BR112020015920A2 - Métodos e composições para aumentar o rendimento colheitável através da edição de genes de ga20 oxidase para gerar plantas de estatura curta - Google Patents

Métodos e composições para aumentar o rendimento colheitável através da edição de genes de ga20 oxidase para gerar plantas de estatura curta Download PDF

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Abstract

a presente invenção refere-se a composições e métodos para a edição ou mutação de subtipos específicos de genes da ga20 oxidase e combinações específicas de zigosidade dessas edições ou mutações. plantas modificadas, e partes de plantas e células das mesmas, tendo mutações reduzindo a expressão ou atividade de genes de ga20 oxidase, são ainda dotadas de características aprimoradas, tal como altura de planta reduzida e elevada resistência a alojamento, mas sem tipos de fora. são também fornecidos métodos para fazer plantas modificadas, e partes de plantas e células das mesmas, tendo uma ou mais mutações em subtipos específicos de genes de ga20 oxidase.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para “MÉTO- DOS E COMPOSIÇÕES PARA AUMENTAR O RENDIMENTO CO- LHEITÁVEL ATRAVÉS DA EDIÇÃO DE GENES DE GA20 OXIDASE PARA GERAR PLANTAS DE ESTATURA CURTA”.
REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS
[001] Este pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório U.S. 62/631.412, depositado em 15 de fevereiro de 2018 e Pedido Provisório U.S. 62/631.416, depositado em 15 de fevereiro de 2018, ambos os quais são no presente documento incorporados por referência em suas totalidades.
INCORPORAÇÃO DA LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS
[002] O arquivo de listagem de sequências chamado “P34606WO_SEQ.txt” que é de 382 kilobytes (medido no MS-WIN- DOWS) e foi criado em 14 de fevereiro de 2019, é submetido a este documento e incorporado no presente documento por referência na sua totalidade.
ANTECEDENTES
[003] A presente invenção refere-se a composições e métodos para melhorar traços, como resistência ao alojamento e aumento do ren- dimento no milho.
[004] As giberelinas (ácidos giberélicos ou GAs) são hormônios vegetais que regulam vários dos principais processos de crescimento e desenvolvimento das plantas. A manipulação dos níveis de GA nas va- riedades de trigo semi-anão, arroz e sorgo levou ao aumento da produ- tividade e redução do alojamento nessas culturas de cereais durante o século 20o, o que foi em grande parte responsável pela revolução verde. No entanto, ganhos de rendimento bem-sucedidos em outras culturas de cereais, como o milho, não foram alcançados através da manipula- ção da via GA. De fato, algumas mutações nos genes da via GA têm sido associadas a vários tipos estranhos de milho que são incompatíveis com o rendimento, o que levou os pesquisadores a encontrar varieda- des de milho semi-anã e de alto rendimento através da manipulação da via GA.
[005] Continua a haver uma necessidade na técnica para o desen- volvimento de monocotiledôneas ou plantas de cereais, como o milho, com aumento do rendimento e/ou resistência ao alojamento.
SUMÁRIO
[006] Em um aspecto, a presente invenção fornece uma planta de milho modificada com uma altura de planta reduzida em relação a uma planta de controle do tipo selvagem e (i) um diâmetro aumentado da haste ou caule em relação a uma planta de controle do tipo selvagem, (ii) resistência melhorada ao alojamento a uma planta de controle do tipo selvagem, ou (iii) melhor tolerância à seca em relação a uma planta de controle do tipo selvagem.
[007] Em um aspecto, a presente invenção fornece uma planta de milho modificada, ou parte de planta da mesma, com um fenótipo semi- anão desejável e tendo uma redução de altura de planta intermediária. Em outro aspecto, uma planta de milho modificada com altura de planta moderadamente reduzida pode oferecer vantagens agronômicas sobre qualquer de plantas não modificadas com altura regular ou de outras plantas modificadas que podem exibir uma forte redução em altura de planta.
[008] Em um aspecto, a presente invenção fornece uma planta de milho modificada, ou parte de planta da mesma, compreendendo um alelo mutante em locus de GA20 oxidase_3 e um alelo mutante em locus de GA20 oxidase_5, em que pelo menos um dos loci GA20 oxidase_3 e GA20 oxidase_5 compreende alelos mutantes homozigotos.
[009] Em outro aspecto, a presente invenção fornece uma planta de milho modificada, ou parte de planta da mesma, compreendendo uma primeira mutação homozigota em um dos genes de GA20 oxi- dase_3 e GA20 oxidase_5 e ainda compreendendo uma segunda mu- tação heterozigota ou homozigota no outros dos genes de GA20 oxi- dase_3 e GA20 oxidase_5.
[0010] Em um aspecto, a presente invenção fornece um método para fazer uma planta de milho modificada, ou parte de planta da mesma, compreendendo: (a) cruzar uma primeira planta de milho com- preendendo um alelo mutante do locus de GA20 oxidase_3 com uma segunda planta compreendendo um alelo mutante dolocus de GA20 oxi- dase_5; e (b) selecionar uma planta de progênie de milho, ou parte de planta da mesma, a partir do cruzamento na etapa (a) que é (i) homozi- gota para um ou mais alelos mutantes do locus de GA20 oxidase_3 e heterozigota para um alelo mutante do lócus de GA20 oxidase_5, ou (ii) heterozigota para um alelo mutante do locus de GA20 oxidase_3 e ho- mozigota para um ou mais alelos mutantes do lócus de GA20 oxi- dase_5.
[0011] Em outro aspecto, a presente invenção fornece um método para fazer uma planta de milho modificada, ou parte de planta da mesma, compreendendo: (a) cruzar uma primeira planta de milho com- preendendo um alelo mutante do locus de GA20 oxidase_3 e um alelo mutante do locus de GA20 oxidase_5 com uma segunda planta; e (b) selecionar uma planta de progênie de milho, ou parte de planta da mesma, a partir do cruzamento na etapa (a) que é (i) homozigota para um ou mais alelos mutantes do locus de GA20 oxidase_3 e heterozigota para um alelo mutante do lócus de GA20 oxidase_5, ou (ii) heterozigota para um alelo mutante do locus de GA20 oxidase_3 e homozigota para um ou mais alelos mutantes do lócus de GA20 oxidase_5.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0012] A FIG. 1 mostra alturas de plantas de plantas mutantes en- dogâmicas possuindo genes GA20 oxidase_3 e/ou GA20 oxidase_5 mutantes editados em comparação com plantas de controle endogâmi- cas tipo selvagem e plantas que expressam um construto de supressão de GA20 oxidase.
DESCRIÇÃO DETALHADA
[0013] Para facilitar o entendimento da invenção, vários termos e abreviações, conforme no presente documento utilizados, são definidos a seguir:
[0014] O termo “e/ou”, quando utilizado em uma lista de dois ou mais itens, significa que qualquer um dos itens listados pode ser usado sozinho ou em combinação com qualquer um ou mais dos itens listados. Por exemplo, a expressão "A e/ou B” se destina a significar um ou am- bos de A e B - isto é, A sozinho, B sozinho ou A e B em combinação. A expressão "A, B e/ou C ” se destina a significar A sozinho, B sozinho, C sozinho, A e B em combinação, A e C em combinação, B e C em com- binação ou A, B e C em combinação.
[0015] O termo “cerca de,” conforme utilizado neste documento, se destina a qualificar os valores numéricos que modifica, denotando que certo valor é variável dentro de uma margem do erro. Quando nenhuma margem de erro particular, como um desvio padrão para um valor mé- dio, é recitada, o termo "cerca de" deve ser entendido como significando o intervalo que abrangeria o valor recitado e o intervalo que seria inclu- ído arredondando para cima ou para baixo a esse valor, tendo em conta algarismos significativos.
[0016] Conforme utilizado neste documento, “locus” é uma região de cromossomo em que um ácido nucleico polimórfico, determinante de traço, gene ou marcador está situado. Um "locus" pode ser comparti- lhado por dois cromossomos homólogos para se referir ao locus ou re- gião correspondente. Conforme utilizado neste documento, "alelo" re- fere-se a uma sequência alternativa de ácido nucleico de um gene ou em um locus particular (por exemplo, uma sequência de ácido nucleico de um gene ou locus diferente de outros alelos para o mesmo gene ou locus). Tal alelo pode ser considerado (i) tipo selvagem ou (ii) mutante se uma ou mais mutações ou edições estiverem presentes na sequência de ácido nucleico do alelo mutante em relação ao alelo tipo selvagem. Um alelo mutante para um gene pode ter uma atividade ou nível de ex- pressão reduzido ou eliminado para o gene em relação ao alelo tipo selvagem. Para organismos diploides como o milho, um primeiro alelo pode ocorrer em um cromossomo e um segundo alelo pode ocorrer no mesmo locus em um segundo cromossomo homólogo. Se um alelo em um locus em um cromossomo de uma planta é um alelo mutante e o outro alelo correspondente no cromossomo homólogo da planta é tipo selvagem, a planta é descrita como heterozigótica para o alelo mutante. No entanto, se os dois alelos de um locus são alelos mutantes, a planta é descrita como homozigótica para os alelos mutantes. Uma planta ho- mozigótica para alelos mutantes em um locus pode compreender o mesmo alelo mutante ou alelos mutantes diferentes, se heteroalélico ou bialélico.
[0017] Conforme utilizado neste documento, um "gene tipo selva- gem" ou "alelo tipo selvagem" refere-se a um gene ou alelo com uma sequência ou genótipo que é mais comum em uma espécie de planta específica ou outra sequência ou genótipo com variações naturais, po- limorfismos, ou outras mutações silenciosas relativas à sequência ou genótipo mais comum que não afetam significativamente a expressão e a atividade do gene ou alelo. De fato, um gene ou alelo do tipo "selva- gem" não contém variação, polimorfismo ou qualquer outro tipo de mu- tação que afete substancialmente a função, atividade, expressão ou consequência fenotípica normal do gene ou alelo.
[0018] Os termos "porcentagem de identidade" ou "porcentagem idêntica", conforme utilizados neste documento em referência a duas ou mais sequências nucleotídicas ou proteínas, são calculados (i) compa- rando duas sequências alinhadas de forma otimizada (nucleotídeo ou proteína) ao longo de uma janela de comparação, (ii) determinando o número de posições nas quais a base de ácido nucleico idêntica (para sequências de nucleotídeos) ou resíduo de aminoácido (para proteínas) ocorre em ambas as sequências para produzir o número de posições correspondentes, (iii) dividindo o número de posições correspondentes pelo número total de posições na janela de comparação, e então (iv) multiplicando este quociente por 100% para produzir a identidade por- centual.
Para fins de cálculo da "porcentagem de identidade" entre as sequências de DNA e RNA, um uracil (U) de uma sequência de RNA é considerado idêntico a uma timina (T) de uma sequência de DNA.
Se a janela de comparação for definida como uma região de alinhamento en- tre duas ou mais sequências (isto é, excluindo nucleotídeos nas extre- midades 5' e 3' das sequências polinucleotídicas alinhadas ou aminoá- cidos no terminal N e no terminal C de sequências de proteínas alinha- das, que não são idênticas entre as sequências comparadas), então a "porcentagem de identidade" também pode ser referida como "porcen- tagem de identidade de alinhamento". Se a "porcentagem de identi- dade" está sendo calculada em relação a uma sequência de referência sem uma janela de comparação particular sendo especificada, então a porcentagem de identidade é determinada dividindo o número de posi- ções combinadas sobre a região de alinhamento pelo comprimento total da sequência de referência.
Por conseguinte, conforme utilizado neste documento, quando duas sequências (consulta e sujeito) estão ideal- mente alinhadas (com tolerância para folgas no seu alinhamento), a “porcentagem de identidade” para a sequência de consulta é igual ao número de posições idênticas entre as duas sequências divididas pelo número total de posições na sequência de consulta sobre seu compri- mento (ou uma janela de comparação), que é então multiplicada por
100%.
[0019] Quando o porcentual de identidade de sequência é usado em referência a proteínas ou peptídeos, reconhece-se que as posições do resíduo que não são idênticas frequentemente diferem por substitui- ções conservativas de aminoácidos, onde os resíduos de aminoácidos são substituídos por outros resíduos de aminoácidos com propriedades químicas similares (por exemplo, carga, hidrofobicidade, polaridade, etc.) e, portanto, não pode alterar as propriedades funcionais da molé- cula. Onde as sequências diferem em substituições conservativas, o porcentual de identidade de sequência pode ser ajustado de forma as- cendente para corrigir a natureza conservativa da substituição. As se- quências que diferem por tais substituições conservadoras são ditas para terem "similaridade das sequência" ou "similaridade". Assim, "por- centagem de similaridade" ou "porcentagem similar", conforme utilizado neste documento em referência a duas ou mais sequências de proteí- nas, é calculada (i) comparando duas sequências de proteínas alinha- das de forma otimizada ao longo de uma janela de comparação, (ii) de- terminando o número de posições nas quais o mesmo resíduo de ami- noácido ou semelhante ocorre em ambas as sequências para produzir o número de posições combinadas, (iii) dividindo o número de posições combinadas pelo número total de posições na janela de comparação (ou o comprimento total da proteína de referência ou consulta se uma janela de comparação não for especificada), e então (iv) multiplicando esse quociente por 100% para obter a similaridade porcentual. As subs- tituições conservadoras de aminoácidos por proteínas são conhecidas na técnica.
[0020] Para o alinhamento ideal de sequências para calcular sua porcentagem de identidade ou similaridade, vários algoritmos e progra- mas de alinhamento de sequência múltipla ou em pares são conhecidos na técnica, como ClustalW ou Basic Local Alignment Search Tool®
(BLAST®), etc., que pode ser utilizado para comparar a identidade de sequência ou similaridade entre duas ou mais sequências de nucleotí- deos ou proteínas. Embora outros métodos de alinhamento e compara- ção sejam conhecidos na técnica, o alinhamento entre duas sequências (incluindo os intervalos percentuais de identidade descritos acima) pode ser conforme determinado pelo algoritmo ClustalW ou BLAST®, ver, por exemplo, Chenna R. et al., “Multiple sequence alignment with the Clustal series of programs,” Nucleic Acids Research 31: 3497-3500 (2003); Tho- mpson JD et al., “Clustal W: Improving the sensitivity of progressive mul- tiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice,” Nucleic Acids Research 22: 4673-4680 (1994); e Larkin MA et al., “Clustal W and Clustal X version
2.0,” Bioinformatics 23: 2947-48 (2007); e Altschul, S.F., Gish, W., Miller, W., Myers, E.W. & Lipman, D.J. (1990) "Basic local alignment search tool." J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990), todos os conteúdos e divulga- ções dos quais são incorporados neste documento por referência.
[0021] Os termos "porcentagem de complementaridade" ou "por- centagem complementar", conforme utilizado neste documento em re- ferência a duas sequências de nucleotídeos, são semelhantes ao con- ceito de porcentagem de identidade, mas referem-se à porcentagem de nucleotídeos de uma sequência de consulta que otimiza o par de bases ou hibrida com nucleotídeos de uma sequência de sujeito quando as sequências de consulta e sujeito são organizadas linearmente e empa- relhadas de maneira ideal sem estruturas de dobra secundárias, como alças, hastes ou hairpins. Essa complementaridade porcentual pode es- tar entre duas fitas de DNA, duas fitas de RNA ou uma fita de DNA e uma fita de RNA. A "porcentagem de complementaridade" é calculada por (i) emparelhamento de bases ideal ou hibridização das duas se- quências de nucleotídeos em um arranjo linear e totalmente estendido (ou seja, sem dobras ou estruturas secundárias) ao longo de uma janela de comparação, (ii) determinar o número de posiciona esse par de ba- ses entre as duas sequências ao longo da janela de comparação para produzir o número de posições complementares, (iii) dividindo o número de posições complementares pelo número total de posições na janela de comparação e (iv) multiplicando este quociente em 100% para pro- duzir a complementaridade porcentual das duas sequências. O empa- relhamento ideal de bases de duas sequências pode ser determinado com base nos pares conhecidos de bases nucleotídicas, como G-C, A- T, e A-U, através de ligações de hidrogênio. Se a “porcentagem de iden- tidade” está sendo calculada em relação a uma sequência de referência, sem uma janela de comparação particular a ser especificada, então a porcentagem de identidade é determinada através da divisão do número de posições correspondentes ao longo da região de alinhamento pelo comprimento total da sequência de referência. Assim, para os fins da presente invenção, quando duas sequências (consulta e sujeito) são emparelhadas de forma otimizada (com tolerância para incompatibilida- des ou nucleotídeos não emparelhados de base, mas sem dobras ou estruturas secundárias), a "porcentagem de complementaridade" para a sequência de consulta é igual ao número de posições emparelhadas de base entre as duas sequências dividido pelo número total de posi- ções na sequência de consulta em seu comprimento (ou pelo número de posições na sequência de consulta em uma janela de comparação), que é então multiplicado em 100%.
[0022] Como utilizado neste documento, "modificado" no contexto de uma planta, semente de planta, parte de planta, célula de planta, e/ou genoma de planta, refere-se a uma planta, semente de planta, parte de planta, célula de planta e/ou genoma de planta compreendendo uma mudança engenheirada no nível de expressão e/ou sequência de codificação de um ou mais gene(s) de GA oxidase em relação a uma planta tipo selvagem ou controle, semente de planta, parte de planta,
célula de planta e/ou genoma de planta, tal como através de um evento de edição do genoma ou mutação que afeta (por exemplo, reduzindo ou eliminando) o nível de expressão ou atividade de um ou mais genes endógenos de GA3 e/ou GA20 oxidase.
De fato, o termo "modificado" pode se referir ainda a uma planta, semente de planta, parte de planta, célula de planta e/u genoma de planta com uma ou mais mutações que afetam a expressão de um ou mais genes endógenos de GA oxidase, como um ou mais genes endógenos de GA3 e/ou GA20 oxidase, intro- duzidos através de mutagênese química, inserção ou excisão de trans- poson, ou qualquer outra técnica conhecida de mutagênese, ou introdu- zidos através da edição de genoma.
Para maior clareza, portanto, uma planta modificada, semente de planta, parte de planta, célula de planta e/ou genoma de planta inclui uma planta mutada e/ou editada, semente de planta, parte de planta, célula de planta e/ou genoma de planta com um nível de expressão modificado, padrão de expressão e/ou sequência de codificação de um ou mais gene(s) de GA oxidase em relação a uma planta tipo selvagem ou controle, semente de planta, parte de planta, célula de planta e/ou genoma de planta.
As plantas modificadas podem ser homozigotas ou heterozigotas para qualquer mutação ou edição, e/ou podem ser bi-alélicas em um sítio genético da GA oxidase.
Uma planta modificada é bi-alélica para um gene da GA oxidase se cada có- pia do gene da GA oxidase for modificada por um alelo diferente (isto é, mutação(ões) diferente(s) e/ou edição(ões)), em que cada alelo reduz o nível de expressão e/ou atividade do gene da GA oxidase.
Plantas ou sementes modificadas podem conter várias alterações moleculares que afetam a expressão do(s) gene(s) da GA oxidase, tais como gene(s) de oxidase GA3 e/ou GA20, incluindo modificações genéticas e/ou epige- néticas.
Plantas modificadas, partes de plantas, sementes, etc., podem ter sido submetidas à mutagênese, edição de genoma ou integração dirigida ao sítio (por exemplo, sem ser limitativo, por meio de métodos usando nucleases específicas do sítio), transformação genética (por exemplo, sem ser limitativo, via métodos de transformação de Agrobac- terium ou bombardeio de microprojétil), ou uma combinação dos mes- mos. Essas plantas "modificadas", sementes de plantas, partes de plan- tas e células de plantas incluem plantas, sementes de plantas, partes de plantas e células de plantas que são descendentes ou derivadas de plantas "modificadas", sementes de plantas, partes de plantas e células de plantas que retêm a mudança molecular (por exemplo, mudança no nível de expressão e/ou atividade) aos um ou mais genes da GA oxi- dase. Uma semente modificada no presente documento fornecida pode dar origem a uma planta modificada no presente documento fornecida. Uma planta modificada, semente de planta, parte de planta, célula de planta ou genoma de planta no presente documento fornecido pode compreender um construto de DNA recombinante ou edição de vetor ou genoma conforme no presente documento fornecido. Um "produto ve- getal modificado" pode ser qualquer produto fabricado a partir de uma planta modificada, parte de planta, célula de planta ou cromossomo ve- getal no presente documento fornecido, ou qualquer parte ou compo- nente do mesmo.
[0023] Conforme utilizado neste documento, o termo "homozigoto" refere-se a um genótipo compreendendo dois alelos idênticos em um determinado locus em um genoma diploide ou um genótipo compreen- dendo dois alelos mutantes não idênticos em um determinado locus em um genoma diploide. O último genótipo compreendendo dois alelos mu- tantes não idênticos também é referido como sendo heteroalélico ou transheterozigoto, ou como uma combinação heterolélica. Conforme uti- lizado neste documento, "heterozigoto" descreve um genótipo compre- endendo um alelo mutante e um alelo tipo selvagem em um determinado locus em um genoma diploide.
[0024] Como utilizado neste documento, o termo "planta de con- trole" (ou da mesma forma uma semente de planta "de controle", parte de planta, célula de planta e/ou genoma de planta) refere-se a uma planta (ou semente de planta, parte de planta, célula de planta e/ou ge- noma de planta) usado para comparação com uma planta modificada (ou semente de planta modificada, parte de planta, célula de planta e/ou genoma de planta) e tem o mesmo fundo genético ou semelhante (por exemplo, mesmas linhagens parentais, cruzamento híbrido, linhagem endogâmica, testadores, etc.) que a planta modificada (ou semente de planta, parte de planta, célula de planta e/ou genoma de planta), exceto para um evento(s) de edição de genoma que afeta um ou mais genes GA oxidase.
Por exemplo, uma planta de controle pode ser uma linha- gem endogâmica que é a mesma que a linhagem endogâmica usada para fazer a planta modificada, ou uma planta de controle pode ser o produto do mesmo cruzamento híbrido de linhagens parentais endogâ- micas que a planta modificada, exceto para a ausência na planta de controle de qualquer evento de edição do genoma que afeta um ou mais genes GA oxidase.
Da mesma forma, uma planta de controle não modi- ficada refere-se a uma planta que compartilha um fundo genético subs- tancialmente semelhante ou essencialmente idêntico ao de uma planta modificada, mas sem uma ou mais alterações de engenharia no genoma (por exemplo, transgene, mutação ou edição) da planta modificada.
Para fins de comparação com uma planta modificada, semente de planta, parte de planta, célula de planta e/ou genoma de planta, uma "planta tipo selvagem" (ou da mesma forma uma semente de planta "tipo selvagem", parte de planta, célula de planta e/ou genoma de planta) re- fere-se a uma planta de controle editada, não transgênica e não genô- mica, semente de planta, parte de planta, célula de planta e/ou genoma de planta.
Como utilizado neste documento, uma planta de "controle", semente de planta, parte da planta, célula de planta e/ou genoma de planta também pode ser uma planta, semente de planta, parte de planta, célula de planta e/ou genoma de planta com um fundo genético seme- lhante (mas não o mesmo ou idêntico) a uma planta modificada, se- mente de planta, parte de planta, célula de planta e/ou genoma de planta, se considerado suficientemente semelhante para comparação das características ou traços a serem analisados.
[0025] Conforme utilizado neste documento, um "sítio alvo" para edição de genoma refere-se à localização de uma sequência polinucle- otídica dentro de um genoma de planta que é ligado e clivado por uma nuclease específica de sítio que introduz uma quebra de fita dupla (ou corte de fita simples) na espinha dorsal de ácido nucleico da sequência polinucleotídica e/ou na sua fita de DNA complementar. Um sítio alvo pode compreender pelo menos 10, pelo menos 11, pelo menos 12, pelo menos 13, pelo menos 14, pelo menos 15, pelo menos 16, pelo menos 17, pelo menos 18, pelo menos 19, pelo menos 20, pelo menos 21, pelo menos 22, pelo menos 23, pelo menos 24, pelo menos 25, pelo menos 26, pelo menos 27, pelo menos 29 ou pelo menos 30 nucleotídeos con- secutivos. Um "sítio alvo" para uma nuclease guiada por RNA pode compreender a sequência de uma fita complementar de uma molécula de ácido nucleico (DNA) de cadeia dupla ou de um cromossomo no sítio alvo. Uma nuclease específica de um sítio pode se ligar a um sítio alvo, como por meio de um RNA guia não codificante (por exemplo, sem limi- tação, um RNA CRISPR (crRNA) ou um RNA guia único (sgRNA), como descrito mais abaixo). Um RNA guia não codificante no presente docu- mento fornecido pode ser complementar a um sítio alvo (por exemplo, complementar à fita de uma molécula de ácido nucleico de fita dupla ou cromossomo no sítio alvo). Será apreciado que uma identidade ou com- plementaridade perfeita pode não ser necessária para que um RNA guia não codificante se ligue ou hibride com um sítio alvo. Por exemplo, pelo menos 1, pelo menos 2, pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5,
pelo menos 6, pelo menos 7 ou pelo menos 8 incompatibilidades (ou mais) entre um sítio e um RNA não codificante pode ser tolerado. Um "sítio alvo" também se refere à localização de uma sequência polinucle- otídica dentro de um genoma de planta que é ligada e clivada por outra nuclease específica de sítio que pode não ser guiada por uma molécula de RNA não codificante, como uma meganuclease, nuclease de dedo de zinco (ZFN), ou uma nuclease efetora do tipo ativador de transcrição (TALEN), para introduzir uma quebra de fita dupla (ou corte de fita sim- ples) na sequência polinucleotídica e/ou sua fita de DNA complementar. Como utilizado neste documento, uma "região alvo" ou uma "região di- recionada" refere-se a uma sequência ou região polinucleotídica que é flanqueada por dois ou mais sítios alvo. Sem ser limitativo, em algumas modalidades uma região alvo pode ser submetida a uma mutação, de- leção, inserção ou inversão. Como utilizado neste documento, "flanque- ado" quando usado para descrever uma região alvo de uma sequência ou molécula polinucleotídica, refere-se a dois ou mais sítios alvo da se- quência ou molécula polinucleotídica em torno da região alvo, com um sítio alvo em cada lado da região alvo. Além da edição do genoma, o termo "sítio alvo" também pode ser usado no contexto da supressão de genes para se referir a uma porção de uma molécula de mRNA (por exemplo, um "sítio de reconhecimento") que é complementar a pelo me- nos uma porção de uma molécula de RNA não codificante (por exemplo, um miRNA, siRNA, etc.) codificada por um construto de supressão.
