CN113667678B - 一种PsARF基因片段及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种PsARF基因片段及其应用。PsARF基因片段包括SEQ I DNO.2所示核苷酸序列。PsARF蛋白表达上述PsARF基因片段。PsARF基因片段、以及包括PsARF基因片段的表达载体可以在促进植物生根中进行应用。本发明具有利于植物根系侧根萌发及侧根数量增多等优点。

Description

一种PsARF基因片段及其应用
技术领域
本发明属于植物生理及分子生物学应用领域，尤其涉及一种PsARF基因片段及其应用。
背景技术
根是植物的六大器官之一，是植物的营养器官，通常位于地表下面，负责吸收土壤里面的水分及溶解其中的无机盐，并且具有支持、繁殖、贮存合成有机物质的作用。因此，根的生长状况对于植物的生长具有重要作用。然而现有技术中，对于能够促进植物根系侧根萌发及侧根数量增多的基因认识有限，能否可以发现新的基因并用于根系生长是亟需解决的问题。
牡丹(Paeonia suffrut icosa Andr.)为芍药科芍药属落叶亚灌木，又名木芍药、富贵花等，是我国的传统名花，具有很高的观赏价值和药用价值。牡丹品种繁多，其花大色艳，雍容华贵，被广泛推崇为我国的国花。牡丹常规繁殖主要以嫁接为主，但其繁殖周期长且繁殖率低，使其种苗工厂化生产受到很大制约。组织培养具有繁殖速度快、系数高、周期短、可保持母株优良性状等优点，近年来广泛应用于植物的快速繁殖中。但牡丹试管苗存在不定根诱导难度大、生根率低、不定根质量较差和移栽成活率低等问题，严重影响牡丹产业化发展。因此，研究其根系发生机理对牡丹组培具有重要意义。
生长素作为促进不定根发生的主要激素，其对植物根系生长发育的调控不仅起直接作用，还能间接对根系生长发育相关基因的表达进行调控。
发明内容
鉴于现有技术所存在的问题，本发明提供一种PsARF基因片段及其应用。本发明具有利于植物根系侧根萌发及侧根数量增多等优点。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
本发明提供一种PsARF基因片段，包括SEQ ID NO.2所示核苷酸序列。
本发明的有益效果：发明人在研究中意外的发现采用上述基因具有利于植物根系侧根萌发及侧根数量增多优点。
本发明提供一种PsARF蛋白，表达上述PsARF基因片段。
进一步，PsARF蛋白的氨基酸序列包括SEQ ID NO.3所示氨基酸序列。
本发明的有益效果：发明人在研究中意外的发现在植物中表达上述蛋白质具有利于植物根系侧根萌发及侧根数量增多优点。
本发明提供一种用于扩增PsARF基因片段的引物，包括SEQ ID NO.8所示核苷酸序列和SEQ ID NO.9所示核苷酸序列。
本发明提供一种表达载体，包括上述PsARF基因片段。
本发明的有益效果：发明人在研究中意外的发现在植物中使用上述表达载体具有利于植物根系侧根萌发及侧根数量增多优点。
本发明提供一种包括PsARF基因片段的菌株，包括上述表达载体。
本发明还提供上述PsARF基因片段和/或表达载体在促进植物生根中应用。
本发明的有益效果：发明人在研究中意外的发现在植物中单独的使用上述PsARF基因片段或者上述表达载体，以及联合使用上述PsARF基因片段和表达载体均具有利于植物根系侧根萌发及侧根数量增多优点。
进一步，上述PsARF基因片段和/或表达载体在促进植物侧根生长、萌发和/或侧根数量增加中的应用。
本发明提供一种促进植物生根的方法，包括以下步骤：在植物中表达 PsARF基因。优选的，以质粒或其他形式过表达PsARF基因。
附图说明
图1为PsARF蛋白结构域预测图。
图2为PsARF基因编码氨基酸与相近组蛋白序列比较结果图。
图3为PsARF基因在不同生根关键期的表达量的结果图。
图4为pD1301S-PsARF质粒的验证结果图。
图5为转基因拟南芥T1代PsARF基因表达量结果图。
图6为转PsARF基因拟南芥T1代根长(左图)、根数(右图)表达结果图。
图7为转PsARF基因拟南芥T1代表型观察结果图，图7中，A：对照CK； B：转PsARF基因拟南芥。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
本发明在研究中意外的获得了牡丹生根调控相关的生长素基因PsARF并进行RT-qPCR表达和功能验证，证实了其具有有利于植物根系侧根萌发及侧根数量增多等优点。揭示了其对牡丹不定根分化的调控作用，为探讨牡丹生根机理及组培快繁体系建立提供了新方法。
实施例1
1、生根差异基因的qRT-PCR及克隆分析
根据牡丹根系发生不同时期的转录组数据结果，筛选并获取1个表达显著差异的基因：CL10096.Contig1_All。采用Primer 5.0进行引物设计，并委托广州赛哲生物科技股份有限公司进行合成，选用的牡丹β-Tubulin基因作为内参基因(EF608942)(纪思羽，2013)，在相同扩增条件下，分别进行CL10096.Contig1_All和内参基因的PCR扩增，相关基因ID和引物序列见表1。涉及的相关试剂购自TAKARA公司。
表1用于qRT-PCR验证的引物
Figure BDA0003153602680000041
PCR扩增反应体系：
Figure BDA0003153602680000042
