JP2004065088A - イネ白葉枯病菌の病原性遺伝子群およびその利用 - Google Patents
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Abstract
【課題】イネの重要な病原細菌であるイネ白葉枯病菌の病原性に関わる遺伝子を同定することを課題とする。さらに、被検イネについてイネ白葉枯病菌の病原性に関わる遺伝子の有無を指標とすることにより、イネ白葉枯病を簡便に診断することができる方法の提供を課題とする。
【解決手段】イネ白葉枯病菌から病原性遺伝子群及びその近傍領域のＤＮＡをクローン化し、イネ白葉枯病の病原性に関わる１４の新規遺伝子を見出した。該遺伝子のＤＮＡの有無を指標とすることにより、被検イネについて簡便かつ正確にイネ白葉枯病の診断を行うことができる。
【選択図】 なし
【解決手段】イネ白葉枯病菌から病原性遺伝子群及びその近傍領域のＤＮＡをクローン化し、イネ白葉枯病の病原性に関わる１４の新規遺伝子を見出した。該遺伝子のＤＮＡの有無を指標とすることにより、被検イネについて簡便かつ正確にイネ白葉枯病の診断を行うことができる。
【選択図】 なし
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、作物病害診断および作物育種に関する。
【０００２】
【従来の技術】
Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ菌（Ｆｌｅｉｓｃｈｍａｎｎ， Ｒ．Ｄ． ｅｔ ａｌ． （１９９５）． Ｗｈｏｌｅ−ｇｅｎｏｍｅ ｒａｎｄｏｍ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎｄ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ Ｒｄ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６９：４９６−５１２）の全ゲノム配列が報告されて以来、モデル微生物である大腸菌や枯草菌の全ゲノム配列、動物病原細菌をはじめとした多様な細菌の全ゲノム配列が報告されている。細菌は、ゲノムサイズが動物・植物に比べ遙かに小さく、また、同じ微生物である糸状菌に比べてもゲノムサイズは約１／１０以下であることから、近年の解析技術の向上とともに急速にゲノム解析が進展している。
【０００３】
ゲノム解析は、遺伝情報の根源であるゲノムを塩基配列レベルで明らかにすることによって、ゲノム上に存在するすべての遺伝子を解析し、そして遺伝子間のネットワークや相互作用等の生命現象全体を理解する上で貴重な情報をもたらすものと期待され、多種多様な生物で全世界的に盛んに行われている。特に動物病原細菌の分野においては、ヒトへの感染や疾病等の病原性機構解明やそこで得られる知見から、ゲノム創薬等様々な研究展開・応用が期待され、現在では、結核菌（Ｃｏｌｅ， Ｓ．Ｔ． ｅｔ ａｌ． （１９９８）． Ｄｅｃｉｐｈｅｒｉｎｇ ｔｈｅ ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ． Ｎａｔｕｒｅ ３９３：５３７−４４）をはじめとして大腸菌Ｏ−１５７（Ｈａｙａｓｈｉ， Ｔ． ｅｔ ａｌ． （２００１）． Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆＥｎｔｅｒｏｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ Ｅｓｃｈｅｌｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｏ１５７：Ｈ７ ａｎｄ ｇｅｎｏｍｉｃ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｗｉｔｈ ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｓｔｒａｉｎ Ｋ−１２． ＤＮＡ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ８：１１−２２）等、多くの種で全ゲノム配列が明らかとなりつつある。
【０００４】
