CN116254293A - 一种提高玉米产量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种提高玉米产量的方法，所述方法是在玉米中过表达生长素输入载体蛋白，筛选穗行数、穗粒重、或容重显著增加的转化株，提高玉米产量。本发明过量表达生长素运输蛋白质可以显著提高玉米自交系和杂交种的米籽粒的容重和穗行数，进而显著提高产量。在相同的遗传背景下，籽粒的容重和穗行数都与玉米的产量成正相关关系，利用容重和穗行数选择导入了生长素运输蛋白质基因的转基因玉米可以有效地获得高产转基因玉米。
Description
(一)技术领域
本发明涉及一种提高玉米产量的方法。
(二)背景技术
提高玉米、水稻等农作物的产量潜力具有重大价值。长期以来，通过农作物的遗传育种，玉米、水稻等农作物的产量获得了很大的提高，但是利用传统的育种方法进一步提高产量变得越来越困难。通过转基因技术和基因编辑技术提高农作物的产量可能是进一步提高农作物产量潜力的重要技术方法。
目前已经报道的转基因改良农作物产量的例子包括，表达一种拟南芥基因的转基因玉米MON87403(USDA-APHIS Petition for the Determination of NonregulatedStatus for Increased Ear Biomass MON 87403Maize.United States Department ofAgriculture,2014.https://www.aphis.usda.gov/brs/aphisdocs/14_21301p.pdf.)；一种表达一个Helianthus annuus基因的转基因大豆HB4(USDA-APHIS Pettition fordetermination of non-regulated status for the new plant variety HB4 soybean(IND-00410–5)intended for environmental release and food and feed use.UnitedStates Department of Agriculture,Animal and Plant Health InspectionService:2017.https://www.aphis.usda.gov/brs/aphisdocs/17_22301p.pdf.)；以及表达玉米基因Zmm28的转基因玉米DP202216(Wu et.al.,Proc Natl Acad Sci USA，116:23850-23858)。但是，进一步获得新型的提高玉米等农作物产量的技术仍然非常需要。
植物生长素(Auxin)是调控植物生长发育的重要激素。器官和整株水平上，生长素从幼苗到果实成熟都起重要作用。生长素最明显的作用是促进生长，但对茎、芽、根生长的促进作用因浓度而异。生长素输入蛋白质(Auxin importer carrier)是一类将生长素从细胞外输入至细胞内的蛋白。以往认为，生长素输入蛋白在植物的根系发育和生殖器官形成中起到调控作用(Swarup,K.,Benková,E.,Swarup,R.et al.The auxin influx carrierLAX3 promotes lateral root emergence.Nat Cell Biol 10,946–954(2008).)(SwarupR,Friml J,Marchant A,et al.Localization of the auxin permease AUX1 suggeststwo functionally distinct hormone transport pathways operate in theArabidopsis root apex.Genes&Development.2001Oct；15(20):2648-2653.)。
中国专利申请201110376993.9提出了利用生长素输入载体AUX1/LAX家族基因蛋白质改善玉米、高粱根系、株高等性状的方法。尽管改善玉米根系、株高可能可以提高玉米产量，但是根系和株高与产量并没有直接的正相关关系。此外，201110376993.9并没有提供获得了产量提高的转基因玉米或者高粱的例子。
我们的研究意外地发现，过量表达生长素运输蛋白质可以显著提高玉米自交系和杂交种的米籽粒的容重和增加穗行数，进而显著提高产量，而这些功能以前并没有发现过。特别是我们发现，在相同的遗传背景下。籽粒的容重和穗行数都与玉米的产量成正相关关系，利用容重和穗行数选择导入了生长素运输蛋白质基因的转基因玉米可以有效地获得高产转基因玉米。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种提高玉米产量的方法，通过导入生长素输入蛋白表达框，调节生长素输入蛋白的表达，可以增加玉米籽粒的穗行数、穗粒重、容重，从而具有增产的潜力。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供了一种提高玉米产量的方法，所述方法是在玉米中过表达生长素输入载体蛋白，筛选穗行数、穗粒重、或容重显著增加的转化株，提高玉米产量。
优选的，所述的生长素输入载体蛋白包括但不限于来自玉米、高粱、水稻、小麦拟南芥等植物的生长素输入载体蛋白。所述生长素输入载体蛋白包含SEQ ID NO：1的多肽片段，或者包含一个与SEQ ID NO：1多肽片段的氨基酸序列至少有75％、78％、80％、85％、90、95％的相同性的肽段。氨基酸的相同性可以通过现有的方法获得，例如Karlin和Altschul，1990，Porc.Natl.Acad.Sci.USA 87：3364；Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5877.)。本领域的技术人员可以通过搜索数据库或者传统的基因克隆的方法从植物中克隆编码本发明所述生长素输入载体蛋白质的DNA序列，或者根据氨基酸序列人工合成生长素输入载体蛋白质的编码序列。
优选的，本发明所述的生长素输入载体蛋白是玉米生长素输入载体蛋白，包括ZmAIC1(亦称ZmAUX1)、ZmATL1、ZmAIC2、ZmAIC3或ZmAIC4，其氨基酸序列分别为SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6。更优选的生长素输入载体蛋白是玉米ZmAUX1。
