CN103014039A - 能识别稻黄单胞菌蛋白激发子的植物基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种能识别稻黄单胞菌蛋白激发子的植物基因，包括水稻HIP1基因和烟草HIP1基因，水稻HIP1基因的序列如SEQ ID NO.1所示，烟草HIP1基因的序列如SEQ ID NO.3所示，其中的水稻HIP1基因编码754个氨基酸，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；烟草HIP1基因编码510个氨基酸，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。上述水稻HIP1基因或烟草HIP1基因及其蛋白质在植物中过表达后，增强了植物对病毒病和细菌病害的抗病性，可作为抗病育种基因资源，克服病原菌进化导致的作物抗性丧失，获得持久抗性转基因作物新品种。

Description

能识别稻黄单胞菌蛋白激发子的植物基因及其应用

技术领域

本发明涉及一种生物技术领域的基因，特别涉及一种能识别稻黄单胞菌蛋白激发子的植物基因，该基因在多种植物中存在，所编码的蛋白能与稻黄单胞菌的Harpin蛋白Hpa1互作，在植物中过量表达增强了植物的抗病性。

背景技术

植物病原菌能够侵染寄主植物，在侵染点附近引起症状，是克服了寄主植物的免疫系统，成功地从寄主植株获得了所需的营养物质。在病原菌与寄主植物的识别过程中，双方的多种基因和信号传导机制共同参与。植物病原细菌的III型分泌系统是病原菌能够侵染和建立寄生关系的关键致病因子，它由近30个基因形成的基因簇，经过一定的表达和调控机制组装成一个hrppilus，将细菌合成的效应蛋白分泌到细胞外，注射到寄主植物细胞，引发寄主植物的抗病或感病反应。通过III型系统分泌并注射进入植物细胞的效应蛋白分为两大类：一类是起到转录激活作用，通过特定的识别密码，特异性地结合到寄主植物启动子区域，激活下游基因的表达。另一类效应蛋白所起的功能是干扰前种识别。因此，植物病原细菌在植物上引发的是感病还是抗病症状，取决于侵染过程中分泌蛋白所诱导的植物反应是感病反应更强还是抗病反应更强。

Harpin蛋白是植物病原细菌的蛋白激发子，一般由植物病原细菌的一个III型分泌系统基因编码，超量的Harpin蛋白能够在非寄主指示植物上诱导细胞快速死亡，引起过敏反应的产生。目前，已经从植物病原细菌中发现了至少5中Harpin蛋白，其中包括来自稻黄单胞菌的Hpa1蛋白。这些Harpin蛋白虽然都可以从III型系统分泌到胞外，但它们的氨酸序列不尽相同，揭示非寄主指示植物对它们的识别存在差异。由Harpin蛋白诱导的细胞快速死亡就是植物产生的一种抗病反应。从植物中筛选和克隆Harpin蛋白的互作或识别蛋白，一方面有助于解析Harpin蛋白诱导植物抗病反应的作用机理，另一方面，更能有助于我们发掘和利用来源于植物源的抗性基因。通过一定的分子设计，在植物中改进Harpin互作或识别蛋白的表达水平，可以有效的诱导植物抗病反应信号。该途径最大的优点在于避开了病原菌侵染时，细菌效应分子在识别阶段对抗病反应的干扰或抑制，而直接从下游启动植物的抗病信号，不易被病原生物的遗传进化所克服，导致抗性丧失。

发明内容

本发明的目的，就是为了提供一种能识别稻黄单胞菌蛋白激发子的植物基因及其应用。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：一种能识别稻黄单胞菌蛋白激发子的植物基因，包括水稻HIP1基因和烟草HIP1基因，水稻HIP1基因的序列如SEQ ID NO.1所示，烟草HIP1基因的序列如SEQ ID NO.3所示。

上述水稻HIP1基因编码754个氨基酸，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述烟草HIP1基因编码510个氨基酸，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

上述能识别稻黄单胞菌蛋白激发子的植物基因的应用是，所述水稻HIP1基因或烟草HIP1基因及其蛋白质在植物中过表达后，增强了植物对病毒病和细菌病害的抗病性，可作为抗病育种基因资源，克服病原菌进化导致的作物抗性丧失，获得持久抗性转基因作物新品种。

本发明涉及的是来自水稻和烟草植物的HIP1基因，能够识别稻黄单胞菌激发子Hpa1，并增强植物的抗病性。来自水稻的HIP1基因序列为SEQ ID NO.1，序列长度为2262bp，编码754个氨基酸，氨基酸序列为SEQ ID NO.2；蛋白质等电点为5.91，呈碱性，分子量为81.53KD。来自烟草的HIP1基因序列为SEQ ID NO.3，序列长度为1530bp，编码510个氨基酸，氨基酸序列为SEQ ID NO.4；蛋白质等电点为5.53，呈碱性，分子量为65.92KD。上述HIP1基因的产物HIP1蛋白能够在病原菌侵染时增加合成，增强植物的抗病反应，加速烟草叶片侵染点附近细胞的快速衰老和死亡。

