CN113621036B

CN113621036B - 水稻氮代谢调控蛋白are4及其编码基因的应用

Info

Publication number: CN113621036B
Application number: CN202010371608.0A
Authority: CN
Inventors: 左建儒; 马晓辉; 粘金沯; 钱前; 李家洋
Original assignee: Institute of Genetics and Developmental Biology of CAS
Current assignee: Institute of Genetics and Developmental Biology of CAS
Priority date: 2020-05-06
Filing date: 2020-05-06
Publication date: 2023-06-27
Anticipated expiration: 2040-05-06
Also published as: CN113621036A

Abstract

本发明公开了水稻氮代谢调控蛋白ARE4及其编码基因的应用。本发明通过图位克隆的技术方法，鉴定到一个调控氮代谢的基因ARE4，并通过转基因实验验证了该基因的功能。将本发明保护的基因在水稻中过表达后，水稻株高升高，生物量增加，产量增加；而功能缺失或降低后，水稻株高降低，生物量减少，产量降低，说明该基因可以调控水稻的生物量及产量。因此，本发明对于培育高产水稻新品种具有重要意义和应用价值。

Description

水稻氮代谢调控蛋白ARE4及其编码基因的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及水稻氮代谢调控蛋白ARE4及其编码基因的应用。

背景技术

植物的生长发育需要多种营养元素，其中氮素(N)尤为重要，一般植物的含氮量约占其干重的0.3％-5％，大多数非豆科作物生产1千克的干物质需要根系吸收约20-50 克的氮，因此在农业生产中，土壤中氮的含量往往是限制作物产量的关键因素。在过去的五十多年间，由于作物育种的发展以及大量化学氮肥的使用，全球粮食产量得到了大幅度的提高，但同时伴随着能源消耗、农业生产成本增加和环境污染等问题。因此，提高作物氮利用效率(NUE)是实现农业可持续发展的有效途径之一，在开展农作物应用基础和应用研究方面，越来越多的科学家致力于能够改善和提高NUE的新基因克隆、功能解析和优良等位变异发掘。

氮利用效率是指单位氮元素供应下植物的生物量或者籽粒产量，主要包括两个生理指标，氮吸收效率(nitrogen uptake efficiency,NUpE)和氮同化效率(nitrogenutilization efficiency,NUtE)。氮吸收效率主要衡量植物根系从根围土壤获取氮素的能力。植物根系从土壤中吸收无机态氮源的主要形式是硝酸盐(NO₃ ^-)和铵盐(NH₄ ⁺)，由于生长环境的不同，植物对硝酸盐和铵盐的吸收具有偏好性。例如，生长在典型缺氧环境水田的水稻偏好吸收铵盐。植物根系吸收土壤中硝酸盐和铵盐主要依赖位于根系细胞膜上的硝酸根转运蛋白(nitrate transporter,NRT)及铵根转运蛋白(ammonium transporter,AMT)完成。NRTs根据其对NO₃ ^-的亲和性可分为高亲和性和低亲和性两类，当植物处于高浓度氮源的生长条件下，低亲和性NRTs(NRT1家族蛋白)起主要作用，而当植物生长于低浓度氮含量的条件下，高亲和性NRTs(NRT2.1,NRT2.2,NRT2.4)起主要作用。NO₃ ^-被植物根系吸收后，一部分直接进入同化作用或储存在液泡中，另一部分则依靠蒸腾作用被转运至地上部分同化为有机氮，拟南芥中低亲和性硝酸根转运蛋白 AtNRT1.5、AtNRT1.8、AtNRT1.9在NO₃ ^-的转运过程中发挥作用。在拟南芥中，至少存在6个铵根转运蛋白AMTs，在NH₄ ⁺吸收转运过程中多以同源或异源多聚体的形式发挥功能，其中AtAMT1.1、AtAMT1.3、AtAMT1.5的表达受低氮条件诱导。

植物从土壤中吸收的NH₄ ⁺可以直接进入氮同化作用，而体内的NO₃ ^-需由细胞质中的硝酸还原酶(nitrate reductase,NR)和叶绿体中的亚硝酸还原酶(nitrite reductase,NiR)先后催化还原为NH₄ ⁺。NH₄ ⁺通过谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase,GS)和谷氨酸合酶(glutamine-2-oxoglutarate aminotransferase,GOGAT)组成的循环反应同化为谷氨酰胺和谷氨酸，是植物氮同化过程的关键环节。植物中的GS存在两类同工酶：定位在细胞质中的GS1和定位在叶绿体中的GS2。植物中的GOGAT也存在两种形式，根据其电子供体不同分为依赖铁氧还蛋白的谷氨酸合酶(Fd-GOGAT)和依赖烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的谷氨酸合酶(NADH-dependent glutamate synthase,NADH-GOGAT)，其中 Fd-GOGAT定位在叶绿体基质，主要在叶片等绿色组织中特异表达，而NADH-GOGAT则定位于细胞质。研究表明，植物体内GS/GOGAT循环中定位于叶绿体的GS2/Fd-GOGAT 主要参与叶片中对光呼吸产生NH₄ ⁺的再同化，定位于细胞质的GS1/NADH-GOGAT主要参与根中氮素的初级同化及维管束中氮的转运。除了GS/GOGAT循环，细胞质定位的天冬酰胺合成酶(asparagine synthetase,AS)及线粒体中依赖NADH的谷氨酸脱氢酶 (glutamate dehydrogenase,GDH)等也参与植物的氮同化过程。

植物对氮的吸收与同化过程需要不断消耗ATP、NAD(P)H及碳骨架，这些物质大部分由碳代谢过程提供。碳代谢过程主要包括光合作用驱动的糖合成代谢及呼吸作用介导的糖分解代谢。植物利用光合作用将光能转变为化学能ATP和还原力NADPH后驱动 CO₂经过一系列酶促反应合成糖类等有机物，呼吸作用则通过糖酵解途径、三羧酸循环途径及光呼吸途径等，以光合作用(中间)产物为底物分解生成氮吸收、同化及氨基酸合成等其它生物学过程所需的碳骨架、ATP和NAD(P)H等。当植物处于高光、高温或低CO₂条件下，光合作用过程中的关键酶1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶 (ribulose-1,5-bisphosphatecarboxylase/oxygenase,RuBisCO)的氧化活性升高，植物进行光呼吸作用释放大量CO₂和NH₃，过量NH₄ ⁺的积累会对细胞产生毒害作用，因此定位于叶绿体的GS2/Fd-GOGAT循环对光呼吸产生NH₄ ⁺进行再同化。研究表明，光呼吸作用产生的NH₄ ⁺约为植物初级氮同化从土壤中获取NH₄ ⁺的10倍，是植物有机氮的重要来源。三羧酸循环的重要中间产物α-酮戊二酸(2-OG)是氮同化GS/GOGAT循环的反应底物，通常认为2-OG是植物体内碳代谢与氮代谢的连接点。同时氮代谢在维持碳代谢效率及稳定中也发挥重要作用，植物光合作用固定的CO₂分配到蔗糖、淀粉或有机酸等代谢物中的比例受氮代谢调控。碳代谢与氮代谢之间的相互作用不仅仅依赖于代谢产物之间的相互调控，同时也涉及碳代谢产生的糖、氨基酸、NO₃ ^-及NH₄ ⁺等多种内源信号之间的相互影响。

目前有研究报道bZIP、Dof、NLP7等转录因子在碳代谢和氮代谢过程中存在调控作用。其中，HY5(elongated hypocotyl 5)是bZIP类转录因子，是促进光形态建成的重要调控因子，参与光、激素等调控的植物根系生长、种子发芽后下胚轴伸长、色素生物合成等生长发育进程。HY5也能够促进植物地上部分光合产物的运输并能作为信号分子从地上部分移动到根系中，促进根系对硝酸盐的吸收转运，维持植物体内的碳氮平衡，实现地上部分与地下部分之间的信号交流转录因子是植物特有的一类转录因子，在种子萌发、光响应、生物胁迫、碳氮代谢等生长发育过程中发挥重要作用。Dof蛋白被认为是有机酸代谢过程中多个关键基因的活化剂，玉米Dof1是磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvatecarboxylase,PEPC)基因的激活剂，能够激活碳骨架合成过程中多个基因的表达，在拟南芥中过表达玉米Dof1基因能够在缺氮条件下提高转基因植物中的氮同化效率，总氮含量增加30％。NLP(NIN-like protein)是硝酸盐信号过程中的重要调节因子，能够感知硝酸盐信号并结合到硝酸盐响应元件上，进而激活一系列硝酸盐诱导基因的表达。有研究报道NLP7也能够调控OPPP (oxidative pentose phosphate pathway)途径的关键基因PGD(6-phosphogluconate dehydrogenase)的表达，而OPPP途径及其代谢(中间)产物在拟南芥中能够提高硝酸盐转运蛋白NRT2.1的积累水平和转运活性，这种调控作用是不依赖于HXK1(hexokinase 1)介导的葡萄糖信号传导过程的，暗示可能通过某种转录后调控机制来影响硝酸盐的吸收。

因此，挖掘更多的调控氮代谢和碳代谢相互作用的转录因子及新基因，能够进一步阐明植物体内碳氮代谢平衡的分子机理，对氮素高效利用、环境适应性和提高作物产量等具有重要理论指导意义和农业育种应用价值。

发明内容

本发明一个目的是提供如下1)-3)中任一种物质的用途。

本发明提供了如下a1)-a3)中任一种物质在如下b1-b6中至少一种中的应用；

a1)蛋白ARE4；

a2)编码蛋白ARE4的核酸分子；

a3)含有编码蛋白ARE4的核酸分子的重组载体、表达盒或重组菌；

所述蛋白ARE4为如下(c1)-(c5)中任一种：

c1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

c2)由序列表中序列7所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

c3)由序列表中序列7第227位至第544位所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

c4)由c1)-c3)任一种蛋白质的氨基酸序列的末端添加标签序列组成的蛋白质；

c5)将c1)-c3)任一种蛋白质的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由c1)-c3)任一种衍生的蛋白质；

b1、调控植物氮代谢；

b2、调控植物株高；

b3、调控植物生物量；

b4、调控植物产量；

b5、调控植物对硝酸盐的吸收或转运能力；

b6、调控目的基因转录。

上述c2)或c3)中的ARE4蛋白能够通过大肠杆菌生物系统表达得到，该蛋白的白编码基因可由序列表中序列2所示的ARE4的编码基因经过密码子优化得到序列3 所示的核苷酸序列。为了使c3)中的ARE4蛋白便于纯化，可在由c3)所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端连接图表1所示的标签，得到c2)。

