CN107058304A - 水稻抗细条病基因bls2的snp标记定位及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，具体公开了一种水稻抗细条病基因BLS2的SNP标记定位及其应用。BLS2基因经过单核苷酸多态性标记定位该基因位于6号染色体上，序列如SEQ ID NO：1。标记定位的具体步骤是经过多亲本高级世代互交系群体的构建；基因组测序；生物信息分析；亲本纯合差异SNP位点的筛选；根据筛选得到的在亲本间存在差异的纯合SNP位点的位置信息，对两个BSA池基因进行频率分析，得到与抗病基因有关的位点。该基因可在选育抗水稻抗细菌性条斑病水稻品种或筛选抗性基因资源中的应用。
Description
【技术领域】
本发明涉及分子生物学领域，特别涉及水稻抗细条病基因BLS2的SNP标记定位及其应用。
【背景技术】
细菌性条斑病(简称细条病)由病原菌Xanthomonas oryze pv.Oryzicola(Xoc)引起，是一种重要的水稻病害。该病害在爆发流行年份可导致水稻产量损失32％。栽培措施和农药使用是防治细条病的有效办法。但是，利用抗性资源培育抗性品种是防治该病害最为经济有效的办法。遗传分析表明存在主效基因和数量性状位点(Quantitativetraitlocus,QTL)等两种不同类型的抗性资源。目前关于抗细菌性条斑病主效基因分子标记应用研究尚很少见。
稻种中抗细条病资源较丰富，但多数抗源主要来自热带地区,且大都是一些古老的地方品种,农艺性状比较差,因此，单靠常规育种方法改良，周期长，资源利用效率低。此外，对抗源开发力度不足，也是造成抗细条病育种进展缓慢的原因之一。细条病抗源中，主效基因控制的抗性是一种重要的抗源类型。关于抗细条病主效基因的研究，大多集中在抗源筛选和抗性遗传分析等方面,而对抗病基因的分子遗传机理研究较少,特别是有关基因的定位等分子基础研究尚不深入。因此，加强抗细条病主效基因的发掘利用，从分子水平定位抗病主效基因，有助于利用分子标记辅助育种、转基因等分子生物技术来提高这一种重要资源的利用效率。
【发明内容】
本发明的发明目的在于：针对上述存在的问题，有必要提供水稻抗细条病基因BLS2的SNP标记定位及其应用，加强抗细条病主效基因的发掘利用，从分子水平定位抗病主效基因，有助于利用分子标记辅助育种、转基因等分子生物技术来提高这一种重要资源的利用效率。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种水稻抗细条病基因BLS2的单核苷酸多态性(SNP)标记定位，所述水稻抗细条病基因BLS2的序列如SEQ ID NO：1；所述水稻抗细条病基因BLS2经过单核苷酸多态性(SNP)标记定位该基因位于6号染色体上。
本发明还提供水稻抗细条病基因BLS2的SNP标记定位的具体步骤如下：
(1)多亲本高级世代互交系群体的构建：在构建群体前，对3个亲本进行抗性鉴定，结果为：普通野生稻CY1抗病、9311和998R感病；将感病品种9311作为母本，抗病普通野生稻CY1作为父本，杂种F1与感病998R杂交，F1连续10代自交，获得多亲本高级世代互交系S10；对多亲本高级世代互交系群体进行抗性鉴定，培育获得极端抗病单株、感病单株；
(2)基因组测序：将抗性鉴定获得的30个极端抗病单株，混合构建抗病池N915进行测序；获得30个极端感病单株，混合构建感病池N908进行测序；
(3)生物信息分析：将测序得到的序列与参考基因组序列进行比对，根据比对结果，计算出相对于参考基因组的测序深度和覆盖度，所测基因组的SNPs、InDels和结构变异SVs分别用SOAPsnp，SOAPindel和SOAPsv软件进行检测，在感病品种9311检测到5271个SNP，在感病品种998R检测到7150个SNP，在抗病普通野生稻CY1有11484个SNP，在感病池N908有137952个SNP，在抗病池N915有105475个SNP；
(4)亲本纯合差异SNP位点的筛选：分别使用标准分析结果中两个亲本CY1和9311、CY1和998R的一致性序列对CY1和9311、CY1和998R的SNP位点进行基因分型；
