KR20220166893A - 벼 뿌리의 중심주에서 특이적인 발현을 유도하는 OsRP4 프로모터 및 이의 용도 - Google Patents
벼 뿌리의 중심주에서 특이적인 발현을 유도하는 OsRP4 프로모터 및 이의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 식물 뿌리의 중심주에서 특이적인 발현을 유도하는 OsRP4 프로모터 및 이의 용도에 관한 것으로, 구체적으로는 OsRP4 프로모터, 상기 프로모터를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환 식물체 및 상기 형질전환 식물체의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 식물 뿌리 중심주에서 특이적으로 발현되는 OsRP4 프로모터를 이용하여, 목적 유전자를 뿌리에 특이적으로 발현시킬 수 있으며, 이를 이용하여 양분, 이온 및 물의 수송, 뿌리 형태 조절 등 뿌리 형질 개선을 통해 내건성, 내염성, 소비성 등 작물의 농업형질 개량에 활용 가능하다.
본 발명의 식물 뿌리 중심주에서 특이적으로 발현되는 OsRP4 프로모터를 이용하여, 목적 유전자를 뿌리에 특이적으로 발현시킬 수 있으며, 이를 이용하여 양분, 이온 및 물의 수송, 뿌리 형태 조절 등 뿌리 형질 개선을 통해 내건성, 내염성, 소비성 등 작물의 농업형질 개량에 활용 가능하다.
Description
본 발명은 벼 뿌리에서 특이적인 발현을 유도하는 OsRP4 프로모터 및 이의 용도에 관한 것으로, 구체적으로는 OsRP4 프로모터, 상기 프로모터를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환 식물체 및 상기 형질전환 식물체의 제조방법에 관한 것이다.
작물분자육종은 모든 종(種)의 유전자를 재료로 사용할 수 있으며 기존의 게놈 단위로만 가능하던 육종기술을 유전자 단위로 끌어내려 무한대의 육종 효과를 미세하게 조절할 수 있다는 측면에서 차세대 농업을 이끌어 갈 핵심적인 기술이다. 이러한 작물분자육종 기술의 효과를 극대화시키려면, 여러 가지 식물의 유전자를 대표할 수 있는 많은 유전자 데이터의 축적이 선행되어야 하고, 다양한 작물의 형질전환 시스템이 구축되어야 하며, 외부에서 삽입된 유전자의 발현을 조절할 수 있는 다양한 프로모터가 개발되어야 한다.
일반적으로 프로모터란 유전자의 발현 시기, 발현 위치, 그리고 발현 정도를 결정하는 작용을 하는 염기서열, 즉, 유전자의 발현을 조절하는 기능을 갖는 조절영역의 일종이다. 종래 연구된 프로모터들은 상시적으로 발현을 유도하는 프로모터 및 시간 또는 위치 특이적으로 발현을 유도하는 프로모터 등 그 특징 및 기능에 따라 구분된다.
그 중에서 발현 조직을 제한하는 조직 특이적인 프로모터는 목적 유전자의 발현을 식물체의 특별한 조직에만 국한시켜 형질전환 목적을 달성하는데 이용되는 프로모터들이다. 이와 같은 조직 특이적인 프로모터는 조직에 따라 전신발현 유도 프로모터, 종자 특이적 발현 유도 프로모터, 뿌리 특이적 발현 유도 프로모터, 잎 등 기타 조직 특이적 발현 유도 프로모터 등을 들 수 있다.
뿌리는 가장 바깥쪽의 표피로 둘러싸여 있고 표피의 안쪽에는 여러 층의 피층이 있으며, 피층의 가장 안쪽에 내피가 자리잡고 있다. 내피의 안쪽에는 내초에 둘러싸인 물관부와 체관부가 분포하여 뿌리의 관다발계를 형성하며, 내피의 안쪽 부분을 전체적으로 뿌리의 중심주로 다루고 있다. 중심주 배열은 독립된 물관부와 체관부가 교대로 배열되는 방사 중심주로서, 대부분의 관속식물에서 공통적으로 나타난다. 이들은 다시 물관부가 중심부에 집중해 있는 경우 또는 중심부는 속으로 차있고 그 주위에 물관부가 흩어져 있는 경우로 나뉠 수 있다.
뿌리가 흡수한 물질은 내피층의 세포 속을 통과하지 않으면 뿌리의 통도 조직에 들어갈 수 없으며, 이곳에서 엄밀한 물질의 선택이 이루어진다. 따라서 내피 안쪽의 중심주는 식물의 양분이동에 핵심적인 기관을 포함하고 있으므로 식물의 생장과 발달에 중요한 역할을 한다.
본 발명자들은 식물의 뿌리에서 목적 유전자를 특이적으로 발현시킬 수 있는 유용한 프로모터를 개발하기 위하여 노력한 결과, 벼에서 목적 유전자를 뿌리에 특이적으로 발현시킬 수 있는 OsRP4 프로모터를 분리함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명이 해결하고자 하는 과제는 벼 뿌리 중심주에서 특이적인 발현을 유도하는 OsRP4 프로모터, 상기 프로모터를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환 식물체 및 상기 재조합 벡터로 식물을 형질전환시켜 목적 단백질을 식물체에 발현시키는 단계를 포함하는 형질전환 식물체의 제조방법 제공을 목적으로 한다.
상기의 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진, 식물의 뿌리에서 특이적으로 발현을 유도하는 프로모터를 제공한다.
상기 뿌리는 관다발 중심주(vascular cylinder)일 수 있다.
상기 프로모터는 식물호르몬 또는 염 스트레스에 의해 특이적으로 발현을 유도할 수 있다.
상기 식물호르몬은 앱시스산(abscisic acid, ABA) 또는 옥신(auxin)일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 프로모터와 작동 가능하게 연결된 목적 단백질을 코딩하는 외래 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 아그로박테리움(Agrobacterium)을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터 또는 상기 아그로박테리움으로 형질전환된 형질전환 식물체를 제공한다.
