CN115976047A - 一种根发育相关基因IbSAUR36及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种根发育相关基因IbSAUR36及其应用，属于分子生物技术领域，本发明提供的与甘薯根发育相关的IbSAUR36基因3'UTR区下游没有保守的DST元件区片段，翻译后mRNA稳定，填补了现有技术的空缺。本发明成功从甘薯中克隆了IbSAUR36，证实了所述基因在甘薯根和叶的表达量高于其他组织，通过农杆菌介导法将该基因转化到甘薯中，首次发现IbSAUR36的过表达使甘薯根数增多、根长变短，进一步证明IbSAUR36基因与甘薯根的形成有关。说明本发明的基因IbSAUR36在甘薯根发育的相关研究以及产量选育中具有广泛的应用前景。

Description

一种根发育相关基因IbSAUR36及其应用

技术领域

本发明涉及分子生物技术领域，尤其涉及一种根发育相关基因IbSAUR36及其应用。

背景技术

甘薯属于块根类的作物，根系的生长变化直接影响甘薯块根的发育，影响甘薯产量。因此，甘薯块根的研究仍然是其高效生产的有效保障。

SAUR(small auxinup RNA)基因是家族最大、基因数量最多的生长素早期响应基因。SAUR基因是植物特有的一类基因，编码蛋白小，在蛋白序列中间有一段60个氨基酸的高度保守。植物的SAUR基因受发育、环境及昼夜节律因子的调控。一些研究发现SAUR36基因参与叶片衰老。如Hou等(HouK.,WuW.,Gan S.S.SAUR36,a small auxin up RNAgene,isinvolved in the promotion of leaf senescence in Arabidopsis[J].PlantPhysiology,2013,161(2):1002-1009.)通过过量表达和基因敲除发现AtSAUR36是叶片衰老的正调控因子，且通过生长素诱导调控，还发现在AtSAUR36的3'UTR包含一个高度保守区致使幼叶SAUR36的转录不稳定。也有研究发现OsSAUR36的过表达株系表现出叶片早衰的表型，而且OsSAUR36的基因敲除突变体叶片衰老发生了推迟(Kant S.,Bi Y.M.,Zhu T.,Rothstein S.J..SAUR39 a small auxin-up,RNA gene acts as a negative regulatorofauxin synthesis and transport in rice[J].Plant Physiology,2009,151:691-701；Bemer M,Van Mourik H,Muino JM,Ferrándiz C，KaufmannK，Angenent GC.FRUITFULLcontrols SAUR10 expression and regulates Arabidopsis growth and architecture[J].Journal of ExperimentalBotany,2017,68,3391–3403)。

现有技术中，在甘薯中未见与IbSAUR36基因有关的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种根发育相关基因IbSAUR36及其应用，用以填补现有技术的空缺。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种根发育相关基因IbSAUR36，所述基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。

本发明还提供了上述根发育相关基因IbSAUR36的应用，通过过表达IbSAUR36来增加作物根数量、减短作物的根长度和/或增加叶片数量。

优选的，所述过表达IbSAUR36的方法包括以下步骤：

将IbSAUR36克隆至基因过表达载体中，得到重组载体；

将所得重组载体转化至根癌农杆菌中；

将根癌农杆菌接种至作物，实现基因的过表达。

优选的，所述基因过表达载体为pCAMBIA1301S载体。

优选的，所述作物为甘薯。

本发明还提供了一种检测上述根发育相关基因IbSAUR36的特异性引物，所述上游引物的5’端到3’端的列如SEQ ID NO.2所示，下游引物的5’端到3’端的序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明还提供了上述检测根发育相关基因IbSAUR36的扩增引物在作物性状相关研究中的应用，用于作物的根系性状辅助育种。