优选的，本发明生长素输入载体蛋白的过表达是将含生长素输入载体蛋白编码基因的表达盒导入玉米基因组中，达到过表达的目的。所述表达盒是在生长素输入载体蛋白质编码基因的5’端与一个启动子功能性地连接，3’端与一个终止子功能性地连接而构成。所述生长素输入载体蛋白过表达盒包括ZmAUX1表达盒，或ZmATL1表达盒；所述ZmAUX1表达盒中ZmAUX1基因的mRNA编码序列可根据SEQ ID NO:7的核酸序列人工合成，然后在5’添加ZmAUX1基因的天然启动子(SEQ ID NO:8中1bp至1775bp)，在3’添加ZmAUX1的天然终止子(SEQ ID NO:8中5984bp至6132bp)，得到5’端添加Hind III酶切位点，3’端添加Kpn I位点的ZmAUX1表达盒。所述ZmATL1表达盒中ZmATL1基因的mRNA编码序列可根据NM_001370703.1的核酸序列人工合成，然后在5’添加ZmATL1基因的天然启动子(SEQ ID NO 12的1bp至1492bp)，在3’添加ZmATL1的天然终止子(SEQ ID NO：12的7803bp至8189bp)，得到5’端添加Hind III酶切位点，3’端添加Kpn I位点的ZmATL1表达盒。
优选的，所述生长素输入载体蛋白的过表达可以使用多种不同的启动子。比较常用的组成型启动子如玉米泛素启动子，水稻actin启动子，CaMV35启动子等。器官或组织特异启动子，如穗特异启动子，种子特异启动子等。通常一种生长素输入载体蛋白基因可以同时使用几种启动子，以找到能够获得更加优良转基因性状的合适启动子。本发明获得高产转基因玉米的一个优先启动子是玉米ZmAUX1天然启动子，其序列为SEQ ID NO:8中第1-1775bp所示。
终止子在基因的正常表达中是需要的，本发明的终止子可以是天然玉米的生长素输入载体蛋白基因终止子，也可以是其他来源的终止子，如NOS终止子，CaMV35S终止子，HSP终止子等。本发明优选的终止子为ZmAUX1天然终止子(SEQ ID NO:8中5984-6132bp)。
为将本发明所述的生长素输入载体蛋白导入到玉米基因组获得转基因玉米，通常还需要使用选择性标记基因表达框，来辅助转基因植物的筛选，选择性标记基因表达框可以与本发明的生长素输入载体蛋白表达框串联在一个T-DNA构建体中，也可以在各自独立的T-DNA构建体中通过共转化的方法进行筛选，以获得包含本发明过表达生长素输入载体蛋白的转基因玉米。本发明用于筛选过表达生长素输入载体蛋白的转基因玉米的标记基因包括但不限于草甘膦抗性基因g10evo epsps，cp4 epsps，草铵膦抗性基因pat、bar，卡那霉素抗性基因，潮霉素抗性基因等。优选草甘膦筛选标记表达盒pCMP-g10evo epsps(SEQ IDNO:9)。
优选，本发明提高玉米产量的方法是将生长素输入载体蛋白过表达盒与在5’端添加Kpn I位点，3’端添加Xho I位点的草甘膦筛选标记表达盒pCMP-g10evo epsps(SEQ IDNO:9)通过三段酶切连接的方式插入到(Hind III,Kpn I)双酶切的pCAMBIA1300载体骨架中，获得的构建体通过电击法导入农杆菌LBA4404，再转化玉米，筛选获得产量提高的玉米；所述生长素输入载体蛋白过表达盒包括ZmAUX1表达盒或ZmATL1表达盒。
优选的，所述构建体还包括将生长素输入载体蛋白编码基因下游的启动子替换为启动子p35S(SEQ ID NO:10)或者在Kpn I位点插入植物病毒增强子3xEnhancer(SEQ IDNO:11)。
将一种包含生长素输入蛋白质基因表达框的DNA片段导入农作物的方法已经是一种成熟的技术。一般可以用农杆菌介导的方法，农杆菌介导的玉米转化是本领域技术人员所熟知的技术。其他转化方法，包括但不限于基因枪、原生质体转化等，也含在本发明获得过表达生长素输入载体蛋白转基因玉米的方法之中。
由于导入的位点、拷贝数等不同因素，导入了生长素输入蛋白质基因的不同转化体的性状表现并不相同。通过与遗传背景相同的常规植株比较，选择在容重或穗行数或者穗粒重显著增加的转化体。优选穗行数增加2％、3％、5％、8％以上，和/或穗粒重增加3％、5％、8％、10％以上，和/或容重增加5、10、13、20g/L以上的玉米。
本发明还提供了在玉米基因组的生长素输入载体蛋白基因座处引入遗传修饰提高玉米产量的的植物、植物细胞、植物部分、种子和谷物，所述基因组生长素输入载体蛋白基因座编码SEQ IDNO：2-6的氨基酸序列。通过对这些基因座进行遗传修饰，增加了蛋白质的活性和/或水平，可获得穗行数、和/或穗粒重、和/或容重显著增加的玉米。
优选的，所述遗传修饰包括将外源的增强子插入到基因组基因组启动子区域，或通过基因编辑的方法改变基因座启动子的核苷酸序列，通过对玉米天然的生长素输入载体蛋白基因座进行编辑，筛选容重，穗行，粒重增加的基因编辑玉米，获得提高产量的玉米植株。
所述“基因组基因座”通常指在植物的染色体上的位置，在该位置上发现了基因，诸如编码多肽的多核苷酸。所述“基因”包括表达功能性分子的核酸片段，诸如但不限于特定蛋白质编码序列和调节元件，诸如在编码序列之前(5’非编码序列)和之后(3’非编码序列)的那些调节元件。
所述“调节元件”通常是指参与调节核酸分子(例如基因或靶基因)转录的调节元件。调节元件是核酸，并且可以包括启动子、增强子、内含子、5’-非翻译区(5’-UTR，还被称为前导序列)、3’-UTR或其组合。调节元件能以“顺式”或“反式”起作用，并且通常以“顺式”起作用，即其激活位于调节元件所在的相同核酸分子(例如染色体)上的基因的表达。
所述“增强子”元件是当功能性连接至启动子时(无论其相对位置如何)都可增加核酸分子的转录的任何核酸分子。
所述“顺式元件”通常是指影响或调控可操作地连接的可转录的多核苷酸表达的
转录调节元件，其中所述可转录的多核苷酸存在于相同DNA序列中。顺式元件可以起到结合转录因子的作用，所述转录因子是调节转录的反式作用多肽。
所述“内含子”是转录成RNA、但是在产生成熟mRNA的过程中被切除的基因中的间插序列。所述术语也用于切除的RNA序列。“外显子”是经转录的基因的序列的一部分，并且在源自所述基因的成熟信使RNA中被发现，但不一定是编码最终基因产物的序列的一部分。5′非翻译区(5’UTR)(也称为翻译前导序列或前导RNA)是直接位于起始密码子上游的mRNA的区域。该区域涉及通过病毒、原核生物和真核生物中的不同机制对转录物的翻译的调节。“3′非编码序列”是指位于编码序列下游的DNA序列，并且包括聚腺苷酸化识别序列和编码能够影响mRNA加工或基因表达的调节信号的其他序列。聚腺苷酸化信号通常表征为影响聚腺苷酸片添加到mRNA前体的3′末端。
“遗传修饰”、“DNA修饰”等是指在植物的特定基因组基因座上改变或变更核苷酸序列的位点特异性修饰。本文所述的组合物和方法的遗传修饰可以是本领域已知的任何修饰，诸如，例如，插入、缺失、单核苷酸多态(SNP)、和或多核苷酸修饰。另外，基因组基因座上的靶向DNA修饰可位于基因组基因座上的任何位置，诸如，例如，所编码的多肽的编码区(例如，外显子)、非编码区(例如，内含子)、调节元件、或非翻译区。“靶向”遗传修饰或“靶向”DNA修饰是指对生物体基因的直接操作。所述靶向修饰可以使用本领域已知的任何技术引入，诸如，例如，植物育种、基因组编辑、或单基因座转化。
