CN117778406A - 大豆GmFT4基因及其编码蛋白和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了大豆GmFT4基因及其编码蛋白和应用，属于植物生物技术领域。本发明解决了目前公开的能够调控大豆种子大小的基因相对较少的问题。所述GmFT4基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示，GmFT4基因编码蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：2所示。本发明通过将GmFT4在大豆中过量表达，发现过表达GmFT4后大豆的籽粒变大、百粒重增加。所述GmFT4基因可用于大豆及其近源物种的生物育种，可以通过该基因增加大豆的籽粒大小，从而增加作物的产量。
Description
技术领域
本发明属于植物生物技术领域，具体涉及一种大豆基因及其编码蛋白和应用。
背景技术
大豆是重要的粮食与经济作物，为人类提供重要的植物蛋白质和油份。种子大小是影响大豆产量的主要性状之一。大豆产量形成的主要因素包括单株荚数、荚粒数、百粒重。种子的大小决定着粒重，从而决定着大豆的产量。通过分子育种及生物育种控制大豆的粒重，培育高产大豆品种是提高大豆产量的有效手段。然而目前为止，调控大豆种子大小的分子机理仍未被完全阐明，各基因之间的调控网络尚不明晰，报道的能够调控大豆种子大小的基因也相对较少。因此，进一步挖掘与大豆种子大小相关基因对人们深入了解种子大小的调控机制及提高大豆产量具有重要意义。本发明以百粒重在6～7g的小粒大豆东农50为研究对象，为调控大豆的种子大小提供了有效手段。
发明内容
本发明提供了一种大豆GmFT4基因及其编码蛋白和应用，解决了目前公开的能够调控大豆种子大小的基因相对较少的问题，同时通过在大豆植株中过表达GmFT4基因增加大豆种子大小，增加大豆粒重，达到大豆增产的目的。
本发明的技术方案如下：
大豆GmFT4基因，所述基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示。
大豆GmFT4基因的编码蛋白，所述编码蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所示。
大豆GmFT4基因在调控大豆籽粒大小中的应用。
大豆GmFT4基因在培育改良大豆品种中的应用。
一种转基因大豆的制备方法，所述方法包括如下步骤：
步骤1：构建GmFT4基因过表达载体pTF101.1:GmFT4；
步骤2：将构建完成的载体pTF101.1:GmFT4转入受体大豆基因组中，获得GmFT4基因过表达转基因大豆株系；
步骤3：将GmFT4基因过表达转基因大豆株系进行分子鉴定，获得GmFT4基因在大豆中实现过量表达的转基因大豆。
进一步的，所述步骤2中构建完成的载体pTF101.1:GmFT4转入受体大豆基因组的方法为根癌农杆菌介导大豆子叶节的方法。
进一步的，所述步骤2中受体大豆的品种为东农50。
本发明公开了大豆GmFT4基因及其编码蛋白和应用。本发明通过将大豆GmFT4基因在大豆中过量表达，确定了大豆GmFT4基因对大豆的种子大小具有调控作用，具有增加大豆种子大小，增加大豆粒重的功能，解决了目前公开的能够调控大豆种子大小的基因相对较少的问题。因此，大豆GmFT4基因可在通过分子或基因工程育种提升大豆及其近源物种产量过程得到应用。
附图说明
图1为GmFT4基因在过表达转基因大豆及非转基因大豆中的半定量RT-PCR分析；
图2为GmFT4基因在过表达转基因大豆及非转基因大豆中的qPCR分析；
图3为Gm FT4过表达转基因大豆及非转基因大豆种子大小表型变化及百粒重数据统计。
具体实施方式
以下结合附图对本发明做进一步的详细描述，所举实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
本实施方式大豆GmFT4基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示。
本实施方式本发明的大豆GmFT4基因的编码蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ IDNO.2所示。
以下实施例中如无特别说明均为常规方法。
实施例1大豆GmFT4基因的功能验证。
(一)GmFT4基因过表达载体的构建。
以过表达E1(在Kariyutaka背景中)大豆植物叶片的cDNA为模板，以GmFT4-F1(SeqID No.3)和GmFT4-R1(Seq ID No.4)为引物，采用购买自北京全式金生物科技有限公司的高保真酶FastPfu Fly DNA Polymeras，进行PCR扩增。PCR反应条件：94℃预变性5min，(94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸60s)×6循环，94℃变性30s，68℃退火30s，72℃延伸60s，26循环，再72℃延伸5min，采用购买自Promega公司的SV Gel and PCR CleanUp System进行凝胶回收。通过PCR扩增获得GmFT4基因的扩增条带，并通过此次PCR扩增在GmFT4基因的上游引入XbaⅠ的酶切位点，在下游引物SacⅠ的酶切位点。扩增所得的PCR产物及载体pTF101.1同时经过XbaⅠ与SacⅠ双酶切后，T4 DNA连接酶过夜连接，转化大肠杆菌感受态细胞。pTF101.1:GmFT4载体含有Bar筛选标记基因(草铵膦抗性)，35S启动子驱动GmFT4基因。