一方、植物病原細菌の分野においては、１９９８年の第７回国際植物病理学会でゲノム解析に関する緊急ミーティングが開かれ、今後の展開に関して議論が行われた。植物病原細菌においても、動物病原細菌と同じ観点からゲノム解析に大きな期待がもたれ、今後の重要な研究の方向性として認識されつつある。当時、植物病原細菌のゲノム解析では、ブラジルのグループが先鞭をつけ、Ｘｙｌｅｌｌａ ｆａｓｔｉｄｉｏｓａの解析が進行しており、また、フランスのグループでは、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍの解析が予定されている。日本でも、イネ白葉枯病菌を候補としてゲノム解析を行うことが提案され、現在、ほぼ完了している。
【０００５】
イネ白葉枯病（ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｌｅａｆ ｂｌｉｇｈｔ ｏｆ ｒｉｃｅ）は、日本のみならずアジアの稲作地帯をはじめ、アフリカ、オーストラリア、ラテンアメリカ及び米国において発生する世界的に重要なイネの病害である。
【０００６】
本病を引き起こす病原細菌は、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚａｅ ｐｖ． ｏｒｙｚａｅ（イネ白葉枯病菌）で、イネ品種に対して病原性が異なる多数のレースの存在が知られ、病原性が高度に分化した細菌である。
【０００７】
葉枯れを引き起こす病原細菌は、主に葉縁に分布する水孔から通道管を通って導管内へ侵入し増殖する。増殖した細菌が水分の上昇を妨げるために、葉は局部的に萎ちょうし、葉枯れ（ｌｅａｆ ｂｌｉｇｈｔ）の症状が起こるものと考えられている。白葉枯病の発症メカニズムについては、毒素説などが知られているが、その詳細は不明であり、今後解明すべき問題の一つである。
【０００８】
また、本細菌が属するＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ属は、多様な植物に病気を引き起こす細菌で構成され、且つその種類も非常に多いことが知られ、農業上重要な細菌群である。
【０００９】
一方、感染相手（宿主）であるイネは、重要な穀物であると同時に、育種、病害抵抗性機構をはじめとした様々な植物の分子生物学的研究の一大モデルとして世界的に精力的に研究がなされているモデル植物である。
【００１０】
一般に、植物病原細菌が植物に病気を引き起こす過程には、宿主認識／感染成立と発病因子放出／発病という２つの過程があり、そこには多くの遺伝子が関与すると考えられている。しかし、詳細については未だ不明な点が多い。
【００１１】
現在までに、イネ白葉枯病菌においては、いくつかの病原性関連遺伝子がクローン化され、それらの機能解析が行われている。しかしながら、病原性関連遺伝子群の全体像を網羅的に把握し、またゲノム上での分布・位置関係を特定するといった分子生物学的基盤の確立を目指した総合的な解析は行われていない。
【００１２】
これまでイネ白葉枯病菌には有効な農薬等の資材がないため、その防除対策としては主にイネ白葉枯病抵抗性遺伝子を育種によって導入することで、イネ白葉枯病抵抗性品種を育成し栽培してきた。しかし、抵抗性遺伝子を導入した耐病性品種の栽培は新たな病原型（レース）を示す病原菌の出現とともに罹病化する、所謂、抵抗性の崩壊が報告されている。
【００１３】
また、病原菌の検出法としてはイネ白葉枯病菌に特異的に感染するファージを検出することによって、発生予察を行う方法が知られている。しかし、ＤＮＡの検出による簡便なイネ白葉枯病の診断技術はこれまでのところ知られていない。
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、イネの重要な病原細菌であるイネ白葉枯病菌の病原性に関わる遺伝子を同定することを目的とする。より詳しくは、イネ白葉枯病菌の病原性に関わる遺伝子の有無を指標とすることにより、被検イネについてイネ白葉枯病を簡便に診断することができる方法の提供を課題とする。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
一般に、植物、動物を問わず病原細菌は、病原を引き起こす遺伝子群をゲノムあるいはプラスミド上に大きなクラスター（病原性アイランド）を形成して存在させていることが知られている。本発明のイネ白葉枯病菌においても、そのような病原性遺伝子クラスターを形成している可能性が予測された。そこで、本発明者らは、特にイネ白葉枯病菌をはじめとした植物病原細菌において、病原性を発現する上で重要な病原性分泌装置（タイプＩＩＩ分泌装置）をコードするｈｒｐ遺伝子クラスターと、レース分化等の病原性の多様化に関わる非病原性遺伝子（ａｖｒｉｌｕｃｅｎｃｅ ｇｅｎｅ）の解析を中心に、鋭意研究を行った。
