CN117683785A - 一种烟草茉莉酸信号调控因子NbNINJA13及其克隆方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于遗传工程技术领域，具体涉及一种烟草茉莉酸信号调控因子NbNINJA13及其克隆方法与应用。本发明以本氏烟草为主要研究对象，利用生物信息学方法筛选得到了NbNINJA候选基因NbNINJA13，并通过生物化学、植物分子遗传学中的酵母双杂交、双分子荧光互补等手段进行功能验证，克隆获得了本氏烟草茉莉酸信号负调控因子NbNINJA13基因，其中NbNINJA13的基因编码序列如SEQ ID NO.1所示，对应的编码蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。将过表达载体通过农杆菌介导的转化在烟草中过表达，探讨了NbNINJA13对尼古丁合成的负调控机制，筛选获得到了低尼古丁含量转基因烟草品种，在实际生产中具有广阔的应用前景。

Description

一种烟草茉莉酸信号调控因子NbNINJA13及其克隆方法与 应用

技术领域

本发明属于遗传工程技术领域，具体涉及烟草茉莉酸信号负调控因子的鉴定及其克隆方法与在培育低尼古丁含量烟草中的应用。

背景技术

JA(茉莉酸)信号通路是调控植物次生代谢的重要途径，JAs(茉莉素)能诱导植物细胞产生多种次生代谢产物，例如尼古丁和黄酮类化合物等，这些次生代谢产物种类繁多，是植物防御系统的重要组成部分。尼古丁在烟草根中合成，并通过木质部或韧皮部从根向上运输到气生组织。在烟草中，JAs可通过调控尼古丁的合成，介导烟草对虫害、病菌等的抗性。尼古丁含有一个吡啶环和一个吡咯烷环，分别由天冬氨酸和鸟氨酸经多个酶反应衍生而来，并且受特异调控因子控制。JAs主要通过COI1-JAZ-MYC2-NIC2ERFs信号转导方式调控烟草尼古丁合成通路关键基因的转录。烟草中有两个调控位点专门控制尼古丁相关结构基因的表达，分别是NIC1和NIC2；而烟草尼古丁合成通路关键基因PMT、A622、QPT、QS以及BBL等均受NIC位点调控。解析尼古丁生物合成调控具有重要的现实意义和科学价值。

烟草是我国重要经济作物之一，作为烟草属物种中主要的生物碱，尼古丁可作用于神经系统，使得吸烟者成瘾。尼古丁影响身体的许多器官包括心脏、大脑、血管和内分泌系统，危害身体新陈代谢。因此筛选和鉴定低尼古丁含量的烟草品种具有重要意义，不仅能为巨大的烟草消费市场提供多样化的选择，而且在对抗尼古丁成瘾方面具有潜在的应用价值。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种烟草茉莉酸信号调控因子NbNINJA13。

本发明还要解决的技术问题其提供上述烟草茉莉酸信号调控因子NbNINJA13的克隆方法。

本发明最后要解决的技术问题是提供上述烟草茉莉酸信号调控因子NbNINJA13在构建转基因烟草新品种中的应用。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

一种烟草茉莉酸信号调控因子NbNINJA13，其基因编码序列如SEQ ID NO.1所示。

其中，所述的烟草茉莉酸信号调控因子NbNINJA13能够负向调控尼古丁生物合成。

一种烟草茉莉酸信号调控因子NbNINJA13的编码蛋白，其氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。

其中，所述的编码蛋白来源于NINJA家族相关蛋白，其含有能够介导与TPL蛋白互作的EAR保守结构域和与JAZ蛋白互作的TIFY保守结构域。

上述烟草茉莉酸信号调控因子NbNINJA13的克隆方法，包括以下步骤：

(1)烟草茉莉酸信号调控因子NbNINJA13的确定：通过生物信息学分析筛选本氏烟草中候选的烟草茉莉酸信号调控因子，并通过蛋白互作验证获得候选基因NbNINJA13；根据本氏烟草转录组信息获得NbNINJA13编码基因序列；

(2)提取本氏烟草总RNA，再反转录获得cDNA；

(3)以步骤(2)的cDNA为模板，PCR扩增克隆候选基因NbNINJA13，再回收和纯化PCR扩增产物，并测序。

其中，步骤(1)中，所述的通过生物信息学分析筛选本氏烟草中候选的烟草茉莉酸信号调控因子，具体是先从蛋白结构域数据库(http://pfam.xfam.org)中搜索并下载模式植物拟南芥AtNINJA蛋白的保守结构域：PF07897(Ethylene-responsive binding factor-associated repression，即EAR motif)和PF16135(Tify domain binding domain)。其中，PF07897“EAR motif”可介导AtNINJA与AtTPL蛋白互作；而PF16135“Tify domain bindingdomain”是负责AtNINJA与JAZs相互作用所必需的结构域。之后利用Hmmer search工具在本氏烟草蛋白数据库(https://btiscience.org/our-research/research-facilities/research-resources/nicotiana-benthami ana/)中检索同时含有这两个保守结构域的编码蛋白，其编码基因可作为本氏烟草NbNINJA候选基因。

