CN114350677B

CN114350677B - OsWRKY53基因在负向调控水稻分蘖形成中的应用

Info

Publication number: CN114350677B
Application number: CN202210029684.2A
Authority: CN
Inventors: 田晓杰; 卜庆云; 李秀峰; 王臻昱
Original assignee: Northeast Institute of Geography and Agroecology of CAS
Current assignee: Northeast Institute of Geography and Agroecology of CAS
Priority date: 2022-01-05
Filing date: 2022-01-12
Publication date: 2023-05-16
Anticipated expiration: 2042-01-12
Also published as: CN114350677A

Abstract

OsWRKY53基因在负向调控水稻分蘖形成中的应用。涉及植物基因工程领域，尤其涉及一种水稻OsWRKY53基因的新应用。本发明提供OsWRKY53基因在负向调控水稻分蘖形成中的应用。即敲除OsWRKY53基因后，水稻分蘖数目增多。增加水稻分蘖数目的方法为：利用CRISPR/Cas9方法靶向突变水稻OsWRKY53基因，获得敲除突变体oswrky53。本发明应用于水稻分蘖调控。

Description

OsWRKY53基因在负向调控水稻分蘖形成中的应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程领域，尤其涉及一种水稻OsWRKY53基因的新应用。

背景技术

水稻(Oryza sativa L.)是重要的粮食作物之一，世界上一半以上的人口都以其为主食，中国的水稻种植面积居世界第二位，而总产量位居世界第一，因此在农业生产和发展中具有重要的地位。近些年来，理想株型水稻新品种的培育是育种家们的关注重点，力求通过筛选高质、高产水稻新株型，实现水稻产量的新突破。

水稻单株有效穗数、每穗粒数和千粒重是决定产量的3个基本要素。分蘖是构成水稻株型的重要农艺性状之一，其数目直接决定有效穗数。因此，水稻分蘖的研究和应用具有十分重要的意义。水稻分蘖数的形成主要受环境因素、植物激素和基因调控三方面的影响，通过基因编辑的方式对水稻分蘖进行调控，将其应用于水稻分子设计育种，培育高质、高产新株型，实现作物产量的提高是一项十分意义的工作。

OsWRKY53基因是一个功能较强大的水稻转录因子，被报道能够参与调控水稻BR信号反应、参与调控水稻叶倾角和粒型的发育、正向调控水稻稻瘟病反应、负向调控水稻白叶枯病反应、正向调控病原体防御反应、负向调控咀嚼式虫害防御反应。但OsWRKY53在水稻分蘖数上的调控功能未见报道，

发明内容

本发明的目的是要提供OsWRKY53基因在水稻分蘖数上的调控中的新用途。

本发明提供OsWRKY53基因在负向调控水稻分蘖形成中的应用。

进一步的，所述负向调控水稻分蘖为敲除OsWRKY53基因后，水稻分蘖数目增多。

本发明还提供一种增加水稻分蘖数目的方法包括以下步骤：利用CRISPR/Cas9方法靶向突变水稻OsWRKY53基因，获得敲除突变体oswrky53。

进一步的，所述利用CRISPR/Cas9方法靶向突变水稻OsWRKY53基因的具体方法为：

一、根据OsWRKY53基因的CDS序列设计两对靶点引物F1、R1、F2和R2，构建OsWRKY53基因编辑载体

二、将OsWRKY53基因编辑载体转入农杆菌EHA105中，利用农杆菌介导法转化水稻，获得转基因水稻植株；

三、以转基因水稻植株的DNA为模板，用鉴定引物F3和R3进行PCR扩增，筛选出位点编辑纯合的oswrky53突变体。

本发明的有益效果：

水稻单株有效穗数、每穗粒数和千粒重是决定产量的3个基本要素。而单株有效穗数由成蘖数和成穗率直接决定，因而水稻分蘖数的研究对作物产量的提高具有十分重要的意义。

水稻分蘖的形成主要受环境因素、植物激素和基因调控三方面的影响，本发明首次发现水稻转录因子OsWRKY53基因负向调控水稻分蘖的形成，通过基因编辑的方式，在水稻品种龙粳11、龙稻16和稻花香2号中敲除OsWRKY53基因后，筛选出OsWRKY53基因编辑纯合的oswrky53突变体。连续大田种植3年，分别统计3年农艺性状。结果显示这3种遗传背景下的oswrky53突变体，分蘖数均显著增多，说明OsWRKY53负向调控水稻的分蘖数的形成。

