CN115786390A - 一种母体细胞自主的孤雌单倍体生殖方法及其育种应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种母体细胞自主的孤雌单倍体生殖方法及其育种应用。本发明提供了获得玉米孤雌单倍体的方法，包括：将介导玉米卵细胞异位表达ZmBBM2基因的CRISPRa5基因激活系统的系统载体导入受体玉米，得到阳性转基因玉米；由于植物卵细胞中ZmBBM2基因实现异位激活，导致卵细胞直接发育形成单倍体胚。本发明为获得作物单倍体提供了一种有效的途径。同时，为玉米孤雌生殖提供了新的基因资源，为其他作物的无融合生殖合成提供了新的思路。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种母体细胞自主的孤雌单倍体生殖方法及其育种应用。
背景技术
植物无融合生殖过程不经精卵两性细胞受精作用而形成种子，通过该生殖方式能产生基因型与母本完全一致的种子，所以在固定杂种优势、提高育种效率、降低制种成本方面有巨大潜力，在杂交育种界被誉为实现新一次绿色革命的“无性生殖革命”(Spillane,C.,Steimer,A.,and Grossniklaus,U.(2001)Apomixis in agriculture:the quest forclonal seeds.Sex.Plant Reprod.,14,179–187.)。然而，玉米、水稻和小麦等主要粮食作物由于缺乏无融合生殖种质资源，限制了该技术在重要经济粮食作物上的推广与应用。2019年，王克剑研究员团队与Sundaresan教授团队分别独立突破性运用基因编辑技术，创制了有丝分裂型减数分裂(MiMe)结合单性生殖的克隆生殖技术，首次概念性验证了水稻无融合生殖技术的可行性。然而，孤雌单倍体结实率低仍是限制了该技术应用的瓶颈(Wang,C.,Liu,Q.,Shen,Y.,Hua,Y.,Wang,J.,Lin,J.,et al.(2019)Clonal seeds from hybridrice by simultaneous genome engineering of meiosis and fertilizationgenes.Nat.Biotechnol.,37,283–286.Khanday,I.,Skinner,D.,Yang,B.,Mercier,R.,andSundaresan,V.(2019)A male-expressed rice embryogenic trigger redirected forasexual propagation through seeds.Nature,565,91–95.)。因此，探索作物孤雌单倍体发生途径并解析其生物学机制，具有重要的理论意义与实践价值。
BBM转录因子属于APETALA2(AP2)家族，在调控花分生组织的发育、促进细胞增殖和形态发生中发挥了重要的调节作用(Kim S,Soltis P S,Wall K,et al.Phylogeny anddomain evolution in the APETALA2-like gene family[J].Molecular Biology andEvolution,2006,23(1):107-120.)。前期研究表明，BBM转录因子卵细胞异位表达可显著提升植物孤雌单倍体频率。2015年Conner等人发现，狼尾草BBM基因PsASGR-BBML卵细胞异位表达可诱导后代形成36％的孤雌单倍体(Conner J A,Mookkan M,Huo H,et al.Aparthenogenesis gene of apomict origin elicits embryo formation fromunfertilized eggs in a sexual plant[J].Proceedings of the National Academy ofSciences,2015,112(36):11205-11210.)。2017年，Conner等人利用卵细胞特异启动子pDD45启动PsASGR-BBML基因，实现PsASGR-BBML基因在水稻及玉米卵细胞中异位表达并分别获得89％以及80％的孤雌单倍体后代，同时该研究在玉米中利用内源PsASGR-BBML基因启动子启动PsASGR-BBML仍可诱导单倍体形成但频率仅为47％(Conner J A,Podio M,Ozias A P.Haploid embryo production in rice and maize induced by PsASGR-BBMLtransgenes[J].Plant Reproduction,2017,30(1):41-52.)。2018年Khanday等人研究发现水稻卵细胞异位表达OsBBM1基因可显著提升水稻孤雌单倍体诱导频率(Khanday,I.,Skinner,D.,Yang,B.,Mercier,R.,and Sundaresan,V.(2019)A male-expressed riceembryogenic trigger redirected for asexual propagation through seeds.Nature,565,91–95.)。
在真核细胞中，基因表达在发育和分化等过程中受到严格的控制。转录因子通过与靶基因增强子和启动子区域的特定DNA序列结合，是调控靶基因转录的关键调控因子(Spitz,F.and Furlong,E.E.M.(2012)Transcription factors:from enhancer bindingto developmental control.Nat.Rev.Genet.,13,613–626.)。基于同样的原理，人工转录因子(Artificial Transcription Factors，ATFs)是将具有序列特异性的DNA结合域融合到激活结构域以调节基因表达，如锌指ATF(Wilson,K.A.,Chateau,M.L.,and Porteus,M.H.(2013)Design and development of artificial zinc finger transcriptionfactors and zinc finger nucleases to the hTERT locus.Mol.Ther.Nucleic Acids,2,e87.)、转录激活因子样效应器ATF(Liu,W.,Rudis,M.R.,Peng,Y.,Mazarei,M.,Millwood,R.J.,Yang,J.-P.,et al.(2014)Synthetic TAL effectors for targetedenhancement of transgene expression in plants.Plant Biotechnol.J.,12,436–446.)以及CRISPR介导的基因激活系统(Gilbert,L.A.,Larson,M.H.,Morsut,L.,Liu,Z.,Brar,G.A.,Torres,S.E.,et al.(2013)CRISPR-mediated modular RNA-guidedregulation of transcription in eukaryotes.Cell,154,442–451.)。与以前的ATFs工具不同，CRISPR介导的基因激活，也被称为CRISPRa，因其具备设计简单灵活且成本较低等优点，因此，近年来利用基因激活系统调控植物内源基因，研究目标基因表达网络一直是植物研究领域热点。基于基因编辑系统的基因表达调控工具的开发丰富了植物转录激活系列工具，如动物中已建立的几种高效CRISPRa工具：VP64-P65-Rta(VPR)、CRISPR-SAM以及Cas9-SunTag等。在植物中dCas9-VP64、dCas9-6TAL-VP128、CRISPR-Act2.0以及CRISPR-Act3.0等转录激活系列工具在植物中表现出较强的基因转录激活水平。然而目前为止尚未开发出适用于玉米卵细胞特异的或植株的基因激活系统。因此，建立玉米基因激活系统将为研究玉米卵细胞异位表达ZmBBM2基因以及探索BBM基因剂量效应与孤雌单倍体诱导频率之间的关系提供了强有力的技术手段。
发明内容
本发明的目的是提供一种母体细胞自主的孤雌单倍体生殖方法及其育种应用。
第一方面，本发明要求保护一种获得玉米孤雌单倍体的方法。
本发明所要求保护的获得玉米孤雌单倍体的方法，可包括如下步骤：将用于介导玉米卵细胞异位表达ZmBBM2基因的CRISPRa5基因激活系统的系统载体导入受体玉米，得到阳性转基因玉米；所述转基因阳性玉米的部分胚囊中的卵细胞能直接发育成为单倍体胚，形成单倍体种子。
所述系统载体能够表达dCas9-VP64融合蛋白，能够表达MS2-P65-HSF1融合蛋白，并且能够表达靶向ZmBBM2基因转录起始点上游-200至-1bp位置的一个或若干个sgRNA，所述sgRNA为sgRNA2.0。
进一步地，所述系统载体上含有如下2个表达盒：
表达盒1：用于表达2个所述sgRNA；在所述表达盒1中，含有2个sgRNA的编码序列，2个所述sgRNA的编码序列以拟南芥At-tRNAGly编码序列连接，由同一个启动子启动转录；
表达盒2：用于表达功能蛋白，所述功能蛋白为将所述dCas9-VP64融合蛋白和所述MS2-P65-HSF1融合蛋白通过自裂解多肽T2A融合而成；在所述表达盒2中，所述功能蛋白由植物卵细胞特异性启动子启动转录。
在本发明的具体实施方式中，2个sgRNA分别靶向ZmBBM2基因TSS上游的-36及-166bp区域。
在本发明的一些案例中，在所述表达盒1中，所述启动子为ZmU6-2启动子。
在本发明的一些案例中，在所述表达盒2中，所述植物卵细胞特异性启动子为拟南芥DD45启动子。
在本发明的一些案例中，所述dCas9-VP64融合蛋白和所述MS2-P65-HSF1融合蛋白均含有核定位信号。
在本发明的具体实施方式中，所述表达盒1自5’端到3’端依次由所述ZmU6-2启动子、靶向ZmBBM2基因转录起始点(TSS)上游-36bp区域的sgRNA间隔序列的编码核酸、sgRNA2.0支架编码序列、所述拟南芥At-tRNAGly编码序列、靶向ZmBBM2基因转录起始点(TSS)上游-166bp区域的sgRNA间隔序列的编码核酸、所述sgRNA2.0支架编码序列组成。