本发明的技术效果和优点：

本发明提供的IbSAUR36基因3'UTR区下游没有保守的DST元件区片段，翻译后mRNA稳定，证实了所述基因在甘薯根和叶的表达量高于其他组织。本发明成功从甘薯中克隆了IbSAUR36，通过农杆菌介导法将该基因转化到甘薯中，首次发现了IbSAUR36的过表达使甘薯根数增多、根长变短。进一步证明发现了所述IbSAUR36基因与甘薯根的形成有关。说明本发明的基因IbSAUR36在甘薯根发育的相关研究以及性状选育中具有广泛的应用前景。

附图说明

图1为IbSAUR36基因全长cDNA序列的扩增结果；

图2为IbSAUR36基因在不同组织的表达模式；

图3为甘薯IbSAUR36转基因植株的基因组PCR检测；

图4为过表达IbSAUR36甘薯植株的表型鉴定。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1扩增与提取

利用Primer Premier 5.0软件设计IbSAUR36基因全长序列(cDNA核苷酸序列：CTGTTGTTTGCGAATATGCGGAGATTGCGGGGTTTTTCGGTGAAGCACCGGGTGACGACGATTTTCCGGTGTATGTTCCGGCGCCACCGGTGTTCGGGGTACTACCAGCGCCTGGACGCGCCGCCGCGGGTTCAGGGGAGGATAATTCACTCGGTCGTGAGGTGGACGCGCCGGTTGGGGATGAAGGCCAAGGCTATTTGCTCTAAGGCGCAGTTTTCGGGGTACTCGCCGGCGGGGAAAGAGGCGGTGAGTGAGCGGGCGGCGGCGGTGCCGAAAGGGCATCTGGCGGTGTACGTCGGCGGCGAAAAAGGCGAAGATTTCACCCGGGTTTTGGTGCCGGTGATTTACTTCAACCACCCTTTGTTCGGGGAGCTTCTCCGGGAAGCGGAGGCGGAATTCGGGTTCAACCACCCCGGCGGGATCACGCTCCCTTGCCGGATCTCGGAGTTTGAGCGCGTTCAGACCCGGATCATCAGGGAGAGTAGTTGCGGCTCCGGCAGAATGGTTTCCCGCCGGCGGTGAAGTGTTTGATGATGACGACGACAAAACCTTAATTAATTAATGACATTCCATTTTTTGTTTCTTCAAAGTCTCTTCAGGATTTTGGCCCACTATTAGCTTGTTGG，如SEQ ID NO.1所示)的引物。引物序列如下：

IbSAUR36-F1：5-CTGTTGTTTGCGAATATGCG-3(如SEQ ID NO.2所示)；

IbSAUR36-R1：5-CCAACAAGCTAATAGTGGGCCA-3(如SEQ ID NO.3所示)；

甘薯总RNA提取：

利用Trizol试剂盒(Invitrogen，上海，中国)从甘薯品种济薯29甘薯样品中提取总RNA。利用分光光度仪器测定RNA浓度与质量。

第一链cDNA合成：

利用Takara反转录试剂盒对步骤2中的RNA进行反转录，获得济薯29的块根cDNA。

利用高保真酶LATaq，以济薯29的块根cDNA为模板进行IbSAUR36全长序列的扩增。

PCR扩增体系：50μL总体系(ddH₂O₂21μL，

HS(Premix)25μL，Primer-A(10μM)1μL，Primer-S(10μM)1μL，cDNA2μL)。

PCR程序：95℃，5min，[变性：95℃，15s；退火：55℃，1min；延伸72℃，15s]40个循环，72℃,10min。

PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定后纯化，用Nanodrop测纯化产物浓度，再用TaqDNA聚合酶加A尾后连接T载体，随后转化大肠杆菌DH5α，37℃培养箱中培养过夜长出单克隆后，通过PCR鉴定阳性克隆，菌落PCR条件循环数改为22个，其他同上克隆PCR条件，阳性菌落进行测序鉴定。结果如图1所示，其中M为DL2000 DNA Marker，长度分别为2000bp，1000bp，750bp，500bp。