表1为标签序列

上述c2)中的ARE4蛋白可以先合成其编码基因，再进行大肠杆菌生物系统表达得到。上述c3)中的ARE4的编码基因可通过将序列表中序列3所示的DNA序列中缺失或添加一个或几个氨基酸残基的密码子和/或在其氨基末端连接表1所示的标签的DNA 编码序列得到。

上述应用中，所述编码蛋白ARE4的核酸分子是如下d1)-d6)中任一种的DNA分子：

d1)编码区为序列表中序列2所示的DNA分子；

d2)编码区为序列表中序列3所示的DNA分子；

d3)编码区为序列表中序列2的自5’末端第388位到第1341位所示；

d4)编码区为序列表中序列3的自5’末端第391位到第1344位所示；

d5)编码区为序列表中序列4所示的DNA分子；

d6)在严格条件下与d1)-d5)中任一种限定的DNA序列杂交且编码具有相同功能蛋白质的DNA分子；

d7)与d1)-d5)中任一种限定的DNA序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且编码具有相同功能蛋白质的DNA分子。

上述严格条件可为用0.1×SSC，0.1％SDS的缓冲液，在DNA或RNA杂交试验中， 65℃杂交并洗膜。

所述重组载体可用现有的大肠杆菌表达载体或植物表达载体构建；所述的大肠杆菌表达载体包括pGEX-4T-1、pGEX-4T-2、pGEX-4T-3或其它衍生细菌表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等，如pCAMBIA1300、pCAMBIA1301、pGreen0800、pTCK303或其它衍生植物表达载体。所述植物表达载体还可包含ARE4基因的启动子区域和/或5’端非翻译区域和/或3’端非翻译区域。使用所述基因构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，例如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、泛素基因 Ubiquitin启动子(pUbi)等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因细胞或组织或植物进行鉴定及筛选，可对所用重组表达载体进行加工或改造，如加入具有抗性的抗生素标记物(潮霉素基因标记物、卡那霉素标记物等)或可在植物中表达编码产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GFP 基因、GUS基因等)。

在本发明中，所述重组载体中启动所述编码基因转录的启动子具体为泛素基因Ubiquitin启动子(pUbi)(序列6第1位到第1981位)或水稻ARE4基因的内源启动子(序列5)。

上述应用中，所述调控植物氮代谢为促进植物氮代谢；具体体现在促进植物对硝酸盐的吸收或转运；上述促进植物对硝酸盐的吸收或转运通过如下1)和/或 2)体现:1)提高植物对硝酸盐的吸收活性及转运速率；2)提高植物中氮吸收转运相关基因的表达，这些基因具体可为OsNRT2.1、OsNRT2.2、OsNRT2.4基因。

或，所述调控植物株高为提高植物株高；

或，所述调控植物生物量为增加植物生物量；上述增加植物生物量体现在提高植物株高。

或，所述调控植物产量为增加植物产量；上述增加植物产量具体为增加植物单株产量。

或，所述调控植物对硝酸盐的吸收或转运能力为提高植物对硝酸盐的吸收或转运能力；

或，所述调控目的基因转录为促进目的基因转录，具体体现在激活目的基因启动子表达。

上述应用中，所述促进植物氮代谢为促进植物对硝酸盐吸收或转运。

上述第一个目的中的物质在培育如下B1-B5所示植物中的应用也是本发明保护的范围：

B1、氮代谢快的植物；

B2、高株高的植物；

B3、高生物量的植物；

B4、高产的植物；

B5、对硝酸盐的吸收或转运能力提高的植物。

在实际应用中，当所选育株高增高和/或单株产量增加的水稻品种时，需将所述基因或其编码蛋白质表达量较高的转基因水稻作为亲本进行杂交。

本发明另一个目的是抑制植物中蛋白ARE4含量或活性的物质的用途。

本发明提供了抑制植物中蛋白ARE4含量或活性的物质在如下C1-C5中至少一种中的应用；

或本发明提供了抑制植物中蛋白ARE4的编码基因表达的物质在如下C1-C5中至少一种中的应用；

C1、降低植物氮代谢；

C2、降低植物株高；

C3、降低植物生物量；

C4、降低植物产量；

C5、降低植物对硝酸盐的吸收或转运能力；上述降低植物对硝酸盐的吸收或转运通过如下1)和/或2)体现:1)降低植物对硝酸盐的吸收活性及转运速率；2) 降低植物中氮吸收转运相关基因的表达，这些基因具体可为OsNRT2.1、OsNRT2.2、 OsNRT2.4基因。

所述蛋白ARE4为如下(c1)-(c5)中任一种：

c1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

c2)由序列表中序列7所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

c5)将c1)-c3)任一种蛋白质的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由c1)-c3)任一种衍生的蛋白质。

本发明还有个目的是提供一种培育转基因植物的方法。

本发明提供的方法，为如下1)或2)：

1)所述的方法包括如下步骤：提高目的植物中蛋白ARE4的含量和/或活性，得到转基因植物；

2)所述的方法包括如下步骤：提高目的植物中编码蛋白ARE4的核酸分子的表达，得到转基因植物；

所述转基因植物具有如下D1-D5至少一种表型：

D1、所述转基因植物的氮代谢快于所述目的植物；

D2、所述转基因植物的株高高于所述目的植物；

D3、所述转基因植物的生物量大于所述目的植物；

D4、所述转基因植物的产量大于所述目的植物；

D5、所述转基因植物对硝酸盐的吸收或转运能力大于所述目的植物；

所述蛋白ARE4为如下(c1)-(c5)中任一种：

c1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

c2)由序列表中序列7所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

本发明还有一个目的是提供一种培育转基因植物的方法。

本发明提供的方法，为如下1)或2)：

1)所述的方法包括如下步骤：抑制或降低目的植物中蛋白ARE4的含量和/或活性，得到转基因植物；

2)所述的方法包括如下步骤：抑制或降低目的植物中编码蛋白ARE4的核酸分子的表达，得到转基因植物；

所述转基因植物具有如下E1-E5至少一种表型：

E1、所述转基因植物的氮代谢慢于所述目的植物；

E2、所述转基因植物的株高低于所述目的植物；

E3、所述转基因植物的生物量小于所述目的植物；

E4、所述转基因植物的产量小于所述目的植物；

E5、所述转基因植物对硝酸盐的吸收或转运能力小于所述目的植物；

所述蛋白ARE4为如下(c1)-(c5)中任一种：

c1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

c2)由序列表中序列7所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

上述方法中，所述植物为双子叶植物或单子叶植物。

蛋白ARE4在作为转录因子中的应用也是本发明保护的范围；

所述蛋白ARE4为如下(c1)-(c5)中任一种：

c1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

c2)由序列表中序列7所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

本发明通过图位克隆的技术方法，鉴定到一个调控氮代谢的基因ARE4，并通过转基因实验验证了该基因的功能。将该基因在水稻中过表达后，水稻株高升高，生物量增加，产量增加；而该基因功能缺失或降低后，水稻株高降低，生物量减少，产量降低，说明该基因可以调控水稻的生物量及产量。因此，本发明对于培育高产水稻新品种具有重要意义和应用价值。

附图说明

图1为abc1-1 are4-1双突变体与are4-1单突变体的表型分析；图1a为水稻在灌浆期的表型(标尺为15cm)；图1b为水稻在灌浆期株高的定量分析，数值表示平均值±标准偏差，样本量为40；图1c为水稻在灌浆期分蘖数的定量分析，数值表示平均值±标准偏差，样本量为40；其中，WT为野生型粳稻品种日本晴，abc1-1是日本晴背景下的单突变体，abc1-1are4-1是日本晴背景下的双突变体，are4-1是日本晴背景下的单突变体。

图2为ARE4基因的图位克隆；图2a是利用水稻籼稻品种南京6号与are4-1突变体的BC₂F₂进行的遗传定位图；图2b是精细定位图谱，下面标记数字代表重组个体数；图2c表示109kb区域内预测的基因，黑色实心箭头代表预测的基因；图2d代表本发明克隆的ARE4基因的结构示意图，黑色方框代表外显子，白色空心箭头代表3’非翻译区，中间横线代表内含子；黑色细线箭头指示are4-1突变体中发生单核苷酸替换的突变位点及造成的编码氨基酸改变。

图3为ARE4基因的遗传互补验证；图3a为水稻在灌浆期的表型(标尺为15cm)；

图3b为水稻在灌浆期株高的定量分析，pARE4表示将ARE4编码基因转入are4-1突变体得到的T₂代转基因阳性植物，数值表示平均值±标准偏差，样本量为40。

图4为编码硝酸盐转运蛋白基因的表达水平分析；图4a为野生型和are4-1突变体的地上部分中编码硝酸盐转运蛋白基因OsNRT2.1、OsNRT2.2和OsNRT2.4的表达水平；图4b为野生型和are4-1突变体的地下部分中编码硝酸盐转运蛋白基因OsNRT2.1、 OsNRT2.2和OsNRT2.4的表达水平。

图5为不同突变体材料对硝酸盐吸收转运能力分析；图5a表示不同突变体材料对¹⁵N标记硝酸盐的转运能力分析；图5b表示不同突变体材料对¹⁵N标记硝酸盐的吸收能力分析。

图6为ARE4过表达和RNA干扰的水稻转基因植物的表型分析；图6a和图6d为水稻在灌浆期的表型(标尺为15cm)；图6b和图6e为水稻在灌浆期株高的定量分析，数值表示平均值±标准偏差，样本量为40；图6c和图6f为水稻单株产量的定量分析，数值表示平均值±标准偏差，样本量为40。

图7为ARE4重组蛋白与目标核酸探针结合的凝胶迁移实验结果。

图8为ARE4蛋白转录激活目标靶基因表达的双荧光素酶报告检测结果。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，且本发明并不限于以下实施例。

水稻日本晴记载在如下文献中：International Rice Genome SequencingProject &Takuji Sasaki.(2005)The map-based sequence of the rice genome.Nature436, 793-800。

载体pCAMBIA1300，记载在如下文献：Roberts,C.,Rajagopal,S.,Smith,L.M.,Nguyen,T.A.,Yang,W.,Nugrohu,S.,Ravi,K.S.,Vijayachandra,K.,Harcourt, R.L.,Dransfield,L.,et al.(1997).A comprehensive set of modular vectors foradvanced manipulations and efficient transformation of plants.pCAMBIA VectorRelease Manual.