本发明的HIP1基因由以下方法获得：

利用酵母双杂交技术，以稻黄单胞菌的蛋白激发子Hpa1为诱饵，从水稻cDNA文库中筛选互作蛋白，得到了4个cDNA片段，经测序确认为同一个基因片段，虽然大小不同，但相互有交叉覆盖。在GenBank数据库中进行BLAST分析，与已经登录的日本晴水稻数据库比对，与α-半乳糖基转移酶编码基因的cDNA具有100％的一致性，用特异性引物从水稻中扩增了HIP1基因的全长序列。根据序列的保守性，设计简并引物从烟草中扩增出同源基因的片段，用3’和5’RACE方法得到烟草HIP1基因的全长。将HIP1基因克隆到病毒载体2mDNA1上，利用病毒介导的基因沉默技术(VIGS)在非寄主植物烟草上瞬时表达，植株对Hpa1蛋白的敏感性降低，产生过敏反应的最低有效浓度增加了3倍，同时，生长优势明显，株高和叶片大小增加明显。通过接种实验，HIP1过表达植物的抗病能力最强。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明获得了烟草和水稻植物中识别稻黄单胞菌Hpa1蛋白的HIP1的编码序列，对植物的生长发育和抗病性具有重要作用，为运用分子遗传学方法改良作物的生长和抗病性状提供了抗性资源。所获得的基因来源于植物本身，可以获得稳定的抗性遗传，克服了病原菌致病效应分子进化所导致的抗性丧失，具有广泛的应用前景。

本发明中所涉及的水稻和烟草中的HIP1基因与水稻条斑病菌hpa1基因的互作，以及在烟草上的功能分析为首次报道。水稻HIP1基因的序列已在文献《Lee RH，Lin MC and Chen SC.A novel alkaline alpha-galactosidase gene is involved in rice leafsenescence.Plant Mol Biol 55(2)：281-295(2004)》中公开，但烟草中的序列没有公开。序列分析表明，该基因在多种植物中都有存在。涉及玉米的序列在《AlexandrovNN，Brover VV，Freidin S，Troukhan ME，Tatarinova TV，Zhang H，Swaller TJ，Lu YP，Bouck J，Flavell RB and Feldmann KA.Insights into corn genes derived fromlarge-scale cDNA sequencing.Plant Mol Biol 69：179-194(2009)》中公开。涉及拟南芥的序列在《Seki M，Carninci P，Nishiyama Y，Hayashizaki Y and Shinozaki K.High-efficiency cloning of Arabidopsis full-length cDNA by biotinylated CAP trapper.Plant J 15：707-720.(1998)》中公开。其它植物的序列，如番茄(NM001247834.1)，蓖麻(XM002530577.1)，黄瓜(DQ157703.2)，葡萄(EU543561.1)，大麦(AK373761.1)，番杏(AB434769.1)，豌豆(EF433424.1)，莲花(AK339754.1)，盐芥(AK352828.1)和毛果杨(XM002308921.1)均可以在NCBI数据库中查询到(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。

利用病毒载2mDNA1在烟草植物中快速验证HIP1基因功能，是常规的实验技术手段，该方法已经在(《Huang，C.J.，Xie，Y.and Zhou，X.P.(2009)Efficientvirus-induced gene silencing in plants using a modified geminivirus DNA 1component.Plant Biotechnology Journal.7：254-265》)中公开。

附图说明

图1显示HIP1与水稻条斑病菌Hpa1的互作；

图2显示HIP1沉默促进烟草植株生长；

图3显示HIP1沉默降低烟草对Hpa1的敏感性；

图4显示HIP1过表达烟草增强了对TMV和野火疫病的抗性。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York：ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

1、HIP1基因的克隆

本实施例克隆水稻和烟草中HIP1基因的全长，通过酵母双杂交技术，验证与Hpa1的互作。首先以水稻条斑病菌Hpa1为诱饵，从接种条斑菌的水稻cDNA文库中筛选互作因子，共得到4个克隆，经测序确定这4个片段都来源于同一个基因HIP1。在GenBank数据库中，HIP1基因对应的是Osh69，产物是β-半乳糖苷酶。以水稻cDNA为模板，设计引物rHIP1-F(SEQ ID NO.5)：5’-aaaggtaccatgacggtgggagccggggtg-3’和rHIP1-R(SEQ ID NO.6)：5’-tctagagcctggtgatacttccttgccagaa-3’，进行PCR扩增，PCR扩增条件为：95℃/5min+(94℃/45sec+55℃/30sec+72℃/1min30sec)×38循环+72℃/10min。PCR产物经KpnI和SmaI酶切后，连接到pGADT-7载体中，获得pArHIP1，与表达hpa1的pGBKT-7载体构建进行酵母双杂交，确定全长HIP1基因与hpa1的互作(参见图1)。