将构建好的载体pTF101.1:GmFT4通过根癌农杆菌介导大豆子叶节的方法转入大豆东农50品种基因组中，获得GmFT4基因过表达转基因大豆株系。
(二)GmFT4基因过表达转基因大豆的分子鉴定。
1、通过对大豆的遗传转化，使用160mg/L的草铵膦涂抹实验，在T1代获得草铵膦抗性的转化事件有2个(35S:GmFT4#L1、35S:GmFT4#L2)，提取这2个转化事件大豆成熟叶片的RNA，RNA提取方法参见Invitrogen公司的TRIzol试剂盒的操作手册。
2、采用DNase处理步骤1提取的总RNA，处理后的总RNA采用购买自Toyobo公司的NanoDrop检测其RNA含量及质量；
3、取经步骤2NanoDrop检测到达标准后的2μg总RNA，采用购买自北京全式金生物科技有限公司的 One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix试剂盒，以及试验盒配带的dT18引物，按照试剂盒的操作手册合成cDNA；
4、取2μl步骤3稀释5倍后的cDNA作为RT-PCR模板，以qGmFT4-F1(Seq ID No.5)和qGmFT4-R1(Seq ID No.6)为引物，采用购买自北京全式金生物科技有限公司的EasyTaq，进行PCR扩增。PCR反应条件：94℃预变性5min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，内参基因TUA5 27个循环，GmFT4基因29个循环，终延伸72℃，5min，大豆内参基因TUA5的引物序列为qTUA5(Seq ID No.7与Seq ID No.8)，内参基因TUA5的引物序列为已发表论文总的公开序列(Ruibo Hu,et al.2009)。取5μlPCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图1所示，与非转基因大豆东农50相比，GmFT4基因的表达量在2个独立的转化事件中均显著高于非转基因大豆。说明GmFT4基因在大豆中成功实现了过量表达。
5、取1μl步骤3稀释30倍后的cDNA作为qPCR模板，以qGmFT4-F1(Seq ID No.5)和qGmFT4-R1(Seq ID No.6)为引物，大豆内参基因TUA5的引物序列为qTUA5(Seq IDNo.7与Seq ID No.8)，按照TransStart Top Green qPCR Super Mix Kit说明书进行操作，以SYBRGreenⅠ为染料，采用三步法PCR反应。qPCR反应条件：95℃预变性30s，95℃变性5s，60℃退火15s，72℃延伸20s，40个循环，采用2-ΔΔCT算法，计算GmFT4基因的相对表达量，结果如图2所示，与非转基因大豆相比，GmFT4基因的表达量在2个独立的转化事件中均显著高于非转基因大豆。说明GmFT4基因在大豆中成功实现了过量表达。
(三)GmFT4基因过表达转基因大豆的表型分析。
将T2代GmFT4基因过表达转基因大豆与非转基因对照品种东农50播种于盆钵中，每个株系10株，置于自然光下种植(长日照)，对植株的表型进行详细调查。结果发现，GmFT4基因过表达转基因大豆，籽粒显著变大，百粒重显著增加，转基因大豆百粒重在8.7g左右，对照品种东农50百粒重在6.8g左右，转基因大豆的百粒重比非转基因对照品种东农50高1.9g左右(图3)。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.大豆GmFT4基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示。
2.大豆GmFT4基因的编码蛋白，其特征在于，所述编码蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所示。
3.大豆GmFT4基因在调控大豆籽粒大小中的应用。
4.大豆GmFT4基因在培育改良大豆品种中的应用。
5.一种转基因大豆的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
步骤1：构建GmFT4基因过表达载体pTF101.1:GmFT4；
步骤2：将构建完成的载体pTF101.1:GmFT4转入受体大豆基因组中，获得GmFT4基因过表达转基因大豆株系；
步骤3：将GmFT4基因过表达转基因大豆株系进行分子鉴定，获得GmFT4基因在大豆中实现过量表达的转基因大豆。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤2中构建完成的载体pTF101.1:GmFT4转入受体大豆基因组的方法为根癌农杆菌介导大豆子叶节的方法。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤2中受体大豆的品种为东农50。
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