【００１６】
まず本発明者らは、植物−微生物相互作用における微生物側の病原性発現機構や応答機構解明のための分子生物学的基盤の確立をはかることに着手した。詳しくは、イネゲノム研究で得られる病害抵抗性遺伝子の解析を通して、植物−微生物相互作用の研究に応用展開されることを視野におき、本発明者らは、イネ白葉枯病菌のゲノム解析を行った。ゲノム解析に用いた菌株としては、イネゲノム研究においてイネ白葉枯病抵抗性遺伝子Ｘａ１（Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ， Ｓ． ｅｔ ａｌ． （１９９８）． Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｘａ１， ａ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｂｌｉｇｈｔ−ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｇｅｎｅ ｉｎ ｒｉｃｅ， ｉｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９５：１６６３−８）が単離され、その構造解析が行われていた点、即ち相互作用を解明するに当たり、抵抗性遺伝子（Ｘａ１）に対して非病原性遺伝子（ａｖｒＸａ１）を有する菌株を対象に、さらに多数の非病原性遺伝子を有すると考えられる（病原性スペクトラムが狭い）点を考慮した結果、日本のレースＩの代表菌株であるＭＡＦＦ３１１０１８（Ｔ７１７４）を供試した。
【００１７】
迅速かつ簡便的な病原菌の診断には、イネ白葉枯病菌に特異的な遺伝子領域等を増幅するＰＣＲによる検出が有効である。また、病害抵抗性品種には、病原菌由来の病原性遺伝子を植物体に導入することによって、植物側に常時抵抗性誘導させることが有効である。本発明者らは農業資源研究所で保存してある日本産のイネ白葉枯病菌から病原性遺伝子群及びその近傍領域のＤＮＡをクローン化し、その塩基配列を決定した結果、既存のデータベース上に有意な相同性を示さないイネ白葉枯病菌固有の１４の新規病原性遺伝子を同定することに成功した。これらの遺伝子はイネゲノム中には見出されないことから、被検イネについて、これらの新規病原性遺伝子の有無を指標とすることにより、簡便かつ正確にイネ白葉枯病の診断を行うことが可能である。従って、本発明者らによって見出された新規遺伝子は、非常に有用性の高いものと言える。本発明者らは実際に、該新規病原性遺伝子にハイブリダイズし、該遺伝子を増幅可能なＰＣＲプライマーセットを用いて、被検イネについてイネ白葉枯病菌を特異的に検出することに成功した。
【００１８】
また、本発明によって得られたイネ白葉枯病菌のゲノム解析に関する情報は、病原性機構解明のための有力な情報になるとともに、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ属細菌の病原性の多様性をはじめとした遺伝的多様性の解析や分類研究において有効な知見となるものと期待される。
【００１９】
即ち本発明は、イネ白葉枯病菌の新規病原性遺伝子群およびその利用に関し、より詳しくは、
〔１〕 イネ白葉枯病菌に由来する、下記（ａ）から（ｄ）のいずれかに記載のＤＮＡ。
（ａ）配列番号：２から２８のいずれかの偶数番号に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｂ）配列番号：１から２７のいずれかの奇数番号に記載の塩基配列のコード領域を含むＤＮＡ。
（ｃ）配列番号：２から２８のいずれかの偶数番号に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｄ）配列番号：１から２７のいずれかの奇数番号に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ。
〔２〕 下記（ａ）または（ｂ）のいずれかに記載のＤＮＡ。
（ａ）〔１〕に記載のＤＮＡの転写産物と相補的なアンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡ。