本发明发现了OsWRKY53基因所调控的一个新功能，为水稻株型育种提供理论支撑。

附图说明

图1为龙粳11、龙稻16和稻花香遗传背景下的oswrky53突变体突变类型和测序结果；

图2为龙粳11遗传背景下oswrky53突变体及其对照总体形态图；

图3为龙粳11遗传背景下oswrky53突变体及其对照的分蘖放大图；

图4为2019年9月龙粳11遗传背景下oswrky53突变体及其对照分蘖数统计结果；

图5为2020年3月龙粳11遗传背景下oswrky53突变体及其对照分蘖数统计结果；

图6为2020年9月龙粳11遗传背景下oswrky53突变体及其对照分蘖数统计结果；

图7为龙稻16遗传背景下oswrky53突变体及其对照总体形态图；

图8为2019年9月龙稻16遗传背景下oswrky53突变体及其对照分蘖数统计结果；

图9为2020年3月龙稻16遗传背景下oswrky53突变体及其对照分蘖数统计结果；

图10为2020年9月龙稻16遗传背景下oswrky53突变体及其对照分蘖数统计结果；

图11为稻花香2号遗传背景下oswrky53突变体及其对照总体形态图；

图12为2019年9月稻花香2号遗传背景下oswrky53突变体及其对照分蘖数统计结果；

图13为2020年3月稻花香2号遗传背景下oswrky53突变体及其对照分蘖数统计结果；

图14为2020年9月稻花香2号遗传背景下oswrky53突变体及其对照分蘖数统计结果。

具体实施方式

下面对本发明的实施例做详细说明，以下实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方案和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1：构建OsWRKY53基因编辑载体

1、将OsWRKY53基因的CDS序列输入CRISPR Primer Designer软件，设计两对靶点引物(F1和R1；F2和R2)。

正向引物F1：5'-GGCATTCCAGTCGTACCTCTGAGC-3'

反向引物R1：5'-AAACGCTCAGAGGTACGACTGGAA-3'

正向引物F2：5'-GCCGAGCTGGAGGACGGGTACAAC-3'

反向引物R2：5'-AAACGTTGTACCCGTCCTCCAGCT-3'

2、将100μM上下游引物各取1μl加入到98μl的0.5×TE溶液中，90℃热激30s，形成打靶接头，移转至室温冷却，完成退火过程。

3、将以上2个打靶接头分别连接到U3和U6a的gRNA表达盒上，得到连接产物。PCR程序为：37℃ 5min，20℃ 5min，5个循环。

表1

pYL-U3/U6a-gRNA载体(10ng/μl)	1.0μl
		打靶接头(0.1μM)	1.0μl
<![CDATA[10×T<sub>4</sub> DNA ligase buffer]]>	1.0μl
		<![CDATA[T<sub>4</sub> DNA连接酶]]>	0.5μl
Bsa Ⅰ限制性内切酶	0.1μl
		<![CDATA[ddH<sub>2</sub>O]]>	补至10μl

4、通过巢式PCR的方法扩增gRNA表达盒

(1)以步骤3连接产物为模板进行第一轮PCR扩增，PCR程序：98℃ 2min；98℃ 10s，60℃ 10s，72℃ 20s，共25个循环；72℃ 5min。

表2

(2)将第一轮PCR产物稀释10倍，以其为模板进行第二轮PCR扩增，PCR程序：98℃2min；98℃ 10s，60℃ 10s，72℃ 30s，25个循环；72℃ 5min。

表3

模板	1μl
		<![CDATA[B<sub>n</sub>'引物(10μM)]]>	0.3μl
<![CDATA[B<sub>n+1</sub>引物(10μM)]]>	0.3μl
		5×PrimerSTAR GXL Buffer	4μl
PrimerSTAR GXL DNA Polymerase	0.2μl
		dNTP(2.5mM)	1μl
<![CDATA[ddH<sub>2</sub>O]]>	补至18μl

