BR112020015693A2 - Métodos e composições para aumentar o rendimento colheitável através da edição de genes de ga20 oxidase para gerar plantas de estatura curta - Google Patents

Métodos e composições para aumentar o rendimento colheitável através da edição de genes de ga20 oxidase para gerar plantas de estatura curta Download PDF

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Linda A. Rymarquis
Thomas L. Slewinski
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Abstract

a presente descrição refere-se a composições e métodos para a edição ou mutação de subtipos específicos de genes de ga20 oxidase e combinações específicas de zigosidade dessas edições ou mutações. plantas modificadas, e partes de plantas e células das mesmas, tendo mutações reduzindo a expressão ou atividade de genes de ga20 oxidase, são ainda dotadas de características aprimoradas, tal como altura de planta reduzida e elevada resistência a alojamento, mas sem tipos de fora. são também fornecidos métodos para fazer plantas modificadas, e partes de plantas e células das mesmas, tendo uma ou mais mutações em subtipos específicos de genes de ga20 oxidase.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODOS E COMPOSIÇÕES PARA AUMENTAR O RENDIMENTO COLHEITÁVEL ATRAVÉS DA EDIÇÃO DE GENES DE GA20 OXIDASE PARA GERAR PLANTAS DE ESTATURA CURTA".
REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS
[001] Este pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório U.S. 62/631.412, depositado em 15 de fevereiro de 2018 e Pedido Provisório U.S. 62/710.302, depositado em 16 de fevereiro de 2018, ambos os quais são aqui incorporados por referência em suas totalidades.
INCORPORAÇÃO DA LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS
[002] O arquivo de listagem de sequências chamado "P34605WO_SEQ.txt" que é de 382 kilobytes (medido no MS- WINDOWS) e foi criado em 15 de fevereiro de 2018, é submetido a este documento e incorporado aqui por referência na sua totalidade.
FUNDAMENTOS
[003] A presente divulgação refere-se a composições e métodos para melhorar traços, como resistência ao alojamento e aumento do rendimento no milho.
[004] As giberelinas (ácidos giberélicos ou GAs) são hormônios vegetais que regulam vários dos principais processos de crescimento e desenvolvimento das plantas. A manipulação dos níveis de GA nas variedades de trigo semi-anão, arroz e sorgo levou ao aumento da produtividade e redução do alojamento nessas culturas de cereais durante o século 20o, o que foi em grande parte responsável pela revolução verde. No entanto, ganhos de rendimento bem-sucedidos em outras culturas de cereais, como o milho, não foram alcançados através da manipulação da via GA. De fato, algumas mutações nos genes da via GA têm sido associadas a vários tipos estranhos de milho que são incompatíveis com o rendimento, o que levou os pesquisadores a encontrar variedades de milho semi-anã e de alto rendimento através da manipulação da via GA.
[005] Continua a haver uma necessidade na técnica para o desenvolvimento de monocotiledôneas ou plantas de cereais, como o milho, com aumento do rendimento e/ou resistência ao alojamento.
SUMÁRIO
[006] Em um aspecto, a presente divulgação fornece uma planta de milho modificada com uma altura de planta reduzida em relação a uma planta de controle do tipo selvagem e (i) um diâmetro aumentado da haste ou caule em relação a uma planta de controle do tipo selvagem, (ii) resistência melhorada ao alojamento a uma planta de controle do tipo selvagem, ou (iii) melhor tolerância à seca em relação a uma planta de controle do tipo selvagem.
[007] Em outro aspecto, a presente divulgação fornece uma planta de milho modificada, ou parte de planta da mesma, compreendendo um gene de GA20 oxidase_3 mutante homozigoto e um gene de GA20 oxidase_5 mutante homozigoto.
[008] Em outro aspecto, a presente divulgação fornece uma planta de milho modificada, ou parte de planta da mesma, compreendendo alelos mutantes homozigotos em um locus de GA20 oxidase_3 endógeno e alelos mutantes homozigotos em um locus de GA20 oxidase_5 endógeno.
[009] Em um aspecto, a presente divulgação fornece um método para fazer uma planta de milho modificada, ou parte de planta da mesma, compreendendo: (a) cruzar uma primeira planta de milho compreendendo um alelo mutante do locus de GA20 oxidase_3 com uma segunda planta compreendendo um alelo mutante dolocus de GA20 oxidase_5; e (b) selecionar uma planta de progênie de milho, ou parte de planta da mesma, a partir do cruzamento na etapa (a) que é homozigota para um ou mais alelos mutantes do locus de GA20 oxidase_3 e homozigota para um ou mais alelos mutantes d locus de GA20 oxidase_5.
[0010] Em outro aspecto, a presente divulgação fornece um método para fazer uma planta de milho modificada, ou parte de planta da mesma, compreendendo: (a) cruzar uma primeira planta de milho compreendendo um alelo mutante do locus de GA20 oxidase_3 e um alelo mutante do locus de GA20 oxidase_5 com uma segunda planta; e (b) selecionar uma planta de progênie de milho, ou parte de planta da mesma, a partir do cruzamento na etapa (a) que é homozigota para um ou mais alelos mutantes do locus GA20 oxidase_3 e homozigoto para um ou mais alelos mutantes do locus de GA20 oxidase_5.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0011] A Figura 1 mostra alturas de plantas de plantas mutantes endogâmicas possuindo genes GA20 oxidase_3 e/ou GA20 oxidase_5 mutantes editados em comparação com plantas de controle endogâmicas tipo selvagem e plantas que expressam um construto de supressão de GA20 oxidase.
DESCRIÇÃO DETALHADA
[0012] Para facilitar o entendimento da divulgação, vários termos e abreviações, conforme aqui utilizados, são definidos a seguir:
[0013] O termo "e/ou", quando utilizado em uma lista de dois ou mais itens, significa que qualquer um dos itens listados pode ser empregado sozinho ou em combinação com qualquer um ou mais dos itens listados. Por exemplo, a expressão "A e/ou B" se destina a significar um ou ambos de A e B - isto é, A sozinho, B sozinho ou A e B em combinação. A expressão "A, B e/ou C " se destina a significar A sozinho, B sozinho, C sozinho, A e B em combinação, A e C em combinação, B e C em combinação ou A, B e C em combinação.
[0014] O termo "cerca de," Como utilizado neste documento, se destina a qualificar os valores numéricos que modifica, denotando que certo valor é variável dentro de uma margem do erro. Quando nenhuma margem de erro particular, como um desvio padrão para um valor médio, é recitada, o termo "cerca de" deve ser entendido como significando o intervalo que abrangeria o valor recitado e o intervalo que seria incluído arredondando para cima ou para baixo a esse valor, tendo em conta algarismos significativos.
[0015] Como utilizado neste documento, "locus" é uma região de cromossomo em que um ácido nucleico polimórfico, determinante de traço, gene ou marcador está situado. Um "locus" pode ser compartilhado por dois cromossomos homólogos para se referir ao locus ou região correspondente. Como utilizado neste documento, "alelo" refere-se a uma sequência alternativa de ácido nucleico de um gene ou em um locus particular (por exemplo, uma sequência de ácido nucleico de um gene ou locus diferente de outros alelos para o mesmo gene ou locus). Tal alelo pode ser considerado (i) tipo selvagem ou (ii) mutante se uma ou mais mutações ou edições estiverem presentes na sequência de ácido nucleico do alelo mutante em relação ao alelo tipo selvagem. Um alelo mutante para um gene pode ter uma atividade ou nível de expressão reduzido ou eliminado para o gene em relação ao alelo tipo selvagem. Para organismos diploides como o milho, um primeiro alelo pode ocorrer em um cromossomo e um segundo alelo pode ocorrer no mesmo locus em um segundo cromossomo homólogo. Se um alelo em um locus em um cromossomo de uma planta é um alelo mutante e o outro alelo correspondente no cromossomo homólogo da planta é tipo selvagem, a planta é descrita como heterozigótica para o alelo mutante. No entanto, se os dois alelos de um locus são alelos mutantes, a planta é descrita como homozigótica para os alelos mutantes. Uma planta homozigótica para alelos mutantes em um locus pode compreender o mesmo alelo mutante ou alelos mutantes diferentes, se heteroalélico ou bialélico.
[0016] Como utilizado neste documento, um "gene tipo selvagem" ou "alelo tipo selvagem" refere-se a um gene ou alelo com uma sequência ou genótipo que é mais comum em uma espécie de planta específica ou outra sequência ou genótipo com variações naturais, polimorfismos, ou outras mutações silenciosas relativas à sequência ou genótipo mais comum que não afetam significativamente a expressão e a atividade do gene ou alelo. De fato, um gene ou alelo do tipo "selvagem" não contém variação, polimorfismo ou qualquer outro tipo de mutação que afete substancialmente a função, atividade, expressão ou consequência fenotípica normal do gene ou alelo.
[0017] Os termos "porcentagem de identidade" ou "porcentagem idêntica", Como utilizados neste documento em referência a duas ou mais sequências nucleotídicas ou proteínas, são calculados (i) comparando duas sequências alinhadas de forma otimizada (nucleotídeo ou proteína) ao longo de uma janela de comparação, (ii) determinando o número de posições nas quais a base de ácido nucleico idêntica (para sequências de nucleotídeos) ou resíduo de aminoácido (para proteínas) ocorre em ambas as sequências para produzir o número de posições correspondentes, (iii) dividindo o número de posições correspondentes pelo número total de posições na janela de comparação, e então (iv) multiplicando este quociente por 100% para produzir a identidade porcentual. Para fins de cálculo da "porcentagem de identidade" entre as sequências de DNA e RNA, um uracil (U) de uma sequência de RNA é considerado idêntico a uma timina (T) de uma sequência de DNA. Se a janela de comparação for definida como uma região de alinhamento entre duas ou mais sequências (isto é, excluindo nucleotídeos nas extremidades 5' e 3' das sequências polinucleotídicas alinhadas ou aminoácidos no terminal N e no terminal C de sequências de proteínas alinhadas, que não são idênticas entre as sequências comparadas), então a "porcentagem de identidade" também pode ser referida como "porcentagem de identidade de alinhamento". Se a "porcentagem de identidade" está sendo calculada em relação a uma sequência de referência sem uma janela de comparação particular sendo especificada, então a porcentagem de identidade é determinada dividindo o número de posições combinadas sobre a região de alinhamento pelo comprimento total da sequência de referência. Por conseguinte, como utilizado neste documento, quando duas sequências (consulta e sujeito) estão idealmente alinhadas (com tolerância para folgas no seu alinhamento), a "porcentagem de identidade" para a sequência de consulta é igual ao número de posições idênticas entre as duas sequências divididas pelo número total de posições na sequência de consulta sobre seu comprimento (ou uma janela de comparação), que é então multiplicada por 100%.
[0018] Quando o porcentual de identidade de sequência é usado em referência a proteínas ou peptídeos, reconhece-se que as posições do resíduo que não são idênticas frequentemente diferem por substituições conservativas de aminoácidos, onde os resíduos de aminoácidos são substituídos por outros resíduos de aminoácidos com propriedades químicas similares (por exemplo, carga, hidrofobicidade, polaridade, etc.) e, portanto, não pode alterar as propriedades funcionais da molécula. Onde as sequências diferem em substituições conservativas, o porcentual de identidade de sequência pode ser ajustado de forma ascendente para corrigir a natureza conservativa da substituição. As sequências que diferem por tais substituições conservadoras são ditas para terem "similaridade da sequência" ou "similaridade". Assim, "porcentagem de similaridade" ou "porcentagem similar", Como utilizado neste documento em referência a duas ou mais sequências de proteínas, é calculada (i) comparando duas sequências de proteínas alinhadas de forma otimizada ao longo de uma janela de comparação, (ii) determinando o número de posições nas quais o mesmo resíduo de aminoácido ou semelhante ocorre em ambas as sequências para produzir o número de posições combinadas, (iii) dividindo o número de posições combinadas pelo número total de posições na janela de comparação (ou o comprimento total da proteína de referência ou consulta se uma janela de comparação não for especificada), e então (iv) multiplicando esse quociente por 100% para obter a similaridade porcentual. As substituições conservadoras de aminoácidos por proteínas são conhecidas na técnica.
[0019] Para o alinhamento ideal de sequências para calcular sua porcentagem de identidade ou similaridade, vários algoritmos e programas de alinhamento de sequência múltipla ou em pares são conhecidos na técnica, como ClustalW ou Basic Local Alignment Search Tool® (BLAST®), etc., que pode ser utilizado para comparar a identidade de sequência ou similaridade entre duas ou mais sequências de nucleotídeos ou proteínas. Embora outros métodos de alinhamento e comparação sejam conhecidos na técnica, o alinhamento entre duas sequências (incluindo os intervalos percentuais de identidade descritos acima) pode ser conforme determinado pelo algoritmo ClustalW ou BLAST®, ver, por exemplo, Chenna R. et al., "Multiple sequence alignment with the Clustal series of programs," Nucleic Acids Research 31: 3497-3500 (2003); Thompson JD et al., "Clustal W: Improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice," Nucleic Acids Research 22: 4673-4680 (1994); e Larkin MA et al., "Clustal W and Clustal X version 2.0," Bioinformatics 23: 2947-48 (2007); e Altschul, S.F., Gish, W., Miller, W., Myers, E.W. & Lipman, D.J. (1990) "Basic local alignment search tool." J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990), todos os conteúdos e divulgações dos quais são incorporados neste documento por referência.
[0020] Os termos "porcentagem de complementaridade" ou
"porcentagem complementar", Como utilizado neste documento em referência a duas sequências de nucleotídeos, são semelhantes ao conceito de porcentagem de identidade, mas referem-se à porcentagem de nucleotídeos de uma sequência de consulta que otimiza o par de bases ou hibrida com nucleotídeos de uma sequência de sujeito quando as sequências de consulta e sujeito são organizadas linearmente e emparelhadas de maneira ideal sem estruturas de dobra secundárias, como alças, hastes ou hairpins.
Essa complementaridade porcentual pode estar entre duas fitas de DNA, duas fitas de RNA ou uma fita de DNA e uma fita de RNA.
A "porcentagem de complementaridade" é calculada por (i) emparelhamento de bases ideal ou hibridização das duas sequências de nucleotídeos em um arranjo linear e totalmente estendido (ou seja, sem dobras ou estruturas secundárias) ao longo de uma janela de comparação, (ii) determinar o número de posiciona esse par de bases entre as duas sequências ao longo da janela de comparação para produzir o número de posições complementares, (iii) dividindo o número de posições complementares pelo número total de posições na janela de comparação e (iv) multiplicando este quociente em 100% para produzir a complementaridade porcentual das duas sequências.
O emparelhamento ideal de bases de duas sequências pode ser determinado com base nos pares conhecidos de bases nucleotídicas, como G-C, A-T, e A-U, através de ligações de hidrogênio.
Se a "porcentagem de identidade" está sendo calculada em relação a uma sequência de referência, sem uma janela de comparação particular a ser especificada, então a porcentagem de identidade é determinada através da divisão do número de posições correspondentes ao longo da região de alinhamento pelo comprimento total da sequência de referência.
Assim, para os fins da presente divulgação, quando duas sequências (consulta e sujeito) são emparelhadas de forma otimizada (com tolerância para incompatibilidades ou nucleotídeos não emparelhados de base, mas sem dobras ou estruturas secundárias), a "porcentagem de complementaridade" para a sequência de consulta é igual ao número de posições emparelhadas de base entre as duas sequências dividido pelo número total de posições na sequência de consulta em seu comprimento (ou pelo número de posições na sequência de consulta em uma janela de comparação), que é então multiplicado em 100%.
[0021] Como utilizado neste documento, "modificado" no contexto de uma planta, semente de planta, parte de planta, célula de planta, e/ou genoma de planta, refere-se a uma planta, semente de planta, parte de planta, célula de planta e/ou genoma de planta compreendendo uma mudança engenheirada no nível de expressão e/ou sequência de codificação de um ou mais gene(s) de GA oxidase em relação a uma planta tipo selvagem ou controle, semente de planta, parte de planta, célula de planta e/ou genoma de planta, tal como através de um evento de edição do genoma ou mutação que afeta (por exemplo, reduzindo ou eliminando) o nível de expressão ou atividade de um ou mais genes endógenos de GA3 e/ou GA20 oxidase. De fato, o termo "modificado" pode se referir ainda a uma planta, semente de planta, parte de planta, célula de planta e/u genoma de planta com uma ou mais mutações que afetam a expressão de um ou mais genes endógenos de GA oxidase, como um ou mais genes endógenos de GA3 e/ou GA20 oxidase, introduzidos através de mutagênese química, inserção ou excisão de transposon, ou qualquer outra técnica conhecida de mutagênese, ou introduzidos através da edição de genoma. Para maior clareza, portanto, uma planta modificada, semente de planta, parte de planta, célula de planta e/ou genoma de planta inclui uma planta mutada e/ou editada, semente de planta, parte de planta, célula de planta e/ou genoma de planta com um nível de expressão modificado, padrão de expressão e/ou sequência de codificação de um ou mais gene(s) de GA oxidase em relação a uma planta tipo selvagem ou controle, semente de planta, parte de planta, célula de planta e/ou genoma de planta.
As plantas modificadas podem ser homozigotas ou heterozigotas para qualquer mutação ou edição, e/ou podem ser bialélicas em um sítio genético da GA oxidase.
Uma planta modificada é bialélica para um gene da GA oxidase se cada cópia do gene da GA oxidase for modificada por um alelo diferente (isto é, mutação(ões) diferente(s) e/ou edição(ões)), em que cada alelo reduz o nível de expressão e/ou atividade do gene da GA oxidase.
Plantas ou sementes modificadas podem conter várias alterações moleculares que afetam a expressão do(s) gene(s) da GA oxidase, tais como gene(s) de oxidase GA3 e/ou GA20, incluindo modificações genéticas e/ou epigenéticas.
Plantas modificadas, partes de plantas, sementes, etc., podem ter sido submetidas à mutagênese, edição de genoma ou integração dirigida ao sítio (por exemplo, sem ser limitativo, por meio de métodos usando nucleases específicas do sítio), transformação genética (por exemplo, sem ser limitativo, via métodos de transformação de Agrobacterium ou bombardeio de microprojétil), ou uma combinação dos mesmos.
Essas plantas "modificadas", sementes de plantas, partes de plantas e células de plantas incluem plantas, sementes de plantas, partes de plantas e células de plantas que são descendentes ou derivadas de plantas "modificadas", sementes de plantas, partes de plantas e células de plantas que retêm a mudança molecular (por exemplo, mudança no nível de expressão e/ou atividade) aos um ou mais genes da GA oxidase.
Uma semente modificada aqui fornecida pode dar origem a uma planta modificada aqui fornecida.
Uma planta modificada, semente de planta, parte de planta, célula de planta ou genoma de planta aqui fornecido pode compreender um construto de DNA recombinante ou edição de vetor ou genoma conforme aqui fornecido.
Um "produto vegetal modificado" pode ser qualquer produto fabricado a partir de uma planta modificada, parte de planta, célula de planta ou cromossomo vegetal aqui fornecido, ou qualquer parte ou componente do mesmo.
[0022] Como utilizado neste documento, o termo "homozigoto" refere-se a um genótipo compreendendo dois alelos idênticos em um determinado locus em um genoma diploide ou um genótipo compreendendo dois alelos mutantes não idênticos em um determinado locus em um genoma diploide. O último genótipo compreendendo dois alelos mutantes não idênticos também é referido como sendo heteroalélico ou transheterozigoto, ou como uma combinação heterolélica. Como utilizado neste documento, "heterozigoto" descreve um genótipo compreendendo um alelo mutante e um alelo tipo selvagem em um determinado locus em um genoma diploide.
[0023] Como utilizado neste documento, o termo "planta de controle" (ou da mesma forma uma semente de planta "de controle", parte de planta, célula de planta e/ou genoma de planta) refere-se a uma planta (ou semente de planta, parte de planta, célula de planta e/ou genoma de planta) usado para comparação com uma planta modificada (ou semente de planta modificada, parte de planta, célula de planta e/ou genoma de planta) e tem o mesmo fundo genético ou semelhante (por exemplo, mesmas linhagens parentais, cruzamento híbrido, linhagem endogâmica, testadores, etc.) que a planta modificada (ou semente de planta, parte de planta, célula de planta e/ou genoma de planta), exceto para um evento(s) de edição de genoma que afeta um ou mais genes GA oxidase. Por exemplo, uma planta de controle pode ser uma linhagem endogâmica que é a mesma que a linhagem endogâmica usada para fazer a planta modificada, ou uma planta de controle pode ser o produto do mesmo cruzamento híbrido de linhagens parentais endogâmicas que a planta modificada, exceto para a ausência na planta de controle de qualquer evento de edição do genoma que afeta um ou mais genes GA oxidase. Da mesma forma, uma planta de controle não modificada refere-se a uma planta que compartilha um fundo genético substancialmente semelhante ou essencialmente idêntico ao de uma planta modificada, mas sem uma ou mais alterações de engenharia no genoma (por exemplo, transgene, mutação ou edição) da planta modificada. Para fins de comparação com uma planta modificada, semente de planta, parte de planta, célula de planta e/ou genoma de planta, uma "planta tipo selvagem" (ou da mesma forma uma semente de planta "tipo selvagem", parte de planta, célula de planta e/ou genoma de planta) refere-se a uma planta de controle editada, não transgênica e não genômica, semente de planta, parte de planta, célula de planta e/ou genoma de planta. Como utilizado neste documento, uma planta de "controle", semente de planta, parte da planta, célula de planta e/ou genoma de planta também pode ser uma planta, semente de planta, parte de planta, célula de planta e/ou genoma de planta com um fundo genético semelhante (mas não o mesmo ou idêntico) a uma planta modificada, semente de planta, parte de planta, célula de planta e/ou genoma de planta, se considerado suficientemente semelhante para comparação das características ou traços a serem analisados.
[0024] Como utilizado neste documento, um "sítio alvo" para edição de genoma refere-se à localização de uma sequência polinucleotídica dentro de um genoma de planta que é ligado e clivado por uma nuclease específica de sítio que introduz uma quebra de fita dupla (ou corte de fita simples) na espinha dorsal de ácido nucleico da sequência polinucleotídica e/ou na sua fita de DNA complementar. Um sítio alvo pode compreender pelo menos 10, pelo menos 11, pelo menos 12, pelo menos 13, pelo menos 14, pelo menos 15, pelo menos 16, pelo menos 17, pelo menos 18, pelo menos 19, pelo menos 20, pelo menos 21, pelo menos 22, pelo menos 23, pelo menos 24, pelo menos 25, pelo menos 26, pelo menos 27, pelo menos 29 ou pelo menos 30 nucleotídeos consecutivos. Um "sítio alvo" para uma nuclease guiada por RNA pode compreender a sequência de uma fita complementar de uma molécula de ácido nucleico (DNA) de cadeia dupla ou de um cromossomo no sítio alvo.
Uma nuclease específica de um sítio pode se ligar a um sítio alvo, como por meio de um RNA guia não codificante (por exemplo, sem limitação, um RNA CRISPR (crRNA) ou um RNA guia único (sgRNA), como descrito mais abaixo). Um RNA guia não codificante aqui fornecido pode ser complementar a um sítio alvo (por exemplo, complementar à fita de uma molécula de ácido nucleico de fita dupla ou cromossomo no sítio alvo). Será apreciado que uma identidade ou complementaridade perfeita pode não ser necessária para que um RNA guia não codificante se ligue ou hibride com um sítio alvo.
Por exemplo, pelo menos 1, pelo menos 2, pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 6, pelo menos 7 ou pelo menos 8 incompatibilidades (ou mais) entre um sítio e um RNA não codificante pode ser tolerado.
Um "sítio alvo" também se refere à localização de uma sequência polinucleotídica dentro de um genoma de planta que é ligada e clivada por outra nuclease específica de sítio que pode não ser guiada por uma molécula de RNA não codificante, como uma meganuclease, nuclease de dedo de zinco (ZFN), ou uma nuclease efetora do tipo ativador de transcrição (TALEN), para introduzir uma quebra de fita dupla (ou corte de fita simples) na sequência polinucleotídica e/ou sua fita de DNA complementar.
Como utilizado neste documento, uma "região alvo" ou uma "região direcionada" refere-se a uma sequência ou região polinucleotídica que é flanqueada por dois ou mais sítios alvo.
Sem ser limitativo, em algumas modalidades uma região alvo pode ser submetida a uma mutação, deleção, inserção ou inversão.
Como utilizado neste documento, "flanqueado" quando usado para descrever uma região alvo de uma sequência ou molécula polinucleotídica, refere- se a dois ou mais sitios alvo da sequência ou molécula polinucleotídica em torno da região alvo, com um sítio alvo em cada lado da região alvo.
Além da edição do genoma, o termo "sítio alvo" também pode ser usado no contexto da supressão de genes para se referir a uma porção de uma molécula de mRNA (por exemplo, um "sítio de reconhecimento") que é complementar a pelo menos uma porção de uma molécula de RNA não codificante (por exemplo, um miRNA, siRNA, etc.) codificada por um construto de supressão.
[0025] O Pedido PCT copendente Nº PCT/US2017/047405 e o Pedido U.S. 15/679,699, ambos depositados em 17 de agosto de 2017, são incorporados aqui por referência na sua totalidade.
[0026] A maioria das gramíneas produtoras de grãos, como trigo, arroz e sorgo, produzem estruturas macho e fêmeas dentro de cada flor da panícula (isto é, têm uma única estrutura reprodutiva). No entanto, o milho ou maíz são únicos entre as gramíneas produtoras de grãos, pois formam inflorescências separadas macho (borla) e fêmeas (espigas). O milho produz estruturas reprodutivas completamente sexualmente dimórficas pelo aborto seletivo de órgãos de machos (anteras) nas flores da espiga e órgãos de fêmeas (óvulos) nas flores da borla nos estágios iniciais de desenvolvimento. A síntese e sinalização de giberelina reguladas com precisão são críticas para a regulação desse processo seletivo de aborto, com o ouvido reprodutivo da fêmea sendo mais sensível a rupturas na via GA. De fato, o fenótipo "antera da espiga" é o fenótipo reprodutivo mais comum em mutantes do milho GA.