在本发明的具体实施方式中，所述表达盒2自5’端到3’端依次由所述拟南芥DD45启动子、3×Flag标签编码核酸、SV40核定位信号编码序列、dCas9编码基因、NLS核定位信号编码序列、VP64编码基因、所述自裂解多肽T2A的编码基因、MS2编码基因、所述SV40核定位信号编码序列、P65编码基因、HSF1编码基因和转录终止子NOS组成。
在所述表达盒1中，所述ZmU6-2启动子如SEQ ID No.16的第1-397位所示；所述靶向ZmBBM2基因转录起始点(TSS)上游-36bp区域的sgRNA间隔序列的编码核酸如SEQ IDNo.16的第398-417位所示；所述sgRNA2.0支架编码序列如SEQ ID No.16的第418-553位或第651-793位所示；所述拟南芥At-tRNAGly编码序列如SEQ ID No.16的第554-630位所示；所述靶向ZmBBM2基因转录起始点(TSS)上游-166bp区域的sgRNA间隔序列的编码核酸如SEQID No.16的第631-650位所示。
在所述表达盒2，所述拟南芥DD45启动子如SEQ ID No.16的第1008-2017位所示；所述3×Flag标签编码核酸如SEQ ID No.16的第2018-2086位所示；所述SV40核定位信号编码序列如SEQ ID No.16的第2093-2113位或第6992-7012位所示；所述dCas9编码基因如SEQID No.16的第2114-6238位所示；所述NLS核定位信号编码序列如SEQ ID No.16的第6239-6286位所示；所述VP64编码基因如SEQ ID No.16的第6305-6454位所示；所述自裂解多肽T2A的编码基因如SEQ ID No.16的第6482-6535位所示；所述MS2编码基因如SEQ ID No.16的第6551-6937位所示；所述P65编码基因如SEQ ID No.16的第7028-7570位所示；所述HSF1编码基因如SEQ ID No.16的第7595-7966位所示；所述转录终止子NOS如SEQ ID No.16的第7967-8238位所示。
所述表达盒1的核苷酸序列如SEQ ID No.16的第1-1007位所示。
所述表达盒2的核苷酸序列如SEQ ID No.16的第1008-8238位所示。
所述CRISPRa5基因激活系统的系统载体为含有SEQ ID No.16所示DNA片段的质粒。在本发明的具体实施方式中，具体为将SEQ ID No.16所示DNA片段替换CPB载体(本实验室保存，文章Li C,Liu C,Qi X,et al.RNA-guided Cas9 as an in vivo desired-targetmutator in maize[J].Plant biotechnology journal,2017,15(12):1566-1576.)的酶切位点HindIII和EcoRI之间的小片段后得到的重组载体。
所述方法还可包括如下步骤：以玉米单倍体辅助筛选系作为花粉供体，对所述阳性转基因玉米进行授粉，从而筛选出玉米孤雌单倍体。
在本发明的具体实施方式中，所述受体玉米为玉米自交系KN5585。所述玉米单倍体辅助筛选系为DFP单倍体辅助筛选玉米转基因株系(记载于文献“Dong L,Li L,Liu C,etal.Genome editing and double-fluorescence proteins enable robust maternalhaploid induction and identification in maize[J].Molecular plant,2018,11(9):1214-1217.”中的“As shown in Supplemental Figure 1,the eGFP gene was found tobe expressed in embryos(green)and DsRED was expressed in endosperms(red).TheDFP cassette was then stably transformed into the maize variety ZC01,the sameinbred line as the created haploid inducer line(Figure 1C)”，即该文献中将图1C所示的DFP盒稳定转化到玉米品种ZC01中后得到的转基因株系，公众可从申请人处获得，仅可用于重复本发明实验使用，不得他用)。该转基因系含有两个荧光报告表达盒，一个是标记糊粉层的利用糊粉层特异性启动子LTP2启动DsRed2基因，该表达盒可将玉米籽粒的糊粉层标记成红色荧光。另一个表达盒为标记胚的利用胚特异性启动子启动eGFP基因。因此将DFP单倍体辅助筛选玉米转基因株系作为花粉供体对所述受体玉米进行授粉，当材料未诱导成为单倍体时DFP系提供的两个精细胞可以实现双受精进而得到胚发绿光而胚乳糊粉层发红光的籽粒，当材料卵细胞发育成单倍体时，DFP提供的两个精细胞其中一个与中央细胞结合形成胚乳糊粉层发红光，而胚未接受DFP精子因此不发荧光。
第二方面，本发明要求保护前文第一方面中所述的用于介导玉米卵细胞异位表达ZmBBM2基因的所述CRISPRa5基因激活系统的系统载体。
第三方面，本发明要求保护前文第二方面中所述的系统载体在诱发玉米孤雌单倍体发生中的应用。
第四方面，本发明要求保护一种基于CRISPR的基因激活系统。
本发明所要求保护的基于CRISPR的基因激活系统的系统载体能够表达dCas9-VP64融合蛋白，能够表达MS2-P65-HSF1融合蛋白，并且能够表达靶向目标基因靶标区域的一个或若干个sgRNA，所述sgRNA为sgRNA2.0。
进一步地，所述系统载体上含有如下2个表达盒：
表达盒1’：用于表达所述sgRNA；
表达盒2’：用于表达功能蛋白，所述功能蛋白为将所述dCas9-VP64融合蛋白和所述MS2-P65-HSF1融合蛋白通过自裂解多肽T2A融合而成。
更进一步地，在所述表达盒1’中，用于启动所述sgRNA转录的启动子为U6启动子。在所述表达盒2’中，用于启动所述功能蛋白转录的启动子为UBI启动子。所述dCas9-VP64融合蛋白和所述MS2-P65-HSF1融合蛋白均含有核定位信号。
在本发明的具体实施方式中，所述表达盒1’自5’端到3’端依次由所述U6启动子、靶向靶向目标基因靶标区域的sgRNA间隔序列的编码核酸、sgRNA2.0支架编码序列组成。
在本发明的具体实施方式中，所述表达盒2’自5’端到3’端依次由所述UBI启动子、NLS核定位信号编码序列、dCas9编码基因、VP64编码基因、所述自裂解多肽T2A的编码基因、MS2编码基因、所述NLS核定位信号编码序列、P65编码基因、HSF1编码基因和NOS转录终止子组成。
在所述表达盒1’中，所述U6启动子的核苷酸序列如SEQ ID No.7-15的第1-397位所示；所述sgRNA2.0支架编码序列如SEQ ID No.8-15的第418-560位所示。
在所述表达盒2’中，所述UBI启动子的核苷酸序列如SEQ ID No.5的第18-2013位所示；所述NLS核定位信号编码序列如SEQ ID No.5的第2107-2127位或第7006-7026位所示；所述dCas9编码基因如SEQ ID No.5的第2152-6252位所示；所述VP64编码基因如SEQ IDNo.5的第6319-6495位所示；所述自裂解多肽T2A的编码基因如SEQ ID No.5的第6496-6549位所示；所述MS2编码基因如SEQ ID No.5的第6565-6951位所示；所述P65编码基因如SEQID No.5的第7042-7584位所示；所述HSF1编码基因如SEQ ID No.5的第7609-7983位所示；所述NOS转录终止子如SEQ ID No.5的第8018-8270位所示。所述表达盒2’的序列如SEQ IDNo.5所示。
第五方面，本发明要求保护前文第四方面所述基于CRISPR的基因激活系统在对目的基因进行基因激活中的应用。
本发明利用玉米叶肉生质体瞬时表达系统筛选并鉴定了6套基于CRISPR的基因激活系统，结果表明由dCas9-VP64和p65-HSF1激活域组成的CRISPRa5系统在玉米叶肉原生质体中表现出最强的转录激活活性；接着，基于酶解及显微操作技术，本发明建立了玉米卵细胞分离与转化体系，结合卵细胞特异表达的CRISPRa5基因激活系统，验证了CRISPRa5基因激活工具在玉米卵细胞中具有较强的转录激活活性；然后，以玉米内源基因ZmBBM2启动子为靶点，设计CRISPRa5卵细胞异位激活内源ZmBBM2基因载体，结合农杆菌介导玉米幼胚转化技术获得9个转基因事件(EA13,EA15,EA19,EA21,EA22,EA28,EA34,EA36)，利用原位杂交技术、免疫组化、单细胞RT-ddPCR技术等生物化学与分子生物学手段对转化事件进行检测，确定了CRISPRa5在卵细胞中表达且可异位激活内源ZmBBM2基因实现高水平的基因激活；最终，结合流式细胞技术、DFP单倍体筛选系统及表型观察本发明发现，利用CRISPRa5基因激活系统于玉米卵细胞中异位激活ZmBBM2基因可以诱发玉米孤雌单倍体的发生，且最高单倍体诱导发生效率高达3.55％。综上所述，本发明利用CRISPRa5基因激活系统介导玉米卵细胞异位表达ZmBBM2基因，进而诱发玉米孤雌单倍体发生，该技术为工程化的玉米孤雌单倍体生殖的创制提供了一种新的途径与方法。本发明为获得作物单倍体提供了一种有效的途径。同时，为玉米孤雌生殖提供了新的基因资源，为其他作物的无融合生殖合成提供了新的思路。
附图说明