多核苷酸的DNA修饰的类型和位置不受特别限制，只要DNA修饰导致由相应多核苷酸编码的蛋白质的表达和/或活性增加即可。
植物、植物细胞、植物部分、种子、和/或谷物包含存在于编码多肽的内源性多核苷酸的(a)编码区；(b)非编码区；(c)调节序列；(d)非翻译区，或(e)(a)-(d)的任何组合中的一种或多种核苷酸修饰。
所述DNA修饰是在基因组基因座中插入一个或多个核苷酸(优选是连续的)。例如，插入表达调控元件(FMV增强子SEQ ID NO:13)，其与本文所述的目的基因可操作地连接。所述靶向DNA修饰可以是将本领域已知的具有较高表达的启动子(诸如玉米Ubi启动子，ZmAUX1启动子)插入其他生长素输入载体蛋白的5’UTR，从而通过插入的启动子控制内源性多肽的表达。所述DNA修饰是优化Kozak背景以增加表达的修饰。所述DNA修饰是多核苷酸修饰或在调节所表达的蛋白的稳定性的位点上的SNP。
如本文使用的“增加的”、“增加”等是指与对照组(例如，不包含DNA修饰的野生型植物)相比，实验组(例如，具有本文所述的DNA修饰的植物)中的任何可检测的增加。因此，增加的蛋白质表达包含样品中蛋白质总水平的任何可检测的增加，并且可使用本领域的常规方法来确定，例如，蛋白质印迹法和ELISA。
所述基因组基因座具有超过一个(例如，2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、或10个)DNA修饰。例如，基因组基因座的翻译区和调节元件可各自包含靶向DNA修饰。在某些实施例中，植物的超过一个基因组基因座可包含DNA修饰。
可以使用本领域已知的或本文所述的任何基因组修饰技术来完成基因组基因座的DNA修饰。在某些实施例中，通过基因组修饰技术进行靶向DNA修饰，所述基因组修饰技术选自由以下组成的组：多核苷酸指导的内切核酸酶、CRISPR-Cas内切核酸酶、碱基编辑脱氨酶、锌指核酸酶、转录激活子样效应子核酸酶(TALEN)、工程化位点特异性大范围核酸酶、或Argonaute。可以通过在所需改变附近的基因组中的确定位置诱导双链断裂(DSB)或单链断裂来促进基因组修饰。可以使用任何可用的DSB诱导剂诱导DSB，所述诱导剂包括但不限于，TALEN、大范围核酸酶、锌指核酸酶、Cas9-gRNA系统(基于细菌性CRISPR-Cas系统)、指导的cpf1内切核酸酶系统等。在一些实施例中，可以将DSB的引入与多核苷酸修饰模板的引入组合。在另外的一些实施例中，可以通过先导序列编辑的方法将多核苷酸修饰引入(Zong,Y.,Liu,Y.,Xue,C.et al.An engineered prime editor with enhanced editingefficiency in plants.Nat Biotechnol 40,1394–1402(2022).)。
与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：本发明过量表达生长素运输蛋白质可以显著提高玉米自交系和杂交种的米籽粒的容重和穗行数，进而显著提高产量。在相同的遗传背景下，籽粒的容重和穗行数都与玉米的产量成正相关关系，利用容重和穗行数选择导入了生长素运输蛋白质基因的转基因玉米可以有效地获得高产转基因玉米。
(四)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
本发明以下实施例中所使用的分子生物学和生物化学方法均为已知的技术。在Ausubel编写的John Wiley and Sons公司出版的Current Protocols in MolecularBiology，和J.Sambrook等编写的Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)出版的Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3rd ED.等文献均有详细的说明。
实施例1、不同物种中生长素输入载体蛋白编码序列的获得
根据SEQ ID NO:1所示的玉米生长素输入载体蛋白(ZmAUX1 core region)氨基酸序列，在NCBI参考蛋白数据库(Reference proteins)进行序列搜索(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi PROGRAM＝blastp&PAGE_TYPE＝BlastSearch&LINK_LOC＝blasthome)。
SEQ ID NO 1(ZmAUX1 core region)
Whggsaydawfscasnqvaqvlltlpysfaqlgmlsgvlfqlfygllgswtaylisilyleyrtrrerekaadfrnhviqwfevldgllgrhwrnaglafnctfllfgsviqligcasniyyvndrldkrtwtyvfgaccattvfipsfhnyrvwsflglvmttytawymavaslvhgqvegvqhsgptrivlyftgatnilytfgghavtveimhamwrpqkfkaiyllatlyvltltlpsaaasywafgdellthsnalallprtpfrdaavvlmlihqfitfgfactplyfvwekliglhdcrslckraaarlpvvvpiwflaiifpffgpinsavgsllvsftvyiipalahmvtfrspqsrenaverpprfaggwtgayvinsfvvawvlvvgfgfggwasitnfvqqvntfglfakcyqcp。
限定物种分别为玉米(Zea mays)，水稻(Oryza sativa)，拟南芥(Arabidopsisthaliana)，搜索得到与SEQ ID NO:1相同性大于等于75％的生长素输入载体蛋白，如下表1所示，其中编号1-5分别对应SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:3、SEQID NO:6。
SEQ ID NO 2(ZmAUX1)
mhttpvskhrqhaqagkaldhrseglmaaggggggiadekapaaeafgghleaaemteaeeehsgvksrlsgllwhggsaydawfscasnqv
aqvlltlpysfaqlgmlsgvlfqlfygllgswtaylisilyleyrtrrerekaadfrnhviqwfevldgllgrhwrnaglafnctfllfgsviqligcasni
yyvndrldkrtwtyvfgaccattvfipsfhnyrvwsflglvmttytawymavaslvhgqvegvqhsgptrivlyftgatnilytfgghavtveimh