载体pTCK303，记载在如下文献：Wang,Z.,Chen,C.,Xu,Y.,Jiang,R.,Han, Y.,Xu,Z.,and Chong,K.(2004).A practical vector for efficient knockdown of geneexpression in rice(Oryza sativa L.).Plant Mol.Biol.Rep.22,409-417。

载体pGreenII 0800-LUC，记载在如下文献中：Hellens,R.P.,Allan,A.C.,Friel,E.N.,Bolitho,K.,Grafton,K.,Templeton,M.D.,Karunairetnam,S., Gleave,A.P.,and Laing,W.A.(2005).Transient expression vectors for functionalgenomics,quantification of promoter activity and RNA silencing inplants.Plant Methods 1,13。

实施例1、ARE4基因的获得

一、ARE4基因的获得

1、are4-1突变体的分离鉴定与表型分析

ABC1基因编码氮同化过程中的关键酶Fd-GOGAT，在调节氮代谢和碳氮平衡中发挥重要作用(Yang,X.,Nian,J.,Xie,Q.,Feng,J.,Zhang,F.,Jing,H.,Zhang, J.,Dong,G.,Liang,Y.,Peng,J.,et al.(2016).Rice ferredoxin-dependent glutamate synthaseregulates nitrogen-carbon metabolomes and is genetically differentiatedbetween japonica and indicasubspecies.Mol.Plant 9, 1520-1534.)。

为了进一步解析ABC1/Fd-GOGAT调节氮代谢和维持水稻体内碳氮平衡的分子机制，本发明利用EMS诱变筛选abc1-1突变体的抑制突变abc1 repressors(are)，其中abc1-1are4-1双突变体能够部分恢复abc1-1突变体的叶片黄化、株高降低、分蘖减少、结实率低等氮同化异常表型(图1a)。随后，将abc1-1 are4-1双突变体与野生型(日本晴)进行回交后对F2群体进行表型分析，分离鉴定获得are4-1突变体。与野生型相比，are4-1突变体株高降低且单株分蘖数增加(图1b-c)。

2、ARE4基因的图位克隆

本发明将are4-1突变体与野生型材料进行杂交，F₁代植株全部表现为野生型表型， F₂群体植株在幼苗期出现表型分离，分离比接近1:3，表明are4-1突变体是由单个核基因隐性突变造成的。本发明进一步将are4-1突变体与籼稻品种南京6杂交构建遗传定位群体，通过图位克隆方法将ARE4基因初步定位在位于4号染色体约109kb区间内(图2a和图2b)，水稻基因组注释数据库(Rice Genome Annotion Project)预测信息显示该区间内共有13个开放阅读框(open reading frame)(图2c)，随后的测序结果发现只有一个基因LOC_Os04g58020的第二个外显子上发生单碱基突变(G3587A)，造成编码氨基酸由丙氨酸替换为苏氨酸(A312T)，所以将该基因暂定为ARE4候选基因(图 2d)。

本实施例中所涉及的ARE4基因来源于水稻品种日本晴，其基因组序列如序列表中序列4所示，序列4由4432个核苷酸组成，其cDNA序列为序列表中序列2，序列2 由1344个核苷酸组成。序列2和序列4编码序列表中序列1所示的蛋白质(ARE4蛋白)，序列1由447个氨基酸残基组成。内源启动子序列如序列表中序列5所示，序列 5由1843个核苷酸组成。

are4-1突变体与野生型日本晴水稻相比，基因组中序列4所示的ARE4基因第3587位G突变为A，其他核苷酸序列不变。

are4-1突变体与野生型日本晴水稻相比，株高降低且单株分蘖数增加。

二、ARE4基因的转基因遗传互补实验

1、ARE4基因回补转基因水稻的获得

将实施例3中的1制备的重组载体命名为pCAMBIA1300-pUbi::ARE4转入根癌农杆菌EHA105中，得到重组菌EHA105/pCAMBIA1300-pUbi::ARE4。

分别采用上述重组菌侵染are4-1突变体，具体的转化筛选方法参见文献“易自力,曹守云,王力,何锶洁,储成才,唐祚舜,周朴华,田文忠.提高农杆菌转化水稻频率的研究.遗传学报,2001,28(4):352-358”一文，获得T1代ARE4基因回补转基因水稻。

采用实施例3的三的方法PCR初步鉴定鉴定，得到HYG阳性ARE4基因回补转基因水稻。

将HYG阳性ARE4基因回补转基因水稻提取总RNA并反转录cDNA作为模板，采用下述引物序列对通过实时定量荧光PCR检测ARE4基因的转录水平，实验重复3次，结果取平均值。

用于检测ARE4基因表达量的引物序列如下：

qARE4-1F：5’-AGGACGAGCACAGGCTGTT-3’(序列2的第830-848位)；

qARE4-1R：5’-CCTGAGCAGCAGATGTATCTCC-3’(序列2的第1027-1048位的反向互补序列)。

以OsActin1基因作为内参基因，其检测引物对：

OsActin1-F：5’-CAACACCCCTGCTATGTACG-3’；

OsActin1-R：5’-CATCACCAGAGTCCAACACAA-3’。

将内参基因OsActin1基因的表达水平设为1，计算ARE4基因的相对表达量。

以are4-1突变体为对照。

结果显示，与are4-1突变体(ARE4基因的相对表达量为0.89)相比，HYG阳性 ARE4基因回补转基因水稻中ARE4基因的转录水平(ARE4基因的相对表达量为1.74) 显著提高，得到阳性ARE4基因回补转基因水稻(命名为PARE4)。

2、ARE4基因回补转基因水稻表型观察

选取上述阳性ARE4基因回补转基因水稻的种子，播种进行田间表型分析，每种水稻选取2个株系，每个株系40个种子。以are4-1突变体和野生型水稻日本晴(WT) 为对照。

在播种140天后，检测各个植株株高。

结果如图3所示，可以看出,阳性ARE4基因回补转基因水稻的株高恢复为野生型水稻株高。

上述结果表明，ARE4基因可以提高植物株高。

实施例2、ARE4基因在调控氮代谢中的应用

一、are4-1突变体中硝酸盐吸收转运相关基因表达测定

分别取野生型水稻日本晴和are4-1突变体幼苗的地上部分和地下部分，提取植物总RNA反转录获得cDNA，通过qRT-PCR检测硝酸盐吸收转运相关基因的相对表达水平：(1)OsNRT2.1基因(NC_029257，655310-657326，07-AUG-2018)，主要负责硝酸盐的吸收；(2)OsNRT2.2基因(NC_029257，667179-669065，07-AUG-2018),主要负责硝酸盐的吸收；(3)OsNRT2.4基因(NC_029256，20385987-20388532，07-AUG-2018)，主要负责硝酸盐的吸收和转运。

用于检测OsNRT2.1基因的引物对：

OsNRT2.1-F：5’-CACGGTGCAAGTCTCAAG-3’；

OsNRT2.1-R：5’-GGTATAAATGCCTCTCCC-3’。

用于检测OsNRT2.2基因的引物对：

OsNRT2.2-F：5’-TGGAACATTTGGATCCTCC-3’

OsNRT2.2-R：5’-CCATGACGACATACTCTAG-3’。

用于检测OsNRT2.4基因的引物对：

OsNRT2.4-F：5’-AAAGGTCGCTGGGCGTGGTG-3’

OsNRT2.4-R：5’-CCTGGACCCGCTGAAGAAGAG-3’。

以OsActin1基因作为内参基因，其检测引物对：

OsActin1-F：5’-CAACACCCCTGCTATGTACG-3’；

OsActin1-R：5’-CATCACCAGAGTCCAACACAA-3’。

将内参基因OsActin1基因的表达水平设为1，计算OsNRT2.1、OsNRT2.2、OsNRT2.4基因的相对表达量。

结果如图4所示，与野生型水稻材料日本晴(NPB)相比，OsNRT2.1、OsNRT2.2、OsNRT2.4基因在are4-1突变体的地上部分和地下部分的相对表达水平均显著降低 (P<0.01)，表明ARE4基因正调控氮吸收转运相关基因的表达。

二、不同突变体材料对硝酸盐吸收转运能力分析

为了进一步确认ARE4基因是否调控水稻幼苗对硝酸盐的吸收转运，本发明进行了¹⁵N示踪的硝酸盐吸收转运实验。首先，将野生型水稻日本晴、abc1-1突变体、abc1-1are4-1双突变体和are4-1突变体在改良Kimura B营养液(2mM KNO₃，1.8mM KCl， 0.36mMCaCl₂，0.54mM MgSO₄·7H₂O，0.18mM KH₂PO₄，40μM Na₂EDTA-Fe(II)，13.4 μM MnCl₂·4H₂O，18.8μM H₃BO₃，0.03μM Na₂MoO₄·2H₂O，0.3μM ZnSO₄·7H₂O，0.32μM CuSO₄·5H₂O和1.6mMNa₂SiO₃·9H₂O)中培养10天(12h光照/12h黑暗，28℃， 70％湿度)，每天更换新鲜营养液。在进行¹⁵N-KNO₃前先将水稻幼苗的根部在清水中浸洗2次，直接转入含有5mM¹⁵N-KNO₃的改良Kimura B营养液中培养3h。在取样之前，再次将水稻幼苗的根部在0.1mM CaSO₄溶液中浸洗2分钟以除去根系表面残留的¹⁵N-NO₃ ^-，然后将水稻幼苗的地上部分和地下部分分别取样，装入纸袋在65℃烘干后研磨成粉状备用。利用元素质谱分析仪(ICP-MS)测定样品中的¹⁵N含量，每个样品重复4 次(Liu,Y.,Hu,B.,and Chu,C.(2016).15N-nitrate Uptake Activityand Root-to-shoot Transport Assay in Rice.Bio-protocol 6,e1897.)。

¹⁵N标记硝酸盐吸收转运能力测定实验结果如图5所示，与野生型水稻材料日本晴(NPB或WT)相比，are4-1突变体幼苗对硝酸盐的吸收速率及转运速率均降低，且与 abc1-1突变体相比，abc1-1 are4-1双突变体对硝酸盐的吸收速率及转运速率也降低，表明ARE4正调控水稻植株对硝酸盐的吸收和转运(P<0.01)。

上述结果表明，ARE4调控氮代谢，具体为促进硝酸盐吸收或转运；体现在促进硝酸盐吸收或转运相关基因的表达。

实施例3、ARE4转基因植物的获得及表型分析

本实施例中所涉及的ARE4基因来源于水稻品种日本晴，其基因组序列如序列表中序列4所示，序列4由4432个核苷酸组成，其cDNA序列为序列表中序列2，序列2 由1344个核苷酸组成。序列2和序列4编码序列表中序列1所示的ARE4蛋白，序列 1由447个氨基酸残基组成。

一、植物表达载体pCAMBIA1300-pUbi::ARE4的构建

采用CTAB法提取水稻品种日本晴的基因组DNA作为模板，采用下述引物序列对通过PCR扩增，得到泛素基因Ubiquitin启动子(pUbi)。

引物对序列如下：

F：5’-AAGCTTTGCAGCGTGACCCGGTC-3’(下划线部分为HindIII的识别序列)；

R：5’-CTGCAGAAGTAACACCAAACAACAGGGTGA-3’(下划线部分为PstI的识别序列)。

提取水稻品种日本晴的植物总RNA并反转录cDNA作为模板，采用下述引物序列对通过PCR扩增，得到ARE4基因的编码序列CDS(不包含终止密码子)。

引物对序列如下：

F：5’-CTGCAGATGTCCGCGTCTGCATCC-3’(下划线部分为PstI的识别序列，其后的序列为序列表中序列2的第1-18位)；

R：5’-CCCGGGTCCATGAGATGTTGGTGGCG-3’(下划线部分为XmaI的识别序列，其后的序列为序列表中序列2的第1322-1341位的反向互补序列)。

将上述PCR产物泛素基因Ubiquitin启动子(pUbi)和ARE4基因的编码序列CDS分别连接pBluescript SK II(-)载体(Stratagene)后，测序正确后，分别再将泛素基因Ubiquitin启动子(pUbi)经HindIII/PstI双酶切、ARE4基因的编码序列CDS经过 PstI/BamHI双酶切，共同连入植物表达载体pCAMBIA1300(HindIII/BamHI)中，得到重组载体pCAMBIA1300-pUbi::ARE4。

重组载体pCAMBIA1300-pUbi::ARE4为将序列6所示的DNA分子替换pCAMBIA1300载体的酶切位点HindIII和BamHI之间的片段得到的载体，其中序列6所示的DNA分子中，第1位到第1981位为Ubiquitin启动子序列，第1988位到第3328位为ARE4 基因的编码序列CDS。

二、基因沉默载体pTCK303-ARE4的构建

以水稻品种日本晴的cDNA作为模板，采用下述引物序列对通过PCR扩增ARE4基因的沉默靶标序列(对应序列表中序列2的自5’末端第492位到第806位)。

引物对序列如下：

F：5’-GGTACCACTAGTCGAGCAGGAGAAGGCGTTCGAG-3’(下划线部分为KpnI SpeI的识别序列，其后的序列为序列表中序列2的第492-513位)；

R：5’-GGATCCGAGCTCCGCTCCTGCTCAGAGGACTTAGC-3’(下划线部分为BamHI SacI 的识别序列，其后的序列为序列表中序列2的第784-806位的反向互补序列)。

将PCR产物连接pBluescript SK II(-)载体(Stratagene)后，测序正确后得到连接ARE4基因沉默靶标序列的中间载体；该中间载体先经SpeI和SacI双酶切后，将靶标序列(SpeI/SacI)连入基因沉默载体pTCK303(SpeI/SacI)中，测序结果正确后就得到重组载体1；随后将中间载体再经KpnI和BamHI双酶切，得到315bp靶标序列 (KpnI/BamHI)，将该靶标序列替换重组载体1的KpnI/BamHI酶切位点间的片段，测序正确后就得到基因沉默载体pTCK303-ARE4。

基因沉默载体pTCK303-ARE4为将序列2的第492位到第806位的片段替换基因沉默载体Ptck303的SpeI和SacI酶切位点间的片段，且将序列2的第492位到第806 位的片段替换基因沉默载体Ptck303的KpnI和BamHI酶切位点间的片段，得到的载体。

三、ARE4转基因植物的获得及表型分析

1、ARE4转基因植物的获得

将步骤一和步骤二构建的重组植物表达载体pCAMBIA1300-pUbi::ARE4和pTCK303-ARE4分别转入根癌农杆菌EHA105中，得到重组菌EHA105/ pCAMBIA1300-pUbi::ARE4和重组菌EHA105/pTCK303-ARE4。

分别采用上述重组菌侵染粳稻品种日本晴的愈伤组织，具体的转化筛选方法参见文献“易自力,曹守云,王力,何锶洁,储成才,唐祚舜,周朴华,田文忠.提高农杆菌转化水稻频率的研究.遗传学报,2001,28(4):352-358”一文。最终获得两种转基因苗，即过表达ARE4基因的水稻植株(命名为OE-ARE4)和ARE4基因沉默表达的水稻植株(命名为ARE4-RNAi)。

2、ARE4转基因植物的鉴定

将上述过表达ARE4基因的水稻植株(命名为OE-ARE4)和ARE4基因沉默表达的水稻植株(命名为ARE4-RNAi)按照如下两种方法进行鉴定：

(1)PCR初步鉴定

分别提取野生型水稻品种日本晴和上述2种转基因植株的基因组DNA作为模板，采用下述针对潮霉素基因HYG的引物对通过PCR扩增进行鉴定，经鉴定表明含有HYG 基因的(PCR产物大小为557bp)植株即为HYG阳性转基因植株。

HYG-F：5’-GTCTCCGACCTGATGCAGCTCTCGG-3’；

HYG-R：5’-GTCCGTCAGGACATTGTTGGAG-3’。

得到HYG阳性过表达ARE4基因的水稻植株(命名为OE-ARE4)和HYG阳性ARE4 基因沉默表达的水稻植株(命名为ARE4-RNAi)。

(2)转录水平分析

将野生型水稻品种日本晴、上述(1)得到的HYG阳性过表达ARE4基因的水稻植株和上述(1)得到的HYG阳性ARE4基因沉默表达的水稻植株提取总RNA，反转录cDNA 作为模板，采用下述引物序列对通过实时定量荧光PCR检测ARE4基因的转录水平，实验重复3次，结果取平均值。

用于检测ARE4基因表达量的引物序列如下：

qARE4-1F：5’-AGGACGAGCACAGGCTGTT-3’(序列2的第830-848位)；

以OsActin1基因作为内参基因，其检测引物对：

OsActin1-F：5’-CAACACCCCTGCTATGTACG-3’；

OsActin1-R：5’-CATCACCAGAGTCCAACACAA-3’。

结果显示，与野生型水稻材料日本晴(ARE4基因的相对表达量为1)相比，HYG 阳性过表达ARE4基因的水稻植株2个株系中ARE4基因的转录水平(ARE4基因的相对表达量为20.9和25.5)显著提高，得到阳性表达ARE4基因的水稻；HYG阳性ARE4 基因沉默表达的水稻植株2个株系中ARE4基因的表达量(ARE4基因的相对表达量为 0.45和0.54)为日本晴的0.3-0.6倍左右，得到阳性ARE4基因沉默表达的水稻。

采用同样的方法将基因沉默载体Ptck303和pCAMBIA1300载体分别转入日本晴中，得到转Ptck303水稻和转pCAMBIA1300水稻，验证没有目的基因的表达。

3、ARE4转基因植物表型分析

选取上述2得到的阳性表达ARE4基因的水稻(又名OE-ARE4-Flag)和阳性ARE4 基因沉默表达的水稻(又名ARE4-RNAi)的种子，播种进行田间表型分析，每种水稻选取2个株系，每个株系40个种子。以野生型水稻日本晴(又名NPB)、转Ptck303 水稻和转pCAMBIA1300水稻为对照。

在播种140天后，检测各个植株株高及单株产量。

单株产量：单株全部种子的质量之和。

结果如图6所示，

与对照植株日本晴(NPB)相比，ARE4-RNAi转基因植株(#1、#2)的株高降低(图6b)，表示生物量减少(图6a)；与对照植株日本晴(NPB)相比，ARE4-RNAi转基因植株 (#1、#2)的单株产量下降(图6c)；

与对照植株日本晴相比，OE-ARE4-Flag转基因植株(#1、#2)株高升高(图6e)，表示生物量增加(图6d)；与对照植株日本晴相比，OE-ARE4-Flag转基因植株(#1、#2) 单株产量提高(图6f)。

上述结果表明，ARE4基因可以提高植株株高、生物量和单株产量。

转pTCK303水稻和转pCAMBIA1300水稻与野生型水稻结果无显著差异。

实施例4、ARE4蛋白在调控基因转录中的应用

一、重组菌的构建

1、重组载体

将序列2所示的cDNA根据大肠杆菌密码子优化，得到优化后的序列3。

重组载体pGEX-ARE4为将序列3第391位至1344位所示的片段(对应优化前的序列表中序列2的自5’末端第388位到第1341位)替换pGEX-4T-1载体(商购来源GE Healthcare)的酶切位点BamHI和XmaI之间的片段得到的载体，该载体表达重组ARE4 蛋白，该蛋白的氨基酸序列为序列7，该蛋白中序列1-218为是GST(谷胱甘肽S-转移酶)标签，第227位至第544位是截短后的ARE4蛋白的氨基酸序列。

2、重组菌

将重组载体pGEX-ARE4转化BL21(DE3)大肠杆菌感受态细胞中(商购来源TransGenBiotech)，筛选氨苄青霉素抗性菌株即为含有重组载体pGEX-ARE4的大肠杆菌重组菌株。

3、诱导表达纯化

蛋白诱导表达纯化的具体方法主要参照已发表文章(Graslund,S.,Nordlund,P.,Weigelt,J.,Hallberg,B.M.,Bray,J.,Gileadi,O.,Knapp,S.,Oppermann,U.,Arrowsmith,C.,Hui,R.,et al.(2008).Protein production and purification. NatMethods 5,135-146.)，将上一步的重组菌株接种到5mL含有50μg/mL氨苄青霉素的液体LB培养基中，37℃220rpm过夜培养。将菌液全部接种到500mL LB液体培养基(加入氨苄青霉素至终浓度为50μg/mL)，37℃摇床220rpm培养3-4h至 OD值至0.6-0.8，加入IPTG使其终浓度为0.5mM，16℃摇床220rpm过夜诱导表达。室温6000rpm离心5min收集菌体后加入PBS缓冲液(含有蛋白酶抑制剂)重悬菌体沉淀，超声破碎后4℃12000rpm离心30min，转移上清至新的离心管中。加入500μL Glutathione Sepharose 4beads(GE Healthcare)，4℃轻柔摇动结合4h后使用 PBS缓冲液洗涤beads 6-8次，加入1mL 10mM GSH进行蛋白洗脱，即得到ARE4重组蛋白(其氨基酸序列为序列7；蛋白浓度为1mg/mL，溶剂为PBS，配方为2mM KH₂PO₄， 8mMNa₂HPO₄，136mM NaCl，2.6mM KCl，余量为水，pH 7.4)。

二、ARE4蛋白在调控基因转录中的应用

1、ARE4重组蛋白与目标核酸探针的结合

方法：ARE4重组蛋白与目标核酸探针结合的具体方法参照凝胶阻滞实验方法(相关探针合成和试剂盒商购于Thermo Fisher Scientific，具体操作方法参考试剂盒说明书)。在本发明中以OsNRT2.4基因启动子区域(NC_029256，20388533-20390532， 07-AUG-2018)作为ARE4重组蛋白的结合区域为例进行具体的实验验证。

用于结合OsNRT2.4基因启动子区域的核酸探针按照如下引物退火得到的DNA序列，其中OsNRT2.4-P1WT探针序列单碱基突变后获得OsNRT2.4-P1m1探针至 OsNRT2.4-P1m5探针：

OsNRT2.4-P1WT探针的合成引物：

OsNRT2.4-P1F：ACAGGAATCGgataaGAGAGATAGA

OsNRT2.4-P1R：TCTATCTCTCttatcCGATTCCTGT

OsNRT2.4-P1m1探针的合成引物：

OsNRT2.4-P1Fm1：ACAGGAATCGtataaGAGAGATAGA

OsNRT2.4-P1Rm1：TCTATCTCTCttataCGATTCCTGT

OsNRT2.4-P1m2探针的合成引物：

OsNRT2.4-P1Fm2：ACAGGAATCGgttaaGAGAGATAGA

OsNRT2.4-P1Rm2：TCTATCTCTCttaacCGATTCCTGT

OsNRT2.4-P1m3探针的合成引物：

OsNRT2.4-P1Fm3：ACAGGAATCGgaaaaGAGAGATAGA

OsNRT2.4-P1Rm3：TCTATCTCTCttttcCGATTCCTGT

OsNRT2.4-P1m4探针的合成引物：

OsNRT2.4-P1Fm4：ACAGGAATCGgattaGAGAGATAGA

OsNRT2.4-P1Rm4：TCTATCTCTCtaatcCGATTCCTGT

OsNRT2.4-P1m5探针的合成引物：

OsNRT2.4-P1Fm5：ACAGGAATCGgatatGAGAGATAGA

OsNRT2.4-P1Rm5：TCTATCTCTCatatcCGATTCCTGT

结果：为了确认ARE4重组蛋白是否能够直接结合到OsNRT2.4基因的启动子区域，进行了凝胶阻滞实验检测ARE4重组蛋白与OsNRT2.4基因启动子区域包含有GATAA集序的核酸探针(探针长度为25bp)的结合情况。

凝胶迁移实验结果如图7所示，WT为OsNRT2.4-P1WT探针，M1至M5为 OsNRT2.4-P1m1探针至OsNRT2.4-P1m5探针，ARE4蛋白能够直接结合OsNRT2.4基因含有GATAA位点的启动子序列，且不能与GATAA位点突变的启动子序列结合，表明ARE4 蛋白能够在体外直接结合OsNRT2.4的启动子。

2、ARE4蛋白转录激活目标靶基因的表达

鉴于OsNRT2.1、OsNRT2.2及OsNRT2.4基因可能是ARE4蛋白的候选靶基因，按照如下方法检测：

效应因子：分为实验组和对照组；

实验组：重组载体pCAMBIA1300-pUbi::ARE4：实施例3中构建的载体；对照组：pCAMBIA1300；

报告因子：为如下3种：

pGreenII 0800-LUC-pOsNRT2.1为将OsNRT2.1基因的启动子pOsNRT2.1序列 (NC_029257，653310-655309，07-AUG-2018)替换pGreenII 0800-LUC载体的SalI和 NcoI酶切位点间片段得到的载体；

pGreenII 0800-LUC-pOsNRT2.2为将OsNRT2.2基因的启动子pOsNRT2.2序列 (NC_029257，669066-671065，07-AUG-2018)替换pGreenII 0800-LUC载体的SalI和 NcoI酶切位点间片段得到的载体；

pGreenII 0800-LUC-pOsNRT2.4为将OsNRT2.4基因的启动子pOsNRT2.4序列 (NC_029256，20388533-20390532，07-AUG-2018)替换pGreenII 0800-LUC载体的SalI 和NcoI酶切位点间片段得到的载体。

按照实验设计将不同组合的质粒DNA(实验组效应因子：不同的报告因子＝2:1)分别转化日本晴水稻原生质体细胞，培养12h后使用双荧光素酶报告实验检测试剂盒(Dual-Luciferase Reporter Assay System,商购来源Promega Corporation)和单管化学发光检测仪(GLOMAX 20/20,商购来源Promega Corporation)测定，具体操作方法参照检测试剂盒和检测仪的说明书。对照组：仅加入效应因子对照组pCAMBIA1300。

结果如图8所示，在水稻原生质体中通过双荧光素酶报告系统检测效应因子ARE4对OsNRT2s基因的转录调控作用，与对照组相比，ARE4蛋白能够显著激活OsNRT2.1、OsNRT2.2及OsNRT2.4基因启动子的表达，表明，ARE4蛋白在促进基因转录，为转录因子。

序列表

<110>中国科学院遗传与发育生物学研究所

<120>水稻氮代谢调控蛋白ARE4及其编码基因的应用

<160> 7

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 447

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 1

Met Ser Ala Ser Ala Ser Ala Val Cys Leu Leu Pro Pro Arg Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Ala Arg Pro Asp Thr Ala Leu Pro Pro Ala Ser Gln Pro Ala

20 25 30

Thr Val Ala Val Asn Gln Asn Ile Pro Arg Leu Ala Ser Pro Arg Leu

35 40 45

Ala Val Thr Ser Ile Thr Leu Leu Pro Arg Arg Gly Arg Arg Cys Ala

50 55 60

Val Asp Leu Leu Leu Leu His Leu His Arg Leu Leu Leu Phe Leu Ser

65 70 75 80

Leu Phe Ser Glu Glu Thr Pro Asn Leu Phe Leu Pro Arg Lys Pro Ala

85 90 95

Ala Phe Leu Lys Arg Ile Lys Ser Pro Ser Leu Ile Arg Arg Cys Asn

100 105 110

Pro Ser Pro Gln Asn Leu Ala Ala Pro Arg Ala Val Leu Gly Phe Glu

115 120 125

Leu Met Ala Val Glu Glu Ala Ser Ser Ser Ser Gly Gly Gly Arg Gly

130 135 140

Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Glu Glu Gly Leu Ser Gly Cys Gly Gly

145 150 155 160

Gly Trp Thr Arg Glu Gln Glu Lys Ala Phe Glu Asn Ala Leu Ala Thr

165 170 175

Val Gly Asp Asp Glu Glu Glu Gly Asp Gly Leu Trp Glu Lys Leu Ala

180 185 190

Glu Ala Val Glu Gly Lys Thr Ala Asp Glu Val Arg Arg His Tyr Glu

195 200 205

Leu Leu Val Glu Asp Val Asp Gly Ile Glu Ala Gly Arg Val Pro Leu

210 215 220

Leu Val Tyr Ala Gly Asp Gly Gly Val Glu Glu Gly Ser Ala Gly Gly

225 230 235 240

Gly Lys Lys Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly His

245 250 255

Gly Glu Lys Gly Ser Ala Lys Ser Ser Glu Gln Glu Arg Arg Lys Gly

260 265 270

Ile Ala Trp Thr Glu Asp Glu His Arg Leu Phe Leu Leu Gly Leu Glu

275 280 285

Lys Tyr Gly Lys Gly Asp Trp Arg Ser Ile Ser Arg Asn Phe Val Ile

290 295 300

Ser Arg Thr Pro Thr Gln Val Ala Ser His Ala Gln Lys Tyr Phe Ile

305 310 315 320

Arg Leu Asn Ser Met Asn Arg Glu Arg Arg Arg Ser Ser Ile His Asp

325 330 335

Ile Thr Ser Val Asn Asn Gly Asp Thr Ser Ala Ala Gln Gly Pro Ile

340 345 350

Thr Gly Gln Pro Asn Gly Pro Ser Ala Asn Pro Gly Lys Ser Ser Lys

355 360 365

Gln Ser Leu Gln Pro Ala Asn Ala Pro Pro Gly Val Asp Ala Tyr Gly

370 375 380

Thr Thr Ile Gly Gln Pro Val Gly Gly Pro Leu Val Ser Ala Val Gly

385 390 395 400

Thr Pro Val Thr Leu Pro Val Pro Ala Ala Pro His Ile Ala Tyr Gly

405 410 415

Met His Ala Pro Val Pro Gly Ala Val Val Pro Gly Ala Pro Val Asn

420 425 430

Met Pro Pro Met Pro Tyr Pro Met Pro Pro Pro Thr Ser His Gly

435 440 445

<210> 2

<211> 1344

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 2

atgtccgcgt ctgcatccgc tgtctgtctc cttcctcccc gaggaggaag cctggcccga 60

cccgacaccg cactcccccc agccagccag ccagccactg tcgcggtgaa ccaaaatatc 120

ccccgcctcg cctcgcctcg cctcgcggta acatccatca cactcctccc ccgccgcggc 180

cgccgctgcg cggtagatct cctcctcctc cacctccacc gtctcctgct cttcctctct 240

ctcttctcgg aggaaacccc caatttattc cttccccgca aacccgcagc cttcctaaaa 300

cgaattaaat ctccctccct tatccgccgc tgcaatccct ccccacaaaa tctcgctgcg 360

ccgcgcgctg ttttagggtt tgagctcatg gcggtggagg aggcgagcag cagcagtggc 420

ggcggtcgtg gtgggggtgg cggtgggggt ggggaggagg ggttgtccgg ttgcggcggt 480

gggtggacgc gcgagcagga gaaggcgttc gagaacgcgc tggcgacggt gggggatgac 540

gaggaggaag gggacgggtt gtgggagaag ctagcggagg ccgtggaggg gaagacggcc 600

gacgaggtga ggcggcacta cgagctgctg gtggaggacg tcgacggcat cgaggccggg 660

cgggtgccgc tcctggtgta cgccggcgac gggggcgtcg aggagggctc tgcgggaggt 720

gggaagaagg ggggtggtgg gggaggaggt ggaggtggag gggggcatgg ggagaagggg 780

tcggctaagt cctctgagca ggagcgccgg aaggggatcg cctggacgga ggacgagcac 840

aggctgttcc ttcttggact tgagaagtac ggcaaaggcg actggaggag tatctcaaga 900

aactttgtga tctcaaggac acccacccaa gtagctagtc atgcacagaa gtattttatt 960

cgcctgaact caatgaacag agagaggcgg cgatcaagta tacatgacat aaccagcgtg 1020

aacaatggag atacatctgc tgctcagggg ccaatcacag gtcagccaaa tggcccatca 1080

gcaaatcctg gaaaatcctc taagcagtct ctacagccag caaatgcgcc tccaggcgtc 1140

gatgcttatg gtacgacaat tggacagcca gttggtggtc ctcttgtgtc cgcagttggc 1200

actcctgtta cacttcctgt tcctgctgca cctcatatag cctatggcat gcatgcccct 1260

gtccctggag ctgtagtccc tggtgcccca gtaaacatgc ctccaatgcc ctaccccatg 1320

ccgccaccaa catctcatgg atga 1344

<210> 3

<211> 1374

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 3

catatgagcg cgagcgcgag cgcggtttgc ctgctgccgc cgcgtggtgg tagcctggcg 60

cgtccggata ccgcgctgcc gccggcgagc cagccggcga ccgtggcggt taaccaaaac 120

attccgcgtc tggcgagccc gcgtctggcg gtgaccagca ttaccctgct gccgcgtcgt 180

ggtcgtcgtt gcgcggttga cctgctgctg ctgcacctgc accgtctgct gctgttcctg 240

agcctgttta gcgaggaaac cccgaacctg ttcctgccgc gtaagccggc ggcgtttctg 300

aagcgtatca aaagcccgag cctgattcgt cgttgcaacc cgagcccgca gaacctggcg 360

gcgccgcgtg cggtgctggg tttcgaactg atggcggttg aggaagcgag cagcagcagc 420

ggtggcggtc gtggcggtgg cggtggcggt ggcggtgagg aaggcctgag cggttgcggc 480

ggtggctgga cccgtgaaca agagaaagcg tttgagaacg cgctggcgac cgtgggtgac 540

gatgaggaag agggcgacgg tctgtgggaa aagctggcgg aagcggtgga gggtaaaacc 600

gcggatgagg ttcgtcgtca ctacgaactg ctggttgagg acgttgatgg catcgaagcg 660

ggtcgtgtgc cgctgctggt ttatgcgggt gatggtggcg ttgaagaggg cagcgcgggt 720

ggcggtaaga aaggcggtgg cggtggcggt ggcggtggcg gtggcggtca tggtgaaaag 780

ggtagcgcga aaagcagcga acaggagcgt cgtaagggta ttgcgtggac cgaagacgag 840

caccgtctgt tcctgctggg cctggagaag tacggcaagg gtgattggcg tagcatcagc 900

cgtaacttcg tgattagccg taccccgacc caggttgcga gccacgcgca aaaatatttt 960

atccgtctga acagcatgaa ccgtgagcgt cgtcgtagca gcatccacga cattaccagc 1020

gtgaacaacg gtgataccag cgcggcgcag ggtccgatta ccggtcaacc gaacggtccg 1080

agcgcgaacc cgggcaagag cagcaaacag agcctgcaac cggcgaacgc gccgccgggc 1140

gtggatgcgt acggtaccac cattggtcaa ccggttggcg gtccgctggt gagcgcggtt 1200

ggtaccccgg tgaccctgcc ggttccggcg gcgccgcaca ttgcgtatgg catgcatgcg 1260

ccggtgccgg gtgcggtggt tccgggcgcg ccggttaaca tgccgccgat gccgtatccg 1320

atgccgccgc cgaccagcca cggtcaccac caccaccacc actaatgaaa gctt 1374

<210> 4

<211> 4432

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 4

ggccatgtcc gcgtctgcat ccgctgtctg tctccttcct ccccgaggag gaagcctggc 60

ccgacccgac accgcactcc ccccagccag ccagccagcc actgtcgcgg tgaaccaaaa 120

tatcccccgc ctcgcctcgc ctcgcctcgc ggtaacatcc atcacactcc tcccccgccg 180

cggccgccgc tgcgcggtag atctcctcct cctccacctc caccgtctcc tgctcttcct 240

ctctctcttc tcggaggaaa cccccaattt attccttccc cgcaaacccg cagccttcct 300

aaaacgaatt aaatctccct cccttatccg ccgctgcaat ccctccccac aaaatctcgc 360

tgcgccgcgc gctgttttag ggtttgagct catggcggtg gaggaggcga gcagcagcag 420

tggcggcggt cgtggtgggg gtggcggtgg gggtggggag gaggggttgt ccggttgcgg 480

cggtgggtgg acgcgcgagc aggagaaggc gttcgagaac gcgctggcga cggtggggga 540

tgacgaggag gaaggggacg ggttgtggga gaagctagcg gaggccgtgg aggggaagac 600

ggccgacgag gtgaggcggc actacgagct gctggtggag gacgtcgacg gcatcgaggc 660

cgggcgggtg ccgctcctgg tgtacgccgg cgacgggggc gtcgaggagg gctctgcggg 720

aggtgggaag aaggggggtg gtgggggagg aggtggaggt ggaggggggc atggggagaa 780

ggggtcggct aagtcctctg agcaggagcg ccggaagggg atcgcctgga cggaggacga 840

gcacaggtta gctttgcctt cgttcctatc taccaaattg cattgctgct ctagcctaga 900

caatatttga tgattgcaga aactggcttc tgttcggagc ctgtacaact tcactgtttt 960

attgtggatt aatccgtcta gtcattgtaa atggaagttg aaattgaaat gctctgggaa 1020

ttttggaaat cgctgtttag acagtctagc agcttctttt ggttgcagaa ctgcatactt 1080

gtaggtgtgt tgctcttcag ctttctttgc actggacaat taggtagctc ccttttctat 1140

ttcttgaata aatgattgca taggagctag aatagtagtt tatttaatcg tgaattaggt 1200

accgcttctg tgttgttggg aattttgccg attggtttgt cttgttattg cagcctgttt 1260

acgattttgg aaattactgc ttcagacccc aggaagtagg cttgttggtt tgtgtgtgct 1320

aggttttgtc ccgcatggtt tttttatggg tttcaccact tggcagttta tgttacatcc 1380

tgcatagttc ttctcagatg gagcggctga ttacttgtgc tgcatacttg ttttcaactg 1440

gaagtggttc attggagatg ttgtttcttc cttgctagtt tcgacaactc cagtaactac 1500

ttaactcaat caatttttga attataaact gttttctaac aataacctat tcacgttact 1560

tcttatggtg gatcctatgc atttcgagct acatcccact gatttagttt taggtttgtt 1620

tctcatttct tcttgctgaa ggcttgttta attgattcat cttagcatat ttcaccttcc 1680

tcctaaaagg atgagaaaat tctgttcata gcacaattcg taaaatacaa ctaagctttt 1740

tctcactctg cttaatacca tagcgcatca gttttttgtt tgaaaaatac caccgaaaga 1800

ccaaaataat tttacttcaa ttgcaatgca acaagaccta cctcttacgc attcctgttt 1860

gctggggttc ctctggcgcg ttctccttct ctttgttcaa tctgacacct ccattagctc 1920

atacatcatc tttaatcaca aaccaacaga tcaaacagat agtttatcaa atatctttgt 1980

caccattaca gaaatctcct atttcatagg tacaaataaa agaaagaaag caaatctgtc 2040

tgcttgcatc tactttgatt ttccgaacgc caatgctcaa tcccctacat agctccagca 2100

gttcatggaa tacaaaatta aacttggtca tttggcttca aagtggagtg aagaacgatg 2160

ttgtgcatgt gcgccttggc ttccagctag aagatcgatt agccattgac ctgggttaac 2220

acgtggtgag ccagcaggct agcgtcactg gcaagcaacc atacggccac atccaccaag 2280

cgcgtttgct gtgtgcaggt tggagggacg gcaatcacca tggacgtcgc taagcttcga 2340

gctcacagga gttggttgag ggtgaggcgg tggcaccagc aagtgaccac actgccgcgt 2400

ccagcaatcg cgagcataca ggggagggga atggcggcca ccactagccc gtgcctgccg 2460

agaatgacga aacacaagca ggccccagca gcggaagagg gggttagatc aagggatttg 2520

aggatttgga ggagatgggg aattattgtt cagtcaggaa cttacaagat gggttcgaat 2580

catctaggct caatctgagg gacaattttg tccaaataaa ctcccgttag ctcaaaagat 2640

gacggtagtg gtatttcccc tagaaaaacc cacaacctgt ggcattatga aggtttgtgc 2700

tattttctga atttaatggt cagcgtgtgt catggacgaa ttttccctaa aaggagttag 2760

aggaatcagg acaatggtag cttataactg atttttgtcc atcttaaatt tatttcagca 2820

aaatgaacat tttgaacgca tttgtttcac atttcatttt tttttccgta tttgatatgc 2880

taattttagt tgaaattttc ctgctagctt tagaccggaa caagctagta catgcttgct 2940

gtgcgcatat aattggtttt tgtgtctttt agacatagtc ctgttttcat ttgcaacctg 3000

tttcttccat gatattgtgg acagtatttc tggtccaagg agataaaatt ttgatatctt 3060

attggcatat tggtaatatt gaatgtgttt tatcagtata taaggcagta tgcttgtcag 3120

atccccatat aaaatgatgt gattatcgtg tatttttgtc tgtttgaatg gctgaatgag 3180

tgaaatagac ataacatacc aagatgatgc agagcatgaa aatacgtttc aagtagaagt 3240

aacctgatgc cctgatggat gctaatgtgt tgttcgttca ttgccatgta tgcacatgca 3300

tgatattgat tacaactcaa gtgaaagcat ggttgtaaaa atggcacaac taacctcctt 3360

ttgttctgat gcataaattt gtagctatta cccctctctt caggatgaga aatatccaaa 3420

gttgattaat tcatgcagac tgccctttac tcatatggtt attgatgtgt cctaccactt 3480

gattttaatt tgcaggctgt tccttcttgg acttgagaag tacggcaaag gcgactggag 3540

gagtatctca agaaactttg tgatctcaag gacacccacc caagtagcta gtcatgcaca 3600

gaagtatttt attcgcctga actcaatgaa cagagagagg cggcgatcaa gtatacatga 3660

cataaccagc gtgaacaatg gagatacatc tgctgctcag gggccaatca caggtcagcc 3720

aaatggccca tcagcaaatc ctggaaaatc ctctaagcag tctctacagc cagcaaatgc 3780

gcctccaggc gtcgatgctt atggtacgac aattggacag ccagttggtg gtcctcttgt 3840

gtccgcagtt ggcactcctg ttacacttcc tgttcctgct gcacctcata tagcctatgg 3900

catgcatgcc cctgtccctg gagctgtagt ccctggtgcc ccagtaaaca tgcctccaat 3960

gccctacccc atgccgccac caacatctca tggatgaggg ctttgaatac tacagttctt 4020

ctagacaaac tcataatatc tgtcttgttt agagtttcaa tgcatgctgt tatgtctcaa 4080

taaagcaata tcaataaact cttgtacatt acaaatggtt attgaatgta gcattttgag 4140

gacatcctgg actgtattta tcatctttgt tacgcctgca cttcgttcca tcttcaatgt 4200

acgcctgcca ccctgcccca gtcgtaaaat ggttggaatg ctgaatctcc ttcagcccag 4260

atgtagtggt ttattatctg aaaagtaaat atcgagtcaa tacgtaatca tgaacatatg 4320

taatggttca gtaagtatcc gactatctga ttcgtaatta tgaacagatg tattggttca 4380

ctacctgatt cgtactagta atgaacctgg tgcaggtaca aagagatcga aa 4432

<210> 5

<211> 1843

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 5

cggagcgaat acgagacgga acgaatacgg tagcgaatat ttatcggtat ataaaaaacc 60

cctcaaattg agtttcttga tcaaggaaga gatatcgctt attattttag ttcaacatct 120

ccaacattta tatcgtcaat tttatagacg gtcccacaac tgtatgtgga aatcgatttt 180

catggctgtt cctctaagag atccatatgc aaatatgatt atcattttct attcccgaga 240

cctttcacta gatgtataac ttacttacca ttgtataaat tggagatttt gtttatttta 300

cttcacatct tcgaaacttg taatgtttgt attgtacttt aaatgctttc aaatacaaat 360

gttataaact gcaaagtggt agatcccatt gagctctaca attttgatat ggaacacatc 420

tcctcagatg tcgttgaatt gtagatctga gattttgtaa aaattaatat ggtatattat 480

aatgaatatt tagacccata aatgacctca aataataaaa tagtcaataa taaagttgta 540

gatctcatcg agctctacaa tgttgatata aagtttgtct tcatctgatt ccgtatgaaa 600

aagttatgta tatatacgtg ttttttatat aatttgctta atgtctgcgg atatctgaaa 660

aaaattctgg atagtttccg accgttttct gattccgacg gatattaccc ttactgtatt 720

cgttttcgtt tccaagaaaa aatatccgaa ttcgtttccg aatccgagaa tttccggata 780

attccgactg aaactatcct aatccgaaaa atggtccgga cggacgaaaa ctatccgaac 840

cagtttcatc cctacttaaa agcttacagg gtggtgctaa tatagctaaa caaataatag 900

ggtgatggga tgatccttct aggtaactaa ccatgttata attctagctc atgaattact 960

cacttcatcc cataatataa agaattttga agggatgtga cacttcttag gactacgaat 1020

ctggataaag agcctgtcaa gattcgtagt cctagaaagt gtcactcccc tctaaaattc 1080

tttgtattat gagacggaag gagtatttgt ttttgtaata tttaaatcca tgatgtagag 1140

tattatggtc aaaaatagcc tttttagata actaatatac tggtagacat agatttacct 1200

ccattttact gcatgaattc cattttttat acatataaga taactagata agtcccatat 1260

atccatgaac tgagaacatt tatttacgcc aaacattata tgtctatatt ggtaaaacaa 1320

ttaaatatat ctgttcttta taaaccgcta tcacgcttga aacacgacaa aacttgttga 1380

atataaataa ttgaaaagat gcaaatcatg ctctcgctat caccggtaat caggagcata 1440

tggacagcga caggaagaga taaacacgaa ctcatgatta atactgccta gacgctgttg 1500

attttttatc taacgtttga tcattcgtct tattcaaaaa atgtatataa ttattattca 1560

ttttagtgtg acttaattca tcatcaaata ttctttaagc atgatataaa tattttcatt 1620

ttacacaaaa ataaaacgaa tagtcaaaca ttggttaaaa agtcaacgac gttatacatt 1680

gaaatacgga gagagtagta accagctagt acatctataa cacccaaaaa gaaaagtccc 1740

tccccacaaa atcacagaaa gagaacaaaa tgaaaaagga aaaaaaaaga aaaaaaaaag 1800

agacggagaa ataatacggc cggcgtcgcg ccagccagcg gcc 1843

<210> 6

<211> 3370

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 6

tgcagcgtga cccggtcgtg cccctctcta gagataatga gcattgcatg tctaagttat 60

aaaaaattac cacatatttt ttttgtcaca cttgtttgaa gtgcagttta tctatcttta 120

tacatatatt taaactttac tctacgaata atataatcta tagtactaca ataatatcag 180

tgttttagag aatcatataa atgaacagtt agacatggtc taaaggacaa ttgagtattt 240

tgacaacagg actctacagt tttatctttt tagtgtgcat gtgttctcct ttttttttgc 300

aaatagcttc acctatataa tacttcatcc attttattag tacatccatt tagggtttag 360

ggttaatggt ttttatagac taattttttt agtacatcta ttttattcta ttttagcctc 420

taaattaaga aaactaaaac tctattttag tttttttatt taataattta gatataaaat 480

agaataaaat aaagtgacta aaaattaaac aaataccctt taagaaatta aaaaaactaa 540

ggaaacattt ttcttgtttc gagtagataa tgccagcctg ttaaacgccg tcgacgagtc 600

taacggacac caaccagcga accagcagcg tcgcgtcggg ccaagcgaag cagacggcac 660

ggcatctctg tcgctgcctc tggacccctc tcgagagttc cgctccaccg ttggacttgc 720

tccgctgtcg gcatccagaa attgcgtggc ggagcggcag acgtgagccg gcacggcagg 780

cggcctcctc ctcctctcac ggcaccggca gctacggggg attcctttcc caccgctcct 840

tcgctttccc ttcctcgccc gccgtaataa atagacaccc cctccacacc ctctttcccc 900

aacctcgtgt tgttcggagc gcacacacac acaaccagat ctcccccaaa tccacccgtc 960

ggcacctccg cttcaaggta cgccgctcgt cctccccccc cccccctctc taccttctct 1020

agatcggcgt tccggtccat ggttagggcc cggtagttct acttctgttc atgtttgtgt 1080

tagatccgtg tttgtgttag atccgtgctg ctagcgttcg tacacggatg cgacctgtac 1140

gtcagacacg ttctgattgc taacttgcca gtgtttctct ttggggaatc ctgggatggc 1200

tctagccgtt ccgcagacgg gatcgatttc atgatttttt ttgtttcgtt gcatagggtt 1260

tggtttgccc ttttccttta tttcaatata tgccgtgcac ttgtttgtcg ggtcatcttt 1320

tcatgctttt ttttgtcttg gttgtgatga tgtggtctgg ttgggcggtc gttctagatc 1380

ggagtagaat tctgtttcaa actacctggt ggatttatta attttggatc tgtatgtgtg 1440

tgccatacat attcatagtt acgaattgaa gatgatggat ggaaatatcg atctaggata 1500

ggtatacatg ttgatgcggg ttttactgat gcatatacag agatgctttt tgttcgcttg 1560

gttgtgatga tgtggtgtgg ttgggcggtc gttcattcgt tctagatcgg agtagaatac 1620

tgtttcaaac tacctggtgt atttattaat tttggaactg tatgtgtgtg tcatacatct 1680

tcatagttac gagtttaaga tggatggaaa tatcgatcta ggataggtat acatgttgat 1740

gtgggtttta ctgatgcata tacatgatgg catatgcagc atctattcat atgctctaac 1800

cttgagtacc tatctattat aataaacaag tatgttttat aattattttg atcttgatat 1860

acttggatga tggcatatgc agcagctata tgtggatttt tttagccctg ccttcatacg 1920

ctatttattt gcttggtact gtttcttttg tcgatgctca ccctgttgtt tggtgttact 1980

tctgcagatg tccgcgtctg catccgctgt ctgtctcctt cctccccgag gaggaagcct 2040

ggcccgaccc gacaccgcac tccccccagc cagccagcca gccactgtcg cggtgaacca 2100

aaatatcccc cgcctcgcct cgcctcgcct cgcggtaaca tccatcacac tcctcccccg 2160

ccgcggccgc cgctgcgcgg tagatctcct cctcctccac ctccaccgtc tcctgctctt 2220

cctctctctc ttctcggagg aaacccccaa tttattcctt ccccgcaaac ccgcagcctt 2280

cctaaaacga attaaatctc cctcccttat ccgccgctgc aatccctccc cacaaaatct 2340

cgctgcgccg cgcgctgttt tagggtttga gctcatggcg gtggaggagg cgagcagcag 2400

cagtggcggc ggtcgtggtg ggggtggcgg tgggggtggg gaggaggggt tgtccggttg 2460

cggcggtggg tggacgcgcg agcaggagaa ggcgttcgag aacgcgctgg cgacggtggg 2520

ggatgacgag gaggaagggg acgggttgtg ggagaagcta gcggaggccg tggaggggaa 2580

gacggccgac gaggtgaggc ggcactacga gctgctggtg gaggacgtcg acggcatcga 2640

ggccgggcgg gtgccgctcc tggtgtacgc cggcgacggg ggcgtcgagg agggctctgc 2700

gggaggtggg aagaaggggg gtggtggggg aggaggtgga ggtggagggg ggcatgggga 2760

gaaggggtcg gctaagtcct ctgagcagga gcgccggaag gggatcgcct ggacggagga 2820

cgagcacagg ctgttccttc ttggacttga gaagtacggc aaaggcgact ggaggagtat 2880

ctcaagaaac tttgtgatct caaggacacc cacccaagta gctagtcatg cacagaagta 2940

ttttattcgc ctgaactcaa tgaacagaga gaggcggcga tcaagtatac atgacataac 3000

cagcgtgaac aatggagata catctgctgc tcaggggcca atcacaggtc agccaaatgg 3060

cccatcagca aatcctggaa aatcctctaa gcagtctcta cagccagcaa atgcgcctcc 3120

aggcgtcgat gcttatggta cgacaattgg acagccagtt ggtggtcctc ttgtgtccgc 3180

agttggcact cctgttacac ttcctgttcc tgctgcacct catatagcct atggcatgca 3240

tgcccctgtc cctggagctg tagtccctgg tgccccagta aacatgcctc caatgcccta 3300

ccccatgccg ccaccaacat ctcatggacc cggggattac aaggatgacg acgataagtg 3360

ctaagctagc 3370

<210> 7

<211> 553

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 7

Met Ser Pro Ile Leu Gly Tyr Trp Lys Ile Lys Gly Leu Val Gln Pro

1 5 10 15

Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu His Leu

20 25 30

Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Trp Arg Asn Lys Lys Phe Glu Leu

35 40 45

Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr Ile Asp Gly Asp Val Lys

50 55 60

Leu Thr Gln Ser Met Ala Ile Ile Arg Tyr Ile Ala Asp Lys His Asn

65 70 75 80

Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ile Ser Met Leu Glu

85 90 95

Gly Ala Val Leu Asp Ile Arg Tyr Gly Val Ser Arg Ile Ala Tyr Ser

100 105 110

Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys Val Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu

115 120 125

Met Leu Lys Met Phe Glu Asp Arg Leu Cys His Lys Thr Tyr Leu Asn

130 135 140

Gly Asp His Val Thr His Pro Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu Asp

145 150 155 160

Val Val Leu Tyr Met Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu

165 170 175

Val Cys Phe Lys Lys Arg Ile Glu Ala Ile Pro Gln Ile Asp Lys Tyr

180 185 190

Leu Lys Ser Ser Lys Tyr Ile Ala Trp Pro Leu Gln Gly Trp Gln Ala

195 200 205

Thr Phe Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys Ser Asp Leu Val Pro Arg

210 215 220

Gly Ser Met Ala Val Glu Glu Ala Ser Ser Ser Ser Gly Gly Gly Arg

225 230 235 240

Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Glu Glu Gly Leu Ser Gly Cys Gly

245 250 255

Gly Gly Trp Thr Arg Glu Gln Glu Lys Ala Phe Glu Asn Ala Leu Ala

260 265 270

Thr Val Gly Asp Asp Glu Glu Glu Gly Asp Gly Leu Trp Glu Lys Leu

275 280 285

Ala Glu Ala Val Glu Gly Lys Thr Ala Asp Glu Val Arg Arg His Tyr

290 295 300

Glu Leu Leu Val Glu Asp Val Asp Gly Ile Glu Ala Gly Arg Val Pro

305 310 315 320

Leu Leu Val Tyr Ala Gly Asp Gly Gly Val Glu Glu Gly Ser Ala Gly

325 330 335

Gly Gly Lys Lys Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly

340 345 350

His Gly Glu Lys Gly Ser Ala Lys Ser Ser Glu Gln Glu Arg Arg Lys

355 360 365

Gly Ile Ala Trp Thr Glu Asp Glu His Arg Leu Phe Leu Leu Gly Leu

370 375 380

Glu Lys Tyr Gly Lys Gly Asp Trp Arg Ser Ile Ser Arg Asn Phe Val

385 390 395 400

Ile Ser Arg Thr Pro Thr Gln Val Ala Ser His Ala Gln Lys Tyr Phe

405 410 415

Ile Arg Leu Asn Ser Met Asn Arg Glu Arg Arg Arg Ser Ser Ile His

420 425 430

Asp Ile Thr Ser Val Asn Asn Gly Asp Thr Ser Ala Ala Gln Gly Pro

435 440 445

Ile Thr Gly Gln Pro Asn Gly Pro Ser Ala Asn Pro Gly Lys Ser Ser

450 455 460

Lys Gln Ser Leu Gln Pro Ala Asn Ala Pro Pro Gly Val Asp Ala Tyr

465 470 475 480

Gly Thr Thr Ile Gly Gln Pro Val Gly Gly Pro Leu Val Ser Ala Val

485 490 495

Gly Thr Pro Val Thr Leu Pro Val Pro Ala Ala Pro His Ile Ala Tyr

500 505 510

Gly Met His Ala Pro Val Pro Gly Ala Val Val Pro Gly Ala Pro Val

515 520 525

Asn Met Pro Pro Met Pro Tyr Pro Met Pro Pro Pro Thr Ser His Gly

530 535 540

Pro Gly Ser Thr Arg Ala Ala Ala Ser

545 550

Claims

1.如下a1）-a3）中任一种物质在如下b1-b3中至少一种中的应用；

a1）蛋白ARE4；

a2）编码蛋白ARE4的核酸分子；

a3）含有编码蛋白ARE4的核酸分子的重组载体、表达盒或重组菌；

所述蛋白ARE4为如下（c1）或（c2）：

c1）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

c2）由c1）所述蛋白质的氨基酸序列的末端添加标签序列组成的蛋白质；

b1、调控植物株高；

b2、调控植物对硝酸盐的吸收或转运能力；

b3、调控目的基因转录，所述目的基因为OsNRT2.1、OsNRT2.2和/或OsNRT2.4基因；

所述植物为水稻。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：

所述编码蛋白ARE4的核酸分子是如下d1）-d3）中任一种的DNA分子：

d1）编码区为序列表中序列2所示的DNA分子；

d2）编码区为序列表中序列3所示的DNA分子；

d3）编码区为序列表中序列4所示的DNA分子。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：

所述调控植物株高为提高植物株高；

或，所述调控目的基因转录为促进目的基因转录。

4.权利要求1-3任一中的所述物质在培育如下B1和/或B2所示植物中的应用：

B1、高株高的植物；

B2、对硝酸盐的吸收或转运能力提高的植物；

所述植物为水稻。

5.抑制植物中蛋白ARE4含量或活性的物质在如下C1-C2中至少一种中的应用；

或抑制植物中蛋白ARE4的编码基因表达的物质在如下C1-C2中至少一种中的应用；

C1、降低植物株高；

C2、降低植物对硝酸盐的吸收或转运能力；

所述蛋白ARE4为如下（c1）或（c2）：

c1）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

所述植物为水稻。

6.一种培育转基因植物的方法，为如下1）或2）：

1）所述的方法包括如下步骤：提高目的植物中蛋白ARE4的含量和/或活性，得到转基因植物；

2）所述的方法包括如下步骤：提高目的植物中编码蛋白ARE4的核酸分子的表达，得到转基因植物；

所述转基因植物具有如下D1-D2至少一种表型：

D1、所述转基因植物的株高高于所述目的植物；

D2、所述转基因植物对硝酸盐的吸收或转运能力大于所述目的植物；

所述蛋白ARE4为如下（c1）或（c2）中任一种：

c1）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

所述植物为水稻。

7.一种培育转基因植物的方法，为如下1）或2）：

1）所述的方法包括如下步骤：抑制或降低目的植物中蛋白ARE4的含量和/或活性，得到转基因植物；

2）所述的方法包括如下步骤：抑制或降低目的植物中编码蛋白ARE4的核酸分子的表达，得到转基因植物；

所述转基因植物具有如下E1-E2至少一种表型：

E1、所述转基因植物的株高低于所述目的植物；

E2、所述转基因植物对硝酸盐的吸收或转运能力小于所述目的植物；

所述蛋白ARE4为如下（c1）或（c2）：

c1）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

所述植物为水稻。

8.蛋白ARE4在作为OsNRT2.1、OsNRT2.2和/或OsNRT2.4基因启动子的转录因子中的应用；

所述蛋白ARE4为如下（c1）-（c4）中任一种：

c1）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

c2）由序列表中序列7所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

c3）由序列表中序列7第227位至第544位所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

c4）由c1）-c3）任一种蛋白质的氨基酸序列的末端添加标签序列组成的蛋白质。