图1为评估玉米叶肉原生质体中CRISPRa(1-6)工具转录激活能力。a：CRISPRa载体。dCas9，化脓性链球菌Cas9缺乏内切酶活性(突变D10A，H840A)；ERF2m，拟南芥乙烯反应修饰转录激活因子2(ERF2)；HSF1，人热休克因子1；MS2，噬菌体外壳蛋白；NLS，核定位信号；P65，NF-kB反式激活亚基P65；pU6，ZmU6-2启动子；pUBI，玉米泛素启动子；sgRNA1.0，Cas9常规sgRNA；sgRNA2.0，包含两个MS2茎环的sgRNA骨架；T，终止子；T2A，自裂解多肽；VP64，转录激活因子VP16的4个拷贝。b：a4-a6系统的三个组成部分示意图。c-d：RT-qPCR检测ZmDPS1表达。c：ZmDPS1位点示意图。第一个转录起始位点(TSS)被命名为+1。d：CRISPRa(1-6)介导ZmDPS1的激活表达。以玉米泛素基因(NCBIGenBank：U29159.1)为参考。使用2-△△Ct方法计算相对表达水平。e：以ZmDPS1基因作为sgRNA靶点，评估CRISPRa5工具的窗口活性。f-h：以ZmTrxh(f)、ZmES2(g)和ZmRCP1(h)基因为靶点验证CRISPRa5系统。所有值均为n＝3个生物重复的±sem。
图2为玉米雌配子细胞的分离和卵细胞(EC)原生质体中CRISPRa5系统的验证。a-h：玉米雌性配子细胞的单细胞水平的显微操作和分离。a：玉米子房结构示意图。AC反足细胞、CC中央细胞、EC卵细胞、SC助细胞。b：分离的玉米子房及胚囊ES(红色箭头)。c：在体式显微镜下人工微操作分离胚囊。d：通过部分酶解从ES中获得单个细胞。e-h：分离的AC(e)、SC(f)、CC(g)和EC(h)。i和j：卵细胞特异CRISPRa5卵细胞靶向激活稳定转化DFP系的LTP2pro-DsRed2表达盒。i：靶向LTP2pro的CRISPRa5载体示意图。j：通过RsRed2荧光显示，在一个分离的EC中，DsRed2蛋白在卵细胞中实现异位表达。BAR＝50μm。
图3为基于卵细胞特异的CRISPRa5BBM靶向激活玉米内源ZmBBM2基因。a：CRISPRa5BBM载体示意图。3×FLAG，3个串联的FLAG表位标签；Bar，BlpR基因。其他组件如图1中a所示的CRISPRa5载体所示。b：基于ddPCR技术的转化拷贝数的鉴定。T3代的9个独立转化子分别为EA13、EA14、EA15、EA19、EA21、EA22、EA28、EA34和EA36。a5BBM的探针采用FAM标记，而ZmADH1内参探针选择HEX进行标记。左上面板，靶标基因与内参基因1D参考数据；右上面板，计算出a5BBM拷贝数；下面板，是典型的EA19系的2D参考数据。c-f：未授粉的雌性配子体中进行基因表达水平的定量分析。c：RT-ddPCR鉴定胚囊中a5BBM表达水平。d：c所示RT-ddPCR鉴定胚囊中ZmBBM2基因表达水平。定量结果转化为每1μg总RNA的目标基因表达拷贝数。e：单细胞RT-ddPCR技术鉴定EA19及ZC01中分离的ECs、ANs、SCs和CCs的表达水平。f：通过抗FLAG抗体和BBM2 mRNA探针确定dCas9蛋白表达部位及ZmBBM2基因表达模及用Feulgen染色法观察胚囊的发育情况。g和h：0-9DAP授粉前后EA19及ZC01胚囊或幼胚ZmBBM2和a5BBM基因在胚囊中的转录水平。
图4为基于卵细胞特异的CRISPRa5异位激活玉米内源ZmBBM2基因表达引起的无融合生殖表型。a：EA19卵巢中双胚囊的发生率为3.9％。Bar＝50μm。b-e：CRISPRa5BBM母体单倍体。b：单倍体与二倍体籽粒切片荧光照片。c：ZC01、EA19中二倍体和单倍体植株株型及果穗表型。d：通过流式细胞术验证产生的单倍体植株(右)和对照二倍体植株(左)的DNA含量。e：9个CRISPRa5BBM株系单倍体生成效率。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、母体细胞自主的孤雌单倍体生殖方法及其育种应用
一、实验材料与方法
(一)实验材料
B73玉米自交系(未米生物科技(江苏)有限公司提供)、KN5585玉米自交系(未米生物科技(江苏)有限公司提供)、pUC19载体(北京全式金生物技术有限公司)、CPB载体(本实验室保存，记载于文献“Li C,Liu C,Qi X,et al.RNA-guided Cas9 as an in vivodesired-target mutator in maize[J].Plant biotechnology journal,2017,15(12):1566-1576.”中，公众可从申请人处获得，仅可用于重复本发明实验使用，不得他用)、DFP单倍体辅助筛选玉米转基因株系(本实验室保存，记载于文献“Dong L,Li L,Liu C,etal.Genome editing and double-fluorescence proteins enable robust maternalhaploid induction and identification in maize[J].Molecular plant,2018,11(9):1214-1217.”中的“As shown in Supplemental Figure 1,the eGFP gene was found tobe expressed in embryos(green)and DsRED was expressed in endosperms(red).TheDFP cassette was then stably transformed into the maize variety ZC01,the sameinbred line as the created haploid inducer line(Figure 1C)”，即该文献中将图1C所示的DFP盒稳定转化到玉米品种ZC01中后得到的转基因株系，公众可从申请人处获得，仅可用于重复本发明实验使用，不得他用)、农杆菌感受态(EHA105)细胞(北京庄盟国际生物基因科技有限公司)。
(二)实验方法
1、CRISPRa载体的构建
对于CRISPRa(a1-a6)构建，以ZmUbi启动子、核定位信号(NLS)、dCas9(D10A，H830A)、转录激活域以及NOS终止子的序列被扩增并克隆在pUC19载体骨架中。
卵细胞特异表达CRISPRa5载体设计是利用拟南芥卵细胞特异型启动子DD45替换ZmUbi启动子，并将载体构建在pUC19载体骨架中。其中玉米ZmU6-2启动子用于所有sgRNA的表达。
对于靶点设计，本发明选择ZmDPS1基因作为评估CRISPRa(a1-a6)工具的主要目标基因，选择靶点为TSS上游-1至-100bp内的靶点，同时还选择了-100至-200bp、-200至-300bp以及5’UTR区域设计相应靶点来判断CRISPRa5工具的最佳激活窗口。为了进一步验证CRISPRa5工具在玉米中具有较高且稳定的基因激活能力，本发明还选择了ZmTrxh、ZmES2以及ZmRCP1基因的-1至-100bp处分别设计了靶点构建了CRISPRa5激活载体。相关基因靶点及详细信息见表1。
表1、CRISPRa基因激活系统及其靶基因序列位点等信息
2、玉米叶肉原生质体中CRISPRa(a1-a6)的离体评价
收集约5×105个原生质体用于RNA分析。总RNA的提取使用FastPure Plant TotalRNA Isolation Kit试剂盒，根据制造商的说明(诺唯赞生物技术，中国)使用IMPLENP330紫外分光光度计对总RNA进行分光光度法定量并舍弃A260/A280<1.8样品。为了检查RNA的完整性，取500ng总RNA，利用1％(w/v)琼脂糖凝胶RNA质量进行评估，RNA条带为三条清晰完整且未降解的样品用作后续实验。RNA样品使用gDNA wiper mix试剂盒(诺唯赞生物技术，中国)清除RNA中残留的基因组DNA污染。取1μg总RNA利用HiScript III 1st Strand cDNASynthesis Kit试剂盒及寡聚物(dT)引物，按照制造商的说明(诺唯赞生物技术，中国)合成。实验在BIO-RAD CFX96实时荧光定量系统(BIO-RAD，USA)上进行。使用10μL Taq ProUniversal SYBR qPCR Master Mix(诺唯赞生物技术，中国)，每个引物0.5μL(终浓度200nM)，2μL的cDNA，最终体积为20μL。所有的样品设置三个生物学重复。以玉米泛素基因(NCBIGenBank：U29159.1)为内参。采用自动阈值用于定量循环(Cq)的测定。采用2-△△Ct方法计算表达水平。实验所用引物及PCR扩增效率列于表2。
表2、Real-time RT-PCR所用引物详细信息
3、玉米卵细胞分离技术的建立
以实验室前期创建的DFP单倍体辅助筛选玉米转基因株系为实验材料。材料吐丝前对雌穗进行套袋，待花丝5-15cm时取下雌穗，并用70％(v/v)乙醇对雌穗外壳表面进行消毒，显微操作取出玉米子房结构。用手术刀沿胚珠的花丝两侧切口，去除子房两侧的子房壁结构。取20片处理好的含有胚囊结构的子房切片，并将其收集在3.5cm直径无菌细胞培养皿中，加入1.5mL酶解液(1.5mL酶解液中含有150mg甘露醇，19.65U果胶酶，22U半纤维素酶，120U纤维素酶RS，利用KOH调节pH到5.0。其中，1U规定为：在最适条件下，每分钟内催化1微摩尔底物转化为产物所需的酶量定为一个活力单位)。将混合物在震荡摇床上以140rpm的速度震荡，在24℃下孵育60min，然后在体式显微镜下用玻璃针管手动分离胚胎囊(ESs)、助细胞(SCs)、对足细胞(ANs)、中央细胞(CCs)和卵细胞(ECs)。将分离的EC原生质体分别转移到100μL电穿孔缓冲液(配方：0.5M甘露醇，4mM氯化钾，4mM MES，pH5.0)中，加入10μgCRISPRa5pLTP2::DsRed2载体质粒DNA(结构描述：在pUC19载体的HindIII酶切位点处插入表达盒1，同时在BamHI酶切位点处插入表达盒2后得到的重组载体。所述表达盒1为用于表达sgRNA的表达盒，全序列如SEQ ID No.15所示。所述表达盒2全序列如SEQ ID No.5所示)。利用Bio-Rad基因脉冲器，电穿孔条件分别为5ms、400V和200μF。电穿孔样品在冰上保存10min，转移到6孔板中，在28℃的黑暗中孵育24h。DsRed2荧光信号采用DM1000LED系统(LEICA，德国)进行检测，激发波长为554nm，放大倍数为10×10倍。