amwrpqkfkaiyllatlyvltltlpsaaasywafgdellthsnalallprtpfrdaavvlmlihqfitfgfactplyfvwekliglhdcrslckraaarlp
vvvpiwflaiifpffgpinsavgsllvsftvyiipalahmvtfrspqsrenaverpprfaggwtgayvinsfvvawvlvvgfgfggwasitnfvqqvntfglfakcyqcpphltaappaafmpppppmaaapsmppaatafnatglffpplpapapapspminfflrhhhrghhgrhgl*
SEQ ID NO 3(ZmATL1)
MAREQLEESIVADGNGKEEEVGVMGIGAADGADDQHGGGKLSMKSLLWHGGSVWDAWFSCA
SNQVAQVLLTLPYSFSQLGMLSGVLLQIFYGFLGSWTAYLISVLYVEYRSRKEKEGVSFKNHVIQ
WFEVLDGLLGPYWKAAGLAFNCTFLLFGSVIQLIACASNIYYINDRLDKRTWTYIFGACCATTV
FIPSFHNYRIWSFLGLGMTTYTAWYLAIAALLNGQAEGVAHSGPTKLVLYFTGATNILYTFGGHA
VTVEIMHAMWKPAKFKYIYLLATLYVFTLTLPSSAAMYWAFGDELLTHSNAFSLLPKTRWRDAA
VILMLIHQFITFGFACTPLYFVWEKVIGMHDAKSIFKRALARLPIVVPIWFLAIIFPFFGPINSAVGA
LLVSFTVYIIPALAHVLTYRTASARMNAAEKPPFFLPSWTGMFVLNMFIVVWVLVVGFGLGGWASMVNFVRQIDTFGLFAKCYQCPKPPVPAAAQSPAPLPHH*
SEQ ID NO 4(ZmAIC-2)
MASEKVETIVAGNYMEMEHEPGGGGDHDQQPSGGAASSTSSSSRGGGKKKALSSLFWHGGSV
YDAWFSCASNQVAQVLLTLPYSFSQLGMASGVVFQLFYGLMGSWTAYLISILYVEYRTRKEREK
VDFRNHVIQWFEVLDGLLGKHWRNVGLFFNCTFLLFGSVIQLIACASNIYYINDKYDKRTWTYI
FGACCATTVFIPSFHNYRIWSFLGLLMTTYTAWYLTIAAIAHGQVEGVTHSGPSKMVLYFTGATN
ILYTFGGHAVTVEIMHAMWKPHKFKLIYLVATLYVLTLTLPSASAVYWAFGDMLLDHSNAFALL
PRSGFRDAAVIFMLIHQFITFGFACTPLYFVWEKLIGVHETGSVALRAAARLPIVAPIWFLAVVFPF
FGPINSTVGSLLVSFTVYIIPALAHMATFLPPAARENAVERPPRGLGGWAGMYAANFFVVAWVLVVGFGFGGWASTVNFVRQVNTFGLFTRCYQCPPRH*
SEQ ID NO 5(ZmAIC-3)
MSSEASSVVVADENGAAETVGVGRYVEMEKDQESSAAKSRLSGLLWHGGSAYDAWFSCASNQ
VAQVLLTLPYSFSQLGMLSGILFQLLYGLMGSWTAYLISVLYVEYRARKEREKADFRNHVIQWF
EVLDGLLGRHWRNVGLAFNCTFLLFGSVIQLIACASNIYYINDKLDKRTWTYIFGACCATTVFIP
SFHNYRIWSFLGLVMTTYTAWYLAVASLIHGQVDGVKHSGPTKMVLYFTGATNILYTFGGHAVT
VEIMHAMWRPQKFKAIYLMATLYVLTLTLPSAASVYWAFGDQLLTRSNALALLPRTAFRDAAV
VLMLAHQFITFGFACTPLYFVWEKLVGLHDCRSLCRRAAARLPVVVPIWFLAIIFPFFGPINSAVG
SLLVSFTVYIIPALAHMITFRSATARENAMEPPPRLLGRWTGAYMINAFVVAWVLVVGFGFGGW
ASMTNFVRQIDTFGLFTKCYQCPPPPPLPFPGGGLGNITMPFNGDGLPPTPAPSPAHYFFRHHRHHSHHRGL*
SEQ ID NO 6(ZmAIC-4)
MATGEQAEDAIVADVVGNGKGEEVRAMGDDAEQQRDGGKVSMKSLLWHGGSVWDAWFSCA
SNQVAQVLLTLPYSFSQLGMLSGVLLQVWYGLMGSWTAYLISVLYVEYRTRKEKEGVSFRNHV
IQWFEVLDGLLGPYWKAAGLAFNCTFLLFGTVIQLIACASNIYYINDRLDKRTWTYIFGACCATT
VFIPSYHNYRVWSFLGLGMTTYTAWYLTIAAAVHGQVPGVTHSGPSKLVPYFTGATNILYTFGG
HAITVEIMHAMWKPRKFKYIYLLATLYVFTLTLPSAAAMYWAFGDQLLTHSNAFSLLPRTPWRD
AAVVLMLVHQFITFGFACTPLYFVWEKAVGMHVTRSVFLRALVRLPIVVPVWFLAIIFPFFGPINS
AVGALLVSFTVYVIPALAHMLTYRSASARLNAAEKPPSFLPSWSGMFVLNAFVVAWMLVVGFGLGGWASVTNFIKQIDTFGLFAKCYQCPTKPHPGSPLPAPPHH*
表1、玉米、水稻、拟南芥的生长素输入载体蛋白序列
实施例2、过表达玉米ZmAUX1基因的构建体的获得
不同来源的生长素输入载体蛋白基因都可用来表达，以筛选本发明穗行数、穗粒重、容重增加的玉米，以下举例过表达玉米生长素输入载体蛋白ZmAUX1(氨基酸序列如SEQID NO:2所示)、ZmATL1(氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示)基因的T-DNA构建体的获得。
1、ZmAUX1的构建体
为了操作方便，将SEQ ID NO:8所示的天然的ZmAUX启动子-ZmAUX mRNA编码序列(含有intron)-ZmAUX天然终止子中的intron去除，具体操作如下：
ZmAUX1基因的mRNA编码序列可根据SEQ ID NO:7的核酸序列人工合成，然后在5’添加ZmAUX1基因的天然启动子(SEQ ID NO:8中1bp至1775bp)，在3’添加ZmAUX1的天然终止子(SEQ ID NO:8中5984bp至6132bp)，得到5’端添加Hind III酶切位点，3’端添加Kpn I位点的ZmAUX1表达盒。
