JP2021520206A - Chk遺伝子の過剰発現による改良されたシュート再生 - Google Patents
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Abstract
Description
本明細書で定義した植物細胞を、サイトカイニンを含む培地でインキュベートするステップと;
植物細胞を植物に再生させるステップと
を含む、植物を再生する方法に関する。
本発明の方法、組成物、使用及び他の態様に関係する様々な用語は、本明細書及び特許請求の範囲を通じて使用される。そのような用語は、別段の指示のない限り、本発明が関係する技術分野におけるそれらの通常の意味を与えられるものとする。他の詳細に定義された用語は、本明細書で提供された定義と一致する形で解釈されるものとする。
本発明の方法は、本発明の方法のヒスチジンキナーゼの過剰発現又はデノボ発現を試験するステップをさらに含んでいてもよい。言い換えると、本発明はまた、
a)植物細胞において本明細書で定義したヒスチジンキナーゼの発現を増加又は導入するステップと;
b)植物細胞における前記ヒスチジンキナーゼの発現レベルを検出するステップと
を含む、植物細胞のサイトカイニン誘導性再生能力を改良する方法も提供する。
したがって、本発明はまた、
a)植物細胞において本明細書で定義したヒスチジンキナーゼの発現を増加又は導入するステップと;
b)植物細胞における前記ヒスチジンキナーゼの発現レベルを任意選択で検出し、ヒスチジンキナーゼの増加又は導入された発現を有する植物細胞を任意選択で選択するステップと;
c)本明細書で定義したサイトカイニンを含む培地中で、植物細胞、任意選択でステップb)で選択した植物細胞をインキュベートするステップと;
d)植物細胞を植物に再生させることを可能にするステップと
を含む、植物を再生する方法に関する。
シロイヌナズナ(Arabidopsis)CHK2遺伝子(AT5G35750)のコード配列は、テンプレートとしてのシロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)Col−0ゲノムDNAからのCHK2特異的フォワードプライマー14_04109及びリバースプライマー14_04110を使用し、PCRにより増幅させた。第2のPCR増幅は、プライマー14_04116(フォワード)及び14_04117(リバース)で実施して、断片の末端にGatewayクローニングattB部位を組み込んだ。増幅産物をゲルから精製し、標準のGateway BP反応クローニング(thermofisher)によって、pDONR221ドナーベクター(Invitrogen(商標))にクローニングした。
シロイヌナズナCHK4遺伝子(AT2G01830)のコード配列は、テンプレートとしてのシロイヌナズナCol−0ゲノムDNAからのCHK4特異的フォワードプライマー14_04106及びリバースプライマー14_04107を使用し、PCRにより増幅させた。第2の増幅は、プライマー14_04114(フォワード)及び14_04115(リバース)で実施して、断片の末端にGatewayクローニングattB部位を組み込んだ。増幅産物をゲルから精製し、標準のGateway BP反応クローニング(thermofisher)によって、pDONR221ドナーベクター(Invitrogen(商標))にクローニングした。
そのネイティブ2kbプロモーターの調節下にあるシロイヌナズナCHK2遺伝子の発現構築物は、実施例1で説明したエントリーベクターからのCHK2プロモーター断片及びCHK2コード配列断片を、シングルステップLRクローニング反応(ThermoFisher)により、マルチサイトGatewayデスティネーションベクターpK7m24gw,3に組み合わせることによって得られた。
CHK構築物のいずれか(pKG9785又はpKG9791)が安定的に組み込まれたトランスジェニック植物は、Clough及びBent(Plant J. 16 (6):735〜743、1998)のプロトコルに従い、フローラルディップ法を使用して、シロイヌナズナCol−0植物を形質転換することにより得た。陽性形質転換体は、気相(Clough及びBent、1998、Plant J. 16(6):735〜743)を使用してT1後代種子を滅菌し、50mg.L−1のカナマイシンを補充した0.5MS10培養培地(これは100g.L−1のスクロースを含有する、Murashige及びSkoog、1962、Physiol.Plant.15:473〜497に従ったMS培地濃度の半分である)上でin vitroで種子を発芽させ、カナマイシン耐性苗を選択することによって得た。続いて、各構築物の複数の独立したカナマイシン耐性苗を土壌に移し、自家受粉させてT2種子を得た。種子は気相を使用して滅菌し、50mg.L−1のカナマイシンを補充した0.5MS10プレートに播種した。2週間後、実生がカナマイシン耐性又は感受性について単離されなかったT3株はホモ接合体であると考えられ、再生アッセイにおいて使用した。選択されたトランスジェニック株における導入遺伝子の発現レベルは、全インビトロ実生から抽出されたRNAを使用してqRT−PCRによりチェックされ、非形質転換のCol−0対照植物における内因性CHK遺伝子の発現レベルと比較した。qRT−PCRで使用したプライマーは、AtCHK4については17_03894(フォワードプライマー)及び17_03895(リバースプライマー)であり、AtCHK2については17_03890(フォワードプライマー)及び17_03891(リバースプライマー)であった。それぞれの構築物について、ホモ接合体植物株は、それらの再生能力について試験される中程度発現から強発現レベルで選択した。
