CN102250844A - 与类胡萝卜素合成相关的蛋白及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了与类胡萝卜素合成相关的蛋白及其编码基因与应用。本发明所提供的与类胡萝卜素合成相关的蛋白，是如下(a)或(b)的蛋白质：(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列表中序列1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与类胡萝卜素合成相关的由(a)衍生的蛋白质。本发明所提供的IbLytB基因所编码的酶位于类胡萝卜素生物合成途径的上游。该基因的表达也影响类胡萝卜素的生物合成。本发明所提供的IbLytB蛋白及其编码基因在提高甘薯类胡萝卜素含量及甘薯品质的研究中具有重要的应用价值。本发明将在农业领域具有广阔的应用空间和市场前景。

Description

与类胡萝卜素合成相关的蛋白及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域中与类胡萝卜素合成相关的蛋白及其编码基因与应用。

背景技术

自然界中，类胡萝卜素广泛存在于植物、真菌、藻类、细菌体内，呈现由黄到红的颜色变化，动物无法自身合成，需要直接或间接地从植物、真菌、细菌等中摄取。类胡萝卜素是动物和人类必需的微量营养物质，可合成视黄素、清除自由基，预防癌症、心血管及老年性疾病等。类胡萝卜素的缺乏，会严重影响人类的健康，夜盲症即缺乏V_A所致。夜盲症初期通过摄入适量的β-胡萝卜素即可痊愈。面对全球特别是非洲部分国家V_A缺乏的现状，有人提出通过服用V_A解决，但从长远看，服用V_A操作难度较大、加之V_A摄入过多会引起中毒，因此从日常饮食中摄取V_A的前体β-胡萝卜素是一条经济安全的途径。但在人类主食中，通常缺乏这些微量营养物质，因此深入研究其合成机制，并从基因水平上操纵其生物合成，将有效地提高作物、果蔬等的类胡萝卜素等微量营养物质的含量。

类胡萝卜素的生物合成是由一系列核基因编码的酶催化反应完成的。类胡萝卜素生物合成的第一步反应是由八氢番茄红素合成酶(Phytoene synthase，PSY)催化两分子牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸(Geranylgeranyl pyrophosphate，GGPP)缩合成八氢番茄红素，经过4步脱氢反应，八氢番茄红素可生成番茄红素。前两步反应由八氢番茄红素脱氢酶(Phytoene desaturase，PDS)催化、后两步反应由ζ-胡萝卜素脱氢酶(ζ-carotene desaturase，ZDS)催化。自番茄红素以下反应分成两条支路，一条是经连续两次环化反应生成β-胡萝卜素，由番茄红素β-环化酶(Lycopene β-cyclase，LCY-B)催化完成；另一条是生成α-胡萝卜素，由LCY-B和番茄红素ε-环化酶(Lycopeneε-cyclase，LCY-E)催化完成。类胡萝卜素生物合成途径上游是脱氧木酮糖磷酸盐(1-deoxy-d-xylulose 5-phosphate，DXP)途径，该途径相关酶基因表达的差异也会影响下游类胡萝卜素的生物合成。LytB基因所编码的酶位于DXP途径的后端，可催化羟甲基丁烯二磷酸((E)-4-hydroxy-3-methylbut-2-enyl diphosphate，HMBPP)生成异戊二烯焦磷酸(isopentenyl diphosphate，IPP)和二甲基丙烯基焦磷酸(dimethylallyldiphosphate，DMADP)，同时也影响类胡萝卜素的生物合成。类胡萝卜素尤以β-胡萝卜素是维生素A的前体，具有免疫和抗氧化功能，其药用潜力引起人们的极大关注。

发明内容

本发明的一个目的是提供与类胡萝卜素合成相关的蛋白及其编码基因。

本发明所提供的与类胡萝卜素合成相关的蛋白，名称为IbLytB，来源于甘薯(Ipomoea batatas)，是如下(a)或(b)的蛋白质：

(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)将序列表中序列1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与类胡萝卜素合成相关的由(a)衍生的蛋白质。