PCR扩增方法：
Figure BDA0003153602680000043
经PCR扩增，成功获得CL10096.Contig1_All的基因序列(核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示)。其CDS全长1470bp(核苷酸序列如SEQ ID NO.2 所示)，编码489个氨基酸(氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示)。结合 Smart-Blast蛋白序列分析，CL10096.Contig1_All基因具有完整的AUX-IAA 结构域，确定其为IAA基因家族基因(PsARF蛋白结构域预测结果如图1)。通过序列比对发现其序列与黄连木、角豆树、葡萄、麻风树的生长素响应因子ARF蛋白氨基酸序列具有较高相似度，分别为98％、94％、76％、77％，将其命名为牡丹PsARF基因(PsARF基因编码氨基酸与相近组蛋白序列比较结果如图2所示)。
2、连接T载体
回收PCR扩增后得到的产物，连接到pGEM-T easy载体中，转化大肠杆菌，挑取单克隆进行测序，测序正确的提取质粒。
具体方法可以如下：
1)挑取转化后的大肠杆菌阳性单菌落于新鲜的5mL LB液体培养基上， 37℃150-200r/min过夜培养；
2)按照1:100的比例继代到LB液体培养基中，培养至对数期(OD600 为0.4-0.6)；
3)将菌液分装到50mL离心管中，冰上放置10-20min；
4)4℃ 4500g离心10min，迅速除去上清，用1/5体积预冷的灭菌 100mmol/L CaCl2溶液重悬细胞，将重悬液收集到同一个离心管中，冰上放置30min；
5)4℃，4500g离心10min，小心倒掉上清，将细胞轻轻重悬于预冷的灭菌100mmol/LCaCl2+15％甘油中(浓缩倍数100-200，如100mL Subculture最终用0.5-1mL CaCl2+15％甘油)；
6)分装100μL/管至无菌的1.5mL离心管中，液氮中速冻后转入-80℃保存。
转化及重组克隆筛选：按照常规方法进行。
7)挑选阳性克隆大肠杆菌，然后植入终浓度为100μg/mL的氨苄抗性液体LB培养基中，培养环境：温度37℃，5-8小时，最后送基因公司测序。
8)使用质粒小提试剂盒(天根)提取质粒，具体操作按使用说明书进行。
3、生根差异相关基因qRT-PCR
通过实时荧光定量PCR对该基因在扦插苗和嫁接苗生根关键期进行了表达量分析。图3为PsARF基因在不同生根关键期的表达量的结果图，ZC 代表根原基长出期，MF代表根原基萌发期，PD代表根原基膨大期，每组样品中从左至右分别为实生苗、扦插、嫁接；从图3可以看出，PsARF的表达量在萌发期时扦插苗中幅度最大，实生苗最低；膨大期时实生苗中的PsARF 表达量显著高于其他两个时期；根长出阶段PsARF表达量在实生苗、扦插、嫁接中差异不明显。
实时荧光定量PCR方法如下：
用试剂盒进行qRT-PCR反应，按以下试剂顺序配制PCR反应液。
Figure BDA0003153602680000061
上述反应体系的正向引物的序列可以为SEQ ID NO.4所示的序列，反向引物的序列可以为SEQ ID NO.5所示的序列，cDNA溶液来自实生苗不同生根时期的根部的cDNA，使用天根生物的RNA提取和反转录试剂盒获得。
采用
Figure BDA0003153602680000062
的方法进行PCR扩增，反应程序如下表：
Figure BDA0003153602680000063
基因相对的表达量用2-ΔΔCt[298]表示，结果用Microsoft Excel分析。
4、构建拟南芥超表达载体
设计含有酶切位点的引物，引物序列如表2所示，以含有全长基因的质粒(即步骤2中提取的质粒并经测序验证正确的质粒，其中，全长基因包括 SEQ ID NO.1所示的基因序列)为模板，分别扩增基因的完整阅读框(包括 SEQ ID NO.2所示的序列)。
表2构建过表达载体所用引物
Figure BDA0003153602680000071
采用ScaI和SalI限制性内切酶对目的基因(即添加酶切位点扩增的SEQ ID NO.2，即上述通过表2引物扩增获得基因序列)进行双酶切。基因合成在pUC57载体上，获得含有合成基因(即pUC57载体上含有扩增到的带酶切位点的基因条带)的菌液后，摇菌提质粒,然后进行双酶切，同时用相同的酶对pD1301S进行酶切，将回收到的产物用酶T4进行连接，连接后转到DH5a 感受态细胞，37℃培养，挑长出的菌落进行纯化，最后挑菌进行摇菌提质粒，得到终载体pD1301S-PsARF。图4为pD1301S-PsARF质粒的验证的结果，从图4中可以看出4、8、9扩增条带大小与PsARF基本相同，可以确定该重组质粒正确，获得了pD1301S-PsARF质粒。
上述步骤涉及的pUC57载体(购于庄盟生物)后保存于河南农业大学林学院植物生理实验室，pUC57载体的信息可以参照庄盟生物官网，公众可以从实验室获得用于非商业目的重复本发明的步骤。
5、转化拟南芥进行功能验证
将已构建好的超表达载体质粒(pD1301S-PsARF)转化农杆菌LBA4404 (方法同超表达载体构建)，得到含有目的基因载体的农杆菌 (LBA4404-PsARF)，将含有目的基因载体的农杆菌(LBA4404-PsARF) 和含有空载体的农杆菌分别接种于10mL YEB液体培养基(含50mg·L-1利福平Rif+50mg·L-1卡那霉素Kan)，28℃，200rpm，振荡培养12-14h，得到菌液。