具体的，在本氏烟草蛋白数据库中共筛选到NbNINJA候选基因13个，分别为：NbNINJA1～13，优选NbNINJA13。

其中，步骤(1)中，通过蛋白互作验证获得候选基因NbNINJA13，首先将筛选的13个本氏烟草候选基因的编码蛋白与AtNINJA，NaNINJA进行系统进化的同源性分析，发现NbNINJA13与拟南芥AtNINJA同源性最高，分布在同一分支，暗示两者可能具有相似的功能。然后利用酵母双杂交、双分子荧光互补实验进一步验证NbNINJA13蛋白相互作用，发现NbNINJA13与AtTPL、AtJAZ2之间存在蛋白相互作用，这一结果与对照组AtNINJA与AtTPL、AtJAZ2之间存在蛋白相互作用相类似，因此，根据保守蛋白结构域的功能相似性，推测NbNINJA13与AtNINJA功能相似。接着对本氏烟草NbNINJA13蛋白重要结构域，即介导与TPL互作的EAR结构域(EAR motif)和与JAZ互作的TIFY结构域(Tify domain binding domain)进行鉴定与功能分析，发现NbNINJA13的保守结构域介导其与JAZ和TPL间的蛋白相互作用。最终确定烟草茉莉酸信号调控因子NbNINJA的候选基因为NbNINJA13。

其中，步骤(2)中，所述的反转录，其反应体系如下：RNA 50ng-5μg、Oligo(dT)1μL、2X TS Reaction Mix 10μL、RT/RI Enzyme Mix 1μL、gDNA Remover 1μL、RNase-freeWater to 20μL；反转录程序为：42℃30min，85℃5min。

其中，步骤(3)中，所述的PCR扩增克隆候选基因NbNINJA13，其所用引物为：BD-NbNINJA13-FP和BD-NbNINJA13-RP。

一种过表达载体，含有上述烟草茉莉酸信号调控因子NbNINJA13的基因编码序列，也在本发明所保护的范围之内。

具体的，所述的过表达载体为NbNINJA13过表达载体，扩增NbNINJA13并构建至PCAMBIA1302载体中，所用引物为OE-NINJA13-FP和OE-NINJA13-RP。

上述烟草茉莉酸信号调控因子NbNINJA13或烟草茉莉酸信号调控因子NbNINJA13的编码蛋白在构建转基因烟草新品种中的应用也在本发明所保护的范围之内。

其中，所述的转基因烟草新品种为尼古丁含量显著降低的转基因烟草NbNINJA13-OE。

其中，所述的转基因烟草新品种，其获得方法为：克隆烟草茉莉酸信号调控因子NbNINJA13，利用农杆菌介导的烟草叶盘转化法构建烟草NbNINAJ13过表达转基因烟草，筛选获得尼古丁含量降低的转基因烟草新品种。

进一步的，通过对NbNINJA13-OE过表达转基因烟草得尼古丁合成通路相关基因NbPMT，NbA622以及NbQPRT的转录水平进行分析，发现NbPMT，NbA622以及NbQPRT响应MeJA的应答，基因转录水平随着MeJA的处理而上调；但其基因转录水平的上调比率明显低于野生型烟草WT。此外，实验还发现在正常生长情况下，过表达转基因烟草中NbPMT，NbA622以及NbQPRT转录水平也明显低于WT。随后，利用GC-MS对烟草的尼古丁含量进行检测，发现在正常生长情况下NbNINJA13过表达转基因烟草根部的尼古丁含量明显低于野生型烟草WT，降低了57.1％；而经MeJA处理后，烟草中的尼古丁含量明显升高，而NbNINJA13-OE中尼古丁含量也明显低于WT，其含量为WT的0.58倍；此外，叶片中过表达烟草尼古丁含量也显著低于WT，其含量为WT的0.38倍。以上结果表明NbNINJA13负调控本氏烟草中尼古丁的合成。