使用される再生アッセイは、Toら(Plant Cell 16:658〜671、2004、これは参照により本明細書に組み込まれる)によって開示されているシュート開始アッセイに基づいている。試験された株のシロイヌナズナの実生を、3〜4日間暗所にて、次いで3日間薄明りにおいて、垂直に置かれた正方形プレート中の0.5MS10培養培地で成長させ、伸長した堅い胚軸を得た。長さが約7mmの胚軸を実生から切除した。胚軸外植片を、キネチン(300ng.mL−1)及びNAA(100ng.mL−1)を含有する1%(w/v)スクロース及び0.4%(w/v)フィタゲル(phytagel)を補充したMS培地(Murashige及びSkoog、1962、Physiol.Plant.15:473〜497)に移し、7週間25℃で、16時間明期/8時間暗期で維持した。それぞれのトランスジェニック株について、10個の個々の外植片を、5個のシロイヌナズナCol−0の非形質転換(陰性)対照外植片と、再生の陽性対照として有用である5個のシロイヌナズナarr3,4,5,6,8,9六重変異体の外植片も含まれている単一の正方形プレートで試験した。この変異体は、これらの条件下で、高効率で再生することが知られている(Toら、2004、Plant Cell 16:658〜671)。それぞれの実験において、4つの独立したプレートをアッセイし、実験を二つ組で実施した。シュート再生率は、7週間の成長後に形成された花序シュートの数に基づいて決定された。
オルソロジー検索は、複数のタンパク質配列アラインメントソフトウェアJackHMMER(http://hmmer.org,バージョン3.2.1;2018年6月;Johnsonら、BMC Bioinformatics、11:431、2010、 doi: 10.1186/1471−2105−11−431)を使用して、15の植物プロテオームデータベースでAtCHK2遺伝子及びAtCHK4遺伝子(AT5G35750及びAT2G0183)のクエリーにより実施した。JackHMMERブラスト検索は、MEME Suiteモチーフベース配列分析(http://meme−suite.org/index.html; Meme Suite 4.12.0.、2017年6月; Baileyら、Nucl.Acids Res. 37: W2302−W208、2009、 doi.org/10.1093/nar/gkp335)により補い、既知のタンパク質ドメインを同定及び視覚化した。オルソロジー検索により、クエリーとしてのAtCHK2遺伝子及びAtCHK4遺伝子の両方に対するトマトゲノム内の単一候補遺伝子が明らかになり、アミノ酸同一性は>50%であった。これらのトマト遺伝子は、AtCHK2及びAtCHK4の最も可能性のある相同体として、それぞれ、Solyc07g047770(SlyCHK2)及びSolyc07g0081 10(SlyCHK4)である。Solyc07g047770(SlyCHK2)をさらなる研究のために選択した。
2kbのそのネイティブプロモーター配列を含むSlyCHK2の機能的発現カセットをin silicoで設計した。ノパリンシンターゼターミネーター及びGatewayアダプターを配列に追加して、Gatewayデスティネーションベクターに直接クローニングするためのクローニング断片を作製した。カセットの合成は、GeneART(www.thermofisher.com)に発注した。カセットの完全配列を配列番号32に示す。断片は、シングルステップLRクローニング反応(www.thermofisher.com)によって、GatewayバイナリーデスティネーションベクターpKm43GW(Karimiら、Plant Physiol.145:1144〜1154、2007, doi.org/10.1104/pp.107.106989)に導入された。pKm43GWは、細菌選択用のストレプトマイシン耐性マーカー及びスペクチノマイシン耐性マーカーと、カナマイシンで植物組織を選択するためのnptll遺伝子を含むGatewayマルチサイトバイナリーデスティネーションベクターである。得られたプラスミド構築物をpKG10867と命名し、大腸菌(E.coli)にクローニングし、EcoRVとNheIの組合せを使用する制限酵素消化によってチェックした。MiniprepプラスミドDNAは、アグロバクテリウム・チュメファシエンスGV3101株にエレクトロポレーションした。
そのネイティブプロモーター下のSlyCHK2を、アグロバクテリウム媒介性形質転換によって、トマト栽培品種Moneyberg−Plus(TMV耐性)に導入した。約50個のトマト種子を滅菌し、1/2MS10培地で11日間、発芽させた。実生からの子葉外植片を切除し、40μg.l−1のアセトシリンゴンを補充した2N1B培地(=2mg.l−1のNAA及び1mg.l−1のBAPを含有するMS20培地)で24時間前培養した。外植片を、20mg.l−1のストレプトマイシン及び50mg.l−1のスペクチノマイシンを含有するTY培地で一晩増殖させたpKG10867を担持するアグロバクテリウム・ツメファシエンスGV3101の懸濁液に沈め、OD600 0.138に希釈した。外植片を拭き取って乾燥させ、40μg.l−1のアセトシリンゴンを含む2N1Bプレート上で2日間共培養した。続いて、外植片を、1mg.l−1のゼアチン、200mg.l−1のバンコマイシン、200mg.l−1のセフォタキシム及び100mg.l−1のカナマイシンを含むMS20培地からなる選択培地MS20ZVCKに移し、グロースチャンバー内で25℃及び3000ルクス(光周期16/8時間)にて培養した。外植片は、3週間ごとに新鮮な培地に継代培養した。カルスが選択培地上に形成された場合、カルスを継代培養し、元の外植片は廃棄した。