4、CRISPRa5BBM载体构建
为了获得卵细胞特异的CRISPRa5BBM载体，我们提取拟南芥基因组并克隆出拟南芥DD45启动子，通过无缝克隆生物技术将DD45启动子及CRISPRa5元件扩增并组装到CPB载体中。设计靶向ZmBBM2基因启动子的两个靶点sgRNA2.0s：pBBM2TG1sgRNA2.0和pBBM2TG2sgRNA2.0，设计靶点位于ZmBBM2基因TSS的上游区域-36及-166bp区域。两个sgRNA2.0靶点用同一个ZmU6-2启动子进行转录并以拟南芥At-tRNAGly连接pBBM2TG1sgRNA2和pBBMTG2sgRNA序列。本发明中使用的所有引物均见表3。
表3、CRISPRa5BBM载体构建及表达量分析等引物和探针序列
5、农杆菌介导的玉米稳定转化
将CRISPRa5BBM质粒转化农杆菌感受态(EHA105)细胞，取阳性单克隆并进行培养，当培养基OD值600为0.3时在KN5585玉米自交系(未米生物科技(江苏)有限公司提供)中进行了农杆菌介导的幼胚转化。
6、CRISPRa5BBM株系转基因元件拷贝数的确定
使用FastPure Plant DNA Isolation Mini Kit试剂盒(诺唯赞生物技术，中国)从转基因株系中分离和纯化基因组DNA。分别获得ZC01、EA13、EA14、EA15、EA19、EA21、EA22、EA28、EA34和EA36 CRISPRa5BBM基因组DNA。采用多重定量液滴数字PCR(ddPCR)方法确定转基因拷贝数。利用Primer3 Plus(http://primer3plus.com/；Rozen and Skaletsky,2000)设计了CRISPRa5BBM元件和内源内参基因的候选引物和探针。以单拷贝基因ZmADH1作为二倍体基因的内定量对照。转基因拷贝数的测量采用Bio-Rad QuantaSoftTM软件(v1.6.6.0320)，默认设置为阈值测定以区分阳性和阴性液滴。本研究中使用的所有引物和探针均列于表3。
7、胚囊CRISPRa5BBM和ZmBBM2的表达鉴定
在无RNA酶的条件下，通过剥离子房壁，获取无壁子房，收集3个生物重复，每个每组20个子房。子房总RNA的分离、质量控制和cDNA的合成按照前面提到的操作方案进行。子房组织基因表达水平鉴定利用RT-ddPCR技术进行测量，采用Primer3Plus设计了扩增dCas9、ZmBBM2和ZmeIF4α基因的候选引物和探针。所有引物和探针列于表3。每个ddPCR样品包含11μL 2×ddPCR Supermix for Probes(No dUTP)(Bio-Rad,美国)，引物浓度900nM，探针浓度227nM，同时加入2μL cDNA；用无菌ddH2O调整最终体积至22μL。分析液滴计数，并使用Bio-Rad QuantaSoftTM软件(v1.6.6.0320)进行绝对基因表达测量，默认设置为阈值测定以区分阳性和阴性液滴。
8、CRISPRa5BBM和ZmBBM2在单细胞水平上的表达
在显微镜下分离出助细胞、反足细胞、中央细胞、卵细胞。取10个同一类型细胞进行裂解，取细胞池中的1/10原液作为RNA模板。采用单细胞反转录微滴数字PCR技术测量细胞中基因表达水平，试剂盒采用One-Step RT ddPCR Advanced Kit for Probes(Bio-Rad，USA)。利用Primer3Plus设计了dCas9和ZmBBM2基因的候选基因引物和扩增探针。每个ddPCR样品含有5μL Supermix，2μL逆转录酶，1μL DDT，引物浓度900nM，探针浓度250nM，加入1μLRNA裂解液；用无菌ddH2O调整最终体积至20μL。反应在QX200AutoDG ddPCR系统上运行。分析液滴计数并使用Bio-RadQuantaSoftTM软件(v1.6.6.0320)进行绝对基因表达测量，默认设置为阈值测定以区分阳性和阴性液滴。
9、Feulgen染色方法
分离并获得子房组织，利用FAA溶液(配方：10％甲醛，5％醋酸，50％乙醇)将子房固定，并在70％(v/v)乙醇中保存。样品制备前需用不同梯度浓度乙醇进行再水合，然后用6M盐酸处理DNA水解，用0.5％(w/v)periodic acid溶液处理20min，并在1％(w/v)吖啶黄素中孵育20min。然后样品用乙醇系列脱水，用水杨酸甲酯-乙醇和纯水杨酸甲酯溶液将组织透明化。最后，将样品安装在水杨酸甲酯的载玻片上，并在显微镜下观察。
10、免疫组化
采用免疫组化方法定位胚囊切片中的dCas9蛋白。收集到的玉米粒在FAA溶液中被固定，利用石蜡切片技术对样品进行了组织包埋和切片。免疫组化采用标准方案进行实施。以兔抗FLAG抗体ab205606(AbcamInc.，USA)为一抗，以抗山羊抗兔碱性磷酸酶偶联物A9919(Sigma，USA)为二抗，进行免疫组化。
11、mRNA原位杂交
用地高辛标记的反义RNA探针在胚囊组织中进行ZmBBM2 mRNA原位杂交，检测ZmBBM2转录本的积累。将ZmBBM2 cDNA克隆到一个含有T7启动子的pUC19载体中。NcoI限制性内切酶末端用于线性化模板，并在转录前创建一个5“overhang”结构。探针合成采用invitro transcription with T7 RNA polymerase试剂盒结合digoxigenin-11-UTP(Sigma,USA)进行体外转录，合成了标记的ssRNA探针。胚囊组织固定前后必须避免mRNA降解，以免造成mRNA位置的变化。
12、孤雌单倍体种子发生效率评估
对于孤雌单倍体筛选采用双荧光蛋白DFP方法，DFP单倍体辅助筛选玉米转基因株系本实验室保存(文献“Dong L,Li L,Liu C,et al.Genome editing and double-fluorescence proteins enable robust maternal haploid induction andidentification in maize[J].Molecular plant,2018,11(9):1214-1217.”中的“Asshown in Supplemental Figure 1,the eGFP gene was found to be expressed inembryos(green)and DsRED was expressed in endosperms(red).The DFP cassette wasthen stably transformed into the maize variety ZC01.The DFP cassette was thenstably transformed into the maize variety ZC01,the same inbred line as thecreated haploid inducer line(Figure 1C)”，即该文献中将图1C所示的DFP盒稳定转化到玉米品种ZC01中后得到的转基因株系)，该转基因系含有两个荧光报告表达盒，一个是标记糊粉层的利用糊粉层特异性启动子LTP2启动DsRed2基因，该表达盒可将玉米籽粒的糊粉层标记成红色荧光。另一个表达盒为标记胚的利用胚特异性启动子启动eGFP基因。因此将DFP单倍体辅助筛选玉米转基因株系作为花粉供体对KN5585玉米自交系及9个CRISPRa5BBM株系进行授粉，当材料未诱导成为单倍体时DFP系提供的两个精细胞可以实现双受精进而得到胚发绿光而胚乳糊粉层发红光的籽粒，当材料卵细胞发育成单倍体时，DFP提供的两个精细胞其中一个与中央细胞结合形成胚乳糊粉层发红光，而胚未接受DFP精子因此不发荧光。材料种植过程中野生型自交系ZC01、9株CRISPRa5BBM株系和DFP植株分别在温室中生长。在开花期间，选择DFP植株作为花粉供体，用于所有其他基因型的授粉。成熟后的穗和籽粒利用LUYOR-3415RG光源(LUYOR，加利福尼亚州，美国)对单倍体玉米粒进行鉴定。用每个品系的单倍体粒数来计算单倍体频率。
13、倍性鉴定
采用流式细胞术检测细胞的倍性水平。将通过DFP技术筛选得到单倍体种子和二倍体对照种子一起发芽，待幼苗生长到三叶阶段收集约1g幼叶并用刀片切丝，用80μm尼龙网过滤。1000r/min离心5min，沉淀用1mL OTTOI缓冲(配方：100mmol柠檬酸，0.5％(V/V)吐温20，pH＝2.0)和2mL OTTOII缓冲(配方：400mmol磷酸氢二钠，pH＝8)和50μL 1.5mg/L碘化丙啶在黑暗中染色20min。倍性水平在FACSCalibur系统(BD，USA)上进行分析，数据由CellQuest公司软件(BD，USA)提取，并用ModFit软件(Yerity，美国)进行分析。
二、结果与分析
1、基于CRISPR-dCas9介导的玉米CRISPRa系列载体建立
本发明利用缺乏内切酶活性的CRISPR-dCas9作为DNA引导工具，并融合不同的转录激活效应元件构建了6组CRISPRa载体(图1中a)。载体设计分为两个策略：在第一种策略中，将dCas9蛋白融合转录激活效应元件包括来自拟南芥乙烯反应FACTOR2(ERF2m，CRISPRa1)、VP64(4×VP16，CRISPRa2)以及NF-kB反式激活亚基p65(p65，CRISPRa3)的CRISPRa载体。在该策略中dCas9融合转录激活效应元件后，由sgRNA1.0引导dCas9到靶点DNA处，由转录激活效应原件招募RNA聚合酶进行转录及翻译，达到基因激活的目的；在第二种策略种，我们采用了修饰的sgRNA支架sgRNA2.0，该结构包含sgRNA1.0基本骨架并在第2和第4茎环结构处引入两个MS2结合的RNA适配体，该适配体以招募除VP64之外的额外转录激活因子如：ERF2m-HSF1(CRISPRa4)、p65-HSF1(CRISPRa5)和VP64-HSF1(CRISPRa6)。同时，我们将额外的转录激活因子与人类热休克因子1(HSF1)的激活结构域进行融合表达以实现结构域协同激活作用。在第二种策略中，dCas9-VP64和其他额外转录激活因子被设计到一个阅读框内，当该蛋白表达，融合蛋白通过T2A肽释放NLS-dCas9-VP64，该结构与sgRNA2.0结合后其中MS2结合的RNA适配体招募NLS-MS2-affetor-HSF1结构，进而形成增强型的基因激活工具(图1中a和b)。
