CN110195124A - 水稻抗细菌性条斑病主效基因位点的分子标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公布了水稻抗细菌性条斑病主效基因位点的分子标记及其应用。一种水稻抗细菌性条斑病主效基因位点的分子标记,位于水稻第10染色体，扩增的标记引物RM258，所述标记引物扩增长度为369bp。本发明将国际稻BJ1与广西优质稻油占8号为亲本杂交自交获得F₂分离群体，对其进行抗性鉴定和遗传分析，结果表明抗性受1个隐性主效基因控制，获得紧密连锁的分子标记RM258，该标记位于10号染色体上约48.8cM处。本发明用SSR标记首次定位了该品种中抗细菌性条斑病主效基因位点位于第10号染色体。这一新发现能够进一步拓展或辅助鉴定抗细菌性条斑病水稻。

Description

水稻抗细菌性条斑病主效基因位点的分子标记及其应用

【技术领域】

本发明涉及分子生物学领域，特别涉及水稻抗细菌性条斑病主效基因位点的分子标记。

【背景技术】

细菌性条斑病(简称细条病)由病原菌Xanthomonas oryze pv.Oryzicola(Xoc)引起，是一种重要的水稻病害，爆发流行年份该病害可导致水稻产量损失32％。迄今对水稻细条病这一类细菌性病害还没有理想的防治药剂。而与药剂防治相比，应用抗病品种既有利于农作物连年稳产高产，还可节省大量的人力物力，降低农业投资，不污染环境，符合农业可持续发展方向。遗传分析表明水稻对细条病的抗性存在质量抗病性和数量抗病性两种抗性类型，分别由主效基因和数量性状基因座(Quantitativetraitlocus,QTL)控制。目前关于抗细条病主效基因分子标记应用研究尚很少见。

水稻材料中抗细条病资源较丰富，但多数抗源主要来自热带地区,且大都是一些古老的地方品种,农艺性状比较差,因此，单靠常规育种方法改良，周期长，资源利用效率低。此外，对抗源开发力度不足，也是造成抗细条病育种进展缓慢的原因之一。在细条病抗源中，主效基因控制的质量抗病性是一种重要的抗性类型。关于抗细条病主效基因的研究，大多集中在抗源筛选和抗性遗传分析等方面,而对抗病基因的分子遗传机理研究较少,特别是有关基因的定位等分子基础研究尚不深入。因此，加强抗细条病主效基因的发掘利用，开发出可用于辅助育种的分子标记，可以大大提高这一种重要资源的利用效率。

【发明内容】

鉴于上述内容，有必要加强抗细条病主效基因的发掘利用，开发出可用于辅助育种的分子标记，可以大大提高这一种重要资源的利用效率。

为达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：

一种水稻抗细菌性条斑病主效基因位点的分子标记，位于水稻第10染色体，扩增的标记引物RM258，左端引物序列：CTCCCTGGCCTTTAAAGCTGTCG，右端引物序列：GACGAACAGCAGCAGAAGAGAAGC，所述标记引物扩增长度为369bp。

如上所述的分子标记在选育抗水稻抗细菌性条斑病水稻品种或筛选抗性基因的抗细菌性条斑病水稻品种中的应用。

上述分子标记筛选的过程如下：

(1)定位群体构建：国际稻‘BJ1’作为供体，广西优质稻‘油占8号’作为受体进行正反杂交，收获F₁种子，播种F₁种子，F₁植株自交得到F₂，再种植获得定位分离群体近等基因系F₂；

(2)抗性鉴定：分别种植亲本、F₁、F₂群体，在水稻分蘖盛期采用广西的优势致病型Ⅲ菌株连塘13进行接种，接种20天后进行病情调查，每个单株测量10个病斑的长度，根据平均值判定单株对细条病的抗性水平；

(3)抗感池DNA的构建：采用CTAB法提取F₂代抗、感表现极端单株水稻叶片总DNA，按照抗、感分成两组混合各单株的总DNA，构建抗、感DNA池；

(4)SSR分子标记：对亲本国际稻‘BJ1’、广西优质稻‘油占8号’进行多态性检测，筛选得到具多态的SSR引物，多态性表现率为23％，以抗、感基因池DNA为PCR模板，用筛选得到的SSR引物进行进一步的多态性检测，发现来自10号染色体的SSR标记RM258在抗、感病基因池之间具有多态性；

(5)遗传分析：F₂代分离群体的251个单株中抗病的植株有66株，感病的植株有185株，经卡平方检验，抗(R)、感(S)分离符合1∶3的单基因遗传分离理论比率，表明国际稻‘BJ1’携带的抗水稻细菌性条斑病基因为隐性主效基因，该基因位于10号染色体上，与SSR标记RM258紧密连锁。

在步骤(4)中，PCR反应采用20μL反应体系，含10×PCR Buffer(含MgCl₂)2.0μL、2.5mmol·L^–1dNTPs 2.0μL、dd H₂O 11.9μL、10μmol·L^–1引物2.0μL、模板DNA2.0μL、5U·μL^–1Taq DNA聚合酶0.1μL；

PCR反应程序：95℃预变性5min；95℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸5min，4℃保存；