YEB液体培养基配方：蛋白胨0.5g，酵母粉0.1g，牛肉膏0.5g，蔗糖 0.5g，七水硫酸镁0.05g，溶于100ml蒸馏水；
取5mL菌液加入200mL YEB液体培养基(含50mg·L-1Rif+50 mg·L-1Kan)，28℃，200rpm，振荡培养6-12h(至OD600＝0.8-1.0)；
4000rpm，离心10min，收集菌体，用200mL MS盐溶液(含：1/2MS， 5％蔗糖，200μL·L-1Silwet L-77，1mL·L-1Triton X-100)重悬。
MS配方：NH4NO3 1650mg·L-1、KNO3 1900mg·L-1、CaCl2·2H2O 440 mg·L-1、MgSO4·7H2O 370mg·L-1、KH2PO4 170mg·L-1、KI 0.83mg·L-1、H3BO3 6.2mg·L-1、MnSO4·4H2O 22.3mg·L-1、ZnSO4·7H2O 8.6mg·L-1、Na2MoO4·2H2O 0.25mg·L-1、CuSO4·5H2O0.025mg·L-1、CoCl2·6H2O 0.025mg·L-1、FeSO4·7H2O 27.8mg·L-1、Na2-EDTA·2H2O37.3mg·L-1、肌醇100mg·L-1、烟酸0.5mg·L-1、维生素B6 0.5mg·L-1、维生素B1 0.1mg·L-1、甘氨酸2.0mg·L-1。
上述实验涉及的试剂均购于罗莱宝生物科技有限公司。
当野生型拟南芥植株大量开花时，可用于转化，转化前1d应充分浇水。将拟南芥花序浸泡在上述农杆菌重悬液里1min左右，并将花盆侧放，用保鲜袋套上保湿1d。第2d将植物从保鲜袋中取出，黑暗放置1d后放回光照培养架上，按常规方法培育植株到结实，直至收获成熟的T0代种子。将成熟的T0代种子播种，常规培养成苗，得到T1代植株，提取RNA，并反转录为cDNA，用GAP作为内参基因，进行相关基因表达量分析和表型观察。
上述实验涉及的农杆菌(购于庄盟生物)保存于河南农业大学林学院植物生理实验室，公众可以从实验室获得用于非商业目的重复本发明的步骤。
提取RNA的方：使用华越洋RNA提试剂盒提取RNA，具体操作按使用说明书进行。
反转录为cDNA的方法：使用RNA反转录试剂盒(擎科)反转录合成cDNA，具体操作按使用说明书进行。
6、转基因拟南芥T1代生根相关基因的表达分析
图5为转基因拟南芥T1代PsARF基因表达量的结果图，CK为对照组代表未转基因拟南芥，PsARF代表超表达转PsARF基因拟南芥，由图5可以看出，转基因拟南芥T1代生根基因PsARF的表达量均显著高于对照组，说明 PsARF基因成功转入拟南芥T1代，可进行下一步验证。
7、转基因拟南芥T1代表型观察
图6为转PsARF基因拟南芥T1代根长(左图)、根数(右图)表达结果图。图6中，CK代表未转基因拟南芥，PsARF代表超表达转PsARF基因拟南芥。根据图6的左图可以看出，超表达转PsARF基因的拟南芥植株的根长与CK未转基因拟南芥差异不明显，根据图6的右图可以看出超表达转PsARF 基因的拟南芥植株的侧根萌发数量明显比CK未转基因拟南芥的多。
图7为转PsARF基因拟南芥T1代表型观察结果图，图7中，A：对照CK (即未转基因拟南芥)；B：转PsARF基因拟南芥。从图7中可以看出超表达转PsARF基因的拟南芥植株，其侧根萌发数量明显比对照组未转基因拟南芥的多。
图6和图7显示了转基因拟南芥T1代的生长情况，基因PsARF的侧根生长情况明显优于对照。直观地展示了两种转基因拟南芥的生长情况。说明基因PsARF对侧根的萌发效果明显。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 河南农业大学
<120> 一种PsARF基因片段及其应用
<141> 2021-07-08
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2800
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
gtttccctct cccttcttct cttaagctaa aagaagagag cactcattca cctatacatt 60
cccttttacg tcccatcacc tccgctctcc ccttcctccc cgtcatttga ctcatttctc 120
tccccaaaaa ccctctcctt cccacgaata aagcaaaaaa caaaattacg caaataataa 180
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ctggggtttt gagtggtgga atgtggggta accaaactaa ccagactcag cgtatgcgaa 1920
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<211> 1470
