CN116640780A - 西番莲PeWOX-67基因及其应用 - Google Patents
西番莲PeWOX-67基因及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116640780A CN116640780A CN202310895953.8A CN202310895953A CN116640780A CN 116640780 A CN116640780 A CN 116640780A CN 202310895953 A CN202310895953 A CN 202310895953A CN 116640780 A CN116640780 A CN 116640780A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- pewox
- gene
- passion flower
- vector
- plants
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 235000000370 Passiflora edulis Nutrition 0.000 title claims abstract description 62
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 56
- 244000288157 Passiflora edulis Species 0.000 title description 51
- 235000011925 Passiflora alata Nutrition 0.000 claims abstract description 44
- 235000011922 Passiflora incarnata Nutrition 0.000 claims abstract description 44
- 235000013750 Passiflora mixta Nutrition 0.000 claims abstract description 44
- 235000013731 Passiflora van volxemii Nutrition 0.000 claims abstract description 44
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims abstract description 35
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims abstract description 15
- 210000004209 hair Anatomy 0.000 claims abstract description 8
- 241000218996 Passiflora Species 0.000 claims abstract 12
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 32
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 15
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 12
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 8
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 8
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 claims description 4
- 230000008641 drought stress Effects 0.000 abstract description 11
- 230000035882 stress Effects 0.000 abstract description 8
- 238000010367 cloning Methods 0.000 abstract description 5
- 238000011160 research Methods 0.000 abstract description 5
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 abstract description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 abstract description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 abstract description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 abstract description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 abstract description 2
- 230000035899 viability Effects 0.000 abstract description 2
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 13
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 12
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 12
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 9