(5)根据筛选得到的在亲本间存在差异的纯合SNP位点的位置信息，对抗性池N915和感病池N908基因进行频率分析，得到与抗病基因有关的位点即可。
在本发明中，作为进一步说明，在步骤(5)中，所述得到与抗病基因有关的位点是染色体10号上有2个位点，染色体1号上有2个位点，染色体6号上有1个位点，其他染色体上没有位点。
在本发明中，作为进一步说明，以同一染色体位置的SNP在抗病亲本CY1和抗病池N915是一致的，该位置的SNP在感病品种9311、感病品种998R和感病池中是一致的，该位置的SNP在抗病亲本和抗病池与感病亲本和感病池间存在差异为判断依据，得到所述染色体1号的2个突变位点(差异SNP)所在的区域均不含有基因，所述染色体10号的2个位点突变(差异SNP)是无义突变，所述染色体6号的突变(差异SNP)发生在LOC_Os06g07600.1位点的5’端的非翻译区。
在本发明中，作为进一步说明，所述LOC_Os06g07600.1位点的5’非翻译区的第3678831个碱基由C突变为T，造成半乳糖基转移酶所控制的合成途径发生改变，从而产生抗性。
如上所述的SNP标记定位在选育抗水稻抗细菌性条斑病水稻品种或筛选抗性基因资源中的应用。
如上所述的SNP标记定位在检测抗细条病普通野生稻CY1及其衍生品种(系)中是否含有抗细条病基因BLS2应用
综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
(1)获得含有BLS2基因的抗细条病水稻品种；本发明的抗细条病基因与目前报道的位于水稻第6号染色体上的细条病抗性基因都不同；首次定位在染色体6号LOC_Os06g07600.1位点的5’端的非翻译区。
(2)大大提高抗细条病水稻的选择效率。
(3)本发明分子标记可以有效检测抗细条病普通野生稻CY1及其衍生品种(系)中是否含有抗细条病基因BLS2。
对本发明更详细描述可参见实例部分。
【附图说明】
图1—多亲本高级世代互交系(Multiparent Advanced Generation Inter-Cross,MAGIC)的构建图；
附图说明：图中CY1是抗病普通野生稻、9311和998R是感病水稻。
图2—5-UTR+CDNA对比图；
图3—续图2第2部分；
图4—续图2第3部分；
图5—续图2第4部分；
图6—续图2第5部分；
附图说明：图中，resistance gene 5-utr+cdna代表抗病基因，基因序列为SEQ IDNO：1；susceptible gene 5-utr+cdna代表感病基因，基因序列为SEQ ID NO：2。
【具体实施方式】
实施例1：
1.多亲本高级世代互交系(Multiparent Advanced Generation Inter-Cross,MAGIC)的构建
在构建群体前，对3个亲本进行抗性鉴定，结果为：普通野生稻CY1抗病、9311和998R感病；感病9311作为母本，抗病普通野生稻CY1作为父本，杂种F1与感病998R杂交，F1连续10代自交，获得多亲本高级世代互交系(Multiparent Advanced Generation Inter-Cross,MAGIC)S10，对获得多亲本高级世代互交系(MAGIC)群体进行抗性鉴定，获得30个极端抗病单株，混合构建抗病池(N915)进行测序；获得30个极端感病单株，混合构建感病池(N908)进行测序。
2.抗性鉴定
在水稻分蘖期，采用广泛分布于广西的优势致病型细菌性条斑病代表菌株JZ28(Ⅲ型)接种。菌株在NA培养基上培养48h后，用无菌水配成3×108cfu/ml悬浮液。采用针刺法进行接种：把2根针距为0.8cm的大头针固定在橡皮上灭菌备用；用直径9cm、厚度2cm的无菌海绵碟吸足菌液后置于培养皿内；选择生长一致的完全展开叶片，将叶片中部平置于海绵碟上，用插入橡皮的大头针刺透稻叶后(稻叶中脉间隔2个针孔)，轻摁压海绵挤出菌液每株接菌3张叶片，每叶6个针刺点，期间注意补充菌液。接种20天后，测量病斑长度，按照以下标准对病情进行分级：0级，免疫(I)，伤口无症状或仅有褐点；1级，高抗(HR)，病斑长0.1-0.5cm；3级，抗(R)，病斑长0.6-1.0cm；5级，中抗(MR)，病斑长1.1-1.5cm；7级，感病(S)，病斑长1.6-2.5cm；9级，高感(HS)，病斑长度大于2.5cm。抗性鉴定结果表明：普通野生稻CY1抗细条病，平均抗病指数为0.8；9311和998R感细条病，平均抗性指数为9.0；30个极端抗病单株均为高抗，病斑长度小于0.5cm；30个极端感病单株均为高感，病斑长度大于2.5cm。
