CN116656696A - 一种植物铁氧还蛋白PhFd基因及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种植物铁氧还蛋白PhFd基因及其应用，所述PhFd基因包括如序列表SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；植物铁氧还蛋白PhFd基因的CRISPR/Cas9敲除载体转入农杆菌，通过农杆菌介导转化矮牵牛，得到了PhFd基因敲除植株，以调控矮牵牛花期延缓衰老。通过实验证明PhFd在矮牵牛花瓣衰老过程具有的功能，证明该基因在延缓矮牵牛花瓣衰老中具有显著的效果。
Description
技术领域
本发明涉及一种植物铁氧还蛋白PhFd基因及其应用，具体涉及一种延缓观赏植物矮牵牛花瓣衰老的方法，属于生物基因工程技术领域。
背景技术
植物铁氧还蛋白(ferredoxin，Fd)是一类铁硫2Fe–2S簇蛋白，最早是从欧芹(Petroselinum crispum)中获得，作为一个大的家族在植物中普遍存在，作为可溶性的酸性电子载体，可将电子从光系统I(PSI)传递到叶绿体基质新陈代谢过程中的各个受体系统。Fd可以分为光合型和非光合型两种类型。光合型Fd通常存在于叶片等绿色组织中，而非光合型Fd则存在于花瓣、幼果、根和树皮等富含质体(除叶绿体外)的组织中。与光/暗条件无关，非光合型Fd的表达不会改变。Fd基因功能多样，Fd基因不仅在光呼吸、氨同化、生物固氮、硝酸盐还原等植物生理代谢方面具有重要作用，而且Fd基因在植物抵御逆境中的胁迫也有一定作用。
延长观赏植物的观赏期是园艺育种者一直以来关注的问题。传统育种手段虽然育成了一些花朵寿命较野生种延长的花卉新品种。但是，目前的现状远远不能满足生产和消费的需要。传统的花卉育种方法存在随意性大，周期长等问题。化学药剂虽然能在一定程度上延长花卉的观赏寿命，但存在污染环境，增加成本等问题。因此，随着植物分子生物学技术的发展，研究者对植物衰老的分子机理产生了浓厚的兴趣，并期望能将研究成果应用于基因工程方法来延缓花朵的衰老上。但是，目前尚没有采用基因工程方法延缓观赏植物矮牵牛花瓣衰老的具体方案。
发明内容
针对现有技术存在的上述不足，本发明的目的在于提供一种植物铁氧还蛋白PhFd基因及其应用，以延缓观赏植物矮牵牛花瓣衰老的问题。
为了解决上述问题，本发明采用如下技术方案：
本发明提供一种植物铁氧还蛋白PhFd基因，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
进一步，本发明将所述植物铁氧还蛋白PhFd基因用于调控矮牵牛花期延缓衰老。
具体为，将所述植物铁氧还蛋白PhFd基因的CRISPR/Cas9敲除载体转入农杆菌，通过农杆菌介导转化矮牵牛，得到了PhFd基因敲除植株，以调控矮牵牛花期延缓衰老。
相比现有技术，本发明有如下有益效果：
1、本发明提供一种植物铁氧还蛋白PhFd基因，并用于调控矮牵牛花期延缓衰老，有效延长花期的时间达2－4天。
2、本发明将构建好的植物铁氧还蛋白PhFd基因的CRISPR/Cas9敲除载体转入农杆菌，通过农杆菌介导转化矮牵牛，得到了PhFd基因敲除植株，通过实验证明PhFd在矮牵牛花瓣衰老过程具有的功能，证明该基因在延缓矮牵牛花瓣衰老中具有显著的效果。
3、本发明以‘W115’矮牵牛为材料，在已有研究的基础上将构建好的PhFd基因CRISPR/Cas9敲除载体通过农杆菌介导转化矮牵牛，成功获得矮牵牛PhFd基因敲除植株4株。通过观察PhFd基因敲除植株的花期，每个株系选取10朵花进行观察拍照并记录从开花至花朵完全凋谢的时间。经统计分析得出敲除PhFd基因的矮牵牛花期平均为8d，花期最长的为10d；而对照‘W115’平均花期为6d，最长的为8d。因此，PhFd在矮牵牛花瓣衰老中扮演着重要角色，敲除其基因可以有效地延长矮牵牛花的花期。为进一步分析PhFd调控矮牵牛花瓣衰老的分子机制奠定了基础。