- 238000000034 method Methods 0.000 description 9
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 8
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 8
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 241000219194 Arabidopsis Species 0.000 description 6
- 241000219195 Arabidopsis thaliana Species 0.000 description 5
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Chemical compound OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 5
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 5
- 230000036579 abiotic stress Effects 0.000 description 4
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 4
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 4
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 4
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 4
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 4
- WSMYVTOQOOLQHP-UHFFFAOYSA-N Malondialdehyde Chemical compound O=CCC=O WSMYVTOQOOLQHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 230000004345 fruit ripening Effects 0.000 description 3
- 235000011389 fruit/vegetable juice Nutrition 0.000 description 3
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 3
- 229940118019 malondialdehyde Drugs 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 239000006870 ms-medium Substances 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 235000015203 fruit juice Nutrition 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 2
- 230000017260 vegetative to reproductive phase transition of meristem Effects 0.000 description 2
- 206010003210 Arteriosclerosis Diseases 0.000 description 1
- 102100020720 Calcium channel flower homolog Human genes 0.000 description 1
- 235000007516 Chrysanthemum Nutrition 0.000 description 1
- 244000189548 Chrysanthemum x morifolium Species 0.000 description 1
- 101000932468 Homo sapiens Calcium channel flower homolog Proteins 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 241000195947 Lycopodium Species 0.000 description 1
- 240000002853 Nelumbo nucifera Species 0.000 description 1
- 235000006508 Nelumbo nucifera Nutrition 0.000 description 1
- 235000006510 Nelumbo pentapetala Nutrition 0.000 description 1
- 108020005089 Plant RNA Proteins 0.000 description 1
- 238000010802 RNA extraction kit Methods 0.000 description 1
- 241000915604 Scutellaria barbata Species 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 235000002634 Solanum Nutrition 0.000 description 1
- 241000207763 Solanum Species 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000036528 appetite Effects 0.000 description 1