3.技术路线
利用多亲本高级世代互交系(MAGIC)，通过下一代测序技术(NGS)进行基因组重测序，采用采用混合分组分析法(bulked.segregant analysis,BSA)对细条病基因进行定位，基因组测序BSA的具体分析方案如下表。
表1 基因组测序BSA的分析方案
注：0和1表示基因型的不同，1表型阳性位点，0表示阴性位点
4.基因组测序
提取每个样品个体的基因组DNA并随即打断，电泳回收所需长度的DNA片段，并加上接头进cluster制备，最后再Xten上机测序，进行PE151测序。9311有4,150,268,700bp短序列，CY1有4,175,938,800bp，感池有12,075,173,700bp，抗池有11,994,082,200bp，998R有4,208,926,500bp。
5.生物信息分析
运用SOAP2软件(http://soap.genomics.org.cn/soapaligner.html)将测序得到的reads与参考基因组序列进行比对。根据比对结果，计算出相对于参考基因组的测序深度和覆盖度。所测基因组的SNPs、InDels和结构变异SVs分别用SOAPsnp(http://soap.genomics.org.cn/soapsnp.html)，SOAPindel和SOAPsv软件进行检测。当有参考基因组的注释文件，可以分别在SNP、InDel和SV的数据集的基础上进行注释。9311检测到5271个SNP，998R检测到7150个SNP，CY1有11484个SNP，感病池(N908)有137952个SNP，抗病池(N915)有105475个SNP。
6.亲本纯合差异SNP位点的筛选
分别使用标准分析结果中两个亲本CY1和9311、CY1和998R的一致性序列(cns文件)对其SNP位点进行基因分型，条件：1.质量值大于等于20，否则记为“-”(即缺失)；2.位点总深度需大于等于5，否则标记为缺失(即缺失)；3.过滤掉亲本中含有“-”(即缺失)的位点。然后再分别根据两个亲本(CY1和9311)、(CY1和998R)的基因分型文件，筛选在两个亲本间差异且纯合SNP位点，CY1和9311为亲本结果分别从染色体Chr1～Chr12分别筛选到120,75,95,62,58,46,45,63,32,61,54,23纯合差异的SNP位点，总计743个，CY1和998R为亲本结果分别充染色体Chr1～Chr12中筛到93,65,77,60,49,38,39,51,38,44,52,25,纯合差异SNP位点，总计631个。然后将二者的cns信息进行交集，交集Chr1～Chr12筛选到的SNP分别是19,11,16,12,10,7,7,8,8,9,7,1。
7.两个BSA池基因频率分析
7.1.分别在两个BSA池(抗性池N915和感病池N908)的一致性序列(cns文件)中提取两个极端池对应位点的cns信息。
7.2将上步骤从抗性池N915和感病池N908中所提取得到的cns文件的第三列(即参考基因组序列)替换为感病亲本的碱基序列信息。
7.3以感病亲本为参考基因型，分别对抗性池N915和感病池N908进行基因型频率index分析，index值的大小反应了该标记位点与参考亲本基因型的差异程度。
7.4若该标记位点的基因型与参考基因型相同，则SNPindex值记为0。若该标记位点与参考亲本基因型的差异程度越大，则SNPindex值越接近于1。
7.5在亲本组为9311和CY1组中，抗性池中N915和感病池N908在Chr1～Chr12中的位点为36,14,18,14,18,15,13,16,24,23,17，在亲本组为998R和CY1的组中，抗性池N915和感病池N908在Chr1-Ch12上的位点为33,12,14,14,10,10,10,18,11,14,14,14,15，取交集抗病池N915和感病池N908在染色体Chr1～Chr12上的位点为19,11,16,12,10,7,7,8,8,9,7,1，然后分别过滤掉在两个极端池中SNPindex都小于0.3的标记位点，结果发现与抗病基因有关的位点是：Ch10上有2个位点，Chr1上有2个位点，Chr6上只有一个位点，其他染色体上没有位点。