상기 식물체는 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 밀, 팥, 귀리 및 수수로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 식물을 형질전환시켜 목적 단백질을 코딩하는 외래 유전자를 식물체에 발현시키는 단계를 포함하는 형질전환 식물체의 제조방법을 제공한다.
상기 목적 단백질을 코딩하는 외래 유전자는 식물의 뿌리에서 특이적으로 발현될 수 있다.
상기 뿌리는 관다발 중심주(vascular cylinder)일 수 있다.
본 발명의 식물 뿌리 중심주에서 특이적으로 발현되는 OsRP4 프로모터를 이용하여, 목적 유전자를 뿌리에 특이적으로 발현시킬 수 있으며, 이를 이용하여 양분, 이온 및 물의 수송, 뿌리 형태 조절 등 뿌리 형질 개선을 통해 내건성, 내염성, 소비성 등 작물의 농업형질 개량에 활용 가능하다.
도 1은 OsRP4 프로모터-GUS 벡터 모식도이다.
도 2는 OsRP4 프로모터-GUS 발현벡터가 도입된 형질전환 벼의 genomic PCR 분석이다.
도 3은 OsRP4 프로모터-GUS 벡터가 도입된 형질전환 벼 뿌리의 GUS 염색 이미지이다.
도 4는 OsRP4 프로모터-GUS 벡터가 도입된 형질전환 벼 뿌리에서 앱시스산(abscisic acid, ABA), 나프탈렌아세트산(naphthalene acetic acid, NAA) 및 염화나트륨(NaCl) 처리에 의한 GUS 염색을 비교한 것이다.
도 2는 OsRP4 프로모터-GUS 발현벡터가 도입된 형질전환 벼의 genomic PCR 분석이다.
도 3은 OsRP4 프로모터-GUS 벡터가 도입된 형질전환 벼 뿌리의 GUS 염색 이미지이다.
도 4는 OsRP4 프로모터-GUS 벡터가 도입된 형질전환 벼 뿌리에서 앱시스산(abscisic acid, ABA), 나프탈렌아세트산(naphthalene acetic acid, NAA) 및 염화나트륨(NaCl) 처리에 의한 GUS 염색을 비교한 것이다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법 및 이하에 기술하는 실험 방법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명은 식물의 뿌리에서 목적 유전자를 특이적으로 발현시킬 수 있는 유용한 프로모터를 개발하기 위하여 노력한 결과, 벼에서 목적 유전자를 뿌리에 특이적으로 발현시킬 수 있는 OsRP4 프로모터를 분리함으로써 완성하게 되었다. 본 발명에서 “목적 유전자”란 목적 단백질을 코딩하는 외래 유전자를 의미한다.
본 발명은 일 관점에서, 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진, 식물의 뿌리에서 특이적으로 발현을 유도하는 프로모터에 관한 것이다.
본 발명에서 "뿌리"란 식물의 밑동으로서 보통 땅속에 묻히거나 다른 물체에 박혀 수분과 양분을 빨아올리고 줄기를 지탱하는 작용을 하는 기관으로, 분열조직(meristem)에 속한다. 상기 분열조직은 세포분열을 해서 새로운 세포를 만드는 조직을 의미한다. 분열조직은 세포분열을 하여 식물을 성장하게 하는 부분으로, 줄기(stem)나 뿌리(root) 끝에 있는 생장점(growing point)이 이에 속한다.
본 발명의 일 실시예에서, OsRP4 프로모터를 포함하는 재조합 벡터로 벼를 형질전환시킨 결과, 프로모터에 작동 가능하게 연결된 목적 단백질(예, GUS)이 벼 뿌리, 구체적으로 중심주(stele) 또는 관다발 중심주(vascular cylinder)에서 발현되었고, 특히 중심주 안쪽의 원생물관부(protoxylem)에서 뚜렷하게 발현됨을 확인하였다. 뿌리의 횡축 절편에서 GUS 염색 양상을 상세히 분석한 결과, 표피(epidermis), 피층(cortex) 등 중심주 바깥쪽의 주요 조직층을 구성하는 세포에서는 GUS 발현이 관찰되지 않았으며, 뿌리 안쪽 중심주(protoxylem) 영역에는 뚜렷한 GUS 염색이 확인되었다.
따라서 OsRP4 프로모터가 벼 뿌리의 관다발 중심주(vascular cylinder)에서 목적 유전자를 특이적으로 발현시킬 수 있음을 증명하였으며, 구체적으로 관다발 중심주 안쪽에 위치한 원생물관부(protoxylem)일 수 있다.
본 발명에서 “관다발 중심주(vascular cylinder)”란 피층(cortex)의 가장 안쪽에 위치한 내피(exodermis) 안의 내초에 둘러싸인 물관부와 체관부가 분포되어 관다발계를 형성한 것을 의미한다. 뿌리가 흡수한 물질은 내피층의 세포 속을 통과하지 않으면 뿌리의 통도 조직에 들어갈 수 없으며, 이곳에서 물질의 선택이 이루어진다. 따라서 내피 안쪽의 중심주는 식물의 양분이동에 핵심적인 기관을 포함하고 있으므로 식물의 생장과 발달에 중요한 역할을 한다.
상기 관다발 중심주는 구체적으로 물관부 조직, 더욱 구체적으로는 원생물관부(protoxylem)일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서 관다발 중심주의 원생물관부(protoxylem)에서 뚜렷하게 염색이 관찰됨을 확인하였다.
즉, 본 발명의 프로모터는 뿌리의 관다발 중심주의 물관부 조직에서 목적 단백질을 코딩하는 외래 유전자(목적 유전자)를 특이적으로 발현시킨다.
본 발명에서 “프로모터”란 구조유전자(gene)의 상부 쪽에 연결되어 있는 유전체(genome) 부위로서, 이에 연결된 구조유전자가 mRNA로 전사(transcription) 되도록 조절하는 역할을 한다. 프로모터에는 여러 일반전사인자(general transcription factor)들이 결합함으로써 활성화(activation)되는데, 보편적으로 유전자 발현을 조절하는 TATA 박스, CAAT 박스 부위, 외부 자극에 반응하여 유전자 발현에 영향을 주는 부위 및 위치와 방향에 상관없이 거의 모든 유전자의 발현을 촉진하는 인핸서 등으로 이루어져 있다. 생체의 기본대사에 필요한 단백질들은 세포 내에서 일정 농도를 유지해야 하므로 이들의 유전자에 연결된 프로모터는 일반전사인자의 작용만으로도 항시 활성화되어 있다. 이에 반하여 평상시에는 역할이 없고 특수한 상황 하에서만 기능이 요구되는 단백질들은 해당 구조유전자의 발현을 유도하는 조직 특이 프로모터(tissue specific promoter) 또는 유도성 프로모터(inducible promoter)가 연결되어 있다. 즉, 조직 특이 프로모터는 생물체의 발달 과정에서, 유도성 프로모터는 주변으로부터의 환경적 요인에서 오는 외부 자극에 의해 활성화된 특이 전사인자(specific transcription factor)가 결합함으로써 활성화된다.
본 발명의 OsRP4 프로모터는 식물체의 특정 부위, 특히 식물체의 뿌리 조직에서만 특이적으로 발현을 유도하는 프로모터로, 서열번호 1의 염기서열을 가지나 상기 서열과 80% 이상의 상동성을 가지는 서열, 바람직하게는 90% 이상의 상동성, 더 바람직하게는 95% 이상의 상동성, 가장 바람직하게는 99% 이상의 상동성을 나타내는 서열로서, 실질적으로 동일하거나 상응하는 생물학적 활성을 갖는 염기를 포함할 수 있다. 또한, 이러한 상동성을 갖는 서열로서 실질적으로 동일하거나 상응하는 생물학적 활성을 갖는 염기서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 염기서열을 갖는 프로모터도 본 발명의 범위에 포함됨은 자명하다.
본 발명에서 “상동성”이란 야생형(wild type) 염기서열과의 유사한 정도를 나타내기 위한 것으로서, 본 발명의 염기서열과 상기와 같은 퍼센트 이상의 동일한 서열을 가지는 서열을 포함한다. 이러한 상동성의 비교는 육안으로나 구입이 용이한 비교 프로그램을 이용하여 수행할 수 있다. 시판되는 컴퓨터 프로그램은 2개 이상의 서열간의 상동성을 백분율(%)로 계산할 수 있으며, 상동성(%)은 인접한 서열에 대해 계산될 수 있다.
본 발명의 프로모터는 식물체의 뿌리에서 목적 단백질 내지 목적 유전자 RNA를 발현시킬 수 있으며, 바람직하게는 상기 식물체의 뿌리에서 특이적으로 목적 단백질을 코딩하는 외래 유전자를 발현시킬 수 있다.
따라서, 본 발명은 다른 관점에서, 상기 프로모터와 작동 가능하게 연결된 목적 단백질을 암호화하는 외래 유전자를 포함하는 재조합 벡터에 관한 것이다.
본 발명의 위치 특이적 프로모터는 통상의 재조합 벡터의 프로모터로서 작용할 수 있다.
본 발명에서 “재조합 벡터”란 숙주세포에서 목적 단백질 또는 목적 RNA를 발현할 수 있는 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동 가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 제작물을 의미한다.
본 발명의 재조합 벡터는 본 발명의 프로모터 및 상기 프로모터와 작동 가능하게 연결(operably linked)되어 있는 목적 단백질을 암호화하는 유전자 염기 서열이 삽입 또는 도입될 수 있는, 이 기술 분야에 공지된 플라스미드, 바이러스 또는 기타 매개체를 의미한다. 본 발명에 따른 식물체의 조직 특이 발현 프로모터 및 상기 프로모터와 작동 가능하게 연결되어 있는 목적 단백질을 암호화하는 염기서열은 발현 조절 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있으며, 상기 작동 가능하게 연결된 유전자 서열과 발현 조절 서열은 선택 마커 및 복제 개시점(replication origin)을 같이 포함하고 있는 하나의 발현 벡터 내에 포함될 수 있다.
상기 “작동 가능하게 연결(operably linked)”된다는 것은 적절한 분자가 발현 조절 서열에 결합될 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된 유전자 및 발현 조절 서열일 수 있다. “발현 조절 서열(expression control sequence)”이란 특정한 숙주 세포에서 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미한다. 그러한 조절 서열은 전사를 실시하기 위한 프로모터, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다.
상기 본 발명에 따른 발현 벡터로는 단백질 발현에 사용되는 기존의 벡터를 기본 골격으로 하여 본 발명의 프로모터를 삽입하고 상기 프로모터의 하류(downstream) 쪽으로 목적 단백질을 암호화하는 염기서열을 삽입함으로써 제조할 수 있다. 따라서 본 발명에 사용될 수 있는 벡터로는 다양한 클로닝 부위를 가지고 있는 대장균 유래 플라스미드(pBR322, pBR325, pUC118 및 pUC119), 바실러스 서브틸러스 유래 플라스미드(pUB110 및 pTP5), 효모 유래 플라스미드(YEp13, YEp24 및 YCp50) 및 Ti 플라스미드 등의 플라스미드일 수 있고, 식물 바이러스 벡터일 수 있으며, pCHF3, pPZP, pGA 및 pCAMBIA 계열과 같은 바이너리 벡터(binary vector)를 사용할 수도 있다. 그러나 이 기술 분야의 통상의 기술자라면 본 발명의 프로모터 및 상기 프로모터와 작동가능하게 연결되어 있는 목적 단백질을 암호화하는 염기서열을 숙주 세포 내로 도입할 수 있는 벡터라면 어떠한 벡터라도 모두 사용할 수 있다.
본 발명에서 사용될 수 있는 상기 목적 단백질은 본 발명의 프로모터에 의해 식물체 조직 특이적으로 발현되기를 원하는 외부 유래의 어떤 표적 단백질, 즉, 외인성 단백질이거나 또는 내인성 단백질 및 리포터 단백질일 수 있다. 상기 외인성 단백질은 특정 조직 또는 세포에 천연적으로 존재하지 않는 단백질을 말하며, 상기 내인성 단백질은 특정 조직 또는 세포에 천연적으로 존재하는 유전자에 의해 발현되는 단백질을 말한다. 또한, 상기 리포터 단백질은 리포터 유전자에 의해 발현된 단백질로서 그 존재에 의해서 세포 내에서의 그의 활성을 알려주는 표지 단백질을 말한다.
또한, 본 발명의 발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 수 있다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택할 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당될 수 있다.
구체적으로, 본 발명의 일 실시예에서는 청색 발색 유전자인 GUS가 연결된 형태의 리포터 시스템이 내재되어 있는 공지된 벡터에 서열번호 1의 염기서열을 가지는 본 발명의 OsRP4 프로모터를 GUS 유전자의 상류 부분에 작동 가능하게 연결한 재조합 벡터인 OsRP4 프로모터-GUS 발현 벡터를 제조하였다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체에 관한 것이며, 상기 형질전환체는 아그로박테리움을 의미할 수 있다.
본 발명에서 “형질전환(transformation)”이란 외부로부터 주어진 유전물질인 DNA에 의해 개체 또는 세포의 형질이 유전적으로 변화하는 것을 의미하는 것으로, 본 발명에서는 상기 서열번호 1로 표시되는 프로모터 도입에 의해 목적 유전자가 식물의 뿌리에서 특이적으로, 특히 뿌리의 관다발 중심주(vascular cylinder)에서 특이적으로 발현되는 것을 의미한다.
본 발명에서 본 발명의 재조합 벡터로 형질전환하는 것은 당업자에게 공지된 형질전환기술에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 미세사출법(microprojectile bombardment), 입자 총 충격법(particle gun bombardment), 실리콘 탄화물 위스커(Silicon carbide whiskers), 초음파 처리(sonication), 일렉트로포레이션(electroporation), PEG-매개 융합법(PEG-mediated fusion), 미세주입법(microinjection), 리포좀 매개법(liposome-mediated method), 인-플란타 형질전환법(In planta transformation), 진공 침윤법(Vacuum infiltration method), 화아침지법(floral meristem dipping method), 또는 아그로박테리움(Agrobacterium sp.) 매개에 의한 방법 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 형질전환체는 프로모터 및 상기 프로모터와 작동가능하게 연결되어 있는 목적 단백질을 암호화하는 염기서열을 포함하는 재조합 벡터로 형질 전환된 숙주 세포를 의미한다.
상기 형질전환체는 미생물이 바람직하며, 이에 제한되지는 않으나, 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens), 대장균(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis), 스타필로코쿠스(Staphylococcus)일 수 있으며, 바람직하게는 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)일 수 있다.
본 발명의 또 다른 관점은, 상기 벡터 또는 형질전환체로 형질전환된 식물체에 관한 것이며, 상기 형질전환체는 아그로박테리움을 의미할 수 있다.
본 발명에서 “식물체”는 식물 또는 식물세포를 의미한다. 식물이란 전체 식물(whole plant), 식물의 일부분, 캘러스, 식물 조직, 식물 세포 및 식물 종자를 모두 포함한다.
상기 식물체로는 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 밀, 팥, 귀리 또는 수수를 포함하는 식량 작물류로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있으며, 바람직하게는 벼(Oryza sativa)가 될 수 있으며, 더욱 구체적으로는 벼의 유묘가 될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 OsRP4 프로모터를 포함한 재조합 벡터에 의해 형질전환된 미생물 형질전환체인, 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) LBA4404을 벼(Oryza sativa)에 접종하여 형질전환 벼 식물체를 제작하였다.
또한, 본 발명의 일 실시예에서 본 발명의 OsRP4 프로모터-GUS 벡터 삽입이 확인된 형질전환 벼의 유묘를 앱시스산(abscisic acid, ABA) 또는 옥신(auxin)인 나프탈렌아세트산(naphthalene acetic acid, NAA)의 식물 호르몬 및 염 스트레스의 염화나트륨(NaCl)을 포함하는 배지로 3일 동안 노출 시킨 후, 식물체에서 GUS 염색을 분석한 결과, ABA와 NAA 처리구에서는 뿌리의 표피(epidermis)와 내피(exodermis) 조직에서도 GUS 염색이 확인되었으며, 염 스트레스 처리구에선 원생물관부(protoxylem)에서만 염색이 확인되었다. 뿌리의 횡축에서 GUS 염색 양상을 상세히 분석한 결과, 대조구에 비해 ABA와 NAA를 처리한 식물체 뿌리의 측근 원기(lateral root primordia)에서 뚜렷한 GUS 염색이 나타났다. 이런 결과는 OsRP4 프로모터가 뿌리에서 스트레스 호르몬(ABA)과 생장조절 호르몬(auxin)에 반응하여 뿌리의 표피(epidermis), 내피(exodermis) 조직 및 뿌리의 측근 원기(lateral root primordia)에 특이적으로 발현을 유도하는 고유 특성이 있음을 증명하였고, 대표적인 비생물적 스트레스(abiotic stress)인 염 스트레스에서도 반응하여 원생물관부(protoxylem)에 발현을 유도하는 것을 확인하였다.
본 발명의 OsRP4 프로모터가 앱시스산(abscisic acid, ABA) 또는 옥신(auxin)의 식물 호르몬 및 염 스트레스의 염화나트륨(NaCl)에 의해 뿌리의 관다발 중심주에서 목적 유전자의 발현을 증가시킴을 확인하였는바, 본 발명의 OsRP4 프로모터는 앱시스산 또는 옥신의 식물 호르몬 및 염 스트레스의 염화나트륨(NaCl)에 의해 뿌리의 관다발 중심주에서 목적 단백질을 코딩하는 외래 유전자의 발현을 증가시킬 수 있다.
또한, OsRP4 프로모터가 뿌리의 측근 원기(lateral root primordia)에서 스트레스 호르몬(ABA)과 생장조절 호르몬(auxin)에 의해 발현을 유도함을 확인하였는바, 본 발명의 OsRP4 프로모터는 앱시스산(abscisic acid, ABA) 또는 옥신(auxin)에 의해 뿌리의 측근 원기(lateral root primordia)에서 발현을 유도할 수 있다. 또한, OsRP4 프로모터가 원생물관부(protoxylem)에서 염화나트륨(NaCl)에 의해 발현을 유도함을 확인하였는바, 본 발명의 OsRP4 프로모터는 염 스트레스에 의해 원생물관부(protoxylem)에서 발현을 유도할 수 있다.
본 발명의 또 다른 관점은, 상기 벡터로 식물을 형질전환시켜 목적 단백질을 코딩하는 외래 유전자를 식물체에 발현시키는 단계를 포함하는 형질전환 식물체의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 제조방법은 상기 벡터로 식물을 형질전환시켜 목적 단백질을 식물체에 발현시키는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함하는 목적 단백질 특이적 발현용 프로모터 및 목적 단백질을 코딩하는 구조 유전자를 작동 가능하게 연결시켜(operatively linked) 재조합 벡터를 제조하고, 상기 발현 벡터로 아그로박테리움 투메파시엔스를 형질전환시킨 후, 형질전환된 아그로박테리움 투메파시엔스를 벼에 감염시켜 벼의 뿌리 물관부 조직에서 특이적으로 목적 단백질이 발현되는 것을 확인하였다.
따라서 상기 형질전환은 구체적으로 발현 벡터로 형질전환된 아그로박테리움 투메파시엔스를 벼에 감염시키는 것일 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 목적 단백질이 식물체의 뿌리, 구체적으로 뿌리의 관다발 중심주(vascular cylinder)에서 특이적으로 발현될 수 있다.
본 발명에서 “관다발 중심주”에 관한 설명은 전술한 바와 같다.
이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시예에 대하여 첨부한 도면을 참고로 하여 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.
<실시예 1> in silico 벼 전사체 분석을 통한 뿌리 발현 유전자 선발
벼의 뿌리는 다양한 조직으로 구성되어 있다. 벼 뿌리 전사체 Public DB(Rice XPro)에 등록된 45,151 유전자 프로브(probe) 중에서 뿌리의 내피(endodermis), 내초(pericycle), 중심주(stele)에서 유전자 발현정도(normalized intensity)가 8 이상이면서 그 외 조직인 표피(epidermis), 피층(cortex) 등에서는 1 미만으로 발현되는 유전자 23종을 1차 선발한 후, 그 중에서 벼 조직 전사체 Public DB (Rice XPro)를 이용하여 줄기 등 다른 기관에 비교해서 뿌리에서 발현 특이성이 매우 높은 유전자 Os02g0768300을 선발하였다.
<실시예 2> OsRP4 프로모터 분리 및 GUS 융합 운반체 제작
Os02g0768300 유전자의 프로모터 영역을 분리하기 위하여 번역시작 상위 염기서열 2,000 bp의 염기서열 정보를 벼(Nipponbarre) 게놈(genome) 데이터 베이스에서 추출하고, 하기 표 1의 프라이머 쌍(Os02g0768300P-ENTR-F, Os02g0768300P-ENTR-R)을 이용하여 동진 벼의 게놈(genomic) DNA를 주형으로 PCR을 수행하였다.
| 프라이머 | 염기서열 |
| Os02g0768300P-ENTR-F (서열번호2) | 5'-gccgcccccttcacc tgggcggatgtgaggtgattc-3' |
| Os02g0768300P-ENTR-R (서열번호3) | 5'- tcggcgcgcccaccctt tctctcgaacgatctgatc-3' |
PCR 산물을 게이트웨이 벡터(gateway donor vector)에 클로닝하고 전체 염기서열을 결정하였다(표 2). 그 결과 벼(Nipponbarre)의 게놈(genome) 데이터베이스에서 추출한 Os02g0768300 유전자의 프로모터 염기서열과 비교하였을 때 100% 일치하는 2,000 bp의 프로모터를 확인하여 이를 OsRP4(Oryza sativa Root Promoter 4)으로 명명하였다.
| OsRP4 프로모터의 염기서열(서열번호 1) |
| tgggcggatg tgaggtgatt cctagcgtag ttttgtttga ctactgcctt gtgaaattgc 60 tgttgtggaa atgggatcga tgtttggaaa atctgcagct gatgggatca gctaggcccg 120 ggtggccgtt tgaaagttgt tggcccgggt ggccgtttga aagttgttgg ccgggtgcca 180 accttgaatc aattcaaaag actgatactt tgcacatact ccgaccggac gagacgcact 240 gtctcatccg tgtcgtttga gaagcactca cttagttgat ttcagaaaag agttcaaata 300 aaatcaattg caaaaacaac agcctttcct tgaagcctgc attaaacact tatttcccat 360 ggcttgctga gtactcctgt actcaccctt gctctatata aatatctccc ccccagttgc 420 tgaagaagat gaagcggatc ccgctgacga ggagttcttc caggagcaag ccggctacga 480 tgagttttag agtttcggcc tagttcccaa gtcacgcctg tgatgtttgg tccaagtctt 540 ggcttccact tcccttttgc aatgcagttg tgagctcggg atctgtccgc agcccaacat 600 gactgtactc ctactctata ataaagagac ctctgttgct gtgatattct gtcttcctgt 660 gataccagca ctgtttcctg ggactggtat cgattaacag gttaatttgg agcgtcacgg 720 gctagttccg gtcgggacta gttcggggcg tgacaattat tgatttaatg agactaattt 780 ggtgttgtaa atattactat atttatctat aaacttaatc aatcttaaag tagtttgacc 840 ttgaccaaat tcaaaatgag taattataat atgaaacaga ggaagtagta agtaagacct 900 gatacataaa ggccaagctg agcataagtg tatggttaaa ccaaaatttg tggcttaaat 960 tatcatgaat atattgtcca ttctccttgt aatgttacac ggttacaccc atatataaat 1020 atatatgcct ttatattaca ctgtcgcaca tctcccagaa gtgatagcat agtgtaactc 1080 tttatataaa cgaaatgaag ataacaatta tatatggttt ttctgagaat cttcagttaa 1140 ttaattagca ctccaagtta aactgaagat aagagtagct agcagcaacc aactagctag 1200 tcagcattga tgccacatct tatcagtcga ataacccatt gacagtattc tccctactgg 1260 tctctagtct ctacacatcc atgtacaatg catgcatgca tgcacatcga ttgttgtcgg 1320 tacacaagca ctagctctgc tagacagggg ttaacacaag tagtaaaagc ctaggagctg 1380 cagatcagag aagttccagc tgactcccac aaaccttgac ttggacggct ctgatcatgc 1440 atcctcttct cctcaggtag ccaaaaagag acatgacaaa gttgcaaaac ccatcggcag 1500 tatgtgctca ctgcattttc ccggcaaagc agagagaaaa ttaaaaagac gacgcagaca 1560 tatagccctt tctttctctc tctcctttag ccggaagtgg aatattaaac aagctggaaa 1620 catacaagcc agcactgctc gcaacaacaa cattcagaag agagagaagt atagagagag 1680 agaggggagc atgagtcaga tccatgatcc atcaatggca ccacacagtc cacacttggg 1740 catctgggcg agacgagacg actaatccaa cttcgatagc aacggttgct gctagctgct 1800 gtgctgaaca gtgcagcgtc gtgcagctat atgcctatat atatccctca aaactcattg 1860 cctctcctca tcacagccac aacacctagc tagctgcagc ttgtgtgcga gctactcctg 1920 cagctagcta ctagctacag ccaaagatta ccagcaacag aaattaactg tgtgagacgt 1980 cgatcagatc gttcgagaga |
분리한 프로모터는 GUS 리포터(reporter) 유전자를 포함하는 pBGWFS7 벡터에 클로닝하여 도 1과 같은 프로모터(promoter) 발현 분석 벡터(pBGWFS7-OsRP4)를 제작하였다.
<실시예 3> OsRP4 프로모터 영역의 모티프(motif) 검색
OsRP4 프로모터에 존재하는 발현조절인자(cis-acting element)를 확인하기 위해 OsRP4 프로모터의 염기서열을 New PLACE(database of plant cis-acting regulatory DNA elements: http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/)를 이용하여 분석하였다.
OsRP4 프로모터에는 뿌리털 특이적 발현을 지시하는 RHERPATEXPA7 모티프(motif)와 뿌리에서 발현을 지시하는 OSE1ROOTNODULE, OSE2ROOTNODULE, ROOTMOTIFTAPOX1 모티프(motif) 및 종자 혹은 배 특이적인 발현을 지시하는 DPBFCOREDCDC3 모티프(motif)가 발견되었으며, 이는 OsRP4 프로모터가 뿌리 특이적 발현을 유도할 가능성을 시사한다.
또한 가뭄스트레스와 스트레스 호르몬인 ABA 반응을 조절하는 전사인자 (Myb, HD-ZIP 등)가 결합하는 모티브들 (MYB1AT, MYB2AT, MYBCORE, DPBFCOREDCDC3)이 발견되었으므로 OsRP4 프로모터가 비생물적 스트레스 신호에 의해 유도할 가능성을 보여준다. 그 외에도 무산소 (anaerobic) 자극에 의해 발현을 유도하는 모티브 (ANAERO3CONSENSUS)와 무기양분인 황 결핍 시 발현을 유도하는 모티브 (SURECOREATSULTR11)가 발견되었다. OsRP4 프로모터에서 발견된 발현조절 인자 (cis-acting element)의 일부를 표 3에 표시하였다.
| 발현조절인자 Element name | 모티브 시퀀스 Motif sequence | 수 Numbers | 위치 Positions |
| SURECOREATSULTR11 | GAGAC | 10 | +233, -244, +633, +779, -1275, -1282, 1486, +1771, +1776, +1998, |
| DPBFCOREDCDC3 | ACACNNG | 4 | +1338, +1370, +1753, -1923 |
| OSE1ROOTNODULE | AAAGAT | 1 | +1967 |
| OSE2ROOTNODULE | CTCTT | 7 | -291, -631, +1091, -1185, +1462, -1484, -1678 |
| ROOTMOTIFTAPOX1 | ATATT | 11 | -406, +652, -799, +800, -878, -980, +983, -1030, +1045, -1621, +1622 |
| RHERPATEXPA7 | KCACGW | 1 | -1841 |
| ANAERO3CONSENSUS | TCATCAC | 1 | +1891 |
| MYB1AT | WAACCA | 3 | -944, +949, -1128 |
| MYB2AT | TAACTG | 2 | -1148, +1979 |
| MYBCORE | CNGTTR | 12 | +60, -127, -154, +419, 9572, +640, +1012, 1148, -1802, +1805, -1979, -1989 |
| EBOXBNNAPA | CANNTG | 7 | -97, -308, -419, -572, -1414, -1754, -1762, |
<실시예 4> OsRP4 프로모터-GUS 발현벡터가 삽입된 형질전환 벼 제작
OsRP4 프로모터의 기능을 확인하기 위해, 도 1의 발현벡터를 아그로박테리아 LBA4404에 도입 후 동진벼 캘루스에 감염하고 PPT(6 ㎍/l) 조건에서 형질전환체를 선발하여 온실에서 생육하였다. 형질전환 벼의 잎에서 genomic DNA를 분리하여 도입 벡터에 존재하는 부분(GUSA-anti)과 프로모터 부분(OsRP4-1923F)에 존재하는 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하여 도입한 벡터가 삽입되었는지 확인하였다(도 2).프라이머 GUSA-anti와 OsRP4-1923F은 표 4에 표시하였다.
| 프라이머 | 염기서열 |
| GUSA-Anti (서열번호4) | 5'-CGCGATCCAGACTGAATGCCC-3' |
| OsRP4-1923F (서열번호5) | 5'-GCTAGCTACTAGCTACAGCC-3' |
<실시예 5> OsRP4 프로모터의 뿌리 발현 유도성 검정을 위한 형질 전환 벼의 GUS 염색 분석
5.1. OsRP4 프로모터의 조직 특이적 발현 유도 확인
OsRP4 프로모터-GUS 벡터 삽입이 확인된 형질전환 벼에서 발아 후 5일 된 유묘를 GUS 염색한 결과, 줄기와 어린 잎에서는 발현이 되지 않았고 뿌리에서만 염색되는 것을 확인하였다(도 3A).
뿌리에서는 관다발 중심주(vascular cylinder)에서만 GUS 염색이 확인되었고, 특히 중심주 안쪽의 원생물관부(protoxylem)에서 뚜렷하게 염색이 관찰되었다(도 3B, 도 3C).
뿌리의 횡축 절편에서 GUS 염색 양상을 상세히 분석한 결과, 표피(epidermis), 피층(cortex) 등 중심주 바깥쪽의 주요 조직층을 구성하는 세포에서는 GUS 발현이 관찰되지 않았으며, 뿌리 안쪽 중심주 영역에는 뚜렷한 GUS 염색이 확인되었다(도 3D). 상기 결과를 통해 OsRP4 프로모터가 벼 뿌리의 물관부 조직에서 목적 유전자를 특이적으로 발현시킬 수 있음을 증명하였다.
따라서 OsRP4 프로모터가 벼 뿌리의 관다발 중심주, 특히 뿌리의 물관부 조직에서 목적 유전자를 특이적으로 발현시킬 수 있음을 확인하였다.
5.2. OsRP4 프로모터의 식물 호르몬에 의한 발현 유도 확인
실시예 3에서 OsRP4 프로모터가 가뭄 스트레스와 스트레스 호르몬인 ABA 신호전달에 관여하는 모티프(motif)와 ABA 반응을 조절하는 전사인자와 결합하는 모티프(motif)를 포함하여 앱시스산(abscisic acid, ABA) 또는 옥신(auxin)을 포함하는 식물 호르몬에 의해 발현을 유도할 가능성을 확인하였다.
따라서 형질전환 벼에 OsRP4 프로모터의 식물 호르몬에 의한 발현 조절 효과를 분석하였다. 구체적으로 OsRP4 프로모터-GUS 벡터 삽입이 확인된 형질전환 벼의 유묘를 앱시스산(abscisic acid, ABA) 또는 옥신(auxin)인 나프탈렌아세트산(naphthalene acetic acid, NAA)의 식물 호르몬을 포함하는 배지에서 3일간 처리한 후, 식물체에서 GUS 염색을 분석하였다.
분석결과, ABA 또는 NAA 처리한 식물에서는 뿌리의 표피(epidermis)와 내피(exodermis) 조직에서도 GUS 염색이 확인되었으며(도 4A), 뿌리의 횡축에서 GUS 염색 양상을 상세히 분석한 결과, ABA 또는 NAA를 처리한 식물체 뿌리의 측근 원기(lateral root primordia)에서 뚜렷한 GUS 염색이 나타났다(도 4B). 반면, 대조구에서는 염색이 관찰되지 않았다. 이런 결과를 통해 OsRP4 프로모터가 뿌리에서 스트레스 호르몬(ABA)과 생장조절 호르몬(auxin)에 반응하여 뿌리의 표피(epidermis) 내지 내피(exodermis) 조직에서 발현을 유도하며, 측근 원기(lateral root primordia)에서 발현을 증진시키는 고유 특성이 있음을 증명하였다.
5.3. OsRP4 프로모터의 염 스트레스에 의한 발현 유도 확인
실시예 3에서 OsRP4 프로모터가 비생물적 스트레스 신호에 의해 발현을 유도할 가능성을 확인하였으므로, 형질전환 벼에 OsRP4 프로모터의 염 스트레스에 의한 발현 조절 효과를 분석하였다. 구체적으로 OsRP4 프로모터-GUS 벡터 삽입이 확인된 형질전환 벼의 유묘를 염 스트레스의 염화나트륨(NaCl)을 포함하는 배지에서 3일간 처리한 후, 식물체에서 GUS 염색을 분석하였다.
분석결과, 염화나트륨 처리한 식물에서는 뿌리의 원생물관부(protoxylem)에서만 GUS 염색이 확인되었다(도 4A). 반면, 대조구에서는 염색이 관찰되지 않았다. 이런 결과는 OsRP4 프로모터가 대표적인 비생물적 스트레스인 염 스트레스에서도 반응하여 원생물관부(protoxylem)에서 발현을 증진시키는 고유 특성이 있음을 증명하였다.
이러한 결과는 OsRP4 프로모터가 뿌리의 스트레스 반응과 생장조절에 유용하게 사용될 수 있는 가능성을 시사한다.
<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION)
<120> OsRP4 promoter expressed in root vascular cylinder and uses
thereof
<130> DP20210066
<160> 5
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 2000
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> OsRP4 Promoter
<400> 1
tgggcggatg tgaggtgatt cctagcgtag ttttgtttga ctactgcctt gtgaaattgc 60
tgttgtggaa atgggatcga tgtttggaaa atctgcagct gatgggatca gctaggcccg 120
ggtggccgtt tgaaagttgt tggcccgggt ggccgtttga aagttgttgg ccgggtgcca 180
accttgaatc aattcaaaag actgatactt tgcacatact ccgaccggac gagacgcact 240
gtctcatccg tgtcgtttga gaagcactca cttagttgat ttcagaaaag agttcaaata 300
aaatcaattg caaaaacaac agcctttcct tgaagcctgc attaaacact tatttcccat 360
ggcttgctga gtactcctgt actcaccctt gctctatata aatatctccc ccccagttgc 420
tgaagaagat gaagcggatc ccgctgacga ggagttcttc caggagcaag ccggctacga 480
tgagttttag agtttcggcc tagttcccaa gtcacgcctg tgatgtttgg tccaagtctt 540
ggcttccact tcccttttgc aatgcagttg tgagctcggg atctgtccgc agcccaacat 600
gactgtactc ctactctata ataaagagac ctctgttgct gtgatattct gtcttcctgt 660
gataccagca ctgtttcctg ggactggtat cgattaacag gttaatttgg agcgtcacgg 720
gctagttccg gtcgggacta gttcggggcg tgacaattat tgatttaatg agactaattt 780
ggtgttgtaa atattactat atttatctat aaacttaatc aatcttaaag tagtttgacc 840
ttgaccaaat tcaaaatgag taattataat atgaaacaga ggaagtagta agtaagacct 900
gatacataaa ggccaagctg agcataagtg tatggttaaa ccaaaatttg tggcttaaat 960
tatcatgaat atattgtcca ttctccttgt aatgttacac ggttacaccc atatataaat 1020
atatatgcct ttatattaca ctgtcgcaca tctcccagaa gtgatagcat agtgtaactc 1080
tttatataaa cgaaatgaag ataacaatta tatatggttt ttctgagaat cttcagttaa 1140
ttaattagca ctccaagtta aactgaagat aagagtagct agcagcaacc aactagctag 1200
tcagcattga tgccacatct tatcagtcga ataacccatt gacagtattc tccctactgg 1260
tctctagtct ctacacatcc atgtacaatg catgcatgca tgcacatcga ttgttgtcgg 1320
tacacaagca ctagctctgc tagacagggg ttaacacaag tagtaaaagc ctaggagctg 1380
cagatcagag aagttccagc tgactcccac aaaccttgac ttggacggct ctgatcatgc 1440
atcctcttct cctcaggtag ccaaaaagag acatgacaaa gttgcaaaac ccatcggcag 1500
tatgtgctca ctgcattttc ccggcaaagc agagagaaaa ttaaaaagac gacgcagaca 1560
tatagccctt tctttctctc tctcctttag ccggaagtgg aatattaaac aagctggaaa 1620
catacaagcc agcactgctc gcaacaacaa cattcagaag agagagaagt atagagagag 1680
agaggggagc atgagtcaga tccatgatcc atcaatggca ccacacagtc cacacttggg 1740
catctgggcg agacgagacg actaatccaa cttcgatagc aacggttgct gctagctgct 1800
gtgctgaaca gtgcagcgtc gtgcagctat atgcctatat atatccctca aaactcattg 1860
cctctcctca tcacagccac aacacctagc tagctgcagc ttgtgtgcga gctactcctg 1920
cagctagcta ctagctacag ccaaagatta ccagcaacag aaattaactg tgtgagacgt 1980
cgatcagatc gttcgagaga 2000
<210> 2
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Os02g0768300P-ENTR-F
<400> 2
gccgccccct tcacctgggc ggatgtgagg tgattc 36
<210> 3
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Os02g0768300P-ENTR-R
<400> 3
tcggcgcgcc caccctttct ctcgaacgat ctgatc 36
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GUSA-Anti
<400> 4
cgcgatccag actgaatgcc c 21
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> OsRP4-1923F
<400> 5
gctagctact agctacagcc 20
Claims (11)
- 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진, 식물의 뿌리에서 특이적으로 발현을 유도하는 프로모터.
- 제 1항에 있어서,
상기 뿌리는 관다발 중심주(vascular cylinder)인 것을 특징으로 하는, 프로모터. - 제 1항에 있어서,
상기 프로모터는 식물호르몬 또는 염 스트레스에 의해 특이적으로 발현을 유도하는 것을 특징으로 하는, 프로모터. - 제 3항에 있어서,
상기 식물호르몬은 앱시스산(abscisic acid, ABA) 또는 옥신(auxin)인 것을 특징으로 하는, 프로모터. - 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항의 프로모터와 작동 가능하게 연결된 목적 단백질을 코딩하는 외래 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
- 제 5항의 재조합 벡터로 형질전환된 아그로박테리움(Agrobacterium).
- 제 5항의 재조합 벡터 또는 제 6항의 아그로박테리움으로 형질전환된 형질전환 식물체.
- 제 7항에 있어서,
상기 식물체는 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 밀, 팥, 귀리 및 수수로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 형질전환 식물체. - 제 5항의 재조합 벡터로 식물을 형질전환시켜 목적 단백질을 코딩하는 외래 유전자를 식물체에 발현시키는 단계를 포함하는 형질전환 식물체의 제조방법.
- 제 9항에 있어서,
상기 목적 단백질을 코딩하는 외래 유전자는 식물의 뿌리에서 특이적으로 발현되는 것을 특징으로 하는, 형질전환 식물체의 제조방법. - 제 10항에 있어서,
상기 뿌리는 관다발 중심주(vascular cylinder)인 것을 특징으로 하는, 형질전환 식물체의 제조방법.
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| US7868149B2 (en) * | 1999-07-20 | 2011-01-11 | Monsanto Technology Llc | Plant genome sequence and uses thereof |
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-
2021
- 2021-06-10 KR KR1020210075542A patent/KR102691640B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (1)
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