实施例2 IbSAUR36基因在不同组织的表达分离

以济薯25、济薯29两个品种为材料，选取大田生长125天时的第四片展开叶、茎尖、幼茎、基部茎、柴根和块根，取样后，迅速液氮冷冻于-80℃备用。

利用PrimerPremier 5.0软件对IbSAUR36基因ORF序列的非保守区域设计qRT-PCR引物：

IbSAUR36-qRT-F：5-AAGGCCAAGGCTATTTGCTCTAA-3(如SEQ ID NO.4所示)；

IbSAUR36-qRT-R：5-CTGATGATCCGGGTCTGAACG-3(如SEQ ID NO.5所示)；

总RNA的提取、反转录步骤同实施例1。

使用SYBRPremix Ex Taq II定量试剂(Tli RNaseH Plus,TaKaRa,大连,中国)在Roche 

480II(Roche，英国)进行qRT-PCR分析，使用的内参基因为Ib-Actin。利用2-^ΔΔCT方法来计算基因的相对表达水平(Livak et al.,2001)，每个基因的平均Ct值由三次生物学重复实验获得，qRT-PCR反应体系如下：预变性：95℃，5min，[变性：95℃，15s；退火：55℃，1min；延伸72℃，15s]28个循环，结果如图2所示。

由图2可知，IbSAUR36基因在两个品种中的不同组织中的表达趋势相似，其中在柴根和叶片中表达量最高，其次是基部茎、块根，在茎尖和幼茎中的表达量最低。此外，IbSAUR36在济薯25柴根中的表达量显著高于济薯29，在济薯25块根和基部茎中的表达量显著低于济薯29。

实施例3植物表达载体的构建

根据IbSAUR36的ORF序列和植物表达载体pCAMBIA1301S的多克隆酶切位点设计引物，如下：

IbSAUR36-KpnI：5-GGGGTACCCCACCATGCGGAGATTGCGGGGTTTT-3(如SEQ ID NO.6所示)；

IbSAUR36-XbaI：5-GCTCTAGAGCTCACCGCCGGCGGGAAACCATTCTG-3(如SEQ ID NO.7所示)；

利用高保真Pfu酶对IbSAUR36的ORF序列进行扩增，回收产物、连接到克隆T载体007VS上、测序、提取质粒。

将007VS-IbSAUR36质粒和植物表达载体pCAMBIA1301S质粒分别用限制性快速内切酶Kpn I和Xba I进行双酶切。酶切体系如下：质粒1μg，10×Buffer 5μl，KpnI 10U，XbaI10U，补足ddH₂O至10μl。37℃2h，琼脂糖凝胶电泳回收、纯化目的片段。

利用T4连接酶将目的片段连接到pCAMBIA1301S，16℃2h，转化大肠杆菌中，37℃过夜培养，测序获得pCAMBIA1301S-IbSAUR36阳性质粒。

实施例4农杆菌感受态的转化

将200ng的pCAMBIA1301S-IbSAUR36加入冰上融化的100μl根癌农杆菌LBA4404感受态细胞中，混匀；

冰浴5min，液氮速冻1min，迅速37℃水浴5min；加入800μL LB液体培养基，28℃，200rpm摇动5h；

将预表达的菌液均匀涂布在含有50mg/L Kan、100mg/L Rif的LB固体培养基上；28℃倒置培养2天，挑单菌落摇菌28℃培养并进行PCR阳性检测，获得pCAMBIA1301S-IbSAUR36的农杆菌菌液，备用。

实施例5转基因功能验证－甘薯转化筛选

将济薯25薯块于花盆中发芽并用于提供甘薯茎尖，剥取茎尖分生组织接种于2.0mg/L 2,4-D的MS固体培养基上，室温27±1℃，暗培养诱导胚性愈伤组织，然后将胚性愈伤组织进行扩繁和继代。