（ｂ）〔１〕に記載のＤＮＡの転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有するＲＮＡをコードするＤＮＡ。
〔３〕 〔１〕または〔２〕に記載のＤＮＡを含むベクター。
〔４〕 〔１〕または〔２〕に記載のＤＮＡまたは〔３〕に記載のベクターを保持する形質転換細胞。
〔５〕 植物細胞である、〔４〕に記載の形質転換細胞
〔６〕 〔５〕に記載の形質転換細胞を含む形質転換植物体。
〔７〕 〔６〕に記載の形質転換植物体の子孫またはクローンである、形質転換植物体。
〔８〕 〔６〕または〔７〕に記載の形質転換植物体の繁殖材料。
〔９〕 配列番号：１から２７のいずれかの奇数番号に記載の塩基配列若しくはその相補配列における少なくとも１５の連続する塩基配列を含むオリゴヌクレオチド。
〔１０〕 配列番号：１から２７のいずれかの奇数番号に記載の塩基配列からなるＤＮＡと特異的にハイブリダイズし、少なくとも１５塩基の鎖長を有するオリゴヌクレオチド。
〔１１〕 イネがイネ白葉枯病菌に感染しているか否かを診断する方法であって、
（ａ）イネ植物体若しくはその一部から核酸試料を調製する工程、
（ｂ）該核酸試料における、〔１〕に記載のＤＮＡまたはその発現産物の存在を検出する工程、を含み、
工程（ｂ）において〔１〕に記載のＤＮＡまたはその発現産物の存在が検出された場合に、診断対象であるイネがイネ白葉枯病菌に感染していると判定される方法、を提供するものである。
【００２０】
【発明の実施の形態】
本発明者らは、イネ白葉枯病菌の新規な１４の病原性遺伝子を同定した。本発明はまず、イネ白葉枯病菌に由来するＤＮＡを提供する。
【００２１】
本発明に含まれる、本発明者らにより単離されたイネ白葉枯病菌病原性遺伝子の塩基配列を配列番号：１から２７の奇数番号に、それぞれの塩基配列によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号：２から２８の偶数番号に示す。即ち本発明は、イネ白葉枯病菌に由来する配列番号：２から２８のいずれかの偶数番号に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、および、配列番号：１から２７のいずれかの奇数番号に記載の塩基配列のコード領域を含むＤＮＡを提供する。
【００２２】
また、本発明は、配列番号：２から２８のいずれかの偶数番号に記載のタンパク質と構造的に類似しているタンパク質をコードするＤＮＡも提供する。このようなＤＮＡとしては、該タンパク質において１または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡが挙げられる。
【００２３】
上記のＤＮＡを調製するために、当業者によく知られた方法としては、ハイブリダイゼーション技術（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ， ＥＭ．， Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ， １９７５， ９８， ５０３．）やポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術（Ｓａｉｋｉ， ＲＫ． ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， １９８５， ２３０， １３５０．、Ｓａｉｋｉ， ＲＫ． ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， １９８８， ２３９， ４８７．）の他に、例えば、該ＤＮＡに対し、ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ法（Ｋｒａｍｅｒ， Ｗ． ＆ Ｆｒｉｔｚ， ＨＪ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ， １９８７， １５４， ３５０．）により変異を導入する方法が挙げられる。また、自然界においても、塩基配列の変異によりコードするタンパク質のアミノ酸配列が変異することは起こり得ることである。また、塩基配列が変異していても、その変異がタンパク質中のアミノ酸の変異を伴わない場合（縮重変異）があり、このような縮重変異ＤＮＡも本発明に含まれる。
【００２４】