所述与类胡萝卜素合成相关蛋白的编码基因也属于本发明的保护范围。

所述与类胡萝卜素合成相关蛋白的编码基因为如下1)-4)中任一所述的基因：

1)序列表中序列2自5′末端起第63位-第1440位或第30位-第1461位碱基核苷酸所示的DNA分子；

2)序列表中序列2所示的DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)所示的DNA分子杂交且编码所述蛋白的基因；

4)与1)或2)或3)的基因具有90％以上的同源性且编码所述蛋白的基因。

上述严格条件可为用6×SSC，0.5％SDS的溶液，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

序列表中的序列2由1668个碱基组成，其开放阅读框架(ORF)为自5′末端第63位-第1440位碱基，编码氨基酸序列是序列表中序列1所示的蛋白。

含有所述与类胡萝卜素合成相关蛋白的编码基因的表达盒、重组表达载体、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。

所述重组表达载体是在载体pCBGUS的多克隆位点间插入所述编码基因得到的重组表达载体；

所述载体pCBGUS是通过包括如下步骤的方法得到的：

(1)将pCAMBIA1301载体经过HindIII和EcoRI双酶切，回收载体大片段；

(2)将pBI121载体经过HindIII和EcoRI双酶切，回收包含gusA基因的片段；

(3)将步骤(1)中回收的载体大片段与步骤(2)中回收的包含gusA基因的片段连接，得到重组载体pCBGUS。

所述pCAMBIA1301载体购自CAMBIA公司；所述pBI121载体购自Clontech公司。

扩增所述与类胡萝卜素合成相关蛋白的编码基因全长或其任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。

所述引物对为如下1)或2)所示：

1)由序列表中序列3所示的DNA片段和序列表中序列4所示的DNA片段组成的引物对；

2)由序列表中序列5所示的DNA片段和序列表中序列6所示的DNA片段组成的引物对。

本发明的另一个目的是提供一种培育转基因植物的方法。

本发明所提供的培育转基因植物的方法，是将所述与类胡萝卜素合成相关蛋白的编码基因导入目的植物中，得到类胡萝卜素含量高于所述目的植物的转基因植物。

所述与类胡萝卜素合成相关蛋白的编码基因是通过所述重组表达载体导入目的植物中。

所述类胡萝卜素为β-胡萝卜素、玉米黄素、叶黄素、β-隐黄质和α-胡萝卜素中的至少一种。

所述目的植物为双子叶植物或单子叶植物；所述双子叶植物为甘薯(Ipomoeabatatas)。

本发明所提供的IbLytB基因所编码的酶位于类胡萝卜素生物合成途径的上游。该基因的表达也影响类胡萝卜素的生物合成。本发明所提供的IbLytB蛋白及其编码基因在提高甘薯类胡萝卜素含量及甘薯品质的研究中具有重要的应用价值。本发明将在农业领域具有广阔的应用空间和市场前景。

附图说明

图1为重组载体命名为pCBLytB构建过程示意图。

图2为转IbLytB基因甘薯植株的PCR检测结果图。

图3为混合标样中β-胡萝卜素(β-carotene)、玉米黄素(zeaxanthin)、叶黄素(lutein)、β-隐黄质(β-cryptoxanthin)和α-胡萝卜素(α-carotene)的标准曲线图。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、与类胡萝卜素合成相关的蛋白及其编码基因的获得及功能验证

一、与类胡萝卜素合成相关的蛋白及其编码基因的获得

(一)甘薯(Ipomoea batatas)IbLytB蛋白cDNA的克隆

实验材料：

将农大辐14(高系14号的高类胡萝卜素含量突变体)(公众可从中国农业大学获得，记载过农大辐14的非专利文献是：Wang YP，Wang F，Zhai H，Liu QC.Production ofa useful mutant by chronic irradiation in sweetpotato.Scientia Horticulturae 111，2007：173-178)在大田种植约90天，块根膨大前期收获直径3～4cm的块根，液氮速冻，-80℃保存。