将生长状态良好的胚性愈伤组织在研钵中研磨成小颗粒，转移至含有2.0mg/L 2,4-D的MS液体培养基中，28℃摇动培养2-12h，用于遗传转化。

将愈伤组织加入到含有100mg/LAS(乙酰丁香酮)的农杆菌菌液中，避光慢摇30min，超声波导入15s。

侵染后，将愈伤组织转移到含有100mg/L AS、2.0mg/L 2,4-D的MS固体培养基中共培养，28℃黑暗培养2天。

用2mg/L2,4-D的MS液体培养基清洗组织3次，将愈伤组织转移至含有300mg/L头孢霉素(CS)、5.0mg/L潮霉素(Hyg)、2.0mg/L 2,4-D的MS固体培养基上选择筛选培养，27±1℃，光照强度为3000Lux(13h/天光照)。2周继代一次，挑选状态良好的愈伤继代，筛选浓度提高至10.0mg/LHyg。

选择培养4周后，将抗性愈伤组织转移至含有1.0mg/L ABA、200mg/L CS的MS固体培养基上进行诱导体细胞胚的生长，27±1℃，光照强度为3000Lux(13h/天光照)，培养4周。

将变绿色的细胞胚组织转移至MS固体培养基上，培养至完整植株形成，温度为27±1℃，每天13h光照，光照强度为3000Lux。

实施例6转基因功能验证－表型分析

取拟转基因植株的叶片提DNA，以拟转基因株系DNA为模板，同时分别以pCAMBIA1301S-IbSAUR36载体质粒为阳性对照，以水、野生型济薯25的DNA为阴性对照，进行PCR扩增，PCR体系和扩增程序同上。在1％的琼脂糖凝胶电泳，根据PCR结果筛选转基因阳性植株。结果如图3所示。所用引物如下：

35S-F：5-GACGCCATTTCGCCTTTTCA-3(如SEQ ID NO.8所示)

IbSAUR36-Xba I:5-GCTCTAGAGCTCACCGCCGGCGGGAAACCATTCTG-3(如SEQ ID NO.9所示)

选取过表达植株(OE)、野生株系(WT)中带有一片展开叶的茎段于MS培养基上生长，27±1℃，光照强度为3000Lux(13h/天光照)培养。4周后观察，观察植株生长情况，并测定根长度、根数、叶片数与黄叶数。结果如图4(其中：WT为转空载体pCAMBIA1301S对照，OE5，OE8和OE13为三个独立的转基因株系)和表1所示：

表1表型测定结果

由图4和表1可知，IbSAUR36转基因甘薯在组培苗期叶片数量增多，茎长变短，根数显著增多。

由以上实施例可知，本发明提供的IbSAUR36基因3'UTR区下游没有保守的DST元件区片段，翻译后mRNA稳定，证实了所述基因在甘薯根和叶的表达量高于其他组织。本发明成功从甘薯中克隆了IbSAUR36，通过农杆菌介导法将该基因转化到甘薯中，首次发现了IbSAUR36的过表达使甘薯根数增多、根长变短。进一步证明发现了所述IbSAUR36基因与甘薯根的形成有关。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种根发育相关基因IbSAUR36，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.权利要求1所述的根发育相关基因IbSAUR36的应用，其特征在于，通过过表达IbSAUR36来增加作物根数量、减短作物的根长度和/或增加叶片数量。

3.根据权利要求2所述的根发育相关基因IbSAUR36的应用，其特征在于，所述过表达IbSAUR36的方法包括以下步骤：

将克隆的IbSAUR36构建至基因过表达载体中，得到重组载体；

将所得重组载体转化至根癌农杆菌中；

将根癌农杆菌接种至作物，实现基因的过表达。

4.根据权利要求3所述的根发育相关基因IbSAUR36的应用，其特征在于，所述基因过表达载体为pCAMBIA1301S载体。

5.根据权利要求2～4任一项所述的根发育相关基因IbSAUR36的应用，其特征在于，所述作物为甘薯。

6.一种检测权利要求1所述的根发育相关基因IbSAUR36的扩增引物，其特征在于，所述引物的上游5’端到3’端的序列如SEQ ID NO.2所示，下游引物5’端到3’端的序列如SEQ IDNO.3所示。

7.权利要求6所述的检测根发育相关基因IbSAUR36的扩增引物在作物性状相关研究中的应用，其特征在于，用于作物的根系性状辅助育种。

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