PCR产物经8％非变性丙烯酰胺凝胶电泳分离，快速银染后观察读图分析。

本发明具有以下有益效果：

1、将国际稻抗源BJ1与感细条病广西优质稻油占8号为亲本杂交自交获得F2分离群体，对其进行了抗性鉴定和遗传分析，结果表明抗性受1个隐性主效基因控制，获得与抗细菌性条斑病基因紧密连锁的分子标记RM258，该标记位于10号染色体上约48.8cM处。通过本发明用SSR标记首次定位了抗细条病国际稻BJ1及其衍生品种(系)中的抗细菌性条斑病主效基因位点位于第10号染色体。这一新发现能够进一步拓展或辅助鉴定抗细菌性条斑病水稻。

2、本发明分子标记定位的主效基因位点位置明确(位于10号染色体上约48.8cM处)，鉴定快捷。通过检测与该基因位点连锁的分子标记，可预测水稻植株的细菌性条斑病抗性，用于抗细条病国际稻BJ1及其衍生品种(系)中的基因型检测，以判断该品种或品系是否具有细菌性条斑病抗性，进而快速筛选抗病品种或品系用于水稻育种，大大提高抗细菌性条斑病水稻的选择效率,获得含有该抗性基因的抗细菌性条斑病水稻品种。

3、辅助鉴定抗细菌性条斑病水稻的目标明确，有效的节约成本。通过检测抗细菌性条斑病主效基因位点，可以在苗期就鉴定出高抗细菌性条斑病的单株，淘汰其它植株，不仅节约生产成本而且大大提高抗细菌性条斑病水稻材料的选择效率，极大地缩短水稻品种的育种周期。

【附图说明】

图1为标记引物RM258扩增产物的多态性电泳图；

注：1为Marker，2为亲本BJ1(抗病)带型；3为亲本油占8号(感病)带型；15为感病带型；6、7、8、9、11、12、14、16为抗病带型；4、5、10、13为杂合带型。

图2为水稻品种BJ1、油占8号的F₂群体各抗性水平植株分布图。

【具体实施方式】

本说明书中公开的所有特征，或公开的所有方法或过程中的步骤，除了互相排斥的特征和/或步骤以外，均可以以任何方式组合。

本说明书(包括任何附加权利要求、摘要)中公开的任一特征，除非特别叙述，均可被其他等效或具有类似目的的替代特征加以替换。即，除非特别叙述，每个特征只是一系列等效或类似特征中的一个例子而已。

实施例1：

筛选具体步骤：

(1)定位群体的构建：将品种‘BJ1’作为供体，‘油占8号’作为受体，通过进行正反杂交，收获F₁杂交种子，播种F₁杂交种子，杂交种自交收获F₂代种子。

(2)抗性鉴定：

分别种植亲本、F₁、F₂群体，亲本、F₁各种植10株，F₂种植251株，在水稻分蘖盛期采用广西的优势致病型Ⅲ菌株连塘13进行接种：将2根大头针以约8mm的间距插进橡皮胶中，针头露出约5mm cm，灭菌备用；供试菌株连塘13在NA培养基平板培养48h，用无菌水冲洗下来，配成3×10⁸cfu/mL悬浮液(现配现用)；把大小与培养皿内空间相当，厚约2cm的无菌海绵置于培养皿内并倒入菌液，使海绵吸足菌液，然后将水稻叶片的接种部位平置于海绵碟上，用带橡皮胶的大头针刺一下水稻叶片后(注意让针刺在水稻叶片中脉两侧)，再用橡皮胶带着叶片挤压海绵至挤出菌液；在接种过程中不定时地给海绵补充菌液，每株接种2片新生的完全展开叶片。接种20天后进行病情调查，每个单株测量10个病斑的长度，根据平均值判定单株对细条病的抗性水平，划分标准见表1，以1.0cm的病斑长度作为划分抗、感分界线。

表1水稻细条病抗性水平划分及其相应症状描述

抗性	症状表现
		免疫(I)	无症状或有褐色反应
高抗(HR)	病斑长＜0.1cm
		抗(R)	病斑长0.1～0.5cm
中抗(MR)	病斑长0.6～1.0cm
		中感(MS)	病斑长1.1～1.5cm
感(S)	病斑长1.6～2.5cm
		高感(HS)	病斑长＞2.5cm

(3)抗感池DNA的构建：

选抗、感表现极端的F₂代植株各15株(极端抗病病斑长度＜0.5㎝，极端感病病斑长度＞2.5㎝)，用CTAB法分别提取单株的总DNA，按照抗、感分成两组混合各单株的总DNA，构建抗、感DNA池。

(4)SSR标记：

选取分布于水稻12条染色体上的280对简单重复序列标记SSR对亲本‘BJ1’、‘油占8号’进行多态性检测，筛选得到具多态的SSR引物65对，多态性表现率为23％。以抗、感基因池DNA为PCR模板，用筛选得到的65对SSR引物进行进一步的多态性检测，发现来自10号染色体的SSR标记RM258在抗、感病基因池之间具有多态性。