水稻HIP1基因同玉米、番茄和拟南芥等其它植物中的同源基因在有些区域序列保守性很高，有些区域的序列差异较大。我们在特别保守的区域设计了简并引物sHIP1-F(SEQ ID NO.7)：5’-tggtggatgacncagaggat-3’和sHIP1-R(SEQ ID NO.8)：5’-actccrccccagtawccgg-3’，以烟草cDNA为模版，进行PCR扩增，获得了一个631bp大小的HIP1基因片段。PCR扩增条件为：95℃/5min+(94℃/45sec+53℃/45sec+72℃/2min)×38循环+72℃/10min。根据631bp序列设计引物GSP1-R(SEQID NO.9)：5’-ccaggcatatttctaactcgtcgt-3’和GSP2-R(SEQ ID NO.10)：5’-tcccttgaagaacagccctaaa-3’，按照TaKaRa 5’-RACE试剂盒的操作手册，扩增烟草HIP1基因的5，端序列，PCR扩增条件同上。同时设计引物GSP3-F(SEQ ID NO.11)：5’-aggctaactcatatcaaagagaacc-3’和GSP4-F(SEQ ID NO.12)：5’-aatatcaaagaccaacacaat-3’进行3-RACE实验，PCR扩增条件同上。所得到的PCR产物分别连接在pMD18-T载体上，进行测序验证，得到烟草HIP1基因的两端序列。根据测序结果设计引物nHIP1-F(SEQ ID NO.13)：5’-aagattcatagcttatgcg-3’和nHIP1-R(SEQ ID NO.14)：5’-aactcgagctaccagtgcaacaca-3’，以烟草cDNA为模板进行PCR扩增，PCR产物连接pMD18-T载体进行测序验证，得到烟草中HIP1基因的全长总计1530bp，编码510个氨基酸，与水稻HIP1的序列有75％的一致性。将烟草HIP1全长克隆到载体pGADT-7，通过酵母双杂交证明全长cDNA与hpa1的互作(参见图1)。

2、HIP1基因对植物生长发育的影响

本实例通过病毒介导的方法获得HIP1基因沉默烟草植株。设计引物YCI-F(SEQ ID NO.15)：5’-aaggatccccaatttttgattgtggaa-3’和YCI-R(SEQ ID NO.16)：5’-tttctagaaaccagttcaacatgtctg-3’进行PCR反应，扩增条件为：95℃/5min+(94℃/45sec+53℃/45sec+72℃/20sec)×32循环+72℃/10min。回收PCR产物，经过XbaI和BamHI限制性酶切连接到2mDNA1载体上。借助农杆菌GV3101的作用，在烟草Nicotiana Benthamiana上瞬时表达HIP 1。转化烟草经过20-30days的温室培养(25℃，光照/黑暗，16h/12h)后，与空载体对照相比，叶片宽大加厚且颜色加深，茎秆粗壮，节间距增加，根系发达(参见图2)。转基因植株延迟进入开花期，生长周期增长，说明该基因对植物的生长发育有重要作用，对增加作物的生物产量也有一定的应用前景。

在水稻中的HIP1基因在影响植物生长发育上的功能已经在(《Lee，R.H.，Hsu，J.H.，Huang，H.J.，Lo，S.F.，Chen，S.H.(2009)Alkaline alpha-galactosidase degradesthylakoid membranes in the chloroplast during leaf senescence in rice.New Phytol184(3)：596-606》)中公开。

3、HIP1沉默烟草对Hpa1蛋白的敏感性降低

本实例通过抑制HIP1在烟草中的表达水平后，检测烟草对Hpa1的敏感性。设计引物Hpa1.F(SEQ ID NO.17)：5′-tcgggatccatgaattctttgaacacaca-3′和Hpa1.R(SEQ ID NO.18)：5′-acgaagcttctgcatcgatccgctgtcgttc-3′，以水稻条斑病菌的基因组DNA为模板，扩增hpa1基因，构建到原核表达载体pET30a(+)中，在大肠杆菌BL21中大量表达Hpa1蛋白。经Ni-NTA柱分离纯化Hpa1蛋白，用PBS稀释后，形成1.0，0.5，0.4，0.3，0.2，0.15，0.1和0.05mg/mL8个浓度梯度。在HIP1沉默烟草和空载体对照烟草上注射，观察过敏反应的产生。注射后24小时，0.1mg/ml浓度的Hpa1就可以在对照烟草上激发过敏反应的产生，而在HIP1沉默烟草上激发过敏反应的最低浓度要达到0.3mg/ml，所需Hpa1蛋白的量增加了3倍(参见图3)。HIP1沉默烟草对Harpin蛋白的反应敏感性大幅度降低，说明烟草对Hpa1蛋白的识别能力下降，从而消弱了由其激发的过敏反应产生的速度。