本発明のＤＮＡには、天然あるいは単離・精製されたゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、および化学合成ＤＮＡが含まれる。ゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡの調製は、当業者にとって常套手段を利用して行うことが可能である。ゲノムＤＮＡは、例えば、配列番号：２から２８のいずれかの偶数番号に記載のタンパク質をコードする遺伝子を有する生物からゲノムＤＮＡを抽出し、ゲノミックライブラリー（ベクターとしては、プラスミド、ファージ、コスミド、ＢＡＣ、ＰＡＣ等が利用できる）を作成し、これを展開して、該タンパク質をコードするＤＮＡを基に調製したプローブを用いてコロニーハイブリダイゼーションあるいはプラークハイブリダイゼーションを行うことにより調製することが可能である。また、配列番号：２から２８のいずれかの偶数番号に記載のタンパク質をコードするＤＮＡに特異的なプライマーを作成し、これを利用したＰＣＲを行うことによって調製することも可能である。また、ｃＤＮＡは、例えば、該タンパク質をコードする遺伝子を有する生物から抽出したｍＲＮＡを基にｃＤＮＡを合成し、これをλＺＡＰ等のベクターに挿入してｃＤＮＡライブラリーを作成し、これを展開して、上記と同様にコロニーハイブリダイゼーションあるいはプラークハイブリダイゼーションを行うことにより、また、ＰＣＲを行うことにより調製することが可能である。このように、ハイブリダイゼーション技術やＰＣＲ技術によって単離し得る、配列番号：１から２７のいずれかの奇数番号に記載の塩基配列からなるＤＮＡとハイブリダイズするＤＮＡもまた、本発明のＤＮＡに含まれる。
【００２５】
このようなＤＮＡを単離するためには、好ましくはストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーション反応を行う。本発明においてストリンジェントなハイブリダイゼーション条件とは、６Ｍ 尿素、０．４％ ＳＤＳ、０．５×ＳＳＣの条件またはこれと同等のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件を指す。よりストリンジェンシーの高い条件、例えば、６Ｍ 尿素、０．４％ ＳＤＳ、０．１×ＳＳＣの条件下では、より相同性の高いＤＮＡを単離できることが期待される。こうして単離されたＤＮＡは、アミノ酸レベルにおいて、列番号：２から２８のいずれかの偶数番号に記載のアミノ酸配列と高い相同性を有すると考えられる。高い相同性とは、アミノ酸配列全体で少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の配列の同一性を指す。
【００２６】
アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、カーリンおよびアルチュールによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｅｉ． ＵＳＡ， １９９０， ８７， ２２６４−２２６８．、Ｋａｒｌｉｎ，Ｓ． ＆ Ａｌｔｓｃｈｕｌ， ＳＦ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｅｉ． ＵＳＡ， １９９３， ９０， ５８７３．）を用いて決定できる。ＢＬＡＳＴのアルゴリズムに基づいたＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸと呼ばれるプログラムが開発されている（Ａｌｔｓｃｈｕｌ， ＳＦ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ， １９９０， ２１５， ４０３．）。ＢＬＡＳＴＮを用いて塩基配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばｓｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２とする。また、ＢＬＡＳＴＸを用いてアミノ酸配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）。
【００２７】