- 235000019789 appetite Nutrition 0.000 description 1
- 208000011775 arteriosclerosis disease Diseases 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000003796 beauty Effects 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 230000036772 blood pressure Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000009194 climbing Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000002247 constant time method Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 230000003467 diminishing effect Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 1
- 235000019634 flavors Nutrition 0.000 description 1
- 101150062587 flower gene Proteins 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 230000035784 germination Effects 0.000 description 1
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 1
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 235000015094 jam Nutrition 0.000 description 1
- 235000015110 jellies Nutrition 0.000 description 1
- 239000008274 jelly Substances 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 239000002366 mineral element Substances 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 230000000050 nutritive effect Effects 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000008261 resistance mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 230000005070 ripening Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
- C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
- C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
- C12N15/8273—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for drought, cold, salt resistance
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
- C12R2001/85—Saccharomyces
- C12R2001/865—Saccharomyces cerevisiae
Abstract
本发明提供了一种西番莲PeWOX‑67基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明提供了首次从西番莲中克隆获得西番莲PeWOX‑67基因，在干旱、高温等胁迫下西番莲中PeWOX‑67基因转录水平上调，研究显示该基因能够显著提高酵母干旱胁迫下的生存能力，增加植物主根长度、减少植物根毛等，而且还能够提高植物的抗旱性。本发明为提高酵母抗逆性、改变植物根系和提高植物抗逆性等方面的研究提供新的候选基因。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种西番莲PeWOX-67基因及其应用。
背景技术
西番莲是一种多年生常绿攀缘木本藤蔓植物，是一种芳香可口的水果，被誉为“果汁之王”。又称百香果、巴西果、藤桃、心莲、西菊、枝莲、酸茄花、钟表草。它的天然原汁色泽艳丽，具有独特浓郁的芳香风味和丰富的营养。西番莲果实不仅营养价值高，还有防病健身的功效。据测定，西番莲汁含有60多种挥发性化合物，可溶性固物含量高达10-14％，有机酸、氨基酸种维生素和矿物质元素含量均十分丰富，它作原料，可加工成果汁、果露、果酱、果冻等产品，具有美容养颜、清暑开胃、消除疲劳、提神醒酒、消炎祛斑、降脂降压、防止动脉硬化等功效。由于西番莲的应用越来越广泛，其分子生物学的研究也不断深入和发展，基因表达分析也逐渐应用于揭示西番莲基因表达和调控的机理。因此，对西番莲中重要性状基因定位、克隆、功能等，对于西番莲的综合开发利用具有重要的意义。