PCR反应采用20μL反应体系，含10×PCR Buffer(含MgCl₂)2.0μL、2.5mmol·L^{– 1}dNTPs 2.0μL、dd H₂O 11.9μL、10μmol·L^–1引物2.0μL、模板DNA2.0μL、5U·μL^–1Taq DNA聚合酶0.1μL；

PCR反应程序：95℃预变性5min；95℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸5min，4℃保存；

PCR产物经8％非变性丙烯酰胺凝胶电泳分离，快速银染后观察读图分析。

银染程序(各个步骤均需轻轻振荡)：

固定：10％乙醇+0.5％冰醋酸10min。

渗透：0.2％硝酸银10min。

漂洗：双蒸水2次，每次10s；10％硫代硫酸钠30s。

显色：1.5％氢氧化钠+1％甲醛。

清洗：待条带清晰显现后用自来水冲洗。

结果见图1。

(5)遗传分析/验证：

正反交的所有F₁植株对细菌性条斑病的抗性均表现为感和高感，没有发现抗病植株，说明‘BJ1’的抗性是隐性遗传的，受核基因控制。

F₂代分离群体的251个单株中表现免疫的有12株，高抗的有0株，抗的有20株，中抗的有34株，中感的有29株，感的有39株，高感的有117株，图2说明F₂代不同抗性植株是间断非正态分布的，具有质量性状的分布特征。在251个单株F₂代分离群体中表现抗病的植株有66株，感病的植株有185株，经卡平方检验，抗(R)、感(S)分离符合1∶3(χ²＝0.19<χ²0.05＝3.84)的单基因遗传分离理论比率，表明‘BJ1’携带的抗水稻细菌性条斑病基因为隐性主效基因，该基因位于10号染色体上，与SSR标记RM258紧密连锁。由此也可以说明，本发明提供的分子标记能够准确筛选出含有抗细菌性条斑病的主效基因，从而大大提高育种效率。

表2亲本和杂交后代对细菌性条斑病的抗性反应

上述说明是针对本发明较佳可行实施例的详细说明，但实施例并非用以限定本发明的专利申请范围，凡本发明所提示的技术精神下所完成的同等变化或修饰变更，均应属于本发明所涵盖专利范围。

序列表

<110> 广西壮族自治区农业科学院微生物研究所

<120> 水稻抗细菌性条斑病主效基因位点的分子标记及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 1

ctccctggcc tttaaagctg tcg 23

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400> 2

gacgaacagc agcagaagag aagc 24

Claims (4)

1.一种水稻抗细菌性条斑病主效基因位点的分子标记,其特征在于，位于水稻第10染色体，扩增的标记引物RM258，左端引物序列：CTCCCTGGCCTTTAAAGCTGTCG，右端引物序列：GACGAACAGCAGCAGAAGAGAAGC，所述标记引物扩增长度为369bp。

2.根据权利要求1所述的分子标记在选育抗水稻细菌性条斑病水稻品种或筛选抗性基因的抗细菌性条斑病水稻品种中的应用。

3.根据权利要求1所述的分子标记，其特征在于，其筛选具体的步骤如下：

(1)定位群体构建：以国际稻‘BJ1’作为供体，广西优质稻‘油占8号’作为受体进行正反杂交，收获F₁种子，播种F₁种子，F₁植株自交得到F₂，再种植获得定位分离群体近等基因系F2；

(2)抗性鉴定：分别种植亲本、F₁、F₂群体，在水稻分蘖盛期采用广西的优势致病型Ⅲ菌株连塘13进行接种，接种20天后进行病情调查，每个单株测量10个病斑的长度，根据平均值判定单株对细菌性条斑病的抗性水平；

(3)抗感池DNA的构建：采用CTAB法提取F₂代抗、感表现极端单株水稻叶片总DNA，按照抗、感分成两组混合各单株的总DNA，构建抗、感DNA池；

(4)SSR分子标记：对亲本国际稻‘BJ1’、广西优质稻‘油占8号’进行多态性检测，筛选得到具多态的SSR引物，多态性表现率为23％，以抗、感基因池DNA为PCR模板，用筛选得到的SSR引物进行进一步的多态性检测，发现来自10号染色体的SSR标记RM258在抗、感病基因池之间具有多态性；

(5)遗传分析：F₂代分离群体的251个单株中抗病的植株有66株，感病的植株有185株，经卡平方检验，抗(R)、感(S)分离符合1∶3的单基因遗传分离理论比率，表明国际稻‘BJ1’携带的抗水稻细菌性条斑病基因为隐性主效基因，该基因位于10号染色体上，与SSR标记RM258紧密连锁。

4.根据权利要求3所述的分子标记，其特征在于，在步骤(4)中，PCR反应采用20μL反应体系，含10×PCR Buffer(含MgCl₂)2.0μL、2.5mmol·L^–1dNTPs 2.0μL、dd H₂O 11.9μL、10μmol·L^–1引物2.0μL、模板DNA 2.0μL、5U·μL^–1 Taq DNA聚合酶0.1μL；

PCR反应程序：95℃预变性5min；95℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸5min，4℃保存；

PCR产物经8％非变性丙烯酰胺凝胶电泳分离，快速银染后观察读图分析。