[0027] Ao contrário do milho, as mutações na síntese de giberelinas ou nas vias de sinalização que levaram à "Revolução Verde" no trigo, arroz e sorgo tiveram pouco impacto em suas estruturas reprodutivas, porque essas espécies de culturas não sofrem o processo de aborto seletivo da panícula com grãos durante o desenvolvimento e, portanto, não são sensíveis a interrupções nos níveis de GA. As mesmas mutações não foram utilizadas no milho porque a interrupção da síntese de GA e da via de sinalização levou repetidamente a uma distorção dramática e masculinização da espiga ("antera da espiga") e à esterilidade (desenvolvimento interrompido da antera e do micrósporo) na borla, além de nanismo extremo em alguns casos. Veja, por exemplo, Chen, Y. et al., "The Maize DWARF1 Encodes a Gibberellin 3-Oxidase and Is Dual Localized to the Nucleus and Cytosol," Plant Physiology 166: 2028-2039 (2014). Esses fenótipos mutantes GA (tipos estranhos) no milho levaram a reduções significativas na produção de caroços e a uma redução no rendimento. Além disso, a produção de anteras na espiga aumenta a probabilidade de infecções por fungos ou insetos, o que reduz a qualidade do grão produzido nessas espigas mutantes. A procriação direta para desenvolver linhagens de milho semi-anãs não foi bem-sucedida, e os tipos de reprodução (e também o extremo nanismo) dos mutantes GA têm sido difíceis de superar. Assim, as mesmas mutações na via GA que levaram à Revolução Verde em outras gramíneas ainda não tiveram sucesso no milho.
[0028] Apesar dessas dificuldades anteriores em alcançar rendimentos mais altos de caroços de milho através da manipulação da via GA, os presentes inventores descobriram uma maneira de manipular os níveis de GA em plantas de milho de uma maneira que reduz a altura total da planta e o comprimento do internodo do caule e aumenta a resistência ao alojamento, mas não causa os tipos estranhos reprodutivos anteriormente associados a mutações da via GA no milho. Evidências adicionais indicam que essas plantas de milho de baixa estatura ou semi-anãs também podem ter um ou mais traços adicionais, incluindo aumento do diâmetro do caule, redução do estalo verde, raízes mais profundas, aumento da área foliar, fechamento mais precoce do dossel, maior condutância estomática, menor altura da espiga, aumento do teor de água foliar, melhoria da tolerância à seca, aumento da eficiência do uso de nitrogênio, aumento da eficiência do uso de água, redução do teor de antocianina e área nas folhas sob condições normais ou de estresse limitativo à nitrogênio ou água, aumento do peso da espiga, aumento do número de caroços, aumento do peso dos caroços, aumento do rendimento, e/ou aumento do índice de colheita.
[0029] De acordo com modalidades da presente divulgação, são fornecidas plantas de milho modificadas que possuem pelo menos um traço agronômico benéfico e pelo menos um órgão ou espiga reprodutiva fêmea que é substancial ou completamente livre de tipos estranhos. O traço agronômico benéfico pode incluir, por exemplo, altura de planta mais curta, comprimento de Internodo mais curto em um ou mais Internodos, diâmetro de haste ou caule maior (mais espesso), maior resistência ao alojamento, melhor tolerância à seca, maior eficiência de uso de nitrogênio, melhor eficácia no uso de nitrogênio, raízes mais profundas, área foliar maior, fechamento mais precoce do dossel e/ou aumento do rendimento do que pode ser colhido. Os tipos não incluídos podem incluir esterilidade de macho (borla ou antera), número reduzido de caroços ou sementes, e/ou a presença de uma ou mais estruturas reprodutivas masculinizadas ou macho (ou tipo macho) no órgão ou na espiga fêmea (por exemplo, antera da espiga) da planta. Uma planta de milho modificada é fornecida neste documento que carece de tipos estranhos significativos nos tecidos reprodutivos da planta. Tal planta de milho modificada pode ter um órgão ou espiga reprodutivo fêmea que parece normal em relação a uma planta de controle ou tipo selvagem. De fato, são fornecidas plantas de milho modificadas que compreendem pelo menos um órgão ou espiga reprodutivo que não possui ou exibe, ou é substancial ou completamente livre de tipos estranhos, incluindo esterilidade masculina, número reduzido de caroços ou sementes, e/ou estrutura(s) masculinizada(s) em um ou mais órgãos ou espigas fêmeas. Como utilizado neste documento, um órgão ou espiga fêmea de uma planta, como o milho, é "substancialmente livre" das estruturas reprodutivas macho se as estruturas reprodutivas macho estiverem ausentes ou quase ausentes no órgão fêmea ou espiga da planta com base na inspeção visual do órgão ou espiga fêmea em estágios reprodutivos posteriores.
Um órgão ou espiga fêmea de uma planta, como o milho, é "completamente livre" de estruturas reprodutivas macho maduras se as estruturas reprodutivas macho estiverem ausentes ou não forem observadas ou observáveis no órgão ou espiga fêmea da planta, como uma planta de milho, por inspeção visual do órgão ou espiga fêmea em estágios reprodutivos posteriores.
Um órgão ou espiga fêmea de uma planta, como o milho, sem tipos estranhos significativos e substancialmente livre de estruturas reprodutivas macho na espiga pode ter um número de caroços ou sementes por órgão ou espiga fêmea da planta que é de pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, pelo menos 99,5%, pelo menos 99,6%, pelo menos 99,7%, pelo menos 99,8% ou pelo menos 99,9% do número de caroços ou sementes por órgão ou espiga fêmea de uma planta tipo selvagem ou controle.
Da mesma forma, um órgão ou espiga fêmea de uma planta, como o milho, sem tipos estranhos significativos e substancialmente livre de estruturas reprodutivas macho na espiga pode ter um peso médio de caroço ou semente por órgão ou espiga fêmea da planta que é pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, pelo menos 99,5%, pelo menos 99,6%, pelo menos 99,7%, pelo menos 99,8%, ou pelo menos pelo menos 99,9% do peso médio do caroço ou da semente por órgão ou espiga fêmea de uma planta tipo selvagem ou controle.
Um órgão ou espiga fêmea de uma planta, como o milho, completamente livre de estruturas reprodutivas macho maduras, pode ter um número de sementes ou caroços por órgão ou espiga fêmea da planta que é quase o mesmo que o de ma planta de controle ou tipo selvagem.
Por outras palavras, o desenvolvimento reprodutivo do órgão ou espiga fêmea da planta pode ser normal ou substancialmente normal. No entanto, o número de sementes ou caroços por órgão ou espiga fêmea pode depender de outros fatores que afetam a utilização de recursos e o desenvolvimento da planta. Na verdade, o número de caroços ou sementes por órgão ou espiga fêmea da planta e/ou o peso do caroço ou semente por órgão ou espiga fêmea da planta pode ser aproximadamente o mesmo ou maior do que uma planta tipo selvagem ou controle.
[0030] O hormônio vegetal giberelina desempenha um papel importante em vários processos de desenvolvimento de plantas, incluindo germinação, alongamento celular, floração, embriogênese e desenvolvimento de sementes. Certas enzimas biossintéticas (por exemplo, GA20 oxidase e GA3 oxidase) e enzimas catabólicas (por exemplo, GA2 oxidase) na via GA são críticas para afetar os níveis de GA ativa nos tecidos das plantas.
[0031] Várias das GA oxidases em plantas de cereais consistem em uma família de genes relacionados à GA oxidase. Por exemplo, o milho tem uma família de pelo menos nove genes da GA20 oxidase que incluem GA20 oxidase_1, GA20 oxidase_2, GA20 oxidase_3, GA20 oxidase_4, GA20 oxidase_5, GA20 oxidase_6, GA20 oxidase_7, GA20 oxidase_8, e GA20 oxidase_9. No entanto, existem apenas duas GA3 oxidases no milho, GA3 oxidase_1 e GA3 oxidase_2. As sequências de DNA e proteína por SEQ ID Nºs para cada um desses genes da GA20 oxidase são fornecidas na Tabela 1.
Tabela 1. Sequências de DNA e proteína por identificador de sequência para genes GA20 oxidase em milho.
Sequência gene GA20 oxidase cDNA Proteína Codificante (CDS) GA20 oxidase_1 SEQ ID Nº: 1 SEQ ID Nº: 2 SEQ ID Nº: 3 GA20 oxidase_2 SEQ ID Nº: 4 SEQ ID Nº: 5 SEQ ID Nº: 6 GA20 oxidase_3 SEQ ID Nº: 7 SEQ ID Nº: 8 SEQ ID Nº: 9 GA20 oxidase_4 SEQ ID Nº: 10 SEQ ID Nº: 11 SEQ ID Nº: 12 GA20 oxidase_5 SEQ ID Nº: 13 SEQ ID Nº: 14 SEQ ID Nº: 15 GA20 oxidase_6 SEQ ID Nº: 16 SEQ ID Nº: 17 SEQ ID Nº: 18 GA20 oxidase_7 SEQ ID Nº: 19 SEQ ID Nº: 20 SEQ ID Nº: 21 GA20 oxidase_8 SEQ ID Nº: 22 SEQ ID Nº: 23 SEQ ID Nº: 24 GA20 oxidase_9 SEQ ID Nº: 25 SEQ ID Nº: 26 SEQ ID Nº: 27
[0032] A sequência de DNA genômico de GA20 oxidase_3 é fornecida na SEQ ID Nº: 34 e a sequência de DNA genômico de GA20 oxidase_5 é fornecida na SEQ ID Nº: 35. Para o gene GA20 oxidase_3, a SEQ ID Nº: 34 fornece 3000 nucleotídeos a montante da GA20 oxidase_3 5'-UTR; os nucleotídeos 3001-3096 correspondem à 5'-UTR; os nucleotídeos 3097-3665 correspondem ao primeiro éxon; os nucleotídeos 3666-3775 correspondem ao primeiro íntron; os nucleotídeos 3776-4097 correspondem ao segundo éxon; os nucleotídeos 4098-5314 correspondem ao segundo íntron; os nucleotídeos 5315-5584 correspondem ao terceiro éxon; e os nucleotídeos 5585-5800 correspondem à 3'-UTR. A SEQ ID Nº: 34 também fornece 3000 nucleotídeos a jusante da extremidade 3'-UTR (nucleotídeos 5801-8800). Para o gene GA20 oxidase_5, a SEQ ID Nº: 35 fornece 3.000 nucleotídeos a montante do códon de iniciação de GA20 oxidase_5 (nucleotídeos 1-3000); os nucleotídeos 3001-3791 correspondem ao primeiro éxon; os nucleotídeos 3792-3906 correspondem ao primeiro íntron; os nucleotídeos 3907-4475 correspondem ao segundo éxon; os nucleotídeos 4476-5197 correspondem ao segundo íntron; os nucleotídeos 5198-5473 correspondem ao terceiro éxon; e os nucleotídeos 5474-5859 correspondem à 3'-UTR. A SEQ ID Nº: 35 também fornece 3000 nucleotídeos a jusante da extremidade do 3'-UTR (nucleotídeos 5860- 8859).
[0033] Uma planta modificada, parte de planta, célula ou explante aqui fornecida pode ser de uma variedade ou linhagem de elite. Como utilizado neste documento, variedade "cultivada" ou "de elite" significa qualquer planta ou variedade que tenha resultado de melhoria e seleção para desempenho agronômico superior. Uma planta, célula ou explante editada aqui fornecida pode ser uma planta, célula ou explante híbrido. Como utilizado neste documento, um "híbrido" é criado cruzando duas plantas de diferentes variedades, linhagens, endogamias ou espécies, de modo que a progênie compreenda material genético de cada progenitor. Artesãos versados reconhecem que híbridos de ordem superior também podem ser gerados. Por exemplo, um primeiro híbrido pode ser feito cruzando a Variedade A com a Variedade B para criar um híbrido A x B, e um segundo híbrido pode ser feito cruzando a Variedade C com a Variedade D para criar um híbrido C x D. O primeiro e o segundo híbridos podem ser cruzados ainda mais para criar o híbrido de ordem superior (A x B) x (C x D) compreendendo informações genéticas de todas as quatro variedades progenitoras.
[0034] Mutações direcionadas no genoma de uma planta podem ser feitas através da introdução de uma ruptura de fita dupla (DSB) ou corte. De acordo com esta abordagem, mutações, como deleções, inserções, inversões e/ou substituições, podem ser introduzidas no sítio alvo através de reparo imperfeito do DSB ou corte para produzir um knock-
out ou knock-down de um gene GA oxidase.
Tais mutações podem ser geradas por reparo imperfeito do sítio alvo, mesmo sem o uso de uma molécula de modelo de doador.
Um "knock-out" de um gene GA oxidase pode ser alcançado pela indução de um DSB ou corte no ou perto do sítio endógeno do gene GA oxidase que resulta na não expressão da proteína de GA oxidase ou na expressão de uma proteína não funcional, enquanto um "knock-down" de um gene GA oxidase pode ser alcançado de maneira semelhante, induzindo um DSB ou corte no ou perto do locus endógeno do gene GA oxidase que é reparado imperfeitamente em um sítio que não afeta a sequência de codificação do gene GA oxidase de uma maneira que elimina a função da proteína de GA oxidase codificada.
Por exemplo, o sítio do DSB ou corte dentro do locus endógeno pode estar na região a montante ou 5' do gene GA oxidase (por exemplo, uma sequência promotora ou intensificadora) para afetar ou reduzir seu nível de expressão.
Da mesma forma, essas mutações de knock-out ou knock-down direcionadas de um gene GA oxidase podem ser geradas com uma molécula de modelo de doador para direcionar uma mutação específica ou desejada no próximo ao sítio alvo, via reparo do DSB ou corte.
A molécula do modelo de doador pode compreender uma sequência homóloga com ou sem uma sequência de inserção e compreendendo uma ou mais mutações, como uma ou mais deleções, inserções, inversões e/ou substituições, relativas à sequência genômica direcionada no ou próximo ao sítio do DSB ou corte.
Por exemplo, mutações knock-out direcionadas de um gene podem ser alcançadas pela deleção ou inversão de pelo menos uma porção do gene GA oxidase ou pela introdução de um deslocamento de estrutura ou de um códon de parada prematuro na sequência de codificação do gene.
Uma deleção de uma porção de um gene GA oxidase também pode ser introduzida através da geração de DSBs ou cortes em dois sítios alvo e causando uma deleção da região-alvo intermediária flanqueada pelos sítios alvo.
[0035] Uma nuclease específica de sítio aqui fornecida pode ser selecionada do grupo que consiste em uma nuclease de dedo de zinco (ZFN), uma meganuclease, uma endonuclease guiada por RNA, uma endonuclease TALE (TALEN), uma recombinase, uma transposase ou qualquer combinação dos mesmos. Ver, por exemplo, Khandagale, K. et al., "Genome editing for targeted improvement in plants," Plant Biotechnol Rep 10: 327-343 (2016); e Gaj, T. et al., "ZFN, TALEN and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering," Trends Biotechnol. 31(7): 397-405 (2013), cujos conteúdos e divulgações são incorporados neste documento por referência. Uma recombinase pode ser uma serina recombinase ligada a um motivo de reconhecimento de DNA, uma tirosina recombinase ligada a um motivo de reconhecimento de DNA ou outra enzima recombinase conhecida na técnica. Uma recombinase ou transposase pode ser uma DNA transposase ou recombinase ligada a um domínio de ligação ao DNA. Uma tirosina recombinase ligada a um motivo de reconhecimento de DNA pode ser selecionada do grupo que consiste em uma Cre recombinase, uma Flp recombinase e uma recombinase Tnp1. De acordo com algumas modalidades, uma Cre recombinase or a Gin recombinase fornecidas aqui são amarradas a um domínio de ligação a DNA de dedo de zinco. Em outra modalidade, uma serina recombinase fixada a um motivo de reconhecimento de DNA fornecida no presente documento é selecionada a partir do grupo que consiste numa PhiC31 integrase, uma R4 integrase e uma TP-901 integrase. Em outra modalidade, uma DNA transposase fixada a um domínio de ligação ao DNA fornecida no presente documento é selecionada do grupo que consiste num TALE- piggyBac e TALE-Mutator.
[0036] De acordo com modalidades da presente divulgação, uma endonuclease guiada por RNA pode ser selecionada do grupo que consiste em Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8,
Cas9 (também conhecido como Csn1 e Csx12), Cas10, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1, Cse2, Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3, Csf4, Cpf1, CasX, CasY, e homólogos ou versões modificadas dos mesmos, Argonauta (exemplos não limitativos de proteínas Argonautas incluem Thermus thermophilus Argonaute (TtAgo), Pyrococcus furiosus Argonaute (PfAgo), Natronobacterium gregoryi Argonaute (NgAgo) e homólogos ou versões modificadas dos mesmos. De acordo com algumas modalidades, uma endonuclease guiada por RNA pode ser uma enzima Cas9 ou Cpf1.
[0037] Em um aspecto, uma nuclease específica de sítio aqui fornecida é selecionada do grupo que consiste em uma nuclease de dedo de zinco, uma meganuclease, uma nuclease guiada por RNA, uma nuclease TALE, uma recombinase, uma transposase ou qualquer combinação das mesmas. Em outro aspecto, uma nuclease específica de sítio aqui fornecida é selecionada a do grupo que consiste em um Cas9 ou um Cpf1. Em outro aspecto, uma nuclease específica de sítio aqui fornecida é selecionada do grupo que consiste em um Cas1, um Cas1B, um Cas2, um Cas3, um Cas4, um Cas5, um Cas6, um Cas7, um Cas8, um Cas9, um Cas10, um Csy1, um Csy2, um Csy3, um Cse1, um Cse2, um Csc1, um Csc2, um Csa5, um Csn2, um Csm2, um Csm3, um Csm4, um Csm5, um Csm6, um Cmr1, um Cmr3, um Cmr4, um Cmr5, um Cmr6, um Csb1, um Csb2, um Csb3, um Csx17, um Csx14, um Csx10, um Csx16, um CsaX, um Csx3, um Csx1, um Csx15, um Csf1, um Csf2, um Csf3, um Csf4, um Cpf1, CasX, CasY, um homólogo do mesmo ou uma versão modificada do mesmo. Em outro aspecto, uma nuclease guiada por RNA aqui fornecida aqui é selecionada do grupo que consiste em um Cas9 ou um Cpf1. Em outro aspecto, uma nuclease guiada por RNA fornecida aqui é selecionada do grupo que consiste em um Cas1, um Cas1B, um Cas2, um Cas3, um Cas4, um Cas5, um Cas6, um Cas7, um Cas8, um Cas9, um Cas10, um Csy1, um Csy2, um Csy3, um Cse1, um Cse2, um Csc1, um Csc2, um Csa5, um Csn2, um Csm2, um Csm3, um Csm4, um Csm5, um Csm6, um Cmr1, um Cmr3, um Cmr4, um Cmr5, um Cmr6, um Csb1, um Csb2, um Csb3, um Csx17, um Csx14, um Csx10, um Csx16, um CsaX, um Csx3, um Csx1, um Csx15, um Csf1, um Csf2, um Csf3, um Csf4, um Cpf1, CasX, CasY, um homólogo do mesmo ou uma versão modificada do mesmo. Em outro aspecto, um método e/ou uma composição fornecida aqui compreende pelo menos um, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, pelo menos oito, pelo menos nove, ou pelo menos dez nucleases específicas de sítio. Em ainda outro aspecto, um método e/ou uma composição fornecida neste documento compreende pelo menos um, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, pelo menos oito, pelo menos nove, ou pelo menos dez polinucleotídeos que codificam pelo menos um, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, pelo menos oito, pelo menos nove, ou pelo menos dez nucleases específicas de sítio.
[0038] Para endonucleases guiadas por RNA, uma molécula de RNA guia (gRNA) é ainda fornecida para dirigir a endonuclease para um sítio alvo no genoma da planta via pareamento de base ou hibridação para causar um DSB ou corte no sítio ou próximo. O gRNA pode ser transformado ou introduzido em uma célula ou tecido de planta (talvez junto com uma nuclease, ou molécula de DNA que codifica nuclease, construto ou vetor) como uma molécula de gRNA ou como uma molécula de DNA recombinante, construto ou vetor compreendendo uma sequência de DNA transcritível que codifica o RNA guia operativamente ligado a um promotor expressável em plantas. Como entendido na técnica, um "RNA guia" pode compreender, por exemplo, um RNA CRISPR (crRNA), um RNA guia de fita única (sgRNA) ou qualquer outra molécula de RNA que possa guiar ou dirigir uma endonuclease para um sítio alvo específico no genoma.
Um "RNA guia de cadeia única" (ou "sgRNA") é uma molécula de RNA que compreende um crRNA ligado covalentemente a um tracrRNA por uma sequência de ligação, que pode ser expressa como um único transcrito ou molécula de RNA.
O RNA guia compreende uma sequência guia ou de direcionamento que é idêntica ou complementar a um sítio alvo no genoma da planta, como em ou próximo a um gene GA oxidase.
Um motivo protoespaçador-adjacente (PAM) pode estar presente no genoma imediatamente adjacente e a montante da extremidade 5'da sequência do sítio alvo genômico complementar à sequência de direcionamento do RNA guia - isto é, imediatamente a jusante (3') para a fita de sentido (+) do sítio alvo genômico (em relação à sequência de direcionamento do RNA guia) como conhecido na técnica.
Ver, por exemplo, Wu, X. et al., "Target specificity of the CRISPR-Cas9 system," Quant Biol. 2(2):59-70 (2014), cujo conteúdo e divulgação são aqui incorporados por referência.
A sequência PAM genômica na fita de sentido (+) adjacente ao sítio alvo (em relação à sequência de direcionamento do RNA guia) pode compreender 5'-NGG-3'. No entanto, a sequência correspondente do RNA guia (isto é, imediatamente a jusante (3') da sequência alvo do RNA guia) pode geralmente não ser complementar à sequência genômica do PAM.
O RNA guia normalmente pode ser uma molécula de RNA não codificante que não codifica uma proteína.
A sequência guia do RNA guia pode ter pelo menos 10 nucleotídeos de comprimento, como 12-40 nucleotídeos, 12-30 nucleotídeos, 12-20 nucleotídeos, 12-35 nucleotídeos, 12-30 nucleotídeos, 15-30 nucleotídeos, 17-30 nucleotídeos, ou 17-25 nucleotídeos de comprimento, ou cerca de 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18,
19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ou mais nucleotídeos de comprimento. A sequência guia pode ser pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 99% ou 100% idêntica ou complementar a pelo menos 10, pelo menos 11, pelo menos 12, pelo menos 13, pelo menos 14, pelo menos 15, pelo menos 16, pelo menos 17, pelo menos 18, pelo menos 19, pelo menos 20, pelo menos 21, pelo menos 22, pelo menos 23, pelo menos 24, pelo menos 25 ou mais nucleotídeos consecutivos de uma sequência de DNA no sítio alvo genômico.
[0039] Em um aspecto, o gene de GA20 oxidase_3 é editado através de uma técnica de edição de genoma. Para a edição do genoma no ou próximo ao gene GA20 oxidase_3 com uma endonuclease guiada por RNA, um RNA guia pode ser usado compreendendo uma sequência guia que é pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, em pelo menos 99% ou 100% idêntica ou complementar a pelo menos 10, pelo menos 11, pelo menos 12, pelo menos 13, pelo menos 14, pelo menos 15, pelo menos 16, pelo menos 17, pelo menos 18, pelo menos 19, pelo menos 20, pelo menos 21, pelo menos 22, pelo menos 23, pelo menos 24, pelo menos 25, ou mais nucleotídeos consecutivos da SEQ ID Nº: 34 ou uma sequência complementar à mesma (por exemplo, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ou mais nucleotídeos consecutivos de SEQ ID Nº: 34 ou uma sequência complementar à mesma). Para a edição do genoma no ou próximo ao gene GA20 oxidase_5 com uma endonuclease guiada por RNA, um RNA guia pode ser usado compreendendo uma sequência guia que é pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, em pelo menos 99% ou 100% idêntica ou complementar a pelo menos 10, pelo menos 11, pelo menos 12, pelo menos 13, pelo menos 14, pelo menos 15, pelo menos 16, pelo menos 17, pelo menos 18, pelo menos 19, pelo menos 20, pelo menos 21, pelo menos 22, pelo menos 23, pelo menos 24, pelo menos 25, ou mais nucleotídeos consecutivos da SEQ ID Nº: 35 ou uma sequência complementar à mesma (por exemplo, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ou mais nucleotídeos consecutivos da SEQ ID Nº: 35 ou uma sequência complementar à mesma). Como aqui utilizado, o termo "consecutivo" em referência a uma sequência de polinucleotídeos ou de proteínas significa sem deleções ou folgas na sequência.