また本発明は、本発明のＤＮＡの転写産物と相補的なアンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡ、および本発明のＤＮＡの転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有するＲＮＡをコードするＤＮＡを提供する。
【００２８】
本発明の好ましい態様においては、上記ＤＮＡを用いて、例えば、本発明のＤＮＡの発現が抑制されたイネ白葉枯病抵抗性植物の作出を行うことができる。
【００２９】
本発明のＤＮＡの発現が抑制された形質転換植物体を作製する場合には、本発明のＤＮＡの発現を抑制するためのＤＮＡを適当なベクターに挿入して、これを植物細胞に導入し、これにより得られた形質転換植物細胞を再生させる。「本発明のＤＮＡの発現抑制」には、遺伝子の転写の抑制、および／またはタンパク質への翻訳の抑制が含まれる。また、ＤＮＡの発現の完全な停止のみならず発現の減少も含まれる。
【００３０】
植物における特定の遺伝子の発現を抑制する方法としては、アンチセンス技術を利用する方法が当業者に最もよく利用されている。植物細胞におけるアンチセンス効果は、電気穿孔法で導入したアンチセンスＲＮＡが植物においてアンチセンス効果を発揮することをエッカーらが示したことで初めて実証された（Ｅｃｋｅｒ ＪＲ＆ Ｄａｖｉｓ ＲＷ： Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８３： ５３７２， １９８６）。その後、タバコやペチュニアにおいてもアンチセンスＲＮＡの発現により標的遺伝子の発現が低下した例が報告されており（ｖａｎ ｄｅｒ Ｋｒｏｌ ＡＲ， ｅｔ ａｌ： Ｎａｔｕｒｅ ３３３： ８６６， １９８８）、現在では、アンチセンス技術は植物における遺伝子発現を抑制させる手段として確立している。
【００３１】
アンチセンス核酸が標的遺伝子の発現を抑制する作用としては、以下のような複数の要因が存在する。すなわち、三重鎖形成による転写開始阻害、ＲＮＡポリメラーゼによって局部的に開状ループ構造が作られた部位とのハイブリッド形成による転写阻害、合成の進みつつあるＲＮＡとのハイブリッド形成による転写阻害、イントロンとエクソンとの接合点におけるハイブリッド形成によるスプライシング阻害、スプライソソーム形成部位とのハイブリッド形成によるスプライシング阻害、ｍＲＮＡとのハイブリッド形成による核から細胞質への移行阻害、キャッピング部位やポリ（Ａ）付加部位とのハイブリッド形成によるスプライシング阻害、翻訳開始因子結合部位とのハイブリッド形成による翻訳開始阻害、開始コドン近傍のリボソーム結合部位とのハイブリッド形成による翻訳阻害、ｍＲＮＡの翻訳領域やポリソーム結合部位とのハイブリッド形成によるペプチド鎖の伸長阻害、および核酸とタンパク質との相互作用部位とのハイブリッド形成による遺伝子発現阻害などである。このようにアンチセンス核酸は、転写、スプライシングまたは翻訳など様々な過程を阻害することで、標的遺伝子の発現を抑制する（平島および井上： 新生化学実験講座２ 核酸ＩＶ 遺伝子の複製と発現（日本生化学会編， 東京化学同人）ｐｐ．３１９−３４７， １９９３）。
【００３２】
本発明で用いられるアンチセンス配列は、上記のいずれの作用により標的遺伝子の発現を抑制してもよい。一つの態様としては、遺伝子のｍＲＮＡの５’端近傍の非翻訳領域に相補的なアンチセンス配列を設計すれば、遺伝子の翻訳阻害に効果的と考えられる。また、コード領域もしくは３’側の非翻訳領域に相補的な配列も使用することができる。このように、遺伝子の翻訳領域だけでなく非翻訳領域の配列のアンチセンス配列を含むＤＮＡも、本発明で利用されるアンチセンスＤＮＡに含まれる。使用されるアンチセンスＤＮＡは、適当なプロモーターの下流に連結され、好ましくは３’側に転写終結シグナルを含む配列が連結される。このようにして調製されたＤＮＡは、公知の方法を用いることで、所望の植物へ形質転換できる。アンチセンスＤＮＡの配列は、本発明のイネ白葉枯病の病原遺伝子またはその一部と相補的な配列であることが好ましいが、遺伝子の発現を有効に抑制できる限りにおいて、完全に相補的でなくてもよい。転写されたＲＮＡは、標的遺伝子の転写産物に対して好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相補性を有する。アンチセンス配列を用いて標的遺伝子の発現を効果的に抑制するには、アンチセンスＤＮＡの長さは少なくとも１５塩基以上であり、好ましくは１００塩基以上であり、さらに好ましくは５００塩基以上である。通常用いられるアンチセンスＤＮＡの長さは５ｋｂよりも短く、好ましくは２．５ｋｂよりも短い。