本步骤操作所涉及到的通用引物序列为：

U-F:5'-CTCCGTTTTACCTGTGGAATCG-3'

gRNA-R:5'-CGGAGGAAAATTCCATCCAC-3'

B1':5'-TTCAGAGGTCTCTCTCGCACTGGAATCGGCAGCAAAGG-3'

B2:5'-AGCGTGGGTCTCGTCAGGGTCCATCCACTCCAAGCTC-3'

B2':5'-TTCAGAGGTCTCTCTGACACTGGAATCGGCAGCAAAGG-3'

BL:5'-AGCGTGGGTCTCGACCGGGTCCATCCACTCCAAGCTC-3'

5、将上述第二轮PCR获得的片段连接入pYLCRSPR/Cas9-MT载体骨架上，即完成敲除载体的构建。pYLCRSPR/Cas9-MT载体骨架购买自淼灵质粒平台(www.miaolingbio.com)。

表4

pYLCRISPR/Cas9-MT质粒(100ng/μL)	1μL
		各回收PCR产物	20～40ng
BsaI	1μL
		10×Cutsmart Buffer	1.5μL
<![CDATA[ddH<sub>2</sub>O]]>	补至15μL

PCR程序：37℃，15min.

随后，在上述体系基础上加入连接酶，连接体系为：

表5

<![CDATA[T<sub>4</sub> DNA酶]]>	0.1μL
		10x DNA ligase buffer	1.5μL

PCR程序：37℃ 5min，10℃ 5min，20℃ 5min，共15个循环。

6、连接产物转化大肠杆菌

(1)将步骤5的连接产物全部加入至大肠杆菌Top10感受态，用手指轻轻弹动管底，使连接产物与感受态完全混匀，冰上静止30min。

(2)42℃，热激90s，迅速转移至冰上2min。

(3)加入800μl LB液体培养基，37℃，120rpm孵育1h。

(4)将上述大肠杆菌涂布于含50μg/ml的卡那霉素抗性的的固体LB培养基上。

7、鉴定阳性克隆

(1)混合PCR体系

表6

(2)PCR程序如下：95℃ 3min；95℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 1min，35个循环；72℃10min。

8、挑取上述PCR鉴定出的阳性克隆至10ml左右液体LB培养基中(50μg/ml的卡那霉素)，37℃，120rpm孵育12h以上，进行质粒的提取，质粒提取方法参照康为世纪的质粒提取试剂盒。

实施例2：转化农杆菌EHA105

1、将EHA105感受态从-80℃冰箱取出，置于冰上融化。

2、将0.5～1μg的目的质粒加入到100ul EHA105感受态中，冰上放置30min。

3、迅速置于液氮中5min。

4、从液氮中取出，迅速置于37℃水预锅中水浴5min。

5、转移至冰上2min。

6、加入800μl LB液体培养基，置于全温震荡器(购自MKN公司)中，28℃，120rpm孵育4～5h。

7、离心，弃大部分上清，将剩余菌液涂抹于含有卡那霉素(50μg/ml)(购自Amresco)和利福平(50ug/ml)(购自Amresco)的LB固体培养基上，28℃培养3天左右。

8、待长出菌落后，进行菌落PCR鉴定，鉴定出阳性克隆。

9、挑取阳性克隆至加有相应抗生素和利福平的液体LB培养基中，28℃，180rpm培养16h左右，此时的菌液可以用30％的甘油按1:1的体积比进行保存，存至-80℃冰箱，侵染愈伤组织时，从-80℃取出进行活化即可。

实施例3：oswrky53突变体的获得

1、农杆菌侵染水稻愈伤组织

(1)从-80℃冰箱取出以上目的存菌，按1:100的比例加入含有卡那霉素(50μg/ml)和利福平(50μg/ml)的液体LB培养基中，180rpm，28℃培养过夜。

(2)将菌液培养至肉眼看上去像橙汁一样的颜色(OD＝1.0左右)，方可从培养箱中取出。

(3)取500μl左右菌液至1.5ml离心管中，5000rpm，28℃，离心3min，弃上清，可以看到管底有白色的菌团。用300ul含有20μg/ml的乙酰丁香酮(购自Aldrich)的液体共培培养基轻轻吹打管底菌团，使其均匀的悬浮在液体培养基中。