ZmAUX1表达盒和人工合成的在5’端添加Kpn I位点，3’端添加Xho I位点的草甘膦筛选标记表达盒pCMP-g10evo epsps(SEQ ID NO:9)通过三段酶切连接的方式插入到(HindIII,Kpn I)双酶切的pCAMBIA1300载体骨架中，获得的构建体记为AUCC。
类似的，将SEQ ID NO:9中1bp-364bp的pCMP置换成p35S(SEQ ID NO:10)，获得的构建体记为AUCS。
向AUCC的Kpn I位点插入人工合成的植物病毒增强子3xEnhancer(SEQ ID NO:11)，获得的构建体记为AUCE。
SEQ ID NO 7(ZmAUX1 mRNA)
gccacgtacagtacagccccagccccagaggccccgcggcccggcatgaaaagaaaggacgctgggtttctttatgccccagctgctggagtgctg
tctcccccccgggacatcgcctctccatatatacgacacccccgctcccccctgcaatgcacacaacaccagtaagcaagcaccgccagcacgcaca
agcaggcaaagctctcgaccatcgctctgagggattaatggcggcgggaggaggaggcggcggcatcgccgacgagaaggcccctgctgctgag
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SEQ ID NO 8(ZmAUX1genomic)
acgatgggtagggcaatggtgacggttagggttttttcccctaattaaaaacagttttgttgttttttggatttttttggttcttaatttaccgagtgcttttttttgtc
gagtgcgcgaaaaaagtactcgacaaagaaccatttgccgataaataccgagtgtaatactcagcaaaggatttgtcgagtgcaaaaaggtctctgccg
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SEQ ID NO 9 KpnI-pCMP-G10-XhoI
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acaaaggttaggtcggctgcctttaatcaataccaaagtggtccctaccacgatggaaaaactgtgcagtcggtttggctttttctgacgaacaaataaga
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SEQ ID NO 10(p35S)
ctagagcagcttgccaacatggtggagcacgacactctcgtctactccaagaatatcaaagatacagtctcagaagaccaaagggctattgagacttttc
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SEQ ID NO 11(3xEnhancer)
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2、ZmATL1的构建体
类似的，SEQ ID NO:12所示的天然的ZmATL1启动子-Zm ATL1 mRNA编码序列(含有intron)-ZmATL1天然终止子中的intron去除，具体操作如下：ZmATL1基因的mRNA编码序列可根据NM_001370703.1的核酸序列人工合成，然后在5’添加ZmATL1基因的天然启动子(SEQID NO 12的1bp至1492bp)，在3’添加ZmATL1的天然终止子(SEQ ID NO：12的7803bp至8189bp)，得到5’端添加Hind III酶切位点，3’端添加Kpn I位点的ZmATL1表达盒。
ZmATL1表达盒和人工合成的在5’端添加Kpn I位点，3’端添加Xho I位点的草甘膦筛选标记表达盒pCMP-g10evo epsps(SEQ ID NO:9)通过三段酶切连接的方式插入到(HindIII,Kpn I)双酶切的pCAMBIA1300载体骨架中，获得的构建体记为ATC。
类似的，将SEQ ID NO:9中1bp-364bp的pCMP置换成p35S(SEQ ID NO:10)，获得的构建体记为ATS。
向ATC的Kpn I位点插入人工合成的植物病毒增强子3xEnhancer(SEQ ID NO:11)，获得的构建体记为ATE。
SEQ ID NO 12(ATL1 genomic)
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gcgccaccaacatcctctacaccttcggcggccacgccgtcacagtgtaagcaaagccttctctttcccacaaccaactcaacaaattactgactactag
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gttgccctcatgcaaggggcgaaatgatgatgatgataagctttgcgaccatccatggattgggacacattttggtgtttggagctgtaggctgtagccag
ggaaaaaccttgcttggtggagcagtggcgacacacatgcccactttgagagcaaatgcatcctctgagagagagagagagagagagagagagag
agagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagagaggtggtggtgagtgtctctgtccatcttgactcacagtgatcca
gagcttattatgccagttaggctgttactgctctggagactatgcgagtgatgtgacgacgaccatttttagagtactagtgtatactagctagctcttattaa
catgcatcacgaggtcttcctatgctggagctgagttgtgttggcagcagcagcaggtgattagtttattactggtaacggccttgtttggccgcgtttggc
ggaggtgctccatcatttgactggaggctcgtgcatgtgttggcgagattcctcctgccgacgacgagatctttgccctgctgtgccggtgcgtgagtct
gactgggagaaccacttggccgcgccggattttcctttttgccgtacgtcttcacgtatcatttctcgtcaactactaaagcctcgggcctgggcatatagt