表2 碱基位置参照MSU Rice Genome Annotation(Osa1)Release 7
Chr1的2个突变位点所在的区域均不含有基因；Chr10的2个位点突变是无义突变；Chr6的突变发生在LOC_Os06g07600.1位点的5’端的非翻译区。
LOC_Os06g07600编码半乳糖基转移酶,参与棉子糖的合成，该低聚糖在植物抗逆机制中发挥重要作用。我们研究表明LOC_Os06g07600.1位点的5’非翻译区第3678831个碱基由C突变为T，造成半乳糖基转移酶所控制的合成途径发生改变，从而产生抗性，我们把LOC_Os06g07600编码的基因命名为抗细条病基因BLS2。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明的保护范围应以所附权利要求为准。
。
<110> 广西农业科学院水稻研究所
<120> 水稻抗细条病基因BLS2的SNP标记定位及其应用
<130> 2017
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 2729
<212> DNA
<213> 水稻种属
<400> 1
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<212> DNA
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ggtgtcgtcg gggttctggt ggtcggtgcc gacggactgc cagccgtcgt cgatgatgac 1620
gaacttgggc ggcgcgccac cggcggtgag gctgcggagg ccggcctcga cgccctcctg 1680
ggtgacgtcc tggtagaagg cgtcccaggt gcaccacccg aagtagtcga cgatgcccgg 1740
gagcttcttc tcggcgcgga tgcggaacgt cttgaggcag gacttggcgg cggcgacggc 1800
gccggcgatg gcggcgaagg ggtcggagtc cgcggcgccg acgaagagcg cgcggtcgaa 1860
cgacgcggcg cgcgtgcccg cgtcgccgct ctcgacgcag agctggagct cgtcgccgcc 1920
cgcgccgccc ccctggaggc tggcccggaa cgcgccctcg acgagcggga ggaagacgag 1980
gtacgacgcg tcacccccgc cgccatcgac gccggccttg gactccacca gcaggaactg 2040
cgtctcgtgc ggcacgtcgc cgcccttctc ccccatcctc tgcgccatcc accacagctt 2100
gaaccggaag cacgccatga atcgcacccc cctcatcgcg ccgagggaga cgacgtggcg 2160
ggatgccggc tcggcgaagt ctccgccgag gaagacccca tcgacgggcc ccgccgccgc 2220
ggcggacgac gcacgcaccg cctccggcac cccggacagc accgtccgcc catggaccga 2280
gagctcccca ccagcgacct tcaccgacga cgtgaccgtc atctccgacg acgacgcggc 2340
gcacctgctc cgcctctggc accggcgaga agaggagggg agaggggcgg atgcgatggg 2400