4、HIP1基因过表达烟草增强了对烟草花叶病毒(TMV)和野火疫病菌的抗性

本实例通过对烟草花叶病毒和野火疫病抗性测定，说明HIP1在植物抗病性方面的功能。先在双元载体pCAMBIA1310中的多克隆位点引入35S启动子，再将HIP1构建到该启动子下游，所用的引物为nHIPOE.F(SEQ IDNO.19)：5′-tgcgaattcatgagcttgcatgcctgcaggtcga-3′和nHIPOE.R(SEQ ID NO.20)：5′-tgcgaattctacacagtgcaacacagatta-3′。将HIP1克隆到双元载体pCAMBIA1301的EcoRI多克隆位点中，转化进入农杆菌EHA105，以空载体pCAMBIA1301为对照，进行烟草转基因，得到T1代转基因烟草。将0.62mg/mL的TMV通过摩擦接种的方法接种烟草，每次实验接种3株烟草，每株烟草接3张重复3叶片，一周后观察病斑数并进行拍照(参见图4A)。烟草野火疫病菌的接种方式也是采用摩擦接种方法(参见图4B)。约一周后，观察烟草花叶病毒和野火疫病的病斑情况。结果显示，HIP1过表达后能增强对烟草花叶病毒(TMV)和野火疫病的抗病性，过表达烟草的上形成花叶病毒症状斑点明显少于空载体对照。而野火疫病菌在过表达烟草上几乎不发病，说明HIP1在烟草中的过表达增强了植物对TMV和野火疫病的抗性，在植物抗病性中起到非常重要的作用。

关于RS105参见：陈功友、潘小玫、王金生，水稻白叶枯病菌(Xanthomonasoryzae pv.oryzae)化学诱变hrp基因突变体及相关性状的研究，植物病理学报，2001，31(3)：199～207；

关于病毒介导的基因沉默(VIGS)的操作方法参见：Huang CJ，Xie Y and ZhouXP.Efficient virus-induced gene silencing in plants using a modified geminivirus DNA1component.Plant Biotechnol J，2009，7：254-265；

关于基因重组分子操作参见：Sambrook J，Russell DW，Molelcular cloning，ALaboratory Manual(3rd ed)，2001，Spting Harbor Laboratory Press

关于RNA的提取及eDNA的合成方法参见：Li YR，Zou HS，Che YZ，Cui YP，Guo W，Zou LF，Chatterjee S，Biddle EM，Yang CH and Chen GY.A novel regulatoryrole of HrpD6 in regulating hrp-hrc-hpa genes in Xanthomonas oryzae pv.oryzicola.Mol Plant Microbe Interact，2011，24(9)：1086-1101.

关于RACE的方法参见：TaKaRa 5’-RACE和3’-RACE试剂盒的操作手册；

关于克隆载体pMD18-T和表达载体pET30a(+)参见：TAKARA载体说明书和Nerk基因表达载体说明；

关于蛋白原核表达和纯化参见：Nerk基因大肠杆菌表达系统说明书。

序列表

<110>上海交通大学

<120>能识别稻黄单胞菌蛋白激发子的植物基因及其应用

<160>20

<170>PatentIn version

<210>1

<211>2262

<212>DNA

<213>Oryza sativa

<221>CDS

<222>(1)..(2262)