[0040] Para mutações knockdown (e possivelmente knockout) através da edição do genoma, uma endonuclease guiada por RNA pode ser direcionada para uma sequência a montante ou a jusante, tal como uma sequência promotora e/ou intensificadora, ou um íntron, 5'UTR e/ou sequência 3'UTR de um gene GA20 oxidase_3 ou GA20 oxidase_5 para mutar uma ou mais sequências promotoras e/ou regulatórias do gene e afetar ou reduzir seu nível de expressão. Para knockdown (e possivelmente knockout) do gene GA20 oxidase_3 no milho, um RNA guia pode ser usado compreendendo uma sequência guia que é pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 99 % ou 100% idêntica ou complementar a pelo menos 10, pelo menos 11, pelo menos 12, pelo menos 13, pelo menos 14, pelo menos 15, pelo menos 16, pelo menos 17, pelo menos 18, pelo menos 19, pelo menos 20, pelo menos 21, pelo menos 22, pelo menos 23, pelo menos 24, pelo menos 25 ou mais nucleotídeos consecutivos dentro do intervalo de sequência nucleotídicas 1-3096 da SEQ ID Nº: 34, o intervalo de sequência nucleotídicas 3666-3775 da SEQ ID Nº: 34, o intervalo de sequência nucleotídicas 4098-5314 da SEQ ID Nº: 34, o intervalo de sequência nucleotídicas 5585-5800 da SEQ ID Nº: 34 ou o intervalo de sequência nucleotídicas 5801-8800 da SEQ ID Nº: 34, ou a sequência complementar à mesma (por exemplo, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ou mais nucleotídeos consecutivos dentro do intervalo de sequência nucleotídicas 1-3096, 3666-3775, 4098-5314, 5585-5800, 5801-880 0 ou 5585-8800 da SEQ ID Nº: 34, ou uma sequência complementar à mesma).
[0041] Para knockdown (e possivelmente knockout) do gene GA20 oxidase_5 no milho, um RNA guia pode ser usado compreendendo uma sequência guia que é pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 99% ou 100% idêntica ou complementar a pelo menos 10, pelo menos 11, pelo menos 12, pelo menos 13, pelo menos 14, pelo menos 15, pelo menos 16, pelo menos 17, pelo menos 18, pelo menos 19, pelo menos 20, pelo menos 21, pelo menos 22, pelo menos 23, pelo menos 24, pelo menos 25 ou mais nucleotídeos consecutivos dentro do intervalo de sequência nucleotídicas 1-3000 da SEQ ID Nº: 35, o intervalo de sequência nucleotídicas 1-3000 da SEQ ID Nº: 35, o intervalo de sequência nucleotídicas 3792-3906 da SEQ ID Nº: 35, o intervalo de sequência nucleotídicas 4476-5197 da SEQ ID Nº: 35 ou o intervalo de sequência nucleotídicas 5860-8859 da SEQ ID Nº: 35, ou uma sequência complementar à mesma (por exemplo, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ou mais nucleotídeos consecutivos dentro do intervalo de sequência nucleotídicas 1-3000, 3792-3906, 4476-5197 ou 5860-8859 de SEQ ID Nº: 35, ou uma sequência complementar à mesma).
[0042] Para mutações knockout (e possivelmente knockdown) através da edição de genoma, uma endonuclease guiada por RNA pode ser direcionada para uma sequência de codificação e/ou íntron de um gene GA20 oxidase_3 ou GA20 oxidase_5 para eliminar potencialmente a expressão e/ou atividade de uma proteína de GA oxidase funcional do gene. No entanto, um knockout de uma expressão do gene GA oxidase também pode ser alcançado em alguns casos, direcionando a(s) sequência(s) a montante e/ou 5'UTR do gene, ou outras sequências no ou próximo ao locus genômico do gene. Assim, um knockout de uma expressão do gene GA oxidase pode ser alcançado direcionando uma sequência genômica no ou próximo ao sítio ou locus de um gene GA20 oxidase_3 ou GA20 oxidase_5, uma sequência a montante ou a jusante, tal como uma sequência promotora e/ou intensificado, ou um íntron, 5'UTR e/ou sequência 3'UTR, de um gene GA20 oxidase_3 ou GA20 oxidase_5, como descrito acima para knockdown de um gene GA20 oxidase_3 ou GA20 oxidase_5.
[0043] Para knockout (e possivelmente knockdown) do gene GA20 oxidase_3 no milho, um RNA guia pode ser usado compreendendo uma sequência guia que é pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 99% ou 100% idêntica ou complementar a pelo menos 10, pelo menos 11, pelo menos 12, pelo menos 13, pelo menos 14, pelo menos 15, pelo menos 16, pelo menos 17, pelo menos 18, pelo menos 19, pelo menos 20, pelo menos 21, pelo menos 22, pelo menos 23, pelo menos 24, pelo menos 25 ou mais nucleotídeos consecutivos dentro do intervalo de sequência nucleotídica 3097-5584 da SEQ ID Nº: 34, o intervalo de sequência nucleotídica 3097- 3665 da SEQ ID Nº: 34, o intervalo de sequência nucleotídica 3776-4097 da SEQ ID Nº: 34 ou o intervalo de sequência nucleotídica 5315-5584 da SEQ ID Nº: 34 ou uma sequência complementar à mesma (por exemplo, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ou mais nucleotídeos consecutivos dentro do intervalo de sequências de nucleotídeos 3097-5584, 3097-3665, 3097- 3775, 3665-4097, 3776-4097, 3776-5314, 4098-5584 ou 5315-5584 da SEQ ID Nº: 34, ou uma sequência complementar à mesma).
[0044] Para knockout (e possivelmente knockdown) do gene GA20 oxidase_5 em milho, um RNA guia pode ser usado compreendendo uma sequência guia que é pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 99% ou 100% idêntica ou complementar a pelo menos 10, pelo menos 11, pelo menos 12, pelo menos 13, pelo menos 14, pelo menos 15, pelo menos 16, pelo menos 17, pelo menos 18, pelo menos 19, pelo menos 20, pelo menos 21, pelo menos 22, pelo menos 23, pelo menos 24, pelo menos 25 ou mais nucleotídeos consecutivos dentro do intervalo de sequência nucleotídicas 3001-5473 da SEQ ID Nº: 35, o intervalo de sequência nucleotídicas 3001-3791 da SEQ ID Nº: 35, o intervalo de sequência nucleotídicas 3907-4475 da SEQ ID Nº: 35, ou o intervalo de sequência nucleotídicas 5198-5473 da SEQ ID Nº: 35, ou uma sequência complementar à mesma (por exemplo, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ou mais nucleotídeos consecutivos dentro do intervalo de sequência nucleotídicas 3001-5473, 3001-3791, 3001- 3906, 3792-4475, 3907-4475, 3907-5197, 4476-5473 ou 5198-5473 de SEQ ID Nº: 35, ou um sequência complementar à mesma).
[0045] De acordo com algumas modalidades, um RNA guia para direcionar um gene endógeno de GA20 oxidase_3 e/ou GA20 oxidase_5, que pode compreender uma sequência guia que é pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 99% ou 100% idêntica ou complementar a pelo menos 10, pelo menos 11, pelo menos 12, pelo menos 13, pelo menos 14, pelo menos 15, pelo menos 16, pelo menos 17, pelo menos 18, pelo menos 19, pelo menos 20 ou pelo menos 21 nucleotídeos consecutivos de qualquer uma ou mais das SEQ ID Nºs: 138-167. De acordo com algumas modalidades, um RNA guia para direcionar ambos os genes endógenos de GA20 oxidase_3 e GA20 oxidase_5, que podem compreender uma sequência guia que é pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 99% ou 100% idêntica ou complementar a pelo menos 10, pelo menos 11, pelo menos 12, pelo menos 13, pelo menos 14, pelo menos 15, pelo menos 16, pelo menos 17, pelo menos 18, pelo menos 19, pelo menos 20 ou pelo menos 21 nucleotídeos consecutivos da SEQ ID Nº: 34, e pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 99% ou 100% idêntica ou complementares a pelo menos 10, pelo menos 11,
pelo menos 12, pelo menos 13, pelo menos 14, pelo menos 15, pelo menos 16, pelo menos 17, pelo menos 18, pelo menos 19, pelo menos 20 ou pelo menos 21 nucleotídeos consecutivos da SEQ ID Nº: 35. De acordo com algumas modalidades, um RNA guia para direcionar ambos os genes endógenos de GA20 oxidase_3 e GA20 oxidase_5, que pode compreender uma sequência guia que é pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 99% ou 100% idêntica ou complementar a pelo menos 10, pelo menos 11, pelo menos 12, pelo menos 13, pelo menos 14, pelo menos 15, pelo menos 16, pelo menos 17, pelo menos 18, pelo menos 19, pelo menos 20 ou pelo menos 21 nucleotídeos consecutivos de qualquer uma ou mais das SEQ ID Nºs: 158-167.
[0046] Além da sequência guia, um RNA guia pode compreender ainda uma ou mais outra(s) sequência(s) estruturais ou de andaime, que podem se ligar ou interagir com uma endonuclease guiada por RNA. Tais sequências de andaime estruturais podem interagir ainda mais com outras moléculas de RNA (por exemplo, tracrRNA). Métodos e técnicas para projetar construtos de direcionamento e RNAs guia para edição de genoma e integração direcionada ao sítio em um sítio alvo dentro do genoma de uma planta usando uma endonuclease guiada por RNA são conhecidos na técnica.
[0047] De acordo com algumas modalidades, construtos e vetores de DNA recombinante são fornecidos compreendendo uma sequência polinucleotídica que codifica uma nuclease específica de sítio, como uma nuclease de dedo de zinco (ZFN), uma meganuclease, uma endonuclease guiada por RNA, uma TALE-endonuclease (TALEN), uma recombinase ou uma transposase, em que a sequência de codificação está operacionalmente ligada a um promotor expressável em planta. Para endonucleases guiadas por RNA, construtos e vetores de DNA recombinante são ainda fornecidos compreendendo uma sequência polinucleotídica que codifica um RNA guia, em que o RNA guia compreende uma sequência guia de comprimento suficiente com uma porcentagem de identidade ou complementaridade com um sítio alvo dentro do genoma de uma planta, tal como em ou próximo de um gene GA oxidase direcionado. De acordo com algumas modalidades, uma sequência polinucleotídica de um construto de DNA recombinante e vetor que codifica uma nuclease específica de sítio ou um RNA guia pode ser operacionalmente ligada a um promotor expressável em planta, tal como um promotor induzível, um promotor constitutivo, um promotor específico de tecido, etc.
[0048] Em outro aspecto, a presente divulgação fornece uma planta de milho modificada, ou parte de planta da mesma, compreendendo um gene de GA20 oxidase_3 mutante homozigoto e um gene de GA20 oxidase_5 gene mutante homozigoto. Em um aspecto, um gene de GA20 oxidase_3 mutante homozigoto, um gene de GA20oxidase_5 gene mutante homozigoto, ou ambos compreendem uma combinação heteroalélica de alelos mutantes ou dois alelos mutantes idênticos. Em um aspecto, um gene de GA20 oxidase_3 gene mutante homozigoto, um gene de GA20oxidase_5mutante homozigoto, ou ambos compreendem uma mutação em uma região de sequência selecionada do grupo que consiste no promotor, 5 'UTR, primeiro éxon, primeiro íntron, segundo éxon, segundo íntron, terceiro éxon, 3' UTR, terminador e qualquer combinação dos mesmos. Em um aspecto, um gene de GA20 oxidase_3 gene mutante homozigoto, um gene de GA20oxidase_5 mutante homozigoto, ou ambos compreendem tipos de mutação selecionado do grupo que consiste em uma mutação sem sentido, uma mutação de sentido incompatível, uma mutação de mudança de estrutura, uma mutação de sítio de junção e qualquer combinação das mesmas. Em um aspecto, um gene de GA20 oxidase_3 gene mutante homozigoto, um gene de GA20oxidase_5 mutante homozigoto, ou ambos resultam em um ou mais dos seguintes itens: truncamento de proteínas, transcrição não traduzível, proteína não funcional, códon de parada prematuro e qualquer combinação dos mesmos. Em um aspecto, um gene de GA20 oxidase_3 gene mutante homozigoto, um gene de GA20oxidase_5 mutante homozigoto, ou ambos compreendem uma mutação selecionada do grupo que consiste em uma substituição, uma deleção, uma inserção, uma duplicação e uma inversão de um ou mais nucleotídeos em relação a um gene de GA20 oxidase_3 gene tipo selvagem. Em um aspecto, um gene de GA20 oxidase_3 gene mutante homozigoto, um gene de GA20oxidase_5 mutante homozigoto, ou ambos compreendem um alelo nulo.
[0049] Em outro aspecto, a presente divulgação fornece uma planta de milho modificada, ou parte de planta da mesma, compreendendo alelos mutantes homozigotos em um locus de GA20 oxidase_3 endógeno e alelos mutantes homozigotos em um locus de GA20 oxidase_5 endógeno. Em um aspecto, alelos mutantes homozigotos no locus endógeno de GA20 oxidase_3, alelos mutantes homozigotos no locus endógeno de GA20 oxidase_5, ou ambos compreendem uma combinação heteroalélica ou dois alelos mutantes idênticos. Em um aspecto, uma planta modificada compreende um locus homozigoto de GA20 oxidase_3 compreendendo uma combinação heteroalélica de alelos mutantes e um locus homozigoto de GA20 oxidase_5 compreendendo uma combinação heteroalélica de alelos mutantes. Em outro aspecto, uma planta modificada compreende um locus homozigoto de GA20 oxidase_3 compreendendo uma combinação heteroalélica de alelos mutantes e um locus homozigoto de GA20 oxidase_5 compreendendo dois alelos mutantes idênticos. Em um aspecto, uma planta modificada compreende um locus homozigoto de GA20 oxidase_3 compreendendo dois alelos mutantes idênticos e um locus homozigoto de GA20 oxidase_5 compreendendo uma combinação heteroalélica de alelos mutantes. Em outro aspecto, uma planta modificada compreende um locus homozigoto de GA20 oxidase_3 compreendendo dois alelos mutantes idênticos e um locus homozigoto de GA20 oxidase_5 compreendendo dois alelos mutantes idênticos.
[0050] Em um aspecto, um locus ou gene de GA20 oxidase_3 compreende uma sequência que compartilha pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 99% ou pelo menos 99,5% de identidade de sequência com a SEQ ID Nº. 34 ou
168. Em um aspecto, um locus ou gene de GA20 oxidase_5 compreende uma sequência que compartilha pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 99% ou pelo menos 99,5% de identidade de sequência com a SEQ ID Nº 35 ou
169.
[0051] Em um aspecto, uma mutação de GA20 oxidase_3 ou GA20 oxidase_5 (gene mutante ou alelo mutante) compreende um tipo de mutação selecionado do grupo que consiste em uma mutação sem sentido, uma mutação de sentido incompatível, uma mutação de mudança de estrutura e uma mutação de sítio de junção. Em um aspecto, uma mutação de GA20 oxidase_3 ou GA20 oxidase_5 (ou alelo mutante) resulta em um mRNA ou polipeptídeo truncado, ou resulta em uma molécula de mRNA não traduzível. Uma mutação de sentido incompatível é uma alteração em um par de bases de DNA que resulta na substituição de um aminoácido por outro na proteína produzida por um gene. Uma mutação sem sentido também é uma alteração em um par de bases de DNA. Em vez de substituir um aminoácido por outro, no entanto, a sequência de DNA alterada sinaliza prematuramente a célula para parar de construir uma proteína. Esse tipo de mutação resulta em uma proteína reduzida que pode funcionar inadequadamente ou não funcionar. Uma mutação de deslocamento de estrutura ocorre quando a adição ou perda de bases de DNA altera a estrutura de leitura de um gene. Uma mutação de deslocamento de estrutura altera o agrupamento dessas bases e altera o código dos aminoácidos. A proteína resultante, mesmo se feita, geralmente não é funcional. Inserções, deleções e duplicações podem ser mutações de deslocamento de estrutura. Em outro aspecto, uma mutação de GA20 oxidase_3 ou GA20 oxidase_5 (gene mutante ou alelo mutante) pode compreender uma mutação silenciosa que não altera uma sequência de aminoácidos codificada, mas pode afetar a expressão do transcrito de mRNA, a estabilidade ou a eficiência da tradução de proteínas ou de outra forma contribuir para a atividade enzimática reduzida, em relação a um gene de tipo selvagem correspondente de GA20 oxidase_3 ou GA20 oxidase_5. Em um aspecto adicional, uma mutação de GA20 oxidase_3 ou GA20 oxidase_5 (gene mutante ou alelo mutante) pode compreender uma mutação ou edição em ou em torno da caixa TATA ou outros elementos promotores que afetam a transcrição do gene. Em um aspecto, uma mutação de GA20 oxidase_3 ou alelo em uma planta de milho modificada é uma mutação ou alelo recessivo. Em um aspecto, uma mutação de GA20 oxidase_3 ou alelo em uma planta de milho modificada é uma mutação ou alelo dominante. Em um aspecto, uma mutação de GA20 oxidase_5 mutação ou alelo em uma planta de milho modificada é uma mutação ou alelo recessivo. Em um aspecto, uma mutação de GA20 oxidase_5 mutação ou alelo em uma planta de milho modificada é uma mutação ou alelo dominante.
[0052] Em um aspecto, uma mutação de GA20 oxidase_3 ou GA20 oxidase_5 (ou alelo mutante) compreende uma mutação em uma região de sequência de GA20 oxidase_3 ou GA20 oxidase_5 selecionada do grupo que consiste em um promotor, 5 'UTR, primeiro éxon, primeiro íntron, segundo éxon, segundo íntron, terceiro éxon, 3' UTR e terminador. Em um aspecto, uma mutação de GA20 oxidase_3 ou GA20 oxidase_5 (ou alelo mutante) compreende uma mutação no primeiro ou segundo éxon do gene GA20 oxidase_3 ou GA20 oxidase_5.
[0053] Em um aspecto, um alelo de GA20 oxidase_3 ou GA20 oxidase_5 mutante exibe pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% de redução da expressão ou atividade enzimática em relação a um alelo de gene de GA20 oxidase_3 ou GA20 oxidase_5 tipo selvagem, não modificado. Em outro aspecto, um alelo de GA20 oxidase_3 ou GA20 oxidase_5 mutante compreende uma mutação em uma região de sequência selecionada do grupo que consiste em um promotor, 5 'UTR, primeiro éxon, primeiro intron, segundo éxon, segundo íntron, terceiro éxon, 3' UTR, terminador e qualquer combinação dos mesmos. Em outro aspecto, um alelo de GA20 oxidase_3 ou GA20 oxidase_5 mutante compreende um ou mais tiposde mutação selecionados do grupo que consiste em uma mutação sem sentido, uma mutação de sentido incompatível, uma mutação de mudança de estrutura, uma mutação de sítio de junção e qualquer combinação das mesmas. Em outro aspecto, um alelo de GA20 oxidase_3 ou GA20 oxidase_5 mutante resulta em um ou mais dos seguintes itens: truncamento de proteínas, transcrição não traduzível, proteína não funcional, códon de parada prematuro e qualquer combinação dos mesmos. Em outro aspecto, um alelo de GA20 oxidase_3 ou GA20 oxidase_5 mutante compreende uma mutação selecionada do grupo que consiste em uma substituição, uma deleção, uma inserção, uma duplicação e uma inversão de um ou mais nucleotídeos em relação a um gene de GA20 oxidase_3 gene tipo selvagem. Em outro aspecto, um alelo de GA20 oxidase_3 ou GA20 oxidase_5 mutante compreende uma ou mais mutações no primeiro éxon. Em outro aspecto, um alelo de GA20 oxidase_3 ou GA20 oxidase_5 mutante compreende uma ou mais mutações no segundo éxon.
[0054] Em um aspecto, uma planta de milho modificada, ou parte de planta da mesma, compreende uma primeira mutação compreendendo um ou mais alelos, como um par de dois alelos idênticos ou uma combinação heteroalélica, selecionada do grupo que consiste em: uma deleção de 13 bases começando em 536; uma deleção da base 542; uma inserção de CC na base 542; uma deleção da base 541; uma deleção de 3 nt começando na base 540; uma deleção de 2 bases começando na base 422; uma inserção de um A na base 422; uma inserção de um T na base 422; uma deleção da base 564; uma inserção de um A na base 564; uma inserção de um C na base 565; e uma inserção de um C na base 63; em que a numeração de base é baseada na SEQ ID Nº. 168 e contada a partir do primeiro nucleotídeo da SEQ ID Nº: 168 na direção de 5' para 3'. Em outro aspecto, uma planta de milho modificada, ou parte de planta da mesma, compreende uma primeira mutação compreendendo um ou mais alelos, como um par de dois alelos idênticos ou uma combinação heteroalélica, selecionada do grupo que consiste em: uma deleção da base 644; uma deleção de 2 bases começando na base 644; uma inserção de um T na base 644; uma deleção da base 372; uma deleção da base 786; uma deleção de 5 bases começando na base 786; uma deleção de 2 bases começando na base 101; uma inserção de um T na base 102; uma deleção de 3 bases começando na base 99; uma inserção de um A na base 282; e uma inserção de um C na base 282; em que a numeração de base é baseada na SEQ ID Nº. 169 e contada a partir do primeiro nucleotídeo da SEQ ID Nº: 169 na direção 5' para 3'. Em um aspecto, uma planta de milho modificada ou parte de planta da mesma compreende uma primeira mutação identificada por uma ou mais das SEQ ID Nºs.: 170 a 193 e 206 a 217 em relação à sequência de referência correspondente na SEQ ID Nº: 168. Em um aspecto, uma planta de milho modificada ou parte de planta da mesma compreende uma primeira mutação identificada por uma ou mais das SEQ ID Nºs.: 218 a 239 e 251 a 261 em relação à sequência de referência correspondente na SEQ ID Nº:
169. Em um aspecto, a presente divulgação fornece uma planta progenitora de uma ou mais plantas listadas na Tabela 5 ou 6. Em outro aspecto, também é fornecida uma planta progenitora de qualquer uma das plantas Nºs.: 17 a 31 na Tabela 6. Em um aspecto adicional, uma planta é fornecida a partir de um cruzamento ou hibridação de uma ou mais plantas listadas na Tabela 5 ou 6.
[0055] Em um aspecto, uma planta de milho modificada descrita aqui tem uma altura de planta menor e/ou resistência melhorada ao alojamento em relação a uma planta de controle não modificada. Em um aspecto, uma planta de milho modificada é pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35% ou pelo menos 40% mais curto do que uma planta de controle não modificada. Em outro aspecto, uma planta de milho modificada tem um diâmetro de caule ou haste em um ou mais Internodos do caule é pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35% ou pelo menos 40% maior do que o diâmetro de caule ou haste no mesmo um ou mais Internodos de uma planta de controle não modificada. Em outro aspecto, uma planta de milho modificada tem um diâmetro de caule ou haste em um ou mais dos primeiro, segundo, terceiro, e/ou quarto Internodo abaixo da espiga é pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35% ou pelo menos 40% maior do que o mesmo Internodo de uma planta de controle não modificada. Em outro aspecto, o nível de um ou mais GAs ativos em pelo menos um tecido de Internodo do caule ou haste de uma planta de milho modificada é de pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, em pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35% ou pelo menos 40% menor do que o mesmo tecido de entrenó de uma planta de controle não modificada. Em um aspecto, o nível de um ou mais GAs ativos em pelo menos um tecido de entrenó do caule ou haste de uma planta de milho modificada é menor do que o mesmo tecido de entrenó de uma planta de controle não modificada.
[0056] Em outro aspecto, uma planta de milho modificada não tem nenhum tipo fora significativo em pelo menos um órgão ou espiga fêmea. Em um aspecto, uma planta de milho modificada não exibe essencialmente nenhuma anormalidade reprodutiva. Em um aspecto adicional, uma anormalidade reprodutiva ou fora do tipo é selecionada do grupo que consiste em esterilidade de macho (borla ou antera), número reduzido de caroços ou sementes e presença de uma ou mais estruturas reprodutoras masculinizadas ou machos (ou tipo macho) no órgão ou espiga fêmea (por exemplo, antera da espiga).
[0057] Em outro aspecto, uma planta de milho modificada compreende um ou mais traços, em relação a uma planta de controle não modificada, selecionada do grupo que consiste em altura da planta mais curta, diâmetro do caule/haste aumentado, resistência melhorada ao alojamento, estalo verde reduzido, raízes mais profundas, área foliar aumentada, fechamento mais precoce da copa, maior condutância estomática, menor altura da espiga, aumento do teor de água foliar, melhora da tolerância à seca, melhora da eficiência do uso de nitrogênio, redução do teor de antocianina e área nas folhas em condições normais ou limitativas de nitrogênio ou de estresse de água, aumento do peso da espiga, aumento do índice de colheita, aumento do rendimento, aumento do número de sementes, aumento do peso da semente e aumento da prolificidade.
[0058] Em um aspecto, uma planta de milho modificada é endogâmica. Em um outro aspecto, uma planta de milho modificada pode ser um híbrido. Em um aspecto, uma planta de milho modificada é uma planta modificada por uma técnica de edição de genoma direcionada.
[0059] De acordo com algumas modalidades, um construto ou vetor de DNA recombinante pode compreender uma primeira sequência polinucleotídica que codifica uma nuclease específica de sítio e uma segunda sequência polinucleotídica que codifica um RNA guia que pode ser introduzido em uma célula de planta em conjunto por meio de técnicas de transformação de plantas. Alternativamente, dois construtos ou vetores de DNA recombinante podem ser fornecidos, incluindo um primeiro construto ou vetor de DNA recombinante e um segundo construto ou vetor de DNA que podem ser introduzidos em uma célula de planta juntos ou sequencialmente por meio de técnicas de transformação de plantas, em que o primeiro construto ou vetor de DNA recombinante compreende uma sequência polinucleotídica que codifica uma nuclease específica de sítio e o segundo construto ou vetor de DNA recombinante compreende uma sequência polinucleotídica que codifica um RNA guia. De acordo com algumas modalidades, um construto ou vetor de DNA recombinante compreendendo uma sequência polinucleotídica que codifica uma nuclease específica de sítio pode ser introduzido por meio de técnicas de transformação de plantas em uma célula de planta que já compreende (ou é transformada com) um construto ou vetor de DNA recombinante compreendendo uma sequência polinucleotídica que codifica um RNA guia. Alternativamente, um construto ou vetor de DNA recombinante compreendendo uma sequência polinucleotídica que codifica um RNA guia pode ser introduzido por meio de técnicas de transformação de plantas em uma célula de planta que já compreende (ou é transformada com) um construto ou vetor de DNA recombinante compreendendo uma sequência de polinucleotídeo que codifica uma nuclease específica de sítio. De acordo com ainda outras modalidades, uma primeira planta compreendendo (ou transformada com) um construto ou vetor de DNA recombinante compreendendo uma sequência de polinucleotídeo que codifica uma nuclease específica de sítio pode ser cruzada com uma segunda planta compreendendo (ou transformada com) um construto ou vetor de DNA recombinante compreendendo uma sequência polinucleotídica que codifica um RNA guia. Tais construtos ou vetores de DNA recombinante podem ser transitoriamente transformados em uma célula vegetal ou transformados de forma estável ou integrados no genoma de uma célula de planta.