[0026] O Pedido PCT copendente Nº PCT/US2017/047405 e o Pe- dido U.S. 15/679,699, ambos depositados em 17 de agosto de 2017, são incorporados no presente documento por referência na sua totali- dade.
[0027] A maioria das gramíneas produtoras de grãos, como trigo, arroz e sorgo, produzem estruturas macho e fêmeas dentro de cada flor da panícula (isto é, têm uma única estrutura reprodutiva). No entanto, o milho ou maíz são únicos entre as gramíneas produtoras de grãos, pois formam inflorescências separadas macho (borla) e fêmeas (espigas). O milho produz estruturas reprodutivas completamente sexualmente di- mórficas pelo aborto seletivo de órgãos de machos (anteras) nas flores da espiga e órgãos de fêmeas (óvulos) nas flores da borla nos estágios iniciais de desenvolvimento. A síntese e sinalização de giberelina regu- ladas com precisão são críticas para a regulação desse processo sele- tivo de aborto, com o ouvido reprodutivo da fêmea sendo mais sensível a rupturas na via GA. De fato, o fenótipo “antera da espiga” é o fenótipo reprodutivo mais comum em mutantes do milho GA.
[0028] Ao contrário do milho, as mutações na síntese de giberelinas ou nas vias de sinalização que levaram à “Revolução Verde” no trigo, arroz e sorgo tiveram pouco impacto em suas estruturas reprodutivas, porque essas espécies de culturas não sofrem o processo de aborto seletivo da panícula com grãos durante o desenvolvimento e, portanto, não são sensíveis a interrupções nos níveis de GA. As mesmas muta- ções não foram utilizadas no milho porque a interrupção da síntese de GA e da via de sinalização levou repetidamente a uma distorção dramá- tica e masculinização da espiga ("antera da espiga") e à esterilidade (desenvolvimento interrompido da antera e do micrósporo) na borla, além de nanismo extremo em alguns casos. Veja, por exemplo, Chen, Y. et al., “The Maize DWARF1 Encodes a Gibberellin 3-Oxidase and Is Dual Localized to the Nucleus and Cytosol,” Plant Physiology 166: 2028- 2039 (2014). Esses fenótipos mutantes GA (tipos estranhos) no milho levaram a reduções significativas na produção de caroços e a uma re- dução no rendimento. Além disso, a produção de anteras na espiga au- menta a probabilidade de infecções por fungos ou insetos, o que reduz a qualidade do grão produzido nessas espigas mutantes. A procriação direta para desenvolver linhagens de milho semianãs não foi bem-suce-
dida, e os tipos de reprodução (e também o extremo nanismo) dos mu- tantes GA têm sido difíceis de superar. Assim, as mesmas mutações na via GA que levaram à Revolução Verde em outras gramíneas ainda não tiveram sucesso no milho.
[0029] Apesar dessas dificuldades precedentees em alcançar ren- dimentos mais altos de caroços de milho através da manipulação da via GA, os presentes inventores descobriram uma maneira de manipular os níveis de GA em plantas de milho de uma maneira que reduz a altura total da planta e o comprimento do interno do caule e aumenta a resis- tência ao alojamento, mas não causa os tipos estranhos reprodutivos precedentemente associados a mutações da via GA no milho. Evidên- cias adicionais indicam que essas plantas de milho de baixa estatura ou semianãs também podem ter um ou mais traços adicionais, incluindo aumento do diâmetro do caule, redução do estalo verde, raízes mais profundas, aumento da área foliar, fechamento mais precoce do dossel, maior condutância estomática, menor altura da espiga, aumento do teor de água foliar, melhoria da tolerância à seca, aumento da eficiência do uso de nitrogênio, aumento da eficiência do uso de água, redução do teor de antocianina e área nas folhas sob condições normais ou de es- tresse limitativo à nitrogênio ou água, aumento do peso da espiga, au- mento do número de caroços, aumento do peso dos caroços, aumento do rendimento, e/ou aumento do índice de colheita.
[0030] De acordo com modalidades da presente invenção, são for- necidas plantas de milho modificadas que possuem pelo menos um traço agronômico benéfico e pelo menos um órgão ou espiga reprodu- tiva fêmea que é substancial ou completamente livre de tipos estranhos. O traço agronômico benéfico pode incluir, por exemplo, altura de planta mais curta, comprimento de Interno mais curto em um ou mais Internos, diâmetro de haste ou caule maior (mais espesso), maior resistência ao alojamento, melhor tolerância à seca, maior eficiência de uso de nitro- gênio, melhor eficácia no uso de nitrogênio, raízes mais profundas, área foliar maior, fechamento mais precoce do dossel e/ou aumento do ren- dimento do que pode ser colhido.
Os tipos não incluídos podem incluir esterilidade de macho (borla ou antera), número reduzido de caroços ou sementes, e/ou a presença de uma ou mais estruturas reprodutivas masculinizadas ou macho (ou tipo macho) no órgão ou na espiga fêmea (por exemplo, antera da espiga) da planta.
Uma planta de milho modifi- cada é fornecida neste documento que carece de tipos estranhos signi- ficativos nos tecidos reprodutivos da planta.
Tal planta de milho modifi- cada pode ter um órgão ou espiga reprodutivo fêmea que parece normal em relação a uma planta de controle ou tipo selvagem.
De fato, são fornecidas plantas de milho modificadas que compreendem pelo menos um órgão ou espiga reprodutivo que não possui ou exibe, ou é substan- cial ou completamente livre de tipos estranhos, incluindo esterilidade masculina, número reduzido de caroços ou sementes, e/ou estrutura(s) masculinizada(s) em um ou mais órgãos ou espigas fêmeas.
Conforme utilizado neste documento, um órgão ou espiga fêmea de uma planta, como o milho, é "substancialmente livre" das estruturas reprodutivas macho se as estruturas reprodutivas macho estiverem ausentes ou quase ausentes no órgão fêmea ou espiga da planta com base na ins- peção visual do órgão ou espiga fêmea em estágios reprodutivos pos- teriores.
Um órgão ou espiga fêmea de uma planta, como o milho, é "completamente livre" de estruturas reprodutivas macho maduras se as estruturas reprodutivas macho estiverem ausentes ou não forem obser- vadas ou observáveis no órgão ou espiga fêmea da planta, como uma planta de milho, por inspeção visual do órgão ou espiga fêmea em es- tágios reprodutivos posteriores.
Um órgão ou espiga fêmea de uma planta, como o milho, sem tipos estranhos significativos e substancial- mente livre de estruturas reprodutivas macho na espiga pode ter um número de caroços ou sementes por órgão ou espiga fêmea da planta que é de pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, pelo menos 99,5%, pelo menos 99,6%, pelo menos 99,7%, pelo menos 99,8% ou pelo me- nos 99,9 % do número de caroços ou sementes por órgão ou espiga fêmea de uma planta tipo selvagem ou controle. Da mesma forma, um órgão ou espiga fêmea de uma planta, como o milho, sem tipos estra- nhos significativos e substancialmente livre de estruturas reprodutivas macho na espiga pode ter um peso médio de caroço ou semente por órgão ou espiga fêmea da planta que é pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, pelo menos 99,5%, pelo menos 99,6%, pelo menos 99,7%, pelo menos 99,8%, ou pelo menos pelo menos 99,9% do peso médio do ca- roço ou da semente por órgão ou espiga fêmea de uma planta tipo sel- vagem ou controle. Um órgão ou espiga fêmea de uma planta, como o milho, completamente livre de estruturas reprodutivas macho maduras, pode ter um número de sementes ou caroços por órgão ou espiga fêmea da planta que é quase o mesmo que o de ma planta de controle ou tipo selvagem. Por outras palavras, o desenvolvimento reprodutivo do órgão ou espiga fêmea da planta pode ser normal ou substancialmente nor- mal. No entanto, o número de sementes ou caroços por órgão ou espiga fêmea pode depender de outros fatores que afetam a utilização de re- cursos e o desenvolvimento da planta. Na verdade, o número de caro- ços ou sementes por órgão ou espiga fêmea da planta e/ou o peso do caroço ou semente por órgão ou espiga fêmea da planta pode ser apro- ximadamente o mesmo ou maior do que uma planta tipo selvagem ou controle.
[0031] O hormônio vegetal giberelina desempenha um papel impor- tante em vários processos de desenvolvimento de plantas, incluindo germinação, alongamento celular, floração, embriogênese e desenvol- vimento de sementes. Certas enzimas biossintéticas (por exemplo, GA20 oxidase e GA3 oxidase) e enzimas catabólicas (por exemplo, GA2 oxidase) na via GA são críticas para afetar os níveis de GA ativa nos tecidos das plantas.
[0032] Várias das GA oxidases em plantas de cereais consistem em uma família de genes relacionados à GA oxidase. Por exemplo, o milho tem uma família de pelo menos nove genes da GA20 oxidase que in- cluem GA20 oxidase_1, GA20 oxidase_2, GA20 oxidase_3, GA20 oxi- dase_4, GA20 oxidase_5, GA20 oxidase_6, GA20 oxidase_7, GA20 oxi- dase_8, e GA20 oxidase_9. No entanto, existem apenas duas GA3 oxi- dases no milho, GA3 oxidase_1 e GA3 oxidase_2. As sequências de DNA e proteína por SEQ ID NOs para cada um desses genes da GA20 oxidase são fornecidas na Tabela 1. Tabela 1. Sequências de DNA e proteína por identificador de se- quência para genes GA20 oxidase em milho. gene GA20 oxidase cDNA Sequência Codificante (CDS) Proteína GA20 oxidase_1 SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 2 SEQ ID NO: 3 GA20 oxidase_2 SEQ ID NO: 4 SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 6 GA20 oxidase_3 SEQ ID NO: 7 SEQ ID NO: 8 SEQ ID NO: 9 GA20 oxidase_4 SEQ ID NO: 10 SEQ ID NO: 11 SEQ ID NO: 12 GA20 oxidase_5 SEQ ID NO: 13 SEQ ID NO: 14 SEQ ID NO: 15 GA20 oxidase_6 SEQ ID NO: 16 SEQ ID NO: 17 SEQ ID NO: 18 GA20 oxidase_7 SEQ ID NO: 19 SEQ ID NO: 20 SEQ ID NO: 21 GA20 oxidase_8 SEQ ID NO: 22 SEQ ID NO: 23 SEQ ID NO: 24 GA20 oxidase_9 SEQ ID NO: 25 SEQ ID NO: 26 SEQ ID NO: 27
[0033] A sequência de DNA genômico de GA20 oxidase_3 é forne- cida na SEQ ID NO: 34 e a sequência de DNA genômico de GA20 oxi- dase_5 é fornecida na SEQ ID NO: 35. Para o gene GA20 oxidase_3, a SEQ ID NO: 34 fornece 3000 nucleotídeos a montante da GA20 oxi- dase_3 5'-UTR; os nucleotídeos 3001-3096 correspondem à 5’-UTR; os nucleotídeos 3097-3665 correspondem ao primeiro éxon; os nucleotí- deos 3666-3775 correspondem ao primeiro íntron; os nucleotídeos 3776-4097 correspondem ao segundo éxon; os nucleotídeos 4098-5314 correspondem ao segundo íntron; os nucleotídeos 5315-5584 corres- pondem ao terceiro éxon; e os nucleotídeos 5585-5800 correspondem à 3’-UTR. A SEQ ID NO: 34 também fornece 3000 nucleotídeos a ju- sante da extremidade 3'-UTR (nucleotídeos 5801-8800). Para o gene GA20 oxidase_5, a SEQ ID NO: 35 fornece 3000 nucleotídeos a mon- tante do códon de iniciação de GA20 oxidase_5 (nucleotídeos 1-3000); os nucleotídeos 3001-3791 correspondem ao primeiro éxon; os nucleo- tídeos 3792-3906 correspondem ao primeiro íntron; os nucleotídeos 3907-4475 correspondem ao segundo éxon; os nucleotídeos 4476-5197 correspondem ao segundo íntron; os nucleotídeos 5198-5473 corres- pondem ao terceiro éxon; e os nucleotídeos 5474-5859 correspondem à 3’-UTR. A SEQ ID NO: 35 também fornece 3000 nucleotídeos a ju- sante da extremidade do 3'-UTR (nucleotídeos 5860-8859).
[0034] Uma planta modificada, parte de planta, célula ou explante no presente documento fornecida pode ser de uma variedade ou linha- gem de elite. Conforme utilizado neste documento, variedade "cultivada" ou "de elite" significa qualquer planta ou variedade que tenha resultado de melhoria e seleção para desempenho agronômico superior. Uma planta, célula ou explante editada no presente documento fornecida pode ser uma planta, célula ou explante híbrido. Conforme utilizado neste documento, um "híbrido" é criado cruzando duas plantas de dife- rentes variedades, linhagens, endogamias ou espécies, de modo que a progênie compreenda material genético de cada progenitor. Artesãos versados reconhecem que híbridos de ordem superior também podem ser gerados. Por exemplo, um primeiro híbrido pode ser feito cruzando a Variedade A com a Variedade B para criar um híbrido A x B, e um segundo híbrido pode ser feito cruzando a Variedade C com a Varie- dade D para criar um híbrido C x D. O primeiro e o segundo híbridos podem ser cruzados ainda mais para criar o híbrido de ordem superior (A x B) x (C x D) compreendendo informações genéticas de todas as quatro variedades progenitoras.
[0035] Mutações direcionadas no genoma de uma planta podem ser feitas através da introdução de uma ruptura de fita dupla (DSB) ou corte. De acordo com esta abordagem, mutações, como deleções, inserções, inversões e/ou substituições, podem ser introduzidas no sítio alvo atra- vés de reparo imperfeito do DSB ou corte para produzir um knock-out ou knock-down de um gene GA oxidase. Tais mutações podem ser ge- radas por reparo imperfeito do sítio alvo, mesmo sem o uso de uma molécula de modelo de doador. Um "knock-out" de um gene GA oxidase pode ser alcançado pela indução de um DSB ou corte no ou perto do sítio endógeno do gene GA oxidase que resulta na não expressão da proteína de GA oxidase ou na expressão de uma proteína não funcional, enquanto um "knock-down" de um gene GA oxidase pode ser alcançado de maneira semelhante, induzindo um DSB ou corte no ou perto do lo- cus endógeno do gene GA oxidase que é reparado imperfeitamente em um sítio que não afeta a sequência de codificação do gene GA oxidase de uma maneira que elimina a função da proteína de GA oxidase codi- ficada. Por exemplo, o sítio do DSB ou corte dentro do locus endógeno pode estar na região a montante ou 5' do gene GA oxidase (por exem- plo, uma sequência promotora ou intensificadora) para afetar ou reduzir seu nível de expressão. Da mesma forma, essas mutações de knock- out ou knock-down direcionadas de um gene GA oxidase podem ser geradas com uma molécula de modelo de doador para direcionar uma mutação específica ou desejada no próximo ao sítio alvo, via reparo do DSB ou corte. A molécula do modelo de doador pode compreender uma sequência homóloga com ou sem uma sequência de inserção e com- preendendo uma ou mais mutações, como uma ou mais deleções, in- serções, inversões e/ou substituições, relativas à sequência genômica direcionada no ou próximo ao sítio do DSB ou corte. Por exemplo, mu- tações knock-out direcionadas de um gene podem ser alcançadas pela deleção ou inversão de pelo menos uma porção do gene GA oxidase ou pela introdução de um deslocamento de estrutura ou de um códon de parada prematuro na sequência de codificação do gene. Uma deleção de uma porção de um gene GA oxidase também pode ser introduzida através da geração de DSBs ou cortes em dois sítios alvo e causando uma deleção da região-alvo intermediária flanqueada pelos sítios alvo.
[0036] Uma nuclease específica de sítio no presente documento for- necida pode ser selecionada do grupo que consiste em uma nuclease de dedo de zinco (ZFN), uma meganuclease, uma endonuclease guiada por RNA, uma endonuclease TALE (TALEN), uma recombinase, uma transposase ou qualquer combinação dos mesmos. Ver, por exemplo, Khandagale, K. et al., “Genome editing for targeted improvement in plants,” Plant Biotechnol Rep 10: 327-343 (2016); e Gaj, T. et al., “ZFN, TALEN and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering,” Trends Biotechnol. 31(7): 397-405 (2013), cujos conteúdos e divulga- ções são incorporados neste documento por referência. Uma recombi- nase pode ser uma serina recombinase ligada a um motivo de reconhe- cimento de DNA, uma tirosina recombinase ligada a um motivo de reco- nhecimento de DNA ou outra enzima recombinase conhecida na téc- nica. Uma recombinase ou transposase pode ser uma DNA transposase ou recombinase ligada a um domínio de ligação ao DNA. Uma tirosina recombinase ligada a um motivo de reconhecimento de DNA pode ser selecionada do grupo que consiste em uma Cre recombinase, uma Flp recombinase e uma recombinase Tnp1. De acordo com algumas moda-
lidades, uma Cre recombinase or a Gin recombinase fornecidas no pre- sente documento são amarradas a um domínio de ligação a DNA de dedo de zinco. Em outra modalidade, uma serina recombinase fixada a um motivo de reconhecimento de DNA fornecida no presente docu- mento é selecionada a partir do grupo que consiste numa PhiC31 inte- grase, uma R4 integrase e uma TP-901 integrase. Em outra modalidade, uma DNA transposase fixada a um domínio de ligação ao DNA fornecida no presente documento é selecionada do grupo que consiste num TALE-piggyBac e TALE-Mutator.
[0037] De acordo com modalidades da presente invenção, uma en- donuclease guiada por RNA pode ser selecionada do grupo que con- siste em Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9 (também conhecido como Csn1 e Csx12), Cas10, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1, Cse2, Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3, Csf4, Cpf1, CasX, CasY, e homólogos ou versões modificadas dos mesmos, Argonauta (exemplos não limitativos de proteínas Argonautas incluem Thermus thermophilus Argonaute (TtAgo), Pyrococcus furiosus Argonaute (PfAgo), Natronobacterium gregoryi Argonaute (NgAgo) e homólogos ou versões modificadas dos mesmos. De acordo com algu- mas modalidades, uma endonuclease guiada por RNA pode ser uma enzima Cas9 ou Cpf1.
[0038] Em um aspecto, uma nuclease específica de sítio no pre- sente documento fornecida é selecionada do grupo que consiste em uma nuclease de dedo de zinco, uma meganuclease, uma nuclease gui- ada por RNA, uma nuclease TALE, uma recombinase, uma transposase ou qualquer combinação das mesmas. Em outro aspecto, uma nuclease específica de sítio no presente documento fornecida é selecionada a do grupo que consiste em um Cas9 ou um Cpf1. Em outro aspecto, uma nuclease específica de sítio no presente documento fornecida é seleci- onada do grupo que consiste em um Cas1, um Cas1B, um Cas2, um Cas3, um Cas4, um Cas5, um Cas6, um Cas7, um Cas8, um Cas9, um Cas10, um Csy1, um Csy2, um Csy3, um Cse1, um Cse2, um Csc1, um Csc2, um Csa5, um Csn2, um Csm2, um Csm3, um Csm4, um Csm5, um Csm6, um Cmr1, um Cmr3, um Cmr4, um Cmr5, um Cmr6, um Csb1, um Csb2, um Csb3, um Csx17, um Csx14, um Csx10, um Csx16, um CsaX, um Csx3, um Csx1, um Csx15, um Csf1, um Csf2, um Csf3, um Csf4, um Cpf1, CasX, CasY, um homólogo do mesmo ou uma versão modificada do mesmo.
Em outro aspecto, uma nuclease guiada por RNA no presente documento fornecida no presente documento é sele- cionada do grupo que consiste em um Cas9 ou um Cpf1. Em outro as- pecto, uma nuclease guiada por RNA fornecida no presente documento é selecionada do grupo que consiste em um Cas1, um Cas1B, um Cas2, um Cas3, um Cas4, um Cas5, um Cas6, um Cas7, um Cas8, um Cas9, um Cas10, um Csy1, um Csy2, um Csy3, um Cse1, um Cse2, um Csc1, um Csc2, um Csa5, um Csn2, um Csm2, um Csm3, um Csm4, um Csm5, um Csm6, um Cmr1, um Cmr3, um Cmr4, um Cmr5, um Cmr6, um Csb1, um Csb2, um Csb3, um Csx17, um Csx14, um Csx10, um Csx16, um CsaX, um Csx3, um Csx1, um Csx15, um Csf1, um Csf2, um Csf3, um Csf4, um Cpf1, CasX, CasY, um homólogo do mesmo ou uma versão modificada do mesmo.
Em outro aspecto, um método e/ou uma composição fornecida no presente documento compreende pelo menos um, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, pelo menos oito, pelo menos nove, ou pelo menos dez nucleases específicas de sítio.
Em ainda outro aspecto, um método e/ou uma composição fornecida neste documento compreende pelo menos um, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, pelo menos oito, pelo menos nove, ou pelo menos dez polinucleotídeos que codificam pelo menos um, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, pelo menos oito, pelo menos nove, ou pelo menos dez nucleases espe- cíficas de sítio.
[0039] Para endonucleases guiadas por RNA, uma molécula de RNA guia (gRNA) é ainda fornecida para dirigir a endonuclease para um sítio alvo no genoma da planta via pareamento de base ou hibridação para causar um DSB ou corte no sítio ou próximo. O gRNA pode ser transformado ou introduzido em uma célula ou tecido de planta (talvez junto com uma nuclease, ou molécula de DNA que codifica nuclease, construto ou vetor) como uma molécula de gRNA ou como uma molé- cula de DNA recombinante, construto ou vetor compreendendo uma se- quência de DNA transcritível que codifica o RNA guia operativamente ligado a um promotor expressável em plantas. Como entendido na téc- nica, um "RNA guia" pode compreender, por exemplo, um RNA CRISPR (crRNA), um RNA guia de fita única (sgRNA) ou qualquer outra molécula de RNA que possa guiar ou dirigir uma endonuclease para um sítio alvo específico no genoma. Um "RNA guia de cadeia única" (ou "sgRNA") é uma molécula de RNA que compreende um crRNA ligado covalente- mente a um tracrRNA por uma sequência de ligação, que pode ser ex- pressa como um único transcrito ou molécula de RNA. O RNA guia com- preende uma sequência guia ou de direcionamento que é idêntica ou complementar a um sítio alvo no genoma da planta, como em ou pró- ximo a um gene GA oxidase. Um motivo protoespaçador-adjacente (PAM) pode estar presente no genoma imediatamente adjacente e a montante da extremidade 5'da sequência do sítio alvo genômico com- plementar à sequência de direcionamento do RNA guia - isto é, imedia- tamente a jusante (3') para a fita de sentido (+) do sítio alvo genômico (em relação à sequência de direcionamento do RNA guia) como conhe- cido na técnica. Ver, por exemplo, Wu, X. et al., “Target specificity of the
CRISPR-Cas9 system,” Quant Biol. 2(2):59-70 (2014), cujo conteúdo e invenção são no presente documento incorporados por referência. A se- quência PAM genômica na fita de sentido (+) adjacente ao sítio alvo (em relação à sequência de direcionamento do RNA guia) pode compreen- der 5'-NGG-3'. No entanto, a sequência correspondente do RNA guia (isto é, imediatamente a jusante (3') da sequência alvo do RNA guia) pode geralmente não ser complementar à sequência genômica do PAM. O RNA guia normalmente pode ser uma molécula de RNA não codifi- cante que não codifica uma proteína. A sequência guia do RNA guia pode ter pelo menos 10 nucleotídeos de comprimento, como 12-40 nu- cleotídeos, 12-30 nucleotídeos, 12-20 nucleotídeos, 12-35 nucleotídeos, 12-30 nucleotídeos, 15-30 nucleotídeos, 17-30 nucleotídeos, ou 17-25 nucleotídeos de comprimento, ou cerca de 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ou mais nucleotídeos de comprimento. A se- quência guia pode ser pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 99% ou 100% idêntica ou complementar a pelo menos 10, pelo menos 11, pelo menos 12, pelo menos 13, pelo menos 14, pelo menos 15, pelo menos 16, pelo menos 17, pelo menos 18, pelo menos 19, pelo menos 20, pelo menos 21, pelo menos 22, pelo menos 23, pelo menos 24, pelo menos 25 ou mais nucleotídeos consecutivos de uma sequência de DNA no sítio alvo genômico.
[0040] Em um aspecto, o gene de GA20 oxidase_3 é editado atra- vés de uma técnica de edição de genoma. Para a edição do genoma no ou próximo ao gene GA20 oxidase_3 com uma endonuclease guiada por RNA, um RNA guia pode ser usado compreendendo uma sequência guia que é pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, em pelo menos 99% ou 100% idêntica ou complementar a pelo menos 10, pelo menos 11, pelo menos 12, pelo menos 13, pelo menos 14, pelo menos 15, pelo menos 16, pelo menos 17, pelo menos 18, pelo menos 19, pelo menos 20, pelo menos 21, pelo menos 22, pelo menos 23, pelo menos 24, pelo menos 25, ou mais nucleotídeos conse- cutivos da SEQ ID NO: 34 ou uma sequência complementar à mesma (por exemplo, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ou mais nucleotídeos consecutivos de SEQ ID NO: 34 ou uma sequência complementar à mesma). Para a edição do genoma no ou próximo ao gene GA20 oxidase_5 com uma endonuclease guiada por RNA, um RNA guia pode ser usado compreendendo uma sequência guia que é pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, em pelo menos 99% ou 100% idêntica ou complementar a pelo menos 10, pelo menos 11, pelo menos 12, pelo menos 13, pelo menos 14, pelo menos 15, pelo menos 16, pelo menos 17, pelo menos 18, pelo menos 19, pelo menos 20, pelo menos 21, pelo menos 22, pelo menos 23, pelo menos 24, pelo menos 25, ou mais nucleotídeos consecutivos da SEQ ID NO: 35 ou uma sequência complementar à mesma (por exemplo, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ou mais nucleo- tídeos consecutivos da SEQ ID NO: 35 ou uma sequência complemen- tar à mesma). Como no presente documento utilizado, o termo "conse- cutivo" em referência a uma sequência de polinucleotídeos ou de prote- ínas significa sem deleções ou folgas na sequência.