有益效果：

本方案以本氏烟草为主要研究对象，利用生物信息学方法筛选得到了NbNINJA候选基因NbNINJA13，并通过生物化学、植物分子遗传学中的酵母双杂交、双分子荧光互补等手段进行功能验证，克隆获得了本氏烟草茉莉酸信号负调控因子NbNINJA13基因，并探讨了NbNINJA13对尼古丁合成的负调控机制，筛选得到了低尼古丁含量转基因烟草品种。说明本氏烟草茉莉酸信号负调控因子NbNINJA13基因在培育低尼古丁含量的烟草品种方面具有较大的应用前景。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明做更进一步的具体说明，本发明的上述和/或其他方面的优点将会变得更加清楚。

图1为生物信息学筛选本氏烟草NbNINJA候选基因。其中，A：基于Hmmer search的候选NbNINJA筛选；B：NbNINJA候选基因列表。

图2为NbNINJA13蛋白与AtTPL、AtJAZs的相互作用。其中，A：候选基因编码蛋白系统发育分析；B：酵母双杂交验证；C：双分子荧光互补；D：荧光素酶片段互补。

图3为本氏烟草NbNINJA13蛋白互作结构域的鉴定。其中，A：NINJAs蛋白序列比对；B：酵母双杂交验证NbNINJA13蛋白互作结构域。

图4为NbNINJA13负调控烟草中尼古丁的合成。其中，A-C：本氏烟草尼古丁合成通路相关基因NbPMT，NbA622和NbQPRT的转录水平；D：两周龄野生型和过表达转基因烟草经0和100μM MeJA处理2d后，根部组织提取液的GC-MS总离子色谱图，高亮显示为尼古丁指示峰；E：两周龄野生型和过表达转基因烟草根部组织尼古丁含量检测；F：五周龄野生型烟草和过表达转基因烟草叶片组织尼古丁含量检测。

具体实施方式

下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

下述实施例中，所述的pGADT7载体由本实验室保存；所述的酵母AH109感受态细胞、农杆菌感受态GV3101购买于上海唯地生物技术有限公司；所述的p2YN载体、p2YC载体、NLUC载体、CLUC载体、PCAMBIA1302载体由本课题组洪烨淳博士馈赠；所述的NC89烟草种子由本实验室保存。

下述实施例中，所述的YPDA液体培养基，其配方为：20g/L胰蛋白胨，10g/L酵母提取物，20g/L葡萄糖；所述的SD/-Trp-Leu培养基(即二缺营养缺陷型培养基)，其配方为：0.64g DO/-Trp-Leu，26.7g SD base；所述的SD/-Trp-Leu-Ade-His培养基(即四缺营养缺陷型培养基)，其配方为：0.60g DO/-Trp-Leu-Ade-His，26.7Minimal SD base。

下述实施例中，所用引物及其序列如表1所示。

表1本发明所用引物及其序列

实施例1：利用生物信息学筛选本氏烟草NbNINJA候选基因

为获得与拟南芥AtNINJA基因具有相似功能的本氏烟草NbNINJA基因，首先从蛋白结构域数据库(http://pfam.xfam.org)中搜索并下载模式植物拟南芥AtNINJA蛋白的保守结构域：PF07897(Ethylene-responsive binding factor-associated repression，即EARmotif)和PF16135(Tify domain binding domain)。其中，PF07897“EAR motif”可介导AtNINJA与AtTPL蛋白互作；而PF16135“Tify domain binding domain”是负责AtNINJA与JAZs相互作用所必需的结构域。之后利用Hmmer search工具在本氏烟草蛋白数据库(https://btiscience.org/our-research/research-facilities/research-resources/nicotiana-benthami ana/)中检索同时含有这两个保守结构域的编码蛋白(图1)，其编码基因可作为本氏烟草NbNINJA候选基因。

由图1可知，在本氏烟草蛋白数据库中共筛选到NbNINJA候选基因13个，其中除NbNINJA7外，候选NbNINJA在数据库中的注释均为NINJA家族相关蛋白，因此后续实验将以此为基础进一步进行筛选验证。

实施例2：验证候选NbNINJA编码蛋白与JAZ、TPL的蛋白相互作用

为筛选与拟南芥AtNINJA具有相似功能的目的蛋白，将实施例1中筛选的13个本氏烟草候选基因的编码蛋白与AtNINJA，NaNINJA进行系统进化的同源性分析(图2A)。结果显示，候选NbNINJA中，NbNINJA13与拟南芥AtNINJA同源性最高，分布在同一分支，暗示两者可能具有相似的功能。