附图说明
图1含pYLCRISPR/Cas9-PhFd农杆菌菌落。
图2菌液PCR检测；注：M：Marker 1-7：已转化pYLCRISPR/Cas9-PhFd的农杆菌。
图3pYLCRISPR/Cas9-PhFd转基因植株的获得；注：A.共培养B.筛选培养C.分化出愈伤D.诱导生根E.植株生根F.移栽的植株。
图4候选转基因植株基因组的DNA提取结果；注：M：Marker 1-10：提取的候选转基因植株的DNA。
图5候选转基因植株PCR检测；注：M：Marker 1-10：候选转基因植株扩增产物N：阴性对照；P：阳性对照。
图6抗性转化苗Fd基因PCR检测；注：M：Marker 1-6：转基因植株扩增产物。
图7突变植株靶位点测序序列分析。
图8花期对比图；注：A：花朵开放情况B：花期的比较。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明作进一步详细的说明，但本发明并不局限于此。
本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和原料，如无特殊说明，均可以从商业途径获得或根据已知的方法制备获得。本发明中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
本发明以‘W115’矮牵牛为材料，在已有研究的基础上将构建好的PhFd基因CRISPR/Cas9敲除载体通过农杆菌介导转化矮牵牛，成功获得矮牵牛PhFd基因敲除植株4株。在矮牵牛中筛选到一个铁氧还蛋白PhFd基因，其在矮牵牛花瓣衰老过程中表达显著上调，推测其可能参与花瓣衰老过程。
实施例
1材料与方法
1.1材料
植物材料以‘W115’矮牵牛作为遗传转化的外植体来源。菌株为根癌农杆菌(Agrobacterium tumefacien)感受态AGL0。pYLCRISPR/Cas9-PhFd基因敲除(编辑)载体由本实验室前期构建。
1.2重组质粒导入农杆菌
将已经构建好的pYLCRISPR/Cas9-PhFd载体转入到农杆菌AGL0中。电转步骤如下：
(1)将电转杯用纯水清洗干净后于冰上预冷；(2)在2mL离心管中加入10μL农杆菌感受态AGL0、90μL无菌水、1μL的质粒载体轻弹混匀；(3)将上述中的混合物转移到预冷的电转杯中；(4)电击转化；(5)电转杯中加入80μL无抗的LB培养液并混匀；(6)将电转杯中的混合液转移到一个新的离心管中后放200rpm、28℃的摇床中培养3h；(7)6000rpm离心1min；(8)去掉上清液，留大约100μL菌液混匀，涂于含相应抗生素的YEP培养基平板；(9)28℃倒置培养3d左右。
1.3农杆菌菌液PCR鉴定
在Cas9上设计一对用于农杆菌菌液PCR鉴定的引物(B0454+B0455)。在超净工作台中挑取YEP固体培养基上的单菌落，接种于700μLYEP液体培养基中，28℃、200rpm振荡培养6h，取1μL菌液作为模板进行PCR扩增。程序结束后配制1.2％的琼脂糖凝胶，取6μLPCR产物点样。随后进行琼脂糖凝胶电泳看片段是否为预期条带大小。将符合预期电泳条带的农杆菌菌落接种于YEB液体培养基，并放在28℃转速为180rpm中的摇床中振荡培养1d。扩大培养结束后取出菌液将菌液6000rpm离心5min。倒去上清液用约50mL MS液体培养基重悬菌体备用。