[0041] Para mutações knockdown (e possivelmente knockout) atra- vés da edição do genoma, uma endonuclease guiada por RNA pode ser direcionada para uma sequência a montante ou a jusante, tal como uma sequência promotora e/ou intensificadora, ou um íntron, 5'UTR e/ou se- quência 3'UTR de um gene GA20 oxidase_3 ou GA20 oxidase_5 para mutar uma ou mais sequências promotoras e/ou regulatórias do gene e afetar ou reduzir seu nível de expressão. Para knockdown (e possivel- mente knockout) do gene GA20 oxidase_3 no milho, um RNA guia pode ser usado compreendendo uma sequência guia que é pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 99 % ou 100% idêntica ou complementar a pelo menos 10, pelo menos 11,
pelo menos 12, pelo menos 13, pelo menos 14, pelo menos 15, pelo menos 16, pelo menos 17, pelo menos 18, pelo menos 19, pelo menos 20, pelo menos 21, pelo menos 22, pelo menos 23, pelo menos 24, pelo menos 25 ou mais nucleotídeos consecutivos dentro do intervalo de se- quência nucleotídicas 1-3096 da SEQ ID NO: 34, o intervalo de sequên- cia nucleotídicas 3666-3775 da SEQ ID NO: 34, o intervalo de sequência nucleotídicas 4098-5314 da SEQ ID NO: 34, o intervalo de sequência nucleotídicas 5585-5800 da SEQ ID NO: 34 ou o intervalo de sequência nucleotídicas 5801-8800 da SEQ ID NO: 34, ou a sequência comple- mentar à mesma (por exemplo, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ou mais nucleotídeos consecutivos dentro do in- tervalo de sequência nucleotídicas 1-3096, 3666-3775, 4098-5314, 5585-5800, 5801-8800 ou 5585-8800 da SEQ ID NO: 34, ou uma se- quência complementar à mesma).
[0042] Para knockdown (e possivelmente knockout) do gene GA20 oxidase_5 no milho, um RNA guia pode ser usado compreendendo uma sequência guia que é pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 99% ou 100% idêntica ou comple- mentar a pelo menos 10, pelo menos 11, pelo menos 12, pelo menos 13, pelo menos 14, pelo menos 15, pelo menos 16, pelo menos 17, pelo menos 18, pelo menos 19, pelo menos 20, pelo menos 21, pelo menos 22, pelo menos 23, pelo menos 24, pelo menos 25 ou mais nucleotídeos consecutivos dentro do intervalo de sequência nucleotídicas 1-3000 da SEQ ID NO: 35, o intervalo de sequência nucleotídicas 1-3000 da SEQ ID NO: 35, o intervalo de sequência nucleotídicas 3792-3906 da SEQ ID NO: 35, o intervalo de sequência nucleotídicas 4476-5197 da SEQ ID NO: 35 ou o intervalo de sequência nucleotídicas 5860-8859 da SEQ ID NO: 35, ou uma sequência complementar à mesma (por exemplo, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ou mais nucleo- tídeos consecutivos dentro do intervalo de sequência nucleotídicas 1-
3000, 3792-3906, 4476-5197 ou 5860-8859 de SEQ ID NO: 35, ou uma sequência complementar à mesma).
[0043] Para mutações knockout (e possivelmente knockdown) atra- vés da edição de genoma, uma endonuclease guiada por RNA pode ser direcionada para uma sequência de codificação e/ou íntron de um gene GA20 oxidase_3 ou GA20 oxidase_5 para eliminar potencialmente a ex- pressão e/ou atividade de uma proteína de GA oxidase funcional do gene. No entanto, um knockout de uma expressão do gene GA oxidase também pode ser alcançado em alguns casos, direcionando a(s) se- quência(s) a montante e/ou 5'UTR do gene, ou outras sequências no ou próximo ao locus genômico do gene. Assim, um knockout de uma ex- pressão do gene GA oxidase pode ser alcançado direcionando uma se- quência genômica no ou próximo ao sítio ou locus de um gene GA20 oxidase_3 ou GA20 oxidase_5, uma sequência a montante ou a jusante, tal como uma sequência promotora e/ou intensificado, ou um íntron, 5'UTR e/ou sequência 3'UTR, de um gene GA20 oxidase_3 ou GA20 oxidase_5, como descrito acima para knockdown de um gene GA20 oxi- dase_3 ou GA20 oxidase_5.
[0044] Para knockout (e possivelmente knockdown) do gene GA20 oxidase_3 no milho, um RNA guia pode ser usado compreendendo uma sequência guia que é pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 99% ou 100% idêntica ou comple- mentar a pelo menos 10, pelo menos 11, pelo menos 12, pelo menos 13, pelo menos 14, pelo menos 15, pelo menos 16, pelo menos 17, pelo menos 18, pelo menos 19, pelo menos 20, pelo menos 21, pelo menos 22, pelo menos 23, pelo menos 24, pelo menos 25 ou mais nucleotídeos consecutivos dentro do intervalo de sequência nucleotídica 3097-5584 da SEQ ID NO: 34, o intervalo de sequência nucleotídica 3097- 3665 da SEQ ID NO: 34, o intervalo de sequência nucleotídica 3776-4097 da SEQ ID NO: 34 ou o intervalo de sequência nucleotídica 5315-5584 da
SEQ ID NO: 34 ou uma sequência complementar à mesma (por exem- plo, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ou mais nucleotídeos consecutivos dentro do intervalo de sequências de nucle- otídeos 3097-5584, 3097-3665, 3097-3775, 3665-4097, 3776-4097, 3776-5314, 4098-5584 ou 5315-5584 da SEQ ID NO: 34, ou uma se- quência complementar à mesma).
[0045] Para knockout (e possivelmente knockdown) do gene GA20 oxidase_5 em milho, um RNA guia pode ser usado compreendendo uma sequência guia que é pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 99% ou 100% idêntica ou comple- mentar a pelo menos 10, pelo menos 11, pelo menos 12, pelo menos 13, pelo menos 14, pelo menos 15, pelo menos 16, pelo menos 17, pelo menos 18, pelo menos 19, pelo menos 20, pelo menos 21, pelo menos 22, pelo menos 23, pelo menos 24, pelo menos 25 ou mais nucleotídeos consecutivos dentro do intervalo de sequência nucleotídicas 3001-5473 da SEQ ID NO: 35, o intervalo de sequência nucleotídicas 3001-3791 da SEQ ID NO: 35, o intervalo de sequência nucleotídicas 3907-4475 da SEQ ID NO: 35, ou o intervalo de sequência nucleotídicas 5198-5473 da SEQ ID NO: 35, ou uma sequência complementar à mesma (por exemplo, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ou mais nucleotídeos consecutivos dentro do intervalo de sequência nucle- otídicas 3001-5473, 3001-3791, 3001-3906, 3792-4475, 3907-4475, 3907-5197, 4476-5473 ou 5198-5473 de SEQ ID NO: 35, ou um sequên- cia complementar à mesma).
[0046] De acordo com algumas modalidades, um RNA guia para di- recionar um gene endógeno de GA20 oxidase_3 e/ou GA20 oxidase_5, que pode compreender uma sequência guia que é pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 99% ou 100% idêntica ou complementar a pelo menos 10, pelo menos 11, pelo menos 12, pelo menos 13, pelo menos 14, pelo menos 15, pelo menos 16, pelo menos 17, pelo menos 18, pelo menos 19, pelo menos 20 ou pelo menos 21 nucleotídeos consecutivos de qualquer uma ou mais das SEQ ID NOs: 138-167. De acordo com algumas modalidades, um RNA guia para direcionar ambos os genes endógenos de GA20 oxi- dase_3 e GA20 oxidase_5, que podem compreender uma sequência guia que é pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 99% ou 100% idêntica ou complementar a pelo menos 10, pelo menos 11, pelo menos 12, pelo menos 13, pelo menos 14, pelo menos 15, pelo menos 16, pelo menos 17, pelo menos 18, pelo menos 19, pelo menos 20 ou pelo menos 21 nucleotídeos consecutivos da SEQ ID NO: 34, e pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 99% ou 100% idêntica ou comple- mentares a pelo menos 10, pelo menos 11, pelo menos 12, pelo menos 13, pelo menos 14, pelo menos 15, pelo menos 16, pelo menos 17, pelo menos 18, pelo menos 19, pelo menos 20 ou pelo menos 21 nucleotí- deos consecutivos da SEQ ID NO: 35. De acordo com algumas modali- dades, um RNA guia para direcionar ambos os genes endógenos de GA20 oxidase_3 e GA20 oxidase_5, que pode compreender uma se- quência guia que é pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 99% ou 100% idêntica ou comple- mentar a pelo menos 10, pelo menos 11, pelo menos 12, pelo menos 13, pelo menos 14, pelo menos 15, pelo menos 16, pelo menos 17, pelo menos 18, pelo menos 19, pelo menos 20 ou pelo menos 21 nucleotí- deos consecutivos de qualquer uma ou mais das SEQ ID NOs: 158-167.
[0047] Além da sequência guia, um RNA guia pode compreender ainda uma ou mais outra(s) sequência(s) estruturais ou de andaime, que podem se ligar ou interagir com uma endonuclease guiada por RNA. Tais sequências de andaime estruturais podem interagir ainda mais com outras moléculas de RNA (por exemplo, tracrRNA). Métodos e técnicas para projetar construtos de direcionamento e RNAs guia para edição de genoma e integração direcionada ao sítio em um sítio alvo dentro do genoma de uma planta usando uma endonuclease guiada por RNA são conhecidos na técnica.
[0048] De acordo com algumas modalidades, construtos e vetores de DNA recombinante são fornecidos compreendendo uma sequência polinucleotídica que codifica uma nuclease específica de sítio, como uma nuclease de dedo de zinco (ZFN), uma meganuclease, uma endo- nuclease guiada por RNA, uma TALE-endonuclease (TALEN), uma re- combinase ou uma transposase, em que a sequência de codificação está operacionalmente ligada a um promotor expressável em planta. Para endonucleases guiadas por RNA, construtos e vetores de DNA re- combinante são ainda fornecidos compreendendo uma sequência poli- nucleotídica que codifica um RNA guia, em que o RNA guia compreende uma sequência guia de comprimento suficiente com uma porcentagem de identidade ou complementaridade com um sítio alvo dentro do ge- noma de uma planta, tal como em ou próximo de um gene GA oxidase direcionado. De acordo com algumas modalidades, uma sequência po- linucleotídica de um construto de DNA recombinante e vetor que codifica uma nuclease específica de sítio ou um RNA guia pode ser operacio- nalmente ligada a um promotor expressável em planta, tal como um pro- motor induzível, um promotor constitutivo, um promotor específico de tecido, etc.
[0049] Em um aspecto, a presente invenção fornece uma planta de milho modificada, ou parte de planta da mesma, compreendendo um alelo mutante no lócus de GA20 oxidase_3 e um alelo mutante do lócus de GA20 oxidade_5, em que pelo menos um dos loci de GA20 oxi- dase_3 e de GA20 oxidase_5 compreende alelos mutantes homozigo- tos. Em outro aspecto, uma planta de milho modificada compreende ale- los homozigotos no locus de GA20 oxidase_3. Em outro aspecto, uma planta de milho modificada compreende alelos homozigotos no locus de
GA20 oxidase_5. Em um aspecto adicional, apenas um dos loci de GA20 oxidase_3 e GA20 oxidase_5 compreende alelos homozigotos em uma planta de milho modificada. Em outro aspecto, uma planta de milho modificada compreende alelos homozigotos em ambos os loci de GA20 oxidase_3 e GA20 oxidase_5. Em outro aspecto, um ou ambos os loci de GA20 oxidase_3 e GA20 oxidase_5 compreendem uma com- binação heteroalélica ou dois alelos mutantes idênticos em uma planta modificada. Em um aspecto, uma planta modificada compreende um lo- cus de GA20 oxidase_3 homozigoto compreendendo uma combinação heteroalélica de alelos mutantes e um locus de GA20 oxidase_5 hete- rozigoto. Em outro aspecto, uma planta modificada compreende um lo- cus de GA20 oxidase_3 homozigoto compreendendo uma combinação heteroalélica de alelos mutantes e um locus de GA20 oxidase _5 hete- rozigoto. Em um aspecto, uma planta modificada compreende um locus de GA20 oxidase_3 heterozigoto e um locus de GA20 oxidase_5 homo- zigoto compreendendo uma combinação heteroalélica de alelos mutan- tes. Em outro aspecto, uma planta modificada compreende um locus de GA20 oxidase_3 heterozigoto e um locus de GA20 oxidase_5 homozi- goto compreendendo dois alelos mutantes idênticos.
[0050] Em outro aspecto, a presente invenção fornece uma planta de milho modificada, ou parte de planta da mesma, compreendendo uma primeira mutação homozigota em um dos genes de GA20 oxi- dase_3 e GA20 oxidase_5 e ainda compreendendo uma segunda mu- tação heterozigota ou homozigota no outro dos genes de GA20 oxi- dase_3 e GA20 oxidase_5. Em um aspecto, uma primeira mutação ho- mozigota está em GA20 oxidase_3. Em outro aspecto, uma segunda mutação é heterozigota em GA20 oxidase_5. Em um aspecto, uma pri- meira mutação homozigota está em GA20 oxidase_5. Em outro aspecto, uma segunda mutação é heterozigota em GA20 oxidase_3. Em um as- pecto adicional, uma primeira mutação homozigota compreende uma combinação heteroalélica de mutações ou dois alelos mutantes idênti- cos em um dos genes de GA20 oxidase_3 e GA20 oxidase_5.
[0051] Em um aspecto, um locus ou gene de GA20 oxidase_3 com- preende uma sequência que compartilha pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 99% ou pelo me- nos 99,5% de identidade de sequência com a SEQ ID No. 34 ou 168. Em um aspecto, um locus ou gene de GA20 oxidase_5 compreende uma sequência que compartilha pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 99% ou pelo menos 99,5% de identidade de sequência com a SEQ ID No 35 ou 169.
[0052] Em um aspecto, uma mutação de GA20 oxidase_3 ou GA20 oxidase_5 (gene mutante ou alelo mutante) compreende um tipo de mu- tação selecionado do grupo que consiste em uma mutação sem sentido, uma mutação de sentido incompatível, uma mutação de mudança de estrutura e uma mutação de sítio de junção. Em um aspecto, uma mu- tação de GA20 oxidase_3 ou GA20 oxidase_5 (ou alelo mutante) resulta em um mRNA ou polipeptídeo truncado, ou resulta em uma molécula de mRNA não traduzível. Uma mutação de sentido incompatível é uma al- teração em um par de bases de DNA que resulta na substituição de um aminoácido por outro na proteína produzida por um gene. Uma mutação sem sentido também é uma alteração em um par de bases de DNA. Em vez de substituir um aminoácido por outro, no entanto, a sequência de DNA alterada sinaliza prematuramente a célula para parar de construir uma proteína. Esse tipo de mutação resulta em uma proteína reduzida que pode funcionar inadequadamente ou não funcionar. Uma mutação de deslocamento de estrutura ocorre quando a adição ou perda de ba- ses de DNA altera a estrutura de leitura de um gene. Uma mutação de deslocamento de estrutura altera o agrupamento dessas bases e altera o código dos aminoácidos. A proteína resultante, mesmo se feita, geral- mente não é funcional. Inserções, deleções e duplicações podem ser mutações de deslocamento de estrutura. Em outro aspecto, uma muta- ção de GA20 oxidase_3 ou GA20 oxidase_5 (gene mutante ou alelo mutante) pode compreender uma mutação silenciosa que não altera uma sequência de aminoácidos codificada, mas pode afetar a expres- são do transcrito de mRNA, a estabilidade ou a eficiência da tradução de proteínas ou de outra forma contribuir para a atividade enzimática reduzida, em relação a um gene de tipo selvagem correspondente de GA20 oxidase_3 ou GA20 oxidase_5. Em um aspecto adicional, uma mutação de GA20 oxidase_3 ou GA20 oxidase_5 (gene mutante ou alelo mutante) pode compreender uma mutação ou edição em ou em torno da caixa TATA ou outros elementos promotores que afetam a transcrição do gene. Em um aspecto, uma mutação de GA20 oxidase_3 ou alelo em uma planta de milho modificada é uma mutação ou alelo recessivo. Em um aspecto, uma mutação de GA20 oxidase_3 ou alelo em uma planta de milho modificada é uma mutação ou alelo dominante. Em um aspecto, uma mutação de GA20 oxidase_5 mutação ou alelo em uma planta de milho modificada é uma mutação ou alelo recessivo. Em um aspecto, uma mutação de GA20 oxidase_5 mutação ou alelo em uma planta de milho modificada é uma mutação ou alelo dominante.
[0053] Em um aspecto, uma mutação de GA20 oxidase_3 ou GA20 oxidase_5 (ou alelo mutante) compreende uma mutação em uma região de sequência de GA20 oxidase_3 ou GA20 oxidase_5 selecionada do grupo que consiste em um promotor, 5 'UTR, primeiro éxon, primeiro íntron, segundo éxon, segundo íntron, terceiro éxon, 3' UTR e termina- dor. Em um aspecto, uma mutação de GA20 oxidase_3 ou GA20 oxi- dase_5 (ou alelo mutante) compreende uma mutação no primeiro ou segundo éxon do gene GA20 oxidase_3 ou GA20 oxidase_5.
[0054] Em um aspecto, um alelo de GA20 oxidase_3 ou GA20 oxi- dase_5 mutante exibe pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos
90%, pelo menos 95% ou 100% de redução da expressão ou atividade enzimática em relação a um alelo de gene de GA20 oxidase_3 ou GA20 oxidase_5 tipo selvagem, não modificado. Em outro aspecto, um alelo de GA20 oxidase_3 ou GA20 oxidase_5 mutante compreende uma mu- tação em uma região de sequência selecionada do grupo que consiste em um promotor, 5 'UTR, primeiro éxon, primeiro intron, segundo éxon, segundo íntron, terceiro éxon, 3' UTR, terminador e qualquer combina- ção dos mesmos. Em outro aspecto, um alelo de GA20 oxidase_3 ou GA20 oxidase_5 mutante compreende um ou mais tiposde mutação se- lecionados do grupo que consiste em uma mutação sem sentido, uma mutação de sentido incompatível, uma mutação de mudança de estru- tura, uma mutação de sítio de junção e qualquer combinação das mes- mas. Em outro aspecto, um alelo de GA20 oxidase_3 ou GA20 oxi- dase_5 mutante resulta em um ou mais dos seguintes itens: trunca- mento de proteínas, transcrição não traduzível, proteína não funcional, códon de parada prematuro e qualquer combinação dos mesmos. Em outro aspecto, um alelo de GA20 oxidase_3 ou GA20 oxidase_5 mu- tante compreende uma mutação selecionada do grupo que consiste em uma substituição, uma deleção, uma inserção, uma duplicação e uma inversão de um ou mais nucleotídeos em relação a um gene de GA20 oxidase_3 gene tipo selvagem. Em outro aspecto, um alelo de GA20 oxidase_3 ou GA20 oxidase_5 mutante compreende uma ou mais mu- tações no primeiro éxon. Em outro aspecto, um alelo de GA20 oxi- dase_3 ou GA20 oxidase_5 mutante compreende uma ou mais muta- ções no segundo éxon.
[0055] Em um aspecto, uma planta de milho modificada, ou parte de planta da mesma, compreende uma primeira mutação compreen- dendo um ou mais alelos, como um par de alelos idênticos ou uma com- binação heteroalélica, selecionada do grupo que consiste em: uma de- leção de 13 bases começando em 536; uma deleção da base 542; uma inserção de CC na base 542; uma deleção da base 541; uma deleção de 3 nt começando na base 540; uma deleção de 2 bases começando na base 422; uma inserção de um A na base 422; uma inserção de um T na base 422; uma deleção da base 564; uma inserção de um A na base 564; uma inserção de um C na base 565; e uma inserção de um C na base 63; em que a numeração de base é baseada na SEQ ID No. 168 e contada a partir do primeiro nucleotídeo da SEQ ID NO: 168 na direção de 5' para 3'. Em outro aspecto, uma planta de milho modificada, ou parte de planta da mesma, compreende uma primeira mutação com- preendendo um ou mais alelos, como um par de alelos idênticos ou uma combinação heteroalélica, selecionada do grupo que consiste em: uma deleção da base 644; uma deleção de 2 bases começando na base 644; uma inserção de um T na base 644; uma deleção da base 372; uma deleção da base 786; uma deleção de 5 bases começando na base 786; uma deleção de 2 bases começando na base 101; uma inserção de um T na base 102; uma deleção de 3 bases começando na base 99; uma inserção de um A na base 282; e uma inserção de um C na base 282; em que a numeração de base é baseada na SEQ ID No. 169 e contada a partir do primeiro nucleotídeo da SEQ ID NO: 169 na direção 5' para 3'. Em um aspecto, uma planta de milho modificada ou parte de planta da mesma compreende uma primeira mutação identificada por uma ou mais das SEQ ID Nos.: 170 a 193 e 206 a 217 em relação à sequência de referência correspondente na SEQ ID No: 168. Em um aspecto, uma planta de milho modificada ou parte de planta da mesma compreende uma primeira mutação identificada por uma ou mais das SEQ ID Nos.: 218 a 239 e 251 a 261 em relação à sequência de referência correspon- dente na SEQ ID No: 169. Em um aspecto, a presente invenção fornece uma planta progenitora de uma ou mais plantas listadas na Tabela 5 ou
6. Em outro aspecto, também é fornecida uma planta progenitora de qualquer uma das plantas Nos. 17 a 31 na Tabela 6. Em um aspecto adicional, uma planta é fornecida a partir de um cruzamento ou hibrida- ção de uma ou mais plantas listadas na Tabela 5 ou 6.
[0056] Em um aspecto, um gene de GA20 oxidase_3 gene mutante homozigoto, um gene de GA20 oxidase_5mutante homozigoto, ou am- bos compreendem uma mutação em uma região de sequência selecio- nada do grupo que consiste no promotor, 5 'UTR, primeiro éxon, pri- meiro íntron, segundo éxon, segundo íntron, terceiro éxon, 3' UTR, ter- minador e qualquer combinação dos mesmos. Em um aspecto, um gene de GA20 oxidase_3 gene mutante homozigoto, um gene de GA20 oxi- dase_5 mutante homozigoto, ou ambos compreendem tipos de mutação selecionado do grupo que consiste em uma mutação sem sentido, uma mutação de sentido incompatível, uma mutação de mudança de estru- tura, uma mutação de sítio de junção e qualquer combinação das mes- mas. Em um aspecto, um gene de GA20 oxidase_3 gene mutante ho- mozigoto, um gene de GA20 oxidase_5 mutante homozigoto, ou ambos resultam em um ou mais dos seguintes itens: truncamento de proteínas, transcrição não traduzível, proteína não funcional, códon de parada pre- maturo e qualquer combinação dos mesmos. Em um aspecto, um gene de GA20 oxidase_3 gene mutante homozigoto, um gene de GA20 oxi- dase_5 mutante homozigoto, ou ambos compreendem uma mutação selecionada do grupo que consiste em uma substituição, uma deleção, uma inserção, uma duplicação e uma inversão de um ou mais nucleotí- deos em relação a um gene de GA20 oxidase_3 gene tipo selvagem. Em um aspecto, um gene de GA20 oxidase_3 gene mutante homozi- goto, um gene de GA20 oxidase_5 mutante homozigoto, ou ambos com- preendem um alelo nulo.
[0057] Em um aspecto, uma planta de milho modificada descrita no presente documento tem uma altura de planta menor e/ou resistência melhorada ao alojamento em relação a uma planta de controle não mo- dificada. Em um aspecto, uma planta de milho modificada é pelo menos
10%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35% ou pelo menos 40% mais curto do que uma planta de controle não modificada. Em outro aspecto, uma planta de milho modificada tem um diâmetro de caule ou haste em um ou mais Internos do caule é pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35% ou pelo menos 40% maior do que o diâmetro de caule ou haste no mesmo um ou mais In- ternos de uma planta de controle não modificada. Em outro aspecto, uma planta de milho modificada tem um diâmetro de caule ou haste em um ou mais dos primeiro, segundo, terceiro, e/ou quarto Interno abaixo da espiga é pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35% ou pelo menos 40% maior do que o mesmo Interno de uma planta de con- trole não modificada. Em outro aspecto, o nível de um ou mais GAs ati- vos em pelo menos um tecido de Interno do caule ou haste de uma planta de milho modificada é de pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, em pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35% ou pelo menos 40% menor do que o mesmo tecido de entrenó de uma planta de controle não modificada. Em um aspecto, o nível de um ou mais GAs ativos em pelo menos um tecido de entrenó do caule ou haste de uma planta de milho modificada é menor do que o mesmo tecido de entrenó de uma planta de controle não modificada.
[0058] Em outro aspecto, uma planta de milho modificada não tem nenhum tipo fora significativo em pelo menos um órgão ou espiga fê- mea. Em um aspecto, uma planta de milho modificada não exibe essen- cialmente nenhuma anormalidade reprodutiva. Em um aspecto adicio- nal, uma anormalidade reprodutiva ou fora do tipo é selecionada do grupo que consiste em esterilidade de macho (borla ou antera), número reduzido de caroços ou sementes e presença de uma ou mais estruturas reprodutoras masculinizadas ou machos (ou tipo macho) no órgão ou espiga fêmea (por exemplo, antera da espiga).
[0059] Em outro aspecto, uma planta de milho modificada compre- ende um ou mais traços, em relação a uma planta de controle não mo- dificada, selecionada do grupo que consiste em altura da planta mais curta, diâmetro do caule / haste aumentado, resistência melhorada ao alojamento, estalo verde reduzido, raízes mais profundas, área foliar au- mentada, fechamento mais precoce da copa, maior condutância esto- mática, menor altura da espiga, aumento do teor de água foliar, melhora da tolerância à seca, melhora da eficiência do uso de nitrogênio, redu- ção do teor de antocianina e área nas folhas em condições normais ou limitativas de nitrogênio ou de estresse de água, aumento do peso da espiga, aumento do índice de colheita, aumento do rendimento, au- mento do número de sementes, aumento do peso da semente e au- mento da prolificidade.