gttgcctcgcatgtgcagggccgttttgtccgttaatttgtactagaacatatatatacactgatgatgaacagctttactgaatgcaggtagccgaaagcta
gagaacaagctaacaataataccacgtttgtgttcttggtttgtttggcagcgagatcatgcacgcgatgtggaagcccgccaagttcaaatacatctacc
tgctggcgacgctgtacgtgttcacgctgacgctgccgtcgtcggcggccatgtactgggcgttcggcgacgagctgctgacccactcgaacgccttc
tcgctgctgcccaagacccggtggcgcgacgcggcggtgatcctgatgctgatccaccagttcatcaccttcggcttcgcgtgcacgccgctctacttc
gtgtgggagaaggtgatcgggatgcacgacgccaagagcatcttcaagcgcgcgctggcgaggctgcccatcgtcgtgcccatctggttcctcgcca
tcatcttccccttcttcgggcccatcaactccgccgtcggcgcgctgctcgtcagcttcaccgtctacatcatcccggccctggcgcacgtcctcacctac
cgcacggcgtccgcgcgcatggtacgtatacatatgcatgcgtgcatttgcattgcattgcacccccgtcgtttagcaaacaataacaacggcgtcctgt
ggcctggccggccgtcgcgttgcctaatgcctactggttcgggtacgagtaagtgacccgatccgttcatccccgttgcctagctagagtgcagtagta
ccgccaccagtcgcagcagctgtcacgaacagtggcaggactgcaacacgaaatagacagtggagatccgtgcacacgcagcagccagttcacgtt
agatgcaaagcaccggtcccccacttgggcaaatcccccaatcattgaatggagacaacagccacattcaattcgaagccggccccgcccccgcgg
cgcccgacaacgatatgggacgacggatcggggatcggaacaccgcatcacccccacgtcatcatccgcgtctctgcccgtcgcctcgccgaatgc
cggtgcccatggcagatgtaggcttcactgtgccggttccgacagctggcgggggcggtttcggagcgacttttttgcgagtacggcacggcggcgat
ggcaacgccggcgtgggtcaaggaaccgcttgcctgtgacggaagatctgacgtagcgccgatgcggtgctgacgttgggtgtcgcgctgtgacgg
aagaccctcctggcgaggcgcgacgcgacggtggtcgcgacgtcgcggcactggcgcgcgtctggacgcactcggccggccaatcgcgctccca
ggtcccagggcccggcatcgtgtggcggtgtggctggaacgcgagagatgatggctcctctgtcctccgtagacaacgggatggcgatggagatgt
gagatctcggtgtgcgctggagggttcctttcctcgccctccgttttccccagctttttatttccgaaaggaattcgagcagtgaccctgtgaaaatgcctc
gaaaaggatagggctaggaacaagctaaggcggggcacgccgcgatgcttatcttttattcatgtcagtgcttctggcgatcgatttcattctgacgactg
ctgctctgtgtttccctgcaaaaaaaaaattatttgtttttgcaacagaacgccgcggagaagccgcccttcttcctgccgagctggacggggatgttcgt
cctcaacatgttcatcgtggtgtgggtgctggtggtcggcttcgggctgggcggctgggccagcatggtcaacttcgtgaggcagatcgacacgttcg
ggctgttcgccaagtgctaccagtgcccgaagccgccggtcccggcggccgcgcagtcaccggcgccgctgccgcaccactagggcgcgcaggc
cccgtgacggcatggagctagcgtcgctgcttgcattgcagccggtgttaattgctactaggttttggtcgccttgtaatatacaagcctcctctagggtcg
tagaactcgatcacagcagagtcacgcaaaggcggctcgtgccgtgccgtgccgccgccgcgttgctttcccgcccgccctcctctgcctgatcggtc
cgtcggcattggtgtcgttttgttttcgtttggcttgccaccggtattaaaaagttgagtgatggtcatggcttcttaatccatatgatgatatgacatacgtatc
ctatataggttcattagttatttttccttgttggttcgtggaggtcggtccatgttgtgtagcgtgtgggtgactgtaatggactgcgctggaatgctagctaaa
ggcagaaaacaaaaaaccacagtgcccttttgtttgttattgccctctgctcattagtttctcgctggaatttttattatgggcttcttcgaaaggaccacaaa
gcgatcatccaagttccaagggagagaaggaaagcgagcagcaaaggaagaggcgctggctggctgatggatcgatgctgcggccgcggcgtgg
gtcggcgcggaccataattgcacgcactaccagggcctttctgaggctggattgcaacggaatgggggtcgtaaaagccat。
将含构建体AUCC、AUCS、AUCE、ATC、ATS、ATE的双元载体分别通过电击法导入农杆菌LBA4404，用于后续玉米的转化。
由于ZmAUX1、ZmATL1基因不同，以及表达盒3’下游的调控元件不同，将不同构建体导入玉米预期可获得ZmAUX1、ZmATL1基因在不同组织不同程度过表达的转基因玉米，用以筛选目标性状，即穗行、穗粒重、容重或产量增加的转基因玉米。
实施例3、转基因株系的转化