利用已有的本氏烟草转录组信息((http://bioinformatics.boku.ac.at/NicBenth/Download/)获得候选NbNINJA13的编码区序列(CDS)，其编码基因序列如SEQ IDNO.1所示，对应的编码蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。随后通过植物RNA提取试剂盒(购于华越洋生物科技有限公司)提取本氏烟草总RNA，再利用反转录试剂盒(购于北京全式金生物技术股份有限公司，AU341-02-V2)反转录获得cDNA，以此为PCR扩增模板克隆候选NbNINJA13，回收和纯化PCR扩增产物，并测序。详细体系如下：

其中，反转录反应体系如下：RNA 50ng-5μg、Oligo(dT)1μL、2X TS ReactionMix10μL、RT/RI Enzyme Mix 1μL、gDNA Remover 1μL、RNase-free Water to 20μL。

反转录程序为：42℃30min，85℃5min。结束后置于-20℃冰箱中保存。

其中，PCR扩增反应体系如下：(20μl)：2×PCR mix 10μl、Primer-F(10μM)1μl、Primer-R(10μM)1μl、ddH₂O 7μl、模板1μl；

PCR扩增程序为：95℃预变性5min；95℃30s，56℃45s(此步可根据不同情况进行调整)，72℃1min，进行35个扩增循环；最后72℃延伸10min。

PCR扩增所用引物序列如表1中序号1～26所示。

具体的，利用酵母双杂交、双分子荧光互补和荧光素酶互补系统验证候选NbNINJA13与JAZ、TPL蛋白的相互作用，进一步筛选与拟南芥JA信号通路负调控因子AtNINJA具有相似功能的NbNINJA。具体方案如下：

(1)酵母双杂交：分别PCR扩增AtNINJA(正对照)和NbNINJA13的编码基因序列并构建到酵母双杂交中的pGBKT7载体，同时分别PCR扩增AtJAZ2、AtJAZ3和AtTPL的编码基因序列并构建到pGADT7载体。AtNINJA、AtJAZ2、AtJAZ3和AtTPL的编码基因序列分别如SEQ IDNO.3～6所示。

其中，具体PCR扩增反应体系如下(20μl)：2×PCR mix 10μl、Primer-F(10μM)1μl、Primer-R(10μM)1μl、ddH₂O 7μl、模板1μl。

PCR的扩增程序如下：95℃预变性5min；95℃30s，56℃45s(此步可根据不同情况进行调整)，72℃1min，进行35个扩增循环；最后72℃延伸10min。

NbNINJA13、AtNINJA、AtJAZ2、AtJAZ3和AtTPL基因克隆所用引物如表1中序号1～10所示。

琼脂糖凝胶电泳之后利用胶回收试剂盒(DC301-01，喏唯赞)回收相应的目的基因，目的条带与线性化载体通过喏唯赞同源重组试剂盒(ClonExpress IIOne StepCloning Kit，C112)在50℃下连接30min，随后将连接产物与DH5a感受态细胞混匀，冰上静置30min后，42℃水浴热激1min，立即至于冰上；2min后加入200μL LB培养基，在200rpm 37℃培养箱中培养60min；取150μL菌液均匀涂至平板上，37℃过夜培养。菌落PCR鉴定后进行测序分析，确定相应的阳性菌株。最后按照质粒小提试剂盒(DC201，诺唯赞)提取获得相应的质粒AtNINJA/NbNINJA13-BD、AtJAZ2/AtJAZ3/AtTPL-AD。

将构建好并测序正确的AtNINJA/NbNINJA13-BD、AtJAZ2/AtJAZ3/AtTPL-AD质粒分别共转化至酵母AH109感受态细胞，在二缺营养缺陷型培养基上获得成功共转化的阳性克隆后，将其继续涂布至四缺营养缺陷型培养基中培养观察，鉴定能与AtJAZ2、AtJAZ3、AtTPL互作的目标NbNINJA13。具体实验操作步骤如下：

①挑取活化好的酵母菌株AH109单克隆，接种于5mL YPDA液体培养基中，30℃，250rpm，培养16-18h。

②按每个反应10mL的菌量计算所需的培养基体积。将过夜培养物转接入适量的YPDA液体培养基，30℃，250rpm，培养至OD₆₀₀为0.4-0.6。在30℃时，酵母约为2.5h一代，可据此计算接入的菌量。

③开始收集菌体时，准备变性鲑精DNA。沸水浴中煮10min，随后立即插冰上备用。将培养好的细胞转入50mL离心管中。室温，4000rpm，5min，收集细胞。

④弃上清，1/2体积无菌水重悬菌体。室温，4000rpm，5min，收集细胞。弃上清，再次用无菌水洗一次，随后用3-4mL 1.1×TE/LiAC(现用现配，10×TE 1.1mL，1M LiAC 1.1mL)重悬。

⑤将重悬的菌液分装至1.5mL离心管中，室温4000rpm离心1min。弃上清，每管加入500-800μL的1.1×TE/LiAC重悬细胞，待用。

⑥准备转化的质粒：各取1μg质粒DNA(共转化质粒分别为AtNINJA/NbNINJA13-BD、AtJAZ2/AtJAZ3/AtTPL-AD)及10μL变性鲑精DNA加入2mL离心管中，充分混匀。

⑦加入100μL酵母AH109感受态细胞并轻轻混匀，加入600μL PEG/LiAC溶液。迅速震荡使其充分混匀。30℃，200rpm，培养30min-60min。

⑧加入70μL DMSO，上下轻轻颠倒混匀。42℃水浴中热激15-20min。冰上放置2min。室温4000rpm，离心1min，收集菌体。弃去上清，加入700μL 1×TE重悬菌体，室温4000rpm，离心1min，收集菌体。加入500μL 1×TE重悬菌体，室温4000rpm，离心1min。吸取并弃去400μL1×TE，重悬菌体，并将其均匀涂布在SD/-Trp-Leu固体培养基上，30℃倒置培养3-4天至单克隆长出。

⑨挑取合适大小的单克隆，用600μL SD/-Trp-Leu液体培养基在30℃培养箱中振荡培养过夜，室温4000rpm，离心1min，并用1mL无菌水重悬菌体，按照10×，100×，1000×的比例稀释菌液，并将菌液点在SD/-Trp-Leu和SD/-Trp-Leu-Ade-His的平板上。30℃培养3-4天后观察并拍照。

结果如图2B所示，通过分析蛋白间的相互作用验证NbNINJA与AtNINJA的相似性，在酵母双杂交系统中，NbNINJA13可以与AtTPL、AtJAZ2和AtJAZ3蛋白互作。

(2)双分子荧光互补：对酵母双杂交系统中筛选获得的目标NbNINJA13，进一步通过双分子荧光互补实验验证其蛋白相互作用。分别PCR扩增NbNINJA13、AtTPL、AtJAZ2和AtJAZ3的编码基因序列，扩增的NbNINJA13的编码基因序列构建至双分子荧光互补的载体p2YN中，扩增的AtTPL、AtJAZ2和AtJAZ3的编码基因序列构建至双分子荧光互补载体p2YC中。(注：扩增程序与连接转化体系与(1)酵母双杂交中一致，仅将pGBKT7载体替换为载体p2YN，pGADT7载体替换为载体p2YC。)

其中，双分子荧光互补实验中，NbNINJA13、AtJAZ2、AtJAZ3和AtTPL基因克隆所用引物如表1中序号11～18所示。

将构建成功并测序正确的NbNINJA13-YN、AtJAZ2/AtJAZ3/AtTPL-YC质粒分别转化农杆菌感受态GV3101。通过设置实验组和对照组组合，将已转化目标质粒的农杆菌注射(注射量以浸满整个叶片为准)至本氏烟草叶片继续暗培养48至72h后，取样进行荧光显微镜镜检，验证NbNINJA13与AtJAZ2、AtJAZ3、AtTPL的蛋白相互作用。农杆菌转化及烟草注射具体操作步骤如下：

①取农杆菌GV3101感受态，冰上融化，分别加入1-2μL质粒DNA(100-200ng/μL，质粒分别为NbNINJA13-YN、AtJAZ2/AtJAZ3/AtTPL-YC)，混匀后冰浴30min；液氮速冻1min，37度保温5min，加入1ml LB无抗液体培养基，摇匀。28℃慢速培养3小时后，稍离心，收集菌体，涂布于含有相应抗生素的LB平板上，28℃培养2-3天后至单克隆长出，待用。

②挑取合适大小的单克隆，分别接种至10ml的LB培养基中，28℃，200rpm，摇瓶24h。弃上清，加入与菌液等体积的渗透液(MgCl₂ 10mM，AS 0.1mM，MES10mM)，重悬菌体沉淀。重复清洗菌体一次。

③取菌液等体积的渗透液悬浮菌体细胞，待用。将含有不同目标质粒的菌体按照实验组和对照组的组合进行混合，室温放置2h。

④将悬浮的菌体细胞吸入注射器，将注射器头对准叶片下表面，手指垫在与注射器头相对的叶片上表面。温和地推动活塞，可以看到液体扩散至叶肉细胞的间隙。随后，25℃黑暗环境下放置12小时后置于正常的培养条件下培养。3天后在激光共聚焦显微镜下观察目标蛋白表达情况。

(3)荧光素酶片段互补：对目标NbNINJA13进一步通过荧光素酶互补系统实验验证其蛋白相互作用。分别扩增NbNINJA13、AtTPL、AtJAZ2和AtJAZ3的编码基因序列，扩增的NbNINJA13的编码基因序列构建至荧光素酶互补载体NLUC中，扩增的AtTPL、AtJAZ2和AtJAZ3的编码基因序列构建至荧光素酶互补载体CLUC中。(注：扩增程序与连接转化体系与(1)酵母双杂交中一致，仅将pGBKT7载体替换为载体NLUC，pGADT7载体替换为载体CLUC。)

其中，荧光素酶片段互补实验中，NbNINJA13、AtJAZ2、AtJAZ3和AtTPL基因克隆所用引物如表1中序号19～26所示。

将构建成功并测序正确的NLUC-NbNINJA13、CLUC-AtJAZ2/AtJAZ3/AtTPL中，分别转化农杆菌感受态GV3101。将带有目标载体的农杆菌组合分别注射(注射量以浸满整个叶片为准)烟草叶片，继续暗培养48至72h，配置荧光素酶底物并注射至该叶片，暗处理10min后在化学发光成像仪上检测荧光信号，进一步验证蛋白间的互作。

双分子荧光互补和荧光素酶片段互补的实验结果如图2C-2D所示，从图中可以发现，在NbNINJA13与AtTPL的组合、NbNINJA13与AtJAZ2/AtJAZ3的组合中均可以看到明显的荧光信号，这进一步表明NbNINJA13与AtTPL、AtJAZ2、AtJAZ3之间存在蛋白相互作用。这一结果与对照组AtNINJA相类似，根据保守蛋白结构域的功能相似性，因此推测NbNINJA13与AtNINJA具有功能相似性。

实施例3：本氏烟草NbNINJA13蛋白重要结构域鉴定及功能分析

为鉴定NbNINJA13蛋白的保守结构域，即介导与TPL互作的EAR结构域(EAR motif)和与JAZ互作的TIFY结构域(Tify domain binding domain)，首先将NbNINJAs与AtNINJA等同源蛋白在MeGA中(https://www.megasoftware.net/)进行氨基酸序列比对分析(图3A)。进一步克隆含有不同结构域的截短蛋白编码基因序列，根据蛋白保守结构域(A(EAR)，B，Cdomain)的位置构建了NbNINJA13的5个包含不同的结构域截短片段，分别为NbNINJA13-1(1-92aa)，NbNINJA13-2(90-334aa)，NbNINJA13-3(325-511aa)，NbNINJA13-4(1-334aa)和NbNINJA13-5(90-511aa)，其对应的编码基因序列分别如SEQ ID NO.7～SEQ ID NO.11所示。分别扩增NbNINJA13-1(引物NbNINJA13-F1/R1)，NbNINJA13-2(引物NbNINJA13-F2/R2)，NbNINJA13-3(引物NbNINJA13-F3/R3)，NbNINJA13-4(引物NbNINJA13-F1/R2)和NbNINJA13-5(引物NbNINJA13-F2/R3)的编码基因序列并构建至pGBKT7酵母载体中，同时分别扩增AtJAZ2/AtTPL编码基因序列并构建到pGADT7载体中。(注：扩增程序与连接转化体系与(1)酵母双杂交中一致。)

其中，扩增NbNINJA13-1～NbNINJA13-5的编码基因序列所用引物序列如表1中27～32所示。

将构建好并测序正确的NbNINJA13-1/2/3/4/5-BD和AtJAZ2/AtTPL-AD质粒分别共转化至酵母AH109感受态细胞，在二缺营养缺陷型培养基上获得成功共转化的阳性克隆后，将其继续涂布至四缺营养缺陷型培养基中培养观察，分析NbNINJA13不同结构域与TPL、JAZ2的相互作用，以此验证NbNINJA13保守结构域的功能(图3B)。酵母双杂交步骤与实施例2中(1)操作一致。

结果显示，NbNINJA13含有与AtNINJA结构最为相似的N端“EAR motif”和C端“Tifydomain binding domain”(图3A)。通过再进一步构建含不同结构域的载体转化农杆菌GV3101，并在酵母双杂交系统中进行验证，发现NbNINJA13的“EAR motif”介导其与AtTPL蛋白互作；而NbNINJA13蛋白C端的“Tify domain binding domain”则是与AtJAZ2相互作用所必需的结构域(图3B)，表明NbNINJA13的保守结构域介导其与JAZ和TPL间的蛋白相互作用。

实施例4：转基因烟草中尼古丁含量的鉴定

为了研究本氏烟草中NbNINJA的功能及其对次生代谢尤其是尼古丁合成的调控机制，利用农杆菌介导的烟草叶盘遗传转化筛选获得稳定遗传的NbNINJA13过表达转基因材料；烟草遗传转化步骤如下：

(1)获得无菌苗：将NC89烟草种子加入1ml 75％乙醇上下颠倒消毒，吸出液体再加入无菌水洗一次，而后加入1ml 7.5％NaClO，消毒30min，无菌水洗5遍，最后一遍留一点无菌水，全部吸出至1/2MS培养基上，将种子轻轻晃开，28℃黑暗下放置一天后光照培养；

(2)活化农杆菌：取冻存于-80℃的含有表达载体的GV3101甘油菌菌液，接种至含有25mg/L利福平和50mg/L卡那霉素的平板上，28℃培养2d，而后挑取单克隆，接种于4ml含有25mg/L卡那霉素和25mg/L利福平的LB培养基中，180rpm，28℃培养过夜，PCR鉴定后，按1:100接种于50ml含有50mg/L卡那霉素和25mg/L利福平的培养基中，180rpm，28℃培养10h左右，至OD值约为0.6-0.8；(其中，表达载体为NbNINJA13过表达载体，扩增NbNINJA13并构建至PCAMBIA1302载体中，所用引物为OE-NINJA13-FP/RP(表1序号33～34)，扩增程序与转化步骤与前所述载体构建过程一致。)

(3)制备浸染菌液：将上述菌液6000rpm离心10min，倒掉上清液，加入50ml菌液浸染培养基(菌液浸染培养基配方：1/2MS，10mM MES，0.1mM As)，悬浮菌体沉淀；

(4)侵染烟草叶盘：在无菌培养皿用刀片将烟草叶片切成小的叶盘，除去中间的叶脉，在浸染菌液中浸泡10min；

(5)共培养：侵染后的叶盘夹出后放到滤纸上吸干多余的菌液，在共培养培养基(共培养培养基配方：MS干粉4.43g/L，蔗糖30g/L，琼脂粉6g/L，2mg/L 6-BA，0.5mg/L IAA)表面上铺一层无菌滤纸，将叶盘摆放在滤纸上，再盖一层无菌滤纸，暗培养3d；

(6)选择培养：叶盘共培养后，转移到抗性筛选培养基(抗性筛选培养基配方：MS干粉4.43g/L，蔗糖30g/L，琼脂粉6g/L，2mg/L 6-BA，0.5mg/L IAA，500mg/L Carb，100mg/LGly)中，依据生长状态继代；

(7)生根培养：分化后的幼芽长到2-3cm时，切下生长状况良好的幼芽，转接到生根培养基(生根培养基配方：MS干粉2.217g/L，蔗糖15g/L，琼脂粉6g/L，500mg/LCef，100mg/LGly，所配溶液用0.4M NaOH调节pH至5.8)中，诱导其生根；

(8)移栽再生苗：幼苗叶片生长至组培瓶的瓶口附近时，开盖炼苗1-2d，移栽到营养土中生长。

(9)选取长势良好的T0代转基因再生苗，利用CTAB提取基因组DNA，作为模板，进行PCR验证。收获T0代种子，通过潮霉素抗性筛选培养基筛选T1代阳性材料，并移栽到瓶装培养基中，待幼苗长至瓶口时，进行PCR验证，确定阳性或突变位点后，移栽到温室，获得NbNINJA13-OE转基因烟草，继而进行继代培养和后续实验。

随后，利用诺唯赞实时荧光定量qPCR mix对NbNINJA13-OE转基因烟草中尼古丁合成通路相关基因NbPMT，NbA622以及NbQPRT的转录水平进行了检测，并以NbACTIN作为内参基因(NbActin-qFP/qRP)，RNA提取及cDNA合成与实施例2中涉及的RNA提取和cDNA的获得流程一致。

荧光定量所用引物如表1中序号35～42所示。

荧光定量具体扩增程序如下：95℃，45s；35个循环(95℃，5s；58℃，45s)。扩增结束后，按照95℃10s，60℃60s，95℃15s，继续反应，建立扩增产物的熔解曲线。

荧光定量反应体系依次加入：2×Master Mix 10μL、10μM特异引物F 0.5μL、10μM特异引物R 0.5μL，加ddH₂O水至19μL。轻弹管底混合，5000rpm离心1min，将19μL混合液加至96-PCR板孔中，再分别加入对应的1μL cDNA，粘上Sealing Film封口膜，离心1min后混合，上机。同时利用GC-MS(安捷伦，Agilent GC(8890)-MSD)分析烟草叶片和根部的尼古丁含量。

取两周龄烟草幼苗，用MeJA(茉莉酸甲酯)处理24小时后收集烟草根部组织，称取50mg根部样品，放入装有钢珠的1.5mL EP管中，破壁1min，打碎成粉。加入0.5ml乙酸乙酯充分溶解后进行超声30min处理，超声完毕后，14000rpm，离心10min；取300μl上清液加入到新的1.5ml EP管中，再加入适量的无水硫酸钠(除水)，继续14000rpm，离心10min。离心取200μL上清液至新离心管中，并用0.45μm滤膜进行过滤处理，随后将获得的溶液加入到样品瓶内衬管中，上机测试；对于烟草叶片中尼古丁含量检测步骤如下：选取长势、状态一致的五周龄烟草，称取100mg叶片组织，放入装有钢珠的1.5mL EP管中，破壁1min，打碎成粉。按照烟草根部组织的处理方法提取并上机测试。GC-MS分析采用Agilent GC(8890)-MSD(5977B)，配备多功能自动进样器(MPS)和Zebra-5HT INFERO毛细管柱(35m×0.25mm×0.1m)。在70eV的碰撞能量下，通过电子碰撞(EI)电离将GC中洗脱的代谢物进行电离。在全扫描模式下采集MS信号，扫描范围为60～800Da。

结果如下：通过对NbNINJA13-OE过表达转基因烟草尼古丁合成通路相关基因NbPMT，NbA622以及NbQPRT的转录水平进行分析，发现NbPMT，NbA622以及NbQPRT响应MeJA的应答，基因转录水平随着MeJA的处理而上调；但其基因转录水平的上调比率明显低于野生型烟草WT。此外，实验还发现在正常生长情况下，过表达转基因烟草中NbPMT，NbA622以及NbQPRT转录水平也明显低于WT(图4A-4C)。随后，利用GC-MS对烟草的尼古丁含量进行了检测(图4D-4F)，如图4E和4F所示，在正常生长情况下NbNINJA13过表达转基因烟草根部的尼古丁含量明显低于野生型烟草WT，降低了57.1％；而经MeJA处理后，烟草中的尼古丁含量明显升高，而NbNINJA13-OE中尼古丁含量也明显低于WT，其含量为WT的0.58倍；此外，叶片中过表达烟草尼古丁含量也显著低于WT，其含量为WT的0.38倍。综上，结果表明NbNINJA13负调控本氏烟草中尼古丁的合成。

本发明提供了一种烟草茉莉酸信号调控因子NbNINJA13及其克隆方法与应用的思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。

Claims (9)

1.一种烟草茉莉酸信号调控因子NbNINJA13，其特征在于，其基因编码序列如SEQ IDNO.1所示。

2.根据权利要求1所述的烟草茉莉酸信号调控因子NbNINJA13，其特征在于，所述的烟草茉莉酸信号调控因子NbNINJA13负向调控尼古丁生物合成。

3.一种烟草茉莉酸信号调控因子NbNINJA13的编码蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

4.根据权利要求3所述的编码蛋白，其特征在于，所述的编码蛋白来源于NINJA家族相关蛋白，其含有能够介导与TPL蛋白互作的EAR保守结构域和与JAZ蛋白互作的TIFY保守结构域。

5.一种权利要求1所述的烟草茉莉酸信号调控因子NbNINJA13的克隆方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)烟草茉莉酸信号调控因子NbNINJA13的确定：通过生物信息学分析筛选本氏烟草中候选的烟草茉莉酸信号调控因子，并通过蛋白互作验证获得候选基因NbNINJA13；根据本氏烟草转录组信息获得NbNINJA13编码基因序列；

(2)提取本氏烟草总RNA，再反转录获得cDNA；

(3)以步骤(2)的cDNA为模板，PCR扩增克隆候选基因NbNINJA13，再回收和纯化PCR扩增产物，并测序。

6.一种过表达载体，含有权利要求1所述的烟草茉莉酸信号调控因子NbNINJA13的基因编码序列。

7.权利要求1所述的烟草茉莉酸信号调控因子NbNINJA13或权利要求3所述的烟草茉莉酸信号调控因子NbNINJA13的编码蛋白在构建转基因烟草新品种中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的转基因烟草新品种为尼古丁含量显著降低的转基因烟草NbNINJA13-OE。

9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的转基因烟草新品种，其获得方法为：克隆烟草茉莉酸信号调控因子NbNINJA13，利用农杆菌介导的烟草叶盘转化法构建烟草NbNINAJ13过表达转基因烟草，筛选获得尼古丁含量降低的转基因烟草新品种。