西番莲是浅根植物，水平根达4-5 m，在种植过程中整个生育期必须有充足的水分供应。在生长前期需要大量的水分满足树体的萌芽和抽梢的消耗，在开花座采、果实膨大的时候更需要较多水分。干旱对西番莲植株生长有抑制作用。一般在年降雨量1500-2000mm且分布均匀的条件下，生长良好。但年降雨量不宜少于1000mm。因此，提高百香果对干旱胁迫的抗性，减少对水资源的过度依赖，是实现百香果产业持续健康发展的关键因素，也是百香果产业发展亟待解决的关键问题。因此，通过挖掘具有抗逆功能的西番莲基因，进一步验证其在提高西番莲抗干旱及其他非生物胁迫上的调控功能，为研究百香果的抗性机制并利用其进行遗传改良提供了良好的基础。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种西番莲PeWOX-67基因及其应用。
本发明的第一个方面是提供一种西番莲PeWOX-67基因，其ORF序列核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
本发明的第二个方面是提供本发明第一个方面所述西番莲PeWOX-67基因编码的蛋白质。
本发明的第三个方面是提供含有本发明第一个方面所述西番莲PeWOX-67基因编码区的重组载体。
其中，所述重组载体原始载体可以采用基因重组领域中常用的载体，例如病毒、质粒等。本发明对此不进行限定。在本发明的一个具体实施方式中，所述原始载体采pMD 19-T载体、pCAMBIA1304表达载体和pYES 2表达载体，但应当理解的是，本发明还可以采用其他质粒、或者病毒等。
优选地，所述重组载体的原始载体为pCAMBIA1304表达载体，西番莲PeWOX-67基因编码区位于pCAMBIA1304表达载体的NcoI和SpeI两限制性内切酶位点之间。
优选地，所述重组载体的原始载体为pYES 2表达载体，西番莲PeWOX-67基因编码区位于pYES 2表达载体的HinIII和BamHI两限制性内切酶位点之间。
本发明的第四个方面是提供含有第一个方面所述西番莲PeWOX-67基因编码区的宿主菌。
本发明的第五个方面是提供含有本发明第一个方面所述西番莲PeWOX-67基因编码区的表达盒。
本发明的第六个方面是提供如本发明第一个方面所述的西番莲PeWOX-67基因、或者如本发明第二个方面所述的蛋白质、或者如本发明第三个方面所述的重组载体、或者本发明第四个方面所述的宿主菌、或者本发明第五个方面所述的表达盒在提高酵母抗干旱能力中的应用。
优选地，所述酵母为酿酒酵母，比如INVSc 1菌株等。
本发明的第七个方面是提供如本发明第一个方面所述的西番莲PeWOX-67基因、或者如本发明第二个方面所述的蛋白质、或者如本发明第三个方面所述的重组载体、或者本发明第四个方面所述的宿主菌、或者本发明第五个方面所述的表达盒在增加植物主根长度、和/或减少植物根毛中的应用。
在本发明一个具体的实施方式中，所述植物为拟南芥。
本发明的第八个方面是提供如本发明第一个方面所述的西番莲PeWOX-67基因、或者如本发明第二个方面所述的蛋白质、或者如本发明第三个方面所述的重组载体、或者本发明第四个方面所述的宿主菌、或者本发明第五个方面所述的表达盒在提高植物抗旱性中的应用。
在本发明一个具体的实施方式中，所述植物为拟南芥。
本发明的第九个方面是提供一种引物对，所述引物对为ATGACGGGTGATTATCCGTTT和TCAGACAAAGGACCAGTTGATGA，或者所述引物对为TGCCATGGATGACGGGTGATTATCCGTTT和CGGACTAGTGACAAAGGACCAGTTGATGAACA，或者所述引物对为CAAGCTTATGACGGGTGATTATCCGTTT和CGGGATCCGACAAAGGACCAGTTGATGAACA。
本发明提供了首次从西番莲中克隆获得西番莲PeWOX-67基因，在干旱、高温等胁迫下西番莲中PeWOX-67基因转录水平上调，研究显示该基因能够显著提高酵母干旱胁迫下的生存能力，增加植物主根长度、减少植物根毛等，而且还能够提高植物的抗旱性。本发明为提高酵母抗逆性、改变植物根系和提高植物抗逆性等方面的研究提供新的候选基因。
附图说明
图1为PeWOX-67在不同胁迫下紫果西番莲叶片的差异表达分析。
图2为PeWOX-67在紫果西番莲不同果实成熟阶段的差异表达分析。
图3为PeWOX-67在紫果西番莲不同部位差异表达分析。
图4为在干旱胁迫下西番莲PeWOX-67基因对酵母的影响。
图5为转PeWOX-67基因的拟南芥在MS培养基上培养5天后主根情况。
图6为转PeWOX-67基因的拟南芥在MS培养基上培养5天后根毛情况。
图7为转PeWOX-67基因的拟南芥在干旱胁迫下的生长情况和生理指标测量结果。
具体实施方式
下面参照附图，结合具体的实施例对本发明作进一步的说明，以更好地理解本发明。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1：西番莲PeWOX-67基因的克隆
采用反转录多聚酶链式反应（RT-PCR）技术，从紫果西番莲品种中扩增得到PeWOX-67全长cDNA。具体操作如下：
1、提取紫果西番莲幼苗中的总RNA，反转录得到cDNA第一链。
2、以cDNA第一链为模板，以ATGACGGGTGATTATCCGTTT和TCAGACAAAGGACCAGTTGATGA为引物，通过PCR扩增反应获得西番莲PeWOX-67基因的cDNA序列。
反应体系为：模板1ul，5'端引物1ul， 3'端引物1ul，PCR mix 12.5ul，水 9.5ul共25ul体系。
PCR扩增程序为：94℃变性4 min，94℃变性30秒，56℃退火1 min，72℃延伸3 min，72℃延伸10 min，共35个循环。
3、回收扩增产物，并克隆至pMD 19-T载体（Promega，麦迪逊，WI，USA）中（pMD 19-T-PeWOX-67载体），并在ABI PRISM 310遗传分析仪（PerkinElmer Applied Biosystems，Foster City，CA，USA）上测序。测序结果表明，克隆获得西番莲PeWOX-67基因，其ORF序列核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
实施例2：西番莲PeWOX-67基因的表达分析