采用农杆菌介导进行玉米遗传转化，具体是根据Frame等(Plant Physiol,2002,129:13-22)报道的方法和培养基配方进行转化，使用草甘膦为筛选试剂，转化步骤如下：种植玉米自交系沈3336，取授粉后8～10天的玉米穗，收集大小为1.0-1.5mm未成熟胚。将含有转化载体的农杆菌混匀在侵染培养基中，调整菌液浓度OD660为0.5-0.6。将收集的未成熟胚放入含有农杆菌的侵染液中，室温静置5min，将胚倒在共培养基中，吸干液体，将胚平面朝下放置在共培养基上，22℃培养3-5天。将培养后的未成熟胚转移到含有终浓度200mg/L特美汀抗生素(葛兰素史克，美国)的愈伤组织诱导培养基上，28℃暗培养10-14天杀灭农杆菌。诱导培养后的所有愈伤组织转到含有终浓度2mM草甘膦的筛选培养基上，28℃暗培养2-3周。诱导培养后将所有的愈伤组织转到新鲜的含有2mM草甘膦的筛选培养基上，28℃暗培养2-3周。将成活的胚性组织转到再生培养基上，28℃暗培养10-14天后转移到新鲜的再生培养基上，26℃光照培养10-14天。挑取发育完全的植株到生根培养基上，26℃光照培养直到根发育完全，将生根后的再生苗移植到温室中生长繁种。本实施例一共产140，120，55，72，59，61个独立转基因单株，通过taqman探针定量PCR筛选T-DNA单拷贝插入的植株，T0代植株自交收种，并记录穗行数，结果见表2。
表2.不同构建体的转化体穗行变化情况
实施例4、转基因株系的农艺性状测定和选择
选择实施例3中每个构建体穗行增加的转化体各2个。转基因玉米和对照玉米(玉米自交系沈3336)按照随机区组设计，设置3个重复，试验种植行距为0.5米，密度为4500株/亩，对各个处理的穗行数、穗粒重、容重进行测定。结果如表3。结果表明这些转化体的穗行数、穗粒重以及容重相对于非转基因对照玉米都显著的增加了。
表3.过表达生长素输入载体蛋白质不同转化体关键性状筛选分析
实施例5、转基因株系的杂交种产量测定
选实施例3中每个构建体穗行增加的转化体各2个作为父本，与常规母本玉米自交系D5433配制杂交种(转基因沈3336xD5433)。以玉米自交系沈3336为父本，与常规母本玉米自交系D5433配制杂交种(沈3336xD5433)作为对照。植转基因玉米杂交种和对照玉米杂交种(沈3336xD5433)按照随机区组设计，设置3个重复，每个试验种植行距为0.5米，密度为4500株/亩，对各个处理的产量进行测定。结果如表4。结果表明这些过表达玉米生长素输入载体蛋白，穗行、穗粒、粒重增加的玉米，产量也增加了。
表4.过表达生长素输入载体蛋白转基因玉米的产量测定结果
实施例6、通过先导序列编辑获得产量增加的玉米
通过先导序列编辑的方法如Zong,Y.,Liu,Y.,Xue,C.et al.An engineeredprime editor with enhanced editing efficiency in plants.Nat Biotechnol 40,1394–1402(2022).，以及Wang,J.,He,Z.,Wang,G.et al.Efficient targeted insertionof large DNA fragments without DNA donors.Nat Methods 19,331–340(2022).，可以将外源的增强子插入到基因组，从而增强插入位点附近基因的表达。
作为本发明的一个实施例，本发明设计了三对PEgRNA(表5)，利用SEQ ID NO:14、SEQ IDNO:15所示PEgRNA将FMV enhancer(SEQ ID NO:13)插入到ZmAUX1基因的启动子区域距离翻译起始位点-860bp至-616bp之间(对应SEQ ID NO:8中1068bp至1311bp)，获得构建体TEGE-1。
利用SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17所示PEgRNA将FMV enhancer(SEQ ID NO:13)插入到ZmAUX1基因的启动子区域距离翻译起始位点-1207bp至-999bp(对应SEQ ID NO:8中721bp至928bp)之间，获得构建体TEGE-2。
利用SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19所示PEgRNA将FMV enhancer(SEQ ID NO:13)插入到ZmAUX1基因的启动子区域距离翻译起始位点-1597bp至-1411bp(对应SEQ ID NO:8中331bp至516bp)之间，获得构建体TEGE-2。
将上述各个构建体转化玉米，获得启动子区域插入了FMV enhancer，从而ZmAUX1表达水平上调的基因编辑玉米。获得的基因编辑玉米表现为与对照玉米相比穗行数、穗粒重、容重增加，产量提高。
表5.向启动子区域插入enhancer增强ZmAUX1基因表达的pegRNAs
SEQ ID NO 13(FMV enhancer)
catcgagcagctggcttgtggggaccagacaaaaaaggaatggtgcagaattgttaggcgcacctaccaaaagcatctttgcctttattgcaaa gataaagcagattcctctagtacaagtggggaacaaaataacgtggaaaagagctgtcctgacagcccactcactaatgcgtatgacgaacgcagtga cgaccacaaaa。
SEQ ID NO 14(AUXTET1)
gcagaattttaggctggcgcGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCacttgtactagaggaatctgctttatctttgcaataaaggcaaagatgcttttggtaggtgcgcctaacaattctgcaccattccttttttgtctggtccccacaagccagctgctcgatgccagcctaaaTCATCTCTCGCGGTTCTATCTAGTTACGCGTTAAACCAACTAGAATTTTTT。
SEQ ID NO 15(AUXTET2)
tggatgcgtgttccatggctGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCttgcctttattgcaaagataaagcagattcctctagtacaagtggggaacaaaataacgtggaaaagagctgtcctgacagcccactcactaatgcgtatgacgaacgcagtgacgaccacaaaacatggaacacTCATCTCTCGCGGTTCTATCTAGTTACGCGTTAAACCAACTAGAATTTTTT。
SEQ ID NO 16(AUXTET3)
taccttccgtaactattttcGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCacttgtactagaggaatctgctttatctttgcaataaaggcaaagatgcttttggtaggtgcgcctaacaattctgcaccattccttttttgtctggtccccacaagccagctgctcgatgaatagttacggaTCATCTCTCGCGGTTCTATCTAGTTACGCGTTAAACCAACTAGAATTTTTT。
SEQ ID NO 17(AUXTET4)
gtatcctagtgtgacttaatGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCttgcctttattgcaaagataaagcagattcctctagtacaagtggggaacaaaataacgtggaaaagagctgtcctgacagcccactcactaatgcgtatgacgaacgcagtgacgaccacaaaaaagtcacactagTCATCTCTCGCGGTTCTATCTAGTTACGCGTTAAACCAACTAGAATTTTTT。
SEQ ID NO 18(AUXTET5)
atgacgacaaattctaactaGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCacttgtactagaggaatctgctttatctttgcaataaaggcaaagatgcttttggtaggtgcgcctaacaattctgcaccattccttttttgtctggtccccacaagccagctgctcgatgttagaatttgtcgTCATCTCTCGCGGTTCTATCTAGTTACGCGTTAAACCAACTAGAATTTTTT。
SEQ ID NO 19(AUXTET6)
tatatgttatggctacaagaGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCttgcctttattgcaaagataaagcagattcctctagtacaagtggggaacaaaataacgtggaaaagagctgtcctgacagcccactcactaatgcgtatgacgaacgcagtgacgaccacaaaatgtagccataacTCATCTCTCGCGGTTCTATCTAGTTACGCGTTAAACCAACTAGAATTTTTT。
实施例7、通过启动子基因编辑获得产量增加的玉米。
通常启动子区域的核苷酸序列的变化可以导致启动子的增强或者减弱。通过基因编辑的方法改变启动子的核苷酸序列，在启动子区域设计多个gRNAs，gRNA两两相互组合，同Cas9基因一起导入到细胞内，获得启动子发生突变的植株(主要类型为删除突变)，具体操作如下：
在ZmAUX1基因组的启动子区域设计了7个sgRNAs，这些sgRNAs两两相互组合，预期可以获得多个类型ZmAUX1启动子突变的基因编辑玉米。通过对穗行数、穗粒重、容重进行考察，筛选穗行数增加，和/或穗粒重增加，和/或容重增加，和/或产量增加的基因编辑玉米。
表6.ZmAUX1基因启动子区域编辑sgRNAs
Claims (10)
1.一种提高玉米产量的方法，其特征在于，所述方法是在玉米中过表达生长素输入载体蛋白，获得穗行数、穗粒重、或容重显著增加的转化株，提高玉米产量。
2.如权利要求1所述提高玉米产量的方法，其特征在于，所述的生长素输入载体蛋白氨基酸序列为SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6中的一种。
3.如权利要求1所述提高玉米产量的方法，其特征在于，所述过表达生长素输入载体蛋白是将生长素输入载体蛋白过表达盒转入玉米基因组中，所述生长素输入载体蛋白过表达盒是在生长素输入载体蛋白质编码基因的5’端与一个启动子功能性地连接，3’端与一个终止子功能性地连接而构成。
4.如权利要求3所述提高玉米产量的方法，其特征在于，所述生长素输入载体蛋白过表达盒包括ZmAUX1表达盒，或ZmATL1表达盒。
5.如权利要求4所述提高玉米产量的方法，其特征在于，所述ZmAUX1表达盒中ZmAUX1基因的mRNA编码序列根据SEQ ID NO:7的核酸序列人工合成，然后在5’添加SEQ ID NO:8中1bp至1775bp所示ZmAUX1基因的天然启动子，在3’添加SEQ ID NO:8中5984bp至6132bp所示ZmAUX1的天然终止子，得到5’端添加Hind III酶切位点，3’端添加Kpn I位点的ZmAUX1表达盒；所述ZmATL1表达盒中ZmATL1基因的mRNA编码序列根据NM_001370703.1的核酸序列人工合成，然后在5’添加SEQ ID NO 12的1bp至1492bp所示ZmATL1基因的天然启动子，在3’添加SEQ ID NO：12的7803bp至8189bp所示ZmATL1的天然终止子，得到5’端添加Hind III酶切位点，3’端添加Kpn I位点的ZmATL1表达盒。
6.如权利要求3所述提高玉米产量的方法，其特征在于，所述方法是将长素输入载体蛋白过表达盒与选择性标记基因表达框共同转入玉米基因组，所述选择性标记基因表达框包括草甘膦筛选标记表达盒pCMP-g10evo epsps。
7.如权利要求6所述提高玉米产量的方法，其特征在于，草甘膦筛选标记表达盒pCMP-g10evo epsps核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示。
8.如权利要求6所述提高玉米产量的方法，其特征在于，所述方法是将生长素输入载体蛋白过表达盒与在5’端添加Kpn I位点，3’端添加Xho I位点的草甘膦筛选标记表达盒pCMP-g10evo epsps通过三段酶切连接的方式插入到Hind III、Kpn I双酶切的pCAMBIA1300载体骨架中，获得的构建体通过电击法导入农杆菌LBA4404，再转化玉米，筛选获得产量提高的玉米。
9.如权利要求8所述提高玉米产量的方法，其特征在于，所述构建体将生长素输入载体蛋白编码基因下游的启动子替换为启动子p35S或者在Kpn I位点插入植物病毒增强子3xEnhancer，所述启动子p35S核苷酸序列SEQ ID NO:10；所述植物病毒增强子3xEnhancer核苷酸序列为SEQ ID NO:11。
10.如权利要求1所述提高玉米产量的方法，其特征在于，所述方法在在玉米基因组的生长素输入载体蛋白基因座处引入遗传修饰，提高玉米产量；所述基因组基因座编码SEQID NO：2-SEQ ID NO：6的氨基酸序列；所述遗传修饰包括将外源的增强子插入到基因组基因座启动子区域，或通过基因编辑的方法改变基因座启动子的核苷酸序列。
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