1、块根总RNA提取和纯化

取农大辐14膨大块根约2g，在液氮中研磨成粉状，加入10mL离心管，用Applygen植物RNA提取试剂盒(Applygen Technologies Inc，Beijing)提取甘薯块根总RNA，试剂盒中包括：Plant RNA Reagent，植物组织裂解、分离RNA、去除植物多糖和多酚；Extraction Reagent，有机抽提去除蛋白质、DNA、多糖和多酚；Plant RNAAid，去除植物多糖多酚和次生代谢产物。利用QIAGEN Oligotex Mini mRNA Kit(QIAGEN，GmbH，Germany)从总RNA中纯化mRNA。最后，取1μL于1.2％琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，另取2μL稀释至500μL，用紫外分光光度计检测其质量(OD₂₆₀)和纯度(OD₂₆₀/OD₂₈₀)，提取的农大辐14的块根总RNA，经非变性胶琼脂糖凝胶电泳检测，28S和18S条带清晰，且二者亮度比值为1.5～2∶1，表明总RNA没有降解，纯化所得mRNA符合实验要求，可用于甘薯IbLytB蛋白cDNA全长的克隆。

2、IbLytB蛋白cDNA的全长克隆

(1)构建农大辐14全长cDNA文库

以农大辐14膨大前期块根mRNA为模板，利用Clontech SMART cDNA LibraryConstruction Kit进行第一链cDNA合成，然后采用引物延伸法合成双链cDNA。将双链cDNA进行酶切，酶切产物大于0.3kb的片段回收纯化，回收片段与λTriplEx2载体16℃连接过夜并进行噬菌体病毒蛋白外壳包装，构建农大辐14全长cDNA文库。

(2)3′-RACE

以农大辐14块根全长cDNA文库噬菌体为模板，用IbLytB EST正向引物1及λcDNA文库测序引物2作为反向引物进行PCR反应。引物序列如下：

引物1：5′-CCCGTGGGTTTCTAAGGTTTG-3′，

引物2：5′-TAATACGACTCACTATAGGG-3′。

PCR得到的3′RACE片段，回收后连接pGEM T-Easy载体进行TA克隆，以SP6/T7通用引物进行测序。

(3)5′-RACE

以农大辐14块根全长cDNA文库噬菌体为模板，用λcDNA文库测序引物3作为正向引物，用IbLytB EST反向引物4进行PCR反应。引物序列如下：

引物3：5′-TCCGAGATCTGGACGAGC-3′，

引物4：5′-TGCCTCCGCAATGTTCTTCAC-3′。

PCR得到的5′RACE片段，回收后连接pGEM T-Easy载体进行TA克隆，以SP6/T7通用引物进行测序。

(4)PCR扩增IbLytB蛋白cDNA的编码区

利用DNAMAN 6.0软件拼接候选的甘薯IbLytB蛋白cDNA序列。进一步设计正向引物5和反向引物6进行PCR扩增IbLytB蛋白cDNA的编码区。引物序列如下：

引物5：5′-GAATCAGCTAACGTGC-3′，

引物6：5′-TCTGAGACTGTGACTTAGCC-3′。

以农大辐14块根总RNA经Oligo(dT)反转录为模板，用高保真的KOD酶，进行PCR扩增，PCR条件为94℃5min，随后60℃30min和72℃2min30s进行34个循环，最后72℃延伸5min。琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，获得1377bp长度的扩增片段。

综合上述4个步骤的结果，获得了目的cDNA序列，其核苷酸序列如序列表中序列2所示。序列表中序列2由1668个碱基组成，自5′端第63位-第1440位碱基为其开放阅读框，编码具有序列表中序列1所示的氨基酸残基序列的蛋白质。序列表中序列1由459个氨基酸残基组成。将该基因命名为IbLytB，将其编码的蛋白命名为IbLytB。