最终获得的6个CRISPRa载体结构描述如下：
CRISPRa1载体结构描述：在pUC19载体的HindIII酶切位点处插入表达盒1，同时在BamHI酶切位点处插入表达盒2后得到的重组载体。所述表达盒1为用于表达sgRNA的表达盒；所述表达盒1中自5’端到3’端依次由U6启动子(SEQ ID No.7的第1-397位)、靶向目标基因靶标区域的sgRNA间隔序列插入位点(gtaacgtcaccgtagggcct)、sgRNA1.0支架编码序列(SEQ ID No.7的第418-500位所示)组成。所述表达盒2自5’端到3’端依次由UBI启动子(SEQID No.1的第18-2013)、NLS核定位信号编码序列(SEQ ID No.1的第2107-2127位)、dCas9编码基因(SEQ ID No.1的第2152-6252位)、ERF2m编码基因(SEQ ID No.1的第6319-7047位)和NOS转录终止子(SEQ ID No.1的第7082-7334位)组成。所述表达盒2的全序列如SEQ IDNo.1所示。
CRISPRa2载体结构描述：在pUC19载体的HindIII酶切位点处插入表达盒1，同时在BamHI酶切位点处插入表达盒2后得到的重组载体。所述表达盒1为用于表达sgRNA的表达盒；所述表达盒1中自5’端到3’端依次由U6启动子(SEQ ID No.7的第1-397位)、靶向目标基因靶标区域的sgRNA间隔序列插入位点(gtaacgtcaccgtagggcct)、sgRNA1.0支架编码序列(SEQ ID No.7的第418-500位所示)组成。所述表达盒2自5’端到3’端依次由UBI启动子(SEQID No.2的第18-2013)、NLS核定位信号编码序列(SEQ ID No.2的第2107-2127位)、dCas9编码基因(SEQ ID No.2的第2152-6252位)、VP64编码基因(SEQ ID No.2的第6319-6468位)和NOS转录终止子(SEQ ID No.2的第6503-6755位)组成。所述表达盒2的全序列如SEQ IDNo.2所示。
CRISPRa3载体结构描述：在pUC19载体的HindIII酶切位点处插入表达盒1，同时在BamHI酶切位点处插入表达盒2后得到的重组载体。所述表达盒1为用于表达sgRNA的表达盒；所述表达盒1中自5’端到3’端依次由U6启动子(SEQ ID No.7的第1-397位)、靶向目标基因靶标区域的sgRNA间隔序列插入位点(gtaacgtcaccgtagggcct)、sgRNA1.0支架编码序列(SEQ ID No.7的第418-500位所示)组成。所述表达盒2自5’端到3’端依次由UBI启动子(SEQID No.3的第18-2013)、NLS核定位信号编码序列(SEQ ID No.3的第2107-2127位)、dCas9编码基因(SEQ ID No.3的第2152-6252位)、P65编码基因(SEQ ID No.3的第6319-6861位)和NOS转录终止子(SEQ ID No.3的第6896-7148位)组成。所述表达盒2的全序列如SEQ IDNo.3所示。
CRISPRa4载体结构描述：在pUC19载体的HindIII酶切位点处插入表达盒1，同时在BamHI酶切位点处插入表达盒2后得到的重组载体。所述表达盒1为用于表达sgRNA的表达盒；所述表达盒1中自5’端到3’端依次由U6启动子(SEQ ID No.8的第1-397位)、靶向目标基因靶标区域的sgRNA间隔序列插入位点(gtaacgtcaccgtagggcct)、sgRNA2.0支架编码序列(SEQ ID No.8的第418-560位所示)组成。所述表达盒2自5’端到3’端依次由UBI启动子(SEQID No.4的第18-2013位)、NLS核定位信号编码序列(SEQ ID No.4的第2107-2127位)、dCas9编码基因(SEQ ID No.4的第2152-6252位)、VP64编码基因(SEQ ID No.4的第6319-6495位)、自裂解多肽T2A的编码基因(SEQ ID No.4的第6496-6549位)、MS2编码基因(SEQ IDNo.4的第6565-6951位)、NLS核定位信号编码序列(SEQ ID No.4的第7006-7026位)、ERF2m编码基因(SEQ ID No.4的第7042-7770位)、HSF1编码基因(SEQ ID No.4的第7795-8169位)和NOS转录终止子(SEQ ID No.4的第8204-8456位)组成。所述表达盒2的全序列如SEQ IDNo.4所示。
CRISPRa5载体结构描述：在pUC19载体的HindIII酶切位点处插入表达盒1，同时在BamHI酶切位点处插入表达盒2后得到的重组载体。所述表达盒1为用于表达sgRNA的表达盒；所述表达盒1中自5’端到3’端依次由U6启动子(SEQ ID No.8的第1-397位)、靶向目标基因靶标区域的sgRNA间隔序列插入位点(gtaacgtcaccgtagggcct)、sgRNA2.0支架编码序列(SEQ ID No.8的第418-560位所示)组成。所述表达盒2自5’端到3’端依次由UBI启动子(SEQID No.5的第18-2013位)、NLS核定位信号编码序列(SEQ ID No.5的第2107-2127位)、dCas9编码基因(SEQ ID No.5的第2152-6252位)、VP64编码基因(SEQ ID No.5的第6319-6495位)、自裂解多肽T2A的编码基因(SEQ ID No.5的第6496-6549位)、MS2编码基因(SEQ IDNo.5的第6565-6951位)、NLS核定位信号编码序列(SEQ ID No.5的第7006-7026位)、P65编码基因(SEQ ID No.5的第7042-7584位)、HSF1编码基因(SEQ ID No.5的第7609-7983位)、NOS转录终止子(SEQ ID No.5的第8018-8270位)。所述表达盒2’的序列如SEQ ID No.5所示。
CRISPRa6载体结构描述：在pUC19载体的HindIII酶切位点处插入表达盒1，同时在BamHI酶切位点处插入表达盒2后得到的重组载体。所述表达盒1为用于表达sgRNA的表达盒；所述表达盒1中自5’端到3’端依次由U6启动子(SEQ ID No.8的第1-397位)、靶向目标基因靶标区域的sgRNA间隔序列插入位点(gtaacgtcaccgtagggcct)、sgRNA2.0支架编码序列(SEQ ID No.8的第418-560位所示)组成。所述表达盒2自5’端到3’端依次由UBI启动子(SEQID No.6的第18-2013位)、NLS核定位信号编码序列(SEQ ID No.6的第2107-2127位)、dCas9编码基因(SEQ ID No.6的第2152-6252位)、VP64编码基因(SEQ ID No.6的第6319-6495位)、自裂解多肽T2A的编码基因(SEQ ID No.6的第6496-6549位)、MS2编码基因(SEQ IDNo.6的第6565-6951位)、NLS核定位信号编码序列(SEQ ID No.6的第7006-7026位)、VP64编码基因(SEQ ID No.6的第7042-7218位)、HSF1编码基因(SEQ ID No.6的第7243-7617位)、NOS转录终止子(SEQ ID No.6的第7652-7904位)。所述表达盒2’的序列如SEQ ID No.6所示。
为了评估CRISPRa(1-6)6个基因激活系统在玉米细胞中基因激活活性，我们选择了玉米内源的种子赖氨酸生物合成相关基因ZmDPS1作为CRISPRa系统的靶点。针对ZmDPS1转录起始位点(TSS)上游100bp区域设计基因激活靶点(图1中b和c)；表1)，并分别构建基因激活载体。所得6个载体结构描述如下：
靶向ZmDPS1基因TSS上游-1至-100bp的CRISPRa1DPS1载体结构描述：在pUC19载体的HindIII酶切位点处插入表达盒1，同时在BamHI酶切位点处插入表达盒2后得到的重组载体。所述表达盒1为用于表达sgRNA的表达盒，全序列如SEQ ID No.7所示。SEQ ID No.7的第1-397位为U6启动子，第398-417位为靶向ZmDPS1基因TSS上游-1至-100bp的sgRNA间隔序列、第418-500位为sgRNA1.0支架编码序列。所述表达盒2全序列如SEQ ID No.1所示。SEQID No.1的第18-2013为UBI启动子，第2107-2127位为NLS核定位信号编码序列、第2152-6252位为dCas9编码基因，第6319-7047位为ERF2m编码基因，第7082-7334位为NOS转录终止子。
靶向ZmDPS1基因TSS上游-1至-100bp的CRISPRa2DPS1载体结构描述：在pUC19载体的HindIII酶切位点处插入表达盒1，同时在BamHI酶切位点处插入表达盒2后得到的重组载体。所述表达盒1为用于表达sgRNA的表达盒，全序列如SEQ ID No.7所示。SEQ ID No.7的第1-397位为U6启动子，第398-417位为靶向ZmDPS1基因TSS上游-1至-100bp的sgRNA间隔序列、第418-500位为sgRNA1.0支架编码序列。所述表达盒2全序列如SEQ ID No.2所示。SEQID No.2的第18-2013为UBI启动子，第2107-2127位为NLS核定位信号编码序列，第2152-6252位为dCas9编码基因，第6319-6468位为VP64编码基因，第6503-6755位为NOS转录终止子。