【００３３】
遺伝子の発現の抑制は、また、リボザイムをコードするＤＮＡを利用して行うことも可能である。リボザイムとは触媒活性を有するＲＮＡ分子のことを指す。リボザイムには種々の活性を有するものが存在するが、中でもＲＮＡを切断する酵素としてのリボザイムに焦点を当てた研究により、ＲＮＡを部位特異的に切断するリボザイムの設計が可能となった。リボザイムには、グループＩイントロン型やＲＮａｓｅＰに含まれるＭ１ ＲＮＡのように４００ヌクレオチド以上の大きさのものもあるが、ハンマーヘッド型やヘアピン型と呼ばれる４０ヌクレオチド程度の活性ドメインを有するものもある（小泉誠および大塚栄子： 蛋白質核酸酵素， ３５： ２１９１， １９９０）。
【００３４】
例えば、ハンマーヘッド型リボザイムの自己切断ドメインは、Ｇ１３Ｕ１４Ｃ１５という配列のＣ１５の３’側を切断するが、その活性にはＵ１４とＡ９との塩基対形成が重要とされ、Ｃ１５の代わりにＡ１５またはＵ１５でも切断され得ることが示されている（Ｋｏｉｚｕｍｉ Ｍ， ｅｔ ａｌ： ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ ２２８： ２２８， １９８８）。基質結合部位が標的部位近傍のＲＮＡ配列と相補的なリボザイムを設計すれば、標的ＲＮＡ中のＵＣ、ＵＵまたはＵＡという配列を認識する制限酵素的なＲＮＡ切断リボザイムを作出することができる（ＫｏｉｚｕｍｉＭ， ｅｔ ａｌ： ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ ２３９： ２８５， １９８８、小泉誠および大塚栄子： 蛋白質核酸酵素 ３５： ２１９１， １９９０、 Ｋｏｉｚｕｍｉ Ｍ， ｅｔ ａｌ： Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １７： ７０５９， １９８９）。
例えば、イネ白葉枯病の病原遺伝子のＤＮＡ（配列番号：１から２７のいずれかの奇数番号に記載）中には、標的となり得る部位が複数存在するものと推定される。
【００３５】
また、ヘアピン型リボザイムも本発明の目的に有用である。このリボザイムは、例えばタバコリングスポットウイルスのサテライトＲＮＡのマイナス鎖に見出される（Ｂｕｚａｙａｎ ＪＭ： Ｎａｔｕｒｅ ３２３： ３４９， １９８６）。ヘアピン型リボザイムからも、標的特異的なＲＮＡ切断リボザイムを作出できることが示されている（Ｋｉｋｕｃｈｉ Ｙ ＆ Ｓａｓａｋｉ Ｎ： Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １９： ６７５１， １９９１、菊池洋： 化学と生物 ３０： １１２， １９９２）。
【００３６】
標的を切断できるように設計されたリボザイムは、植物細胞中で転写されるように、カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーターなどのプロモーターおよび転写終結配列に連結される。このとき、転写されたＲＮＡの５’端や３’端に余分な配列が付加されていると、リボザイムの活性が失われることがあるが、こういった場合は、転写されたリボザイムを含むＲＮＡからリボザイム部分だけを正確に切り出すために、リボザイム部分の５’側や３’側にシスに働く別のトリミングリボザイムを配置させることも可能である（Ｔａｉｒａ Ｋ， ｅｔ ａｌ： Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ ３： ７３３， １９９０、Ｄｚｉａｎｏｔｔ ＡＭ ＆ Ｂｕｊａｒｓｋｉ ＪＪ： Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８６： ４８２３， １９８９、Ｇｒｏｓｓｈａｎｓ ＣＡ ＆ Ｃｅｃｈ ＴＲ： Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １９： ３８７５， １９９１、Ｔａｉｒａ Ｋ， ｅｔ ａｌ： Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １９： ５１２５， １９９１）。また、このような構成単位をタンデムに並べ、標的遺伝子内の複数の部位を切断できるようにすることで、より効果を高めることもできる（Ｙｕｙａｍａ Ｎ， ｅｔ ａｌ： Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ １８６： １２７１，１９９２）。このように、リボザイムを用いて本発明における標的遺伝子の転写産物を特異的に切断することで、該遺伝子の発現を抑制することができる。