二、甘薯IbLytB蛋白cDNA的功能分析

1、植物表达载体的构建

根据甘薯IbLytB蛋白cDNA的编码序列，设计扩增出完整编码序列的引物序列，正反向引物分别引入BamH I和Sac I酶切位点，引物序列如下：

引物7：5′GGGATCCGAATCAGCTAACGTG-3′(序列表中序列3)(下划线部分为BamH I酶切位点)，

引物8：5′-TCGAGCTCTCTGAGACTGTGACTTAG-3′(序列表中序列4)(下划线部分为Sac I酶切位点)。

以人工合成的序列表中序列2为模板，PCR扩增后，将产物连接到pGEM-TEasy载体(购自北京泽平科技有限责任公司，产品目录号为A1360)上，命名为pGLytB载体，进行T7/sp6的测序，保证甘薯IbLytB蛋白cDNA的阅读框及酶切位点的正确。

用Sac I和BamH I酶切载体pCBGUS，回收载体大片段，同时，用Sac I和BamHI酶切载体pGLytB，回收约1.5kb中间片段，将回收的载体大片段与约1.5kb中间片段连接，得到目的质粒。将目的质粒转化大肠杆菌DH5a(购自北京全式金生物技术有限公司，产品目录号为CD201-01)，37℃培养20h，进行重组载体的PCR分析和酶切鉴定，并进行测序验证。测序结果表明，在载体pCBGUS的BamH I和Sac I酶切位点间插入了序列表中序列2自5′端第30位-第1461位所示的序列，说明重组载体构建正确，将重组载体命名为pCBLytB(该重组载体构建过程如图1所示)。

所述pCBGUS载体是通过包括如下步骤的方法得到的：

(1)将pCAMBIA1301载体(购自CAMBIA公司)经过Hind III和EcoR I双酶切，回收11786bp的载体大片段；

(2)将pBI121载体(购自Clontech公司)(含35S启动子，gusA报告基因，nos终止子片段)也经过Hind III和EcoR I双酶切，回收包含gusA基因的3032bp的片段；

(3)将步骤(1)中回收的载体大片段与步骤(2)中回收的包含gusA基因的片段经T4DNA酶连接，得到重组载体pCBGUS。

2、植物表达载体转化农杆菌

(1)从-80℃低温冰箱中取出200μL EHA105感受态细胞(购自北京拜尔迪生物技术有限公司)，置冰上融化，加入1μg上述步骤1得到的植物表达载体pCBLytB，混匀。

(2)液氮冷冻1min，37℃温育5min。

(3)加入800μL LB液体培养基，28℃培养2-6h。

(4)取100μL菌液至LB固体培养基上(含100μg/mL利福平(Rif)、25μg/mL卡那霉素(Kan))，涂布均匀，将培养皿封口。倒置培养皿28℃培养2d。

(5)取PCR鉴定呈阳性的单菌落，接种到含有100μg/mL Rif、25μg/mL Kan的LB液体培养基中，28℃培养30h至对数生长期，取适量农杆菌用液体MS培养基稀释30倍备用，即得到导入pCBLytB载体的农杆菌菌液。

同时，用上述方法得到转空载体pCBGUS对照的农杆菌菌液。

3、甘薯的遗传转化及再生

用农杆菌介导的方法将IbLytB cDNA的编码序列导入到甘薯品种徐薯18中。具体方法如下：

(1)选取经过悬浮培养约3d，直径0.7-1.3mm的甘薯品种徐薯18(公众可从中国农业大学获得，记载过该材料的非专利文献是：Guo JM，Liu QC，Zhai H，Wang YP.Regeneration of plants from Ipomoea cairica L.protoplasts and production of somatic hybrids between I.cairica L.and sweetpotato，I.batatas(L.)Lam.Plant Cell TissOrgan Cult，2006(87)：321-327)胚性细胞团，悬浮于上述步骤2制备好的农杆菌菌液中，5min后将菌液吸出，并用含有30mg/l AS(乙酰丁香酮)、2.0mg/l 2，4-D的MS液体培养基洗涤2次。将侵染过的胚性细胞团接种培养在固体培养基(30mg/l AS、2.0mg/l 2，4-D的MS)上。28℃、黑暗，共培养3d。

