CN117887733A - 一种水稻基因以及利用水稻基因增强水稻穗发芽抗性的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种水稻OsMFT1基因,对其进行种子萌发试验发现,OsMFT1基因的过表达株系与野生型相比极显著降低了水稻种子的发芽率,增强了植株的穗发芽抗性。水稻OsMFT1基因能够极显著抑制种子萌发。
Description
技术领域
本发明属于基因分子生物领域,尤其设计一种水稻基因在提高水稻抗穗发芽方面的应用和方法
背景技术
稻是世界范围内重要的粮食作物之一,近年来,随着全球气候变暖,很多谷物还没出田,穗上的种子就开始发芽。发芽的种子品质降低,严重影响粮食产量。一些发芽过度的籽粒,甚至无法进行饲料加工,让农民的收入大打折扣。有效控制谷物抗穗发芽的时间是目前影响种子品质的重要参考标准。
随着基因技术深入,挖掘抗穗发芽相关基因,研究其抑制萌发的作用机制,培育抗穗发芽较强的水稻新品种是应对逆境胁迫,提高水稻产量的有效途径之一。
常规育种得到抗穗发芽种质资源不仅使一个非常艰难的过程,而且育种周期也比较长,很难培育出理想的抗性品种。随着现代分子生物学的飞速发展,为解决这个问题提供了一个很好的契机。
现有技术表明,水稻的穗发芽抗性与种子休眠性密切相关。目前,通过资源筛选并进行遗传分析,已经定位了大量休眠性数量性状位点(QTL),但只有少数几个被克隆,因此现有技术中能应用于实际生产的基因非常少。
本发明提出可利用一种转基因来增强作物抗穗发芽特性,培育抗穗发芽作物,有利于降低穗发芽对种子品质的影响。
发明内容
针对上述的技术问题,本发明提供了一种水稻基因OsMFT1,以及利用水稻基因OsMFT1提高水稻抗穗发芽的方法,首次明确了水稻基因OsMFT1与谷物种子萌发的关系。
进一步的,本发明利用农杆菌介导的转基因技术对水稻进行基因的转化,并获得水稻基因的过表达转化。同时,进行种子萌发试验发现,基因的过表达株系与野生型相比极显著降低了水稻种子的发芽率,增强了植株的穗发芽抗性。
为解决上述问题,本发明提供
一种水稻基因OsMFT1,所述OsMFT1基因,其核苷酸序列如SEQ ID No.1表所示;或与SEQ ID No.1序列互补的核苷酸序列。
一种所编码蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:2;
一种水稻基因OsMFT1在水稻抗穗发芽中的应用,所述OsMFT1基因其核苷酸序列如SEQ ID No.1表所示。
一种利用水稻基因提高水稻穗发芽抗性的方法,包括
构建重组载体,所述重组载体携带OsMFT1基因;
将所述重组载体通过农杆菌介导转入水稻幼胚中,提高水稻基因OsMFT1在水稻种子中的表达量。
一种培育抗穗发芽的水稻的方法,包括
构建重组载体,所述重组载体携带OsMFT1基因;
所述重组载体通过农杆菌介导转入水稻幼胚中,得到抗穗发芽的转基因作物,获得T0代植株;
自交获得T1代植株,即可获得抗穗发芽的水稻。
本发明的有益效果是,通过研究了水稻基因OsMFT1的功能,所述水稻OsMFT1基因能够极显著抑制种子萌发,利用所述水稻基因OsMFT1的功能特点,将其应用于水稻及其他作物上增强了植株的穗发芽抗性。
附图说明
图1为本发明实验例转基因载体图示;
图2为本发明实验例转基因种子萌发试验对比;
图3为本发明实验例转基因水稻萌发率对比图;
图4为本发明实验例OsMFT1相对表达量分析对比图。
其中,ZH11表示野生型种子的胚,ZH11-G表示清水处理72小时后萌发的野生型种子胚,ZH11-NG表示使用清水处理72小时后未萌发的野生型种子胚。OE-OsMFT1表示过表达OsMFT1基因种子的胚,OE-OsMFT1-G表示清水处理72小时后萌发的过表达OsMFT1基因种子胚,OE-OsMFT1-NG表示使用清水处理72小时后未萌发的过表达OsMFT1基因种子胚。使用最小显著性差异法(Least Significance Difference,LSD)方法对数据进行差异分析,具有相同标记字母的即为差异不显著,具有不同标记字母的即为差异显著。大写字母表示差异极显著(p<0.01),小写字母表示差异显著(p<0.05)。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案,下面将结合本发明实施例中的附图,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都应当属于本发明保护的范围。