<400>1

atgacggtgg gagccggggt ggcggtgcag gacggcggcc tggtggcgct gggcgccacg   60

gtgctgacgg aggtgcgcga caatgtgctc ctgacgccgg ccgccggcgc cggcatgacg   120

agcggcacgt tcgtcggagt ccgctccgcc accgccggca gccgcagcgt cttccccgtc   180

gggaagctca ggggattgcg gttcatctgc acgttccggt ttaagatgtg gtggatgacg   240

cagaggatgg ggacgtcagg ccgcgacatc cccttcgaga cgcagttcct cctcgtcgag   300

gccgccgacg ccgacggatc acacctcgcc ggcgacggcg ccgccgcggt gtacaccgtg   360

ttcctcccga tcttggaggg accgttccga gctgtgcttc aggggaactc tgatgatgag   420

ctcgagattt gcctcgagag tggtgaccca gctgtggaat cattcgaagg cacgcatctg   480

gttttcgtcg gtgccggatc ggatccattc gaagtcatca caaattctgt caaggctgtt   540

gagaggcact tgcagacgtt tactcacagg gaaaagaaga agatgccaga catgctaaac   600

tggtttggtt ggtgcacatg ggatgcgttt tatactgatg ttacttcaga aggagtaatg   660

gaaggattac agagtctagg aaaaggtgga actggcccaa aatttgtgat aattgatgat   720

ggatggcaat cagttagtat ggatcctgca ggaattgcat cattagctga taactcagcc   780

aactttgcaa acaggttgac tcacataaag gagaaccaca aatttcagct aaacgggagg   840

aaaggtcaca gggaagagaa tccggcaaat ggccttgcac acattgtcaa tgaaattaag   900

ggcaaacatc agctgaagta tgtttatgtg tggcacgcga tcaccggata ctggggtgga   960

gtaaggcctg gtgctgatgg aatggagcac tacgaatcga agatgcagta cccggtctca   1020

tcaccgggag ttcagaagaa cgagccatgt gatgctctga acagcataac caccaacggc   1080

cttggccttg tgaaccctga cagagtgttc agcttctaca acgagctaca cgcctacctt   1140

gcatctgctg ggatcgatgg agtgaaagta gatgtgcaga acattcttga gacactgggt   1200

gctggccatg gtggaagagt gcttctggca aggaagtatc accaggctct agaagcttcc   1260

atcgcccgga acttccgcga caacggcatc atatgctgca tgagccacaa cacggataac   1320

ttgtacagtt ctaagaggag tgctgttgtg agagcttctg atgatttctg gcctagagac   1380

cctgcttccc atactataca tattgcatct gttgcatata atactgtatt tcttggagaa   1440

ttcatgcaac cagattggga catgttccat agtgttcacc caatggctga ataccatgct   1500

gcagcaagag cagtcggtgg ctgtgccata tatgtcagtg acaagcctgg gaaccatgac   1560

ttcaatttgc tgaagaagct ggttcttcct gacggatcga tcctgagagc caaactcccc   1620

ggcaggccaa ccagagactg tctgttttca gaccctgcaa gggatggcaa gagtatcctg   1680

aagatatgga atctgaacga gcactccggt gtgattggcg ccttcaattg ccagggtgct  1740

ggatggtgca gagtagggaa gaagaacctc gtccacgacg agcagccggc gacggtcacc  1800

ggtgtcatcc gtgcacagga cgtgcatcac ctcgcaaccg ttgctgccga tggctggaac  1860

ggcgacgtga tcgtctactc gcacatcgga ggggaggtga cctgcctgcc caagaacgcg  1920

tcgttgccgg tgacactgaa gacgcgagag tacgaggtct tcaccgtcgt accactgaag  1980

aagctcgaca atggcgtctc cttcgccgcg gtcgggctga tcgggatgtt caactccggc  2040

ggggcggtga cggcggtgag gtacgtggag gacgccggcg ttgaggtcag ggtgcgtggc  2100

tccggcacgg tcggggcgta ctcctcggcg aagccggcga gggtggtggt ggattcggag  2160

gcggcggaat tctcctacga tgatggatgc ggcttggtca cgttcgagct cgccgtgccg  2220

gagcaagaac tctactcctg gaccatctcg atcgagtact ag                     2262

<210>2

<211>754

<212>PRT

<213>Oryza sativa

<400>2

Met Thr Val Gly Ala Gly Val Ala Val Gln Asp Gly Gly Leu Val Ala

1               5                   10                  15

Leu Gly Ala Thr Val Leu Thr Glu Val Arg Asp Asn Val Leu Leu Thr

            20                  25                  30

Pro Ala Ala Gly Ala Gly Met Thr Ser Gly Thr Phe Val Gly Val Arg

        35                  40                  45

Ser Ala Thr Ala Gly Ser Arg Ser Val Phe Pro Val Gly Lys Leu Arg

    50                  55                  60

Gly Leu Arg Phe Ile Cys Thr Phe Arg Phe Lys Met Trp Trp Met Thr

65                  70                  75                  80

Gln Arg Met Gly Thr Ser Gly Arg Asp Ile Pro Phe Glu Thr Gln Phe

                85                  90                  95

Leu Leu Val Glu Ala Ala Asp Ala Asp Gly Ser His Leu Ala Gly Asp

            100                 105                 110

Gly Ala Ala Ala Val Tyr Thr Val Phe Leu Pro Ile Leu Glu Gly Pro

        115                 120                 125

Phe Arg Ala Val Leu Gln Gly Asn Ser Asp Asp Glu Leu Glu Ile Cys

    130                 135                 140

Leu Glu Ser Gly Asp Pro Ala Val Glu Ser Phe Glu Gly Thr His Leu

145                 150                 155                 160

Val Phe Val Gly Ala Gly Ser Asp Pro Phe Glu Val Ile Thr Asn Ser

                165                 170                 175

Val Lys Ala Val Glu Arg His Leu Gln Thr Phe Thr His Arg Glu Lys

            180                 185                 190

Lys Lys Met Pro Asp Met Leu Asn Trp Phe Gly Trp Cys Thr Trp Asp

        195                 200                 205

Ala Phe Tyr Thr Asp Val Thr Ser Glu Gly Val Met Glu Gly Leu Gln

    210                 215                 220

Ser Leu Gly Lys Gly Gly Thr Gly Pro Lys Phe Val Ile Ile Asp Asp

225                 230                 235                 240

Gly Trp Gln Ser Val Ser Met Asp Pro Ala Gly Ile Ala Ser Leu Ala

                245                 250                 255

Asp Asn Ser Ala Asn Phe Ala Asn Arg Leu Thr His Ile Lys Glu Asn

            260                 265                 270

His Lys Phe Gln Leu Asn Gly Arg Lys Gly His Arg Glu Glu Asn Pro

        275                 280                 285

Ala Asn Gly Leu Ala His Ile Val Asn Glu Ile Lys Gly Lys His Gln

    290                 295                 300

Leu Lys Tyr Val Tyr Val Trp His Ala Ile Thr Gly Tyr Trp Gly Gly

305                 310                 315                 320

Val Arg Pro Gly Ala Asp Gly Met Glu His Tyr Glu Ser Lys Met Gln

                325                 330                 335

Tyr Pro Val Ser Ser Pro Gly Val Gln Lys Asn Glu Pro Cys Asp Ala

            340                 345                 350

Leu Asn Ser Ile Thr Thr Asn Gly Leu Gly Leu Val Asn Pro Asp Arg

        355                 360                 365

Val Phe Ser Phe Tyr Asn Glu Leu His Ala Tyr Leu Ala Ser Ala Gly

    370                 375                 380

Ile Asp Gly Val Lys Val Asp Val Gln Asn Ile Leu Glu Thr Leu Gly

385                 390                 395                 400

Ala Gly His Gly Gly Arg Val Leu Leu Ala Arg Lys Tyr His Gln Ala

                405                 410                 415

Leu Glu Ala Ser Ile Ala Arg Asn Phe Arg Asp Asn Gly Ile Ile Cys

            420                 425                 430

Cys Met Ser His Asn Thr Asp Asn Leu Tyr Ser Ser Lys Arg Ser Ala

        435                 440                 445

Val Val Arg Ala Ser Asp Asp Phe Trp Pro Arg Asp Pro Ala Ser His

    450                 455                 460

Thr Ile His Ile Ala Ser Val Ala Tyr Asn Thr Val Phe Leu Gly Glu

465                 470                 475                 480

Phe Met Gln Pro Asp Trp Asp Met Phe His Ser Val His Pro Met Ala

                485                 490                 495

Glu Tyr His Ala Ala Ala Arg Ala Val Gly Gly Cys Ala Ile Tyr Val

            500                 505                 510

Ser Asp Lys Pro Gly Asn His Asp Phe Asn Leu Leu Lys Lys Leu Val

        515                 520                 525

Leu Pro Asp Gly Ser Ile Leu Arg Ala Lys Leu Pro Gly Arg Pro Thr

    530                 535                 540

Arg Asp Cys Leu Phe Ser Asp Pro Ala Arg Asp Gly Lys Ser Ile Leu

545                 550                 555                 560

Lys Ile Trp Asn Leu Asn Glu His Ser Gly Val Ile Gly Ala Phe Asn

                565                 570                 575

Cys Gln Gly Ala Gly Trp Cys Arg Val Gly Lys Lys Asn Leu Val His

            580                 585                 590

Asp Glu Gln Pro Ala Thr Val Thr Gly Val Ile Arg Ala Gln Asp Val

        595                 600                 605

His His Leu Ala Thr Val Ala Ala Asp Gly Trp Asn Gly Asp Val Ile

    610                 615                 620

Val Tyr Ser His Ile Gly Gly Glu Val Thr Cys Leu Pro Lys Asn Ala

625                 630                 635                 640

Ser Leu Pro Val Thr Leu Lys Thr Arg Glu Tyr Glu Val Phe Thr Val

                645                 650                 655

Val Pro Leu Lys Lys Leu Asp Asn Gly Val Ser  Phe Ala Ala Val Gly

            660                665                   670

Leu Ile Gly Met Phe Asn Ser Gly Gly Ala Val Thr Ala Val Arg Tyr

        675                 680                 685

Val Glu Asp Ala Gly Val Glu Val Arg Val Arg Gly Ser Gly Thr Val

    690                 695                 700

Gly Ala Tyr Ser Ser Ala Lys Pro Ala Arg Val Val Val Asp Ser Glu

705                 710                 715                 720

Ala Ala Glu Phe Ser Tyr Asp Asp Gly Cys Gly Leu Val Thr Phe Glu

                725                 730                 735

Leu Ala Val Pro Glu Gln Glu Leu Tyr Ser Trp Thr Ile Ser Ile Glu

            740                 745                 750

Tyr  ＊

<210>3

<211>1530

<212>DNA

<213>Nicotiana benthamiana

<221>CDS

<222>(1)...(1530)

<400>3

atgagcttgc atgcctgcag gtcgacgatt aaccatggcc aatttttgat tgtggaagga   60

aatgatggtt caaattttga tcaagataac catgaaaatt cagcatcgta tgttgtattc   120

ttgcctattc tggagggaga ttttagggct gttcttcaag ggaactcaaa cgacgagtta   180

gaaatatgcc tggaaagtgg ggatcctgct gtgcaagatt ttgaaggaag ccatttggtt   240

ttcgtagcag ctgggccaga cccttttgat gtcatcacta atgcagtcaa gacggtggag   300

aggcatttgc agacattttg ccaccgtgat agaaagaaga ttccagacat gttgaactgg   360

tttggatggt gtacatggga tgctttctat actactgtta ctgccgaggg agtgaagcaa   420

ggattagaga gtttggagaa aggaggtatt cccccaaaat ttgtactcat tgatgatgga   480

tggcaatccg tgggtatgga tcccaacagt atcgaatcca ttgctgataa ccatgcaaac   540

tttgctaaca ggttaactca tatcaaagag aaccacaagt ttcaaaaaga tggaaaagaa   600

gggcatagga ttgatgatcc tgcaatggga cttcgacatg tcgttaccaa catcaaggac   660

cagcacaatt taaagtatgt gtacgtgtgg catgcactcg ctggttactg gggcggtgtg   720

aaacctgggg tccctgagat ggatcactat gaatccaagt tatctttccc agtttcatcc   780

cctggggtcg agtcacaaga acctgatgat gctttggata gcttgacaaa aaatggtctt   840

ggtctagtga accctgagaa agtctataat ttctataatg aactgcactc ctaccttgct   900

tctgcgggta tagacggggt taaagtagat gttcagaaca tccttgaaac acttggagca   960

ggtcgtggtg gaagagtaaa acttgcaaga aagtatcatc aagcattaga ggcatctatt   1020

tcccaaaact ttcctgataa tggaattatt tcatgcatga gccatagtac tgataatttg   1080

ttcagtgcaa aacgctcagc tgttattaga gcttcagatg atttctggcc gagagatcct   1140

gcatcacaca caattcacat agcatcagtg gcttataata ctattttcct tggggagttc   1200

atgcagcctg attgggacat gtttcatagt gtgcacccaa tagctgaata ccatggagca   1260

gcacgggctg ttggaggctg tgctatttat gtcagtgaca agcctggaca gcacgatttt   1320

aatcttttaa agaagcttgt acttccagat ggttccatat tacgtgccaa acttccagga   1380

aggccaacta gagactgctt gttttctgat ccagaatctc tagaggatcc ccgggtaccg   1440

agctcgaatt tcaatggcgt tgttggtgtg tttataatgt atacgcataa aagagatgga   1500

ttctgctata atctgtgttg cactgtgtag                                    1530

<210>4

<211>510

<212>PRT

<213>Nicotiana benthamiana

<400>4

Met Ser Leu His Ala Cys Arg Ser Thr Ile Asn His Gly Gln Phe Leu

1               5                   10                  15

Ile Val Glu Gly Asn Asp Gly Ser Asn phe Asp Gln Asp Asn His Glu

            20                  25                  30

Asn Ser Ala Ser Tyr Val Val Phe Leu Pro Ile Leu Glu Gly Asp Phe

        35                  40                  45

Arg Ala Val Leu Gln Gly Asn Ser Asn Asp Glu Leu Glu Ile Cys Leu

    50                  55                  60

Glu Ser Gly Asp Pro Ala Val Gln Asp Phe Glu Gly Ser His Leu Val

65                  70                  75                  80

Phe Val Ala Ala Gly Pro Asp Pro Phe Asp Val Ile Thr Asn Ala Val

                85                  90                  95

Lys Thr Val Glu Arg His Leu Gln Thr Phe Cys His Arg Asp Arg Lys

            100                 105                 110

Lys Ile Pro Asp Met Leu Asn Trp Phe Gly Trp Cys Thr Trp Asp Ala

        115                 120                 125

Phe Tyr Thr Thr Val Thr Ala Glu Gly Val Lys Gln Gly Leu Glu Ser

    130                 135                 140

Leu Glu Lys Gly Gly Ile Pro Pro Lys Phe Val Leu Ile Asp Asp Gly

145                 150                 155                 160

Trp Gln Ser Val Gly Met Asp Pro Asn Ser Ile Glu Ser Ile Ala Asp

                165                 170                 175

Asn His Ala Asn Phe Ala Asn Arg Leu Thr His Ile Lys Glu Asn His

            180                 185                 190

Lys Phe Gln Lys Asp Gly Lys Glu Gly His Arg Ile Asp Asp Pro Ala

        195                 200                 205

Met Gly Leu Arg His Val Val Thr Asn Ile Lys Asp Gln His Asn Leu

    210                 215                 220

Lys Tyr Val Tyr Val Trp His Ala Leu Ala Gly Tyr Trp Gly Gly Val

225                 230                 235                 240

Lys Pro Gly Val Pro Glu Met Asp His Tyr Glu Ser Lys Leu Ser Phe

                245                 250                 255

Pro Val Ser Ser Pro Gly Val Glu Ser Gln Glu Pro Asp Asp Ala Leu

            260                 265                 270

Asp Ser Leu Thr Lys Asn Gly Leu Gly Leu Val Asn Pro Glu Lys Val

        275                 280                 285

Tyr Asn Phe Tyr Asn Glu Leu His Ser Tyr Leu Ala Ser Ala Gly Ile

    290                 295                 300

Asp Gly Val Lys Val Asp Val Gln Asn Ile Leu Glu Thr Leu Gly Ala

305                 310                 315                 320

Gly Arg Gly Gly Arg Val Lys Leu Ala Arg Lys Tyr His Gln Ala Leu

                325                 330                 335

Glu Ala Ser Ile Ser Gln Asn Phe Pro Asp Asn Gly Ile Ile Ser Cys

            340                 345                 350

Met Ser His Ser Thr Asp Asn Leu Phe Ser Ala Lys Arg Ser Ala Val

        355                 360                 365

Ile Arg Ala Ser Asp Asp Phe Trp Pro Arg Asp Pro Ala Ser His Thr

    370                 375                 380

Ile His Ile Ala Ser Val Ala Tyr Asn Thr Ile Phe Leu Gly Glu Phe

385                 390                 395                 400

Met Gln Pro Asp Trp Asp Met Phe His Ser Val His Pro Ile Ala Glu

                405                 410                 415

Tyr His Gly Ala Ala Arg Ala Val Gly Gly Cys Ala Ile Tyr Val Ser

            420                 425                 430

Asp Lys Pro Gly Gln His Asp Phe Asn Leu Leu Lys Lys Leu Val Leu

        435                 440                 445

Pro Asp Gly Ser Ile Leu Arg Ala Lys Leu Pro Gly Arg Pro Thr Arg

    450                 455                 460

Asp Cys Leu Phe Ser Asp Pro Glu Ser Leu Glu Asp Pro Arg Val Pro

465                 470                 475                 480

Ser Ser Asn Phe Asn Gly Val Val Gly Val Phe Ile Met Tyr Thr His

                485                 490                 495

Lys Arg Asp Gly Phe Cys Tyr Asn Leu Cys Cys Thr Val＊

            500                 505

<210>5

<211>30

<212>DNA

<213>Oryzae sativa

<400>5

aaaggtaccatgacggtgggagccggggtg          30

<210>6

<211>31

<212>DNA

<213>Oryzae sativa

<400>6

tctagagcctggtgatacttccttgccagaa         31

<210>7

<211>20

<212>DNA

<213>Oryza sativa

<400>7

tggtggatgacncagaggat                    20

<210>8

<211>19

<212>DNA

<213>Oryza sativa

<400>8

actccrccccagtawccgg                     19

<210>9

<211>24

<212>DNA

<213>Nicotiana benthamiana

<400>9

ccaggcatatttctaactcgtcgt         24

<210>10

<211>22

<212>DNA

<213>Nicotiana benthamiana

<400>10

tcccttgaagaacagccctaaa           22

<210>11

<211>25

<212>DNA

<213>Nicotiana benthamiana

<400>11

aggctaactcatatcaaagagaacc        25

<210>12

<211>21

<212>DNA

<213>Nicotiana benthamiana

<400>12

aatatcaaagaccaacaca at           21

<210>13

<211>19

<212>DNA

<213>Nicotiana benthamiana

<400>13

aagattcatagct tatgcg            19

<210>14

<211>24

<212>DNA

<213>Nicotiana benthamiana

<400>14

aactcgagctaccagtgcaacaca         24

<210>15

<211>27

<212>DNA

<213>Nicotiana benthamiana

<400>15

aaggatccccaatttttgattgtggaa      27

<210>16

<211>27

<212>DNA

<213>Nicotiana benthamiana

<400>16

tttctaga aaccagttcaacatgtctg      27

<210>17

<211>29

<212>DNA

<213>Nicotiana benthamiana

<400>17

tcgggatccatgaattctttgaacacaca        29

<210>18

<211>31

<212>DNA

<213>Nicotiana benthamiana

<400>18

acgaagcttctgcatcgatccgctgtcgttc       31

<210>19

<211>34

<212>DNA

<213>Nicotiana benthamiana

<400>19

tgcgaattcatgagcttgcatgcctgcaggtcga    34

<210>20

<211>30

<212>DNA

<213>Nicotiana benthamiana

<400>20

tgcgaattctacacagtgcaacacagatta        30

Claims (3)

1.一种能识别稻黄单胞菌蛋白激发子的植物基因，包括水稻HIP1基因和烟草HIP1基因，水稻HIP1基因的序列如SEQ ID NO.1所示，烟草HIP1基因的序列如SEQIDNO.3所示。

2.根据权利要求1所述的能识别稻黄单胞菌蛋白激发子的植物基因，其特征是，所述水稻HIP1基因编码754个氨基酸，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述烟草HIP1基因编码510个氨基酸，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

3.根据权利要求1或2所述的能识别稻黄单胞菌蛋白激发子的植物基因的应用，其特征是，所述水稻HIP1基因或烟草HIP1基因及其蛋白质在植物中过表达后，增强了植物对病毒病和细菌病害的抗病性，可作为抗病育种基因资源，克服病原菌进化导致的作物抗性丧失，获得持久抗性转基因作物新品种。

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