反应体系：灭菌水5.5μL、Es Taq Master Mix7.5μL、B0454与B0455各0.5μL、菌液1μL，共15μL。反应程序：94℃预变性5min；94℃变性30s；75℃退火30s；72℃延伸32s；36个循环；72℃5min后延伸15℃短暂保存。
表1.1引物序列表
1.4农杆菌介导的矮牵牛遗传转化
采用农杆菌介导的矮牵牛叶盘转化法转化矮牵牛‘W115’。具体步骤如下：(1)取健康成熟中等大小的矮牵牛叶片放于自来水中；用0.5％次氯酸钠消毒10min；用灭菌水清洗3次(分别在3个不同的培养瓶中清洗在10min内清洗完毕)；(2)在培养基皿中倒入少量灭菌水，在无菌水中将叶片切成约0.5cm2大小的外植体，一个转化约90个左右外植体；(3)切好后放在一个加灭菌水的培养皿中暂存，将切好的外植体于上述重悬好的菌液中浸染约10min；(4)将浸染完成后的外植体正面向上(即叶片上表面)铺于共培养培养基；做好标记和记录。(5)将经过共培养的矮牵牛外植体转入筛选培养基上进行选择培养；(6)间隔一周更换一次筛选培养基，并随时观察生长情况；(7)待矮牵牛植株长到5-7cm且根粗壮时，将其培养瓶的瓶盖打开放置6h，然后将其取出，并用水清洗干净将其移栽入蛭石和蚯蚓土(1：3)的基质中并盖保湿盖进行保湿。
1.5DNA提取
采用CTAB法(十六烷基三甲基溴化铵)提取候选转基因植株总DNA。DNA提取步骤如下：(1)在1.5mL离心管中放入少量矮牵牛叶片然后用研棒研磨成匀浆；(2)加65℃预热的CTAB700μL，65℃热水浴0.5h；(3)加氯仿异戊醇700μL摇匀，12000rpm离心10min；(4)取上清液600μL，加等体积氯仿异戊醇，12000rpm离心10min；(5)取上清液400μL，加1000μL无水乙醇与50μL NaAc；(6)用液氮冷冻5min，12000rpm、4℃离心30min后去上清液；(7)70％酒精洗2次；开盖室温晾干5min；(8)加50μL TE溶解-20℃保存备用。
1.6候选转基因植株的PCR鉴定
以提取候选转基因植株的DNA为模板，用Cas9上特异性引物B0454和B0455进行PCR扩增，随后进行琼脂糖凝胶电泳，鉴定出转基因成功的阳性矮牵牛植株。以PCR鉴定的阳性转基因植株DNA为模板，采用PhFd基因上的特异性引物B0629与B0630进行PCR扩增，扩增结束后电泳检测其长度是否与预期一致。然后采用Gel DNA Extraction Mini Kit产物纯化试剂盒进行产物回收，回收具体步骤见说明书(南京诺唯赞生物科技股份有限公司/>Gel DNA Extraction Mini Kit)。将回收后的产物用PhFd基因上的特异性引物B0929送往华大生物公司测序，检测靶点敲除位置的DNA序列是否发生改变，从而判断基因敲除是否成功。
1.7基因敲除植株花期观测
以‘W115’矮牵牛为对照观察PhFd基因敲除植株的花期变化，每个株系选取10朵矮牵牛花进行观察、拍照并记录从开花至花朵完全凋谢的时间。
2结果与分析
2.1农杆菌介导的矮牵牛遗传转化过程分析
将构建好的pYLCRISPR/Cas9-PhFd质粒产物通过电转法转入根癌农杆菌AGL0中，然后接种于YEB固体培养基上，28℃倒置培养2d后长出了颗粒饱满的单菌落(如图1)。挑取大小颗粒饱满的单菌落于含有卡拉霉素和利福平抗性的YEB液体培养基中于摇床培养，待菌液浑浊时选取Cas9上的特异性引物B0455和B0454进行菌液PCR扩增，并通过琼脂凝胶电泳检测。在成像仪上观察到条带大小约为800bp左右(如图2)，长度与预期一致。结果显示，已将基因敲除载体pYLCRISPR/Cas9-PhFd质粒成功转入农杆菌。阳性克隆检测正确后，采用农杆菌介导的矮牵牛叶盘转化法转化矮牵牛‘W115’，大约两周之后，未转pYLCRISPR/Cas9-PhFd质粒的外植体陆续枯黄死亡，转入质粒载体的外植体可分化出愈伤组织。将愈伤组织切下更换至新的培养基，待愈伤组织分化出2-3cm左右的抗性芽后，转入生根培养基中进行生根培养，后续将成功生根的矮牵牛植株移入蛭石和砂子(3:1)的基质中(图3)继续培养。转化一共使用120个外植体，得到大约50块愈伤组织，最后得到10株候选转基因苗。