甘薯品种徐薯18胚性细胞团的制备方法如下：

剥取长约0.5mm的甘薯品种徐薯18的茎尖组织(带1-2片叶原基)，将其在胚性愈伤组织诱导培养基(添加2.0mg/L 2，4-D、3.0％蔗糖和0.8％琼脂的MS培养基(pH5.8))上培养，在温度为27℃、黑暗条件下培养8周后，将诱导得到的胚性愈伤组织转入液体培养基，该液体培养基除不加琼脂外，其余成分与上述胚性愈伤组织诱导培养基相同。将三角瓶放在水平摇床上以100r/min进行振荡培养，培养条件为：27℃，每天13h、500lx光照，悬浮培养每10天继代1次。

(2)将共培养3d后的胚性细胞团用含有500mg/l Carb和2.0mg/l 2，4-D的MS液体培养基洗涤2次后，将胚性细胞团转至含有2.0mg/l 2，4-D、100mg/l Carb和5-20mg/l Hyg的固体MS培养基上进行选择培养，培养条件为27±1℃、黑暗，每2周继代培养1次。经过10-12周选择培养，将其转移至含有1.0mg/l ABA和100mg/l Carb的MS固体培养基上进行体细胞胚诱导，培养条件为27±1℃、每日13h、3000lx的光照。2-4周后，将抗性愈伤组织转移至MS基本培养基上，培养条件为27±1℃、每日13h、3000lx的光照，4-8周后，形成完整的再生植株，即分别得到转化pCBLytB的甘薯拟转基因植株和转空载体对照甘薯植株。设未转化的甘薯品种徐薯18为野生型对照甘薯植株。

(3)用CTAB法提取拟转基因植株和对照植株的基因组DNA。用常规方法进行PCR检测，所使用的IbLytB基因引物为：primer 1：5′-CGCACAATCCCACTATCC-3′和primer2：5′-GTTTACGCGTTGCTTCCG-3′。在0.2ml Eppendorf离心管中加入10×PCR buffer 2μl、4dNTP(10mol/L)1μl、引物(10μmol/l)均为1μl、模板DNA(50ng/ul)2μl、Taq DNA聚合酶1ul，加H₂O至总体积20μl。反应程序为94℃变性4min，60℃复性1min，72℃延伸2min，共36个循环。电泳检测扩增结果见图2(图2中，泳道M为Maker，泳道W为野生型对照甘薯植株；泳道P为阳性对照(重组质粒pCBLytB)；泳道C为转空载体对照甘薯植株；泳道1-泳道13为转化pCBLytB的甘薯拟转基因植株)，从图中可见，转化pCBLytB的甘薯拟转基因植株和阳性对照扩增出455bp的目标条带，表明IbLytB基因已经整合到徐薯18的基因组中，并证明这些再生植株为转基因植株；对照植株没有扩增出455bp的目标条带。将经鉴定为转基因甘薯植株扩繁，并进行隔离大田种植，收获转基因甘薯薯块进行胡萝卜素含量的测定。

4、高效液相色谱法测定转基因甘薯块根中的类胡萝卜素含量

(1)标样的准备

①β-胡萝卜素(β-carotene)、玉米黄素(zeaxanthin)和叶黄素(lutein)标样购自sigma公司，商品号分别为C4582-10MG、14681-1、95507)；β-隐黄质(β-cryptoxanthin)标样购自北京华美互利生化公司，商品号为0317S。