[0060] Em um aspecto, uma planta de milho modificada é endogâ- mica. Em um outro aspecto, uma planta de milho modificada pode ser um híbrido. Em um aspecto, uma planta de milho modificada é uma planta modificada por uma técnica de edição de genoma direcionada.
[0061] De acordo com algumas modalidades, um construto ou vetor de DNA recombinante pode compreender uma primeira sequência poli- nucleotídica que codifica uma nuclease específica de sítio e uma se- gunda sequência polinucleotídica que codifica um RNA guia que pode ser introduzido em uma célula de planta em conjunto por meio de técni- cas de transformação de plantas. Alternativamente, dois construtos ou vetores de DNA recombinante podem ser fornecidos, incluindo um pri- meiro construto ou vetor de DNA recombinante e um segundo construto ou vetor de DNA que podem ser introduzidos em uma célula de planta juntos ou sequencialmente por meio de técnicas de transformação de plantas, em que o primeiro construto ou vetor de DNA recombinante compreende uma sequência polinucleotídica que codifica uma nuclease específica de sítio e o segundo construto ou vetor de DNA recombinante compreende uma sequência polinucleotídica que codifica um RNA guia. De acordo com algumas modalidades, um construto ou vetor de DNA recombinante compreendendo uma sequência polinucleotídica que co- difica uma nuclease específica de sítio pode ser introduzido por meio de técnicas de transformação de plantas em uma célula de planta que já compreende (ou é transformada com) um construto ou vetor de DNA recombinante compreendendo uma sequência polinucleotídica que co- difica um RNA guia. Alternativamente, um construto ou vetor de DNA recombinante compreendendo uma sequência polinucleotídica que co- difica um RNA guia pode ser introduzido por meio de técnicas de trans- formação de plantas em uma célula de planta que já compreende (ou é transformada com) um construto ou vetor de DNA recombinante com- preendendo uma sequência de polinucleotídeo que codifica uma nu- clease específica de sítio. De acordo com ainda outras modalidades, uma primeira planta compreendendo (ou transformada com) um cons- truto ou vetor de DNA recombinante compreendendo uma sequência de polinucleotídeo que codifica uma nuclease específica de sítio pode ser cruzada com uma segunda planta compreendendo (ou transformada com) um construto ou vetor de DNA recombinante compreendendo uma sequência polinucleotídica que codifica um RNA guia. Tais construtos ou vetores de DNA recombinante podem ser transitoriamente transfor- mados em uma célula vegetal ou transformados de forma estável ou integrados no genoma de uma célula de planta.
[0062] Em um aspecto, vetores compreendendo polinucleotídeos que codificam uma nuclease específica de sítio e, opcionalmente, um ou mais, dois ou mais, três ou mais ou quatro ou mais gRNAs são for- necidos a uma célula de planta por métodos de transformação conheci- dos na técnica (por exemplo, sem estar limitado, bombardeio de partí- culas, transfecção de protoplastos mediada por PEG ou transformação mediada por Agrobacterium). Em um aspecto, vetores compreendendo polinucleotídeos que codificam uma nuclease Cas9 e, opcionalmente, um ou mais, dois ou mais, três ou mais ou quatro ou mais gRNAs são fornecidos a uma célula de planta por métodos de transformação co- nhecidos na técnica (por exemplo, sem estar limitado, bombardeio de partículas, transfecção de protoplastos mediada por PEG ou transfor- mação mediada por Agrobacterium). Em outro aspecto, vetores com- preendendo polinucleotídeos que codificam um Cpf1 e, opcionalmente, um ou mais, dois ou mais, três ou mais ou quatro ou mais crRNAs são fornecidos a uma célula por métodos de transformação conhecidos na técnica (por exemplo, sem estar limitado, transfecção, bombardeio de partículas, transfecção de protoplastos mediada por PEG ou transfor- mação mediada por Agrobacterium).
[0063] Várias nucleases específicas de sítio, como recombinases, nucleases de dedo de zinco (ZFNs), meganucleases e TALENs, não são guiadas por RNA e dependem de sua estrutura de proteínas para deter- minar seu sítio alvo para causar o DSB ou corte, ou são fundidas, amar- radas ou ligadas a um domínio ou motivo de proteína de ligação ao DNA. A estrutura proteica da nuclease específica de sítio (ou o domínio de ligação de DNA fundido / ligado / amarrado) pode direcionar a nuclease específica de sítio para o sítio alvo. De acordo com muitas dessas mo- dalidades, nucleases específicas de sítio não guiadas por RNA, como recombinases, nucleases de dedo de zinco (ZFNs), meganucleases e TALENs, podem ser projetadas, engenheiradas e construídas de acordo com métodos conhecidos para atingir e se ligar a um sítio alvo no ou perto do locus genômico de um gene endógeno da GA oxidase de uma planta de milho, como o gene GA20 oxidase_3 ou o gene GA20 oxi- dase_5 gene no milho, para criar um DSB ou corte nesse locus genô- mico, para knockou ou knockdown da expressão do gene GA oxidase via reparo do DSB ou corte. Por exemplo, uma nuclease específica de um sítio engenheirado, como uma recombinase, nuclease de dedo de zinco (ZFN), meganuclease ou TALEN, pode ser projetada para atingir e se ligar a (i) um sítio alvo dentro do genoma de uma planta correspon- dente a uma sequência dentro da SEQ ID NO: 34, ou sua sequência complementar, para criar um DSB ou nick no locus genômico para o gene GA20 oxidase_3 (ii) um sítio alvo dentro do genoma de uma planta correspondente a uma sequência dentro da SEQ ID NO: 35, ou sua se- quência complementar, para criar um DSB ou corte no locus genômico para o gene GA20 oxidase_5, e/ou (iii) um sítio alvo dentro do genoma de uma planta correspondente a uma sequência dentro da SEQ ID NO: 38, ou sua sequência complementar, para criar um DSB ou corte no locus genômico para o gene GA20 oxidase_4, que pode levar à criação de uma mutação ou inserção de uma sequência no sítio do DSB ou corte, através de mecanismos de reparo celular, que podem ser guiados por uma molécula ou modelo doador.
[0064] Em um aspecto, uma técnica de edição de genoma direcio- nada no presente documento descrita pode compreender o uso de uma recombinase. Em algumas modalidades, uma tirosina recombinase li- gada, etc., a um domínio ou motivo de reconhecimento de DNA pode ser selecionada do grupo que consiste em uma Cre recombinase, uma Flp recombinase e uma Tnp1 recombinase. Em um aspecto, uma Cre recombinase ou uma Gin recombinase fornecida no presente docu- mento pode ser amarrada a um domínio de ligação a DNA de dedo de zinco. O sistema de recombinação direcionado ao sítio Flp-FRT pode vir do plasmídeo 2µ da levedura de padeiro Saccharomyces cerevisiae. Neste sistema, a Flp recombinase (flippase) pode recombinar sequên- cias entre os sítios alvo de reconhecimento da flippase (FRT). Os sítios de FRT compreendem 34 nucleotídeos. Flp pode se ligar aos "braços" dos sítios de FRT (um braço está na orientação reversa) e cliva o sítio de FRT em cada extremidade de uma sequência de ácido nucleico in- terveniente. Após a clivagem, Flp pode recombinar sequências de áci- dos nucleicos entre dois sítios de FRT. O Cre-lox é um sistema de re- combinação direcionado ao sítio, derivado do bacteriófago P1, seme- lhante ao sistema de recombinação Flp-FRT. O Cre-lox pode ser usado para inverter uma sequência de ácido nucleico, excluir uma sequência de ácido nucleico ou translocar uma sequência de ácido nucleico. Neste sistema, a Cre recombinase pode recombinar um par de sequências de ácido nucleico lox. Os sítios Lox compreendem 34 nucleotídeos, sendo o primeiro e o último 13 nucleotídeos (braços) palindrômicos. Durante a recombinação, a proteína Cre recombinase se liga a dois sítios lox em diferentes ácidos nucléicos e cliva nos sítios lox. Os ácidos nucleicos clivados são unidos (translocados reciprocamente) e a recombinação está completa. Em outro aspecto, um sítio lox no presente documento fornecido é um sítio loxP, lox 2272, loxN, lox 511, lox 5171, lox71, lox66, M2, M3, M7 ou M11.
[0065] ZFNs são proteínas sintéticas que consistem em um domínio de ligação de DNA de dedo de zinco engenheirado fundido a um domí- nio de clivagem (ou um meio domínio de clivagem), que pode ser deri- vado de uma endonuclease de restrição (por exemplo, FokI). O domínio de ligação ao DNA pode ser canônico (C2H2) ou não canônico (por exemplo, C3H ou C4). O domínio de ligação ao DNA pode compreender um ou mais dedos de zinco (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou mais dedos de zinco), dependendo do sítio alvo. Vários dedos de zinco em um domínio de ligação ao DNA podem ser separados por sequência(s) de ligação. As ZFNs podem ser projetadas para clivar quase qualquer trecho de DNA de fita dupla pela modificação do domínio de ligação ao DNA do dedo de zinco. As ZFNs formam dímeros a partir de monômeros compostos por um domínio de clivagem de DNA não específico (por exemplo, derivado da FokI nuclease) fundidos a um domínio de ligação a DNA compreendendo um arranjo de dedo de zinco engenheirado para ligar uma sequência de DNA do sítio alvo. O domínio de ligação ao DNA de uma ZFN pode tipicamente ser composto por 3-4 (ou mais) dedos de zinco. Os aminoácidos nas posições -1, +2, +3, e +6 em relação ao início da α-hélice do dedo de zinco, que contribui para a ligação específica de sítio ao sítio alvo, pode ser alterada e personalizada para se ajustar a sequências alvo específicas. Os outros aminoácidos podem formar uma espinha dorsal de consenso para gerar ZFNs com diferentes especifici- dades de sequência. Métodos e regras para projetar ZFNs para direcio- namento e ligação a sequências alvo específicas são conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Pedido de Patente U.S. 2005/0064474, 2009/0117617 e 2012/0142062, cujos conteúdos e divulgações são no presente documento incorporados por referência. O domínio da FokI nu- clease pode exigir dimerização para clivar o DNA e, portanto, são ne- cessárias duas ZFNs com suas regiões C-terminais para ligar as fita de DNA opostas do sítio de clivagem (separadas por 5-7 pb). O monômero ZFN pode cortar o sítio alvo se os sítios de ligação a dois ZF forem palindrômicos. Uma ZFN, conforme utilizado neste documento, é ampla e inclui uma ZFN monomérica que pode clivar o DNA de fita dupla sem assistência de outra ZFN. O termo ZFN também pode ser usado para se referir a um ou ambos os membros de um par de ZFNs que são pro- jetados para trabalhar juntos para clivar o DNA no mesmo sítio.
[0066] Sem estar limitado por nenhuma teoria científica, porque as especificidades de ligação ao DNA dos domínios de dedos de zinco po- dem ser reprojetadas usando um dos vários métodos, teoricamente, ZFNs personalizados podem ser construídos para atingir quase qual- quer sequência alvo (por exemplo, em ou perto de um gene GA oxidase em um genoma de planta). Os métodos publicamente disponíveis para engenharia de domínios de dedo de zinco incluem Montagem depen- dente de Contexto (CoDA), Engenharia de Grupo Oligomerizada
(OPEN) e Montagem Modular. Em um aspecto, um método e/ou a com- posição no presente documento fornecida compreende uma ou mais, duas ou mais, três ou mais, quatro ou mais ou cinco ou mais ZFNs. Em outro aspecto, uma ZFN fornecida no presente documento é capaz de gerar um DSB ou corte direcionado. Em um aspecto, vetores compre- endendo polinucleotídeos que codificam uma ou mais, dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais ou cinco ou mais ZFNs são fornecidos a uma célula por métodos de transformação conhecidos na técnica (por exem- plo, sem estar limitado, transfecção viral, bombardeio de partículas, transfecção de protoplasto mediada por PEG ou transformação medi- ada por Agrobacterium). As ZFNs podem ser introduzidas como proteí- nas ZFN, como polinucleotídeos que codificam proteínas ZFN, e/ou como combinações de proteínas e polinucleotídeos que codificam pro- teínas.
[0067] As meganucleases, comumente identificadas em micróbios, como a família LAGLIDADG de endonucleases locais, são enzimas úni- cas com alta atividade e longas sequências de reconhecimento (> 14 pb) resultando na digestão específica de sítio do DNA alvo. Versões en- genheiradas de meganucleases de ocorrência natural geralmente têm sequências de reconhecimento de DNA estendidas (por exemplo, 14 a 40 pb). De acordo com algumas modalidades, uma meganuclease pode compreender uma espinha dorsal ou enzima de base selecionada do grupo que consiste em I-CreI, I-CeuI, I-MsoI, I-SceI, I-AniI e I-DmoI. A engenharia de meganucleases pode ser mais desafiadora que as ZFNs e TALENs, porque as funções de reconhecimento e clivagem de DNA das meganucleases estão entrelaçadas em um único domínio. Métodos especializados de mutagênese e triagem de alto rendimento foram utili- zados para criar novas variantes de meganucleases que reconhecem sequências únicas e possuem atividade aprimorada de nucleases. As- sim, uma meganuclease pode ser selecionada ou engenheirada para se ligar a uma sequência alvo genômica em uma planta, como no ou pró- ximo do locus genômico de um gene da GA oxidase. Em um aspecto, um método e/ou composição no presente documento fornecido compre- ende uma ou mais, duas ou mais, três ou mais, quatro ou mais ou cinco ou mais meganucleases. Em outro aspecto, uma meganuclease no pre- sente documento fornecida é capaz de gerar um DSB direcionado. Em um aspecto, vetores compreendendo polinucleotídeos que codificam uma ou mais, duas ou mais, três ou mais, quatro ou mais ou cinco ou mais meganucleases são fornecidos a uma célula por métodos de trans- formação conhecidos na técnica (por exemplo, sem estar limitado, trans- fecção viral, bombardeio de partículas, transfecção de protoplastos me- diada por PEG ou transformação mediada por Agrobacterium).
[0068] TALENs são enzimas de restrição artificiais geradas pela fu- são do domínio de ligação ao DNA efetor do tipo ativador de transcrição (TALE) a um domínio de nuclease (por exemplo, FokI). Quando cada membro de um par TALEN se liga aos sítios de DNA que flanqueiam um sítio alvo, os monômeros FokI dimerizam e causam uma quebra de DNA de fita dupla no sítio alvo. Além do domínio de clivagem FokI tipo selva- gem, variantes do domínio de clivagem FokI com mutações foram pro- jetadas para melhorar a especificidade de clivagem e a atividade de cli- vagem. As funções de domínio de FokI como um dímero, requerendo dois construtos com domínios de ligação de DNA únicos para sítios no genoma alvo com orientação e espaçamento adequados. Tanto o nú- mero de resíduos de aminoácidos entre o domínio de ligação ao DNA de TALEN quanto o domínio de clivagem de FokI e o número de bases entre os dois sítios de ligação de TALEN individuais são parâmetros para alcançar níveis elevados de atividade.
[0069] TALENs são enzimas de restrição artificiais geradas pela fu- são do domínio de ligação ao DNA efetor do tipo ativador de transcrição (TALE) a um domínio de nuclease. Em alguns aspectos, a nuclease é selecionada de um grupo que consiste em PvuII, MutH, TevI, FokI, AlwI, MlyI, SbfI, SdaI, StsI, CleDORF, Clo051, e Pept071. Quando cada mem- bro de um par TALEN se liga aos sítios de DNA que flanqueiam um sítio alvo, os monômeros FokI dimerizam e causam uma quebra de DNA de fita dupla no sítio alvo. O termo TALEN, como no presente documento utilizado, é amplo e inclui um TALEN monomérico que pode clivar o DNA de fita dupla sem a assistência de outro TALEN. O termo TALEN tam- bém se refere a um ou ambos os membros de um par de TALENs que trabalham juntos para clivar o DNA no mesmo sítio.
[0070] Os efetores do tipo ativador de transcrição (TALEs) podem ser projetados para ligar praticamente qualquer sequência de DNA, como no ou próximo do locus genômico de um gene GA oxidase em uma planta. TALE possui um domínio central de ligação ao DNA com- posto por 13-28 monômeros repetidos de 33-34 aminoácidos. Os ami- noácidos de cada monômero são altamente conservados, exceto os re- síduos de aminoácidos hipervariáveis nas posições 12 e 13. Os dois aminoácidos variáveis são chamados di-resíduos de repetição variável (RVDs). Os pares de aminoácidos NI, NG, HD e NN dos RVDs prefe- rencialmente reconhecem adenina, timina, citosina e guanina/adenina, respectivamente, e a modulação de RVDs pode reconhecer bases con- secutivas de DNA. Essa relação simples entre a sequência de aminoá- cidos e o reconhecimento de DNA permitiu a engenharia de domínios de ligação a DNA específicos, selecionando uma combinação de seg- mentos de repetição contendo os RVDs apropriados.
[0071] Além do domínio de clivagem de FokI tipo selvagem, varian- tes do domínio de clivagem de FokI com mutações foram projetadas para melhorar a especificidade de clivagem e a atividade de clivagem. As funções de domínio de FokI como um dímero, requerendo dois cons- trutos com domínios de ligação de DNA únicos para sítios no genoma alvo com orientação e espaçamento adequados. Tanto o número de re- síduos de aminoácidos entre o domínio de ligação ao DNA de TALEN quanto o domínio de clivagem FokI e o número de bases entre os dois sítios de ligação de TALEN individuais são parâmetros para alcançar níveis elevados de atividade. Domínios de clivagem de PvuII, MutH, e TevI são alternativas úteis para variantes de FokI e FokI para uso com TALEs. PvuII funciona como um domínio de clivagem altamente espe- cífico quando acoplado a um TALE (ver Yank et al. 2013. PLoS One. 8: e82539). MutH é capaz de introduzir cortes específicos de fita no DNA (ver Gabsalilow et al. 2013. Nucleic Acids Research. 41: e83). TevI in- troduz quebras de fita dupla no DNA nos sítios direcionados (ver Beur- deley et al., 2013. Nature Communications. 4: 1762).
[0072] A relação entre a sequência de aminoácidos e o reconheci- mento de DNA do domínio de ligação TALE permite proteínas projetá- veis. Programas de software como o DNA Works podem ser usados para projetar construtos TALE. Outros métodos de conceber construtos TALE são conhecidos dos versados na técnica. Ver Doyle et al., Nucleic Acids Research (2012)40: W117-122.; Cermak et al., Nucleic Acids Re- search (2011). 39:e82; e tale-nt.cac.cornell.edu/about. Em um aspecto, um método e/ou a composição no presente documento fornecida com- preende uma ou mais, duas ou mais, três ou mais, quatro ou mais ou cinco ou mais TALENs. Em outro aspecto, um TALEN no presente do- cumento fornecido é capaz de gerar um DSB direcionado. Em um as- pecto, vetores compreendendo polinucleotídeos que codificam uma ou mais, duas ou mais, três ou mais, quatro ou mais ou cinco ou mais TA- LENs são fornecidos a uma célula por métodos de transformação co- nhecidos na técnica (por exemplo, sem estar limitado, transfecção viral, bombardeio de partículas, transfecção de protoplastos mediada por PEG ou transformação mediada por Agrobacterium). Ver, por exemplo, Pedido de Patente U.S. 2011/0145940, 2011/0301073, e
2013/0117869, cujos conteúdos e divulgações são no presente docu- mento incorporados por referência.
[0073] Conforme utilizado neste documento, uma "técnica de edi- ção de genoma direcionada" refere-se a qualquer método, protocolo ou técnica que permita a edição precisa e/ou direcionada de um local es- pecífico no genoma de uma planta (isto é, a edição é ampla ou comple- tamente não aleatória) usando uma nuclease específica de sítio, como uma meganuclease, uma nuclease de dedo de zinco (ZFN), uma endo- nuclease guiada por RNA (por exemplo, o sistema CRISPR/Cas9), uma endonuclease TALE (TALEN), uma recombinase ou uma transposase. Conforme utilizado neste documento, "edição" ou "edição do genoma" refere-se à geração de uma mutação, deleção, inversão ou substituição direcionada de pelo menos 1, pelo menos 2, pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 6, em pelo menos 7, pelo menos 8, pelo menos 9, pelo menos 10, pelo menos 15, pelo menos 20, pelo menos 25, pelo menos 30, pelo menos 35, pelo menos 40, pelo menos 45, pelo menos 50, pelo menos 75, pelo menos 100, pelo menos 250, pelo me- nos 500, pelo menos 1000, pelo menos 2500, pelo menos 5000, pelo menos 10.000 ou pelo menos 25.000 nucleotídeos de uma sequência de ácido nucleico de genoma de planta endógena. Conforme utilizado neste documento, "edição" ou "edição do genoma" também abrange a inserção direcionada ou integração direcionada ao sítio de pelo menos 1, pelo menos 2, pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 6, pelo menos 7, pelo menos 8, pelo menos 9, pelo menos 10, pelo me- nos 15, pelo menos 20, pelo menos 25, pelo menos 30, pelo menos 35, pelo menos 40, pelo menos 45, pelo menos 50, pelo menos 75, pelo menos 100, pelo menos 250, pelo menos 500, pelo menos 750, pelo menos 1000, pelo menos 1500, pelo menos 2000, pelo menos 2500, pelo menos 3000, pelo menos 4000, pelo menos 5000, pelo menos
10.000 ou pelo menos 25.000 nucleotídeos no genoma endógeno de uma planta. Uma "edição" ou "edição genômica" no singular refere-se a uma dessas mutações, deleções, inversões, substituições ou inserções direcionadas, enquanto "edições" ou "edições genômicas" se referem a duas ou mais mutação(ões), deleção(ões), inversão(ões), substitui- ção(ões) e/ou inserção(ões), com cada “edição” sendo introduzida atra- vés de uma técnica de edição de genoma direcionada.
[0074] Em um aspecto, abordagens de edição de genes direciona- das são usadas para modificar a sequência promotora e/ou região(ões) regulatória(s) de um ou mais dos genes GA20 oxidase_3 e/ou GA20 oxidase_5 para expressão knock-down ou knock-out deste(s) gene(s), tal como através de deleções, inserções, mutações direcionadas ou ou- tras alterações de sequência. De fato, a região(ões) ou sequência(s) promotora(s) e/ou regulatória(s), ou a 5'-UTR, 3'UTR e/ou sequência(s) de íntron, de um ou mais dos genes GA20 oxidase_3 e/ou GA20 oxi- dase_5 pode ser amplamente excluído ou sofrer mutação. Alternativa- mente, toda ou uma porção da(s) sequência(s) de codificação (éxon), 5- UTR, 3'UTR e/ou íntron de um ou mais dos genes GA20 oxidase_3 e/ou GA20 oxidase_5 podem ser editados, deletados, mutados ou de outro modo modificado para expressão ou atividade knock-down ou knock-out desses genes. Tais modificações direcionadas ao loci de genes GA20 oxidase_3 e/ou GA20 oxidase_5 podem ser alcançadas usando qual- quer tecnologia de edição de genoma adequada conhecida na técnica, como por meio do reparo de uma quebra de fita dupla (DSB) ou corte introduzida por uma nuclease específica de sítio, como, por exemplo, uma nuclease de dedo de zinco, uma meganuclease engenheirada ou nativa, uma TALE-endonuclease ou uma endonuclease guiada por RNA (por exemplo, Cas9 ou Cpf1). Esse reparo do DSB ou corte pode intro- duzir deleções, adições, mutações etc. espontâneas ou estocásticas, no sítio direcionado em que o DSB ou corte foi introduzido, ou o reparo do sítio pode envolver o uso de uma molécula de modelo de doador para direcionar ou causar uma deleção, adição, mutação etc. preferida ou específica no sítio direcionado.
[0075] Para os fins da presente invenção, uma "planta" pode incluir um explante, parte de planta, muda, plântula ou planta inteira em qual- quer estágio de regeneração ou desenvolvimento. Conforme utilizado neste documento, uma "parte de planta" pode referir-se a qualquer ór- gão ou tecido intacto de uma planta, como um meristema, órgão / estru- tura de broto (por exemplo, folha, caule ou nó), raiz, flor ou órgão / es- trutura floral (por exemplo, bráctea, sépala, pétala, estame, carpelo, an- tera e óvulo), semente (por exemplo, embrião, endosperma e tegumento da semente), fruta (por exemplo, o ovário maduro), propágulo ou outros tecidos de planta (por exemplo, tecido vascular, tecido dérmico, tecido moído e semelhantes), ou qualquer porção dos mesmos. As partes de planta da presente invenção podem ser viáveis, não viáveis, regenerá- veis e/ou não regeneráveis. Um "propágulo" pode incluir qualquer parte de planta que é capaz de crescer até formar uma planta inteira.
[0076] De acordo com algumas modalidades, uma planta modifi- cada pode ser plantada em uma densidade no campo (plantas por ter- reno / área de campo) que é de pelo menos 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 50%, 75%, 100%, 125%, 150%, 175%, 200%, 225% ou 250% maior do que a densidade de plantio normal para aquela planta de acordo com as práticas agronômicas padrão. Uma planta modificada pode ser plan- tada em uma densidade no campo de pelo menos 38.000 plantas por acre, pelo menos 40.000 plantas por acre, pelo menos 42.000 plantas por acre, pelo menos 44.000 plantas por acre, pelo menos 45.000 plan- tas por acre, pelo menos 46.000 plantas por acre, pelo menos 48.000 plantas por acre, 50.000 plantas por acre, pelo menos 52.000 plantas por acre, pelo menos 54.000 por acre, ou pelo menos 56.000 plantas por acre. Como um exemplo, as plantas de milho podem ser plantadas em uma densidade mais alta, tal como em uma faixa de cerca de 38.000 plantas por acre a cerca de 60.000 plantas por acre, ou cerca de 40.000 plantas por acre a cerca de 58.000 plantas por acre, ou cerca de 42.000 plantas por acre para cerca de 58.000 plantas por acre, ou cerca de
40.000 plantas por acre para cerca de 45.000 plantas por acre, ou cerca de 45.000 plantas por acre para cerca de 50.000 plantas por acre, ou cerca de 50.000 plantas por acre para cerca de 58.000 plantas por acre, ou cerca de 52.000 plantas por acre a cerca de 56.000 plantas por acre, ou cerca de 38.000 plantas por acre, cerca de 42.000 plantas por acre, cerca de 46.000 plantas por acre, ou cerca de 48.000 plantas por acre, cerca de 50.000 plantas por acre, ou cerca de 52.000 plantas por acre, ou cerca de 54.000 plantas por acre, em oposição a uma faixa de den- sidade padrão, como cerca de 18.000 plantas por acre a cerca de
38.000 plantas por acre.