(4)挑选生长状态良好的龙粳11(LJ11)、龙稻16(LD16)和稻花香(DHX)的愈伤组织至50ml离心管中，大约至离心管刻度5ml左右。

(5)加入20ml含有20μg/ml的乙酰丁香酮的液体共培培养基，然后将上述悬浮好的300μl菌液全部加入到50ml离心管中，持续轻柔混匀2～3min，以进行侵染。

(6)将液体共培培养基倒掉，然后将侵染好的愈伤组织转移至铺有滤纸的培养皿中，吸附多余的培养基，这一过程大约需要1min左右。在固体共培培养基上铺一层滤纸，使滤纸浸透，然后将上述侵染好的愈伤组织转移至此固体培养基上，28℃暗培养2～3天。

2、恢复培养

(1)除菌：被侵染的愈伤暗培养2～3天后，将愈伤颗粒转移至50ml离心管中，用含有400μg/ml羧卞青霉素(购自Amresco)的无菌水，清洗愈伤组织4～5遍，每次持续1min左右。

(2)再用无菌水清洗愈伤组织2～3遍，转移至铺有滤纸的培养皿上，吸干多余水分。将上述愈伤组织转移至含有400μg/ml羧卞青霉素的恢复培养基上，28℃人工气候培养箱(24h光培养)恢复培养4～5天。

3、筛选培养

恢复培养4～5天后，将恢复培养基上的愈伤组织转移至含有400μg/ml羧卞青霉素和50μg/ml潮霉素(购自Roche)的筛选培养基上。将其转移至28℃人工气候培养箱(24h光培养)中培养30天左右。

4、分化培养

将筛选培养基上的抗性愈伤转移至分化培养基上，每瓶移至一簇愈伤。将其置于28℃人工气候培养箱(24h光培养)中培养30天左右，即可分化出转基因苗。

5、转基因苗的鉴定

(1)将20mg左右水稻叶片装入2ml离心管中，加入经高压灭菌的钢珠，用液氮速冻，然后剧烈震荡，直至叶片成粉末状。

(2)将钢珠倒出，加入700μl DNA裂解液，65℃水浴30min，使其充分裂解。

(3)加入700μl氯仿，上下剧烈颠倒混匀，室温静置10min。

(4)12000rpm，4℃，离心10min。

(5)取上清至一新的1.5ml离心管中，加入等体积异丙醇，上下颠倒混匀，室温静置10min。

(6)12000rpm，4℃，离心10min。

(7)弃上清，即可看到管底有白色沉淀，该沉淀即为DNA和蛋白的混合物，加入70％乙醇清洗沉淀。

(8)12000rpm，4℃，离心10min。弃上清并置于室温晾干，待乙醇挥发干净后，加入50～100μl去离子水溶解沉淀，此时的液体即为水稻的DNA粗提液，可用于进行下一步PCR鉴定。

(9)用以上粗提的DNA为模板，按照上述Takara公司的的LA Taq DNA Polymerase说明书，用鉴定引物(F3和R3)进行扩增，PCR产物送至金唯智公司进行测序，直至筛选出位点编辑纯合的oswrky53(LJ11)、oswrky53(LD16)和oswrky53(DHX)突变体。

F3:5'-CGGGGTGCCCAAGTTCAAGTC-3'

R3:5'-ATGGAGCAGCCGTTGTAGGTG-3'

如图1所示，是龙粳11、龙稻16和稻花香2号遗传背景下，获得的3种突变体材料，oswrky53(LJ11)、oswrky53(LD16)和oswrky53(DHX2)的编辑类型和测序结果。以上结果显示，本实验所采用的的3种不同遗传背景下的oswrky53突变体均为纯合的基因编辑材料。

实施例4：大田实验统计水稻农艺性状

将oswrky53(LJ11)、oswrky53(LD16)、oswrky53(DHX2)及各自对照材料分别于2019年5月种植于黑龙江省，2019年9月统计分蘖等农艺性状；2019年11月种植于海南省，2020年3月统计分蘖等农艺性状；2020年5月种植于黑龙江省，2020年9月统计分蘖等农艺性状，连续统计3年。