将商品名为“台农”的紫果西番莲（Passiflora edulis）的健康西番莲幼苗在培养箱（30 ℃，200μmol·m-2·s-1光强，12小时光照/12小时黑暗循环，70%相对湿度）生长至约1m的高度，并具有8-10片功能性叶片。 将植物用于各种非生物胁迫处理：
①干旱胁迫：将植株进行干旱处理，当土壤水分为50%和10%时分别取样；
②盐处理：用300mM的盐溶液处理3天和10天分别取样；
③低温处理：将植株置于0℃除了20和48小时分别取样；
④高温处理：将植株置于45℃ 2，4和24小时分别取样。
利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术，检测PeWOX-67基因在不同非生物胁迫下叶片中西番莲PeWOX-67基因的表达情况。结果如图1所示，PeWOX-67均能受到各种非生物胁迫的诱导表达，其中在干旱以及低温处理时被高度诱导表达。
对正常生长条件下对于成熟期间的西番莲果实取样，选择三个果实成熟阶段的果实（T1，收获前两周，果皮是绿色的；T2，采收时果皮红紫色，无皱缩；T3，在30 °C下收获后一周，果皮已经收缩）。利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术，检测果实成熟3个阶段，西番莲PeWOX-67基因的表达情况，结果如图2所示，该基因在果实成熟三个时期的表达差异不大。
对正常生长条件下已经开花结果的西番莲的不同组织（叶、根、茎、果实）取样。利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术，检测PeWOX-67基因在不同组织（叶、根、茎、果实）中的表达。结果如图3所示，该基因在根和茎中表达最高，其次是果，在叶片中的表达量最低。
实时荧光定量PCR（qRT-PCR）操作如下：将组织和叶冷冻，并使用植物RNA分离试剂盒以三个生物学重复提取总RNA。 在Light 96（Roche）上使用SYBR ® Premix Ex Taq™（TaKaRa，Japan，Tokyo）化学进行qRT-PCR分析。 使用2−∆∆CT方法计算相对表达水平。引物为F:TGAATCGGTGGTGACGAGTGGTC, R:CAGGCTTCATACCAGGCATTTGG，PCR反应体系为模板1ul，5'端引物1ul， 3'端引物1ul，PCR mix 12.5ul，水 9.5ul共25ul体系。PCR反应程序如下：94℃变性4 min，94℃变性30秒，58℃退火1 min，72℃延伸1 min，72℃延伸10 min，共35个循环。
实施例3：重组载体的构建
以pMD19-T-PeWOX-67质粒为模板，以引物TGCCATGGATGACGGGTGATTATCCGTTT（划线为NcoI酶切位点）和CGGACTAGTGACAAAGGACCAGTTGATGAACA（划线为SpeI酶切位点），进行PCR扩增。反应体系为模板1ul，5'端引物1ul， 3'端引物1ul，PCR mix 12.5ul，水 9.5ul共25ul体系。反应程序为94℃变性4 min，94℃变性30秒，56℃退火1 min，72℃延伸3 min，72℃延伸10 min，共35个循环。扩增产物经NcoIHinIII和SpeIBamHI双酶切后连接至经相同酶切后的pCAMBIA1304表达载体，得到pCAMBIA 1304-PeWOX-67载体。
以pMD19-T-PeWOX-67载体为模板，以引物CAAGCTTATGACGGGTGATTATCCGTTT（划线为HinIII酶切位点）和CGGGATCCGACAAAGGACCAGTTGATGAACA（划线为BamHI酶切位点），进行PCR扩增。反应体系为模板1ul，5'端引物1ul，3'端引物1ul，PCR mix 12.5ul，水 9.5ul共25ul体系。反应程序为94℃变性4 min，94℃变性30秒，56℃退火1 min，72℃延伸3 min，72℃延伸10 min，共35个循环。扩增产物经HinIII和BamHI双酶切后连接至经相同酶切后的pYES 2表达载体，得到pYES 2-PeWOX-67载体。
实施例4：PeWOX-67在酵母中的功能互补
将pYES 2-PeWOX-67和pYES 2载体（对照）分别转染到INVSc 1菌株（酿酒酵母）中。为了进行酵母互补测定，将酵母液在SD-Ura液体培养基中在30 ° C下培养，并分别在18%PEG中处理（0、12、24、36、48、60 h）。实验重复了三次。
将pYES 2-PeWOX-67和pYES 2空载体（对照）转化到INVSCl中用于干旱胁迫实验，结果如图4所示（图4中1×、10×、100×、1000×分别代表将菌液稀释1倍，10倍，100倍，1000倍）。结果表明，随着处理时间的增加，空载体和转基因酵母的生长越来越受到限制。在18%PEG中处理60 h，只有转化酵母能生长。这表明PeWOX-67在干旱胁迫下发挥了一定的作用。
实施例5：对转基因系的根系的影响
将pCAMBIA 1304-PeWOX-67转化农杆菌，然后将转化后的农杆菌用在28 °C下在分别含有Kan和Rif抗生素的YEB培养基中振荡，并添加到拟南芥转基因浸润溶液（1/2 MS，50g/L）中至0 D 600=0.8-1.0。使用花序浸渍转化拟南芥，我们获得了三个独立的PeWOX-67转基因拟南芥系，命名为L1、L2和L3。将野生型（WT)和获得的3个转基因拟南芥分别播种在MS培养基中，5天后分别测量各株系的根长和根毛数量，结果如图5-6所示。
结果表明，转基因株系的主根长度均长于野生型（图5），而根毛数量少于野生型株系（图6），经统计数据表明，转基因植株的主根平均长度约为野生型植株的1.5倍，而转基因植株的平均根毛数量约为野生型的0.48倍。
实施例6：转基因系和WT的干旱胁迫处理