2.2候选转基因植株的筛选鉴定
采用CTAB法提取候选转基因植株总DNA(图4)。以构建好的质粒载体pYLCRISPR/Cas9-PhFd为阳性对照，‘W115’矮牵牛植株为阴性对照，使用Cas9上的引物进行PCR扩增，目的片段长度约为788bp(图5)。结果显示有8株抗性转化苗扩增的条带与预期大小一致，分别为305-1、305-2、305-3、305-4、305-5、305-8、305-9、305-10，阳性转化率为80％。
2.3矮牵牛转化植株基因编辑情况分析
以上述8株转基因矮牵牛的DNA为模板，利用PhFd基因特异性引物B0629和B0630进行PCR扩增，扩增后采用Gel DNA Extraction Mini Kit产物纯化试剂盒进行回收纯化，将回收纯化的产物送往华大生物公司测序(图6)。测序结果比对分析发现8株阳性苗中305-3为4bp缺失和7bp缺失杂合突变，305-4和305-8都为1bp插入和4bp缺失杂合突变，305-5为一个T碱基缺失和一个A碱基缺失杂合突变(图7)。基因突变率达到50％(突变率＝突变数量/阳性苗数量)
2.4基因敲除植株花期分析
通过对比‘W115’矮牵牛和PhFd基因敲除植株的花期变化，发现敲除PhFd基因可以显著地延长矮牵牛的花期。具体而言，敲除PhFd基因的矮牵牛花期平均为8d，最长的为10d，而‘W115’矮牵牛花期平均为6d，最长的为8d(图8)。这一结果显示，铁氧还蛋白基因在矮牵牛花瓣衰老中扮演着重要的角色，敲除其基因可以有效地延长矮牵牛的花期。
3结论
在本研究中通过敲除矮牵牛中PhFd基因，通过观察PhFd基因敲除植株的花期，每个株系选取10朵花进行观察拍照并记录从开花至花朵完全凋谢的时间。经统计分析发现对照‘W115’平均花期为6d，最长的为8d。本发明显著延长了矮牵牛的花期平均约2d。由此可以证明，敲除其基因可以有效地延长矮牵牛花的花期。
最后需要说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制技术方案，本领域的普通技术人员应当理解，那些对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本技术方案的宗旨和范围，均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (4)
1.一种植物铁氧还蛋白PhFd基因，其特征在于，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO .1所示。
2.一种植物铁氧还蛋白PhFd基因的应用，其特征在于，将权利要求1所述植物铁氧还蛋白PhFd基因用于调控矮牵牛花期延缓衰老。
3.根据权利要求2所述植物铁氧还蛋白PhFd基因的应用，其特征在于，将权利要求1所述植物铁氧还蛋白PhFd基因的CRISPR/Cas9敲除载体转入农杆菌，通过农杆菌介导转化矮牵牛，得到了PhFd基因敲除植株，以调控矮牵牛花期延缓衰老。
4.根据权利要求3所述植物铁氧还蛋白PhFd基因的应用，其特征在于，具体步骤包括：利用基因敲除/编辑、RNAi技术敲除或者降低PhFD基因表达水平延迟花瓣衰老。
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