②α-胡萝卜素(α-carotene)标样：由于α-carotene标样极易降解，没有进行商业化标样，必须自行提取。具体方法如下：

1)将胡萝卜丁放入食物料理机中打碎。

2)将打碎的胡萝卜浆状物导入盛有5g硅藻土的大研钵中，混匀。

3)加入适量的预冷丙酮用力研磨，将胡萝卜中的胡萝卜素萃取到丙酮中。

4)将研磨液倒入磨砂漏斗中进行抽真空，黄色液体会被抽到三角瓶中，磨砂漏斗中的干燥物质用勺取出，再放入到大研钵中，加适量预冷丙酮再次用力研磨。重复5-6次，直到研磨液的颜色变为无色。

5)将三角瓶中的金黄色液体(胡萝卜素萃取液)分若干次倒入分液漏斗中，每倒入一次胡萝卜素萃取液后，均倒入300ml的dd H₂O，静置稍许，将下层透明液层排出到废液瓶中。

6)胡萝卜素萃取液经过若干次dd H₂O洗涤后，最后一次用饱和食盐水洗涤，以彻底除去所形成的乳状物层，同样排出下层的透明废液。

7)用吸水纸擦干分液漏斗的出水孔。将金黄色的石油醚层(高纯度胡萝卜素萃取液)排出倒入一个干燥的锥形瓶中；加入适量无水硫酸钠(Na₂SO₄)干燥(至无水NaSO₄结晶呈分散状态)，摇晃，吸取萃取液中的残留水分。

8)将处理后的金黄色液体倒入一干燥的球形瓶中，再加入100ml 10％KOH的甲醇溶液皂化和0.1％二丁基羟基甲苯。

9)将球形瓶接入旋转蒸发仪，旋转蒸发仪的另一接口接真空泵，真空蒸干液相石油醚，将有机相浓缩至大约5ml，之后用胶头滴管吸取石油醚(＜5ml)以洗净球形瓶壁上的橙色固态物质，胶头滴管反复吹打橙色液相，使固态物质充分溶解，以获得更高纯度的胡萝卜素萃取液，工作时间约50分钟。

10)柱填料硅藻土和氧化镁(1∶1)于110℃活化4个小时，在干燥器里冷却、干燥。准备一个铁架台，将玻璃层析柱放置在铁架台上并固定。在玻璃层析柱下方接好一个带口三角瓶，三角瓶通过皮管连接真空泵。

11)填柱：将高温激活的硅藻土氧化镁混合物小心倒入玻璃层析柱内，不时用柱塞棒小心压实，填柱约20cm左右，确保柱面水平；再在柱面上方加入细化无水硫酸钠层1cm，之后塞入一层1.5cm左右的脱脂棉层，保证硫酸钠层和脱脂棉层的相平。再次压实后，打开真空泵，抽真空1小时。

12)石油醚过柱：抽真空1小时后，不要关闭真空泵，沿柱壁加入石油醚润柱，调整真空泵，使流速为每秒2-3滴，并用柱塞棒保持固态面的水平，最终使石油醚润洗整个层析柱。

13)用滴管将浓缩后的提取物小心转入层析柱中，至样品层进入到接近无水Na₂SO₄层时，再把冲洗圆底烧瓶的石油醚相转入层析柱中，过柱过程中要保证石油醚相始终高于无水Na₂SO₄层。

14)层析工作过程中，一定要保证固相上方的石油醚液相的存在，石油醚一旦不足必须立即补充(层析柱需要避光，可以使用锡箔纸包裹)。

15)α-胡萝卜素是第一个流出层析柱的物质，所以当分层的α-胡萝卜素层即将流出层析柱时，暂时关闭真空泵，更换新的带口三角瓶，以盛接α-胡萝卜素，连接好后，打开真空泵，金黄色的α-胡萝卜素会流出进入到三角瓶内(三角瓶同样需要避光)。