靶向ZmDPS1基因TSS上游-1至-100bp的CRISPRa3DPS1载体结构描述：在pUC19载体的HindIII酶切位点处插入表达盒1，同时在BamHI酶切位点处插入表达盒2后得到的重组载体。所述表达盒1为用于表达sgRNA的表达盒，全序列如SEQ ID No.7所示。SEQ ID No.7的第1-397位为U6启动子，第398-417位为靶向ZmDPS1基因TSS上游-1至-100bp的sgRNA间隔序列，第418-500位为sgRNA1.0支架编码序列。所述表达盒2全序列如SEQ ID No.3所示。SEQID No.3的第18-2013为UBI启动子，第2107-2127位为NLS核定位信号编码序列，第2152-6252位为dCas9编码基因，第6319-6861位为P65编码基因，第6896-7148位为NOS转录终止子。
靶向ZmDPS1基因TSS上游-1至-100bp的CRISPRa4DPS1载体结构描述：在pUC19载体的HindIII酶切位点处插入表达盒1，同时在BamHI酶切位点处插入表达盒2后得到的重组载体。所述表达盒1为用于表达sgRNA的表达盒，全序列如SEQ ID No.8所示。SEQ ID No.8的第1-397位为U6启动子，第398-417位为靶向ZmDPS1基因TSS上游-1至-100bp的sgRNA间隔序列，第418-560位为sgRNA2.0支架编码序列。所述表达盒2全序列如SEQ ID No.4所示。SEQID No.4的第18-2013位为UBI启动子，第2107-2127位为NLS核定位信号编码序列，第2152-6252位为dCas9编码基因，第6319-6495位为VP64编码基因，第6496-6549位为自裂解多肽T2A的编码基因，第6565-6951位为MS2编码基因，第7006-7026位为NLS核定位信号编码序列，第7042-7770位为ERF2m编码基因，第7795-8169位为HSF1编码基因，第8204-8456位为NOS转录终止子。
靶向ZmDPS1基因TSS上游-1至-100bp的CRISPRa5DPS1载体结构描述：在pUC19载体的HindIII酶切位点处插入表达盒1，同时在BamHI酶切位点处插入表达盒2后得到的重组载体。所述表达盒1为用于表达sgRNA的表达盒，全序列如SEQ ID No.8所示。SEQ ID No.8的第1-397位为U6启动子，第398-417位为靶向ZmDPS1基因TSS上游-1至-100bp的sgRNA间隔序列，第418-560位为sgRNA2.0支架编码序列。所述表达盒2全序列如SEQ ID No.5所示。SEQID No.5的第18-2013位为UBI启动子，第2107-2127位为NLS核定位信号编码序列，第2152-6252位为dCas9编码基因，第6319-6495位为VP64编码基因，第6496-6549位为自裂解多肽T2A的编码基因，第6565-6951位为MS2编码基因，第7006-7026位为NLS核定位信号编码序列，第7042-7584位为P65编码基因，第7609-7983位为HSF1编码基因，第8018-8270位为NOS转录终止子。
靶向ZmDPS1基因TSS上游-1至-100bp的CRISPRa6DPS1载体结构描述：在pUC19载体的HindIII酶切位点处插入表达盒1，同时在BamHI酶切位点处插入表达盒2后得到的重组载体。所述表达盒1为用于表达sgRNA的表达盒，全序列如SEQ ID No.8所示。SEQ ID No.8的第1-397位为U6启动子，第398-417位为靶向ZmDPS1基因TSS上游-1至-100bp的sgRNA间隔序列，第418-560位为sgRNA2.0支架编码序列。所述表达盒2全序列如SEQ ID No.6所示。SEQID No.6的第18-2013位为UBI启动子，第2107-2127位为NLS核定位信号编码序列，第2152-6252位为dCas9编码基因，第6319-6495位为VP64编码基因，第6496-6549位为自裂解多肽T2A的编码基因，第6565-6951位为MS2编码基因，第7006-7026位为NLS核定位信号编码序列，第7042-7218位为VP64编码基因，第7243-7617位为HSF1编码基因，第7652-7904位为NOS转录终止子。
分别将上述CRISPRa(1-6)DPS1转入B73玉米自交系叶肉原生质体中，使其分别对ZmDPS1基因进行激活，筛选高活性CRISPRa基因激活工具。通过RT-qPCR实验数据可知，与未转入载体的原生质体对照组相比所有CRISPRa系统的转录水平至少增加了1.6倍的ZmDPS1表达水平，且CRISPRa5系统产生了最强大的转录激活(相对于对照组11.25倍)，这表明了设计的CRISPRa基因激活工具可在玉米叶肉原生质体细胞中实现高活性的转录激活(图1中d)。下一步我们要对CRISPRa5转录激活工具的激活窗口进行评估。因此我们选择了ZmDPS1基因5’UTR、TSS上游-1至-100bp、-100至-200bp、-200至-300bp四个区域设计了sgRNA靶点并设计CRIPRa5基因激活载体。所得4个载体结构描述如下：
靶向ZmDPS1基因5’UTR的CRISPRa5DPS1载体结构描述：在pUC19载体的HindIII酶切位点处插入表达盒1，同时在BamHI酶切位点处插入表达盒2后得到的重组载体。所述表达盒1为用于表达sgRNA的表达盒，全序列如SEQ ID No.11所示。SEQ ID No.11的第1-397位为U6启动子，第398-417位为靶向ZmDPS1基因5’UTR的sgRNA间隔序列，第418-560位为sgRNA2.0支架编码序列。所述表达盒2全序列如SEQ ID No.5所示。SEQ ID No.5的第18-2013位为UBI启动子，第2107-2127位为NLS核定位信号编码序列，第2152-6252位为dCas9编码基因，第6319-6495位为VP64编码基因，第6496-6549位为自裂解多肽T2A的编码基因，第6565-6951位为MS2编码基因，第7006-7026位为NLS核定位信号编码序列，第7042-7584位为P65编码基因，第7609-7983位为HSF1编码基因，第8018-8270位为NOS转录终止子。
靶向ZmDPS1基因TSS上游-1至-100bp的CRISPRa5DPS1载体结构描述：在pUC19载体的HindIII酶切位点处插入表达盒1，同时在BamHI酶切位点处插入表达盒2后得到的重组载体。所述表达盒1为用于表达sgRNA的表达盒，全序列如SEQ ID No.8所示。SEQ ID No.8的第1-397位为U6启动子，第398-417位为靶向ZmDPS1基因TSS上游-1至-100bp的sgRNA间隔序列，第418-560位为sgRNA2.0支架编码序列。所述表达盒2全序列如SEQ ID No.5所示。SEQID No.5的第18-2013位为UBI启动子，第2107-2127位为NLS核定位信号编码序列，第2152-6252位为dCas9编码基因，第6319-6495位为VP64编码基因，第6496-6549位为自裂解多肽T2A的编码基因，第6565-6951位为MS2编码基因，第7006-7026位为NLS核定位信号编码序列，第7042-7584位为P65编码基因，第7609-7983位为HSF1编码基因，第8018-8270位为NOS转录终止子。
靶向ZmDPS1基因TSS上游-100至-200bp的CRISPRa5DPS1载体结构描述：在pUC19载体的HindIII酶切位点处插入表达盒1，同时在BamHI酶切位点处插入表达盒2后得到的重组载体。所述表达盒1为用于表达sgRNA的表达盒，全序列如SEQ ID No.9所示。SEQ ID No.9的第1-397位为U6启动子，第398-417位为靶向ZmDPS1基因TSS上游-100至-200bp的sgRNA间隔序列，第418-560位为sgRNA2.0支架编码序列。所述表达盒2全序列如SEQ ID No.5所示。SEQID No.5的第18-2013位为UBI启动子，第2107-2127位为NLS核定位信号编码序列，第2152-6252位为dCas9编码基因，第6319-6495位为VP64编码基因，第6496-6549位为自裂解多肽T2A的编码基因，第6565-6951位为MS2编码基因，第7006-7026位为NLS核定位信号编码序列，第7042-7584位为P65编码基因，第7609-7983位为HSF1编码基因，第8018-8270位为NOS转录终止子。
靶向ZmDPS1基因TSS上游-200至-300bp的CRISPRa5DPS1载体结构描述：在pUC19载体的HindIII酶切位点处插入表达盒1，同时在BamHI酶切位点处插入表达盒2后得到的重组载体。所述表达盒1为用于表达sgRNA的表达盒，全序列如SEQ ID No.10所示。SEQ ID No.10的第1-397位为U6启动子，第398-417位为靶向ZmDPS1基因TSS上游-200至-300bp的sgRNA间隔序列，第418-560位为sgRNA2.0支架编码序列。所述表达盒2全序列如SEQ ID No.5所示。SEQ ID No.5的第18-2013位为UBI启动子，第2107-2127位为NLS核定位信号编码序列，第2152-6252位为dCas9编码基因，第6319-6495位为VP64编码基因，第6496-6549位为自裂解多肽T2A的编码基因，第6565-6951位为MS2编码基因，第7006-7026位为NLS核定位信号编码序列，第7042-7584位为P65编码基因，第7609-7983位为HSF1编码基因，第8018-8270位为NOS转录终止子。
通过转化B73玉米自交系叶肉原生质体及RT-qPCR对ZmDPS1表达水平进行测量。通过实验我们发现，针对-1至-100bp区域的sgRNA靶点对ZmDPS1表达水平显示出最高的倍数激活(图1中e)。为了进一步验证了CRISPRa5系统的基因激活能力，我们分别针对ZmTrxh、ZmES2、ZmRCP1三个基因的TSS上游-1至-100bp区域设计sgRNA靶点，并分别构建CRISPRa5载体。所得3个载体结构描述如下：
靶向ZmTrxh基因TSS上游-1至-100bp的CRISPRa5Trxh载体结构描述：在pUC19载体的HindIII酶切位点处插入表达盒1，同时在BamHI酶切位点处插入表达盒2后得到的重组载体。所述表达盒1为用于表达sgRNA的表达盒，全序列如SEQ ID No.12所示。SEQ ID No.12的第1-397位为U6启动子，第398-417位为靶向ZmTrxh基因TSS上游-1至-100bp的sgRNA间隔序列，第418-560位为sgRNA2.0支架编码序列。所述表达盒2全序列如SEQ ID No.5所示。SEQID No.5的第18-2013位为UBI启动子，第2107-2127位为NLS核定位信号编码序列，第2152-6252位为dCas9编码基因，第6319-6495位为VP64编码基因，第6496-6549位为自裂解多肽T2A的编码基因，第6565-6951位为MS2编码基因，第7006-7026位为NLS核定位信号编码序列，第7042-7584位为P65编码基因，第7609-7983位为HSF1编码基因，第8018-8270位为NOS转录终止子。
靶向ZmES2基因TSS上游-1至-100bp的CRISPRa5ES2载体结构描述：在pUC19载体的HindIII酶切位点处插入表达盒1，同时在BamHI酶切位点处插入表达盒2后得到的重组载体。所述表达盒1为用于表达sgRNA的表达盒，全序列如SEQ ID No.13所示。SEQ ID No.13的第1-397位为U6启动子，第398-417位为靶向ZmES2基因TSS上游-1至-100bp的sgRNA间隔序列，第418-560位为sgRNA2.0支架编码序列。所述表达盒2全序列如SEQ ID No.5所示。SEQID No.5的第18-2013位为UBI启动子，第2107-2127位为NLS核定位信号编码序列，第2152-6252位为dCas9编码基因，第6319-6495位为VP64编码基因，第6496-6549位为自裂解多肽T2A的编码基因，第6565-6951位为MS2编码基因，第7006-7026位为NLS核定位信号编码序列，第7042-7584位为P65编码基因，第7609-7983位为HSF1编码基因，第8018-8270位为NOS转录终止子。
靶向ZmRCP1基因TSS上游-1至-100bp的CRISPRa5RCP1载体结构描述：在pUC19载体的HindIII酶切位点处插入表达盒1，同时在BamHI酶切位点处插入表达盒2后得到的重组载体。所述表达盒1为用于表达sgRNA的表达盒，全序列如SEQ ID No.14所示。SEQ ID No.14的第1-397位为U6启动子，第398-417位为靶向ZmRCP1基因TSS上游-1至-100bp的sgRNA间隔序列，第418-560位为sgRNA2.0支架编码序列。所述表达盒2全序列如SEQ ID No.5所示。SEQID No.5的第18-2013位为UBI启动子，第2107-2127位为NLS核定位信号编码序列，第2152-6252位为dCas9编码基因，第6319-6495位为VP64编码基因，第6496-6549位为自裂解多肽T2A的编码基因，第6565-6951位为MS2编码基因，第7006-7026位为NLS核定位信号编码序列，第7042-7584位为P65编码基因，第7609-7983位为HSF1编码基因，第8018-8270位为NOS转录终止子。
通过B73玉米自交系叶肉原生质体及RT-qPCR技术评估，我们观察到与未转入载体的原生质体的对照组相比较CRISPRa5基因激活工具对ZmTrxh基因表达量提高了375.38倍(图1中f)，对ZmES2基因表达水平提高了5.33倍(图1中g)，对ZmRCP1基因表达量提高了4.45倍(图1中h)。综上结果表明，我们所设计的CRISPRa5基因激活工具(sgRNA2.0，dCas9-VP64和MS2-p65-HSF1效应体)，在玉米细胞中显示出最强的靶向转录激活能力。
2、基于卵细胞分离与转化技术评估CRISPRa5在卵细胞中激活活性
为了确定CRISPRa5在卵细胞中基因激活能力，通过显微操作结合胚囊酶解方法我们建立了玉米卵细胞分离与转化系统。首先在体式显微镜下，我们利用显微操作技术从胚珠组织中分离出胚囊组织(图2中a和b)。随后用酶解的方法处理这些胚囊组织样本1小时(图2中c)，通过显微操作技术分离出整个胚囊(图2中d)。接下来，我们在体式显微镜下手动分离反足细胞(ACs)(图2中e)、助细胞(SCs)(图2中f)、中央细胞(CC)(图2中g)和卵细胞(EC)(图2中h)。我们从酶解后的胚囊中分离出的SCs、CCs和ECs的产量约为25％。
为了验证CRISPRa5在玉米卵细胞中的激活能力，我们以实验室前期建立的DFP单倍体辅助筛选玉米转基因株系(本实验室保存，文献：Dong L,Li L,Liu C,et al.Genomeediting and double-fluorescence proteins enable robust maternal haploidinduction and identification in maize[J].Molecular plant,2018,11(9):1214-1217.)为材料制备卵细胞及其原生质体，DFP转基因系中包含糊粉层特异性启动子LTP2启动子驱动的红色荧光蛋白DsRed2基因(Dong,L.,Li,L.,Liu,Changlin,Liu,Chenxu,Geng,S.,Li,X.,et al.(2018)Genome editing and double-fluorescence proteins enablerobust maternal haploid induction and identification in maize.Mol.Plant,11,1214–1217.)。LTP2启动子在糊粉层特异表达，而在卵细胞中不表达。为了验证CRISPRa5在卵细胞中的活性，我们利用拟南芥卵细胞特异性启动子DD45启动子表达CRISPRa5系统，并在LTP2启动子TSS上游-1至-100bp处设计了基因激活靶点并设计靶向LTP2启动子的卵细胞特异的CRISPRa5pLTP2::DsRed2载体。所得载体结构描述如下：在pUC19载体的HindIII酶切位点处插入表达盒1，同时在BamHI酶切位点处插入表达盒2后得到的重组载体。所述表达盒1为用于表达sgRNA的表达盒，全序列如SEQ ID No.15所示。SEQ ID No.15的第1-397位为U6启动子，第398-417位为靶向LTP2启动子TSS上游-1至-100bp的sgRNA间隔序列，第418-560位为sgRNA2.0支架编码序列。所述表达盒2全序列如SEQ ID No.5所示。SEQ ID No.5的第18-2013位为UBI启动子，第2107-2127位为NLS核定位信号编码序列，第2152-6252位为dCas9编码基因，第6319-6495位为VP64编码基因，第6496-6549位为自裂解多肽T2A的编码基因，第6565-6951位为MS2编码基因，第7006-7026位为NLS核定位信号编码序列，第7042-7584位为P65编码基因，第7609-7983位为HSF1编码基因，第8018-8270位为NOS转录终止子。
通过卵细胞转化技术，我们将载体转入DFP单倍体辅助筛选玉米转基因株系(本实验室保存，文献：Dong L,Li L,Liu C,et al.Genome editing and double-fluorescenceproteins enable robust maternal haploid induction and identification in maize[J].Molecular plant,2018,11(9):1214-1217.)的卵细胞中，以诱导DFP卵细胞中LTP2pro：DsRed2的表达(图2中i)。转化后的卵细胞经过24小时培养后检测DsRed2荧光，经过荧光显微镜检测我们发现了DsRed2荧光蛋白的表达，表明LTP2pro：DsRed2表达盒被转录激活导致卵细胞中DsRed2蛋白的表达(图2中j)。综合以上数据表明，CRISPRa5基因激活工具可在玉米卵细胞中实现高活性的基因激活。
3、通过CRISPRa在玉米卵细胞中异位激活ZmBBM2
基于8个物种的14个BBM蛋白的系统发育树分析可知ZmBBM2与PsASGR-BBML及OsBBM1蛋白序列具有较近的亲缘进化关系，我们推断ZmBBM2基因具有PsASGR-BBML及OsBBM1类似的功能，其卵细胞异位活性可诱发孤雌生殖现象。因此，我们构建了以内源ZmBBM2基因启动子为目标的卵细胞特异表达的CRISPRa5BBM基因激活体载体(图3中a)。所得载体结构描述如下：将CPB载体的酶切位点HindIII和EcoRI之间的小片段替换为SEQ IDNo.16所示DNA片段后得到的重组载体。SEQ ID No.16的第1-1007位为用于表达sgRNA的表达盒。SEQ ID No.16的第1-397位为ZmU6-2启动子，第398-417位为靶向ZmBBM2基因转录起始点(TSS)上游-36bp区域的sgRNA间隔序列的编码核酸，第418-553位为sgRNA2.0支架编码序列，第554-630位为拟南芥At-tRNAGly编码序列，第631-650位为靶向ZmBBM2基因转录起始点(TSS)上游-166bp区域的sgRNA间隔序列的编码核酸，第651-793位为sgRNA2.0支架编码序列。SEQ ID No.16的第1008-8238位为用于表达功能蛋白的表达盒。SEQ ID No.16的第1008-2017位为拟南芥DD45启动子，第2018-2086位为3×Flag标签编码核酸，第2093-2113位为SV40核定位信号编码序列，第2114-6238位为dCas9编码基因，第6239-6286位为NLS核定位信号编码序列，第6305-6454位为VP64编码基因，第6482-6535位为自裂解多肽T2A的编码基因，第6551-6937位为MS2编码基因，第6992-7012位为SV40核定位信号编码序列，第7028-7570位为P65编码基因，第7595-7966位为HSF1编码基因，第7967-8238位为NOS转录终止子。
我们通过农杆菌(根癌农杆菌)介导将上述所得载体对KN5585玉米自交系进行转化，得到9个独立的转基因株系EA13、EA14、EA15、EA19、EA21、EA222、EA28、EA34和EA36，并将其繁殖到T3代。我们利用微滴数字PCR(ddPCR)对上述材料转基因元件拷贝数进行检测，结果表明EA15、EA19、EA22、EA34和EA36为单拷贝，而EA13、EA21和EA28是双拷贝且EA14为4个拷贝(图3中b)。利用分离的胚囊提取上述转基因材料总RNA，我们以ZmeIF4α基因为内参，采用逆转录ddPCR(RT-ddPCR)分析了CRISPRa5BBM材料胚囊dCas9和ZmBBM2转录水平。我们在所有9个CRISPRa5BBM转基因株系的胚囊中都检测到CRISPRa5BBM(图3中c)和ZmBBM2(图3中d)RNA的高转录水平，且每1μg总RNA高达103拷贝，而在对照组野生型KN5585玉米自交系中没有检测到任何表达痕迹。由于在5个单拷贝转基因株系中EA19表现出最高的ZmBBM2激活水平，因此接下来我们选择了转基因株系EA19进行进一步的验证。为了进一步分析单个卵细胞CRISPRa5BBM和ZmBBM2 RNA的转录水平，我们利用显微操作技术将EA19转基因株系植物中分离出ANs、SCs、CCs和ECs。结合单细胞RT-ddPCR技术对EC中CRISPRa5BBM和ZmBBM2转录本进行检测(图3中e)，数据表明，CRISPRa5BBM可在卵细胞中表达，且CRISPRa5BBM可激活玉米内源ZmBBM2基因的异位表达。为了进一步验证这以上结论，我们对EA19材料胚囊组织进行了免疫组化分析以及原位杂交分析，实验结果表明，在EA19卵细胞的细胞核中检测到了dCas9蛋白的表达，同时利用ZmBBM2mRNA探针我们发现ZmBBM2 RNA在卵细胞中表现出较强的信号。以上结果证实了未授粉EC中CRISPRa5BBM表达且成功激活了卵细胞ZmBBM2基因的靶向激活(图3中f)。同时，通过RT-ddPCR技术我们还分析了EA19材料授粉前及不同授粉时间胚囊/幼胚中CRISPRa5BBM及ZmBBM2表达水平。实验数据表明，ZC01野生型未授粉胚囊中未发现CRISPRa5BBM及ZmBBM2表达，随着授粉时间推移ZmBBM2的表达量迅速增加而未发现CRISPRa5BBM表达。在EA19材料中未授粉胚囊中发现CRISPRa5BBM及ZmBBM2表达，随着授粉时间推移CRISPRa5BBM及ZmBBM2的表达量迅速增加(图3中g和h)。
4、CRISPRa5BBM2介导的ZmBBM2基因卵细胞异位活性诱导玉米孤雌单倍体发生
为了确定CRISPRa5BBM介导ZmBBM2基因在卵细胞中异位激活可诱发孤雌生殖表型现象的可能性，我们首先对受精前的胚囊进行观察(图4中a)，实验发现3.9％的EA19籽粒在胚珠中发育出双胚囊。此外我们利用DFP单倍体辅助筛选玉米转基因株系评估CRISPRa5BBM的单倍体发生率，我们使用DFP单倍体辅助筛选玉米转基因株系作为花粉供体对EA19材料进行授粉，当发生孤雌单倍体时则胚不发光，糊粉层发红光，而正常的二倍体则表现为胚发绿光而糊粉层发红光(图4中b)。我们激光共聚焦观察成熟种子横切样品，发现了EA19材料孤雌单倍体的发生。同时我们对筛选出的单倍体籽粒进行播种生长(图4中c)。通过表型发现与二倍体和野生型相比，单倍体植株更瘦弱矮小，且雌花不育。我们利用流式细胞术从叶肉原生质体中分离的细胞核进一步确定了倍性水平，并获得了单倍体的信号强度值，约为二倍体的一半(图4中d)。我们对所有9个CRISPRa5BBM株系的单倍体粒产生率进行了统计，统计结果表明，CRISPRa5BBM介导ZmBBM2基因在卵细胞中异位激活可诱发孤雌生殖表型，比率从0.44％到3.55％不等，大多数株系产生的单倍体粒在1.5％到2％之间(图4中e)。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
Claims (10)
1.一种获得玉米孤雌单倍体的方法，包括如下步骤：将用于介导玉米卵细胞异位表达ZmBBM2基因的CRISPRa5基因激活系统的系统载体导入受体玉米，得到阳性转基因玉米；所述转基因阳性玉米的部分胚囊中的卵细胞能直接发育成为单倍体胚,形成单倍体种子；
所述系统载体能够表达dCas9-VP64融合蛋白，能够表达MS2-P65-HSF1融合蛋白，并且能够表达靶向ZmBBM2基因转录起始点上游-200至-1bp位置的一个或若干个sgRNA，所述sgRNA为sgRNA2.0。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述系统载体上含有如下2个表达盒：
表达盒1：用于表达2个所述sgRNA；在所述表达盒1中，含有2个sgRNA的编码序列，2个所述sgRNA的编码序列以拟南芥At-tRNAGly编码序列连接，由同一个启动子启动转录；
表达盒2：用于表达功能蛋白，所述功能蛋白为将所述dCas9-VP64融合蛋白和所述MS2-P65-HSF1融合蛋白通过自裂解多肽T2A融合而成；在所述表达盒2中，所述功能蛋白由植物卵细胞特异性启动子启动转录。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：在所述表达盒1中，所述启动子为ZmU6-2启动子；和/或
在所述表达盒2中，所述植物卵细胞特异性启动子为拟南芥DD45启动子；和/或
所述dCas9-VP64融合蛋白和所述MS2-P65-HSF1融合蛋白均含有核定位信号。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述表达盒1自5’端到3’端依次由所述ZmU6-2启动子、靶向ZmBBM2基因转录起始点上游-36bp区域的sgRNA间隔序列的编码核酸、sgRNA2.0支架编码序列、所述拟南芥At-tRNAGly编码序列、靶向ZmBBM2基因转录起始点上游-166bp区域的sgRNA间隔序列的编码核酸、所述sgRNA2.0支架编码序列组成；和/或
所述表达盒2自5’端到3’端依次由所述拟南芥DD45启动子、3×Flag标签编码核酸、SV40核定位信号编码序列、dCas9编码基因、NLS核定位信号编码序列、VP64编码基因、所述自裂解多肽T2A的编码基因、MS2编码基因、所述SV40核定位信号编码序列、P65编码基因、HSF1编码基因和转录终止子NOS组成。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述ZmU6-2启动子如SEQ ID No.16的第1-397位所示；和/或
所述靶向ZmBBM2基因转录起始点上游-36bp区域的sgRNA间隔序列的编码核酸如SEQID No.16的第398-417位所示；和/或
所述sgRNA2.0支架编码序列如SEQ ID No.16的第418-553位或第651-793位所示；和/或
所述拟南芥At-tRNAGly编码序列如SEQ ID No.16的第554-630位所示；和/或
所述靶向ZmBBM2基因转录起始点上游-166bp区域的sgRNA间隔序列的编码核酸如SEQID No.16的第631-650位所示；
和/或
所述拟南芥DD45启动子如SEQ ID No.16的第1008-2017位所示；和/或
所述3×Flag标签编码核酸如SEQ ID No.16的第2018-2086位所示；和/或
所述SV40核定位信号编码序列如SEQ ID No.16的第2093-2113位或第6992-7012位所示；和/或
所述dCas9编码基因如SEQ ID No.16的第2114-6238位所示；和/或
所述NLS核定位信号编码序列如SEQ ID No.16的第6239-6286位所示；和/或
所述VP64编码基因如SEQ ID No.16的第6305-6454位所示；和/或
所述自裂解多肽T2A的编码基因如SEQ ID No.16的第6482-6535位所示；和/或
所述MS2编码基因如SEQ ID No.16的第6551-6937位所示；和/或
所述P65编码基因如SEQ ID No.16的第7028-7570位所示；和/或
所述HSF1编码基因如SEQ ID No.16的第7595-7966位所示；和/或
所述转录终止子NOS如SEQ ID No.16的第7967-8238位所示。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述表达盒1的核苷酸序列如SEQ IDNo.16的第1-1007位所示；和/或
所述表达盒2的核苷酸序列如SEQ ID No.16的第1008-8238位所示；
进一步地，所述CRISPRa5基因激活系统的系统载体为含有SEQ ID No.16所示DNA片段的质粒。
7.权利要求1-6任一中所述的用于介导玉米卵细胞异位表达ZmBBM2基因的所述CRISPRa5基因激活系统的系统载体。
8.权利要求7所述系统载体在诱发玉米孤雌单倍体发生中的应用。
9.一种基于CRISPR的基因激活系统，其特征在于：所述基于CRISPR的基因激活系统的系统载体能够表达dCas9-VP64融合蛋白，能够表达MS2-P65-HSF1融合蛋白，并且能够表达靶向目标基因靶标区域的一个或若干个sgRNA，所述sgRNA为sgRNA2.0；
进一步地，所述系统载体上含有如下2个表达盒：
表达盒1’：用于表达所述sgRNA；
表达盒2’：用于表达功能蛋白，所述功能蛋白为将所述dCas9-VP64融合蛋白和所述MS2-P65-HSF1融合蛋白通过自裂解多肽T2A融合而成；
更进一步地，在所述表达盒1’中，用于启动所述sgRNA转录的启动子为U6启动子；和/或，在所述表达盒2’中，用于启动所述功能蛋白转录的启动子为UBI启动子；和/或
更进一步地，所述dCas9-VP64融合蛋白和所述MS2-P65-HSF1融合蛋白均含有核定位信号。
10.权利要求9所述基于CRISPR的基因激活系统在对目的基因进行基因激活中的应用。
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