将实施例5获得的转基因拟南芥生长4周后，在培养箱中在23 °C下无水处理12天并恢复6天，观察拟南芥的生长情况，并对植物进行生理指标测量。结果如图7所示。将生长4周的转基因和野生型植物（WT）在没有水的情况下处理12天并恢复6天，转基因植物比野生型植物生长更强壮。在经受干旱胁迫和复水后对植物进行生理指标测量，在正常生长条件下，WT和转基因植物的MDA（丙二醛）和PRO（脯氨酸）含量没有显著差异，而干旱胁迫和复水处理后，转基因植株的MDA含量显著低于野生型，而PRO含量显著高于野生型（图7）。 结果表明，PeWOX-67可以提高植物的抗旱性。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对该实用进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。
Claims (9)
1.一种西番莲PeWOX-67基因，其特征在于，其ORF序列如SEQ ID NO:1所示。
2.权利要求1所述西番莲PeWOX-67基因编码的蛋白质。
3.含有权利要求1所述西番莲PeWOX-67基因编码区的重组载体或宿主菌或表达盒。
4.如权利要求3所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体的原始载体为pCAMBIA1304表达载体，西番莲PeWOX-67基因编码区位于pCAMBIA1304表达载体的NcoI和SpeI两限制性内切酶位点之间。
5.如权利要求3所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体的原始载体为pYES 2表达载体，西番莲PeWOX-67基因编码区位于pYES 2表达载体的HinIII和BamHI两限制性内切酶位点之间。
6.如权利要求1所述的西番莲PeWOX-67基因、或者如权利要求2所述的蛋白质、或者如权利要求3所述的重组载体或宿主菌或表达盒在提高酵母抗干旱能力中的应用。
7.如权利要求1所述的西番莲PeWOX-67基因、或者如权利要求2所述的蛋白质、或者如权利要求3所述的重组载体或宿主菌或表达盒在增加植物主根长度、和/或减少植物根毛中的应用。
8.如权利要求1所述的西番莲PeWOX-67基因、或者如权利要求2所述的蛋白质、或者如权利要求3所述的重组载体或宿主菌或表达盒在提高植物抗旱性中的应用。
9.一种引物对，其特征在于，所述引物对为ATGACGGGTGATTATCCGTTT和TCAGACAAAGGACCAGTTGATGA，或者
所述引物对为TGCCATGGATGACGGGTGATTATCCGTTT和CGGACTAGTGACAAAGGACCAGTTGATGAACA，或者
所述引物对为CAAGCTTATGACGGGTGATTATCCGTTT和CGGGATCCGACAAAGGACCAGTTGATGAACA。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310895953.8A CN116640780B (zh) | 2023-07-20 | 2023-07-20 | 西番莲PeWOX-67基因及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310895953.8A CN116640780B (zh) | 2023-07-20 | 2023-07-20 | 西番莲PeWOX-67基因及其应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN116640780A true CN116640780A (zh) | 2023-08-25 |
| CN116640780B CN116640780B (zh) | 2023-09-22 |
Family
ID=87643720
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202310895953.8A Active CN116640780B (zh) | 2023-07-20 | 2023-07-20 | 西番莲PeWOX-67基因及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN116640780B (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116926086A (zh) * | 2023-09-15 | 2023-10-24 | 中国热带农业科学院三亚研究院 | 西番莲PeARF-1基因及其应用 |
| CN116926085A (zh) * | 2023-09-15 | 2023-10-24 | 中国热带农业科学院三亚研究院 | 西番莲PeERF-2基因及其应用 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103183731A (zh) * | 2013-04-03 | 2013-07-03 | 杭州师范大学 | 石斛DnMYB类转录因子、编码基因、载体、工程菌及应用 |
| CN103882053A (zh) * | 2008-11-03 | 2014-06-25 | 瑞典树木科技公司 | 植物材料、植物以及产生具有改变的木质素特性之植物的方法 |
| KR101664206B1 (ko) * | 2015-05-15 | 2016-10-10 | 명지대학교산학협력단 | 식물의 환경 스트레스 내성을 증가시키는 벼 유래의 OsWOX13 유전자 및 이의 용도 |
| US20190225976A1 (en) * | 2016-10-11 | 2019-07-25 | Vib Vzw | Means and methods for improved regeneration |
-
2023