16)将获得的金黄色液体倒入玻璃螺口离心管中保存，详细注明标样提取时间，parafilm严格密封，锡箔纸避光，-80℃冰箱直立保存。

17)取出少量用N₂气吹干(剩余的大量提取物密封、避光保存于-70℃，备用)，用1ml V乙腈∶V甲醇∶V二氯甲烷＝45∶20∶35的溶剂溶解。

18)用1ml一次性注射器使溶质完全溶解后，通过0.22μl的过滤器转移至2ml棕色进样小瓶中，50μl进样检测提取样品的纯度。

(2)混合标准样品的制备及标准曲线的绘制

将提取并检测的α-胡萝卜素(α-carotene)直接用于混合标样的制备；叶黄素(Lutein)标样用无水乙醇和乙醚溶解；玉米黄素(Zeaxanthin)用丙酮溶解；β-隐黄质(β-cryptoxanthin)标样用乙醚和石油醚溶解；β-胡萝卜素(β-catotene)标样则用石油醚进行溶解。将标准样品溶解后各取100μl至小容量瓶(5ml)定容，用紫外-可见光分光光度计在各成分特定波长下测定其吸光值。根据公式(1)计算浓度，公式(2)校对公式(1)计算所得浓度，用公式(3)配置成50ml混合标样。混合标样需经氮气浓缩后，用石油醚定容。分别取1ml、2ml、3ml和5ml混合标样并分别重复3次共45ml建立标准曲线，标样测定值满足表1所列各成分所在的浓度范围内即可进行标准曲线的绘制。混合标样中β-胡萝卜素(β-carotene)、玉米黄素(zeaxanthin)、叶黄素(lutein)、β-隐黄质(β-cryptoxanthin)和α-胡萝卜素(α-carotene)的标准曲线如图3所示，图3中A为β-胡萝卜素的标准曲线，其标准曲线方程为y＝294.92x-35.199；图3中B为玉米黄素的标准曲线，其标准曲线方程为y＝339.83x-126.76；图3中C为叶黄素的标准曲线，其标准曲线方程为y＝479.56x-72.214；图3中D为β-隐黄质的标准曲线，其标准曲线方程为y＝425.88x-40.863；图3中E为α-胡萝卜素的标准曲线，其标准曲线方程为y＝350.5lx-4.7455。

式中OD为吸光值；

为吸光系数；

校对浓度(μg/ml)＝浓度c×纯度(％)            (2)

纯度(％)＝标样HPLC 峰面积/HPLC 峰总面积×100；

a＝(50×b)/c                                 (3)

式中50为混合标样总体积50ml；a为加入标样量(μg/ml)；

b为浓度范围中值(μg/ml)；c为校对浓度(μg/ml)。

表1标准溶液吸光系数和浓度范围

(3)转基因甘薯块根中的类胡萝卜含量测定

①转基因甘薯块根中类胡萝卜素的提取

1)上述步骤3得到的转基因甘薯植株的块根去皮经匀浆后，快速称取5g，倒入研钵中，加入50ml冰丙酮浸泡(丙酮预冷约2小时)和3g硅藻土混匀后，用力研磨5min。

2)将研磨液倒入磨砂漏斗中进行抽真空，漏斗中的干燥粉末加适量预冷丙酮再次用力研磨。重复操作4次，直至研磨液的颜色变为无色。

3)分液漏斗加入40ml石油醚，将提取物转移至500ml分液漏斗(分液漏斗活塞处使用前应用甘油润滑)。

4)沿着漏斗壁缓缓加入约300ml水。如出现乳状物层，可用饱和Nacl溶液去除。出现分层后，将下面水相弃掉。

5)用约200ml水洗石油醚相，重复4次，然后收集到20ml棕色样品瓶，封口，-80℃避光保存，得到待测类胡萝卜素溶液，2天内送样检测。

同时，用以上方法得到转空载体对照甘薯植株和野生型对照甘薯植株的待测样品。

②转基因甘薯块根中的类胡萝卜含量测定(高效液相色谱仪为美国Agilent公司1200型)

1)将上述得到的待测类胡萝卜素溶液在旋转蒸发器中集中收集，并用N2干燥。

2)立即使类胡萝卜素溶解于1ml乙腈∶甲醇∶二氯甲烷(V∶V∶V)＝45∶20∶35的的溶剂中。

3)将待测样品通过0.22μl注射器过虑后，直接将10μl样品到加入到色谱柱中。

4)采用YMC C30色谱柱(250mm×4.6mm，5nm)，以乙腈∶甲醇∶二氯甲烷(V∶V∶V)＝75∶20∶5为流动相，流速1.8ml/min检测波长450nm处的吸收峰的变化。

5)每个待测样品，重复测定3次。

根据上述建立的β-胡萝卜素(β-carotene)、玉米黄素(zeaxanthin)、叶黄素(lutein)、β-隐黄质(β-cryptoxanthin)和α-胡萝卜素(α-carotene)的标准曲线，分别测定转基因甘薯、转空载体对照甘薯和野生型对照甘薯块根中的类胡罗卜素含量。其中总类胡萝卜素含量是五种类胡萝卜素含量(x/0.6(ug/g))之和。结果如表1所示，表1中编号1-编号5分别表示5个转基因甘薯植株的待测样品；ck代表转空载体对照甘薯；ckw代表野生型对照甘薯；Peak SQU.(y)表示待测样品的HPLC峰面积；x(ug/ml)表示每ml待测样品中类胡萝卜素的含量(ug)；x/0.6(ug/g)表示每g待测甘薯植株的块根中类胡萝卜素的含量(ug)。

表1转基因甘薯、转空载体对照甘薯(ck)和野生型对照甘薯(ckw)块根中的类胡罗卜素含量

由表1可以看出，转基因甘薯、转空载体对照甘薯和野生型对照甘薯块根中都没有检测到α-胡萝卜素(α-carotene)；转空载体对照甘薯和野生型对照甘薯块根中未检测到玉米黄素(zeaxanthin)和β-隐黄质(β-cryptoxanthin)，而转基因植株都检测到玉米黄素(zeaxanthin)，其中编号1和2的转基因植株检测到β-隐黄质(β-cryptoxanthin)；转空载体对照甘薯和野生型对照甘薯块根中的类胡罗卜素含量无显著差异；转基因植株的总类胡萝卜素含量与野生型对照植株相比显著提高，分别是其含量的2.79倍、2.75倍、2.75倍、2.41倍和2.32倍。

Claims (9)

1.一种蛋白，是如下(a)或(b)的蛋白质：

(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)将序列表中序列1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与类胡萝卜素合成相关的由(a)衍生的蛋白质。

2.权利要求1所述蛋白的编码基因。

3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于：所述蛋白的编码基因为如下1)-4)中任一所述的基因：

1)序列表中序列2自5′末端起第63位-第1440位或第30位-第1461位碱基核苷酸所示的DNA分子；

2)序列表中序列2所示的DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)所示的DNA分子杂交且编码所述蛋白的基因；

4)与1)或2)或3)的基因具有90％以上的同源性且编码所述蛋白的基因。

4.含有权利要求2或3所述编码基因的表达盒、重组表达载体、转基因细胞系或重组菌。

5.扩增权利要求2或3所述编码基因全长或其任一片段的引物对，为如下1)或2)所示：

1)由序列表中序列3所示的DNA片段和序列表中序列4所示的DNA片段组成的引物对；

2)由序列表中序列5所示的DNA片段和序列表中序列6所示的DNA片段组成的引物对。

6.一种培育转基因植物的方法，是将权利要求2或3所述的编码基因导入目的植物中，得到类胡萝卜素含量高于所述目的植物的转基因植物。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：权利要求2或3所述的编码基因是通过权利要求4所述的重组表达载体导入目的植物中。

8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于：所述类胡萝卜素为β-胡萝卜素、玉米黄素、叶黄素、β-隐黄质和α-胡萝卜素中的至少一种。

9.根据权利要求6-8中任一所述的方法，其特征在于：所述目的植物为双子叶植物或单子叶植物；所述双子叶植物为甘薯(Ipomoea batatas)。

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