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acaataatca gagcccattc cggtcttacg gatggggatg ctccgtcatg ttcaacctcc 480
ccgtctacca ataattgcca gattcctcca tccaaccttc tgaacagaaa ccaacaaggg 540
ccagcaatat tagcggggag ttcggtggtt gagcctgaaa gtaatctggt tcaagagatt 600
cttcaaaaca agtctgatct gcatattaaa caagaacttc ccagcttaaa aggtcctgag 660
caactaaagt acaaaggttc cattactgat caattggagg tgtcctcatc tgcgacatca 720
tattgcttgg atgctggtac ccttatgcag aatttctctc tccccacttt gctggatggg 780
gatgttcaat cacacccccg gaataatgtt ccttttgcag ttaatgttga tagtttggca 840
cctgacactt tgttgtcaag aggatatgac tctggaaagg atcttcaaaa catgattcct 900
aattatggca gtactccaag agatattgag acggagttgt ctactgctgc gatcagctct 960
cagtcatttg gggtgccgga catgtctttc aagcctggat gttcaagtga tgttgccatc 1020
aacgaggctg gggttttgag tggtggaatg tggggtaacc aaactaacca gactcagcgt 1080
atgcgaactt atacaaaggt tcaaaagcgt ggttcggtgg gtagatctat cgatgtcacc 1140
cggtacagag gatacgatga actgagacgt gatctagcac gcatgtttgg gatcgaaggt 1200
cagctagaag attcacaaag aagtgattgg aaacttgttt acgtggatca tgaaaatgac 1260
atactactag tcggtgacga cccatgggag gagtttgtaa actgtgtaca aagcataaag 1320
atactgtcat cagctgaagt acaacaaatg agtttggatg gagatttggg aaacgtgccg 1380
atcccgaatc aagcttgtag tgggacggat agtgagaatg catggagagg gaattatgat 1440
gataattcgg caacctcgtt taatcgataa 1470
<210> 3
<211> 489
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 3
Met Gly Gly Gly Gly Ser Leu Leu Gly Ala Gly Gly Gly Gly Leu Gly
1 5 10 15
Thr Gly Leu Gly Gly Ser Pro Leu Gly Ser Leu Ala Ala Ser Met Ser
20 25 30
Pro Ala Pro Leu Gly Leu Gly Gly Val Gly Gly Leu Pro Gly Gly Ser
35 40 45
Leu Ala Gly His Gly Thr Gly Gly Gly Leu Leu Gly Leu Leu Gly Gly
50 55 60
Gly Gly Gly Gly Leu Leu Ser Pro Val Ser Pro Ala Val Gly Ser Gly
65 70 75 80
Leu Leu Gly Gly Gly Gly Pro His Gly Gly Ala Gly His Leu Pro Gly
85 90 95
Leu Pro Leu Ser Leu His Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Leu Leu
100 105 110
Ser Gly Ala Ser Pro Ser Thr Ser Pro Leu Met Gly Ser Gly Gly Pro
115 120 125
Pro Val Ala Gly Leu Gly Gly Gly Gly Leu Pro His Thr Ile Ile Ala
130 135 140
Ala His Ser Gly Leu Thr Ala Gly Ala Ala Pro Ser Cys Ser Thr Ser
145 150 155 160
Pro Ser Thr Ala Ala Cys Gly Ile Pro Pro Ser Ala Leu Leu Ala Ala
165 170 175
Ala Gly Gly Gly Pro Ala Ile Leu Ala Gly Ser Ser Val Val Gly Pro
180 185 190
Gly Ser Ala Leu Val Gly Gly Ile Leu Gly Ala Leu Ser Ala Leu His
195 200 205
Ile Leu Gly Gly Leu Pro Ser Leu Leu Gly Pro Gly Gly Leu Leu Thr
210 215 220
Leu Gly Ser Ile Thr Ala Gly Leu Gly Val Ser Ser Ser Ala Thr Ser
225 230 235 240
Thr Cys Leu Ala Ala Gly Thr Leu Met Gly Ala Pro Ser Leu Pro Thr
245 250 255
Leu Leu Ala Gly Ala Val Gly Ser His Pro Ala Ala Ala Val Pro Pro
260 265 270
Ala Val Ala Val Ala Ser Leu Ala Pro Ala Thr Leu Leu Ser Ala Gly
275 280 285
Thr Ala Ser Gly Leu Ala Leu Gly Ala Met Ile Pro Ala Thr Gly Ser
290 295 300
Thr Pro Ala Ala Ile Gly Thr Gly Leu Ser Thr Ala Ala Ile Ser Ser
305 310 315 320
Gly Ser Pro Gly Val Pro Ala Met Ser Pro Leu Pro Gly Cys Ser Ser
325 330 335
Ala Val Ala Ile Ala Gly Ala Gly Val Leu Ser Gly Gly Met Thr Gly
340 345 350
Ala Gly Thr Ala Gly Thr Gly Ala Met Ala Thr Thr Thr Leu Val Gly
355 360 365
Leu Ala Gly Ser Val Gly Ala Ser Ile Ala Val Thr Ala Thr Ala Gly
370 375 380
Thr Ala Gly Leu Ala Ala Ala Leu Ala Ala Met Pro Gly Ile Gly Gly
385 390 395 400
Gly Leu Gly Ala Ser Gly Ala Ser Ala Thr Leu Leu Val Thr Val Ala
405 410 415
His Gly Ala Ala Ile Leu Leu Val Gly Ala Ala Pro Thr Gly Gly Pro
420 425 430
Val Ala Cys Val Gly Ser Ile Leu Ile Leu Ser Ser Ala Gly Val Gly
435 440 445
Gly Met Ser Leu Ala Gly Ala Leu Gly Ala Val Pro Ile Pro Ala Gly
450 455 460
Ala Cys Ser Gly Thr Ala Ser Gly Ala Ala Thr Ala Gly Ala Thr Ala
465 470 475 480
Ala Ala Ser Ala Thr Ser Pro Ala Ala
485
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
atgggaggag tttgtaaact gtgt 24
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
ctcactatcc gtcccactac aag 23
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
tgagcaccaa agaagtggac gaac 24
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 7
cacacgcctg aacatctcct gaa 23
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 8
tactagtcgg tgacgaccca 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 9
cattctcact atccgtccca 20

Claims (7)

1.一种PsARF基因片段，其特征在于，如SEQ ID NO.2所示核苷酸序列。
2.一种PsARF蛋白，其特征在于，权利要求1所述PsARF基因片段表达的蛋白质。
3.根据权利要求2所述PsARF蛋白，其特征在于，PsARF蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.3所示。
4.一种表达载体，其特征在于，包括权利要求1所述PsARF基因片段。
5.一种包括PsARF基因片段的菌株，其特征在于，包括权利要求4所述表达载体。
6.权利要求1所述PsARF基因片段和/或权利要求4所述表达载体在促进植物侧根数量增加中的应用。
7.一种促进植物侧根数量增加的方法，其特征在于，包括以下步骤：在植物中过表达权利要求1所述PsARF基因片段。
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