需要说明的是,本发明的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象,而不必用于描述特定的顺序或先后次序。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换,以便这里描述的本发明的实施例能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。此外,术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形,意图在于覆盖不排他的包含,例如,包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元,而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。
实验例
OsMFT1过表达株系的获得及分析,OsMFT1定位于水稻第6号染色体chr06.17,540,126-chr06.156,542,392之间。
本实施例以Ubi作启动子,NOS做终止子,bar作为选择标记基因,以卡那霉素作为选择标记基因,根据OsMFT1(Oryza sativa MOTHER OF FT AND TFL1)序列设计目的基因片段引物,以pCAMBIA1302载体为骨架,采用同源重组法,利用BamHⅠ和KpnⅠ双酶切构建OsMFT1基因的过表达载体。
将构建好的干涉载体转化农杆菌感受态细胞。农杆菌浸染中花11(ZhongHua 11,ZH11)幼胚培养得到T0代OsMFT1基因过表达水稻。
以下为具体步骤:
水稻RNA的提取和cDNA的制备
RNA提取参照Trizol试剂盒(北京美基美生物科技有限公司)中的方法,
具体步骤如下:
(1)用液氮冷却研磨器:将已称量好的材料迅速放入研钵中并快速研磨,直至材料研磨成极细粉末;
(2)按照每0.1g材料1mL的用量,将Trizol加入研钵中;
(3)20min后,拆开研钵继续研磨,直至研钵内Trizol呈透明状,将其分装到2mL离心管中;
(4)在上述离心管中再加入氯仿300μL,颠倒1分钟充分混匀,并静置5min后离心15min(4℃,12000rpm),小心吸取上清液至另一2mL离心管中;
(5)重复第4步加氯仿及之后步骤,再次吸取上清液转至另一1.5mL离心管中;
6)待RNA沉淀晾干后,加入适量DEPC处理水溶解。利用TakaRa公司的PrimeScriptTMIV 1st strand cDNA Synthesis Mix(试剂盒名称和货号Code No.6215A)获得cDNA用来克隆基因的模板。
植物重组载体(OE-OsMFT1)的构建
以反转录的cDNA为模板,采用以下引物对进行PCR扩增:
上游引物:5'-GACTACAAAGATGATGACGATAAACCTAGGATGGCATCGCATGTGGACCCGCTG-3',如SEQ ID NO.3所示;
下游引物:5'-TCATCCTTGTAATCACTAGTAGGCCTGTAGCGGCGGCGGCGGTTGGC-3',如SEQID NO.4所示。
用上游引物和下游引物进行PCR扩增,得到531bp的PCR扩增产物(OsMFT1基因)。将其与用BlnI和StuⅠ双酶切pCAMBIA1302::UBI表达载体大片段重组连接。
然后连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,在含有卡纳霉素(50mg/L)的LB固体培养基上培养过夜。
挑取白色菌落,在含有卡纳霉素(50mg/L)的LB液体培养基中培养过夜。碱法提取质粒DNA并进行BlnI和StuⅠ酶切鉴定,得到大小为531bp的基因片段为阳性质粒。将该阳性质粒命名为OE-OsMFT1,
载体部分结构示意图如图1所示,图中Target gene(目的基因)区为转基因插入目标片段的位置。将OE-OsMFT1转化农杆菌LBA4404感受态细胞,并获得可供转化使用的农杆菌菌株,命名LBA4404/OE-OsMFT1。
胚性愈伤的获得
挑选成熟水稻种子,剥离颖壳,倒入50mL离心管中,加入75%乙醇消毒1min,倒掉乙醇,无菌水冲洗一遍,倒掉,再加入30%次氯酸钠消毒20min,倒掉次氯酸钠后用无菌水冲洗5-6遍。