[0077] De acordo com modalidades da presente invenção, é/são fornecida(s) uma(s) planta(s) de milho modificada(s) que compre- ende(m) (i) uma altura de planta inferior a 2000 mm, inferior a 1950 mm, inferior a 1900 mm, inferior a 1850 mm, inferior a 1800 mm, inferior a 1750 mm, inferior a 1700 mm, inferior a 1650 mm, inferior a 1600 mm, inferior a 1550 mm, inferior a 1500 mm, inferior a 1450 mm, inferior a 1400 mm, inferior a 1350 mm, inferior a 1300 mm, inferior a 1250 mm, inferior a 1200 mm, inferior a 1150 mm, inferior a 1100 mm, inferior a 1050 mm ou inferior a 1000 mm e/ou (ii) diâmetro médio da haste ou caule de pelo menos 18 mm, pelo menos 18,5 mm, pelo menos 19 mm, pelo menos 19,5 mm, pelo menos 20 mm, pelo menos 20,5 mm, pelo menos 21 mm, pelo menos 21,5 mm ou pelo menos 22 mm. De maneira diferente, é/são fornecida(s) uma(s) planta(s) de milho modificada(s) que compreende(m) uma altura de planta inferior a 2000 mm, inferior a 1950 mm, inferior a 1900 mm, inferior a 1850 mm, inferior a 1800 mm, inferior a 1750 mm, inferior a 1700 mm, inferior a 1650 mm, inferior a 1600 mm, inferior a 1550 mm, inferior a 1500 mm, inferior a 1450 mm,
inferior a 1400 mm, inferior a 1350 mm, inferior a 1300 mm, inferior a 1250 mm, inferior a 1200 mm, inferior a 1150 mm, inferior a 1100 mm, inferior a 1050 mm ou inferior a 1000 mm e/ou diâmetro médio da haste ou caule superior a 18 mm, superior a 18,5 mm, superior a 19 mm, su- perior a 19,5 mm, superior a 20 mm, superior a 20,5 mm, superior a 21 mm, superior a 21,5 mm ou superior a 22 mm. Qualquer traço ou faixa da altura da planta expressa em milímetros (mm) pode ser convertida em uma unidade de medida diferente com base em conversões conhe- cidas (por exemplo, uma polegada é igual a 2,54 cm ou 25,4 milímetros e milímetros (mm), centímetros (cm) e metros (m) diferem apenas em uma ou mais potências de dez). Assim, qualquer medida no presente documento fornecida é ainda descrita em termos de quaisquer outras unidades de medida comparáveis de acordo com conversões conheci- das e estabelecidas. No entanto, a altura exata da planta e/ou diâmetro do caule de uma planta de milho modificada pode depender do ambiente e do fundo genético. Assim, a mudança na altura da planta e/ou diâme- tro do caule de uma planta de milho modificada pode, em vez disso, ser descrito em termos de uma diferença mínima ou variação porcentual em relação a uma planta de controle. Uma planta de milho modificada pode ainda compreender pelo menos uma espiga que está substancialmente livre de tecidos ou estruturas reprodutivas macho ou outros tipos estra- nhos.
[0078] De acordo com modalidades da presente invenção, são for- necidas plantas de milho modificadas que compreendem uma altura de planta durante os estágios vegetativos e/ou reprodutivos tardios de de- senvolvimento (por exemplo, no estágio R3) entre entre 1000 mm e 1800mm, entre 1000 mm e 1700 mm, entre 1050 mm e 1700 mm, entre 1100 mm e 1700 mm, entre 1150 mm e 1700 mm, entre 1200 mm e 1700 mm, entre 1250 mm e 1700 mm, entre 1300 mm e 1700 mm, entre 1350 mm e 1700 mm, entre 1400 mm e 1700 mm, entre 1450 mm e
1700 mm, entre 1000 mm e 1500 mm, entre 1050 mm e 1500 mm, entre 1100 mm e 1500 mm, entre 1150 mm e 1500 mm, entre 1200 mm e 1500 mm, entre 1250 mm e 1500 mm, entre 1300 mm e 1500 mm, entre 1350 mm e 1500 mm, entre 1400 mm e 1500 mm, entre 1450 mm e 1500 mm, entre 1000 mm e 1600 mm, entre 1100 mm e 1600 mm, entre 1200 mm e 1600 mm, entre 1300 mm e 1600 mm, entre 1350 mm e 1600 mm, entre 1400 mm e 1600 mm, entre 1450 mm e 1600 mm, entre 1000 mm e 2000 mm, entre 1200 mm e 2000 mm, entre 1200 mm e 1800 mm, entre 1300 mm e 1700 mm, entre 1400 mm e 1700 mm, entre 1400 mm e 1600 mm, entre 1400 mm e 1700 mm, entre 1400 mm e 1800 mm, entre 1400 mm e 1900 mm, entre 1400 mm e 2000 mm, ou entre 1200 mm e 2500 mm e/ou um diâmetro de caule médio entre 17,5 mm e 22 mm, entre 18 mm e 22 mm, entre 18,5 e 22 mm, entre 19 mm e 22 mm, entre 19,5 mm e 22 mm, entre 20 mm e 22 mm, entre 20,5 mm e 22 mm, entre 21 mm e 22 mm, entre 21,5 mm e 22 mm, entre 17,5 mm e 21 mm, entre 17,5 mm e 20 mm, entre 17,5 mm e 19 mm, entre 17,5 mm e 18 mm, entre 18 mm e 21 mm, entre 18 mm e 20 mm ou entre 18 mm e 19 mm. Uma planta de milho modificada pode estar substancialmente livre de tipos estranhos, como tecidos ou estruturas reprodutivas macho em uma ou mais espigas da planta de milho modi- ficada.
[0079] De acordo com modalidades da presente invenção, plantas de milho modificadas são fornecidas que têm (i) uma altura de planta que é pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70% ou pelo menos 75% inferior à altura de uma planta tipo selvagem ou controle, e/ou (ii) um diâmetro de haste ou caule que é pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, em pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo me- nos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 100% maior que o diâmetro deo caule da planta tipo selvagem ou controle. De acordo com as mo- dalidades da presente invenção, uma planta de milho modificada pode ter uma altura de planta reduzida que não é superior a 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55% ou 60% inferior à altura de uma planta tipo selvagem ou controle e/ou um diâmetro do caule ou haste que é inferior a (ou não mais que) 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 100% maior do que o diâmetro do caule ou haste de um tipo selvagem ou planta de controle. Por exemplo, uma planta modificada pode ter (i) uma altura de planta que é pelo menos 10%, pelo menos 15%, ou pelo menos 20% menor ou mais curta (ou seja, maior ou igual a 10%, 15% ou 20% me- nor), mas não maior ou superior a 50% mais curta do que uma planta tipo selvagem ou controle, e/ou (ii) um diâmetro de caule ou haste que seja pelo menos 5%, pelo menos 10% ou pelo menos 15% maior, mas não superior a 30%, 35% ou 40% maior do que um tipo selvagem ou planta controle. Para maior clareza, as frases "pelo menos 20% mais curto" e "maior ou igual a 20% mais curto" excluiriam, por exemplo, 10% mais curto. Da mesma forma, para maior clareza, as frases “não supe- rior a 50% mais curto”, “não superior a 50% mais curto” e “não superior a 50% mais curto” excluiria 60% mais curto; a frase “pelo menos 5% maior” excluiria 2% maior; e as frases “não mais que 30% maior” e “não mais que 30% maior” excluiriam 40% maior.
[0080] De acordo com modalidades da presente invenção, são for- necidas plantas de milho modificadas que compreendem uma altura en- tre 5% e 75%, entre 5% e 50%, entre 10% e 70%, entre 10% e 65%, entre 10% e 60%, entre 10% e 55%, entre 10% e 50%, entre 10% e
45%, entre 10% e 40%, entre 10% e 35%, entre 10% e 30%, entre 10% e 25%, entre 10% e 20%, entre 10% e 15%, entre 10% e 10%, entre 10% e 75%, entre 25% e 75%, entre 10% e 50%, entre 20% e 50%, entre 25% e 50%, entre 30% e 75%, entre 30% e 50%, entre 25% e 50%, entre 15% e 50%, entre 20% e 50%, entre 25% e 45%, ou entre 30% e 45% menor que a altura de uma planta selvagem ou de controle, e/ou um diâmetro da haste ou caule que está entre 5% e 100%, entre 5% e 95%, entre 5% e 90%, entre 5% e 85%, entre 5% e 80%, entre 5% e 75%, entre 5% e 70%, entre 5% e 65%, entre 5% e 60%, entre 5% e 55%, entre 5% e 50%, entre 5% e 45%, entre 5% e 40%, entre 5% e 35%, entre 5% e 30%, entre 5% e 25%, entre 5% e 20%, entre 5% e 15%, entre 5% e 10%, entre 10% e 100%, entre 10% e 75%, entre 10% e 50%, entre 10% e 40%, entre 10% e 30%, entre 10% e 20%, entre 25% e 75%, entre 25% e 50%, entre 50% e 75%, entre 8% e 20%, ou entre 8% e 15% maior que o diâmetro do caule ou haste da planta sel- vagem ou de controle.
[0081] De acordo com modalidades da presente invenção, plantas de milho modificadas são fornecidas que compreendem um compri- mento médio de Interno (ou um comprimento de Interno menos 2 e/ou comprimento de Interno menos 4 em relação à posição da espiga) que é de pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, ou pelo menos 75% inferior ao mesmo comprimento de Interno ou comprimento médio de uma planta tipo selvagem ou controle. O "Interno menos 2" de uma planta de milho refere-se ao segundo Interno abaixo da espiga da planta e o "In- terno menos 4" de uma planta de milho refere-se ao quarto Interno abaixo da espiga da planta De acordo com muitas modalidades, plantas de milho modificadas são fornecidas com um comprimento médio de
Internos (ou um comprimento de Interno de menos 2 e/ou comprimento de Interno de menos 4 em relação à posição da espiga) que fica entre 5% e 75%, entre 5% e 50%, entre 10% e 70%, entre 10% e 65%, entre 10% e 60%, entre 10% e 55%, entre 10% e 50%, entre 10% e 45%, entre 10% e 40%, entre 10% e 35%, entre 10% e 30%, entre 10% e 25%, entre 10% e 20%, entre 10% e 15%, entre 10% e 10%, entre 10% e 75%, entre 25% e 75%, entre 10% e 50%, entre 20% e 50%, entre 25% e 50%, entre 30% e 75%, entre 30% e 50%, entre 25% e 50%, entre 15% e 50%, entre 20% e 50%, entre 25% e 45%, ou entre 30% e 45% menor que o comprimento igual ou médio dos Internos de uma planta selvagem ou de controle.
[0082] De acordo com modalidades da presente invenção, plantas de milho modificadas são fornecidas que compreendem um peso de es- piga (individualmente ou em média) que é pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 100% maior do que o peso da espiga de uma planta tipo selvagem ou controle. Uma planta de milho modificada no presente documento fornecida pode compreender um peso de espiga que está entre 5% e 100%, entre 5% e 95%, entre 5% e 90%, entre 5% e 85%, entre 5% e 80%, entre 5 % e 75%, entre 5% e 70%, entre 5% e 65%, entre 5% e 60%, entre 5% e 55%, entre 5% e 50%, entre 5% e 45%, entre 5% e 40%, entre 5% e 35%, entre 5% e 30%, entre 5% e 25%, entre 5% e 20%, entre 5% e 15%, entre 5% e 10%, entre 10% e 100%, entre 10% e 75%, entre 10% e 50%, entre 25% e 75%, entre 25% e 50%, ou entre 50% e 75% maior do que o peso da espiga de uma planta tipo selvagem ou controle.
[0083] De acordo com as modalidades da presente invenção, são fornecidas plantas de milho modificadas que têm um índice de colheita de pelo menos 0,57, pelo menos 0,58, pelo menos 0,59, pelo menos 0,60, pelo menos 0,61, pelo menos 0,62, pelo menos 0,63, pelo menos 0,64, ou pelo menos 0,65 (ou maior). Uma planta de milho modificada pode compreender um índice de colheita entre 0,57 e 0,65, entre 0,57 e 0,64, entre 0,57 e 0,63, entre 0,57 e 0,62, entre 0,57 e 0,61, entre 0,57 e 0,60, entre 0,57 e 0,59, entre 0,57 e 0,58, entre 0,58 e 0,65, entre 0,59 e 0,65 ou entre 0,60 e 0,65. Uma planta de milho modificada pode ter um índice de colheita de pelo menos 1%, pelo menos 2%, pelo menos 3%, pelo menos 4%, pelo menos 5%, pelo menos 6%, pelo menos 7%, pelo menos 8%, pelo menos 9%, pelo menos 10%, pelo menos 11%, pelo menos 12%, pelo menos 13%, pelo menos 14%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45% ou pelo menos 50% maior do que o índice de colheita de uma planta tipo selvagem ou controle. Uma planta de milho modificada pode ter um índice de colheita que fica entre 1% e 45%, entre 1% e 40%, entre 1% e 35%, entre 1% e 30%, entre 1% e 25%, entre 1% e 20%, entre 1% e 15%, entre 1% e 14%, entre 1% e 13%, entre 1% e 12%, entre 1% e 11%, entre 1% e 10%, entre 1% e 9 %, entre 1% e 8%, entre 1% e 7%, entre 1% e 6%, entre 1% e 5%, entre 1% e 4%, entre 1% e 3%, entre 1% e 2%, entre 5% e 15%, entre 5% e 20%, entre 5% e 30%, ou entre 5% e 40% maior que o índice de colheita de uma planta tipo selvagem ou controle.
[0084] De acordo com as modalidades da presente invenção, plan- tas de milho modificadas são fornecidas com um aumento no rendi- mento colhido de pelo menos 1 alqueire por acre, pelo menos 2 alquei- res por acre, pelo menos 3 alqueires por acre, pelo menos 4 alqueires por acre, em pelo menos 5 alqueires por acre, pelo menos 6 alqueires por acre, pelo menos 7 alqueires por acre, pelo menos 8 alqueires por acre, pelo menos 9 alqueires por acre, ou pelo menos 10 alqueires por acre, em relação a uma planta tipo selvagem ou controle. Uma planta de milho modificada pode ter um aumento no rendimento colhido entre 1 e 10, entre 1 e 8, entre 2 e 8, entre 2 e 6, entre 2 e 5, entre 2,5 e 4,5, ou entre 3 e 4 alqueires por acre. Uma planta de milho modificada pode ter um aumento no rendimento colhido de pelo menos 1%, pelo menos 2%, pelo menos 3%, pelo menos 4%, pelo menos 5%, pelo menos 6%, pelo menos 7%, pelo menos 8%, pelo menos 9%, pelo menos 10%, pelo menos 11%, pelo menos 12%, pelo menos 13%, pelo menos 14%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, ou pelo menos 25% maior que o rendi- mento colhido de uma planta tipo selvagem ou controle. Uma planta de milho modificada pode ter um rendimento colhido que está entre 1% e 25%, entre 1% e 20%, entre 1% e 15%, entre 1% e 14%, entre 1% e 13%, entre 1% e 12%, entre 1% e 11%, entre 1% e 10%, entre 1% e 9%, entre 1% e 8%, entre 1% e 7%, entre 1% e 6%, entre 1% e 5 %, entre 1% e 4%, entre 1% e 3%, entre 1% e 2%, entre 5% e 15%, entre 5% e 20%, entre 5% e 25%, entre 2% e 10%, entre 2% e 9%, entre 2% e 8%, entre 2% e 7%, entre 2% e 6%, entre 2% e 5%, ou entre 2% e 4% maior do que o rendimento colhido de um planta tipo selvagem ou con- trole.
[0085] De acordo com modalidades da presente invenção, uma planta de milho modificada é fornecida que tem uma frequência de alo- jamento que é pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% menos ou inferior a uma planta tipo selvagem ou controle. Uma planta de milho modificada pode ter uma frequência de alojamento que está entre 5% e 100%, entre 5% e 95%, entre 5% e 90%, entre 5% e 85%, entre 5% e 80%, entre 5% e 75%, entre 5% e 70%, entre 5% e
65%, entre 5% e 60%, entre 5% e 55%, entre 5% e 50%, entre 5% e 45%, entre 5% e 40%, entre 5% e 35%, entre 5% e 30%, entre 5% e 25%, entre 5% e 20%, entre 5% e 15%, entre 5% e 10%, entre 10% e 100%, entre 10% e 75%, entre 10% e 50%, entre 10% e 40%, entre 10% e 30%, entre 10% e 20%, entre 25% e 75%, entre 25% e 50%, ou entre 50% e 75% menos ou inferior a uma planta tipo selvagem ou controle. Além disso, são fornecidas populações de plantas de milho com maior resistência ao alojamento e uma frequência de alojamento reduzida. As populações de plantas de milho modificadas são fornecidas com uma frequência de alojamento que é pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% menos ou inferior a uma população de plantas tipo selvagem ou controle. Uma população de plantas de milho modificadas pode compreender uma frequência de alojamento que está entre 5% e 100%, entre 5% e 95%, entre 5% e 90%, entre 5% e 85%, entre 5% e 80%, entre 5% e 75%, entre 5% e 70%, entre 5% e 65%, entre 5% e 60%, entre 5% e 55%, entre 5% e 50%, entre 5% e 45%, entre 5% e 40%, entre 5% e 35%, entre 5% e 30%, entre 5% e 25%, entre 5% e 20%, entre 5% e 15%, entre 5% e 10%, entre 10% e 100%, entre 10% e 75%, entre 10% e 50%, entre 10% e 40%, entre 10% e 30%, entre 10% e 20%, entre 25% e 75%, entre 25% e 50%, ou entre 50% e 75% menos ou inferior a uma população de plantas selvagens ou de controle, que pode ser expressa como média em um número especificado de plantas ou área de cultivo de igual densidade.
[0086] De acordo com as modalidades da presente invenção, as plantas de milho modificadas são fornecidas com uma altura de planta significativamente reduzida ou diminuída (por exemplo, 2.000 mm ou menos) e um diâmetro do caule significativamente aumentado (por exemplo, 18 mm ou mais), em relação a uma planta tipo selvagem ou controle.
De acordo com essas modalidades, a diminuição ou redução na altura da planta e o aumento no diâmetro do caule podem estar den- tro de qualquer uma das faixas de altura, diâmetro ou porcentagem no presente documento citadas.
Tais plantas de milho modificadas tendo uma altura de planta reduzida e diâmetro de caule aumentado em rela- ção a uma planta tipo selvagem ou controle podem ser transformadas com uma sequência de DNA transcritível que codifica uma molécula de RNA não codificante que direciona pelo menos um gene GA20 oxidase para supressão.
Plantas de milho modificadas com uma altura de planta significativamente reduzida e/ou um diâmetro de caule significativa- mente aumentado em relação a uma planta tipo selvagem ou controle podem ainda ter pelo menos uma espiga que é substancialmente livre de tecidos reprodutivos macho ou estruturas e/ou outros tipos estra- nhos.
Plantas de milho modificadas com uma altura de planta significa- tivamente reduzida e/ou um diâmetro de caule aumentado em relação a uma planta tipo selvagem ou controle podem ter atividade reduzida de um ou mais gene(s) de GA20 oxidase e/ou GA3 oxidase em um ou mais tecido(s) da planta, tal como um ou mais tecidos vasculares e/ou foliares da planta, em relação ao(s) mesmo(s) tecido(s) da planta tipo selvagem ou controle.
De acordo com muitas modalidades, as plantas de milho modificadas podem compreender pelo menos um polinucleotídeo ou se- quência de DNA transcritível que codifica uma molécula de RNA não codificante operacionalmente ligada a um promotor, que pode ser um promotor constitutivo, específico de tecido ou preferido de tecido, em que a molécula de RNA não codificante direciona pelo menos uma oxi- dase GA20 para supressão, conforme fornecido no presente docu- mento.
A molécula de RNA não codificante pode ser um miRNA, siRNA ou miRNA ou molécula precursora de siRNA.
De acordo com algumas modalidades, as plantas de milho modificadas com uma altura de planta significativamente reduzida e/ou um diâmetro de caule aumentado em relação a uma planta tipo selvagem ou controle podem ainda ter um índice de colheita aumentado e/ou resistência de alojamento aumen- tada em relação à planta tipo selvagem ou controle.
[0087] Plantas de milho modificadas com uma altura de planta sig- nificativamente reduzida e/ou um diâmetro de caule significativamente aumentado em relação a uma planta tipo selvagem ou controle podem compreender uma mutação (por exemplo, uma inserção, deleção, subs- tituição, etc.) em um gene GA oxidase introduzido através de uma tec- nologia de edição de gene ou outra técnica de mutagênese, em que a expressão do gene GA oxidase é reduzida ou eliminada em um ou mais tecidos da planta modificada. Tais plantas de milho modificadas tendo uma altura de planta reduzida e/ou um diâmetro de caule aumentado em relação a uma planta tipo selvagem ou controle podem ainda ter um índice de colheita aumentado e/ou resistência ao alojamento aumen- tada em relação à planta tipo selvagem ou controle. Tais plantas de mi- lho modificadas podem estar substancialmente livres de tipos estra- nhos, como tecidos ou estruturas reprodutivas macho e/ou outros tipos estranhos em pelo menos uma espiga das plantas modificadas. As téc- nicas de mutagênese de plantas (excluindo edição de genoma) podem incluir mutagênese química (isto é, tratamento com um mutagênico quí- mico, como uma azida, hidroxilamina, ácido nitroso, acridina, análogo de base de nucleotídeo ou agente alquilante - por exemplo, EMS (sulfo- nato de etilmetano), MNU (N-metil-N-nitrosoureia), etc.), mutagênese fí- sica (por exemplo, raios gama, raios-X, UV, feixe de íons, outras formas de radiação, etc.) e mutagênese de inserção (por exemplo, transposon ou inserção de T-DNA). As plantas ou várias partes de planta, tecidos de planta ou células de planta podem estar sujeitos à mutagênese. As plantas tratadas podem ser reproduzidas para coletar sementes ou pro- duzir uma planta progenitor, e partes de plantas tratadas, tecidos de planta ou células de planta podem ser desenvolvidas ou regeneradas em plantas ou outros tecidos de plantas. Mutações geradas com técni- cas de mutagênese química ou física podem incluir uma mutação de mudança de estrutura, sem sentido ou de sentido incompatível, levando à perda da função ou expressão de um gene alvo, como um gene oxi- dase GA3 ou GA20.
[0088] Um método para a mutagênese de um gene é chamado “TIL- LING” (para direcionar lesões locais induzidas em genomas), em que as mutações são criadas em uma célula ou tecido de planta, preferencial- mente na semente, tecido reprodutivo ou linhagem germinativa de uma planta, por exemplo, usando um mutagênico, como um tratamento EMS. As plantas resultantes são cultivadas e autofertilizadas, e a progênie é usada para preparar amostras de DNA. A amplificação por PCR e o se- quenciamento de uma sequência de ácido nucleico de um gene da GA oxidase pode ser usada para identificar se uma planta mutada tem uma mutação no gene da GA oxidase. As plantas com mutações no gene da GA oxidase podem então ser testadas quanto a um traço alterado, como redução da altura da planta. Alternativamente, as plantas mutageniza- das podem ser testadas para um traço alterado, como altura reduzida da planta, e então a amplificação por PCR e o sequenciamento de uma sequência de ácido nucleico de um gene da GA oxidase pode ser usada para determinar se uma planta com o traço alterado também tem uma mutação no gene da GA oxidase. Ver, por exemplo, Colbert et al., 2001, PlantPhysiol 126:480-484; e McCallum et al., 2000, Nature Biotechno- logy 18:455-457. TILLING pode ser usado para identificar mutações que alteram a expressão de um gene ou a atividade de proteínas codificadas por um gene, que pode ser usado para introduzir e selecionar uma mu- tação direcionada em um gene de GA oxidase de uma planta de milho.
[0089] As plantas de milho que foram submetidas a um tratamento de mutagênese ou edição de genoma podem ser rastreadas e selecio- nadas com base em um fenótipo observável (por exemplo, qualquer fe- nótipo no presente documento descrito, como altura de planta mais curta, diâmetro de haste / caule aumentado, etc.) ou usando um agente de seleção com um marcador selecionável (por exemplo, herbicida, etc.), um marcador rastreável ou uma técnica molecular (por exemplo, níveis mais baixos de GA, níveis de proteína ou transcrito de GA oxidase mais baixos, presença de transgene ou sequência transcritível, etc.). Essa triagem e/ou técnicas de seleção podem ser usadas para identifi- car e selecionar plantas com uma mutação em um gene da GA oxidase que leva a um fenótipo de planta desejável.
[0090] De acordo com modalidades da presente invenção, é forne- cida uma população de plantas de milho modificadas, em que a popula- ção de plantas de milho modificadas tem uma altura média de planta significativamente menor, e/ou diâmetro médio da haste ou caule signi- ficativamente maior do que uma população de plantas selvagens ou controle. A população de plantas de milho modificadas pode comparti- lhar ancestralidade com uma única planta de milho modificada. As plan- tas de milho modificadas em uma população de plantas de milho modi- ficadas geralmente podem compreender pelo menos uma espiga que é substancialmente livre de tecidos ou estruturas reprodutivas macho e/ou outros tipos estranhos. Uma população de plantas de milho modificadas pode ter maior resistência ao alojamento em média ou por número de plantas ou área de campo do que uma população de plantas tipo selva- gem ou controle. A população de plantas de milho modificadas pode ter uma frequência de alojamento que é pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70% pelo menos 80%, pelo menos 90% ou 100% menos (ou inferior) do que uma população de plantas de milho de controle. Uma população de plantas de milho modificadas pode ter um índice de colheita de pelo menos 0,57 ou mais.
[0091] De acordo com as modalidades da presente invenção, as plantas de milho modificadas são fornecidas com um teor reduzido de giberelina (na forma ativa) pelo menos no(s) tecido(s) do caule e Interno, tais como o caule, Interno, folha e/ou tecido(s) vascular(es), em compa- ração com o(s) mesmo(s) tecido(s) de plantas tipo selvagem ou con- trole. De acordo com muitas modalidades, as plantas de milho modifica- das são fornecidas com uma altura de planta significativamente redu- zida e/ou um diâmetro do caule significativamente aumentado em rela- ção às plantas tipo selvagem ou controle, em que as plantas de milho modificadas têm níveis significativamente reduzidos ou diminuídos de giberelinas ativas ou GAs ativos (por exemplo, um ou mais de GA1, GA3, GA4, e/ou GA7) em um ou mais caules, Internos, folhas e/ou te- cido(s) vascular(es), relativo(s) ao(s) mesmo(s) tecido(s) das plantas selvagens ou controle. Por exemplo, o nível de um ou mais GAs ativos no caule, no Interno, na folha e/ou no tecido(s) vascular(es) de uma planta de milho modificada pode ser pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 100% menos ou menor do que no(s) mesmo(s) tecido(s) de uma planta de milho tipo selvagem ou controle.
[0092] De acordo com algumas modalidades, uma planta de milho modificada pode compreender um nível(is) ativo(s) de giberelina (GA) (por exemplo, um ou mais de GA1, GA3, GA4, e/ou GA7) em um ou mais caules, Internos, folhas e/ou tecido(s) vascular(es) que está entre 5% e 50%, entre 10% e 100%, entre 20% e 100%, entre 30% e 100%, entre 40% e 100%, entre 50% e 100%, entre 60% e 100%, entre 70% e
100%, entre 80% e 100%, entre 80% e 90%, entre 10% e 90%, entre 10% e 80%, entre 10% e 70%, entre 10% e 60%, entre 10% e 50%, entre 10% e 40%, entre 10% e 30%, entre 10% e 20%, entre 50% e 100%, entre 20% e 90%, entre 20% e 80%, entre 20% e 70%, entre 20% e 60%, entre 20% e 50%, entre 20% e 40%, entre 20% e 40%, entre 20% e 30%, entre 30% e 90%, entre 30% e 80%, entre 30% e 70%, entre 30% e 60%, entre 30% e 50%, entre 30% e 40%, entre 40% e 90% entre 40% e 80%, entre 40% e 70%, entre 40% e 60%, entre 40% e 50%, entre 50% e 90%, entre 50% e 80%, entre 50% e 70%, entre 50% e 60%, entre 60% e 90%, entre 60% e 80%, entre 60% e 70%, entre 70% e 90%, ou entre 70% e 80% menos ou (ou inferior) do que nos mesmos tecidos de uma planta de milho tipo selvagem ou controle. Uma planta de milho modificada com um nível(is) reduzido(s) de giberelina (GA) ativa(s) em um ou mais tecidos do caule, Interno, folha e/ou vas- cular(es) pode ainda ser substancialmente livre de tipos estranhos, como tecidos ou estruturas reprodutivas macho e/ou outros tipos em pelo menos uma espiga de uma planta de milho modificada.
[0093] De acordo com as modalidades da presente invenção, as plantas de milho modificadas são fornecidas com um nível de expressão significativamente reduzido ou eliminado de um ou mais transcritos do gene GA3 oxidase e/ou GA20 oxidase e/ou proteína(s) em um ou mais tecido(s), tal como um ou mais tecidos do caule, Interno, folha e/ou vas- cular(es) das plantas modificadas, em comparação com o(s) mesmo(s) tecido(s) de plantas tipo selvagem ou controle. De acordo com muitas modalidades, uma planta de milho modificada é fornecida compreen- dendo uma altura de planta significativamente reduzida e/ou um diâme- tro de caule significativamente aumentado em relação às plantas tipo selvagem ou controle, em que a planta de milho modificada tem um nível de expressão significativamente reduzido ou eliminado de um ou mais transcrito(s) e/ou proteína(s) do gene GA20 oxidase e/ou GA3 oxidase em um ou mais tecidos, tais como um ou mais tecidos do caule, Interno, folha e/ou vascular(es) da planta modificada, em comparação com o(s) mesmo(s) tecido(s) de uma planta de milho tipo selvagem ou controle. Por exemplo, uma planta de milho modificada tem um nível de expres- são significativamente reduzido ou eliminado de um transcrito(s) e/ou proteína(s) do gene GA20 oxidase_3 e/ou GA20 oxidase_5 e/ou um ní- vel de expressão significativamente reduzido ou eliminado de um trans- crito (s) e/ou proteína (s) do gene GA3 oxidase_1 e/ou GA3 oxidase_2, em toda a planta modificada, ou em um ou mais tecido(s) do caule, In- terno, folha e/ou vascular(es) da planta modificada, em comparação com o(s) mesmo(s) tecido(s) de uma planta tipo selvagem ou controle. Por exemplo, o nível de um ou mais transcritos e/ou proteína (s) do gene GA3 oxidase e/ou GA20 oxidase, ou um ou mais transcritos e/ou trans- crito(s) e/ou proteína (s) do gene GA oxidase (ou semelhante a GA oxi- dase), em um ou mais tecidos(s) do caule, Interno, folha e/ou vascular (es) de uma planta de milho modificada pode ser pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, em pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 100% menos ou in- ferior do que no(s) mesmo(s) tecido(s) de uma planta de milho tipo sel- vagem ou controle.
[0094] De acordo com algumas modalidades, uma planta de milho modificada pode compreender nível(is) de um ou mais transcrito(s) e/ou proteína (s) do gene GA3 oxidase e/ou GA20 oxidase, ou um ou mais transcrito(s) e/ou proteína (s) do gene GA oxidase (ou semelhante à GA oxidase) em toda a planta, ou em um ou mais tecido(s) do caule, Interno, folha e/ou vascular(es) que está entre 5% e 50%, entre 10% e 100%, entre 20% e 100%, entre 30% e 100%, entre 40% e 100%, entre 50% e
100%, entre 60% e 100%, entre 70% e 100%, entre 80% e 100%, entre 80% e 90%, entre 10% e 90%, entre 10% e 80%, entre 10% e 70%, entre 10% e 60%, entre 10% e 50%, entre 10% e 40%, entre 10% e 30%, entre 10% e 20%, entre 50% e 100%, entre 20% e 90%, entre 20% e 80%, entre 20% e 70%, entre 20% e 60%, entre 20% e 50%, entre 20% e 40%, entre 20% e 40%, entre 20% e 30%, entre 30% e 90%, entre 30% e 80%, entre 30% e 70%, entre 30% e 60%, entre 30% e 50%, entre 30% e 40%, entre 40% e 90% entre 40% e 80%, entre 40% e 70%, entre 40% e 60%, entre 40% e 50%, entre 50% e 90%, entre 50% e 80%, entre 50% e 70%, entre 50% e 60%, entre 60% e 90%, entre 60% e 80%, entre 60% e 70%, entre 70% e 90%, ou entre 70% e 80% menos ou (ou inferior) do que nos mesmos tecidos de uma planta de milho tipo selvagem ou controle. Uma planta de milho modificada com um nível de expressão reduzido ou eliminado de pelo menos um gene(s) de GA20 oxidase e/ou GA3 oxidase em um ou mais tecido(s), também pode ser substancialmente livre de tipos estranhos, como teci- dos reprodutivos macho ou estruturas e/ou outros tipos estranhos de pelo menos uma espiga da planta de milho modificada.
[0095] Métodos e técnicas são fornecidos para a triagem e/ou iden- tificação de células ou plantas, etc., quanto à presença de edições ou transgenes direcionados e seleção de células ou plantas compreen- dendo edições direcionadas ou transgenes, que podem ser baseados em um ou mais fenótipos ou traços, ou na presença ou ausência de um marcador molecular ou polinucleotídeo ou sequência de proteína nas células ou plantas. Os ácidos nucleicos podem ser isolados e detecta- dos usando técnicas conhecidas na técnica. Por exemplo, os ácidos nu- cleicos podem ser isolados e detectados usando, sem limitação, tecno- logia de ácido nucleico recombinante e/ou a reação em cadeia da poli- merase (PCR). Técnicas gerais de PCR são descritas, por exemplo, em PCR Primer: A Laboratory Manual, Dieffenbach & Dveksler, Eds., Cold
Spring Harbor Laboratory Press, 1995. As técnicas de ácido nucleico recombinante incluem, por exemplo, digestão e ligação de enzimas de restrição, que podem ser usadas para isolar um ácido nucleico. Ácidos nucleicos isolados também podem ser quimicamente sintetizados, seja como uma molécula única de ácido nucleico ou como uma série de oli- gonucleotídeos. Os polipeptídeos podem ser purificados a partir de fon- tes naturais (por exemplo, uma amostra biológica) por métodos conhe- cidos como troca iônica DEAE, filtração em gel e cromatografia em hi- droxiapatita. Um polipeptídeo também pode ser purificado, por exemplo, expressando um ácido nucleico em um vetor de expressão. Além disso, um polipeptídeo purificado pode ser obtido por síntese química. O grau de isolamento ou pureza pode ser medido por qualquer método ade- quado, por exemplo, cromatografia de coluna, eletroforese em gel de poliacrilamida ou análise HPLC. Qualquer método conhecido na técnica pode ser usado para rastrear, e/ou identificar células, plantas, etc., que tenham um transgene ou genoma editado em seu genoma, que pode ser baseado em qualquer forma adequada de observação visual, sele- ção, técnica molecular, etc.
[0096] Em algumas modalidades, são fornecidos métodos para de- tectar ácidos nucleicos recombinantes e/ou polipeptídeos em células de planta. Por exemplo, os ácidos nucleicos podem ser detectados usando sondas de hibridação ou através da produção de amplicons usando PCR com iniciadores, como conhecido na técnica. A hibridização entre os ácidos nucleicos é discutida em Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). Os polipeptídeos podem ser detectados usando anticorpos. As técnicas para detectar polipeptídeos usando an- ticorpos incluem ensaios de imunoabsorção enzimática (ELISAs), trans- ferências Western, imunoprecipitações, imunofluorescência e seme- lhantes. Um anticorpo no presente documento fornecido pode ser um anticorpo policlonal ou um anticorpo monoclonal. Um anticorpo com afi- nidade de ligação específica para um polipeptídeo no presente docu- mento fornecido pode ser gerado usando métodos conhecidos na téc- nica. Uma sonda de anticorpo ou hibridação pode ser conectada a um suporte sólido, como um tubo, placa ou poço, usando métodos conhe- cidos na técnica.
[0097] A detecção (por exemplo, de um produto de amplificação, de um complexo de hibridação, de um polipeptídeo) pode ser realizada usando marcadores detectáveis que podem ser ligados ou associados a uma sonda ou anticorpo de hibridação. O termo "rótulo" visa abranger o uso de rótulos diretos e indiretos. Exemplos de substâncias detectá- veis incluem, mas não estão limitados a, várias enzimas, grupos pros- téticos, materiais fluorescentes, materiais luminescentes, materiais bio- luminescentes e materiais radioativos.
[0098] A triagem e seleção de plantas ou células vegetais modifica- das ou editadas pode ser realizada através de quaisquer metodologias conhecidas pelos versados na técnica de biologia molecular. Exemplos de metodologias de triagem e seleção incluem, mas sem limitação, aná- lise Southern, amplificação de PCR para detecção de um polinucleotí- deo; Northern blots, proteção da RNase, extensão de iniciador, amplifi- cação de RT-PCR para detecção de transcritos de RNA, sequencia- mento Sanger, tecnologias de sequenciamento de Próxima Geração (por exemplo, Illumina®, PacBio®, Ion TorrentTM, etc.) ensaios enzimá- ticos para detecção de atividade de enzima ou ribozima de polipeptídeos e polinucleotídeos; e eletroforese em gel de proteína, Western blots, imunoprecipitação e imunoensaios ligados a enzima para detectar poli- peptídeos. Outras técnicas, tais como hibridização in situ, coloração en- zimática e imunocoloração também podem ser usadas para detectar a presença ou expressão de polipeptídeos e/ou polinucleotídeos. Méto- dos para executar todas as técnicas referidas são conhecidos.
EXEMPLOS Exemplo 1. Observações fenotípicas de plantas de milho com um gene GA20 oxidase_3 ou GA20 oxidase_5 editado.
[0099] Várias mutações editadas pelo genoma foram criadas nos genes endógenos de GA20 oxidase_3 e GA20 oxidase_5 em plantas de milho para testar o efeito fenotípico de nocautear cada um desses ge- nes. Uma série de dez RNAs guia de cadeia única (sgRNAs) que codi- ficam construtos de direcionamento foi criada para cada um dos genes GA20 oxidase_3 e GA20 oxidase_5 que direcionam posições diferentes ao longo da sequência genômica de cada gene. Uma série adicional de dez sgRNAs foi criada para cada alvo dos genes GA20 oxidase_3 e GA20 oxidase_5, em posições semelhantes ou diferentes ao longo da sequência genômica de cada gene. As edições direcionadas do genoma foram feitas distribuindo o sgRNA junto com a expressão de uma prote- ína Cas9 para explantes de milho para fazer com que um DSB ou corte ocorresse no ou próximo ao sítio alvo genômico para o gRNA, que pode então ser reparado de forma imperfeita para introduzir uma mutação no ou perto do sítio alvo. A presença de uma mutação foi subsequente- mente confirmada por análise RFLP e/ou sequenciamento de plantas. A Tabela 2 abaixo fornece uma lista dos construtos de RNA guia (gRNA) que foram testados, que podem ser usados para a edição do genoma de um ou ambos os genes GA20 oxidase_3 e GA20 oxidase_5 com uma endonuclease guiada por RNA. Estes construtos de RNA guia são ge- ralmente projetados para direcionar as sequências de codificação dos genes GA20 oxidase_3 e/ou GA20 oxidase_5, mas alguns dos constru- tos de direcionamento conjunto podem, em vez disso, direcionar uma sequência UTR de um dos dois genes. Esses gRNAs podem ser usados com uma endonuclease adequada para produzir uma quebra de fita du- pla (DSB) ou corte no genoma no ou próximo ao sítio alvo genômico do respectivo gRNA, que pode ser reparado de forma imperfeita para pro- duzir uma mutação (por exemplo, uma inserção, deleção, substituição, etc.). As plantas homozigotas para um gene GA20 oxidase_3 editado ou homozigotas para um gene GA20 oxidase_5 editado foram geradas a partir de alguns construtos (ver texto em negrito). Eventos também foram gerados a partir de construtos direcionando os dois genes para edição.
Para os construtos que direcionam conjuntamente os genes GA20 oxidase_3 e GA20 oxidase_5, as coordenadas da sequência de codificação (CDS) são fornecidas em referência a um dos dois genes, conforme indicado entre parênteses.
A Tabela 2 mostra ainda quais construtos produziram eventos de edição de genes, se esses eventos eram homozigotos ou heterozigotos nas plantas R0 e os números ± en- tre parênteses indicam a provável mudança de sequência com a muta- ção (por exemplo, +1 significa uma inserção de 1 nucleotídeo, -1 signi- fica uma deleção de 1 nucleotídeo, etc., e Indels maiores ou mais com- plicados são rotulados como "del". ou inserto.”). Para direcionamento conjunto dos genes GA20 oxidase_3 e GA20 oxidase_5, a identidade do gene mutado também é fornecida entre parênteses.
As plantas R0 homozigotas para um gene GA20 oxidase_3 ou GA20 oxidase_5 edi- tado não tinham uma estatura baixa observável, fenótipo semianão e tinham uma altura de planta normal em relação às plantas de controle (ver construtos GA20 oxidase_3-D e GA20 oxidase_3-G, e construtos GA20 oxidase_5-B e GA20 oxidase_5-G na Tabela 2), indicando que o knockout de apenas um desses genes não é suficiente para produzir o fenótipo semianão.
Tabela 2. RNAs guia (gRNAs) direcionados aos genes GA20 oxi- dase_3 e GA oxidase_5 para edição.
Sequência de direcio- gRNA Gene Alvo namento por gRNA Coordenadas do gene CDS Plantas R0 geradas (SEQ ID NO)
GA20 oxidase_3-A 138 552-572 ---
GA20 oxidase_3-B 139 879-899 --- GA20 oxidase_3-C 140 147-167 ---
1. homozigoto (-1) GA20 oxidase_3-D 141 526-546 2. heterozigoto (-1)
3. bi-alélico (-2, +1) GA20 oxidase_3-E 142 446-466 --- GA20 oxidase_3-F 143 2227-2247 ---
1. homozigoto (+1) GA20 oxidase_3-G 144 548-568 2. heterozigoto (-1)
3. bi-alélico (+1, -1) GA20 oxidase_3-H 145 547-567 --- GA20 oxidase_3-I 146 43-63 --- GA20 oxidase_3-J 147 548-567 --- GA20 oxidase_5-A 148 356-376 (+) 1. heterozigoto (-1)
1. homozigoto (-1)
2. heterozigoto (+1) GA20 oxidase_5-B 149 99-119
3. heterozigoto (+1, -7)
4. heterozigoto (-3, -1) GA20 oxidase_5-C 150 369-389 --- GA20 oxidase_5-D 151 48-68 --- GA20 oxidase_5-E 152 356-376 (-) --- GA20 oxidase_5-F 153 748-768 1. heterozigoto (-1, +1)
1. homozigoto (-1) GA20 oxidase_5-G 154 770-790
2. homozigoto (-1) GA20 oxidase_5-H 155 10-30 --- GA20 oxidase_5-I 156 262-282 --- GA20 oxidase_5-J 157 768-788 ---
290..310 GA20 oxidase_3/5-A 158 --- (GA20 Ox_3)
289..309 GA20 oxidase_3/5-B 159 --- (GA20 Ox_3)
270..290 GA20 oxidase_3/5-C 160 --- (GA20 Ox_5)
49..69 GA20 oxidase_3/5-D 161 --- (GA20 Ox_3)
265..285 1. heterozigoto (Ox5, GA20 oxidase_3/5-E 162 (GA20 Ox_5) +1)
1. hetero (Ox3, +1, -1) hetero (Ox5, +1, del.)
419..439 GA20 oxidase_3/5-F 163 2. hetero (Ox3, +1, (GA20 Ox_3) del.) hetero (Ox5, +1)
110..130 GA20 oxidase_3/5-G 164 --- (GA20 Ox_3)
634..654 GA20 oxidase_3/5-H 165 --- (GA20 Ox_5)
98..118 GA20 oxidase_3/5-I 166 --- (GA20 Ox_5)
517..537 GA20 oxidase_3/5-J 167 --- (GA20 Ox_5) Exemplo 2. Identificação de plantas de milho com várias combina- ções de alelos mutantes de GA20 oxidase_3 e GA20 oxidase_5 edi- tados.
[00100] As plantas de milho foram editadas conforme descrito no Exemplo 1 através de uma abordagem baseada em CRISPR / Cas9 usando RNAs guia (gRNAs) que direcionam um dos genes GA20 oxi- dase_3 e GA20 oxidase_5 especificamente ou direcionam ambos os dois genes simultaneamente (ver Tabela 2). No total, 30 construtos de gRNA foram transformadas em milho. Amostras de folhas de plantas R0 foram coletadas e analisadas para InDels por um ensaio de Análise de Comprimento de Fragmento (FLA). Os alelos mutantes putativos identi- ficados por FLA foram sequenciados usando iniciadores específicos de gene e protocolos de sequenciamento profundo padrão para confirmar a(s) mutação(ões). A Tabela 3 fornece uma lista de 12 alelos mutantes editados no gene GA20 oxidase_3 (ga20ox3-1 a ga20ox3-12) e suas sequências. A Tabela 4 fornece uma lista de 11 alelos mutantes edita- dos no gene GA20 oxidase_5 (ga20ox5-1 a ga20ox5-11) e suas se- quências. Plantas R0 com mutação(ões) em GA20 oxidase_3 ou GA20 oxidase_5, ou em ambos os genes, foram criados para produzir plantas
R1.
[00101] Sementes R1 de múltiplas plantas R0 foram plantadas e amostradas novamente para confirmar a(s) mutação(ões) usando FLA e protocolos de sequenciamento padrão. A Tabela 5 fornece uma lista de plantas R1 com mutações em GA20 oxidase_3, GA20 oxidase_5, ou ambos os genes. A Tabela 5 também mostra a altura da planta e o com- primento do Interno (espiga menos 2) das plantas R1 medidas no está- gio R3. A altura da planta foi medida em estágio de crescimento R2/R3 da linhagem do solo até a base da folha com maior coleira. Plantas R1 que são homozigotas ou heterozigotas para uma mutação no gene de interesse (GA20 oxidase_3 e/ou GA20 oxidase_5) foram identificados por sequenciamento e autoprodutivos para produzir plantas R2. Os ge- nótipos das plantas R2 foram novamente determinados por FLA e se- quenciamento. A Tabela 6 fornece uma lista de plantas R2 com muta- ções em GA20 oxidase_3, GA20 oxidase_5 ou em ambos os genes e sua altura de planta no estágio R2 / R3. A Tabela 6 também fornece a caracterização correspondente de plantas de controle de referência não editadas (plantas endogâmicas tipo selvagem, mostradas como WT) e plantas de milho endogâmicas transgênicas tendo um construto de su- pressão de microRNA artificial direcionado aos genes GA20 oxidase_3 e GA20 oxidase_5 para supressão (SUP_GA20Ox3 & Ox5 ("SUP_Ox3 e Ox5")).
[00102] Em média, as plantas R2 contendo alelos mutantes homozi- gotos de ambos os genes GA20 oxidase_3 e GA20 oxidase_5 (isto é, duplo homozigoto) mostraram um fenótipo semianão (cerca de 27,5% de redução na altura da planta em relação ao controle) com arquitetura de planta alterada semelhante a plantas SUP_Ox3 e Ox5 (comparação das plantas Homo_ox3 / Homo_ox5 e SUP_Ox3 & Ox5 na Tabela 7 e FIG. 1). Mutantes ga20ox3 homozigotos simples e mutantes ga20ox5 homozigotos simples exibiram uma ligeira redução (cerca de 10-11%)
na altura média da planta (no estágio R3) em relação às plantas de con- trole de referência não editadas (WT endogâmicas). Além disso, plantas de milho com mutações ga20ox3 homozigotas e heterozigotas para uma mutação ga20ox5 (isto é, Homo_ox3/ Het_ox5 na Tabela 7 e FIG. 1) exibiu uma redução moderada (cerca de 19,1%) na altura média da planta (no estágio R3) em relação às plantas de controle de referência não editadas (WT endogâmicas). Plantas Homo_ox3/ Het_ox5 eram li- geiramente mais altas que as plantas ga20ox3 ga20ox5 homozigotas duplas (Homo_ox3/ Homo_ox5). Dado que o milho é um organismo di- ploide, a edição de genes mediada por CRISPR pode resultar em mu- tações bialélicas em plantas R0 (também conhecidas como uma combi- nação de mutantes bialélicos ou mutações trans-heterozigotas). Por uma questão de simplicidade, um mutante bialélico em um locus parti- cular é tratado como um mutante homozigoto nesse locus para descri- ção do genótipo e fins de cálculo da altura da planta.
Genótipos mutan- tes detalhados (incluindo mutantes bialélicos) são fornecidos nas Tabe- las 18 e 19 para plantas de geração R1 e R2, respectivamente.
Ambos os mutantes ga20ox3 /ga20ox5 homozigotos duplos, e combinações de mutantes homozigotos / heterozigotos (por exemplo, Homo_ox3 / Het_ox5 ou Het_ox3 / Homo_ox5) também resultaram em plantas semi- anãs mais curtas, embora as alturas das plantas em combinações de mutantes homozigotos / heterozigotos não foram reduzidas tanto quanto as plantas mutantes ga20ox3 /ga20ox5 homozigotas duplas.
Tabela 3. Uma lista de 12 alelos mutantes editados em GA20 oxidase_3 (ga20ox3-1 a ga20ox3-12) e suas se- quências. Os IDs de gRNA mostrados no presente documento correspondem aos da Tabela 2.
SEQ ID para SEQ ID para sequên- SEQ ID para sequên- SEQ ID para sequên- Sequência de cia de referência tipo Descrição do Alelo (EDIÇÃO em coor- cia de alelos mutantes cia de alelos mutantes Alelos Mutan- Genus Locus Alelo mutante selvagem (~60 nt edi- denada de DNA codificante genômico, Posição de edição ID do gRNA (~30 nt edições de (~60 nt edições de tes (DNA codi- ções de flanquea- com base na SEQ ID No. 168) flanqueamento) flanqueamento) ficante genô- mento) mico) GA20ox3 ga20ox3-1 170 182 194 206 Deleção de 13 bases começando em 536 primeiro éxon GA20ox3_d 78/86 GA20ox3 ga20ox3-2 171 183 195 207 Deleção da base 542 primeiro éxon GA20ox3_d GA20ox3 ga20ox3-3 172 184 196 208 Inserção de CC na base 542 primeiro éxon GA20ox3_d GA20ox3 ga20ox3-4 173 185 197 209 Supressão da base 541 primeiro éxon GA20ox3_d GA20ox3 ga20ox3-5 174 186 198 210 Deleção de 3 nt começando na base 540 primeiro éxon GA20ox3_d Deleção de 2 bases começando na base GA20ox3 ga20ox3-6 175 187 199 211 primeiro éxon GA20ox3_5_f 422 GA20ox3 ga20ox3-7 176 188 200 212 Inserção de um A na base 422 primeiro éxon GA20ox3_5_f GA20ox3 ga20ox3-8 177 189 201 213 Inserção de um T na base 422 primeiro éxon GA20ox3_5_f GA20ox3 ga20ox3-9 178 190 202 214 Deleção da base 564 primeiro éxon GA20ox3_g GA20ox3 ga20ox3-10 179 191 203 215 Inserção de um A na base 564 primeiro éxon GA20ox3_g GA20ox3 ga20ox3-11 180 192 204 216 Inserção de um C na base 565 primeiro éxon GA20ox3_g GA20ox3 ga20ox3-12 181 193 205 217 Inserção de um C na base 63 primeiro éxon GA20ox3_5_e
Tabela 4. Uma lista de 11 alelos mutantes editados no gene GA20 oxidase_5 (ga20ox5-1 a ga20ox5-11) e suas sequências. Os IDs de gRNA mostrados no presente documento correspondem aos da Tabela 2.
SEQ ID para SEQ ID para sequên- SEQ ID para sequên- SEQ ID para sequên- Sequência de cia de referência tipo Descrição do alelo (EDIÇÃO em coor- cia de alelos mutantes cia de alelos mutantes Alelos Mutan- Genus Locus Alelo Mutante selvagem (~60 nt edi- denada de DNA codificador genômico, Posição de edição ID do gRNA (~30 nt edições de (~60 nt edições de tes (DNA codi- ções de flanquea- com base na SEQ ID No. 169) flanqueamento) flanqueamento) ficante genô- mento) mico) 79/86 GA20ox5 ga20ox5-1 218 229 240 251 Deleção da base 644 primeiro éxon GA20ox3_5_f Deleção de 2 bases começando na base GA20ox5 ga20ox5-2 219 230 241 252 primeiro éxon GA20ox3_5_f 644 GA20ox5 ga20ox5-3 220 231 242 253 Inserção de um T na base 644 primeiro éxon GA20ox3_5_f GA20ox5 ga20ox5-4 221 232 243 254 Supressão da base 372 primeiro éxon GA20ox5_a GA20ox5 ga20ox5-5 222 233 244 255 Deleção da base 786 primeiro éxon GA2ox5_g Deleção de 5 bases começando na base GA20ox5 ga20ox5-6 223 234 245 256 primeiro éxon GA2ox5_g 786 Deleção de 2 bases começando na base GA20ox5 ga20ox5-7 224 235 246 257 primeiro éxon GA20ox5_b 101 GA20ox5 ga20ox5-8 225 236 247 258 Inserção de um T na base base 102 primeiro éxon GA20ox5_b Deleção de 3 bases começando na base GA20ox5 ga20ox5-9 226 237 248 259 primeiro éxon GA20ox5_b 99 GA20ox5 ga20ox5-10 227 238 249 260 Inserção de um A na base 282 primeiro éxon GA20ox3_5_e GA20ox5 ga20ox5-11 228 239 250 261 Inserção de um C na base 282 primeiro éxon GA20ox3_5_e
Tabela 5. Uma lista de plantas R1 com mutações em GA20 oxidase_3, GA20 oxidase_5, ou ambos os genes.
Altura da Comprimento In- Planta No.
Genótipo de planta planta (pole- Genótipo GA20ox3 Genótipo GA20ox5 Alelo(s) ga20ox3 Alelo(s) ga20ox5 Geração gRNA terno (cm) gadas)
1 simples homo ga20ox5 58,74 12 WT Deleção bialélica -1, deleção -5, nenhum ga20ox5-6, ga20ox5-5 R1 GA20ox5_g
2 simples homo ga20ox5 51,65 10 WT Deleção bialélica -1, deleção -5, nenhum ga20ox5-6, ga20ox5-5 R1 GA20ox5_g
3 simples homo ga20ox5 57,49 10,5 WT Deleção bialélica -1, deleção -5, nenhum ga20ox5-6, ga20ox5-5 R1 GA20ox5_g
4 simples homo ga20ox5 68,27 13,8 WT Deleção bialélica -2, inserção +1, nenhum ga20ox5-8, ga20ox5-7 R1 GA20ox5_b
5 simples homo ga20ox5 56,89 11,3 WT Deleção bialélica -5, deleção -1, nenhum ga20ox5-6, ga20ox5-5 R1 GA20ox5_g
6 hetero ga20ox3/homo ga20ox5 53,7 10 Inserção Het +1, Inserção bialélica +1,inserção +1, ga20ox3-12 ga20ox5-11, ga20ox5-10 R1 GA20ox3_5_e
7 homo ga20ox3/hetero ga20ox5 53,9 9,5 Inserção bialélica +1,inserção +1, Deleção Het -1, ga20ox3-8, ga20ox3-7 ga20ox5-1 R1 GA20ox3_5_f
8 homo ga20ox3/hetero ga20ox5 56,69 10 Deleção bialélica -2, inserção +1, Deleção Het -2, ga20ox3-6, ga20ox3-8 ga20ox5-2 R1 GA20ox3_5_f
9 homo ga20ox3/hetero ga20ox5 49,09 9,5 Inserção bialélica +1,deleção -2, Deleção Het -2, ga20ox3-6, ga20ox3-8 ga20ox5-2 R1 GA20ox3_5_f
80/86 10 homo ga20ox3/hetero ga20ox5 54,96 10,3 Inserção bialélica +1,deleção -2, Deleção Het -2, ga20ox3-6, ga20ox3-8 ga20ox5-2 R1 GA20ox3_5_f
11 homo ga20ox3/hetero ga20ox5 47,13 9 Inserção homozigota +1, Deleção Het -2, ga20ox3-8 ga20ox5-2 R1 GA20ox3_5_f
12 hetero ga20ox3/hetero ga20ox5 53,31 10 Inserção Het +1, Deleção Het -5, ga20ox3-10 ga20ox5-6 R1 GA20ox3_g
13 homo ga20ox3/hetero ga20ox5 56,57 11 Inserção bialélica +1,inserção +1, Inserção Het +1, ga20ox3-8, ga20ox3-7 ga20ox5-3 R1 GA20ox3_5_f
14 homo ga20ox3/hetero ga20ox5 49,57 8,1 Inserção bialélica +1,inserção +1, Inserção Het +1, ga20ox3-8, ga20ox3-7 ga20ox5-3 R1 GA20ox3_5_f
15 homo ga20ox3/hetero ga20ox5 53,35 9,1 Inserção bialélica +1,inserção +1, Inserção Het +1, ga20ox3-8, ga20ox3-7 ga20ox5-3 R1 GA20ox3_5_f
16 homo ga20ox3/hetero ga20ox5 59,41 9,6 Inserção bialélica +1,inserção +1, Inserção Het +1, ga20ox3-7, ga20ox3-8 ga20ox5-3 R1 GA20ox3_5_f
17 homo ga20ox3/hetero ga20ox5 60,75 11 Inserção bialélica +1,inserção +1, Inserção Het +1, ga20ox3-7, ga20ox3-8 ga20ox5-3 R1 GA20ox3_5_f
18 simples homo ga20ox5 51,54 10 WT Deleção homozigota -1, nenhum ga20ox5-4 R1 GA20ox5_a
19 simples homo ga20ox5 57,4 12,2 WT Deleção homozigota -1, nenhum ga20ox5-4 R1 GA20ox5_a
20 simples homo ga20ox5 58,9 11,5 WT Deleção homozigota -1, nenhum ga20ox5-4 R1 GA20ox5_a
21 simples homo ga20ox5 50,83 9 WT Deleção homozigota -1, nenhum ga20ox5-5 R1 GA20ox5_g
22 simples homo ga20ox5 55,08 10,5 WT Deleção homozigota -1, nenhum ga20ox5-5 R1 GA20ox5_g
23 simples homo ga20ox5 54,76 10 WT Deleção homozigota -1, nenhum ga20ox5-5 R1 GA20ox5_g
24 simples homo ga20ox5 56,54 10 WT Deleção homozigota -1, nenhum ga20ox5-5 R1 GA20ox5_g
25 simples homo ga20ox5 55,12 10,3 WT Deleção homozigota -1, nenhum ga20ox5-5 R1 GA20ox5_g
26 simples homo ga20ox5 55,47 9 WT Deleção homozigota -1, nenhum ga20ox5-5 R1 GA20ox5_g
27 simples homo ga20ox5 61,02 10 WT Deleção homozigota -1, nenhum ga20ox5-5 R1 GA20ox5_g
28 simples homo ga20ox5 48,62 7 WT Deleção homozigota -1, nenhum ga20ox5-5 R1 GA20ox5_g
29 simples homo ga20ox5 63,5 11,5 WT Deleção homozigota -1, nenhum ga20ox5-5 R1 GA20ox5_g
30 simples homo ga20ox5 60,28 10,5 WT Deleção homozigota -1, nenhum ga20ox5-5 R1 GA20ox5_g
31 simples homo ga20ox5 58,12 11,3 WT Deleção homozigota -1, nenhum ga20ox5-5 R1 GA20ox5_g
32 simples homo ga20ox5 51,89 12 WT Deleção homozigota -1, nenhum ga20ox5-5 R1 GA20ox5_g
33 simples homo ga20ox5 70,08 14. WT Deleção homozigota -3, nenhum ga20ox5-9 R1 GA20ox5_b
34 simples homo ga20ox5 55,55 9,8 WT Inserção homozigota +1, nenhum ga20ox5-10 R1 GA20ox3_5_e
35 Indisponível 59,57 10 Indisponível Indisponível Indisponível Indisponível R1 GA20ox3_d
36 Indisponível 67,28 13,3 Indisponível Indisponível Indisponível Indisponível R1 GA20ox3_g
37 Indisponível 56,54 9 Indisponível Indisponível Indisponível Indisponível R1 GA20ox3_d
81/86 38 Indisponível 63,74 11,5 Indisponível Indisponível Indisponível Indisponível R1 GA20ox3_g
39 ga20ox3 homo simples 65,24 10 Deleção bialélica -1, deleção -1, WT ga20ox3-4, ga20ox3-2 nenhum R1 GA20ox3_d
40 ga20ox3 homo simples 69,49 9,5 Deleção bialélica -1, deleção -1, WT ga20ox3-2, ga20ox3-4 nenhum R1 GA20ox3_d
41 ga20ox3 homo simples 60,12 9 Deleção bialélica -1, deleção -3, WT ga20ox3-5, ga20ox3-2 nenhum R1 GA20ox3_d
42 ga20ox3 homo simples 53,74 10 Deleção bialélica -1, inserção +1, WT ga20ox3-10, ga20ox3-9 nenhum R1 GA20ox3_g
43 ga20ox3 homo simples 58,43 9,8 Deleção bialélica -13, deleção -1, WT ga20ox3-1, ga20ox3-2 nenhum R1 GA20ox3_d
44 ga20ox3 homo simples 57,28 11,5 Deleção bialélica -2, inserção +1, WT ga20ox3-8, ga20ox3-6 nenhum R1 GA20ox3_5_f
45 ga20ox3 homo simples 56,26 11,5 Inserção bialélica +1,deleção -2, WT ga20ox3-8, ga20ox3-6 nenhum R1 GA20ox3_5_f
46 ga20ox3 homo simples 59,8 10,8 Inserção bialélica +1,deleção -2, WT ga20ox3-8, ga20ox3-6 nenhum R1 GA20ox3_5_f
47 único hetero ga20ox3 54,45 11 Inserção Het +1, WT ga20ox3-8 nenhum R1 GA20ox3_5_f
48 ga20ox3 homo simples 52,68 9,5 Deleção homozigota -1, WT ga20ox3-2 nenhum R1 GA20ox3_d
49 ga20ox3 homo simples 64,17 12 Deleção homozigota -1, WT ga20ox3-2 nenhum R1 GA20ox3_d
50 ga20ox3 homo simples 56,97 11 Deleção homozigota -1, WT ga20ox3-9 nenhum R1 GA20ox3_g
51 ga20ox3 homo simples 43,19 12,5 Deleção homozigota -1, WT ga20ox3-9 nenhum R1 GA20ox3_g
52 ga20ox3 homo simples 58,94 11,3 Deleção homozigota -1, WT ga20ox3-9 nenhum R1 GA20ox3_g
53 ga20ox3 homo simples 61,65 13 Inserção homozigota +1, WT ga20ox3-8 nenhum R1 GA20ox3_5_f
54 ga20ox3 homo simples 60,91 11,5 Inserção homozigota +1, WT ga20ox3-10 nenhum R1 GA20ox3_g
Tabela 6. Uma lista de plantas R2 com alelos editados em GA20 oxidase_3, GA20 oxidase_5, ou ambos os genes.
As plantas 45 e 46 são consideradas exceções e não são incluídas para gerar dados médios de altura da planta mostrados na Tabela 7. Planta No.
Genótipo de planta Altura da planta (polegadas) Genótipo GA20ox3 Genótipo GA20ox5 Alelo(s) ga20ox3 Alelo ga20ox5 Geração gRNA
45 1 homo ga20ox3/hetero ga20ox5 Inserção bialélica +1 Deleção heterozigota -1 ga20ox3-7,ga20ox3-8 ga20ox5-1 R2 GA2ox3_5_f
45,2 2 homo ga20ox3/hetero ga20ox5 Inserção homozigota +1 Deleção heterozigota -1 ga20ox3-8 ga20ox5-1 R2 GA2ox3_5_f
45 3 homo ga20ox3/hetero ga20ox5 Deleção bialélica -2, inserção +1 Deleção heterozigota -2 ga20ox3-6,ga20ox3-8 ga20ox5-2 R2 GA2ox3_5_f
42,8 4 homo ga20ox3/hetero ga20ox5 Inserção homozigota +1 Deleção heterozigota -2 ga20ox3-8 ga20ox5-2 R2 GA2ox3_5_f
45,2 5 homo ga20ox3/hetero ga20ox5 Inserção homozigota +1 Deleção heterozigota -2 ga20ox3-8 ga20ox5-2 R2 GA2ox3_5_f
48,8 6 homo ga20ox3/hetero ga20ox5 Inserção homozigota +1 Deleção heterozigota -2 ga20ox3-8 ga20ox5-2 R2 GA2ox3_5_f
82/86 51,8 7 homo ga20ox3/hetero ga20ox5 Inserção homozigota +1 Deleção heterozigota -2 ga20ox3-8 ga20ox5-2 R2 GA2ox3_5_f
45,4 8 homo ga20ox3/hetero ga20ox5 Inserção homozigota +1 Deleção heterozigota -2 ga20ox3-8 ga20ox5-2 R2 GA2ox3_5_f
47 9 homo ga20ox3/hetero ga20ox5 Deleção homozigota -2 Deleção heterozigota -2 ga20ox3-6 ga20ox5-2 R2 GA2ox3_5_f
49,8 10 homo ga20ox3/hetero ga20ox5 Deleção homozigota -2 Deleção heterozigota -2 ga20ox3-6 ga20ox5-2 R2 GA2ox3_5_f
52,4 11 simples homo ga20ox5 WT Deleção homozigota -1 nenhum ga20ox5-4 R2 GA2ox5_a
39,2 12 simples homo ga20ox5 WT Deleção homozigota -1 nenhum ga20ox5-4 R2 GA2ox5_a
53 13 simples homo ga20ox5 WT Deleção homozigota -1 nenhum ga20ox5-4 R2 GA2ox5_a
54 14 simples homo ga20ox5 WT Deleção homozigota -1 nenhum ga20ox5-4 R2 GA2ox5_a
53,8 15 simples homo ga20ox5 WT Deleção homozigota -1 nenhum ga20ox5-4 R2 GA2ox5_a simples homo ga20ox5 53,4 ga20ox5-4 16 WT Deleção homozigota -1 nenhum R2 GA2ox5_a
45 17 Homo duplo Inserção bialélica +1 Inserção homozigota +1 ga20ox3-7,ga20ox3-8 ga20ox5-3 R2 GA2ox3_5_f
37 18 Homo duplo Inserção homozigota +1 Deleção homozigota -2 ga20ox3-8 ga20ox5-2 R2 GA2ox3_5_f
39,2 19 Homo duplo Inserção homozigota +1 Deleção homozigota -2 ga20ox3-8 ga20ox5-2 R2 GA2ox3_5_f
39,8 20 Homo duplo Inserção homozigota +1 Deleção homozigota -2 ga20ox3-8 ga20ox5-2 R2 GA2ox3_5_f
40,8 21 Homo duplo Inserção homozigota +1 Deleção homozigota -2 ga20ox3-8 ga20ox5-2 R2 GA2ox3_5_f
40,8 22 Homo duplo Inserção homozigota +1 Deleção homozigota -2 ga20ox3-8 ga20ox5-2 R2 GA2ox3_5_f
41 23 Homo duplo Inserção homozigota +1 Deleção homozigota -2 ga20ox3-8 ga20ox5-2 R2 GA2ox3_5_f
41,4 24 Homo duplo Inserção homozigota +1 Deleção homozigota -2 ga20ox3-8 ga20ox5-2 R2 GA2ox3_5_f
41,8 25 Homo duplo Inserção homozigota +1 Deleção homozigota -2 ga20ox3-8 ga20ox5-2 R2 GA2ox3_5_f
42 26 Homo duplo Inserção homozigota +1 Deleção homozigota -2 ga20ox3-8 ga20ox5-2 R2 GA2ox3_5_f
42 27 Homo duplo Inserção homozigota +1 Deleção homozigota -2 ga20ox3-8 ga20ox5-2 R2 GA2ox3_5_f
42,4 28 Homo duplo Inserção homozigota +1 Deleção homozigota -2 ga20ox3-8 ga20ox5-2 R2 GA2ox3_5_f
43 29 Homo duplo Inserção homozigota +1 Deleção homozigota -2 ga20ox3-8 ga20ox5-2 R2 GA2ox3_5_f
43,8 30 Homo duplo Inserção homozigota +1 Deleção homozigota -2 ga20ox3-8 ga20ox5-2 R2 GA2ox3_5_f
46,2 31 Homo duplo Inserção homozigota +1 Deleção homozigota -2 ga20ox3-8 ga20ox5-2 R2 GA2ox3_5_f
62 32 ga20ox3 homo simples Deleção homozigota -1 WT ga20ox3-9 nenhum R2 GA2ox3_g
83/86 39 33 ga20ox3 homo simples Deleção homozigota -1 WT ga20ox3-9 nenhum R2 GA2ox3_g
51 34 ga20ox3 homo simples Deleção bialélica -2, inserção +1 WT ga20ox3-6, ga20ox3-8 nenhum R2 GA2ox3_5_f
52,8 35 ga20ox3 homo simples Inserção homozigota +1 WT ga20ox3-8 nenhum R2 GA2ox3_5_f
59,4 36 ga20ox3 homo simples Inserção homozigota +1 WT ga20ox3-8 nenhum R2 GA2ox3_5_f
46 37 ga20ox3 homo simples Inserção homozigota +1 WT ga20ox3-8 nenhum R2 GA2ox3_5_f
52,8 38 ga20ox3 homo simples Inserção homozigota +1 WT ga20ox3-8 nenhum R2 GA2ox3_5_f
51,4 39 ga20ox3 homo simples Deleção homozigota -2 WT ga20ox3-6 nenhum R2 GA2ox3_5_f
43,6 40 SUP_Ox3&Ox5 WT WT Nenhum nenhum N/A nenhum SUP_Ox3&Ox5 43,8 41 WT WT Nenhum nenhum N/A nenhum SUP_Ox3&Ox5 42,2 42 WT WT Nenhum nenhum N/A nenhum
56,4 43 WT WT WT Nenhum nenhum N/A nenhum
58,8 44 WT WT WT Nenhum nenhum N/A nenhum
61,8 GA2ox3_5_f 45 Homo duplo Deleção bialélica -2, inserção +1 Deleção homozigota -2 ga20ox3-6 ga20ox5-2 R2
61,8 GA2ox3_5_f 46 Homo duplo Inserção bialélica +1 Deleção homozigota -1 ga20ox3-7,ga20ox3-8 ga20ox5-1 R2
Tabela 7. Diferenças de altura de planta no estágio R2/R3 entre plantas endogâmicas com gene editado cultivadas em estufa e plantas de controle de referência. Média Altura da Genótipo de planta Desvio Padrão # de Plantas % de Redução planta (polegadas) WT 57,6 1,7 2 0 Homo_ox3/ WT_Ox5 51,8 7,2 8 10,1% WT_Ox3/ Homo_ox5 51,0 5,8 6 11,5% Homo_ox3/ Het_ox5 46,6 2,7 10 19,1% Homo_ox3/ Homo_ox5 41,7 2,3 17 27,5% SUP_Ox3&Ox5 43,2 6,6 3 25,0% Exemplo 3. Editar GA20 oxidase_3 e GA20 oxidase_5 reduz os ní- veis de GA ativa na planta.
[00105] Plantas R2 com alelos editados em GA20 oxidase_3, GA20 oxidase_5 ou ambos os genes foram testadas no campo junto com plan- tas de milho endogâmicas transgênicas com um construto de supressão de microRNA artificial direcionado aos genes GA20 oxidase_3 e GA20 oxidase_5 para supressão SUP_GA20Ox3&Ox5 (“SUP_Ox3&Ox5”)). Vários traços fisiológicos foram medidos, incluindo altura da planta ao nó da espiga em R3, altura da planta até a lígula superior, altura da espiga, comprimento da espiga, diâmetro da espiga, caroços / espiga, caroços / área unitária, peso do caroço único, diâmetro do caule e esti- mativa de rendimento de caroços. Plantas contendo alelos mutantes ho- mozigotos de ambos os genes GA20 oxidase_3 e GA20 oxidase_5 (isto é, mutantes ga20ox3 /ga20ox5 homozigotos duplos) mostraram fenóti- pos semianões com arquitetura de plantas alterada. Mutantes ga20ox3 homozigotos simples e mutantes ga20ox5 homozigotos simples apre- sentaram altura de planta ligeiramente mais alta do que mutantes ga20ox3/ga20ox5 homozigotos duplos. A Tabela 8 mostra os principais traços com delta porcentual em relação às plantas de controle tipo sel- vagem sem alelo editado (isto é, diferença porcentual em comparação ao controle).
[00106] Além disso, as folhas de colar superior em V8 foram coleta- das para medir o nível de um painel de hormônios do ácido giberélico através de ensaios bioquímicos padrão.
Os dados indicam que, no es- tágio de crescimento V8, os tecidos foliares dos colares superiores de plantas com edições GA20ox3 e GA20ox5 apresentam níveis significa- tivamente mais baixos de GA20, GA4 e GA1, mas níveis mais altos de GA53 em comparação com o tipo selvagem (controle). As alterações nos níveis de hormônio GA observadas em tecidos de plantas com edi- ções GA20ox3 e GA20ox5 foram semelhantes às observadas em plan- tas transgênicas SUP_Ox3&Ox5 (Tabela 9). Tabela 8: Editar GA20 oxidase_3, GA20 oxidase_5, ou ambos os genes impacta vários traços fisiológicos (mostrado como diferença percentual média em relação a um controle de tipo selvagem). Delta porcentual em relação ao controle WT ga20ox3 /ga20ox5 homozigoto ga20ox5 homozigoto simples ga20ox3 homozigoto sim- Traço duplo (Planta # 18 a 31 na Ta- (planta # 11 a 16 na Tabela 6) ples (planta # 32 e 33 na Ta- bela 6) bela 6) Altura da planta até o nó da espiga R3 -46,12 -16,24 -22,55 Altura da planta até a folha ligulada mais alta R3 -30,39 -4,49 -8,6 Espiga do diâmetro da haste menos quatro R3 -6,21 -11,01 -3,37 Dias para 50% de seda visível em R1 -2,48 -2,48 -2,48 Diâmetro da espiga (imageamento) R6 -0,4 -0,48 -1,72 Comprimento da espiga (imageamento) R6 -5,83 -1,31 -4,56 Estimativa de rendimento de grãos R6 -12,2 -17,62 -16,55 Caroços por Espiga R6 -2,62 -5,14 -9,03 Caroços por unidade de área -10,59 -7,08 -11,15 Peso do caroço único R6 -1,59 -11,32 -6,29
Tabela 9: Editar GA20 oxidase_3, GA20 oxidase_5, ou ambos os genes afeta os níveis hormonais de GA (mostrados como Delta Médio, isto é, diferença em pmol GA / grama de tecido e (valor p), em relação a um controle tipo selvagem). A média de pmol GA / grama de tecido para níveis hormonais tipo selvagem também é mostrada. ga20ox5 homozi- ga20ox3 /ga20ox5 SUP_ Estágio de Tipo selva- ga20ox3 homozigoto Tipo de folha Tipo hormonal goto simples homozigoto duplo Ox3 & Ox5 crescimento gem (média) simples (Delta médio) (Delta médio) (Delta médio) (Delta Médio) 0,0250 0,0007 0,1382 0,1726 V8 Folha - colar superior GA12-pmol / g 0,065 (0,517) (0,985) (0,002) (1,91 E-4) 0,3236 0,0984 -1,8405 -1,4112 V8 Folha - colar superior GA1-pmol/g 2,726 (0,355) (0,776) (5,64 E-5) (7,41 E-4) 0,6085 0,6311 -1,8525 -1,8446 V8 Folha - colar superior GA20-pmol/g 2,025 (0,017) (0,014) (4,85 E-7) (5,13 E-7) -0,2339 -0,1940 0,3424 0,2456 V8 Folha - colar superior GA34-pmol/g 2,665 (0,191) (0,275) (0,061) (0,170)
0,1747 0,2062 -0,0586 -0,03487 V8 Folha - colar superior GA3-pmol/g 0,200 (0,006) (0,002) (0,312) (0,544) -0,0734 0,0169 -0,1473 -0,0842 V8 Folha - colar superior GA4-pmol/g 0,270 (0,455) (0,863) (0,144) (0,393) -0,0291 0,1493 0,9521 1,0875 V8 Folha - colar superior GA53-pmol/g 0,355 (0,893) (0,492) (3,77 E-4) (1,03 E-4) 0,0066 -0,0063 -0,0065 0,0393 V8 Folha - colar superior GA8-pmol/g 0,067 (0,857) (0,863) (0,860) (0,292) -1,0053 -0,5852 2,5123 1,9821 V8 Folha - colar superior GA9-pmol/g 1,894 (0,034) (0,201) (1,48 E-5) (2,29 E-4)
[00109] Tendo descrito a presente invenção em detalhes, será evi- dente que modalidades, variações e modificações equivalentes são possíveis sem se afastar do espírito e escopo da presente invenção como descritas no presente documento e nas reivindicações anexadas. Além disso, deve ser apreciado que todos os exemplos na presente in- venção são fornecidos como exemplos não limitativos.

Claims (92)

REIVINDICAÇÕES
1. Planta de milho modificada, ou parte de planta da mesma, caracterizada pelo fato de que compreende um alelo mutante no locus GA20 oxidase_3 e um alelo mutante no locus GA20 oxidase_5, em que pelo menos um dos referidos loci GA20 oxidase_3 e GA20 oxidase_5 compreende alelos mutantes homozigotos.
2. Planta de milho modificada, ou parte de planta da mesma, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o refe- rido locus GA20 oxidase_3 compreende alelos mutantes homozigotos.
3. Planta de milho modificada, ou parte de planta da mesma, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que apenas um dos referidos loci GA20 oxidase_3 e GA20 oxidase_5 compreende alelos mutantes homozigotos.
4. Planta de milho modificada, ou parte de planta da mesma, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o refe- rido locus GA20 oxidase_5 compreende alelos mutantes homozigotos.
5. Planta de milho modificada, ou parte de planta da mesma, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que ambos os referidos loci GA20 oxidase_3 e GA20 oxidase_5 compreendem ale- los mutantes homozigotos.
6. Planta de milho modificada, ou parte de planta da mesma, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que um ou ambos os referidos loci GA20 oxidase_3 e GA20 oxidase_5 compreendem uma combinação heteroalélica ou dois alelos mutantes idênticos.
7. Planta de milho modificada, ou parte de planta da mesma, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que o referido alelo mutante exibe pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de redução da expressão ou atividade enzimática em relação a um alelo do gene GA20 oxidase_3 ou GA20 oxidase_5 tipo selvagem não modificado.
8. Planta de milho modificada, ou parte de planta da mesma, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de que o referido alelo mutante no locus GA20 oxidase_3 com- preende uma mutação em uma região de sequência selecionada do grupo que consiste em um promotor, 5' UTR, primeiro éxon, primeiro íntron, segundo éxon, segundo íntron, terceiro éxon, 3' UTR, terminador e qualquer combinação dos mesmos.
9. Planta de milho modificada, ou parte de planta da mesma, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizada pelo fato de que o referido alelo mutante no locus GA20 oxidase_3 com- preende um ou mais tipos de mutação selecionados do grupo que con- siste em uma mutação nonsense, uma mutação missense, uma muta- ção frameshift, uma mutação de sítio de splice e qualquer combinação das mesmas.
10. Planta de milho modificada, ou parte de planta da mes- ma, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracteri- zada pelo fato de que o referido alelo mutante no GA20 oxidase_3 re- sulta em um ou mais dos seguintes: um truncamento de proteína GA20 oxidase_3, um transcrito de gene GA20 oxidase_3 não traduzível, uma proteína GA20 oxidase_3 não funcional, um códon de parada prematura no gene GA20 oxidase_3 e qualquer combinação dos mesmos.
11. Planta de milho modificada, ou parte de planta da mesma, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, carac- terizada pelo fato de que cada alelo mutante no locus GA20 oxidase_3 compreende uma mutação selecionada do grupo que consiste em uma substituição, uma deleção, uma inserção, uma duplicação e uma inver- são de um ou mais nucleotídeos em relação a um gene GA20 oxidase_3 tipo selvagem .
12. Planta de milho modificada, ou parte de planta da mes- ma, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracteri- zada pelo fato de que o referido alelo mutante no locus GA20 oxidase_3 compreende uma ou mais mutações no primeiro éxon do gene GA20 oxidase_3.
13. Planta de milho modificada, ou parte de planta da mesma, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, carac- terizada pelo fato de que o referido alelo mutante no locus GA20 oxi- dase_3 compreende uma ou mais mutações no segundo éxon do GA20 oxidase_3.
14. Planta de milho modificada, ou parte de planta da mesma, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, carac- terizada pelo fato de que o referido alelo mutante no locus GA20 oxi- dase_5 compreende uma mutação em uma região de sequência seleci- onada do grupo que consiste em um promotor, 5' UTR, primeiro éxon, primeiro íntron, segundo éxon, segundo íntron, terceiro éxon, 3' UTR, terminador e qualquer combinação dos mesmos.
15. Planta de milho modificada, ou parte de planta da mesma, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, carac- terizada pelo fato de que o referido alelo mutante no locus GA20 oxi- dase_5 compreende um ou mais tipos de mutação selecionados do grupo que consiste em uma mutação nonsense, uma mutação mis- sense, uma mutação frameshift, uma mutação de sítio de splice e qual- quer combinação das mesmas.
16. Planta de milho modificada, ou parte de planta da mesma, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, carac- terizada pelo fato de que o referido alelo mutante no GA20 oxidase_5 resulta em um ou mais dos seguintes: um truncamento de proteína GA20 oxidase_5, um transcrito de gene GA20 oxidase_5 não traduzível,
uma proteína GA20 oxidase_5 não funcional, um códon de parada pre- matura no gene GA20 oxidase_5 e qualquer combinação dos mesmos.
17. Planta de milho modificada, ou parte de planta da mesma, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, carac- terizada pelo fato de que cada alelo mutante no locus GA20 oxidase_5 compreende uma mutação selecionada do grupo que consiste em uma substituição, uma deleção, uma inserção, uma duplicação e uma inver- são de um ou mais nucleotídeos em relação a um gene GA20 oxidase_5 tipo selvagem .
18. Planta de milho modificada, ou parte de planta da mesma, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, carac- terizada pelo fato de que o referido alelo mutante no locus GA20 oxi- dase_5 compreende uma ou mais mutações no primeiro éxon do gene GA20 oxidase_5.
19. Planta de milho modificada, ou parte de planta da mesma, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, carac- terizada pelo fato de que o referido alelo mutante no locus GA20 oxi- dase_5 compreende uma ou mais mutações no segundo éxon do GA20 oxidase_5.
20. Planta de milho modificada, ou parte de planta da mesma, caracterizada pelo fato de que compreende uma primeira mu- tação homozigótica em um dos genes GA20 oxidase_3 e GA20 oxi- dase_5 compreendendo ainda uma segunda mutação heterozigótica ou homozigótica no outro dos referidos genes GA20 oxidase_3 e GA20 oxi- dase_5.
21. Planta de milho modificada, ou parte de planta da mesma, de acordo com a reivindicação 20, caracterizada pelo fato de que a referida primeira mutação homozigótica está no gene GA20 oxi- dase_3.
22. Planta de milho modificada, ou parte de planta da mesma, de acordo com a reivindicação 21, caracterizada pelo fato de que a referida segunda mutação é heterozigótica no gene GA20 oxi- dase_5.
23. Planta de milho modificada, ou parte de planta da mesma, de acordo com a reivindicação 20, caracterizada pelo fato de que a referida primeira mutação homozigótica está no gene GA20 oxi- dase_5.
24. Planta de milho modificada, ou parte de planta da mesma, de acordo com a reivindicação 23, caracterizada pelo fato de que a referida segunda mutação é heterozigótica no gene GA20 oxi- dase_3.
25. Planta de milho modificada, ou parte de planta da mesma, de acordo com a reivindicação 20, caracterizada pelo fato de que a referida primeira mutação homozigótica compreende uma combi- nação heteroalélica de mutações ou dois alelos mutantes idênticos em um dos genes GA20 oxidase_3 e GA20 oxidase_5.
26. Planta de milho modificada, ou parte de planta da mesma, de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 25, ca- racterizada pelo fato de que a referida primeira mutação homozigótica resulta na planta de milho modificada tendo pelo menos 30%, pelo me- nos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de redução da expressão ou atividade enzimática do GA20 oxidase_3 em relação a um alelo do gene GA20 oxidase_3 tipo selvagem não modificado.
27. Planta de milho modificada, ou parte de planta da mesma, de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 25, ca- racterizada pelo fato de que a referida primeira mutação homozigótica ou a segunda mutação heterozigótica ou homozigótica resulta na planta de milho modificada tendo pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo me- nos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de redução da expressão ou atividade enzimática do GA20 oxidase_5 em relação a um alelo do gene GA20 oxidase_5 tipo selvagem não modificado.
28. Planta de milho modificada, ou parte de planta da mesma, de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 27, ca- racterizada pelo fato de que o referido alelo mutante no locus GA20 oxi- dase_3 compreende uma mutação em uma região de sequência seleci- onada do grupo que consiste em um promotor, 5' UTR, primeiro éxon, primeiro íntron, segundo éxon, segundo íntron, terceiro éxon, 3' UTR, terminador e qualquer combinação dos mesmos.
29. Planta de milho modificada, ou parte de planta da mesma, de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 28, ca- racterizada pelo fato de que o referido alelo mutante no locus GA20 oxi- dase_3 compreende um ou mais tipos de mutação selecionados do grupo que consiste em uma mutação nonsense, uma mutação mis- sense, uma mutação frameshift, uma mutação de sítio de splice e qual- quer combinação das mesmas.
30. Planta de milho modificada, ou parte de planta da mesma, de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 29, ca- racterizada pelo fato de que o referido alelo mutante no GA20 oxidase_3 resulta em um ou mais dos seguintes: um truncamento de proteína GA20 oxidase_3, um transcrito de gene GA20 oxidase_3 não traduzível, uma proteína GA20 oxidase_3 não funcional, um códon de parada pre- matura no gene GA20 oxidase_3 e qualquer combinação dos mesmos.
31. Planta de milho modificada, ou parte de planta da mesma, de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 30, ca- racterizada pelo fato de que cada alelo mutante no locus GA20 oxi- dase_3 compreende uma mutação selecionada do grupo que consiste em uma substituição, uma deleção, uma inserção, uma duplicação e uma inversão de um ou mais nucleotídeos em relação a um gene GA20 oxidase_3 tipo selvagem .
32. Planta de milho modificada, ou parte de planta da mesma, de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 31, ca- racterizada pelo fato de que o referido alelo mutante no locus GA20 oxi- dase_3 compreende uma ou mais mutações no primeiro éxon do gene GA20 oxidase_3.
33. Planta de milho modificada, ou parte de planta da mesma, de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 32, ca- racterizada pelo fato de que o referido alelo mutante no locus GA20 oxi- dase_3 compreende uma ou mais mutações no segundo éxon do GA20 oxidase_3.
34. Planta de milho modificada, ou parte de planta da mesma, de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 33, ca- racterizada pelo fato de que o referido alelo mutante no locus GA20 oxi- dase_5 compreende uma mutação em uma região de sequência seleci- onada do grupo que consiste em um promotor, 5' UTR, primeiro éxon, primeiro íntron, segundo éxon, segundo íntron, terceiro éxon, 3' UTR, terminador e qualquer combinação dos mesmos.
35. Planta de milho modificada, ou parte de planta da mesma, de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 34, ca- racterizada pelo fato de que o referido alelo mutante no locus GA20 oxi- dase_5 compreende um ou mais tipos de mutação selecionados do grupo que consiste em uma mutação nonsense, uma mutação mis- sense, uma mutação frameshift, uma mutação de sítio de splice e qual- quer combinação das mesmas.
36. Planta de milho modificada, ou parte de planta da mesma, de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 35, ca- racterizada pelo fato de que o referido alelo mutante no GA20 oxidase_5 resulta em um ou mais dos seguintes: um truncamento de proteína GA20 oxidase_5, um transcrito de gene GA20 oxidase_5 não traduzível,
uma proteína GA20 oxidase_5 não funcional, um códon de parada pre- matura no gene GA20 oxidase_5 e qualquer combinação dos mesmos.
37. Planta de milho modificada, ou parte de planta da mesma, de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 36, ca- racterizada pelo fato de que cada alelo mutante no locus GA20 oxi- dase_5 compreende uma mutação selecionada do grupo que consiste em uma substituição, uma deleção, uma inserção, uma duplicação e uma inversão de um ou mais nucleotídeos em relação a um gene GA20 oxidase_5 tipo selvagem .
38. Planta de milho modificada, ou parte de planta da mesma, de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 37, ca- racterizada pelo fato de que o referido alelo mutante no locus GA20 oxi- dase_5 compreende uma ou mais mutações no primeiro éxon do gene GA20 oxidase_5.
39. Planta de milho modificada, ou parte de planta da mesma, de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 38, ca- racterizada pelo fato de que o referido alelo mutante no locus GA20 oxi- dase_5 compreende uma ou mais mutações no segundo éxon do GA20 oxidase_5.
40. Planta de milho modificada, ou parte de planta da mesma, de acordo com a reivindicação 20, caracterizada pelo fato de que a referida primeira mutação homozigótica compreende um ou mais alelos, tal como um par de dois alelos idênticos ou uma combinação heteroalélica, selecionados do grupo que consiste em: a. uma deleção de 13 bases começando em 536; b. uma deleção da base 542; c. uma inserção de CC na base 542; d. uma deleção da base 541; e. uma deleção de 3 nt começando na base 540; f. uma deleção de 2 bases começando na base 422;
g. uma inserção de um A na base 422; h. uma inserção de um T na base 422; i. uma deleção da base 564; j. uma inserção de um A na base 654; k. uma inserção de um C na base 565; e l. uma inserção de um C na base 63; em que a referida numeração de base é baseada em SEQ ID No. 168 e contada a partir do primeiro nucleotídeo de SEQ ID NO: 168 na direção 5' a 3'.
41. Planta de milho modificada, ou parte de planta da mesma, de acordo com a reivindicação 20, caracterizada pelo fato de que a referida primeira mutação homozigótica é identificada por uma ou mais de SEQ ID Nos: 170 a 193 e 206 a 217 em relação à sequência de referência correspondente em SEQ ID No: 168.
42. Planta de milho modificada, ou parte de planta da mesma, de acordo com a reivindicação 20, caracterizada pelo fato de que a referida primeira mutação homozigótica compreende um ou mais alelos, tal como um par de dois alelos idênticos ou uma combinação heteroalélica, selecionados do grupo que consiste em: a. uma deleção da base 644; b. uma deleção de 2 bases começando na base 644; c. uma inserção de um T na base 644; d. uma deleção da base 372; e. uma deleção da base 786; f. uma deleção de 5 bases começando na base 786; g. uma deleção de 2 bases começando na base 101; h. uma inserção de um T na base base 102; i. uma deleção de 3 bases começando na base 99; j. uma inserção de um A na base 282; e k. uma inserção de um C na base 282;
em que a referida numeração de base é baseada em SEQ ID No. 169 e contada a partir do primeiro nucleotídeo de SEQ ID NO: 169 na direção 5' a 3'.
43. Planta de milho modificada, ou parte de planta da mesma, de acordo com a reivindicação 20, caracterizada pelo fato de que a referida primeira mutação homozigótica é identificada por uma ou mais de SEQ ID Nos: 218 a 239 e 251 a 261 em relação à sequência de referência correspondente em SEQ ID No: 169.
44. Planta de milho modificada, ou parte de planta da mesma, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 to 43, carac- terizada pelo fato de que a referida planta de milho modificada tem uma altura de planta mais curta e/ou resistência de alojamento melhorada em relação a uma planta de controle não modificada.
45. Planta de milho modificada, ou parte de planta da mesma, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 43, carac- terizada pelo fato de que a referida planta de milho modificada é pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35% ou pelo menos 40% mais curta que uma planta de controle não modificada.
46. Planta de milho modificada, ou parte de planta da mesma, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 43, carac- terizada pelo fato de que o diâmetro do talo ou caule da referida planta de milho modificada em um ou mais internodos de caule é pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35% ou pelo menos 40% maior que o diâmetro do talo ou caule nos mesmos um ou mais internodos de uma planta de controle não modificada.
47. Planta de milho modificada, ou parte de planta da mesma, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 43, carac- terizada pelo fato de que o diâmetro do talo ou caule da referida planta de milho modificada em um ou mais do primeiro, segundo, terceiro e/ou quarto internodos abaixo da espiga é pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35% ou pelo menos 40% maior que o mesmo interno de uma planta de controle não modificada.
48. Planta de milho modificada, ou parte de planta da mesma, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 43, carac- terizada pelo fato de que o nível de um ou mais GAs ativos em pelo menos um tecido interno do talo ou caule da referida planta de milho modificada é pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35% ou pelo menos 40% mais baixo que o mesmo tecido interno de uma planta de controle não modificada.
49. Planta de milho modificada, ou parte de planta da mesma, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 43, carac- terizada pelo fato de que o nível de um ou mais GAs ativos em pelo menos um tecido interno do talo ou caule da referida planta de milho modificada é mais baixo que o mesmo tecido interno de uma planta de controle não modificada.<
50. Planta de milho modificada, ou parte de planta da mesma, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 43, carac- terizada pelo fato de que a referida planta de milho modificada não temi nenhum fora de tipo significativo em pelo menos um órgão ou espiga fêmea.
51. Planta de milho modificada, ou parte de planta da mesma, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 43, carac- terizada pelo fato de que a referida planta de milho modificada não exibe essencialmente nenhuma anormalidade reprodutiva.
52. Planta de milho modificada, ou parte de planta da mesma, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 43, carac- terizada pelo fato de que a referida planta de milho modificada compre- ende um ou mais traços em relação a uma planta de controle não mo- dificada selecionada do grupo que consiste em altura de planta mais curta, elevado diâmetro de talo/caule, resistência ao alojamento melho- rada, estalo verde reduzido, raízes mais profundas, elevada área foliar, fechamento de copa mais precoce, condutância estomática mais alta, altura de espiga mais baixa, elevado teor de água foliar, tolerância à seca melhorada, eficiência de uso de nitrogênio melhorada, teor de an- tocianina reduzido e área nas folhas sob condições de tensão normais ou limitantes de nitrogênio ou limitantes de água, elevado peso de es- piga, elevado índice de colheita, elevada produtividade, elevado número de sementes, elevado peso de semente e elevada prolificidade.
53. Método para fazer uma planta de milho modificada, ou parte de planta da mesma, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) cruzar uma primeira planta de milho compreendendo um alelo mutante do locus GA20 oxidase_3 com uma segunda planta com- preendendo um alelo mutante do locus GA20 oxidase_5; e (b) selecionar uma planta de milho de progênie, ou parte de planta da mesma, do cruzamento na etapa (a) que é (i) homozigoto para um ou mais alelos mutantes do locus GA20 oxidase_3 e heterozigoto para um alelo mutante do locus GA20 oxidase_5, ou (ii) heterozigoto para um alelo mutante do locus GA20 oxi- dase_3 e homozigoto para um ou mais alelos mutantes do locus GA20 oxidase_5.
54. Método, de acordo com a reivindicação 53, caracterizado pelo fato de que a primeira planta de milho é homozigótica para um ou mais alelos mutantes do locus GA20 oxidase_3 e a segunda planta de milho é heterozigótica para um alelo mutante do locus GA20 oxidase_5.
55. Método, de acordo com a reivindicação 53, caracterizado pelo fato de que a primeira planta de milho é heterozigótica para um alelo mutante do locus GA20 oxidase_3 e a segunda planta de milho é homozigótica para um ou mais alelos mutantes do locus GA20 oxi- dase_5.
56. Método, de acordo com a reivindicação 53, caracterizado pelo fato de que a primeira planta de milho é homozigótica para um ou mais alelos mutantes do locus GA20 oxidase_3 e a segunda planta de milho é homozigótica para um ou mais alelos mutantes do locus GA20 oxidase_5.
57. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 53 a 56, caracterizado pelo fato de que a primeira planta de milho é heterozigótica para um alelo mutante do locus GA20 oxidase_5.
58. Método, de acordo com a reivindicação 57, caracterizado pelo fato de que a segunda planta de milho é homozigótica para um alelo do tipo selvagem do locus GA20 oxidase_3.
59. Método, de acordo com a reivindicação 57, caracterizado pelo fato de que a segunda planta de milho é heterozigótica para um alelo mutante do locus GA20 oxidase_3.
60. Método, de acordo com a reivindicação 57, caracterizado pelo fato de que a segunda planta de milho é homozigótica para um ou mais alelos mutantes do locus GA20 oxidase_3.
61. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 53 a 56, caracterizado pelo fato de que a primeira planta de milho é homozigótica para um ou mais alelos mutantes do locus GA20 oxi- dase_5.
62. Método, de acordo com a reivindicação 61, caracterizado pelo fato de que a segunda planta de milho é homozigótica para um alelo do tipo selvagem do locus GA20 oxidase_3.
63. Método, de acordo com a reivindicação 61, caracterizado pelo fato de que a segunda planta de milho é heterozigótica para um alelo mutante do locus GA20 oxidase_3.
64. Método, de acordo com a reivindicação 61, caracterizado pelo fato de que a segunda planta de milho é homozigótica para um ou mais alelos mutantes do locus GA20 oxidase_3.
65. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 53 a 56, caracterizado pelo fato de que a primeira planta de milho é homozigótica para um alelo tipo selvagem do locus GA20 oxidase_5.
66. Método, de acordo com a reivindicação 64, caracterizado pelo fato de que a segunda planta de milho é homozigótica para um alelo tipo selvagem do locus GA20 oxidase_3.
67. Método, de acordo com a reivindicação 64, caracterizado pelo fato de que a segunda planta de milho é homozigótica para um ou mais alelos mutantes do locus GA20 oxidase_3.
68. Método, de acordo com a reivindicação 64, caracterizado pelo fato de que a segunda planta de milho é heterozigótica para um alelo mutante do locus GA20 oxidase_3.
69. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 53 a 68, caracterizado pelo fato de que a planta de milho de progênie é uma planta de milho de progênie F1.
70. Método para fazer uma planta de milho modificada, ou parte de planta da mesma, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) cruzar uma primeira planta de milho compreendendo um alelo mutante do locus GA20 oxidase_3 e um alelo mutante do locus GA20 oxidase_5 com uma segunda planta; e (b) selecionar uma planta de milho de progênie, ou parte de planta da mesma, do cruzamento na etapa (a) que é (i) homozigoto para um ou mais alelos mutantes do locus GA20 oxidase_3 e heterozigoto para um alelo mutante do locus GA20 oxidase_5, ou
(ii) heterozigoto para um alelo mutante do locus GA20 oxi- dase_3 e homozigoto para um ou mais alelos mutantes do locus GA20 oxidase_5.
71. Método, de acordo com a reivindicação 70, caracterizado pelo fato de que a primeira planta de milho é heterozigótica para um alelo mutante do locus GA20 oxidase_3 e é heterozigótica para um alelo mutante do locus GA20 oxidase_5.
72. Método, de acordo com a reivindicação 70, caracterizado pelo fato de que a primeira planta de milho é homozigótica para um ou mais alelos mutantes do locus GA20 oxidase_3 e é heterozigótica para um alelo mutante do locus GA20 oxidase_5.
73. Método, de acordo com a reivindicação 70, caracterizado pelo fato de que a primeira planta de milho é homozigótica para um ou mais alelos mutantes do locus GA20 oxidase_3 e é homozigótica para um ou mais alelos mutantes do locus GA20 oxidase_5.
74. Método, de acordo com a reivindicação 70, caracterizado pelo fato de que a primeira planta de milho é homozigótica para um ou mais alelos mutantes do locus GA20 oxidase_3 e a segunda planta de milho é heterozigótica para um alelo mutante do locus GA20 oxidase_5.
75. Método, de acordo com a reivindicação 70, caracterizado pelo fato de que a primeira planta de milho é heterozigótica para um alelo mutante do locus GA20 oxidase_3 e a segunda planta de milho é homozigótica para um ou mais alelos mutantes do locus GA20 oxi- dase_5.
76. Método, de acordo com a reivindicação 70, caracterizado pelo fato de que a primeira planta de milho é homozigótica para um ou mais alelos mutantes do locus GA20 oxidase_3 e a segunda planta de milho é homozigótica para um ou mais alelos mutantes do locus GA20 oxidase_5.
77. Método, de acordo com a reivindicação 70, caracterizado pelo fato de que a primeira planta de milho é homozigótica para um ou mais alelos mutantes do locus GA20 oxidase_3 e a segunda planta de milho é homozigótica para um ou mais alelos mutantes do locus GA20 oxidase_5.
78. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 74 a 77, caracterizado pelo fato de que a primeira planta de milho é heterozigótica para um alelo mutante do locus GA20 oxidase_5.
79. Método, de acordo com a reivindicação 78, caracterizado pelo fato de que a segunda planta de milho é homozigótica para um alelo do tipo selvagem do locus GA20 oxidase_3.
80. Método, de acordo com a reivindicação 78, caracterizado pelo fato de que a segunda planta de milho é heterozigótica para um alelo mutante do locus GA20 oxidase_3.
81. Método, de acordo com a reivindicação 78, caracterizado pelo fato de que a segunda planta de milho é homozigótica para um ou mais alelos mutantes do locus GA20 oxidase_3.
82. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 74 a 77, caracterizado pelo fato de que a primeira planta de milho é homozigótica para um ou mais alelos mutantes do locus GA20 oxi- dase_5.
83. Método, de acordo com a reivindicação 82, caracterizado pelo fato de que a segunda planta de milho é homozigótica para um alelo do tipo selvagem do locus GA20 oxidase_3.
84. Método, de acordo com a reivindicação 82, caracterizado pelo fato de que a segunda planta de milho é heterozigótica para um alelo mutante do locus GA20 oxidase_3.
85. Método, de acordo com a reivindicação 82, caracterizado pelo fato de que a segunda planta de milho é homozigótica para um ou mais alelos mutantes do locus GA20 oxidase_3.
86. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações
74 a 77, caracterizado pelo fato de que a segunda planta de milho é heterozigótica para um alelo mutante do locus GA20 oxidase_3.
87. Método, de acordo com a reivindicação 86, caracterizado pelo fato de que a primeira planta de milho é heterozigótica para um alelo mutante do locus GA20 oxidase_3.
88. Método, de acordo com a reivindicação 86, caracterizado pelo fato de que a primeira planta de milho é homozigótica para um ou mais alelos mutantes do locus GA20 oxidase_5.
89. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 74 a 77, caracterizado pelo fato de que a segunda planta de milho é homozigótica para um ou mais alelos mutantes do locus GA20 oxi- dase_3.
90. Método, de acordo com a reivindicação 89, caracterizado pelo fato de que a primeira planta de milho é heterozigótica para um alelo mutante do locus GA20 oxidase_5.
91. Método, de acordo com a reivindicação 89, caracterizado pelo fato de que a primeira planta de milho é homozigótica para um ou mais alelos mutantes do locus GA20 oxidase_5.
92. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 70 a 91, caracterizado pelo fato de que a planta de milho de progênie é uma planta de milho de progênie F1.
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