagctc gtcggtcgcg atccaatccg aatccggcca tggacgccgg ggcgcagccg 60
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gcgggggcgg gggcaggggc ggggatgatg gagaacatcc aggcgacgct gagccatgga 180
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ccccccctcc cccccccctc ggaaggggcc cctagggtct cctgggtctc ttttgccccc 300
ccctctcccc ttttcttggg gggggggggg tgtgtttttg gtgtatattt tatattttgg 360
gtggagaaga cctctccgct ctcctctcag acagggggga acgggt 406
<210> 4
<211> 398
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 4
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gggcgcagcc gccggacacg gagatggcgg aggccggcgg cgggcagcag ccgcctgctg 120
cggctgcggc ggcgggggcg ggggcagggg cggggatgat ggagaacatc caggcgacgc 180
tgagccatgg cgggaggttc atccagtaca acatcttcgg gaacgtgttc gaggtcaccg 240
ccaagtacaa gccccccatc ctccccatcg gcaagggcgc ctacggcatc gtctggttcg 300
tttgctcccc cctctctccc attccgttgg cggcggcggc ctgattttgg tttggatttt 360
ggattttggg tttggatgac agctcggcgc tcaactcg 398
<210> 5
<211> 35
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 5
cagtggtctc acaacatgga cgccggggcg cagcc 35
<210> 6
<211> 35
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 6
cagtggtctc atacactggt aatcagggtt gaacg 35
<210> 7
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<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 7
cagtggtctc aggcactgga tgaacctccc gcca 34
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<211> 34
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 8
cagtggtctc aaaactggcg ggaggttcat ccag 34
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<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 9
cagtggtctc aggcaagccc cccatcctcc ccat 34
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<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 10
cagtggtctc aaaacatggg gaggatgggg ggct 34
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<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 11
cacctgctcc cccgtctc 18
<210> 12
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<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 12
cctccacttt cccttccc 18

Claims (5)

1.一种通过基因编辑创制广谱抗细条病新种质的方法，其特征在于，通过对水稻OsMPK6基因全长cDNA进行克隆，利用CRISPR/Cas9技术对基因OsMPK6进行编辑，构建转基因载体，利用农杆菌介导法进行转基因，获得T0转基因阳性苗，通过测序和野生型的目的片段进行比对确定所得转基因阳性苗目的基因已被编辑，种植T0转基因苗，利用分子标记辅助选择，获得基因型纯合的T1代转基因苗，对T1、T2代转基因苗进行人工接种鉴定，若表现出广谱细条病的抗性，则获得了广谱抗细条病的水稻新种质。
2.根据权利要求1所述的通过基因编辑创制广谱抗细条病新种质的方法，其特征在于：对水稻OsMPK6基因全长cDNA进行克隆步骤中，反转录cDNA，使用的引物序列如：左端引物序列cagtggtctcacaacatggacgccggggcgcagcc，左端引物序列：cagtggtctcatacactggtaatcagggttgaacg。
3.根据权利要求1所述的通过基因编辑创制广谱抗细条病新种质的方法，其特征在于：构建的转基因载体，设计的载体构建靶标引物分别如下：
(1)第1靶标引物：
7082-Y+：cagtggtctcaggcactggatgaacctcccgcca；
7082-Y-：cagtggtctcaaaactggcgggaggttcatccag；
(2)第2靶标引物：
7082-B+：cagtggtctcaggcaagccccccatcctccccat；
7082-B-：cagtggtctcaaaacatggggaggatggggggct。
4.根据权利要求1所述的通过基因编辑创制广谱抗细条病新种质的方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)定位候选基因：将BLS1定位在RM19400和RM510之间21-kb的物理范围内，登录RiceGenome Annotation Project网站(http://rice.plantbiology.msu.edu/)，查询定位区域(Chr.6 2810860-2831635)，得到精细定位区域包含OsMPK6基因(LOC_Os06g06090)、二氢新喋呤醛缩酶(LOC_Os06g06100)、转座子(LOC_Os06g06110)和未知基因(LOC_Os06g06115)4个候选基因；
(2)候选基因表达分析：以抗感亲本和后代植株为材料，分别接种细条病菌后，在不同时间点取样提取RNA，逆转录成cDNA，对定位区域内的候选基因进行表达分析，选择出与细条病抗性有关的基因；
(3)精细定位区域测序：使用Agilent捕获平台，将水稻材料DP3、9311、708-2和810进行精细定位区域及侧翼200kb范围进行测序，获得目标区段大量的数据供生物信息学分析，利用IGV软件对精细定位测序结果进行对比分析，发现在OsMPK6基因区域抗感亲本和抗感后代单株之间存在丰富的基因结构差异；
(4)候选基因cDNA克隆：利用设计的引物反转录cDNA，对候选基因OsMPK6全长CDNA进行克隆，获得抗病植株DP3和708-2和感病植株9311和810的序列；
(5)利用CRISPR/Cas9基因编辑构建转基因载体：选择对细条病的抗性介于普通DP3和9311之间的基因编辑材料708-2，然后通过PCR扩增、酶切连接、测序分析构建转基因载体；
(6)转基因苗获得：利用农杆菌介导法转基因，得到23个株系的T0阳性苗；提取T0阳性苗的基因组DNA，用目标基因引物对T0阳性苗进行PCR检测，对扩增的PCR产物进行测序，将测序结果和野生型的目的片段进行比对确定所得转基因苗目的基因已被编辑，种植T0转基因苗，利用目标基因引物检测，获得基因型纯合的T1代转基因苗；
目标基因引物：7082-6200+：cacctgctcccccgtctc，7082-6633-：cctccactttcccttccc；
(7)广谱多抗细条病新种质创制：通过人工接种鉴定，从T1代转基因苗，筛选获得比野生型708-2表现出更好的抗性的株系E136-27-1；功能互补实验说明OsMPK6基因(LOC_Os06g06090)就是目的基因BLS1；利用蛋白质免疫印迹(Western Blot,WB)技术对E136-27-1的后代V902进行检测，发现V902与野生型708-2相比目标蛋白OSMPK6翻译量大大减少；利用细条病菌I型菌(菌株号为QC-1)、II型菌(菌株号为HG-3)和III型菌(菌株号为JZ-8)对V902与野生型708-2进行接种鉴定，发现V902比野生型708-2具有广谱细条病抗性，证明获得了广谱抗细条病创新种质。
5.权利要求1-4任一所述的通过基因编辑在创制广谱抗细条病水稻新种质中的应用。
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