可用灭菌过的滤纸吸干,将种子转移到诱导培养基(MS+2mg/L 2,4-D+300mg/L CHPH=5.8)上,每皿20-25颗种子。
愈伤长出后可用原胚直接做转化,原胚旁边长出的小颗粒可挑取到新的诱导培养基上进行继代培养(MS+2mg/L 2,4-D+300mg/L CH PH=5.8),长到适宜的大小时同样可以进行转化。
农杆菌扩繁
将甘油菌在LB固体培养基(卡那霉素+利福平)上划线,28℃培养2~3d(天)后,挑取单克隆接种到5mL LB液体培养基(卡那霉素+利福平)中,28℃,220rpm恒温震荡培养过夜培养,5000rpm离心10min收集菌体,将收集的菌体用MS液体培养基重悬至OD600=0.4~0.6。
农杆菌侵染和共培养
将愈伤组织(愈伤状态良好,颜色鲜黄,质地圆润坚硬,颗粒直径在3mm左右为宜)置于重悬好的农杆菌菌液中,室温放置侵染20min,并不时晃动,用无菌滤纸吸干胚性愈伤组织表面的菌液,将其置于共培养培养基(MS+2mg/L 2,4-D+300mg/L CH+100μM AS PH=5.8)上黑暗培养3d。
筛选培养
共培养3d后的愈伤组织转到已灭菌的空三角瓶中,加入无菌水冲洗两遍,第三遍用含有500mg/L羧苄青霉素的无菌水冲洗一遍,移液枪吸掉多余水分后将愈伤转移到无菌滤纸上吹干愈伤上的水,待愈伤吹干后转移到筛选培养基(MS+2mg/L 2,4-D+300mg/L CH+600mg/L Cef+50mg/L Hyg PH=5.8)上进行筛选培养,培养条件28-30℃,暗培养。筛选时长3-4周。芽诱导分化共培养结束后,将胚性愈伤转移到筛选分化培养基(MS+10mg/Lsorbitol+1mg/L 6-BA+0.25mg/L NAA+0.5mg/L KT+0.2mg/L ZT+500mg/L CH+600mg/L Cef+50mg/L Hyg PH=5.8)上;诱导生芽,每两周更换一次培养基。
分化再生
筛选一个月后,可见颜色鲜黄的阳性愈伤长出,此时可将阳性愈伤挑取到分化培养基上进行分化再生。每个分化皿上放16颗阳性愈伤,置于28-30℃温室中光照培养。一般10d左右可将愈伤冒出绿点,在经过10d左右会有幼苗分化出。
生根及抗性植株筛选
待分化出的幼苗长到2-3cm左右,有明显根系的时候就可以将幼苗转移到生根培养基(1/2MS+0.2mg/L NAA+1mg/L MET+600mg/L Cef+50mg/L Hyg PH=5.8)上让幼苗长大,培养条件28-30℃,无菌光照培养。待形成完整植株时,切取部分叶片,使用TransDirectPlant Tissue PCR Kit试剂盒提取基因组DNA,用基因特异引物检测阳性植株。
使用试剂盒提取基因组DNA,具体操作步骤如下:1.取5mg或0.5cm2左右的植物组织样品,剪碎后加入40μL PD1 Buffer,吹吸或涡旋混匀。2.95℃孵育10min。3.加入40μLPD2Buffer,混匀后直接作为模板进行PCR或置于4℃或-20℃保存。PCR扩增,MFT1检测引物序列为:
上游引物:5'-ACGCGTAGATCCATGGATTACAAGG-3',如SEQ ID NO.5所示;
下游引物:5'-TCATCCTTGTAATCACTAGTAGGCCT-3',如SEQ ID NO.6所示。
基因OsMFT1检测序列长度为647bp,扩增条件为:94℃预变性5min;94℃变性30s,59℃退火30s,72℃延伸40s,循环35次;72℃延伸10min。
采用同样的方法将空载体pCAMBIA1302转入野生型水稻中,得到T0代转pCAMBIA1302水稻。采用同样的方法检测,其结果与野生型水稻无显著差异。将T0代植株播种,自交得到T1代植株。
对阳性转基因过表达植株进行种子萌发试验
种子萌发试验
选择饱满的种子浸于无菌水中过夜处理,待种子充分吸胀后至于湿润的滤纸上,23℃黑暗培养72h(保持滤纸湿润状态),计算种子的萌发率。
OsMFT1基因的表达分析
参考上文提“水稻RNA的提取和cDNA的制备”方法取T2种子胚总RNA,反转录得到cDNA。使用引物进行qRT-PCR试验。
上游引物:5'-AGCCGTTGGTGAGGTCCTTGG-3',如SEQ ID NO.7
33.所示;
下游引物:5'-GAAATTCAGAGAGTCACCGCGAGAG-3',如SEQ ID NO.8所示。
反应体系:F/R 1μL、cDNA 1μL、H2O 7μL、Mix 10μL