图2为龙粳11遗传背景下oswrky53突变体及其对照总体形态图，由图2可以看出，敲除OsWRKY53基因后，与对照相比水稻植株矮小。图3为龙粳11遗传背景下oswrky53突变体及其对照的分蘖放大图。由图3可以看出，敲除OsWRKY53基因后，与对照相比水稻分蘖数增多。图4为2019年9月龙粳11遗传背景下oswrky53突变体及其对照分蘖数统计结果。图5为2020年3月龙粳11遗传背景下oswrky53突变体及其对照分蘖数统计结果。图6为2020年9月龙粳11遗传背景下oswrky53突变体及其对照分蘖数统计结果。由统计结果可知，与对照相比oswrky53突变体水稻分蘖数显著增多。

图7为龙稻16遗传背景下oswrky53突变体及其对照总体形态图。由图7可以看出oswrky53突变体分蘖数较对照增多，图8为2019年9月龙稻16遗传背景下oswrky53突变体及其对照分蘖数统计结果。图9为2020年3月龙稻16遗传背景下oswrky53突变体及其对照分蘖数统计结果。图10为2020年9月龙稻16遗传背景下oswrky53突变体及其对照分蘖数统计结果。由统计结果可知，与对照相比oswrky53突变体水稻分蘖数显著增多。

图11为稻花香2号遗传背景下oswrky53突变体及其对照总体形态图。由图11可以看出oswrky53突变体分蘖数较对照增多，图12为2019年9月稻花香2号遗传背景下oswrky53突变体及其对照分蘖数统计结果。图13为2020年3月稻花香2号遗传背景下oswrky53突变体及其对照分蘖数统计结果。图14为2020年9月稻花香2号遗传背景下oswrky53突变体及其对照分蘖数统计结果。由统计结果可知，与对照相比oswrky53突变体水稻分蘖数显著增多。

由以上实验，oswrky53(LJ11)、oswrky53(LD16)和oswrky53(DHX2)的分蘖数目较它们各自的对照都显著增多，且茎较对照显著变细。说明OsWRKY53能够抑制水稻分蘖的形成，负向调控水稻的分蘖数目。

序列表

<110> 中国科学院东北地理与农业生态研究所

<120> OsWRKY53基因在负向调控水稻分蘖形成中的应用

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ggcattccag tcgtacctct gagc 24

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

aaacgctcag aggtacgact ggaa 24

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gccgagctgg aggacgggta caac 24

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aaacgttgta cccgtcctcc agct 24

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ctccgtttta cctgtggaat cg 22

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cggaggaaaa ttccatccac 20

<210> 7

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ttcagaggtc tctctcgcac tggaatcggc agcaaagg 38

<210> 8

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

agcgtgggtc tcgtcagggt ccatccactc caagctc 37

<210> 9

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ttcagaggtc tctctgacac tggaatcggc agcaaagg 38

<210> 10

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

agcgtgggtc tcgaccgggt ccatccactc caagctc 37

Claims

1.OsWRKY53基因在负向调控水稻分蘖数目中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述负向调控水稻分蘖数目为敲除OsWRKY53基因后，水稻分蘖数目增多。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于增加水稻分蘖数目的方法包括以下步骤：利用CRISPR/Cas9方法靶向突变水稻OsWRKY53基因，获得敲除突变体oswrky53。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述利用CRISPR/Cas9方法靶向突变水稻OsWRKY53基因的具体方法为：

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于步骤一中靶点引物F1的序列为GGCATTCCAGTCGTACCTCTGAGC，引物R1的序列为AAACGCTCAGAGGTACGACTGGAA。

6.根据权利要求4或5所述的应用，其特征在于步骤一中靶点引物F2的序列为GCCGAGCTGGAGGACGGGTACAAC，引物R2的序列为AAACGTTGTACCCGTCCTCCAGCT。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于步骤三中鉴定引物F3的序列为CGGGGTGCCCAAGTTCAAGTC，鉴定引物R3的序列为ATGGAGCAGCCGTTGTAGGTG。