3週間ごとに新鮮な培地MS20ZCVKに継代培養されたトマトのカルスは、実験の114日目からシュート分裂組織及びシュートの生成が開始された。長さが5mmを超えるシュートをカルスから採取し、MS20からなる発根培地にいずれの添加剤も加えずに移した。このように回収されたシュートの累積数を記録し(表4)、アグロバクテリウム・ツメファシエンスと接触されておらず、カナマイシン非含有培地で成長させて同様に栽培したトマトMoneyberg子葉外植片と比較した。pKG10867形質転換後にカナマイシン耐性カルスから回収されたシュートは、対照のトマト外植片から再生するシュートよりも、より速く多数出現することが明らかである。この効果は、SlyCHK2遺伝子の異所性発現に起因する。
Claims (15)
- 植物細胞のサイトカイニン誘導性再生能力を改良する方法であって、植物細胞におけるヒスチジンキナーゼの発現を増加又は導入するステップを含み、ヒスチジンキナーゼがCHK4、CHK2及びCHK3のうちの少なくとも1つであり、好ましくは、ヒスチジンキナーゼがCHK4及びCHK2のうちの少なくとも1つであり、好ましくは、ヒスチジンキナーゼがCHK4である、方法。
- ヒスチジンキナーゼが、配列番号3、配列番号1及び配列番号2のうちの少なくとも1つと少なくとも50%の配列同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされており、好ましくは、ヌクレオチド配列が配列番号3と少なくとも50%の配列同一性を有する、請求項1に記載の方法。
- 植物細胞の再生能力が、ヒスチジンキナーゼの増加又は導入された発現を有していない同一の植物細胞と比較して改良されている、請求項1又は請求項2に記載の方法。
- ヒスチジンキナーゼのアミノ酸配列が、配列番号6、配列番号4及び配列番号5のうちの少なくとも1つと少なくとも50%の配列同一性を有し、好ましくは、ヒスチジンキナーゼのアミノ酸配列が配列番号6と少なくとも50%の配列同一性を有する、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- ヒスチジンキナーゼの発現が植物細胞において一過的に増加又は導入される、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- ヒスチジンキナーゼの発現が植物細胞において連続的に増加又は導入される、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 植物細胞がオオムギ、キャベツ、キャノーラ、カッサバ、カリフラワー、チコリ、ワタ、キュウリ、ナス、ブドウ、トウガラシ、レタス、トウモロコシ、メロン、ナタネ、ジャガイモ、カボチャ、イネ、ライムギ、モロコシ、西洋カボチャ、サトウキビ、サトウダイコン、ヒマワリ、アマトウガラシ、トマト、スイカ、コムギ、ズッキーニ、ダイズ、キク、及びシロイヌナズナからなる群から選択される植物から得ることができる、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- サイトカイニンがアデニン型サイトカイニンであり、好ましくは、アデニン型サイトカイニンがキネチン、ゼアチン、トランス−ゼアチン、シス−ゼアチン、ジヒドロゼアチン、6−ベンジルアミノプリン及び2iPからなる群から選択される、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項1〜8のいずれか一項で定義した植物細胞を、サイトカイニンを含む培地でインキュベートするステップと;
植物細胞を植物に再生させるステップと
を含む、植物を再生する方法。 - 培地が少なくとも1つのさらなる植物ホルモンを含み、好ましくは、1つのさらなる植物ホルモンがオーキシンである、請求項9に記載の方法。
- 植物細胞が多細胞組織、好ましくはカルス組織、植物器官又は外植片の一部であり、好ましくは外植片が胚軸外植片、茎部外植片、子葉外植片、根外植片、葉外植片、花外植片及び分裂組織のうちの少なくとも1つである、請求項9又は請求項10に記載の方法。
- 培地中のサイトカイニン濃度が約100〜3000ng/mlであり、好ましくは、サイトカイニン濃度が約200〜600ng/mlである、請求項9〜11のいずれか一項に記載の方法。
- 配列番号3と少なくとも50%の配列同一性を有する第1のヌクレオチド配列と、配列番号1と少なくとも50%の配列同一性を有する第2のヌクレオチド配列とを含む発現構築物であって、好ましくは第1のヌクレオチド配列と第2のヌクレオチド配列のうちの少なくとも1つが調節エレメントに作動可能に連結されている、発現構築物。
- 好ましくは、植物部分が種子、果実、又は非増殖材料である、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法によって得ることができる植物又は植物部分。
- 植物のサイトカイニン誘導性再生能力を改良するための、CHK4、CHK2及び/又はCHK3ヒスチジンキナーゼ或いは請求項13に記載の発現構築物の使用。
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