结果
如图2所示,
A组,野生型ZH11的萌发试验,萌发率为94%。
B组,敲除OsMFT1基因突变株的萌发实验,萌发率为94.5%。
C组,过表达OsMFT1基因转基因株的萌发试验,萌发率为11.1%。
图3所示,表示A组、B组、C组差异极显著,p<0.01,其中p值,也称显著性值或者Sig.值,用于描述某件事情发生的概率情况,其取值范围是0~1,不包括0和1,通常情况下,一般有三个判断标准一个是0.01、0.05以及0.1。在绝大多数情况下,如果p值小于0.01,则说明至少有99%的把握,如果p值小于0.05(且大于或等于0.01),则说明至少有95%的把握,如果p值小于0.1(且大于或等于0.05),则说明至少有90%的把握。
OE-表示基因过表达,Edit-表示基因敲除,可以看出种子萌发试验结果显示,过表达OsMFT1基因后,种子的萌发率极显著受到抑制,敲除OsMFT1对种子的萌发率无显著影响。图4所示,qRT-PCR结果显示,ZH11表示野生型种子的胚,ZH11-G表示清水处理72小时后萌发的野生型种子胚,ZH11-NG表示使用清水处理72小时后未萌发的野生型种子胚。OE-OsMFT1表示过表达OsMFT1基因种子的胚,OE-OsMFT1-G表示清水处理72小时后萌发的过表达OsMFT1基因种子胚,OE-OsMFT1-NG表示使用清水处理72小时后未萌发的过表达OsMFT1基因种子胚。使用最小显著性差异法(Least Significance Difference,LSD)方法对数据进行差异分析,具有相同标记字母的即为差异不显著,具有不同标记字母的即为差异显著。大写字母表示差异极显著(p<0.01),小写字母表示差异显著(p<0.05)。
OsMFT1基因在成熟胚中高表达,在种子萌发过程中,OsMFT1基因的表达水平会极显著降低。使用清水处理72小时后,未萌发和萌发的野生型水稻胚OsMFT1基因表达水平无显著差异,未萌发的转基因水稻胚的OsMFT1基因表达水平显著高于萌发转基因株系胚。
图4大写字母表示差异极显著,p<0.01;小写字母表示差异显著p<0.05。OE-表示基因过表达,Edit-表示基因敲除,ZH11表示转基因受体材料,-G表示清水处理72h后萌发,-NG表示清水处理72h后不萌发。
本发明研究了水稻基因OsMFT1的功能,首次明确了水稻基因OsMFT1与谷物种子萌发的关系,同时,利用农杆菌介导的转基因技术对水稻进行OsMFT1基因的转化,并获得水稻OsMFT1基因的过表达转化事件。
进一步,对过表达的植株进行表达量分析发现,与受体材料相比,其表达量显著提高。最后,对其进行种子萌发试验发现,OsMFT1基因的过表达株系与野生型相比极显著降低了水稻种子的发芽率,增强了植株的穗发芽抗性。
实验结果表明,水稻OsMFT1基因能够极显著抑制种子萌发,首次明确了水稻OsMFT1基因与作物种子萌发的关系,验证了该基因在水稻种子萌发过程中的负调节作用。为该基因在水稻及其他作物上的应用以及提高抗穗发芽提供了理论依据和实践价值。水稻OsMFT1基因在作物抗穗发芽领域,特别是水稻抗穗发芽领域具有广阔的应用前景,其经济效益潜力巨大。
本领域的普通技术人员将会意识到,这里所述的实施例是为了帮助读者理解本发明的原理,应被理解为本发明的保护范围并不局限于这样的特别陈述和实施例。本领域的普通技术人员可以根据本发明公开的这些技术启示做出各种不脱离本发明实质的其它各种具体变形和组合,这些变形和组合仍然在本发明的保护范围内。
Claims (4)
1.一种水稻基因OsMFT1,所述OsMFT1基因其核苷酸序列如SEQ ID No.1表所示;或与SEQ ID No.1序列互补的核苷酸序列。
2.一种水稻基因OsMFT1在水稻抗穗发芽中的应用,所述OsMFT1基因其核苷酸序列如SEQ ID No.1表所示。
3.一种利用水稻基因提高水稻穗发芽抗性的方法,包括
构建重组载体,所述重组载体携带OsMFT1基因;
将所述重组载体通过农杆菌介导转入水稻幼胚中,提高水稻基因OsMFT1在水稻种子中的表达量。
4.一种水稻的培育方法,包括
构建重组载体,所述重组载体携带OsMFT1基因;
所述重组载体通过农杆菌介导转入水稻幼胚中,得到抗穗发芽的转基因作物,获得T0代植株;
自交获得T1代植株,即可获得抗穗发芽的水稻。
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