- 2023-07-20 CN CN202310895953.8A patent/CN116640780B/zh active Active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103882053A (zh) * | 2008-11-03 | 2014-06-25 | 瑞典树木科技公司 | 植物材料、植物以及产生具有改变的木质素特性之植物的方法 |
| CN103183731A (zh) * | 2013-04-03 | 2013-07-03 | 杭州师范大学 | 石斛DnMYB类转录因子、编码基因、载体、工程菌及应用 |
| KR101664206B1 (ko) * | 2015-05-15 | 2016-10-10 | 명지대학교산학협력단 | 식물의 환경 스트레스 내성을 증가시키는 벼 유래의 OsWOX13 유전자 및 이의 용도 |
| US20190225976A1 (en) * | 2016-10-11 | 2019-07-25 | Vib Vzw | Means and methods for improved regeneration |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| MARIANA 等: "Identification and Characterization of the WUSCHEL-related homeobox (WOX) Genes Family in Passiflora organensis", 《REV TRAB. INICIAÇ》, no. 26, pages 1 * |
| 艾安涛 等: "茶树WOX基因家族的鉴定和表达模式分析", 《中国茶叶》, vol. 43, no. 3, pages 28 - 36 * |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116926086A (zh) * | 2023-09-15 | 2023-10-24 | 中国热带农业科学院三亚研究院 | 西番莲PeARF-1基因及其应用 |
| CN116926085A (zh) * | 2023-09-15 | 2023-10-24 | 中国热带农业科学院三亚研究院 | 西番莲PeERF-2基因及其应用 |
| CN116926086B (zh) * | 2023-09-15 | 2023-12-19 | 中国热带农业科学院三亚研究院 | 西番莲PeARF-1基因及其应用 |
| CN116926085B (zh) * | 2023-09-15 | 2023-12-19 | 中国热带农业科学院三亚研究院 | 西番莲PeERF-2基因及其应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN116640780B (zh) | 2023-09-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN116640780B (zh) | 西番莲PeWOX-67基因及其应用 | |
| CN110845590B (zh) | 野葡萄VyPPR基因及其编码蛋白在干旱胁迫中的应用 | |
| CN105255915B (zh) | 拟南芥AtGDSL基因在油菜抗菌核病及促进种子萌发中的应用 | |
| CN107698673A (zh) | 红掌AaMYB3转录因子及其编码基因与应用 | |
| CN107056911B (zh) | 一种促进植物提前开花的草莓转录因子及其应用 | |
| CN114606245B (zh) | 茶树CsVAAT3基因及其应用 | |
| CN109852618A (zh) | 一种节瓜WRKY类转录因子基因CqWRKY1及其应用 | |
| CN111304216B (zh) | 水稻低温萌发相关基因OsDJC58及其应用 | |
| CN110452917B (zh) | 野葡萄VyGOLS基因及其编码蛋白在干旱胁迫中的应用 | |
| CN109880830B (zh) | 桃多肽激素合成基因PpRGF1及其应用 | |
| CN113881685B (zh) | 促进植物器官产生红色色泽的基因PpHSP20-like1及其应用 | |
| CN116926086B (zh) | 西番莲PeARF-1基因及其应用 | |
| CN116926085B (zh) | 西番莲PeERF-2基因及其应用 | |
| CN114214333A (zh) | 一种调控植物叶表皮毛发育和次生壁厚度的基因及其应用 | |
| CN108948162B (zh) | 一种花生逆境胁迫基因AhDOG1L及其应用 | |
| CN114941003B (zh) | 野葡萄VyMPBQ基因及其编码的蛋白和应用 | |
| CN113957083B (zh) | 一种花生脂氧合酶基因AhLOX29及其克隆与功能表达方法、应用 | |
| CN116286869B (zh) | 一种羽毛针禾糖转运蛋白基因SpSWEET14在提高植物抗寒性中的应用 | |
| CN113817746B (zh) | 节瓜bHLH类转录因子基因Cq-bHLH92及其应用 | |
| CN108410829A (zh) | 蒙古沙冬青叶绿体ω-3脂肪酸脱饱和酶AmFAD7编码基因与应用 | |
| CN110885841B (zh) | 葡萄VyCYP89A2基因及其编码蛋白和基因在抗旱品种育种中的应用 | |
| CN114736278B (zh) | 一种马铃薯花色素苷生物合成负调控基因、转录因子及应用 | |
| CN117431256B (zh) | 一个小麦黄花叶病抗病基因TaRx-2D及其编码的蛋白和应用 | |
| CN111560382B (zh) | 调控油菜春化过程的基因BnGF14a及其应用 | |
| CN112280779B (zh) | 启动子pNtab3450及其表达载体和应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |