CN101585871B

CN101585871B - 耐热性相关蛋白及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN101585871B
Application number: CN2009100878960A
Authority: CN
Inventors: 孙其信; 秦丹丹; 彭惠茹; 倪中福; 姚颖垠; 梁荣奇; 解超杰; 刘志勇; 杜金昆
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2009-06-25
Filing date: 2009-06-25
Publication date: 2012-05-23
Anticipated expiration: 2029-06-25
Also published as: CN101585871A

Abstract

本发明公开了一种耐热性相关的蛋白及其编码基因。本发明所提供的耐热性相关的蛋白，名称为TaMBF1c(Triticum aestivum Multiprotein Binding Factorlc)，来源于普通小麦(Triticum aestivum L.)，是如下1)或2)的蛋白质：1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；2)将序列表中序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与耐热性相关的由1)衍生的蛋白质。耐热相关蛋白TaMBF1c及其编码基因对于培育抗逆性提高的作物、林草等新品种具有重要的理论及实际意义，可用于农牧业和生态环境治理所需的抗性植物品种的培育与鉴定。

Description

耐热性相关蛋白及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及一种与抗逆性相关的蛋白及其编码基因与应用，特别是涉及一种与耐热性相关的蛋白及其编码基因TaMBF1c与应用。

背景技术

随着全球人口的增加，对粮食的需求日益增加。作为世界范围内主要的粮食作物，小麦生育后期的高温胁迫严重影响着其产量和品质，给人们的生活带来了很大的影响，因此我们迫切需要研究小麦耐热性的机理，开发耐热相关基因，并将它们应用到小麦育种，从而培育出耐热品种。

Multiprotein bridging factor 1(MBF1)，作为一种转录共激活子，可以通过连接TATA-Box Binding Protein(TBP)和某种转录因子激活依赖于该转录因子的下游基因的表达。虽然MBF1家族基因最早在蚕中发现，但对这类基因的特性以及功能的研究主要集中在植物，特别是拟南芥中。而拟南芥中的研究表明AtMBF1c基因可能通过影响体内乙烯途径、水杨酸途径以及海藻糖途径提高植株的耐热性。在小麦中仅有关于TaMBF1a基因的表达受病原菌侵染诱导的报道，还未有关于小麦该家族基因与耐热性关系的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种耐热性相关的蛋白及其编码基因。

本发明所提供的耐热性相关的蛋白，名称为TaMBF1c(Triticum aestivumMultiprotein Bridging Factorlc)，来源于普通小麦(Triticum aestivum L.)，是如下1)或2)的蛋白质：

1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

2)将序列表中序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与耐热性相关的由1)衍生的蛋白质。

为了使1)中的TaMBF1c便于纯化，可在由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1.标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH

FLAG	8	DYKDDDDK
			Strep-tag II	8	WSHPQFEK
c-myc	10	EQKLI SEEDL

上述2)中的TaMBF1c可人工合成，也可先合成编码基因，在进行生物表达得到。上述2)中的TaMBF1c的编码基因可通过将序列表中序列1自5′末端第1095-1565位碱基所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

上述与抗逆性相关蛋白的DNA基因也属于本发明的保护范围。

与耐热性相关的蛋白的DNA基因为如下1)-4)中任一所述的基因：

1)其编码序列是序列表中序列1的自5′末端第1095-1565位脱氧核糖核苷酸；

2)其核苷酸序列是序列表中的序列1；

3)在严格条件下与序列表中序列1的自5′末端第1095-1565位脱氧核糖核苷酸杂交且编码权利要求1所述蛋白的DNA分子；

4)与1)或2)的基因具有90％以上的同源性且编码权利要求1所述蛋白的DNA分子。

序列表中的序列1由1761个碱基组成，其开放阅读框架(ORF)为自5′末端第1095-1565位碱基，编码具有序列表中序列2的氨基酸序列的TaMBF1c蛋白。

上述严格条件可为用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在DNA或者RNA杂交实验中65℃下杂交并洗膜。

序列表中的序列1由1761个脱氧核苷酸组成。自5′端第1位至1094位脱氧核苷酸为启动子区，自5′端第1095位至1565位脱氧核苷酸为编码框序列，编码具有序列表中序列2的氨基酸残基序列的蛋白质。自5′端第1566位至1761位脱氧核苷酸为3′端非翻译区序列。

序列表中的序列2由156个氨基酸残基组成，含有两个结构域，其中N端(序列2的自氨基端第12位至83位氨基酸残基)编码Multiprotein Bridging Factor 1(MBF1)结构域，C端(序列2的自氨基端第90位至142位氨基酸残基)编码螺旋-转角-螺旋(Helix-Turn-Helix_XRE，HTH_XRE)结构域。

扩增上述TaMBF1c基因全长或其任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。

含有上述与抗逆性相关蛋白编码基因的重组载体、转基因细胞系和重组菌也属于本发明的保护范围。

其中，上游引物和下游引物之间的距离在50到5000个碱基之间；该引物对中的每一个引物的长度为15到30个碱基。如，引物1：5’-AAGACAGAGGCGAGGAGAAG-3’；引物2：5’-ACCACAAAGCAACCCGAGA-3’。

使用TaMBF1c基因构建重组表达载体时，可在其转录起始核苷酸前加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、泛素(Ubiquitin)基因启动子(pUbi)等，它们可单独使用或与其它的启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入在植物中表达可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、GFP基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

所述重组表达载体具体可为在植物表达载体pYES2的多克隆位点间插入上述与抗逆性相关蛋白的编码基因得到的重组表达载体，如TaMBF1c-pYES2。

携带有本发明的与耐热性相关蛋白编码基因TaMBF1c的植物表达载体可通过Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化到植物细胞或组织中。被转化的植物宿主可以是水稻、小麦、拟南芥、非洲菊、矮牵牛或马铃薯等。

本发明还提供了上述与耐热性相关蛋白编码基因TaMBF1c在制备耐热重组酵母中的应用。

利用可以引导外源基因在酵母中表达的载体，将本发明的TaMBF1c基因导入酵母细胞，将TaMBF1c基因过表达，酵母表现为对高温胁迫的抗性增强。说明TaMBF1c是与耐热性相关的蛋白。与耐热相关蛋白TaMBF1c及其编码基因对于培育抗逆性提高的作物、林草等新品种具有重要的理论及实际意义，可用于农牧业和生态环境治理所需的抗性植物品种的培育与鉴定。

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。

附图说明

图1为TaMBF1c基因在热胁迫下的诱导表达模式。

图2为TaMBF1c基因在其它非生物胁迫及激素处理下的诱导表达模式。

图3为TaMBF1c与GFP的融合蛋白在热胁迫前后的亚细胞定位结果。

图4为转化TaMBF1c-pYES2和pYES2的酵母细胞在热胁迫条件下的生长状况。

具体实施方式

下述实验方法如无特别说明均为常规方法。

实施例1、TaMBF1c基因的克隆

(1)小麦TaMBF1c基因序列的电子克隆

以Affymetrix

wheat Genome array中探针号为Ta.12225.1.S1_x_at的序列为基础序列，在NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov)网站上进行ORF finder分析，发现该序列已包含完整的ORF序列，以此序列为基础设计基因特异引物。

(2)小麦TaMBF1c基因的cDNA及非翻译区序列克隆

根据电子克隆得到的序列设计引物，所用引物对为TaMBF1c-1：5’-AAGACAGAGGCGAGGAGAAG-3’和TaMBF1c-2：5’-ACCACAAAGCAACCCGAGA-3’。

实验材料为普通小麦品种TAM107(Triticum aestivum L)，即5分钟，再用蒸馏水冲洗3遍，置于常温萌动24小时。挑选萌动一致的种子转移至铺有三层湿润滤纸的培养皿中，置于培养箱中(正常生长条件为白天/晚上，22/18℃，12h/12h，湿度60％)生长10天。将生长十天的幼苗转移至40℃的培养箱中，处理1个小时后，取叶片迅速置于液氮中，-80℃保存，待用。

以上述叶片为材料进行RNA提取并反转录为cDNA作为模板进行PCR扩增，PCR产物经过测序验证后，得到TaMBF1c基因的ORF区段。利用BD GenomeWalker^TM UniversalKit(购自Clontech公司)得到5’端的启动子区域1094bp，全序列信息见序列分析表中的序列1，登录Plantcare(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)网站对该区域所包含的顺式作用成分进行了分析，见表2；TaMBF1c的ORF序列编码的蛋白质序列如序列表中的序列2，共含有两个保守的结构域，其中N端(序列2的自氨基端第12位至83位氨基酸残基)编码Multiprotein Bridging Factor 1(MBF1)结构域，C端(序列2的自氨基端第90位至142位氨基酸残基)编码螺旋-转角-螺旋(Helix-Turn-Helix_XRE，HLH_XRE)结构域。并且TaMBF1c基因是一个不含有内含子的转录共激活子。

表2 TaMBF1c启动子区域所包含的顺式作用元件及其数目

实施例2、TaMBF1c基因在高温胁迫下的诱导表达模式

将如上所述在正常条件下生长十天的小麦幼苗进行如下的热胁迫处理：(1)直接在40℃高温条件处理0.25、0.5、1、2、12和24小时，分别命名为0.25h、0.5h、1h、2h、12h和24h；(2)34℃热锻炼3小时后40℃高温处理0.25、0.5、1和2小时，分别命名为0.25sh、0.5sh、1sh和2sh；(3)34℃热锻炼3小时后，正常条件下恢复生长0、1、2和12小时，分别命名为3s、1sc、2sc和12sc，未进行任何高温处理的材料命名为ck。取处理后的叶片，提取RNA进行Northern杂交。用引物对TaMBF1c-1：5’-AAGACAGAGGCGAGGAGAAG-3’和TaMBF1c-3：

5’-CGGAGGCATTCTTGTTCGTC-3’扩增TaMBF1c基因的片段并回收，利用Takara公司的探针标记试剂盒进行探针标记，用于Northern杂交。

结果如图1所示，在正常条件下(ck)TaMBF1c不表达或者表达很弱，而热处理15分钟(0.25h)便可以诱导它的表达，且在直接热处理2小时达到最高(2h)。直接热胁迫处理(h系列)比经过热锻炼后处理(sh系列)上调明显，34℃热锻炼3小时(3s)可以轻微诱导它的表达，且一旦恢复到正常条件(sc)，该基因的表达即恢复到正常水平。

实施例3、TaMBF1c基因在其它胁迫下的诱导表达模式

以20％PEG-6000、250mM NaCl、氧化胁迫(100μM H₂O₂)处理，以及植物激素ACC(200μM)、ABA(100μM)、MeJA(100μM)分别处理小麦幼苗，并取不同处理时间的小麦叶片，提取RNA进行Northern杂交，所用探针以及标记方法同上。其中胁迫处理的具体方法为如下：

高盐处理：在培养瓶中加入NaCl溶液至终浓度为250mM。

PEG处理：在培养瓶中加入PEG-6000溶液至终浓度为20％(质量百分含量)。

ABA处理：把ABA(分析纯，购自Sigma-aldrich)溶解在DMSO中制成10mM贮存液，然后加入到培养瓶中至终浓度为100uM。

ACC处理：把ACC溶解在水中制成10mM母液，然后加到培养瓶中至终浓度200uM。

MeJA处理：吸取一定体积的MeJA(分析纯，购自Sigma-aldrich)加入水中制成10mM母液，然后加入到培养瓶中至终浓度100uM。

H₂O₂处理：吸取一定体积的30％的H₂O₂(购自北京化工厂)加入水中制成100uM的工作液。

在加入上述溶液以后，分别在处理0、0.5、1、6、12小时选取小麦的叶片，迅速置于液氮中，于-80℃冰箱中保存，待用。其中0小时的样品为每种处理的对照CK，同时以未处理的小麦叶片(即只生长在水中)，作为对光周期响应的对照组CK。

Northern结果如图2所示，TaMBF1c的表达受干旱胁迫快速且短暂诱导，在处理30分钟时即达到最高，1小时后开始减弱。TaMBF1c可以轻微应答氧化胁迫(H₂O₂，0.5h)、ABA(1h)和乙烯合成前体ACC(0.5h和1h)。

实施例4、TaMBF1c基因所编码蛋白在热胁迫前后的亚细胞定位

为验证TaMBF1c基因在细胞以及高温胁迫中的作用部位，将TaMBF1c的编码区(5′端第1095位至1565位脱氧核苷酸)插入pEGAD(Sean R.Cutler，David W.Ehrhardt，Joel S.Griffitts，and Chris R.Somerville Random GFP::cDNA fusions enablevisualization of subcellular structures in cells of Arabidopsis at a highfrequency，PNAS，2000，(97)3718-3723)的35S启动子和绿色荧光蛋白GFP基因之间得到含有TaMBF1c-GFP融合基因的重组表达载体TaMBF1c-pEGAD，通过GFP表达部位确定蛋白在细胞内的定位情况，将上述重组质粒转化农杆菌菌株EHA105，经叶盘法将包含有TaMBF1c-pEGAD转入烟草品种NC98，利用激光共聚焦显微镜观察绿色荧光所处的位置。结果如图3所示，在正常条件下(图中A)，可以在细胞膜和细胞壁以及气孔保卫细胞上观察到荧光，而经过37℃高温处理后(图中B)，只能在保卫细胞处观察到荧光。

构建方法如下：以上述叶片的cDNA为模板，利用引物TaMBF1c-6：

5’-TACTGGGTACCATGGAAGGAGCAATGCCGACGG-3’和TaMBF1c-7：

5’-TACTGGGATCCACCACAAAGCAACCCGAGA-3’，将得到的TaMBF1c片段插入pYES2(购自Invitrogen公司)的限制型内切酶kpn I和BamHI(购自Takara公司)酶切位点之间，得到含有TaMBF1c编码区片段的重组表达载体TaMBF1c-pYES2。

实施例5、TaMBF1c基因的表达增强真核生物酵母细胞的抗逆性

为了验证TaMBF1c在真核生物耐热性中的作用，将其与pYES2载体(购自Invitrogen公司)进行连接构建了酵母表达载体TaMBF1c-pYES2。构建方法如下：以上述叶片的cDNA为模板，利用引物TaMBF1c-6：

5’-TACTGGGTACCATGGAAGGAGCAATGCCGACGG-3’和TaMBF1c-7：

5’-TACTGGGATCCACCACAAAGCAACCCGAGA-3’，将得到的TaMBF1c片段插入pYES2(购自Invitrogen公司)的限制型内切酶kpn I和Bam HI(购自Takara公司)酶切位点之间，得到含有TaMBF1c编码区片段的重组表达载体TaMBF1c-pYES2。

利用醋酸锂法制备转化了重组表达载体TaMBF1c-pYES2的酵母菌株INVSc1(购自Invitrogen公司)，作为实验组。挑选在缺失培养基SD-Ura(Minimal SD Base和-UraDO supplement均购自Clontech公司)上表现为阳性的克隆，按照Invitrogen公司提供的技术手册进行基因的诱导表达20小时后，各取1ml在水浴锅中分别进行30℃、45℃和48℃的高温胁迫处理1小时，将不同温度处理后的酵母细胞分别稀释1、10、100和1000倍，取20μl点于缺失培养基SD-Ura(Clontech)上，在30℃倒置培养2-3天待出现克隆，观察并记录结果，从而进行酵母的耐热性评价。同时，利用醋酸锂法制备转空载体(pYES2)的酵母菌株INVSc1作为对照组，进行与实验组相同的耐热胁迫处理。

结果如图4所示，在正常生长条件下(30℃)，转空载体(pYES2)对照组及转重组表达载体TaMBF1c-pYES2的酵母的生长趋势没有显著差别；在温度提高到45℃后，两者的生长趋势仍没有显著差别；而进行1小时的48℃热胁迫后，转空载体(pYES2)酵母的生长明显受到抑制，而转重组表达载体TaMBF1c-pYES2的酵母虽然生长较温度30℃、45℃有所抑制，但是与转空载体(pYES2)的对照组相比，还是具有明显的生长优势。说明转重组表达载体TaMBF1c-pYES2的酵母比转空载体(pYES2)的酵母具有更高的耐热性。

序列表

<110>中国农业大学

<120>耐热性相关的蛋白及其编码基因与应用

<160>1

<210>1

<211>1761

<212>DNA

<213>小麦(Triticum aestivum L.)

<400>1

actatagggc acgcgtggtc gacggcccgg gctggtaaaa ttttgccaag gaagtttgat 60

gcacctgtag cactgaatgg cccgttgcac cagatacgtt ctcgtctcga acctccctcc 120

tcattttgct ggacatgcag acgtaggcga ctacatcaca tagagtttga agagtccgtc 180

gagctcctcc cttcgccgcc ccgacctcct ccctccgctg cacctgtgat tctcaagtga 240

tgagctcatt cgccaacctc atacgactca tcccccctat ccctgagctc cacacctccg 300

ccgactttcg ggatcgactc tctgtccgcc cccgcgcttc tcccgtgccc tccgaactcc 360

tggtcacctt cctacccaag gcctaggccc tcgacctcga ctcgccccgt caactcctcc 420

ttcaagcagc aagctagttt gcctgaacat ttttcctaaa aaacgtaata atctgaaaca 480

tcaccattct tatgtttggg agtgaataca gtaaatcttt gtacttgcta aattttatct 540

tctttttttg cgggtgaaat tttatctttt tgtacagaag aagaagacta ctctctctgt 600

aaattaatat aagagcgttt agatcactaa aatagtaatc taaacgctct tatattagtt 660

tatggaggga gtacaaatca acgaattcca gtttcgtgcc gcgcactgaa tttgtttttt 720

ttaataggaa aggtcacaga atttgaatga gtagtgcgtg accgccaagt accctctcct 780

aggtttaccg tggtatccaa gtttttagac ccatctgcag ccgtccgttc ccctgaactg 840

cctacaatcg acggtgcgca aacaactgac ctctctccca gaaccttcca gaccacacga 900

gtgcacgagc gcgttcagga accttcccga accgcctccc aaccgtcatc gtccacctcc 960

accgtccacg ccctctatat atgcgtcccc accaaaccca atggcacgag aaatgagaaa 1020

gacagaggcg aggagaagaa aaaaatctac aggaaaaaca ggggagaggc agagagaaca 1080

gaagcgaagg agcaatgccg acgggcagga tgagcggcaa catcacgcag gactgggagc 1140

cggtggtgct gcggcgggcg aagcccaagg cggccgacct caagtccgcc aaggcggtga 1200

accaggcgct gcggacgggc gcgccggtgg agacggtgcg caaggcggcg gcggggacga 1260

acaagaatgc ctccgccgcg gccgtggcgg cgcccgcgcg gaagctggac gagatgacgg 1320

agcctgcggg gctggggcgc gtgggcggcg acgtgcgcgc ggccatccag aaggcgcgcg 1380

tggcgaaagg atggagccag gcggagctgg ccaagcgcat caacgagcgg gcgcaggtgg 1440

tgcaggagta cgagagcggc aaggccgtcc ccgtccaggc cgtgctcgcc aagatggagc 1500

gcgccctcga ggtcaagctc cgcggcaagg cggttggggc gcccgcgccc gccgggacaa 1560

agtgatggtc cgtggggaca tatcctttcc tgtgaatttg tgatgaatgg tagtaaatca 1620

gatctgtaaa tctcgggttg ctttgtggtg gatkgggttg taagtcgtgc aaagkgataa 1680

atctccatgt gaaatttgat gtcaaatcct aaatcctatt gtgagctgat ttgcaatttt 1740

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa a 1761

<210>2

<211>156

<212>PRT

<213>小麦(Triticum aestivum L.)

<400>2

Met Pro Thr Gly Arg Met Ser Gly Asn Ile Thr Gln Asp Trp Glu Pro

1 5 10 15

Val Val Leu Arg Arg Ala Lys Pro Lys Ala Ala Asp Leu Lys Ser Ala

20 25 30

Lys Ala Val Asn Gln Ala Leu Arg Thr Gly Ala Pro Val Glu Thr Val

35 40 45

Arg Lys Ala Ala Ala Gly Thr Asn Lys Asn Ala Ser Ala Ala Ala Val

50 55 60

Ala Ala Pro Ala Arg Lys Leu Asp Glu Met Thr Glu Pro Ala Gly Leu

65 70 75 80

Gly Arg Val Gly Gly Asp Val Arg Ala Ala Ile Gln Lys Ala Arg Val

85 90 95

Ala Lys Gly Trp Ser Gln Ala Glu Leu Ala Lys Arg Ile Asn Glu Arg

100 105 110

Ala Gln Val Val Gln Glu Tyr Glu Ser Gly Lys Ala Val Pro Val Gln

115 120 125

Ala Val Leu Ala Lys Met Glu Arg Ala Leu Glu Val Lys Leu Arg Gly

130 135 140

Lys Ala Val Gly Ala Pro Ala Pro Ala Gly Thr Lys

145 150 155

Claims

1.一种蛋白，是由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

2.权利要求1所述蛋白的编码基因。

3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于：所述蛋白的编码基因为序列表中序列1的自5′末端第1095-1565位脱氧核糖核苷酸所示的编码区。

4.含有权利要求2或3所述编码基因的重组载体或重组菌。

5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体为在pYES2的多克隆位点间插入权利要求2或3所述编码基因得到的重组表达载体。