[0060] Em um aspecto, vetores compreendendo polinucleotídeos que codificam uma nuclease específica de sítio e, opcionalmente, um ou mais, dois ou mais, três ou mais ou quatro ou mais gRNAs são fornecidos a uma célula de planta por métodos de transformação conhecidos na técnica (por exemplo, sem estar limitado, bombardeio de partículas, transfecção de protoplastos mediada por PEG ou transformação mediada por Agrobacterium). Em um aspecto, vetores compreendendo polinucleotídeos que codificam uma nuclease Cas9 e, opcionalmente, um ou mais, dois ou mais, três ou mais ou quatro ou mais gRNAs são fornecidos a uma célula de planta por métodos de transformação conhecidos na técnica (por exemplo, sem estar limitado, bombardeio de partículas, transfecção de protoplastos mediada por PEG ou transformação mediada por Agrobacterium). Em outro aspecto, vetores compreendendo polinucleotídeos que codificam um Cpf1 e, opcionalmente, um ou mais, dois ou mais, três ou mais ou quatro ou mais crRNAs são fornecidos a uma célula por métodos de transformação conhecidos na técnica (por exemplo, sem estar limitado, transfecção, bombardeio de partículas, transfecção de protoplastos mediada por PEG ou transformação mediada por Agrobacterium).
[0061] Várias nucleases específicas de sítio, como recombinases,
nucleases de dedo de zinco (ZFNs), meganucleases e TALENs, não são guiadas por RNA e dependem de sua estrutura de proteínas para determinar seu sítio alvo para causar o DSB ou corte, ou são fundidas, amarradas ou ligadas a um domínio ou motivo de proteína de ligação ao DNA.
A estrutura proteica da nuclease específica de sítio (ou o domínio de ligação de DNA fundido/ igado/amarrado) pode direcionar a nuclease específica de sítio para o sítio alvo.
De acordo com muitas dessas modalidades, nucleases específicas de sítio não guiadas por RNA, como recombinases, nucleases de dedo de zinco (ZFNs), meganucleases e TALENs, podem ser projetadas, engenheiradas e construídas de acordo com métodos conhecidos para atingir e se ligar a um sítio alvo no ou perto do locus genômico de um gene endógeno da GA oxidase de uma planta de milho, como o gene GA20 oxidase_3 ou o gene GA20 oxidase_5 gene no milho, para criar um DSB ou corte nesse locus genômico, para knockou ou knockdown da expressão do gene GA oxidase via reparo do DSB ou corte.
Por exemplo, uma nuclease específica de um sítio engenheirado, como uma recombinase, nuclease de dedo de zinco (ZFN), meganuclease ou TALEN, pode ser projetada para atingir e se ligar a (i) um sítio alvo dentro do genoma de uma planta correspondente a uma sequência dentro da SEQ ID Nº: 34, ou sua sequência complementar, para criar um DSB ou nick no locus genômico para o gene GA20 oxidase_3 (ii) um sítio alvo dentro do genoma de uma planta correspondente a uma sequência dentro da SEQ ID Nº: 35, ou sua sequência complementar, para criar um DSB ou corte no locus genômico para o gene GA20 oxidase_5, e/ou (iii) um sítio alvo dentro do genoma de uma planta correspondente a uma sequência dentro da SEQ ID Nº: 38, ou sua sequência complementar, para criar um DSB ou corte no locus genômico para o gene GA20 oxidase_4, que pode levar à criação de uma mutação ou inserção de uma sequência no sítio do DSB ou corte, através de mecanismos de reparo celular, que podem ser guiados por uma molécula ou modelo doador.
[0062] Em um aspecto, uma técnica de edição de genoma direcionada aqui descrita pode compreender o uso de uma recombinase.
Em algumas modalidades, uma tirosina recombinase ligada, etc., a um domínio ou motivo de reconhecimento de DNA pode ser selecionada do grupo que consiste em uma Cre recombinase, uma Flp recombinase e uma Tnp1 recombinase.
Em um aspecto, uma Cre recombinase ou uma Gin recombinase fornecida aqui pode ser amarrada a um domínio de ligação a DNA de dedo de zinco.
O sistema de recombinação direcionado ao sítio Flp-FRT pode vir do plasmídeo 2µ da levedura de padeiro Saccharomyces cerevisiae.
Neste sistema, a Flp recombinase (flippase) pode recombinar sequências entre os sítios alvo de reconhecimento da flippase (FRT). Os sítios de FRT compreendem 34 nucleotídeos.
Flp pode se ligar aos "braços" dos sítios de FRT (um braço está na orientação reversa) e cliva o sítio de FRT em cada extremidade de uma sequência de ácido nucleico interveniente.
Após a clivagem, Flp pode recombinar sequências de ácidos nucleicos entre dois sítios de FRT.
O Cre-lox é um sistema de recombinação direcionado ao sítio, derivado do bacteriófago P1, semelhante ao sistema de recombinação Flp-FRT.
O Cre-lox pode ser usado para inverter uma sequência de ácido nucleico, excluir uma sequência de ácido nucleico ou translocar uma sequência de ácido nucleico.
Neste sistema, a Cre recombinase pode recombinar um par de sequências de ácido nucleico lox.
Os sítios Lox compreendem 34 nucleotídeos, sendo o primeiro e o último 13 nucleotídeos (braços) palindrômicos.
Durante a recombinação, a proteína Cre recombinase se liga a dois sítios lox em diferentes ácidos nucléicos e cliva nos sítios lox.
Os ácidos nucleicos clivados são unidos (translocados reciprocamente) e a recombinação está completa.
Em outro aspecto, um sítio lox aqui fornecido é um sítio loxP, lox 2272, loxN, lox 511, lox 5171, lox71, lox66, M2, M3, M7 ou M11.
[0063] ZFNs são proteínas sintéticas que consistem em um domínio de ligação de DNA de dedo de zinco engenheirado fundido a um domínio de clivagem (ou um meio domínio de clivagem), que pode ser derivado de uma endonuclease de restrição (por exemplo, FokI). O domínio de ligação ao DNA pode ser canônico (C2H2) ou não canônico (por exemplo, C3H ou C4). O domínio de ligação ao DNA pode compreender um ou mais dedos de zinco (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou mais dedos de zinco), dependendo do sítio alvo.
Vários dedos de zinco em um domínio de ligação ao DNA podem ser separados por sequência(s) de ligação.
As ZFNs podem ser projetadas para clivar quase qualquer trecho de DNA de fita dupla pela modificação do domínio de ligação ao DNA do dedo de zinco.
As ZFNs formam dímeros a partir de monômeros compostos por um domínio de clivagem de DNA não específico (por exemplo, derivado da FokI nuclease) fundidos a um domínio de ligação a DNA compreendendo um arranjo de dedo de zinco engenheirado para ligar uma sequência de DNA do sítio alvo.
O domínio de ligação ao DNA de uma ZFN pode tipicamente ser composto por 3-4 (ou mais) dedos de zinco.
Os aminoácidos nas posições -1, +2, +3, e +6 em relação ao início da α-hélice do dedo de zinco, que contribui para a ligação específica de sítio ao sítio alvo, pode ser alterada e personalizada para se ajustar a sequências alvo específicas.
Os outros aminoácidos podem formar uma espinha dorsal de consenso para gerar ZFNs com diferentes especificidades de sequência.
Métodos e regras para projetar ZFNs para direcionamento e ligação a sequências alvo específicas são conhecidos na técnica.
Ver, por exemplo, Pedido de Patente U.S. 2005/0064474, 2009/0117617 e 2012/0142062, cujos conteúdos e divulgações são aqui incorporados por referência.
O domínio da FokI nuclease pode exigir dimerização para clivar o DNA e, portanto, são necessárias duas ZFNs com suas regiões C-terminais para ligar as fita de DNA opostas do sítio de clivagem (separadas por 5-
7 pb). O monômero ZFN pode cortar o sítio alvo se os sítios de ligação a dois ZF forem palindrômicos. Uma ZFN, como utilizado neste documento, é ampla e inclui uma ZFN monomérica que pode clivar o DNA de fita dupla sem assistência de outra ZFN. O termo ZFN também pode ser usado para se referir a um ou ambos os membros de um par de ZFNs que são projetados para trabalhar juntos para clivar o DNA no mesmo sítio.
[0064] Sem estar limitado por nenhuma teoria científica, porque as especificidades de ligação ao DNA dos domínios de dedos de zinco podem ser reprojetadas usando um dos vários métodos, teoricamente, ZFNs personalizados podem ser construídos para atingir quase qualquer sequência alvo (por exemplo, em ou perto de um gene GA oxidase em um genoma de planta). Os métodos publicamente disponíveis para engenharia de domínios de dedo de zinco incluem Montagem dependente de Contexto (CoDA), Engenharia de Grupo Oligomerizada (OPEN) e Montagem Modular. Em um aspecto, um método e/ou a composição aqui fornecida compreende uma ou mais, duas ou mais, três ou mais, quatro ou mais ou cinco ou mais ZFNs. Em outro aspecto, uma ZFN fornecida aqui é capaz de gerar um DSB ou corte direcionado. Em um aspecto, vetores compreendendo polinucleotídeos que codificam uma ou mais, dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais ou cinco ou mais ZFNs são fornecidos a uma célula por métodos de transformação conhecidos na técnica (por exemplo, sem estar limitado, transfecção viral, bombardeio de partículas, transfecção de protoplasto mediada por PEG ou transformação mediada por Agrobacterium). As ZFNs podem ser introduzidas como proteínas ZFN, como polinucleotídeos que codificam proteínas ZFN, e/ou como combinações de proteínas e polinucleotídeos que codificam proteínas.
[0065] As meganucleases, comumente identificadas em micróbios, como a família LAGLIDADG de endonucleases locais, são enzimas únicas com alta atividade e longas sequências de reconhecimento (> 14 pb) resultando na digestão específica de sítio do DNA alvo. Versões engenheiradas de meganucleases de ocorrência natural geralmente têm sequências de reconhecimento de DNA estendidas (por exemplo, 14 a 40 pb). De acordo com algumas modalidades, uma meganuclease pode compreender uma espinha dorsal ou enzima de base selecionada do grupo que consiste em I-CreI, I-CeuI, I-MsoI, I-SceI, I-AniI e I-DmoI. A engenharia de meganucleases pode ser mais desafiadora que as ZFNs e TALENs, porque as funções de reconhecimento e clivagem de DNA das meganucleases estão entrelaçadas em um único domínio. Métodos especializados de mutagênese e triagem de alto rendimento foram utilizados para criar novas variantes de meganucleases que reconhecem sequências únicas e possuem atividade aprimorada de nucleases. Assim, uma meganuclease pode ser selecionada ou engenheirada para se ligar a uma sequência alvo genômica em uma planta, como no ou próximo do locus genômico de um gene da GA oxidase. Em um aspecto, um método e/ou composição aqui fornecido compreende uma ou mais, duas ou mais, três ou mais, quatro ou mais ou cinco ou mais meganucleases. Em outro aspecto, uma meganuclease aqui fornecida é capaz de gerar um DSB direcionado. Em um aspecto, vetores compreendendo polinucleotídeos que codificam uma ou mais, duas ou mais, três ou mais, quatro ou mais ou cinco ou mais meganucleases são fornecidos a uma célula por métodos de transformação conhecidos na técnica (por exemplo, sem estar limitado, transfecção viral, bombardeio de partículas, transfecção de protoplastos mediada por PEG ou transformação mediada por Agrobacterium).
[0066] TALENs são enzimas de restrição artificiais geradas pela fusão do domínio de ligação ao DNA efetor do tipo ativador de transcrição (TALE) a um domínio de nuclease (por exemplo, FokI).
Quando cada membro de um par TALEN se liga aos sítios de DNA que flanqueiam um sítio alvo, os monômeros FokI dimerizam e causam uma quebra de DNA de fita dupla no sítio alvo. Além do domínio de clivagem FokI tipo selvagem, variantes do domínio de clivagem FokI com mutações foram projetadas para melhorar a especificidade de clivagem e a atividade de clivagem. As funções de domínio de FokI como um dímero, requerendo dois construtos com domínios de ligação de DNA únicos para sítios no genoma alvo com orientação e espaçamento adequados. Tanto o número de resíduos de aminoácidos entre o domínio de ligação ao DNA de TALEN quanto o domínio de clivagem de FokI e o número de bases entre os dois sítios de ligação de TALEN individuais são parâmetros para alcançar níveis elevados de atividade.
[0067] TALENs são enzimas de restrição artificiais geradas pela fusão do domínio de ligação ao DNA efetor do tipo ativador de transcrição (TALE) a um domínio de nuclease. Em alguns aspectos, a nuclease é selecionada de um grupo que consiste em PvuII, MutH, TevI, FokI, AlwI, MlyI, SbfI, SdaI, StsI, CleDORF, Clo051, e Pept071. Quando cada membro de um par TALEN se liga aos sítios de DNA que flanqueiam um sítio alvo, os monômeros FokI dimerizam e causam uma quebra de DNA de fita dupla no sítio alvo. O termo TALEN, como aqui utilizado, é amplo e inclui um TALEN monomérico que pode clivar o DNA de fita dupla sem a assistência de outro TALEN. O termo TALEN também se refere a um ou ambos os membros de um par de TALENs que trabalham juntos para clivar o DNA no mesmo sítio.
[0068] Os efetores do tipo ativador de transcrição (TALEs) podem ser projetados para ligar praticamente qualquer sequência de DNA, como no ou próximo do locus genômico de um gene GA oxidase em uma planta. TALE possui um domínio central de ligação ao DNA composto por 13-28 monômeros repetidos de 33-34 aminoácidos. Os aminoácidos de cada monômero são altamente conservados, exceto os resíduos de aminoácidos hipervariáveis nas posições 12 e 13. Os dois aminoácidos variáveis são chamados di-resíduos de repetição variável (RVDs). Os pares de aminoácidos NI, NG, HD e NN dos RVDs preferencialmente reconhecem adenina, timina, citosina e guanina/adenina, respectivamente, e a modulação de RVDs pode reconhecer bases consecutivas de DNA. Essa relação simples entre a sequência de aminoácidos e o reconhecimento de DNA permitiu a engenharia de domínios de ligação a DNA específicos, selecionando uma combinação de segmentos de repetição contendo os RVDs apropriados.
[0069] Além do domínio de clivagem de FokI tipo selvagem, variantes do domínio de clivagem de FokI com mutações foram projetadas para melhorar a especificidade de clivagem e a atividade de clivagem. As funções de domínio de FokI como um dímero, requerendo dois construtos com domínios de ligação de DNA únicos para sítios no genoma alvo com orientação e espaçamento adequados. Tanto o número de resíduos de aminoácidos entre o domínio de ligação ao DNA de TALEN quanto o domínio de clivagem FokI e o número de bases entre os dois sítios de ligação de TALEN individuais são parâmetros para alcançar níveis elevados de atividade. Domínios de clivagem de PvuII, MutH, e TevI são alternativas úteis para variantes de FokI e FokI para uso com TALEs. PvuII funciona como um domínio de clivagem altamente específico quando acoplado a um TALE (ver Yank et al. 2013. PLoS One. 8: e82539). MutH é capaz de introduzir cortes específicos de fita no DNA (ver Gabsalilow et al. 2013. Nucleic Acids Research. 41: e83). TevI introduz quebras de fita dupla no DNA nos sítios direcionados (ver Beurdeley et al., 2013. Nature Communications. 4: 1762).
[0070] A relação entre a sequência de aminoácidos e o reconhecimento de DNA do domínio de ligação TALE permite proteínas projetáveis. Programas de software como o DNA Works podem ser usados para projetar construtos TALE. Outros métodos de conceber construtos TALE são conhecidos dos versados na técnica. Ver Doyle et al., Nucleic Acids Research (2012)40: W117-122.; Cermak et al., Nucleic Acids Research (2011). 39:e82; e tale-nt.cac.cornell.edu/about. Em um aspecto, um método e/ou a composição aqui fornecida compreende uma ou mais, duas ou mais, três ou mais, quatro ou mais ou cinco ou mais TALENs. Em outro aspecto, um TALEN aqui fornecido é capaz de gerar um DSB direcionado. Em um aspecto, vetores compreendendo polinucleotídeos que codificam uma ou mais, duas ou mais, três ou mais, quatro ou mais ou cinco ou mais TALENs são fornecidos a uma célula por métodos de transformação conhecidos na técnica (por exemplo, sem estar limitado, transfecção viral, bombardeio de partículas, transfecção de protoplastos mediada por PEG ou transformação mediada por Agrobacterium). Ver, por exemplo, Pedido de Patente U.S. 2011/0145940, 2011/0301073, e 2013/0117869, cujos conteúdos e divulgações são aqui incorporados por referência.
[0071] Como utilizado neste documento, uma "técnica de edição de genoma direcionada" refere-se a qualquer método, protocolo ou técnica que permita a edição precisa e/ou direcionada de um local específico no genoma de uma planta (isto é, a edição é ampla ou completamente não aleatória) usando uma nuclease específica de sítio, como uma meganuclease, uma nuclease de dedo de zinco (ZFN), uma endonuclease guiada por RNA (por exemplo, o sistema CRISPR/Cas9), uma endonuclease TALE (TALEN), uma recombinase ou uma transposase. Como utilizado neste documento, "edição" ou "edição do genoma" refere-se à geração de uma mutação, deleção, inversão ou substituição direcionada de pelo menos 1, pelo menos 2, pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 6, em pelo menos 7, pelo menos 8, pelo menos 9, pelo menos 10, pelo menos 15, pelo menos 20, pelo menos 25, pelo menos 30, pelo menos 35, pelo menos 40, pelo menos 45, pelo menos 50, pelo menos 75, pelo menos 100, pelo menos 250, pelo menos 500, pelo menos 1000, pelo menos 2500, pelo menos 5000, pelo menos 10.000 ou pelo menos 25.000 nucleotídeos de uma sequência de ácido nucleico de genoma de planta endógena. Como utilizado neste documento, "edição" ou "edição do genoma" também abrange a inserção direcionada ou integração direcionada ao sítio de pelo menos 1, pelo menos 2, pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 6, pelo menos 7, pelo menos 8, pelo menos 9, pelo menos 10, pelo menos 15, pelo menos 20, pelo menos 25, pelo menos 30, pelo menos 35, pelo menos 40, pelo menos 45, pelo menos 50, pelo menos 75, pelo menos pelo menos 100, pelo menos 250, pelo menos 500, pelo menos 750, pelo menos 1000, pelo menos 1500, pelo menos 2000, pelo menos 2500, pelo menos 3000, pelo menos 4000, pelo menos 5000, pelo menos 10.000 ou pelo menos 25.000 nucleotídeos no genoma endógeno de uma planta. Uma "edição" ou "edição genômica" no singular refere-se a uma dessas mutações, deleções, inversões, substituições ou inserções direcionadas, enquanto "edições" ou "edições genômicas" se referem a duas ou mais mutação(ões), deleção(ões), inversão(ões), substituição(ões) e/ou inserção(ões), com cada "edição" sendo introduzida através de uma técnica de edição de genoma direcionada.
[0072] Em um aspecto, abordagens de edição de genes direcionadas são usadas para modificar a sequência promotora e/ou região(ões) regulatória(s) de um ou mais dos genes GA20 oxidase_3 e/ou GA20 oxidase_5 para expressão knock-down ou knock-out deste(s) gene(s), tal como através de deleções, inserções, mutações direcionadas ou outras alterações de sequência. De fato, a(s) região(ões) ou sequência(s) promotora(s) e/ou regulatória(s), ou a 5'- UTR, 3'UTR e/ou sequência(s) de íntron, de um ou mais dos genes GA20 oxidase_3 e/ou GA20 oxidase_5 pode ser amplamente excluído ou sofrer mutação. Alternativamente, toda ou uma porção da(s) sequência(s) de codificação (éxon), 5-UTR, 3'UTR e/ou íntron de um ou mais dos genes GA20 oxidase_3 e/ou GA20 oxidase_5 podem ser editados, deletados, mutados ou de outro modo modificado para expressão ou atividade knock-down ou knock-out desses genes. Tais modificações direcionadas ao loci de genes GA20 oxidase_3 e/ou GA20 oxidase_5 podem ser alcançadas usando qualquer tecnologia de edição de genoma adequada conhecida na técnica, como por meio do reparo de uma quebra de fita dupla (DSB) ou corte introduzida por uma nuclease específica de sítio, como, por exemplo, uma nuclease de dedo de zinco, uma meganuclease engenheirada ou nativa, uma TALE- endonuclease ou uma endonuclease guiada por RNA (por exemplo, Cas9 ou Cpf1). Esse reparo do DSB ou corte pode introduzir deleções, adições, mutações etc. espontâneas ou estocásticas, no sítio direcionado em que o DSB ou corte foi introduzido, ou o reparo do sítio pode envolver o uso de uma molécula de modelo de doador para direcionar ou causar uma deleção, adição, mutação etc. preferida ou específica no sítio direcionado.
[0073] Para os fins da presente invenção, uma "planta" pode incluir um explante, parte de planta, muda, plântula ou planta inteira em qualquer estágio de regeneração ou desenvolvimento. Como utilizado neste documento, uma "parte de planta" pode referir-se a qualquer órgão ou tecido intacto de uma planta, como um meristema, órgão/estrutura de broto (por exemplo, folha, caule ou nó), raiz, flor ou órgão/estrutura floral (por exemplo, bráctea, sépala, pétala, estame, carpelo, antera e óvulo), semente (por exemplo, embrião, endosperma e tegumento da semente), fruta (por exemplo, o ovário maduro), propágulo ou outros tecidos de planta (por exemplo, tecido vascular, tecido dérmico, tecido moído e semelhantes), ou qualquer porção dos mesmos. As partes de planta da presente divulgação podem ser viáveis,
não viáveis, regeneráveis e/ou não regeneráveis. Um "propágulo" pode incluir qualquer parte de planta que é capaz de crescer até formar uma planta inteira.
[0074] De acordo com algumas modalidades, uma planta modificada pode ser plantada em uma densidade no campo (plantas por terreno/área de campo) que é de pelo menos 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 50%, 75%, 100%, 125%, 150%, 175%, 200%, 225% ou 250% maior do que a densidade de plantio normal para aquela planta de acordo com as práticas agronômicas padrão. Uma planta modificada pode ser plantada em uma densidade no campo de pelo menos 38.000 plantas por acre, pelo menos 40.000 plantas por acre, pelo menos 42.000 plantas por acre, pelo menos 44.000 plantas por acre, pelo menos
45.000 plantas por acre, pelo menos 46.000 plantas por acre, pelo menos 48.000 plantas por acre, 50.000 plantas por acre, pelo menos
52.000 plantas por acre, pelo menos 54.000 por acre, ou pelo menos
56.000 plantas por acre. Como um exemplo, as plantas de milho podem ser plantadas em uma densidade mais alta, tal como em uma faixa de cerca de 38.000 plantas por acre a cerca de 60.000 plantas por acre, ou cerca de 40.000 plantas por acre a cerca de 58.000 plantas por acre, ou cerca de 42.000 plantas por acre para cerca de 58.000 plantas por acre, ou cerca de 40.000 plantas por acre para cerca de 45.000 plantas por acre, ou cerca de 45.000 plantas por acre para cerca de 50.000 plantas por acre, ou cerca de 50.000 plantas por acre para cerca de 58.000 plantas por acre, ou cerca de 52.000 plantas por acre a cerca de 56.000 plantas por acre, ou cerca de 38.000 plantas por acre, cerca de 42.000 plantas por acre, cerca de 46.000 plantas por acre, ou cerca de 48.000 plantas por acre, cerca de 50.000 plantas por acre, ou cerca de 52.000 plantas por acre, ou cerca de 54.000 plantas por acre, em oposição a uma faixa de densidade padrão, como cerca de 18.000 plantas por acre a cerca de 38.000 plantas por acre.
[0075] De acordo com modalidades da presente divulgação, é/são fornecida(s) uma(s) planta(s) de milho modificada(s) que compreende(m) (i) uma altura de planta inferior a 2000 mm, inferior a 1950 mm, inferior a 1900 mm, inferior a 1850 mm, inferior a 1800 mm, inferior a 1750 mm, inferior a 1700 mm, inferior a 1650 mm, inferior a 1600 mm, inferior a 1550 mm, inferior a 1500 mm, inferior a 1450 mm, inferior a 1400 mm, inferior a 1350 mm, inferior a 1300 mm, inferior a 1250 mm, inferior a 1200 mm, inferior a 1150 mm, inferior a 1100 mm, inferior a 1050 mm ou inferior a 1000 mm e/ou (ii) diâmetro médio da haste ou caule de pelo menos 18 mm, pelo menos 18,5 mm, pelo menos 19 mm, pelo menos 19,5 mm, pelo menos 20 mm, pelo menos 20,5 mm, pelo menos 21 mm, pelo menos 21,5 mm ou pelo menos 22 mm.
De maneira diferente, é/são fornecida(s) uma(s) planta(s) de milho modificada(s) que compreende(m) uma altura de planta inferior a 2000 mm, inferior a 1950 mm, inferior a 1900 mm, inferior a 1850 mm, inferior a 1800 mm, inferior a 1750 mm, inferior a 1700 mm, inferior a 1650 mm, inferior a 1600 mm, inferior a 1550 mm, inferior a 1500 mm, inferior a 1450 mm, inferior a 1400 mm, inferior a 1350 mm, inferior a 1300 mm, inferior a 1250 mm, inferior a 1200 mm, inferior a 1150 mm, inferior a 1100 mm, inferior a 1050 mm ou inferior a 1000 mm e/ou diâmetro médio da haste ou caule superior a 18 mm, superior a 18,5 mm, superior a 19 mm, superior a 19,5 mm, superior a 20 mm, superior a 20,5 mm, superior a 21 mm, superior a 21,5 mm ou superior a 22 mm.
Qualquer traço ou faixa da altura da planta expressa em milímetros (mm) pode ser convertida em uma unidade de medida diferente com base em conversões conhecidas (por exemplo, uma polegada é igual a 2,54 cm ou 25,4 milímetros e milímetros (mm), centímetros (cm) e metros (m) diferem apenas em uma ou mais potências de dez). Assim, qualquer medida aqui fornecida é ainda descrita em termos de quaisquer outras unidades de medida comparáveis de acordo com conversões conhecidas e estabelecidas. No entanto, a altura exata da planta e/ou diâmetro do caule de uma planta de milho modificada pode depender do ambiente e do fundo genético. Assim, a mudança na altura da planta e/ou diâmetro do caule de uma planta de milho modificada pode, em vez disso, ser descrito em termos de uma diferença mínima ou variação porcentual em relação a uma planta de controle. Uma planta de milho modificada pode ainda compreender pelo menos uma espiga que está substancialmente livre de tecidos ou estruturas reprodutivas macho ou outros tipos estranhos.
[0076] De acordo com modalidades da presente divulgação, são fornecidas plantas de milho modificadas que compreendem uma altura de planta durante os estágios vegetativos e/ou reprodutivos tardios de desenvolvimento (por exemplo, no estágio R3) entre entre 1000 mm e 1800mm, entre 1000 mm e 1700 mm, entre 1050 mm e 1700 mm, entre 1100 mm e 1700 mm, entre 1150 mm e 1700 mm, entre 1200 mm e 1700 mm, entre 1250 mm e 1700 mm, entre 1300 mm e 1700 mm, entre 1350 mm e 1700 mm, entre 1400 mm e 1700 mm, entre 1450 mm e 1700 mm, entre 1000 mm e 1500 mm, entre 1050 mm e 1500 mm, entre 1100 mm e 1500 mm, entre 1150 mm e 1500 mm, entre 1200 mm e 1500 mm, entre 1250 mm e 1500 mm, entre 1300 mm e 1500 mm, entre 1350 mm e 1500 mm, entre 1400 mm e 1500 mm, entre 1450 mm e 1500 mm, entre 1000 mm e 1600 mm, entre 1100 mm e 1600 mm, entre 1200 mm e 1600 mm, entre 1300 mm e 1600 mm, entre 1350 mm e 1600 mm, entre 1400 mm e 1600 mm, entre 1450 mm e 1600 mm, entre 1000 mm e 2000 mm, entre 1200 mm e 2000 mm, entre 1200 mm e 1800 mm, entre 1300 mm e 1700 mm, entre 1400 mm e 1700 mm, entre 1400 mm e 1600 mm, entre 1400 mm e 1700 mm, entre 1400 mm e 1800 mm, entre 1400 mm e 1900 mm, entre 1400 mm e 2000 mm, ou entre 1200 mm e 2500 mm e/ou um diâmetro de caule médio entre 17,5 mm e 22 mm, entre 18 mm e 22 mm, entre 18,5 e 22 mm, entre 19 mm e 22 mm, entre 19,5 mm e 22 mm, entre 20 mm e 22 mm, entre 20,5 mm e 22 mm, entre 21 mm e 22 mm, entre 21,5 mm e 22 mm, entre 17,5 mm e 21 mm, entre 17,5 mm e 20 mm, entre 17,5 mm e 19 mm, entre 17,5 mm e 18 mm, entre 18 mm e 21 mm, entre 18 mm e 20 mm ou entre 18 mm e 19 mm. Uma planta de milho modificada pode estar substancialmente livre de tipos estranhos, como tecidos ou estruturas reprodutivas macho em uma ou mais espigas da planta de milho modificada.
[0077] De acordo com modalidades da presente divulgação, plantas de milho modificadas são fornecidas que têm (i) uma altura de planta que é pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70% ou pelo menos 75% inferior à altura de uma planta tipo selvagem ou controle, e/ou (ii) um diâmetro de haste ou caule que é pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, em pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 100% maior que o diâmetro deo caule da planta tipo selvagem ou controle. De acordo com as modalidades da presente divulgação, uma planta de milho modificada pode ter uma altura de planta reduzida que não é superior a 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55% ou 60% inferior à altura de uma planta tipo selvagem ou controle e/ou um diâmetro do caule ou haste que é inferior a (ou não mais que) 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 100% maior do que o diâmetro do caule ou haste de um tipo selvagem ou planta de controle. Por exemplo, uma planta modificada pode ter (i) uma altura de planta que é pelo menos 10%, pelo menos 15%, ou pelo menos 20% menor ou mais curta (ou seja, maior ou igual a 10%, 15% ou 20% menor), mas não maior ou superior a 50% mais curta do que uma planta tipo selvagem ou controle, e/ou (ii) um diâmetro de caule ou haste que seja pelo menos 5%, pelo menos 10% ou pelo menos 15% maior, mas não superior a 30%, 35% ou 40% maior do que um tipo selvagem ou planta controle. Para maior clareza, as frases "pelo menos 20% mais curto" e "maior ou igual a 20% mais curto" excluiriam, por exemplo, 10% mais curto. Da mesma forma, para maior clareza, as frases "não superior a 50% mais curto", "não superior a 50% mais curto" e "não superior a 50% mais curto" excluiria 60% mais curto; a frase "pelo menos 5% maior" excluiria 2% maior; e as frases "não mais que 30% maior" e "não mais que 30% maior" excluiriam 40% maior.
[0078] De acordo com modalidades da presente divulgação, são fornecidas plantas de milho modificadas que compreendem uma altura entre 5% e 75%, entre 5% e 50%, entre 10% e 70%, entre 10% e 65%, entre 10% e 60%, entre 10% e 55%, entre 10% e 50%, entre 10% e 45%, entre 10% e 40%, entre 10% e 35%, entre 10% e 30%, entre 10% e 25%, entre 10% e 20%, entre 10% e 15%, entre 10% e 10%, entre 10% e 75%, entre 25% e 75%, entre 10% e 50%, entre 20% e 50%, entre 25% e 50%, entre 30% e 75%, entre 30% e 50%, entre 25% e 50%, entre 15% e 50%, entre 20% e 50%, entre 25% e 45%, ou entre 30% e 45% menor que a altura de uma planta selvagem ou de controle, e/ou um diâmetro da haste ou caule que está entre 5% e 100%, entre 5% e 95%, entre 5% e 90%, entre 5% e 85%, entre 5% e 80%, entre 5% e 75%, entre 5% e 70%, entre 5% e 65%, entre 5% e 60%, entre 5% e 55%, entre 5% e 50%, entre 5% e 45%, entre 5% e 40%, entre 5% e 35%, entre 5% e 30%, entre 5% e 25%, entre 5% e 20%, entre 5% e 15%, entre 5% e 10%, entre 10% e 100%, entre 10% e 75%, entre 10% e 50%, entre 10% e 40%, entre 10% e 30%, entre 10% e 20%, entre
25% e 75%, entre 25% e 50%, entre 50% e 75%, entre 8% e 20%, ou entre 8% e 15% maior que o diâmetro do caule ou haste da planta selvagem ou de controle.
[0079] De acordo com modalidades da presente divulgação, plantas de milho modificadas são fornecidas que compreendem um comprimento médio de Internodo (ou um comprimento de Internodo menos 2 e/ou comprimento de Internodo menos 4 em relação à posição da espiga) que é de pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, ou pelo menos 75% inferior ao mesmo comprimento de Internodo ou comprimento médio de uma planta tipo selvagem ou controle. O "Internodo menos 2" de uma planta de milho refere-se ao segundo Internodo abaixo da espiga da planta e o "Internodo menos 4" de uma planta de milho refere- se ao quarto Internodo abaixo da espiga da planta De acordo com muitas modalidades, plantas de milho modificadas são fornecidas com um comprimento médio de Internodos (ou um comprimento de Internodo de menos 2 e/ou comprimento de Internodo de menos 4 em relação à posição da espiga) que fica entre 5% e 75%, entre 5% e 50%, entre 10% e 70%, entre 10% e 65%, entre 10% e 60%, entre 10% e 55%, entre 10% e 50%, entre 10% e 45%, entre 10% e 40%, entre 10% e 35%, entre 10% e 30%, entre 10% e 25%, entre 10% e 20%, entre 10% e 15%, entre 10% e 10%, entre 10% e 75%, entre 25% e 75%, entre 10% e 50%, entre 20% e 50%, entre 25% e 50%, entre 30% e 75%, entre 30% e 50%, entre 25% e 50%, entre 15% e 50%, entre 20% e 50%, entre 25% e 45%, ou entre 30% e 45% menor que o comprimento igual ou médio dos Internodos de uma planta selvagem ou de controle.
[0080] De acordo com modalidades da presente divulgação, plantas de milho modificadas são fornecidas que compreendem um peso de espiga (individualmente ou em média) que é pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 100% maior do que o peso da espiga de uma planta tipo selvagem ou controle. Uma planta de milho modificada aqui fornecida pode compreender um peso de espiga que está entre 5% e 100%, entre 5% e 95%, entre 5% e 90%, entre 5% e 85%, entre 5% e 80%, entre 5 % e 75%, entre 5% e 70%, entre 5% e 65%, entre 5% e 60%, entre 5% e 55%, entre 5% e 50%, entre 5% e 45%, entre 5% e 40%, entre 5% e 35%, entre 5% e 30%, entre 5% e 25%, entre 5% e 20%, entre 5% e 15%, entre 5% e 10%, entre 10% e 100%, entre 10% e 75%, entre 10% e 50%, entre 25% e 75%, entre 25% e 50%, ou entre 50% e 75% maior do que o peso da espiga de uma planta tipo selvagem ou controle.
[0081] De acordo com as modalidades da presente divulgação, são fornecidas plantas de milho modificadas que têm um índice de colheita de pelo menos 0,57, pelo menos 0,58, pelo menos 0,59, pelo menos 0,60, pelo menos 0,61, pelo menos 0,62, pelo menos 0,63, pelo menos 0,64, ou pelo menos 0,65 (ou maior). Uma planta de milho modificada pode compreender um índice de colheita entre 0,57 e 0,65, entre 0,57 e 0,64, entre 0,57 e 0,63, entre 0,57 e 0,62, entre 0,57 e 0,61, entre 0,57 e 0,60, entre 0,57 e 0,59, entre 0,57 e 0,58, entre 0,58 e 0,65, entre 0,59 e 0,65 ou entre 0,60 e 0,65. Uma planta de milho modificada pode ter um índice de colheita de pelo menos 1%, pelo menos 2%, pelo menos 3%, pelo menos 4%, pelo menos 5%, pelo menos 6%, pelo menos 7%, pelo menos 8%, pelo menos 9%, pelo menos 10%, pelo menos 11%, pelo menos 12%, pelo menos 13%, pelo menos 14%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35%,
pelo menos 40%, pelo menos 45% ou pelo menos 50% maior do que o índice de colheita de uma planta tipo selvagem ou controle. Uma planta de milho modificada pode ter um índice de colheita que fica entre 1% e 45%, entre 1% e 40%, entre 1% e 35%, entre 1% e 30%, entre 1% e 25%, entre 1% e 20%, entre 1% e 15%, entre 1% e 14%, entre 1% e 13%, entre 1% e 12%, entre 1% e 11%, entre 1% e 10%, entre 1% e 9%, entre 1% e 8%, entre 1% e 7%, entre 1% e 6%, entre 1% e 5%, entre 1% e 4%, entre 1% e 3%, entre 1% e 2%, entre 5% e 15%, entre 5% e 20%, entre 5% e 30%, ou entre 5% e 40% maior que o índice de colheita de uma planta tipo selvagem ou controle.
[0082] De acordo com as modalidades da presente divulgação, plantas de milho modificadas são fornecidas com um aumento no rendimento colhido de pelo menos 1 alqueire por acre, pelo menos 2 alqueires por acre, pelo menos 3 alqueires por acre, pelo menos 4 alqueires por acre, em pelo menos 5 alqueires por acre, pelo menos 6 alqueires por acre, pelo menos 7 alqueires por acre, pelo menos 8 alqueires por acre, pelo menos 9 alqueires por acre, ou pelo menos 10 alqueires por acre, em relação a uma planta tipo selvagem ou controle. Uma planta de milho modificada pode ter um aumento no rendimento colhido entre 1 e 10, entre 1 e 8, entre 2 e 8, entre 2 e 6, entre 2 e 5, entre 2,5 e 4,5, ou entre 3 e 4 alqueires por acre. Uma planta de milho modificada pode ter um aumento no rendimento colhido de pelo menos 1%, pelo menos 2%, pelo menos 3%, pelo menos 4%, pelo menos 5%, pelo menos 6%, pelo menos 7%, pelo menos 8%, pelo menos 9%, pelo menos 10%, pelo menos 11%, pelo menos 12%, pelo menos 13%, pelo menos 14%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, ou pelo menos 25% maior que o rendimento colhido de uma planta tipo selvagem ou controle. Uma planta de milho modificada pode ter um rendimento colhido que está entre 1% e 25%, entre 1% e 20%, entre 1% e 15%, entre 1% e 14%, entre 1% e 13%, entre 1% e 12%, entre 1% e 11%,
entre 1% e 10%, entre 1% e 9%, entre 1% e 8%, entre 1% e 7%, entre 1% e 6%, entre 1% e 5 %, entre 1% e 4%, entre 1% e 3%, entre 1% e 2%, entre 5% e 15%, entre 5% e 20%, entre 5% e 25%, entre 2% e 10%, entre 2% e 9%, entre 2% e 8%, entre 2% e 7%, entre 2% e 6%, entre 2% e 5%, ou entre 2% e 4% maior do que o rendimento colhido de um planta tipo selvagem ou controle.
[0083] De acordo com modalidades da presente divulgação, uma planta de milho modificada é fornecida que tem uma frequência de alojamento que é pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% menos ou inferior a uma planta tipo selvagem ou controle. Uma planta de milho modificada pode ter uma frequência de alojamento que está entre 5% e 100%, entre 5% e 95%, entre 5% e 90%, entre 5% e 85%, entre 5% e 80%, entre 5% e 75%, entre 5% e 70%, entre 5% e 65%, entre 5% e 60%, entre 5% e 55%, entre 5% e 50%, entre 5% e 45%, entre 5% e 40%, entre 5% e 35%, entre 5% e 30%, entre 5% e 25%, entre 5% e 20%, entre 5% e 15%, entre 5% e 10%, entre 10% e 100%, entre 10% e 75%, entre 10% e 50%, entre 10% e 40%, entre 10% e 30%, entre 10% e 20%, entre 25% e 75%, entre 25% e 50%, ou entre 50% e 75% menos ou inferior a uma planta tipo selvagem ou controle. Além disso, são fornecidas populações de plantas de milho com maior resistência ao alojamento e uma frequência de alojamento reduzida. As populações de plantas de milho modificadas são fornecidas com uma frequência de alojamento que é pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100% menos ou inferior a uma população de plantas tipo selvagem ou controle. Uma população de plantas de milho modificadas pode compreender uma frequência de alojamento que está entre 5% e 100%, entre 5% e 95%, entre 5% e 90%, entre 5% e 85%, entre 5% e 80%, entre 5% e 75%, entre 5% e 70%, entre 5% e 65%, entre 5% e 60%, entre 5% e 55%, entre 5% e 50%, entre 5% e 45%, entre 5% e 40%, entre 5% e 35%, entre 5% e 30%, entre 5% e 25%, entre 5% e 20%, entre 5% e 15%, entre 5% e 10%, entre 10% e 100%, entre 10% e 75%, entre 10% e 50%, entre 10% e 40%, entre 10% e 30%, entre 10% e 20%, entre 25% e 75%, entre 25% e 50%, ou entre 50% e 75% menos ou inferior a uma população de plantas selvagens ou de controle, que pode ser expressa como média em um número especificado de plantas ou área de cultivo de igual densidade.
[0084] De acordo com as modalidades da presente divulgação, as plantas de milho modificadas são fornecidas com uma altura de planta significativamente reduzida ou diminuída (por exemplo, 2.000 mm ou menos) e um diâmetro do caule significativamente aumentado (por exemplo, 18 mm ou mais), em relação a uma planta tipo selvagem ou controle. De acordo com essas modalidades, a diminuição ou redução na altura da planta e o aumento no diâmetro do caule podem estar dentro de qualquer uma das faixas de altura, diâmetro ou porcentagem aqui citadas. Tais plantas de milho modificadas tendo uma altura de planta reduzida e diâmetro de caule aumentado em relação a uma planta tipo selvagem ou controle podem ser transformadas com uma sequência de DNA transcritível que codifica uma molécula de RNA não codificante que direciona pelo menos um gene GA20 oxidase para supressão. Plantas de milho modificadas com uma altura de planta significativamente reduzida e/ou um diâmetro de caule significativamente aumentado em relação a uma planta tipo selvagem ou controle podem ainda ter pelo menos uma espiga que é substancialmente livre de tecidos reprodutivos macho ou estruturas e/ou outros tipos estranhos. Plantas de milho modificadas com uma altura de planta significativamente reduzida e/ou um diâmetro de caule aumentado em relação a uma planta tipo selvagem ou controle podem ter atividade reduzida de um ou mais gene(s) de GA20 oxidase e/ou GA3 oxidase em um ou mais tecido(s) da planta, tal como um ou mais tecidos vasculares e/ou foliares da planta, em relação ao(s) mesmo(s) tecido(s) da planta tipo selvagem ou controle. De acordo com muitas modalidades, as plantas de milho modificadas podem compreender pelo menos um polinucleotídeo ou sequência de DNA transcritível que codifica uma molécula de RNA não codificante operacionalmente ligada a um promotor, que pode ser um promotor constitutivo, específico de tecido ou preferido de tecido, em que a molécula de RNA não codificante direciona pelo menos uma oxidase GA20 para supressão, conforme fornecido aqui. A molécula de RNA não codificante pode ser um miRNA, siRNA ou miRNA ou molécula precursora de siRNA. De acordo com algumas modalidades, as plantas de milho modificadas com uma altura de planta significativamente reduzida e/ou um diâmetro de caule aumentado em relação a uma planta tipo selvagem ou controle podem ainda ter um índice de colheita aumentado e/ou resistência de alojamento aumentada em relação à planta tipo selvagem ou controle.
[0085] Plantas de milho modificadas com uma altura de planta significativamente reduzida e/ou um diâmetro de caule significativamente aumentado em relação a uma planta tipo selvagem ou controle podem compreender uma mutação (por exemplo, uma inserção, deleção, substituição, etc.) em um gene GA oxidase introduzido através de uma tecnologia de edição de gene ou outra técnica de mutagênese, em que a expressão do gene GA oxidase é reduzida ou eliminada em um ou mais tecidos da planta modificada. Tais plantas de milho modificadas tendo uma altura de planta reduzida e/ou um diâmetro de caule aumentado em relação a uma planta tipo selvagem ou controle podem ainda ter um índice de colheita aumentado e/ou resistência ao alojamento aumentada em relação à planta tipo selvagem ou controle. Tais plantas de milho modificadas podem estar substancialmente livres de tipos estranhos, como tecidos ou estruturas reprodutivas macho e/ou outros tipos estranhos em pelo menos uma espiga das plantas modificadas. As técnicas de mutagênese de plantas (excluindo edição de genoma) podem incluir mutagênese química (isto é, tratamento com um mutagênico químico, como uma azida, hidroxilamina, ácido nitroso, acridina, análogo de base de nucleotídeo ou agente alquilante - por exemplo, EMS (sulfonato de etilmetano), MNU (N-metil-N-nitrosoureia), etc.), mutagênese física (por exemplo, raios gama, raios-X, UV, feixe de íons, outras formas de radiação, etc.) e mutagênese de inserção (por exemplo, transposon ou inserção de T- DNA). As plantas ou várias partes de planta, tecidos de planta ou células de planta podem estar sujeitos à mutagênese. As plantas tratadas podem ser reproduzidas para coletar sementes ou produzir uma planta progenitor, e partes de plantas tratadas, tecidos de planta ou células de planta podem ser desenvolvidas ou regeneradas em plantas ou outros tecidos de plantas. Mutações geradas com técnicas de mutagênese química ou física podem incluir uma mutação de mudança de estrutura, sem sentido ou de sentido incompatível, levando à perda da função ou expressão de um gene alvo, como um gene oxidase GA3 ou GA20.
[0086] Um método para a mutagênese de um gene é chamado "TILLING" (para direcionar lesões locais induzidas em genomas), em que as mutações são criadas em uma célula ou tecido de planta, preferencialmente na semente, tecido reprodutivo ou linhagem germinativa de uma planta, por exemplo, usando um mutagênico, como um tratamento EMS. As plantas resultantes são cultivadas e autofertilizadas, e a progênie é usada para preparar amostras de DNA. A amplificação por PCR e o sequenciamento de uma sequência de ácido nucleico de um gene da GA oxidase pode ser usada para identificar se uma planta mutada tem uma mutação no gene da GA oxidase. As plantas com mutações no gene da GA oxidase podem então ser testadas quanto a um traço alterado, como redução da altura da planta. Alternativamente, as plantas mutagenizadas podem ser testadas para um traço alterado, como altura reduzida da planta, e então a amplificação por PCR e o sequenciamento de uma sequência de ácido nucleico de um gene da GA oxidase pode ser usada para determinar se uma planta com o traço alterado também tem uma mutação no gene da GA oxidase. Ver, por exemplo, Colbert et al., 2001, PlantPhysiol 126:480-484; e McCallum et al., 2000, Nature Biotechnology 18:455-
457. TILLING pode ser usado para identificar mutações que alteram a expressão de um gene ou a atividade de proteínas codificadas por um gene, que pode ser usado para introduzir e selecionar uma mutação direcionada em um gene de GA oxidase de uma planta de milho.
[0087] As plantas de milho que foram submetidas a um tratamento de mutagênese ou edição de genoma podem ser rastreadas e selecionadas com base em um fenótipo observável (por exemplo, qualquer fenótipo aqui descrito, como altura de planta mais curta, diâmetro de haste/caule aumentado, etc.) ou usando um agente de seleção com um marcador selecionável (por exemplo, herbicida, etc.), um marcador rastreável ou uma técnica molecular (por exemplo, níveis mais baixos de GA, níveis de proteína ou transcrito de GA oxidase mais baixos, presença de transgene ou sequência transcritível, etc.). Essa triagem e/ou técnicas de seleção podem ser usadas para identificar e selecionar plantas com uma mutação em um gene da GA oxidase que leva a um fenótipo de planta desejável.
[0088] De acordo com modalidades da presente divulgação, é fornecida uma população de plantas de milho modificadas, em que a população de plantas de milho modificadas tem uma altura média de planta significativamente menor, e/ou diâmetro médio da haste ou caule significativamente maior do que uma população de plantas selvagens ou controle. A população de plantas de milho modificadas pode compartilhar ancestralidade com uma única planta de milho modificada. As plantas de milho modificadas em uma população de plantas de milho modificadas geralmente podem compreender pelo menos uma espiga que é substancialmente livre de tecidos ou estruturas reprodutivas macho e/ou outros tipos estranhos. Uma população de plantas de milho modificadas pode ter maior resistência ao alojamento em média ou por número de plantas ou área de campo do que uma população de plantas tipo selvagem ou controle. A população de plantas de milho modificadas pode ter uma frequência de alojamento que é pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70% pelo menos 80%, pelo menos 90% ou 100% menos (ou inferior) do que uma população de plantas de milho de controle. Uma população de plantas de milho modificadas pode ter um índice de colheita de pelo menos 0,57 ou mais.
[0089] De acordo com as modalidades da presente invenção, as plantas de milho modificadas são fornecidas com um teor reduzido de giberelina (na forma ativa) pelo menos no(s) tecido(s) do caule e Internodo, tais como o caule, Internodo, folha e/ou tecido(s) vascular(es), em comparação com o(s) mesmo(s) tecido(s) de plantas tipo selvagem ou controle. De acordo com muitas modalidades, as plantas de milho modificadas são fornecidas com uma altura de planta significativamente reduzida e/ou um diâmetro do caule significativamente aumentado em relação às plantas tipo selvagem ou controle, em que as plantas de milho modificadas têm níveis significativamente reduzidos ou diminuídos de giberelinas ativas ou GAs ativos (por exemplo, um ou mais de GA1, GA3, GA4, e/ou GA7) em um ou mais caules, Internodos, folhas e/ou tecido(s) vascular(es), relativo(s) ao(s) mesmo(s) tecido(s) das plantas selvagens ou controle. Por exemplo, o nível de um ou mais GAs ativos no caule, no Internodo, na folha e/ou no tecido(s) vascular(es) de uma planta de milho modificada pode ser pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 100% menos ou menor do que no(s) mesmo(s) tecido(s) de uma planta de milho tipo selvagem ou controle.
[0090] De acordo com algumas modalidades, uma planta de milho modificada pode compreender um nível(is) ativo(s) de giberelina (GA) (por exemplo, um ou mais de GA1, GA3, GA4, e/ou GA7) em um ou mais caules, Internodos, folhas e/ou tecido(s) vascular(es) que está entre 5% e 50%, entre 10% e 100%, entre 20% e 100%, entre 30% e 100%, entre 40% e 100%, entre 50% e 100%, entre 60% e 100%, entre 70% e 100%, entre 80% e 100%, entre 80% e 90%, entre 10% e 90%, entre 10% e 80%, entre 10% e 70%, entre 10% e 60%, entre 10% e 50%, entre 10% e 40%, entre 10% e 30%, entre 10% e 20%, entre 50% e 100%, entre 20% e 90%, entre 20% e 80%, entre 20% e 70%, entre 20% e 60%, entre 20% e 50%, entre 20% e 40%, entre 20% e 40%, entre 20% e 30%, entre 30% e 90%, entre 30% e 80%, entre 30% e 70%, entre 30% e 60%, entre 30% e 50%, entre 30% e 40%, entre 40% e 90% entre 40% e 80%, entre 40% e 70%, entre 40% e 60%, entre 40% e 50%, entre 50% e 90%, entre 50% e 80%, entre 50% e 70%, entre 50% e 60%, entre 60% e 90%, entre 60% e 80%, entre 60% e 70%, entre 70% e 90%, ou entre 70% e 80% menos ou (ou inferior) do que nos mesmos tecidos de uma planta de milho tipo selvagem ou controle.
Uma planta de milho modificada com um nível(is) reduzido(s) de giberelina (GA) ativa(s) em um ou mais tecidos do caule, Internodo, folha e/ou vascular(es) pode ainda ser substancialmente livre de tipos estranhos, como tecidos ou estruturas reprodutivas macho e/ou outros tipos em pelo menos uma espiga de uma planta de milho modificada.
[0091] De acordo com as modalidades da presente divulgação, as plantas de milho modificadas são fornecidas com um nível de expressão significativamente reduzido ou eliminado de um ou mais transcritos do gene GA3 oxidase e/ou GA20 oxidase e/ou proteína(s) em um ou mais tecido(s), tal como um ou mais tecidos do caule, Internodo, folha e/ou vascular(es) das plantas modificadas, em comparação com o(s) mesmo(s) tecido(s) de plantas tipo selvagem ou controle. De acordo com muitas modalidades, uma planta de milho modificada é fornecida compreendendo uma altura de planta significativamente reduzida e/ou um diâmetro de caule significativamente aumentado em relação às plantas tipo selvagem ou controle, em que a planta de milho modificada tem um nível de expressão significativamente reduzido ou eliminado de um ou mais transcrito(s) e/ou proteína(s) do gene GA20 oxidase e/ou GA3 oxidase em um ou mais tecidos, tais como um ou mais tecidos do caule, Internodo, folha e/ou vascular(es) da planta modificada, em comparação com o(s) mesmo(s) tecido(s) de uma planta de milho tipo selvagem ou controle. Por exemplo, uma planta de milho modificada tem um nível de expressão significativamente reduzido ou eliminado de um transcrito(s) e/ou proteína(s) do gene GA20 oxidase_3 e/ou GA20 oxidase_5 e/ou um nível de expressão significativamente reduzido ou eliminado de um transcrito (s) e/ou proteína (s) do gene GA3 oxidase_1 e/ou GA3 oxidase_2, em toda a planta modificada, ou em um ou mais tecido(s) do caule, Internodo, folha e/ou vascular(es) da planta modificada, em comparação com o(s) mesmo(s) tecido(s) de uma planta tipo selvagem ou controle. Por exemplo, o nível de um ou mais transcritos e/ou proteína (s) do gene GA3 oxidase e/ou GA20 oxidase, ou um ou mais transcritos e/ou transcrito(s) e/ou proteína (s) do gene GA oxidase (ou semelhante a GA oxidase), em um ou mais tecidos(s) do caule, Internodo, folha e/ou vascular (es) de uma planta de milho modificada pode ser pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, em pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 100% menos ou inferior do que no(s) mesmo(s) tecido(s) de uma planta de milho tipo selvagem ou controle.
[0092] De acordo com algumas modalidades, uma planta de milho modificada pode compreender nível(is) de um ou mais transcrito(s) e/ou proteína (s) do gene GA3 oxidase e/ou GA20 oxidase, ou um ou mais transcrito(s) e/ou proteína (s) do gene GA oxidase (ou semelhante à GA oxidase) em toda a planta, ou em um ou mais tecido(s) do caule, Internodo, folha e/ou vascular(es) que está entre 5% e 50%, entre 10% e 100%, entre 20% e 100%, entre 30% e 100%, entre 40% e 100%, entre 50% e 100%, entre 60% e 100%, entre 70% e 100%, entre 80% e 100%, entre 80% e 90%, entre 10% e 90%, entre 10% e 80%, entre 10% e 70%, entre 10% e 60%, entre 10% e 50%, entre 10% e 40%, entre 10% e 30%, entre 10% e 20%, entre 50% e 100%, entre 20% e 90%, entre 20% e 80%, entre 20% e 70%, entre 20% e 60%, entre 20% e 50%, entre 20% e 40%, entre 20% e 40%, entre 20% e 30%, entre 30% e 90%, entre 30% e 80%, entre 30% e 70%, entre 30% e 60%, entre 30% e 50%, entre 30% e 40%, entre 40% e 90% entre 40% e 80%, entre 40% e 70%, entre 40% e 60%, entre 40% e 50%, entre 50% e 90%, entre 50% e 80%, entre 50% e 70%, entre 50% e 60%, entre 60% e 90%, entre 60% e 80%, entre 60% e 70%, entre 70% e 90%, ou entre
70% e 80% menos ou (ou inferior) do que nos mesmos tecidos de uma planta de milho tipo selvagem ou controle. Uma planta de milho modificada com um nível de expressão reduzido ou eliminado de pelo menos um gene(s) de GA20 oxidase e/ou GA3 oxidase em um ou mais tecido(s), também pode ser substancialmente livre de tipos estranhos, como tecidos reprodutivos macho ou estruturas e/ou outros tipos estranhos de pelo menos uma espiga da planta de milho modificada.
[0093] Métodos e técnicas são fornecidos para a triagem e/ou identificação de células ou plantas, etc., quanto à presença de edições ou transgenes direcionados e seleção de células ou plantas compreendendo edições direcionadas ou transgenes, que podem ser baseados em um ou mais fenótipos ou traços, ou na presença ou ausência de um marcador molecular ou polinucleotídeo ou sequência de proteína nas células ou plantas. Os ácidos nucleicos podem ser isolados e detectados usando técnicas conhecidas na técnica. Por exemplo, os ácidos nucleicos podem ser isolados e detectados usando, sem limitação, tecnologia de ácido nucleico recombinante e/ou a reação em cadeia da polimerase (PCR). Técnicas gerais de PCR são descritas, por exemplo, em PCR Primer: A Laboratory Manual, Dieffenbach & Dveksler, Eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995. As técnicas de ácido nucleico recombinante incluem, por exemplo, digestão e ligação de enzimas de restrição, que podem ser usadas para isolar um ácido nucleico. Ácidos nucleicos isolados também podem ser quimicamente sintetizados, seja como uma molécula única de ácido nucleico ou como uma série de oligonucleotídeos. Os polipeptídeos podem ser purificados a partir de fontes naturais (por exemplo, uma amostra biológica) por métodos conhecidos como troca iônica DEAE, filtração em gel e cromatografia em hidroxiapatita. Um polipeptídeo também pode ser purificado, por exemplo, expressando um ácido nucleico em um vetor de expressão. Além disso, um polipeptídeo purificado pode ser obtido por síntese química. O grau de isolamento ou pureza pode ser medido por qualquer método adequado, por exemplo, cromatografia de coluna, eletroforese em gel de poliacrilamida ou análise HPLC. Qualquer método conhecido na técnica pode ser usado para rastrear, e/ou identificar células, plantas, etc., que tenham um transgene ou genoma editado em seu genoma, que pode ser baseado em qualquer forma adequada de observação visual, seleção, técnica molecular, etc.
[0094] Em algumas modalidades, são fornecidos métodos para detectar ácidos nucleicos recombinantes e/ou polipeptídeos em células de planta. Por exemplo, os ácidos nucleicos podem ser detectados usando sondas de hibridação ou através da produção de amplicons usando PCR com iniciadores, como conhecido na técnica. A hibridização entre os ácidos nucleicos é discutida em Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). Os polipeptídeos podem ser detectados usando anticorpos. As técnicas para detectar polipeptídeos usando anticorpos incluem ensaios de imunoabsorção enzimática (ELISAs), transferências Western, imunoprecipitações, imunofluorescência e semelhantes. Um anticorpo aqui fornecido pode ser um anticorpo policlonal ou um anticorpo monoclonal. Um anticorpo com afinidade de ligação específica para um polipeptídeo aqui fornecido pode ser gerado usando métodos conhecidos na técnica. Uma sonda de anticorpo ou hibridação pode ser conectada a um suporte sólido, como um tubo, placa ou poço, usando métodos conhecidos na técnica.
[0095] A detecção (por exemplo, de um produto de amplificação, de um complexo de hibridação, de um polipeptídeo) pode ser realizada usando marcadores detectáveis que podem ser ligados ou associados a uma sonda ou anticorpo de hibridação. O termo "rótulo" visa abranger o uso de rótulos diretos e indiretos. Exemplos de substâncias detectáveis incluem, mas não estão limitados a, várias enzimas, grupos prostéticos, materiais fluorescentes, materiais luminescentes, materiais bioluminescentes e materiais radioativos.
[0096] A triagem e seleção de plantas ou células vegetais modificadas ou editadas pode ser realizada através de quaisquer metodologias conhecidas pelos versados na técnica de biologia molecular. Exemplos de metodologias de triagem e seleção incluem, mas sem limitação, análise Southern, amplificação de PCR para detecção de um polinucleotídeo; Northern blots, proteção da RNase, extensão de iniciador, amplificação de RT-PCR para detecção de transcritos de RNA, sequenciamento Sanger, tecnologias de sequenciamento de Próxima Geração (por exemplo, Illumina®, PacBio®, Ion TorrentTM, etc.) ensaios enzimáticos para detecção de atividade de enzima ou ribozima de polipeptídeos e polinucleotídeos; e eletroforese em gel de proteína, Western blots, imunoprecipitação e imunoensaios ligados a enzima para detectar polipeptídeos. Outras técnicas, tais como hibridização in situ, coloração enzimática e imunocoloração também podem ser usadas para detectar a presença ou expressão de polipeptídeos e/ou polinucleotídeos. Métodos para executar todas as técnicas referidas são conhecidos.
EXEMPLOS Exemplo 1. Observações fenotípicas de plantas de milho com um gene GA20 oxidase_3 ou GA20 oxidase_5 editado.
[0097] Várias mutações editadas pelo genoma foram criadas nos genes endógenos de GA20 oxidase_3 e GA20 oxidase_5 em plantas de milho para testar o efeito fenotípico de nocautear cada um desses genes. Uma série de dez RNAs guia de cadeia única (sgRNAs) que codificam construtos de direcionamento foi criada para cada um dos genes GA20 oxidase_3 e GA20 oxidase_5 que direcionam posições diferentes ao longo da sequência genômica de cada gene. Uma série adicional de dez sgRNAs foi criada para cada alvo dos genes GA20 oxidase_3 e GA20 oxidase_5, em posições semelhantes ou diferentes ao longo da sequência genômica de cada gene.
As edições direcionadas do genoma foram feitas distribuindo o sgRNA junto com a expressão de uma proteína Cas9 para explantes de milho para fazer com que um DSB ou corte ocorresse no ou próximo ao sítio alvo genômico para o gRNA, que pode então ser reparado de forma imperfeita para introduzir uma mutação no ou perto do sítio alvo.
A presença de uma mutação foi subsequentemente confirmada por análise RFLP e/ou sequenciamento de plantas.
A Tabela 2 abaixo fornece uma lista dos construtos de RNA guia (gRNA) que foram testados, que podem ser usados para a edição do genoma de um ou ambos os genes GA20 oxidase_3 e GA20 oxidase_5 com uma endonuclease guiada por RNA.
Estes construtos de RNA guia são geralmente projetados para direcionar as sequências de codificação dos genes GA20 oxidase_3 e/ou GA20 oxidase_5, mas alguns dos construtos de direcionamento conjunto podem, em vez disso, direcionar uma sequência UTR de um dos dois genes.
Esses gRNAs podem ser usados com uma endonuclease adequada para produzir uma quebra de fita dupla (DSB) ou corte no genoma no ou próximo ao sítio alvo genômico do respectivo gRNA, que pode ser reparado de forma imperfeita para produzir uma mutação (por exemplo, uma inserção, deleção, substituição, etc.). As plantas homozigotas para um gene GA20 oxidase_3 editado ou homozigotas para um gene GA20 oxidase_5 editado foram geradas a partir de alguns construtos (ver texto em negrito). Eventos também foram gerados a partir de construtos direcionando os dois genes para edição.
Para os construtos que direcionam conjuntamente os genes GA20 oxidase_3 e GA20 oxidase_5, as coordenadas da sequência de codificação (CDS) são fornecidas em referência a um dos dois genes, conforme indicado entre parênteses.
A Tabela 2 mostra ainda quais construtos produziram eventos de edição de genes, se esses eventos eram homozigotos ou heterozigotos nas plantas R0 e os números ± entre parênteses indicam a provável mudança de sequência com a mutação (por exemplo, +1 significa uma inserção de 1 nucleotídeo, -1 significa uma deleção de 1 nucleotídeo, etc., e Indels maiores ou mais complicados são rotulados como "del". ou inserto."). Para direcionamento conjunto dos genes GA20 oxidase_3 e GA20 oxidase_5, a identidade do gene mutado também é fornecida entre parênteses.
As plantas R0 homozigotas para um gene GA20 oxidase_3 ou GA20 oxidase_5 editado não tinham uma estatura baixa observável, fenótipo semianão e tinham uma altura de planta normal em relação às plantas de controle (ver construtos GA20 oxidase_3-D e GA20 oxidase_3-G, e construtos GA20 oxidase_5-B e GA20 oxidase_5-G na Tabela 2), indicando que o knockout de apenas um desses genes não é suficiente para produzir o fenótipo semianão.
Tabela 2. RNAs guia (gRNAs) direcionados aos genes GA20 oxidase_3 e GA oxidase_5 para edição. Sequência de Coordenadas do gene gRNA Gene Alvo direcionamento por Plantas R0 geradas
CDS gRNA (SEQ ID Nº) GA20 oxidase_3-A 138 552-572 --- GA20 oxidase_3-B 139 879-899 --- GA20 oxidase_3-C 140 147-167 ---
1. homozigoto (-1) GA20 oxidase_3-D 141 526-546 2. heterozigoto (-1)
3. bialélico (-2, +1) GA20 oxidase_3-E 142 446-466 --- GA20 oxidase_3-F 143 2227-2247 ---
1. homozigoto (+1) GA20 oxidase_3-G 144 548-568 2. heterozigoto (-1)
3. bialélico (+1, -1) GA20 oxidase_3-H 145 547-567 --- GA20 oxidase_3-I 146 43-63 --- GA20 oxidase_3-J 147 548-567 --- GA20 oxidase_5-A 148 356-376 (+) 1. heterozigoto (-1)
1. homozigoto (-1)
2. heterozigoto (+1) GA20 oxidase_5-B 149 99-119
3. heterozigoto (+1, -7)
4. heterozigoto (-3, -1) GA20 oxidase_5-C 150 369-389 --- GA20 oxidase_5-D 151 48-68 --- GA20 oxidase_5-E 152 356-376 (-) --- GA20 oxidase_5-F 153 748-768 1. heterozigoto (-1, +1)
1. homozigoto (-1) GA20 oxidase_5-G 154 770-790
2. homozigoto (-1) GA20 oxidase_5-H 155 10-30 --- GA20 oxidase_5-I 156 262-282 --- GA20 oxidase_5-J 157 768-788 --- GA20 oxidase_3/5-A 158 290..310 (GA20 Ox_3) --- GA20 oxidase_3/5-B 159 289..309 (GA20 Ox_3) --- GA20 oxidase_3/5-C 160 270..290 (GA20 Ox_5) --- GA20 oxidase_3/5-D 161 49..69 (GA20 Ox_3) --- GA20 oxidase_3/5-E 162 265..285 (GA20 Ox_5) 1. heterozigoto (Ox5, +1)
1. hetero (Ox3, +1, -1)
419..439 hetero (Ox5, +1, del.) GA20 oxidase_3/5-F 163 (GA20 Ox_3) 2. hetero (Ox3, +1, del.) hetero (Ox5, +1) GA20 oxidase_3/5-G 164 110..130 (GA20 Ox_3) --- GA20 oxidase_3/5-H 165 634..654 (GA20 Ox_5) --- GA20 oxidase_3/5-I 166 98..118 (GA20 Ox_5) --- GA20 oxidase_3/5-J 167 517..537 (GA20 Ox_5) ---
Exemplo 2. Identificação de plantas de milho com várias combinações de alelos mutantes de GA20 oxidase_3 e GA20 oxidase_5 editados.
[0098] As plantas de milho foram editadas conforme descrito no Exemplo 1 através de uma abordagem baseada em CRISPR/Cas9 usando RNAs guia (gRNAs) que direcionam um dos genes GA20 oxidase_3 e GA20 oxidase_5 especificamente ou direcionam ambos os dois genes simultaneamente (ver Tabela 2). No total, 30 construtos de gRNA foram transformadas em milho. Amostras de folhas de plantas R0 foram coletadas e analisadas para InDels por um ensaio de Análise de Comprimento de Fragmento (FLA). Os alelos mutantes putativos identificados por FLA foram sequenciados usando iniciadores específicos de gene e protocolos de sequenciamento profundo padrão para confirmar a(s) mutação(ões). A Tabela 3 fornece uma lista de 12 alelos mutantes editados no gene GA20 oxidase_3 (ga20ox3-1 a ga20ox3-12) e suas sequências. A Tabela 4 fornece uma lista de 11 alelos mutantes editados no gene GA20 oxidase_5 (ga20ox5-1 a ga20ox5-11) e suas sequências. Plantas R0 com mutação(ões) em GA20 oxidase_3 ou GA20 oxidase_5, ou em ambos os genes, foram criados para produzir plantas R1.
[0099] Sementes R1 de múltiplas plantas R0 foram plantadas e amostradas novamente para confirmar a(s) mutação(ões) usando FLA e protocolos de sequenciamento padrão. A Tabela 5 fornece uma lista de plantas R1 com mutações em GA20 oxidase_3, GA20 oxidase_5, ou ambos os genes. A Tabela 5 também mostra a altura da planta e o comprimento do Internodo (espiga menos 2) das plantas R1 medidas no estágio R3. A altura da planta foi medida em estágio de crescimento R2/R3 da linhagem do solo até a base da folha com maior coleira. Plantas R1 que são homozigotas ou heterozigotas para uma mutação no gene de interesse (GA20 oxidase_3 e/ou GA20 oxidase_5) foram identificados por sequenciamento e autoprodutivos para produzir plantas R2. Os genótipos das plantas R2 foram novamente determinados por FLA e sequenciamento. A Tabela 6 fornece uma lista de plantas R2 com mutações em GA20 oxidase_3, GA20 oxidase_5 ou em ambos os genes e sua altura de planta no estágio R2/R3. A Tabela 6 também fornece a caracterização correspondente de plantas de controle de referência não editadas (plantas endogâmicas tipo selvagem, mostradas como WT) e plantas de milho endogâmicas transgênicas tendo um construto de supressão de microRNA artificial direcionado aos genes GA20 oxidase_3 e GA20 oxidase_5 para supressão (SUP_GA20Ox3 & Ox5 ("SUP_Ox3 e Ox5")).
[00100] Em média, as plantas R2 contendo alelos mutantes homozigotos de ambos os genes GA20 oxidase_3 e GA20 oxidase_5 (isto é, duplo homozigoto) mostraram um fenótipo semianão (cerca de 27,5% de redução na altura da planta em relação ao controle) com arquitetura de planta alterada semelhante a plantas SUP_Ox3 e Ox5 (comparação das plantas Homo_ox3/Homo_ox5 e SUP_Ox3 & Ox5 na Tabela 7 e FIG. 1). Mutantes ga20ox3 homozigotos simples e mutantes ga20ox5 homozigotos simples exibiram uma ligeira redução (cerca de 10-11%) na altura média da planta (no estágio R3) em relação às plantas de controle de referência não editadas (WT endogâmicas). Além disso, plantas de milho com mutações ga20ox3 homozigotas e heterozigotas para uma mutação ga20ox5 (isto é, Homo_ox3/ Het_ox5 na Tabela 7 e FIG. 1) exibiu uma redução moderada (cerca de 19,1%) na altura média da planta (no estágio R3) em relação às plantas de controle de referência não editadas (WT endogâmicas). Plantas Homo_ox3/ Het_ox5 eram ligeiramente mais altas que as plantas ga20ox3 ga20ox5 homozigotas duplas (Homo_ox3/ Homo_ox5). Dado que o milho é um organismo diploide, a edição de genes mediada por CRISPR pode resultar em mutações bialélicas em plantas R0 (também conhecidas como uma combinação de mutantes bialélicos ou mutações trans-heterozigotas). Por uma questão de simplicidade, um mutante bialélico em um locus particular é tratado como um mutante homozigoto nesse locus para descrição do genótipo e fins de cálculo da altura da planta.
Genótipos mutantes detalhados (incluindo mutantes bialélicos) são fornecidos nas Tabelas 18 e 19 para plantas de geração R1 e R2, respectivamente.
Ambos os mutantes ga20ox3 /ga20ox5 homozigotos duplos, e combinações de mutantes homozigotos/heterozigotos (por exemplo, Homo_ox3/Het_ox5 ou Het_ox3/Homo_ox5) também resultaram em plantas semianãs mais curtas, embora as alturas das plantas em combinações de mutantes homozigotos/heterozigotos não foram reduzidas tanto quanto as plantas mutantes ga20ox3 /ga20ox5 homozigotas duplas.
Tabela 3. Uma lista de 12 alelos mutantes editados em GA20 oxidase_3 (ga20ox3-1 a ga20ox3-12) e suas sequências.
Os IDs de gRNA mostrados aqui correspondem aos da Tabela 2. SEQ ID para SEQ ID para SEQ ID para SEQ ID para sequência de sequência de Sequência de Descrição do Alelo (EDIÇÃO em sequência de Gene Alelo alelos mutantes referência tipo Alelos coordenada de DNA codificante Posição de alelos mutantes ID do gRNA Locus mutante (~60 nt edições selvagem (~60 nt Mutantes (DNA genômico, com base na SEQ ID Nº. edição (~30 nt edições de de edições de codificante 168) flanqueamento) flanqueamento) flanqueamento) genômico)
Deleção de 13 bases começando GA20ox3 ga20ox3-1 170 182 194 206 primeiro éxon GA20ox3_d em 536 GA20ox3 ga20ox3-2 171 183 195 207 Deleção da base 542 primeiro éxon GA20ox3_d
78/88 GA20ox3 ga20ox3-3 172 184 196 208 Inserção de CC na base 542 primeiro éxon GA20ox3_d GA20ox3 ga20ox3-4 173 185 197 209 Deleção da base 541 primeiro éxon GA20ox3_d Deleção de 3 nt começando na base GA20ox3 ga20ox3-5 174 186 198 210 primeiro éxon GA20ox3_d 540 Deleção de 2 bases começando na GA20ox3 ga20ox3-6 175 187 199 211 primeiro éxon GA20ox3_5_f base 422 GA20ox3 ga20ox3-7 176 188 200 212 Inserção de um A na base 422 primeiro éxon GA20ox3_5_f GA20ox3 ga20ox3-8 177 189 201 213 Inserção de um T na base 422 primeiro éxon GA20ox3_5_f GA20ox3 ga20ox3-9 178 190 202 214 Deleção da base 564 primeiro éxon GA20ox3_g GA20ox3 ga20ox3-10 179 191 203 215 Inserção de um A na base 564 primeiro éxon GA20ox3_g GA20ox3 ga20ox3-11 180 192 204 216 Inserção de um C na base 565 primeiro éxon GA20ox3_g GA20ox3 ga20ox3-12 181 193 205 217 Inserção de um C na base 63 primeiro éxon GA20ox3_5_e
Tabela 4. Uma lista de 11 alelos mutantes editados no gene GA20 oxidase_5 (ga20ox5-1 a ga20ox5-11) e suas sequências.
Os IDs de gRNA mostrados aqui correspondem aos da Tabela 2. SEQ ID para SEQ ID para SEQ ID para SEQ ID para Sequência sequência de Descrição do alelo (EDIT @ sequência de sequência de de Alelos Gene Alelo referência tipo coordenada de DNA codificador alelos mutantes alelos mutantes Mutantes Posição de edição ID do gRNA Locus Mutante selvagem (~60 nt genômico, com base na SEQ ID (~30 nt edições de (~60 nt edições de (DNA edições de Nº. 169) flanqueamento) flanqueamento) codificante flanqueamento) genômico) GA20ox5 ga20ox5-1 218 229 240 251 Deleção da base 644 primeiro éxon GA20ox3_5_f Deleção de 2 bases GA20ox5 ga20ox5-2 219 230 241 252 primeiro éxon GA20ox3_5_f começando na base 644
79/88 GA20ox5 ga20ox5-3 220 231 242 253 Inserção de um T na base 644 primeiro éxon GA20ox3_5_f GA20ox5 ga20ox5-4 221 232 243 254 Deleção da base 372 primeiro éxon GA20ox5_a GA20ox5 ga20ox5-5 222 233 244 255 Deleção da base 786 primeiro éxon GA2ox5_g Deleção de 5 bases GA20ox5 ga20ox5-6 223 234 245 256 primeiro éxon GA2ox5_g começando na base 786 Deleção de 2 bases GA20ox5 ga20ox5-7 224 235 246 257 primeiro éxon GA20ox5_b começando na base 101 Inserção de um T na base GA20ox5 ga20ox5-8 225 236 247 258 primeiro éxon GA20ox5_b base 102 Deleção de 3 bases GA20ox5 ga20ox5-9 226 237 248 259 primeiro éxon GA20ox5_b começando na base 99 GA20ox5 ga20ox5-10 227 238 249 260 Inserção de um A na base 282 primeiro éxon GA20ox3_5_e GA20ox5 ga20ox5-11 228 239 250 261 Inserção de um C na base 282 primeiro éxon GA20ox3_5_e
Tabela 5. Uma lista de plantas R1 com mutações em GA20 oxidase_3, GA20 oxidase_5, ou ambos os genes.
Altura da Planta Comprimento Alelo(s) Gera- Genótipo de planta planta Genótipo GA20ox3 Genótipo GA20ox5 Alelo(s) ga20ox5 gRNA Nº.
Internodo (cm) ga20ox3 ção (polegadas)
1 ga20ox5 homo simples 58,74 12 WT Deleção bialélica -1, deleção -5, nenhum ga20ox5-6, ga20ox5-5 R1 GA20ox5_g 2 ga20ox5 homo simples 51,65 10 WT Deleção bialélica -1, deleção -5, nenhum ga20ox5-6, ga20ox5-5 R1 GA20ox5_g 3 ga20ox5 homo simples 57,49 10,5 WT Deleção bialélica -1, deleção -5, nenhum ga20ox5-6, ga20ox5-5 R1 GA20ox5_g 4 ga20ox5 homo simples 68,27 13,8 WT Deleção bialélica -2, inserção +1, nenhum ga20ox5-8, ga20ox5-7 R1 GA20ox5_b 5 ga20ox5 homo simples 56,89 11,3 WT Deleção bialélica -5, deleção -1, nenhum ga20ox5-6, ga20ox5-5 R1 GA20ox5_g Inserção bialélica +1,inserção 6 hetero ga20ox3/homo ga20ox5 53,7 10 Inserção Het +1, +1, ga20ox3-12 ga20ox5-11, ga20ox5-10 R1 GA20ox3_5_e ga20ox3-8, 7 homo ga20ox3/hetero ga20ox5 53,9 9,5 Inserção bialélica +1,inserção +1, Deleção Het -1, ga20ox3-7 ga20ox5-1 R1 GA20ox3_5_f ga20ox3-6,
80/88 8 homo ga20ox3/hetero ga20ox5 56,69 10 Deleção bialélica -2, inserção +1, Deleção Het -2, ga20ox3-8 ga20ox5-2 R1 GA20ox3_5_f ga20ox3-6, 9 homo ga20ox3/hetero ga20ox5 49,09 9,5 Inserção bialélica +1,deleção -2, Deleção Het -2, ga20ox3-8 ga20ox5-2 R1 GA20ox3_5_f ga20ox3-6, 10 homo ga20ox3/hetero ga20ox5 54,96 10,3 Inserção bialélica +1,deleção -2, Deleção Het -2, ga20ox3-8 ga20ox5-2 R1 GA20ox3_5_f 11 homo ga20ox3/hetero ga20ox5 47,13 9 Inserção homozigota +1, Deleção Het -2, ga20ox3-8 ga20ox5-2 R1 GA20ox3_5_f 12 hetero ga20ox3/hetero ga20ox5 53,31 10 Inserção Het +1, Deleção Het -5, ga20ox3-10 ga20ox5-6 R1 GA20ox3_g ga20ox3-8, 13 homo ga20ox3/hetero ga20ox5 56,57 11 Inserção bialélica +1,inserção +1, Inserção Het +1, ga20ox3-7 ga20ox5-3 R1 GA20ox3_5_f ga20ox3-8, 14 homo ga20ox3/hetero ga20ox5 49,57 8,1 Inserção bialélica +1,inserção +1, Inserção Het +1, ga20ox3-7 ga20ox5-3 R1 GA20ox3_5_f ga20ox3-8, 15 homo ga20ox3/hetero ga20ox5 53,35 9,1 Inserção bialélica +1,inserção +1, Inserção Het +1, ga20ox3-7 ga20ox5-3 R1 GA20ox3_5_f ga20ox3-7, 16 homo ga20ox3/hetero ga20ox5 59,41 9,6 Inserção bialélica +1,inserção +1, Inserção Het +1, ga20ox3-8 ga20ox5-3 R1 GA20ox3_5_f
Altura da Planta Comprimento Alelo(s) Gera- Genótipo de planta planta Genótipo GA20ox3 Genótipo GA20ox5 Alelo(s) ga20ox5 gRNA Nº.
Internodo (cm) ga20ox3 ção (polegadas) ga20ox3-7, 17 homo ga20ox3/hetero ga20ox5 60,75 11 Inserção bialélica +1,inserção +1, Inserção Het +1, ga20ox3-8 ga20ox5-3 R1 GA20ox3_5_f 18 ga20ox5 homo simples 51,54 10 WT Deleção homozigota -1, nenhum ga20ox5-4 R1 GA20ox5_a 19 ga20ox5 homo simples 57,4 12,2 WT Deleção homozigota -1, nenhum ga20ox5-4 R1 GA20ox5_a 20 ga20ox5 homo simples 58,9 11,5 WT Deleção homozigota -1, nenhum ga20ox5-4 R1 GA20ox5_a 21 ga20ox5 homo simples 50,83 9 WT Deleção homozigota -1, nenhum ga20ox5-5 R1 GA20ox5_g 22 ga20ox5 homo simples 55,08 10,5 WT Deleção homozigota -1, nenhum ga20ox5-5 R1 GA20ox5_g 23 ga20ox5 homo simples 54,76 10 WT Deleção homozigota -1, nenhum ga20ox5-5 R1 GA20ox5_g 24 ga20ox5 homo simples 56,54 10 WT Deleção homozigota -1, nenhum ga20ox5-5 R1 GA20ox5_g 25 ga20ox5 homo simples 55,12 10,3 WT Deleção homozigota -1, nenhum ga20ox5-5 R1 GA20ox5_g 26 ga20ox5 homo simples 55,47 9 WT Deleção homozigota -1, nenhum ga20ox5-5 R1 GA20ox5_g
81/88 27 ga20ox5 homo simples 61,02 10 WT Deleção homozigota -1, nenhum ga20ox5-5 R1 GA20ox5_g 28 ga20ox5 homo simples 48,62 7 WT Deleção homozigota -1, nenhum ga20ox5-5 R1 GA20ox5_g 29 ga20ox5 homo simples 63,5 11,5 WT Deleção homozigota -1, nenhum ga20ox5-5 R1 GA20ox5_g 30 ga20ox5 homo simples 60,28 10,5 WT Deleção homozigota -1, nenhum ga20ox5-5 R1 GA20ox5_g 31 ga20ox5 homo simples 58,12 11,3 WT Deleção homozigota -1, nenhum ga20ox5-5 R1 GA20ox5_g 32 ga20ox5 homo simples 51,89 12 WT Deleção homozigota -1, nenhum ga20ox5-5 R1 GA20ox5_g 33 ga20ox5 homo simples 70,08 14 WT Deleção homozigota -3, nenhum ga20ox5-9 R1 GA20ox5_b 34 ga20ox5 homo simples 55,55 9,8 WT Inserção homozigota +1, nenhum ga20ox5-10 R1 GA20ox3_5_e 35 Indisponível 59,57 10 Indisponível Indisponível Indisponível Indisponível R1 GA20ox3_d 36 Indisponível 67,28 13,3 Indisponível Indisponível Indisponível Indisponível R1 GA20ox3_g 37 Indisponível 56,54 9 Indisponível Indisponível Indisponível Indisponível R1 GA20ox3_d 38 Indisponível 63,74 11,5 Indisponível Indisponível Indisponível Indisponível R1 GA20ox3_g ga20ox3-4, 39 ga20ox3 homo simples 65,24 10 Deleção bialélica -1, deleção -1, WT ga20ox3-2 nenhum R1 GA20ox3_d 40 ga20ox3 homo simples 69,49 9,5 Deleção bialélica -1, deleção -1, WT ga20ox3-2, nenhum R1 GA20ox3_d
Altura da Planta Comprimento Alelo(s) Gera- Genótipo de planta planta Genótipo GA20ox3 Genótipo GA20ox5 Alelo(s) ga20ox5 gRNA Nº.
Internodo (cm) ga20ox3 ção (polegadas) ga20ox3-4 ga20ox3-5, 41 ga20ox3 homo simples 60,12 9 Deleção bialélica -1, deleção -3, WT ga20ox3-2 nenhum R1 GA20ox3_d ga20ox3-10, 42 ga20ox3 homo simples 53,74 10 Deleção bialélica -1, inserção +1, WT ga20ox3-9 nenhum R1 GA20ox3_g ga20ox3-1, 43 ga20ox3 homo simples 58,43 9,8 Deleção bialélica -13, deleção -1, WT ga20ox3-2 nenhum R1 GA20ox3_d ga20ox3-8, 44 ga20ox3 homo simples 57,28 11,5 Deleção bialélica -2, inserção +1, WT ga20ox3-6 nenhum R1 GA20ox3_5_f ga20ox3-8, 45 ga20ox3 homo simples 56,26 11,5 Inserção bialélica +1,deleção -2, WT ga20ox3-6 nenhum R1 GA20ox3_5_f ga20ox3-8,
82/88 46 ga20ox3 homo simples 59,8 10,8 Inserção bialélica +1,deleção -2, WT ga20ox3-6 nenhum R1 GA20ox3_5_f 47 único hetero ga20ox3 54,45 11 Inserção Het +1, WT ga20ox3-8 nenhum R1 GA20ox3_5_f 48 ga20ox3 homo simples 52,68 9,5 Deleção homozigota -1, WT ga20ox3-2 nenhum R1 GA20ox3_d 49 ga20ox3 homo simples 64,17 12 Deleção homozigota -1, WT ga20ox3-2 nenhum R1 GA20ox3_d 50 ga20ox3 homo simples 56,97 11 Deleção homozigota -1, WT ga20ox3-9 nenhum R1 GA20ox3_g 51 ga20ox3 homo simples 43,19 12,5 Deleção homozigota -1, WT ga20ox3-9 nenhum R1 GA20ox3_g 52 ga20ox3 homo simples 58,94 11,3 Deleção homozigota -1, WT ga20ox3-9 nenhum R1 GA20ox3_g 53 ga20ox3 homo simples 61,65 13 Inserção homozigota +1, WT ga20ox3-8 nenhum R1 GA20ox3_5_f 54 ga20ox3 homo simples 60,91 11,5 Inserção homozigota +1, WT ga20ox3-10 nenhum R1 GA20ox3_g
Tabela 6. Uma lista de plantas R2 com alelos editados em GA20 oxidase_3, GA20 oxidase_5, ou ambos os genes.
As plantas 45 e 46 são consideradas exceções e não são incluídas para gerar dados médios de altura da planta mostrados na Tabela 7. Altura da Planta Alelo Genótipo de planta planta Genótipo GA20ox3 Genótipo GA20ox5 Alelo(s) ga20ox3 Geração gRNA Nº. ga20ox5 (polegadas)
1 homo ga20ox3/hetero ga20ox5 45 Inserção bialélica +1 Deleção heterozigota -1 ga20ox3-7,ga20ox3-8 ga20ox5-1 R2 GA2ox3_5_f
2 homo ga20ox3/hetero ga20ox5 45,2 Inserção homozigota +1 Deleção heterozigota -1 ga20ox3-8 ga20ox5-1 R2 GA2ox3_5_f
3 homo ga20ox3/hetero ga20ox5 45 Deleção bialélica -2, inserção +1 Deleção heterozigota -2 ga20ox3-6,ga20ox3-8 ga20ox5-2 R2 GA2ox3_5_f
4 homo ga20ox3/hetero ga20ox5 42,8 Inserção homozigota +1 Deleção heterozigota -2 ga20ox3-8 ga20ox5-2 R2 GA2ox3_5_f
83/88 5 homo ga20ox3/hetero ga20ox5 45,2 Inserção homozigota +1 Deleção heterozigota -2 ga20ox3-8 ga20ox5-2 R2 GA2ox3_5_f
6 homo ga20ox3/hetero ga20ox5 48,8 Inserção homozigota +1 Deleção heterozigota -2 ga20ox3-8 ga20ox5-2 R2 GA2ox3_5_f
7 homo ga20ox3/hetero ga20ox5 51,8 Inserção homozigota +1 Deleção heterozigota -2 ga20ox3-8 ga20ox5-2 R2 GA2ox3_5_f
8 homo ga20ox3/hetero ga20ox5 45,4 Inserção homozigota +1 Deleção heterozigota -2 ga20ox3-8 ga20ox5-2 R2 GA2ox3_5_f
9 homo ga20ox3/hetero ga20ox5 47 Deleção homozigota -2 Deleção heterozigota -2 ga20ox3-6 ga20ox5-2 R2 GA2ox3_5_f
10 homo ga20ox3/hetero ga20ox5 49,8 Deleção homozigota -2 Deleção heterozigota -2 ga20ox3-6 ga20ox5-2 R2 GA2ox3_5_f
11 ga20ox5 homo simples 52,4 WT Deleção homozigota -1 nenhum ga20ox5-4 R2 GA2ox5_a
12 ga20ox5 homo simples 39,2 WT Deleção homozigota -1 nenhum ga20ox5-4 R2 GA2ox5_a
13 ga20ox5 homo simples 53 WT Deleção homozigota -1 nenhum ga20ox5-4 R2 GA2ox5_a
14 ga20ox5 homo simples 54 WT Deleção homozigota -1 nenhum ga20ox5-4 R2 GA2ox5_a
Altura da Planta Alelo Genótipo de planta planta Genótipo GA20ox3 Genótipo GA20ox5 Alelo(s) ga20ox3 Geração gRNA Nº. ga20ox5 (polegadas)
15 ga20ox5 homo simples 53,8 WT Deleção homozigota -1 nenhum ga20ox5-4 R2 GA2ox5_a
16 ga20ox5 homo simples 53,4 WT Deleção homozigota -1 nenhum ga20ox5-4 R2 GA2ox5_a
17 Homo duplo 45 Inserção bialélica +1 Inserção homozigota +1 ga20ox3-7,ga20ox3-8 ga20ox5-3 R2 GA2ox3_5_f
18 Homo duplo 37 Inserção homozigota +1 Deleção homozigota -2 ga20ox3-8 ga20ox5-2 R2 GA2ox3_5_f
19 Homo duplo 39,2 Inserção homozigota +1 Deleção homozigota -2 ga20ox3-8 ga20ox5-2 R2 GA2ox3_5_f
20 Homo duplo 39,8 Inserção homozigota +1 Deleção homozigota -2 ga20ox3-8 ga20ox5-2 R2 GA2ox3_5_f
21 Homo duplo 40,8 Inserção homozigota +1 Deleção homozigota -2 ga20ox3-8 ga20ox5-2 R2 GA2ox3_5_f
84/88 22 Homo duplo 40,8 Inserção homozigota +1 Deleção homozigota -2 ga20ox3-8 ga20ox5-2 R2 GA2ox3_5_f
23 Homo duplo 41 Inserção homozigota +1 Deleção homozigota -2 ga20ox3-8 ga20ox5-2 R2 GA2ox3_5_f
24 Homo duplo 41,4 Inserção homozigota +1 Deleção homozigota -2 ga20ox3-8 ga20ox5-2 R2 GA2ox3_5_f
25 Homo duplo 41,8 Inserção homozigota +1 Deleção homozigota -2 ga20ox3-8 ga20ox5-2 R2 GA2ox3_5_f
26 Homo duplo 42 Inserção homozigota +1 Deleção homozigota -2 ga20ox3-8 ga20ox5-2 R2 GA2ox3_5_f
27 Homo duplo 42 Inserção homozigota +1 Deleção homozigota -2 ga20ox3-8 ga20ox5-2 R2 GA2ox3_5_f
28 Homo duplo 42,4 Inserção homozigota +1 Deleção homozigota -2 ga20ox3-8 ga20ox5-2 R2 GA2ox3_5_f
29 Homo duplo 43 Inserção homozigota +1 Deleção homozigota -2 ga20ox3-8 ga20ox5-2 R2 GA2ox3_5_f
30 Homo duplo 43,8 Inserção homozigota +1 Deleção homozigota -2 ga20ox3-8 ga20ox5-2 R2 GA2ox3_5_f
31 Homo duplo 46,2 Inserção homozigota +1 Deleção homozigota -2 ga20ox3-8 ga20ox5-2 R2 GA2ox3_5_f
Altura da Planta Alelo Genótipo de planta planta Genótipo GA20ox3 Genótipo GA20ox5 Alelo(s) ga20ox3 Geração gRNA Nº. ga20ox5 (polegadas)
32 ga20ox3 homo simples 62 Deleção homozigota -1 WT ga20ox3-9 nenhum R2 GA2ox3_g
33 ga20ox3 homo simples 39 Deleção homozigota -1 WT ga20ox3-9 nenhum R2 GA2ox3_g
34 ga20ox3 homo simples 51 Deleção bialélica -2, inserção +1 WT ga20ox3-6, ga20ox3-8 nenhum R2 GA2ox3_5_f
35 ga20ox3 homo simples 52,8 Inserção homozigota +1 WT ga20ox3-8 nenhum R2 GA2ox3_5_f
36 ga20ox3 homo simples 59,4 Inserção homozigota +1 WT ga20ox3-8 nenhum R2 GA2ox3_5_f
37 ga20ox3 homo simples 46 Inserção homozigota +1 WT ga20ox3-8 nenhum R2 GA2ox3_5_f
38 ga20ox3 homo simples 52,8 Inserção homozigota +1 WT ga20ox3-8 nenhum R2 GA2ox3_5_f
85/88 39 ga20ox3 homo simples 51,4 Deleção homozigota -2 WT ga20ox3-6 nenhum R2 GA2ox3_5_f
40 SUP_Ox3&Ox5 43,6 WT WT Nenhum nenhum N/A nenhum
41 SUP_Ox3&Ox5 43,8 WT WT Nenhum nenhum N/A nenhum
42 SUP_Ox3&Ox5 42,2 WT WT Nenhum nenhum N/A nenhum
43 WT 56,4 WT WT Nenhum nenhum N/A nenhum
44 WT 58,8 WT WT Nenhum nenhum N/A nenhum
45 Homo duplo 61,8 Deleção bialélica -2, inserção +1 Deleção homozigota -2 ga20ox3-6 ga20ox5-2 R2 GA2ox3_5_f
46 Homo duplo 61,8 Inserção bialélica +1 Deleção homozigota -1 ga20ox3-7,ga20ox3-8 ga20ox5-1 R2 GA2ox3_5_f
Tabela 7. Diferenças de altura de planta no estágio R2/R3 entre plantas endogâmicas com gene editado cultivadas em estufa e plantas de controle de referência.
Média Altura da Desvio Nº. de % de Genótipo de planta planta (polegadas) Padrão Plantas Redução WT 57,6 1,7 2 0 Homo_ox3/ WT_Ox5 51,8 7,2 8 10,1% WT_Ox3/ Homo_ox5 51,0 5,8 6 11,5% Homo_ox3/ Het_ox5 46,6 2,7 10 19,1% Homo_ox3/ Homo_ox5 41,7 2,3 17 27,5% SUP_Ox3&Ox5 43,2 6,6 3 25,0% Exemplo 3. Editar GA20 oxidase_3 e GA20 oxidase_5 reduz os níveis de GA ativa na planta.
[00102] Plantas R2 com alelos editados em GA20 oxidase_3, GA20 oxidase_5 ou ambos os genes foram testadas no campo junto com plantas de milho endogâmicas transgênicas com um construto de supressão de microRNA artificial direcionado aos genes GA20 oxidase_3 e GA20 oxidase_5 para supressão SUP_GA20Ox3&Ox5 ("SUP_Ox3&Ox5")). Vários traços fisiológicos foram medidos, incluindo altura da planta ao nó da espiga em R3, altura da planta até a lígula superior, altura da espiga, comprimento da espiga, diâmetro da espiga, caroços/espiga, caroços/área unitária, peso do caroço único, diâmetro do caule e estimativa de rendimento de caroços. Plantas contendo alelos mutantes homozigotos de ambos os genes GA20 oxidase_3 e GA20 oxidase_5 (isto é, mutantes ga20ox3 /ga20ox5 homozigotos duplos) mostraram fenótipos semi-anões com arquitetura de plantas alterada. Mutantes ga20ox3 homozigotos simples e mutantes ga20ox5 homozigotos simples apresentaram altura de planta ligeiramente mais alta do que mutantes ga20ox3/ga20ox5 homozigotos duplos. A Tabela
8 mostra os principais traços com delta porcentual em relação às plantas de controle tipo selvagem sem alelo editado (isto é, diferença porcentual em comparação ao controle).
[00103] Além disso, as folhas de colar superior em V8 foram coletadas para medir o nível de um painel de hormônios do ácido giberélico através de ensaios bioquímicos padrão. Os dados indicam que, no estágio de crescimento V8, os tecidos foliares dos colares superiores de plantas com edições GA20ox3 e GA20ox5 apresentam níveis significativamente mais baixos de GA20, GA4 e GA1, mas níveis mais altos de GA53 em comparação com o tipo selvagem (controle). As alterações nos níveis de hormônio GA observadas em tecidos de plantas com edições GA20ox3 e GA20ox5 foram semelhantes às observadas em plantas transgênicas SUP_Ox3&Ox5 (Tabela 9). Tabela 8: Editar GA20 oxidase_3, GA20 oxidase_5, ou ambos os genes impacta vários traços fisiológicos (mostrado como diferença percentual média em relação a um controle de tipo selvagem). Porcentual_ delta em relação ao controle WT ga20ox3 /ga20ox5 ga20ox5 ga20ox3 homozigoto duplo homozigoto homozigoto Traço (Planta # 18 a 31 na simples (planta # 11 simples (planta # Tabela 6) a 16 na Tabela 6) 32 e 33 na Tabela 6) Altura da planta até o nó da espiga R3 -46,12 -16,24 -22,55 Altura da planta até a folha ligulada mais alta R3 -30,39 -4,49 -8,6 Espiga do diâmetro da haste menos quatro R3 -6,21 -11,01 -3,37 Dias para 50% de seda visível em R1 -2,48 -2,48 -2,48 Diâmetro da espiga (imageamento) R6 -0,4 -0,48 -1,72 Comprimento da espiga (imageamento) R6 -5,83 -1,31 -4,56 Estimativa de rendimento de grãos R6 -12,2 -17,62 -16,55 Caroços por Espiga R6 -2,62 -5,14 -9,03 Caroços por unidade de área -10,59 -7,08 -11,15 Peso do caroço único R6 -1,59 -11,32 -6,29
Tabela 9: Editar GA20 oxidase_3, GA20 oxidase_5, ou ambos os genes afeta os níveis hormonais de GA (mostrados como Delta Médio, isto é, diferença em pmol GA/grama de tecido e (valor p), em relação a um controle tipo selvagem). A média de pmol GA/grama de tecido para níveis hormonais tipo selvagem também é mostrada. ga20ox3 ga20ox5 Estágio Tipo ga20ox3 /ga20ox5 Tipo homozigoto homozigoto SUP_Ox3 & Ox5 de cresci- Tipo de folha selvagem homozigoto duplo hormonal simples (Delta simples (Delta (Delta Médio) mento (média) (Delta médio) médio) médio) GA12- V8 Folha - colar superior 0,065 0,0250 (0,517) 0,0007 (0,985) 0,1382 (0,002) 0,1726 (1,91 E-4) pmol/g V8 Folha - colar superior GA1-pmol/g 2,726 0,3236 (0,355) 0,0984 (0,776) -1,8405 (5,64 E-5) -1,4112 (7,41 E-4) GA20- V8 Folha - colar superior 2,025 0,6085 (0,017) 0,6311 (0,014) -1,8525 (4,85 E-7) -1,8446 (5,13 E-7) pmol/g GA34- V8 Folha - colar superior 2,665 -0,2339 (0,191) -0,1940 (0,275) 0,3424 (0,061) 0,2456 (0,170) pmol/g V8 Folha - colar superior GA3-pmol/g 0,200 0,1747 (0,006) 0,2062 (0,002) -0,0586 (0,312) -0,03487 (0,544) V8 Folha - colar superior GA4-pmol/g 0,270 -0,0734 (0,455) 0,0169 (0,863) -0,1473 (0,144) -0,0842 (0,393) GA53- V8 Folha - colar superior 0,355 -0,0291 (0,893) 0,1493 (0,492) 0,9521 (3,77 E-4) 1,0875 (1,03 E-4) pmol/g V8 Folha - colar superior GA8-pmol/g 0,067 0,0066 (0,857) -0,0063 (0,863) -0,0065 (0,860) 0,0393 (0,292) V8 Folha - colar superior GA9-pmol/g 1,894 -1,0053 (0,034) -0,5852 (0,201) 2,5123 (1,48 E-5) 1,9821 (2,29 E-4)
[00104] Tendo descrito a presente divulgação em detalhes, será evidente que modalidades, variações e modificações equivalentes são possíveis sem se afastar do espírito e escopo da presente divulgação como descritas aqui e nas reivindicações anexadas. Além disso, deve ser apreciado que todos os exemplos na presente divulgação são fornecidos como exemplos não limitativos.

Claims (94)

REIVINDICAÇÕES
1. Planta de milho modificada, ou parte de planta da mesma, caracterizada pelo fato de que compreende um gene GA20 oxidase_3 mutante homozigoto e um gene GA20oxidase_5 mutante homozigoto.
2. Planta de milho modificada, ou parte de planta da mesma, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o referido gene GA20 oxidase_3 mutante homozigoto, o referido gene GA20 oxidase_5 mutante homozigoto ou ambos compreendem uma combinação heteroalélica de alelos mutantes ou dois alelos mutantes idênticos.
3. Planta de milho modificada, ou parte de planta da mesma, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que o referido gene GA20 oxidase_3 mutante compreende uma mutação em uma região de sequência selecionada do grupo que consiste em um promotor, 5' UTR, primeiro éxon, primeiro íntron, segundo éxon, segundo íntron, terceiro éxon, 3' UTR, terminador e qualquer combinação dos mesmos.
4. Planta de milho modificada, ou parte de planta da mesma, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que o referido gene GA20 oxidase_3 compreende um ou mais tipos de mutação selecionados do grupo que consiste em uma mutação não senso, uma mutação missenso, uma mutação frameshift, uma mutação de sítio de junção e qualquer combinação das mesmas.
5. Planta de milho modificada, ou parte de planta da mesma, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que o referido gene GA20 oxidase_3 resulta em um ou mais dos seguintes: um truncamento de proteína GA20 oxidase_3, um transcrito de gene GA20 oxidase_3 não traduzível, uma proteína GA20 oxidase_3 não funcional, um códon de parada prematura no gene GA20 oxidase_3 e qualquer combinação dos mesmos.
6. Planta de milho modificada, ou parte da planta da mesma, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que o referido gene GA20 oxidase_3 compreende uma mutação selecionada do grupo que consiste em uma substituição, uma deleção, uma inserção, uma duplicação e uma inversão de um ou mais nucleotídeos em relação a um gene GA20 oxidase_3 tipo selvagem.
7. Planta de milho modificada, ou parte de planta da mesma, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que o referido gene GA20 oxidase_5 mutante compreende uma mutação em uma região de sequência selecionada do grupo que consiste em um promotor, 5' UTR, primeiro éxon, primeiro íntron, segundo éxon, segundo íntron, terceiro éxon, 3' UTR, terminador e qualquer combinação dos mesmos.
8. Planta de milho modificada, ou parte de planta da mesma, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que o referido gene GA20 oxidase_5 compreende um ou mais tipos de mutação selecionados do grupo que consiste em uma mutação não senso, uma mutação missenso, uma mutação frameshift, uma mutação de sítio de junção e qualquer combinação das mesmas.
9. Planta de milho modificada, ou parte de planta da mesma, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que o referido gene GA20 oxidase_5 resulta em um ou mais dos seguintes: um truncamento de proteína GA20 oxidase_5, um transcrito de gene GA20 oxidase_5 não traduzível, uma proteína GA20 oxidase_5 não funcional, um códon de parada prematura no gene GA20 oxidase_5 e qualquer combinação dos mesmos.
10. Planta de milho modificada, ou parte de planta da mesma, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que o referido gene GA20 oxidase_5 compreende uma mutação selecionada do grupo que consiste em uma substituição, uma deleção, uma inserção, uma duplicação e uma inversão de um ou mais nucleotídeos em relação a um gene GA20 oxidase_5 tipo selvagem.
11. Planta de milho modificada, ou parte de planta da mesma, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que o referido gene GA20 oxidase_3, o referido gene GA20 oxidase_5 mutante homozigoto, ou ambos, compreendem uma ou mais mutações no primeiro éxon do gene correspondente.
12. Planta de milho modificada, ou parte de planta da mesma, de acordo com as reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que o referido gene GA20 oxidase_3, o referido gene GA20 oxidase_5 mutante homozigoto, ou ambos, compreendem uma ou mais mutações no segundo éxon do gene correspondente.
13. Planta de milho modificada, ou parte de planta da mesma, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizada pelo fato de que o referido gene GA20 oxidase_3, o referido gene GA20 oxidase_5, ou ambos compreendem um alelo nulo.
14. Planta de milho modificada, ou parte de planta da mesma, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 to 12, caracterizada pelo fato de que o referido gene GA20 oxidase_3 mutante homozigoto ou o referido gene GA20 oxidase_5 mutante homozigoto exibe uma redução de pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou 100% de expressão ou atividade enzimática em relação a um gene tipo selvagem correspondente.
15. Planta de milho modificada, ou parte de planta da mesma, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizada pelo fato de que o referido gene GA20 oxidase_3 mutante homozigoto compreende uma sequência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID Nºs: 170 a 181.
16. Planta de milho modificada, ou parte de planta da mesma, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizada pelo fato de que o referido gene GA20 oxidase_3 gene mutante homozigoto compreende uma sequência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID Nºs: 182 a 193.
17. Planta de milho modificada, ou parte de planta da mesma, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizada pelo fato de que o referido gene GA20 oxidase_3 mutante homozigoto compreende uma mutação identificada por uma ou mais de SEQ ID Nºs: 182 a 193 em relação à sequência de referência correspondente em SEQ ID Nºs:: 194 a 205.
18. Planta de milho modificada, ou parte de planta da mesma, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizada pelo fato de que o referido gene GA20 oxidase_3 gene mutante homozigoto compreende uma sequência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID Nºs: 206 a 217.
19. Planta de milho modificada, ou parte de planta da mesma, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, caracterizada pelo fato de que o referido gene GA20 oxidase_5 gene mutante homozigoto compreende uma sequência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID Nºs: 218 a 228.
20. Planta de milho modificada, ou parte de planta da mesma, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, caracterizada pelo fato de que o referido gene GA20 oxidase_5 gene mutante homozigoto compreende uma sequência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID Nºs: 229 a 239.
21. Planta de milho modificada, ou parte de planta da mesma, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, caracterizada pelo fato de que o referido gene GA20 oxidase_5 mutante homozigoto compreende uma mutação identificada por uma ou mais de
SEQ ID Nºs: 229 a 239 em relação à sequência de referência correspondente em SEQ ID Nºs: 240 a 250.
22. Planta de milho modificada, ou parte de planta da mesma, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, caracterizada pelo fato de que o referido gene GA20 oxidase_5 gene mutante homozigoto compreende uma sequência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID Nºs: 251 a 261.
23. Planta de milho modificada, ou parte de planta da mesma, caracterizada pelo fato de que compreende alelos mutantes em um locus de GA20 oxidase_3 endógeno e alelos mutantes homozigotos em um locus GA20 oxidase_5 endógeno.
24. Planta de milho modificada, ou parte de planta da mesma, de acordo com a reivindicação 23, caracterizada pelo fato de que os referidos alelos mutantes no locus de GA20 oxidase_3 endógeno, os referidos alelos mutantes homozigotos no locus GA20 oxidase_5 endógeno, ou ambos compreendem uma combinação heteroalélica ou dois alelos mutantes idênticos.
25. Planta de milho modificada, ou parte de planta da mesma, de acordo com a reivindicação 23 ou 24, caracterizada pelo fato de que os referidos alelos mutantes exibem uma redução de pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou 100% de redução de expressão ou atividade enzimática em relação a um alelo de GA20 oxidase_3 ou GA20 oxidase_5.
26. Planta de milho modificada, ou parte de planta da mesma, de acordo com qualquer uma das reivindicações 23 a 25, caracterizada pelo fato de que os referidos alelos mutantes homozigotos no locus de GA20 oxidase_3 endógeno compreendem uma mutação em uma região de sequência selecionada do grupo que consiste em um promotor, 5' UTR, primeiro éxon, primeiro íntron, segundo éxon,
segundo íntron, terceiro éxon, 3' UTR, terminador e qualquer combinação dos mesmos.
27. Planta de milho modificada, ou parte de planta da mesma, de acordo com qualquer uma das reivindicações 23 a 26, caracterizada pelo fato de que os referidos alelos mutantes homozigotos no locus de GA20 oxidase_3 endógeno compreendem um ou mais tipos de mutação selecionados do grupo que consiste em uma mutação não senso, uma mutação missenso, uma mutação frameshift, uma mutação de sítio de junção e qualquer combinação das mesmas.
28. Planta de milho modificada, ou parte de planta da mesma, de acordo com qualquer uma das reivindicações 23 a 27, caracterizada pelo fato de que os referidos alelos mutantes homozigotos no locus de GA20 oxidase_3 resulta em dos seguintes: um truncamento de proteína GA20 oxidase_3, um transcrito de gene GA20 oxidase_3 não traduzível, uma proteína GA20 oxidase_3 não funcional, um códon de parada prematura no gene GA20 oxidase_3 e qualquer combinação dos mesmos.
29. Planta de milho modificada, ou parte de planta da mesma, de acordo com qualquer uma das reivindicações 23 a 28, caracterizada pelo fato de que os referidos alelos mutantes homizigotos no locus de GA20 oxidase_3 endógeno compreendem uma mutação selecionada do grupo que consiste em uma substituição, uma deleção, uma inserção, uma duplicação e uma inversão de um ou mais nucleotídeos em relação a um gene GA20 oxidase_3 tipo selvagem.
30. Planta de milho modificada, ou parte de planta da mesma, de acordo com qualquer uma das reivindicações 23 a 29, caracterizada pelo fato de que os referidos alelos mutantes homozigotos no locus de GA20 oxidase_3 endógeno compreendem uma ou mais mutações no primeiro éxon do gene e GA20 oxidase_3.
31. Planta de milho modificada, ou parte de planta da mesma, de acordo com qualquer uma das reivindicações 23 a 30, caracterizada pelo fato de que os referidos alelos mutantes homozigotos no locus de GA20 oxidase_3 compreende uma ou mais mutações no segundo éxon do gene GA20 oxidase_3.
32. Planta de milho modificada, ou parte de planta da mesma, de acordo com qualquer uma das reivindicações 23 a 31, caracterizada pelo fato de que os referidos alelos mutantes homozigotos no locus de GA20 oxidase_5 endógeno compreendem uma mutação em uma região de sequência selecionada do grupo que consiste em um promotor, 5' UTR, primeiro éxon, primeiro íntron, segundo éxon, segundo íntron, terceiro éxon, 3' UTR, terminador e qualquer combinação dos mesmos.
33. Planta de milho modificada, ou parte de planta da mesma, de acordo com qualquer uma das reivindicações 23 a 32, caracterizada pelo fato de que os referidos alelos mutantes homozigotos no locus de GA20 oxidase_5 endógeno compreendem um ou mais tipos de mutação selecionados do grupo que consiste em uma mutação não senso, uma mutação missenso, uma mutação frameshift, uma mutação de sítio de junção e qualquer combinação das mesmas.
34. Planta de milho modificada, ou parte de planta da mesma, de acordo com qualquer uma das reivindicações 23 a 33, caracterizada pelo fato de que os referidos alelos mutantes homozigotos no locus de GA20 oxidase_5 endógeno resulta em um ou mais dos seguintes: um truncamento de proteína GA20 oxidase_5, um transcrito de gene GA20 oxidase_5 não traduzível, uma proteína GA20 oxidase_5 não funcional, um códon de parada prematura no gene GA20 oxidase_5 e qualquer combinação dos mesmos.
35. Planta de milho modificada, ou parte de planta da mesma, de acordo com qualquer uma das reivindicações 23 a 34, caracterizada pelo fato de que os referidos alelos mutantes homizigotos no locus de GA20 oxidase_5 endógeno compreendem uma mutação selecionada do grupo que consiste em uma substituição, uma deleção, uma inserção, uma duplicação e uma inversão de um ou mais nucleotídeos em relação a um gene GA20 oxidase_5 tipo selvagem.
36. Planta de milho modificada, ou parte de planta da mesma, de acordo com qualquer uma das reivindicações 23 a 35, caracterizada pelo fato de que os referidos alelos mutantes homozigotos no locus de GA20 oxidase_5 endógeno compreendem uma ou mais mutações no primeiro éxon do gene e GA20 oxidase_5.
37. Planta de milho modificada, ou parte de planta da mesma, de acordo com qualquer uma das reivindicações 23 a 36, caracterizada pelo fato de que os referidos alelos mutantes homozigotos no locus de GA20 oxidase_5 compreende uma ou mais mutações no segundo éxon do gene GA20 oxidase_5.
38. Planta de milho modificada, ou parte de planta da mesma, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 37, caracterizada pelo fato de que a referida planta de milho modificada tem uma altura de planta mais curta e/ou resistência de alojamento melhorada em relação a uma planta de controle não modificada.
39. Planta de milho modificada, ou parte de planta da mesma, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 37, caracterizada pelo fato de que a referida planta de milho modificada é pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35% ou pelo menos 40% mais curta que uma planta de controle não modificada.
40. Planta de milho modificada, ou parte de planta da mesma, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 37, caracterizada pelo fato de que o diâmetro do talo ou caule da referida planta de milho modificada em um ou mais internodos de caule é pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35% ou pelo menos 40% maior que o diâmetro do talo ou caule nos mesmos um ou mais internodos de uma planta de controle não modificada.
41. Planta de milho modificada, ou parte de planta da mesma, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 37, caracterizada pelo fato de que o diâmetro do talo ou caule da referida planta de milho modificada em um ou mais do primeiro, segundo, terceiro e/ou quarto internodos abaixo da espiga é pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35% ou pelo menos 40% maior que o mesmo internodo de uma planta de controle não modificada.
42. Planta de milho modificada, ou parte de planta da mesma, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 37, caracterizada pelo fato de que o nível de um ou mais GAs ativos em pelo menos um tecido internodo do talo ou caule da referida planta de milho modificada é pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35% ou pelo menos 40% mais baixo que o mesmo tecido internodo de uma planta de controle não modificada.
43. Planta de milho modificada, ou parte de planta da mesma, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 37, caracterizada pelo fato de que o nível de um ou mais GAs ativos em pelo menos um tecido internodo do talo ou caule da referida planta de milho modificada é mais baixo que o mesmo tecido internodo de uma planta de controle não modificada.
44. Planta de milho modificada, ou parte de planta da mesma, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 37, caracterizada pelo fato de que a referida planta de milho modificada não temi nenhum fora de tipo significativo em pelo menos um órgão ou espiga fêmea.
45. Planta de milho modificada, ou parte de planta da mesma, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 37, caracterizada pelo fato de que a referida planta de milho modificada não exibe essencialmente nenhuma anormalidade reprodutiva.
46. Planta de milho modificada, ou parte de planta da mesma, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 37, caracterizada pelo fato de que a referida planta de milho modificada compreende um ou mais traços em relação a uma planta de controle não modificada selecionada do grupo que consiste em altura de planta mais curta, elevado diâmetro de talo/caule, resistência ao alojamento melhorada, estalo verde reduzido, raízes mais profundas, elevada área foliar, fechamento de copa mais precoce, condutância estomática mais alta, altura de espiga mais baixa, elevado teor de água foliar, tolerância à seca melhorada, eficiência de uso de nitrogênio melhorada, teor de antocianina reduzido e área nas folhas sob condições de tensão normais ou limitantes de nitrogênio ou limitantes de água, elevado peso de espiga, elevado índice de colheita, elevada produtividade, elevado número de sementes, elevado peso de semente e elevada prolificidade.
47. Planta de milho modificada ou parte da planta de qualquer uma das reivindicações 23 a 37, caracterizada pelo fato de que os referidos alelos mutantes homozigotos no locus de GA20 oxidase_3 compreendem uma sequência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID Nºs: 170 a 181.
48. Planta de milho modificada, ou parte de planta da mesma, de acordo com qualquer uma das reivindicações 23 a 37, caracterizada pelo fato de que os referidos alelos mutantes homozigotos no locus de GA20 oxidase_3 endógeno compreendem uma sequência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID Nºs: 182 a 193.
49. Planta de milho modificada, ou parte de planta da mesma, de acordo com qualquer uma das reivindicações 23 a 37, caracterizada pelo fato de que os referidos alelos mutantes homozigotos no locus de GA20 oxidase_3 endógeno compreendem um ou mais alelos identificados por uma ou mais de SEQ ID Nºs: 182 a 193 em relação à sequência de referência correspondente em SEQ ID Nºs: 194 a 205.
50. Planta de milho modificada, ou parte de planta da mesma, de acordo com qualquer uma das reivindicações 23 a 37, caracterizada pelo fato de que os referidos alelos mutantes homozigotos no locus de GA20 oxidase_3 endógeno compreende uma sequência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID Nºs: 206 a 217.
51. Planta de milho modificada, ou parte de planta da mesma, de acordo com qualquer uma das reivindicações 23 a 50, caracterizada pelo fato de que os referidos alelos mutantes homozigotos no locus de GA20 oxidase_5 endógeno compreendem uma sequência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID Nºs: 218 a 228.
52. Planta de milho modificada, ou parte de planta da mesma, de acordo com qualquer uma das reivindicações 23 a 50, caracterizada pelo fato de que os referidos alelos mutantes homozigotos no locus de GA20 oxidase_5 endógeno compreende uma sequência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID Nºs: 229 a 239.
53. Planta de milho modificada, ou parte de planta da mesma, de acordo com qualquer uma das reivindicações 23 a 50, caracterizada pelo fato de que os referidos alelos mutantes homozigotos no locus de GA20 oxidase_5 endógeno compreendem um ou mais alelos identificados por uma ou mais de SEQ ID Nºs: 229 a 239 em relação à sequência de referência correspondente em SEQ ID Nºs: 240 a 250.
54. Planta de milho modificada, ou parte de planta da mesma, de acordo com qualquer uma das reivindicações 23 a 50,
caracterizada pelo fato de que os referidos alelos mutantes homozigotos no locus de GA20 oxidase_5 endógeno compreende uma sequência selecionada do grupo que consiste em SEQ ID Nºs: 251 a 261.
55. Método para fazer uma planta de milho modificada, ou parte de planta da mesma, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) cruzar uma primeira planta de milho compreendendo um alelo mutante do locus GA20 oxidase_3 com uma segunda planta compreendendo um alelo mutante do locus GA20 oxidase_5; e (b) selecionar uma planta de milho de progênie, ou parte da mesma, do cruzamento na etapa (a) que é homozigoto para um ou mais alelos mutantes do locus de GA20 oxidase_3 e homozigoto para um ou mais alelos mutantes do locus de GA20 oxidase_5 locus.
56. Método, de acordo com a reivindicação 55, caracterizado pelo fato de que a primeira planta de milho é homozigoto para um ou mais alelos mutantes do locus de GA20 oxidase_3 e a segunda planta de milho é heterozigoto para um alelo mutante do locus de GA20 oxidase_5.
57. Método, de acordo com a reivindicação 55, caracterizado pelo fato de que a primeira planta de milho é heterozigoto para um alelo mutante do locus de GA20 oxidase_3 e a segunda planta de milho é homozigoto para um ou mais alelos mutantes do locus de GA20 oxidase_5.
58. Método, de acordo com a reivindicação 55, caracterizado pelo fato de que a primeira planta de milho é homozigoto para um ou mais alelos mutantes do locus de GA20 oxidase_3 e a segunda planta de milho é homozigoto para um ou mais alelos mutantes do locus de GA20 oxidase_5.
59. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 55 a 56, caracterizado pelo fato de que a primeira planta de milho é heterozigoto para um alelo mutante do locus de GA20 oxidase_5.
60. Método, de acordo com a reivindicação 59, caracterizado pelo fato de que a segunda planta de milho é homozigoto para um alelo do tipo selvagem do locus de GA20 oxidase_3.
61. Método, de acordo com a reivindicação 59, caracterizado pelo fato de que a segunda planta de milho é heterozigoto para um alelo mutante do locus de GA20 oxidase_3.
62. Método, de acordo com a reivindicação 59, caracterizado pelo fato de que a segunda planta de milho é homozigótica para um ou mais alelos mutantes do locus de GA20 oxidase_3.
63. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 55 a 58, caracterizado pelo fato de que a primeira planta de milho é homozigótica para um ou mais alelos mutantes do locus de GA20 oxidase_5.
64. Método, de acordo com a reivindicação 63, caracterizado pelo fato de que a segunda planta de milho é homozigoto para um alelo do tipo selvagem do locus de GA20 oxidase_3.
65. Método, de acordo com a reivindicação 63, caracterizado pelo fato de que a segunda planta de milho é heterozigoto para um alelo mutante do locus de GA20 oxidase_3.
66. Método, de acordo com a reivindicação 63, caracterizado pelo fato de que a segunda planta de milho é homozigoto para um ou mais alelos mutantes do locus de GA20 oxidase_3.
67. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 55 a 58, caracterizado pelo fato de que a primeira planta de milho é homozigoto para um alelo do tipo selvagem do locus de GA20 oxidase_5.
68. Método, de acordo com a reivindicação 67, caracterizado pelo fato de que a segunda planta de milho é homozigoto para um alelo do tipo selvagem do locus de GA20 oxidase_3.
69. Método, de acordo com a reivindicação 67, caracterizado pelo fato de que a segunda planta de milho é homozigótica para um ou mais alelos mutantes do locus de GA20 oxidase_3.
70. Método, de acordo com a reivindicação 67, caracterizado pelo fato de que a segunda planta de milho é heterozigótica para um alelo mutante do locus de GA20 oxidase_3.
71. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 55 a 70, caracterizado pelo fato de que a planta de milho de progênie é uma planta de milho de progênie F1.
72. Método para fazer uma planta de milho modificada, ou parte de planta da mesma, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) cruzar uma primeira planta de milho compreendendo um alelo mutante do locus GA20 oxidase_3 e um alelo mutante do locus GA20 oxidase_5 com uma segunda planta; e (b) selecionar uma planta de milho de progênie, ou parte da mesma, do cruzamento na etapa (a) que é homozigoto para um ou mais alelos mutantes do locus de GA20 oxidase_3 e homozigoto para um ou mais alelos mutantes do locus de GA20 oxidase_5 locus.
73. Método, de acordo com a reivindicação 72, caracterizado pelo fato de que a primeira planta de milho é heterozigótica para um alelo mutante do locus GA20 oxidase_3 e é heterozigótica para um alelo mutante do locus GA20 oxidase_5.
74. Método, de acordo com a reivindicação 72, caracterizado pelo fato de que a primeira planta de milho é homozigoto para um ou mais alelos mutantes do locus de GA20 oxidase_3 e é heterozigoto para um alelo mutante do locus de GA20 oxidase_5.
75. Método, de acordo com a reivindicação 72, caracterizado pelo fato de que a primeira planta de milho é homozigoto para um ou mais alelos mutantes do locus de GA20 oxidase_3 e é homozigoto para um ou mais alelos mutantes do locus de GA20 oxidase_5.
76. Método, de acordo com a reivindicação 72, caracterizado pelo fato de que a primeira planta de milho é homozigoto para um ou mais alelos mutantes do locus de GA20 oxidase_3 e a segunda planta de milho é heterozigoto para um alelo mutante do locus de GA20 oxidase_5.
77. Método, de acordo com a reivindicação 72, caracterizado pelo fato de que a primeira planta de milho é heterozigoto para um alelo mutante do locus de GA20 oxidase_3 e a segunda planta de milho é homozigoto para um ou mais alelos mutantes do locus de GA20 oxidase_5.
78. Método, de acordo com a reivindicação 72, caracterizado pelo fato de que a primeira planta de milho é homozigoto para um ou mais alelos mutantes do locus de GA20 oxidase_3 e a segunda planta de milho é homozigoto para um ou mais alelos mutantes do locus de GA20 oxidase_5.
79. Método, de acordo com a reivindicação 72, caracterizado pelo fato de que a primeira planta de milho é homozigoto para um ou mais alelos mutantes do locus de GA20 oxidase_3 e a segunda planta de milho é homozigoto para um ou mais alelos mutantes do locus de GA20 oxidase_5.
80. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 76 a 79, caracterizado pelo fato de que a primeira planta de milho é heterozigoto para um alelo mutante do locus de GA20 oxidase_5.
81. Método, de acordo com a reivindicação 80, caracterizado pelo fato de que a segunda planta de milho é homozigoto para um alelo do tipo selvagem do locus de GA20 oxidase_3.
82. Método, de acordo com a reivindicação 80, caracterizado pelo fato de que a segunda planta de milho é heterozigótica para um alelo mutante do locus de GA20 oxidase_3.
83. Método, de acordo com a reivindicação 80, caracterizado pelo fato de que a segunda planta de milho é homozigótica para um ou mais alelos mutantes do locus de GA20 oxidase_3.
84. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 76 a 79, caracterizado pelo fato de que a primeira planta de milho é homozigótica para um ou mais alelos mutantes do locus de GA20 oxidase_5.
85. Método, de acordo com a reivindicação 84, caracterizado pelo fato de que a segunda planta de milho é homozigótica para um alelo do tipo selvagem do locus de GA20 oxidase_3.
86. Método, de acordo com a reivindicação 84, caracterizado pelo fato de que a segunda planta de milho é heterozigótica para um alelo mutante do locus de GA20 oxidase_3.
87. Método, de acordo com a reivindicação 84, caracterizado pelo fato de que a segunda planta de milho é homozigótica para um ou mais alelos mutantes do locus de GA20 oxidase_3.
88. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 76 a 79, caracterizado pelo fato de que a segunda planta de milho é heterozigótica para um alelo mutante do locus de GA20 oxidase_3.
89. Método, de acordo com a reivindicação 88, caracterizado pelo fato de que a primeira planta de milho é heterozigótica para um alelo mutante do locus de GA20 oxidase_3.
90. Método, de acordo com a reivindicação 88, caracterizado pelo fato de que a primeira planta de milho é homozigótica para um ou mais alelos mutantes do locus de GA20 oxidase_5.
91. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 76 a 79, caracterizado pelo fato de que a segunda planta de milho é homozigótica para um ou mais alelos mutantes do locus de GA20 oxidase_3.
92. Método, de acordo com a reivindicação 91, caracterizado pelo fato de que a primeira planta de milho é heterozigótica para um alelo mutante do locus de GA20 oxidase_5.
93. Método, de acordo com a reivindicação 91, caracterizado pelo fato de que a primeira planta de milho é homozigótica para um ou mais alelos mutantes do locus de GA20 oxidase_5.
94. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 72 a 93, caracterizado pelo fato de que a planta de milho de progênie é uma planta de milho de progênie F1.
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