gggaaatgcg cgggaaggga aggtatatat ggtgcgcggg cgcgggagaa ggggagagga 2460
ggaggcgggc ggcgtggcgc gggtggtgga gatcatgagc agccttcgcg ccaccggcac 2520
ggacattggc gggggtgatt ggcggcggcg gcggcggctg gatcggatcg ggttggttgg 2580
tgactggcct gtgactctga cactgcgcgc gtgccgcgtg cgtgtgcagg attgggttgg 2640
ctggtcgggt tgagctgttt gggttggacg agtcgtcacg tgagtgaggt gagtggtggt 2700
gtggtgggcg aacacgcgac gcgacgcat 2729
Claims (7)
1.一种水稻抗细条病基因BLS2的SNP标记定位，其特征在于，所述水稻抗细条病基因BLS2的序列如SEQ ID NO：1；所述水稻抗细条病基因BLS2经过SNP标记定位该基因位于6号染色体上。
2.根据权利要求1所述的水稻抗细条病基因BLS2的SNP标记定位，其特征在于，其标记定位的具体步骤为：
(1)多亲本高级世代互交系群体的构建：在构建群体前，对3个亲本进行抗性鉴定，结果为：普通野生稻CY1抗病，9311和998R感病；将感病品种9311作为母本，抗病普通野生稻CY1作为父本，杂种F1与感病998R杂交，F1连续10代自交，获得多亲本高级世代互交系S10；对多亲本高级世代互交系群体进行抗性鉴定，培育获得极端抗病单株、感病单株；
(2)基因组测序：将抗性鉴定获得的30个极端抗病单株，混合构建抗病池N915进行测序；获得30个极端感病单株，混合构建感病池N908进行测序；
(3)生物信息分析：将测序得到的序列与参考基因组序列进行比对，根据比对结果，计算出相对于参考基因组的测序深度和覆盖度，所测基因组的SNPs、InDels和结构变异SVs分别用SOAPsnp，SOAPindel和SOAPsv软件进行检测，在感病品种9311检测到5271个SNP，在感病品种998R检测到7150个SNP，在抗病普通野生稻CY1有11484个SNP，在感病池N908有137952个SNP，在抗病池N915有105475个SNP；
(4)亲本纯合差异SNP位点的筛选：分别使用标准分析结果中两个亲本CY1和9311、CY1和998R的一致性序列对CY1和9311、CY1和998R的SNP位点进行基因分型；
(5)根据筛选得到的在亲本间存在差异的纯合SNP位点的位置信息，对抗性池N915和感病池N908基因进行频率分析，得到与抗病基因有关的位点。
3.根据权利要求2所述水稻抗细条病基因BLS2的SNP标记定位，其特征在于，在步骤(5)中，所述得到与抗病基因有关的位点是染色体10号上有2个位点，染色体1号上有2个位点，染色体6号上有1个位点，其他染色体上没有位点。
4.根据权利要求3所述水稻抗细条病基因BLS2的SNP标记定位，其特征在于，以同一染色体位置的SNP在抗病亲本CY1和抗病池N915是一致的，该位置的SNP在感病品种9311、感病品种998R和感病池中是一致的，该位置的SNP在抗病亲本和抗病池与感病亲本和感病池间存在差异为判断依据，得到所述染色体1号的2个突变位点(差异SNP)所在的区域均不含有基因，所述染色体10号的2个位点突变(差异SNP)是无义突变，所述染色体6号的突变(差异SNP)发生在LOC_Os06g07600.1位点的5’端的非翻译区。
5.根据权利要求4所述水稻抗细条病基因BLS2的SNP标记定位，其特征在于，所述LOC_Os06g07600.1位点的5’非翻译区的第3678831个碱基由C突变为T，造成半乳糖基转移酶所控制的合成途径发生改变，从而产生抗性。
6.根据权利要求1所述的SNP标记定位在选育抗水稻抗细菌性条斑病水稻品种或筛选抗性基因资源中的应用。
7.根据权利要求1所述的SNP标记定位在检测抗细条病普通野生稻CY1及其衍生品种(系)中是否含有抗细条病基因BLS2应用。
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