CN110540993B

CN110540993B - 细叶百合耐盐基因LpNAC20的克隆及其应用

Info

Publication number: CN110540993B
Application number: CN201910845706.0A
Authority: CN
Inventors: 崔颖; 张彦妮; 曹尚杰
Original assignee: Northeast Forestry University
Current assignee: Northeast Forestry University
Priority date: 2019-09-06
Filing date: 2019-09-06
Publication date: 2022-07-12
Anticipated expiration: 2039-09-06
Also published as: CN110540993A

Abstract

本发明涉及细叶百合(Lilium pumilum DC.)耐盐基因LpNAC20的克隆及其应用。包括以下步骤：(1)目的基因的克隆；(2)表达载体的构建；(3)转基因植株生理指标的检测。本项实验以细叶百合为研究对象，应用RT‑PCR技术克隆LpNAC20基因；通过构建过表达载体转化烟草；通过转基因烟草鉴定LpNAC20的过表达提高烟草盐胁迫的功能，揭示细叶百合NAC基因在受到逆境胁迫时有何功能，为细叶百合在百合育种的进一步应用奠定基础，为NAC转录因子的功能和作用提供理论依据。

Description

细叶百合耐盐基因LpNAC20的克隆及其应用

技术领域

本发明涉及基因技术领域，尤其涉及一种细叶百合耐盐基因LpNAC20及其应用。特别涉及一种细叶百合LpNAC20基因的克隆、表达载体的构建、烟草的转化，以及所述基因在提高转基因植物盐胁迫抗性的应用。

背景技术

NAC转录因子是植物中一类非常重要的转录因子，参与植物生长发育、生物与非生物胁迫、激素信号传导通路和光信号通路等多种反应。不少研究已经证实NAC转录因子在植物发育和生长调节以及逆境应答分子网络中扮演着极其重要的角色，目前已发现多个NAC蛋白参与植物对逆境的响应。

细叶百合(Lilium pumilum DC.)又名山丹，为百合科百合属多年生草本植物。细叶百合在食用、药用、观赏方面都有一定的应用价值，在园林应用方面其观赏价值尤为突出。同时细叶百合抗盐性很强，是优良的百合属种质资源，可用于培育抗盐的百合新品种。

本项实验以细叶百合为研究对象，应用RT-PCR技术克隆LpNAC20基因；通过构建过表达载体转化烟草；通过转基因烟草鉴定LpNAC20的过表达植株抵抗盐胁迫的功能，为细叶百合在百合育种的进一步应用奠定基础，为NAC转录因子的功能和作用提供理论依据。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种细叶百合耐盐基因，并验证其功能。

为了实现上述任务，本发明采取如下技术解决方案：

一种细叶百合耐盐基因，其特征在于，该细叶百合耐盐基因含ORF开放阅读框的部分核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，长度为1986bp；其cDNA编码氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示，编码661个氨基酸。

与现有技术相比，本发明的细叶百合耐盐基因，带来的有一技术效果在于：

1、得到了细叶百合耐盐基因含ORF开放阅读框的部分核苷酸序列。

2、根据申请人的实验证明，将该细叶百合LpNAC20基因转入烟草中，能够明显提高烟草的耐盐能力，可用于提高转基因植物的盐胁迫抗性。

培育得到抗盐能力强的烟草品种，通过以下步骤得以实现：

1)将细叶百合耐盐基因和植物表达载体pBI121-GFP用T4连接酶连接，构建过表达载体；

2)将构建的过表达载体质粒导入农杆菌EHA105，利用农杆菌介导法将LpNAC20基因转入烟草植株，利用卡那霉素筛选阳性植株，采集阳性植株叶片提取DNA和RNA进行分子水平鉴定；

3)将所筛选得到的烟草株系的种子和野生型烟草种子后接种于1/2MS培养基中，通过炼苗，移栽入土中，选取大小基本一致的烟草植株，进行300mmol/L的NaCl盐胁迫处理，观察植物的生长状态， 15d后拍照并剪取相同部位的健康叶片并测定其生理指标。

附图说明

图1细叶百合鳞茎RNA提取电泳结果图；

图2细叶百合LpNAC20基因编码区序列验证电泳图；A：PCR结果；B：转入大肠杆菌后菌液PCR；

图3细叶百合LpNAC20基因中间载体验证电泳图；A:连接pMD18-T中间载体；B:中间载体pMD18-T 双酶切；

图4细叶百合LpNAC20基因植物表达载体验证电泳图；A：植物表达载体鉴定；B：表达载体酶切鉴定；

图5细叶百合LpNAC20基因转农杆后菌液PCR鉴定；

图6转基因烟草植株鉴定结果；A：转基因烟草T0代植株DNA的PCR鉴定B：转基因烟草T0代植株cDNA的PCR鉴定；

图7为转基因烟草在盐胁迫处理后生理指标检测结果：其中，A为盐胁迫后叶绿素含量的检测结果，B为盐胁迫处理后脯氨酸含量的检测结果，C为盐胁迫处理后可溶性蛋白含量的检测结果；

图8为转基因烟草在盐胁迫处理后生理指标检测结果：其中，A为盐胁迫处理后超氧化物歧化酶 (SOD)活性的检测结果，B为盐胁迫处理后过氧化物酶(POD)活性的检测结果，C为盐胁迫处理后过氧化氢酶(CAT)活性的检测结果；

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明。

具体实施方式

实施例1细叶百合鳞茎RNA提取和cDNA的合成

用CTAB法提取细叶百合鳞茎总RNA，用适量RNAse水溶解RNA。

取1μlRNA溶液用DEPC水稀释100倍，以DEPC水为空白对照调零，用紫外分光光度计测定 A260/A280比值，测定RNA的浓度与纯度；将提取的RNA用1％的琼脂糖凝胶，检测其完整性，电泳结果如图1所示，将提取的RNA保存于-80℃冰箱中备用。

取-80℃保存的RNA，检测RNA浓度均在1100ng/ul左右，按照反转录试剂盒ReverTra Ace qPCR RT Kit(TOYOBO)说明书进行，总反应体系为50ul，其中：

反转录程序为：37℃15min；98℃5min。反应结束后立即放冰上冷却，保存于-20℃冰箱中备用。

实施例2细叶百合LpNAC20基因编码区序列的克隆

根据细叶百合基因的编码区序列，用Primer Premier 5设计特异性引物：

LpNAC20F：GTTCCTCCTATGGCTCTCAG

LpNAC20R：TATACACACCACGGGTACAA；

进行编码区序列的克隆：以细叶百合cDNA为模板进行PCR扩增反应，反应体系为：

总反应体系50μl，其中：

PCR扩增程序如下：94℃预变性2min，94℃变性30sec，65-55℃退火30sec，68℃延伸1min，循环 35次，72℃最终延伸10min，4℃forever；经过胶回收连接到克隆载体pMD18-T载体(TaKaRa)上，进一步通过菌液PCR检测(图2)，选取条带明亮且清晰的菌液送公司进行测序，提取测序比对结果正确的菌液的质粒，保存与-20℃冰箱中。

将获得的细叶百合NAC基因的全长cDNA序列，利用NCBI网站上的BLASTp功能对NAC基因进行保守结构域分析，利用ExPASy网站的Protparam(https://web.expasy.org/protparam/)生物信息学工具分析NAC蛋白序列的氨基酸数目、理论等电点和疏水性等基本信息。利用PlantTFDB (http://planttfdb.cbi.pku.edu.cn/)数据库进一步预测NAC转录因子的功能。利用NCBI上的BLASTp 功能将NAC基因编码的氨基酸序列进行比对，得到与该氨基酸序列具有同源性的其他植物中的NAC转录因子氨基酸序列，选取相似度较高的序列使用DNAMAN软件进行序列比对并构建系统进化树。

实施例3细叶百合LpNAC20基因的植物表达载体的构建

中间表达载体的构建：

1)根据细叶百合LpNAC20基因序列针对PBI121-GFP表达载体图谱分析合适的酶切位点，利用 Primer5设计合适的加酶切位点引物：

LpNAC20-KpnI：GGTACC ATGAACGGCGCATCCTCCTC

LpNAC20-SpeI：ACTAGT CCTGCTACAGATCCGAATCC；

2)以测序正确的全长cDNA质粒稀释100倍为模板，以加酶切位点的引物进行PCR扩增，扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳后胶回收(图3)，胶回收产物与pMD18-T载体过夜连接之后转化大肠杆菌DH-5α，过夜培养后挑取单菌落进行PCR验证(图3)，选择阳性克隆菌液测序。

植物表达载体的构建：

1)提取添加上正确酶切位点的菌液和pBI121-GFP空载体菌液的质粒备用。

2)使用限制性内切酶KpnI、SpeI对已构建的中间载体pMD18-T-LpNACs质粒pBI121-GFP空载质粒分别进行双酶切，酶切体系如如下，反应条件为37℃水浴30min。

总反应体系20μl，其中：

3)反应结束后分别用1％和1.5％琼脂糖凝胶电泳检测pBI121-GFP载体片段和pMD18-T-LpNACs 目的片段(图4)，将检测到的正确片段分别用胶回收试剂盒回收。

4)将回收的pBI121-GFP的大片段和pMD18-T-LpNACs目的小片段使用T4-DNA连接酶16℃过夜连接；

总反应体系10μl，其中：

5)将连接产物转化至大肠杆菌感受态DH-5α感受态细胞中。

6)用含有50mg/l Kan的LB固体培养基平板上进行筛选，挑取单克隆摇菌后PCR鉴定(图5)和质粒酶切鉴定(图5)，均有目的条带，说明植物表达载体构建成功，命名为pBI121-LpNAC20-GFP。

实施例4植物表达载体转化农杆菌

电转化法转化根癌农杆菌：

(1)使用前用无水乙醇清洗电转化杯3遍，将构建好的重组质粒pBI121-LpNAC20-GFP与农杆菌感受态置于冰上解冻；

(2)取3μl pBI121-LpNACs质粒，加入到100μl的EHA105农杆菌感受态细胞中吸打混匀，冰上放置10min；

(3)调整好电转化仪参数为1800v，将混合液放入转化杯中，进行电击；

(4)电击后迅速向混合液中加入1ml 28℃预热的YEP液体培养基，将电转化杯中的混合液全部转移到1.5ml离心管中，28℃，200rpm振荡1h；

(5)5000rmp离心5min，弃掉上清液800μl，剩余菌液涂于含有50mg/l Kana和100mg/l Rif的 YEP固体培养基平板上，28℃倒置培养24-48h；

挑取单克菌落并摇菌，取1μl菌液进行PCR鉴定(图6)，将检测正确的菌液用50％的甘油和菌液以1：1体积保存农杆菌菌液，放于-80℃冰箱中保存备用。

实施例5验证转基因植株耐盐性

将构建好的超表达载体通过叶盘侵染法侵染烟草叶片，利用卡那霉素筛选转基因烟草抗性植株，将抗性植株通过炼苗移入土中，其进行PCR检测(图7)。

盐胁迫处理：使用100ml浓度为300mmol/L的NaCl溶液对T1代转基因烟草进行盐胁迫处理，在0，15d取样，测定样品叶绿素、脯氨酸、可溶性蛋白的含量和SOD、POD、CAT的活性，结果分别如图7、8所示。

结果表明，转基因烟草植株具有较强的耐盐的能力。

序列表

<110> 东北林业大学

<120> 细叶百合耐盐基因LpNAC20的克隆及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 661

<212> PRT

<213> 细叶百合(Lilium pumilum DC.)

<400> 1

Met Asn Gly Ala Ser Ser Ser His Pro Pro Pro Pro Pro Pro Ala Ala

1 5 10 15

Val Val Pro Ala Ala Thr Pro Glu Ala Ser Ser Leu Leu Ala Pro Gly

20 25 30

Phe Arg Phe His Pro Thr Asp Glu Glu Leu Val Ser Tyr Tyr Leu Lys

35 40 45

Arg Lys Val Phe Gly Arg Pro Leu Arg Val Asp Ala Ile Ala Glu Val

50 55 60

Glu Leu Tyr Lys Ala Glu Pro Trp Asp Leu Pro Ala Leu Ser Arg Leu

65 70 75 80

Arg Ser Arg Asp Met Glu Trp Tyr Phe Phe Ser Pro Leu Asp Arg Lys

85 90 95

Tyr Ala Asn Arg Ser Arg Thr Asn Arg Ala Thr Ser Gln Gly Tyr Trp

100 105 110

Lys Thr Thr Gly Lys Asp Arg Pro Val Arg Arg Gly Pro Arg Thr Val

115 120 125

Gly Met Lys Lys Thr Leu Val Phe His Val Gly Arg Ala Pro Arg Gly

130 135 140

Glu Arg Thr Asn Trp Val Met His Glu Tyr Arg Leu Glu Asp Asp Glu

145 150 155 160

Leu Thr Asn Ala Gly Ile Pro Gln Asp Ser Tyr Val Val Cys Arg Ile

165 170 175

Phe Gln Lys Ser Gly Thr Gly Pro Gln Asn Gly Ala Gln Tyr Gly Ala

180 185 190

Pro Phe Asn Glu Glu Glu Trp Glu Glu Glu Ala Asn Asn Met His Leu

195 200 205

Ala Ile Val Asp Asn Gly Asp Gly Asp Gly Asp Asn Gln Gly Met Pro

210 215 220

Pro Ala Gly Ser Asp Ala Ala Val Val Gly Asn Gly Glu Tyr Phe Gln

225 230 235 240

Leu Ser Asp Phe Ala Glu Asn Gln Asp Gln Gly Asn Gln Phe Glu Thr

245 250 255

Gly Gly Phe Leu Thr Val Glu Ser Asn Gly Gln Asn Ile Gly Ser Ala

260 265 270

Arg Glu Asp Asp Pro Ile Phe Leu Val Glu Gly Leu Phe Asn Asp Gln

275 280 285

Asn Tyr Ala Gly Leu Gln Asp His Pro Ser Val Ser Asn Gly Ile Val

290 295 300

Arg Asn Asp Gly Phe Ala Val Gln Gln Pro Pro Ser Ser Pro Cys Gln

305 310 315 320

Asn Asp Gly Phe Leu Glu Leu Asn Asp Ile Val Asp Ser Val Asn Met

325 330 335

Asn Tyr Pro Ser Ser Glu Glu Ser Val Asp Cys Phe Leu Gly Asp Thr

340 345 350

Thr Pro Leu Asn Ile Gly Glu Leu Phe Asp Ser Asn Glu Asn Thr Glu

355 360 365

Ala Pro Ala Thr Tyr Glu Met Cys Pro Phe Gln Asp Asp Phe Tyr Leu

370 375 380

Glu Pro Lys Asp Leu Asp Leu Gly Asp Phe Ala Tyr Pro Ser Asp Gln

385 390 395 400

Thr Gly Glu Asp Asn Ile Ile Phe His Asp Ala Ser Ser Tyr Asp Leu

405 410 415

Pro Ser Gly Met Asp Thr Phe Ile Gln Met Asn Asp Leu Tyr Pro Pro

420 425 430

Ile Ala Asp Ser Val Gly Ile Ser Thr Val Glu Asp Val Ser Ser Tyr

435 440 445

Phe Asp Asn Ala Tyr Asn Ser His Tyr Pro Ala Met Asp Gly Ser Thr

450 455 460

Glu Asn Ile Ser Ala Ala Ser Ala Val Val Glu Ser Asn Phe Pro Arg

465 470 475 480

Glu Val Arg Arg Thr Val Ala Ile Pro Ala Glu Ala Phe Glu Thr Val

485 490 495

Gly Thr Ser Ser Val Asn Leu Pro Gly Pro Ser Arg Pro Asn Cys Ile

500 505 510

Lys Glu Asn Val Ala Val Val Pro Asp Ser Arg Val Val Glu Gly Cys

515 520 525

Asp Arg Ser Leu Thr Lys Arg Leu Val Asn Met Leu Gly Ser Ile Ser

530 535 540

Ala Pro Pro Ala Tyr Ala Ala Glu Pro Thr Ser Ser Ser Lys Ser Val

545 550 555 560

Gly Arg Met Ser Ala Thr Asn Ser Ala Ser Ser Ser Ile His Val Thr

565 570 575

Ala Gly Met Ile Gln Ile Arg Gly Phe Glu Val Met Gly Arg Ala Glu

580 585 590

His Trp Ser Met His Arg Asn Gly Asp Met Gly Phe Leu Leu Ser Cys

595 600 605

Gly Val Ala Ser Arg Lys Ser Asp Asp Gly Phe Glu Thr Val Pro Lys

610 615 620

Ile Arg Gly Trp Ser Met Leu Val Val Leu Arg Gly Gly Leu Tyr Cys

625 630 635 640

Phe Leu Leu Ser Ala Leu Val Leu Met Leu Cys Phe Lys Val Gly Ile

645 650 655

Arg Ile Cys Ser Arg

660

<210> 2

<211> 1986

<212> DNA

<213> 细叶百合(Lilium pumilum DC.)

<400> 2

atgaacggcg catcctcctc ccaccccccg ccaccgcctc cggcggccgt cgtccccgcc 60

gccacgccgg aggcgtcctc cctccttgcc cccggctttc gcttccaccc caccgacgag 120

gagctcgtca gctactacct caagcgcaag gtcttcggcc gtcccctccg cgtcgacgcc 180

atcgccgagg tcgagctcta caaagccgag ccgtgggacc tccccgccct ctctcgcctc 240

cgcagccgcg atatggagtg gtattttttc tcccctctcg accgcaagta cgccaaccgt 300

tcccgcacaa accgagccac ctcgcagggc tactggaaga ccaccggcaa ggaccgcccc 360

gtccgccgcg gtccccggac cgtcggcatg aagaagaccc tcgtcttcca tgtcggccgc 420

gccccccgcg gcgagcgcac caactgggtg atgcacgagt accgcctgga ggacgacgag 480

ctcaccaacg ctggcatccc ccaggactcg tatgtggtct gcaggatttt ccagaagagc 540

gggactgggc cccagaatgg ggcgcagtat ggcgccccct tcaacgagga ggagtgggag 600

gaagaggcta acaatatgca tttggcgata gtggataacg gcgatggtga tggtgacaac 660

cagggcatgc caccggctgg cagcgatgct gctgttgttg ggaatgggga gtacttccag 720

ctctctgact ttgcagaaaa ccaagaccag ggcaatcagt ttgaaactgg cggcttcttg 780

acagtggaat ccaatgggca gaacattggt agtgctcgag aggatgaccc tattttttta 840

gtggaggggt tatttaatga ccagaattat gctggtctgc aggatcaccc ttctgtttct 900

aatggcattg tgagaaatga tgggtttgct gttcagcagc cccctagttc accttgccag 960

aacgatggat ttctggagct gaatgatatt gtggacagtg tcaatatgaa ttatccttcc 1020

agtgaggaat ctgttgattg ctttttgggg gatacaacgc ctcttaatat tggggagtta 1080

tttgactcga atgaaaatac tgaggctccg gcaacatacg aaatgtgccc atttcaggat 1140

gacttctatc ttgaaccaaa ggatctggac ctcggtgatt ttgcttatcc ttctgatcag 1200

acaggcgaag ataatatcat atttcatgat gcatctagtt atgatcttcc gtctgggatg 1260

gatactttca tacagatgaa tgatctatat ccgcccattg ctgactcagt tgggatcagt 1320

actgtggagg acgtatcatc atattttgac aatgcatata actctcacta tcctgccatg 1380

gatggctcga cagaaaacat ctctgctgct tctgctgtag ttgagtccaa ctttccacgg 1440

gaggttcgta gaactgtggc aatacctgct gaggcttttg aaacggtggg tacatcctcg 1500

gtaaatttac caggacctag taggccaaat tgcataaaag agaatgtcgc tgttgtgcca 1560

gattcccggg tggtggaggg ttgtgacaga agcctcacaa aacgtctggt gaacatgttg 1620

ggatcaatat ctgcacctcc tgcttatgct gcagaaccaa cttcttctag caaatctgtg 1680

ggacgtatgt ctgcaactaa ttctgcaagc tcttccatcc atgtcactgc tgggatgatt 1740

cagattcgtg gttttgaagt gatgggcagg gccgagcact ggtccatgca tagaaatgga 1800

gacatgggtt ttctcctttc atgcggtgtg gcatctagga agtctgatga tgggtttgag 1860

accgttccaa aaatcagagg ctggtctatg ttggtggtac tgcgtggtgg gttatattgc 1920

ttcttactct ctgcattggt tctgatgctg tgctttaagg tggggattcg gatctgtagc 1980

aggtaa 1986

Claims

1.细叶百合耐盐基因用于提高转基因植物盐胁迫抗性的应用，所述细叶百合耐盐基因编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，按以下步骤进行：

1)将细叶百合耐盐基因和植物表达载体pBI121-GFP用双酶切后再用T4连接酶连接，构建烟草过表达载体；

2)将烟草过表达载体质粒用电转化法导入农杆菌EHA105中，利用农杆菌介导法侵染烟草叶片，利用卡那霉素筛选阳性植株，采集阳性植株叶片提取DNA和RNA进行分子水平鉴定；

3)将所筛选得到的烟草株系的种子和野生型烟草种子接种于1/2MS培养基中，通过炼苗，移栽入土中，选取大小基本一致的烟草植株，进行300mmol/L的NaCl盐胁迫处理；

4)观察经NaCl盐胁迫处理烟草的生长状态，在0和15d取样，测定样品叶绿素、脯氨酸和可溶性蛋白的含量以及SOD、POD和CAT的活性。

3.细叶百合LpNAC20基因在异源表达提高转基因烟草盐胁迫抗性中的应用，所述细叶百合LpNAC20基因编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。