【００３７】
また、本発明のＤＮＡを植物体に導入することによって、植物側に常時抵抗性を誘導させることも有効である。
【００３８】
本発明のＤＮＡは、例えば、組み換えタンパク質の調製に利用することが可能である。
【００３９】
組み換えタンパク質を調製する場合には、通常、本発明のＤＮＡを適当な発現ベクターに挿入し、該ベクターを適当な細胞に導入し、形質転換細胞を培養して発現させたタンパク質を精製する。組み換えタンパク質は、精製を容易にするなどの目的で、他のタンパク質との融合タンパク質として発現させることも可能である。例えば、大腸菌を宿主としてマルトース結合タンパク質との融合タンパク質として調製する方法（米国Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ社発売のベクターｐＭＡＬシリーズ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として調製する方法（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社発売のベクターｐＧＥＸシリーズ）、ヒスチジンタグを付加して調製する方法（Ｎｏｖａｇｅｎ社のｐＥＴシリーズ）などを利用することが可能である。宿主細胞としては、組み換えタンパク質の発現に適した細胞であれば特に制限はなく、上記の大腸菌の他、発現ベクターを変えることにより、例えば、酵母、種々の動植物細胞、昆虫細胞などを用いることが可能である。宿主細胞へのベクターの導入には、当業者に公知の種々の方法を用いることが可能である。例えば、大腸菌への導入には、カルシウムイオンを利用した導入方法（Ｍａｎｄｅｌ， Ｍ． ＆ Ｈｉｇａ， Ａ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， １９７０， ５３， １５８−１６２．、Ｈａｎａｈａｎ， Ｄ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， １９８３， １６６， ５５７−５８０．）を用いることができる。宿主細胞内で発現させた組み換えタンパク質は、該宿主細胞またはその培養上清から、当業者に公知の方法により精製し、回収することができる。組み換えタンパク質を上記したマルトース結合タンパク質などとの融合タンパク質として発現させた場合には、容易にアフィニティー精製を行うことが可能である。このようにして作製される本発明のＤＮＡによってコードされるタンパク質もまた、本発明に含まれる。
【００４０】
得られた組み換えタンパク質を用いることにより、これに結合する抗体を調製することも可能である。該抗体は、後述のイネ白葉枯病菌に感染しているか否かを診断する方法に使用することができる。
【００４１】
ポリクローナル抗体は、例えば、精製した本発明のタンパク質若しくはその一部のペプチドをウサギなどの免疫動物に免疫し、一定期間の後に血液を採取し、血ぺいを除去した血清より調製することが可能である。また、モノクローナル抗体は、上記タンパク質もしくはペプチドで免疫した動物の抗体産生細胞と骨腫瘍細胞とを融合させ、目的とする抗体を産生する単一クローンの細胞（ハイブリドーマ）を単離し、該細胞から抗体を得ることにより調製することができる。これにより得られた抗体は、本発明のタンパク質の精製や検出などに利用することが可能である。本発明の抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、およびこれら抗体の断片が含まれる。
【００４２】
また本発明は、上記ＤＮＡを含むベクター、該ベクターを保持する形質転換細胞、植物細胞である形質転換細胞、該形質転換細胞を含む形質転換植物体、該形質転換植物体の子孫またはクローンである形質転換植物体、および該形質転換植物体の繁殖材料を提供する。
【００４３】
本発明のＤＮＡまたは核酸の植物細胞への導入は、当業者においては、公知の方法、例えばアグロバクテリウム法、電気穿孔法（エレクトロポーレーション法）、パーティクルガン法により実施することができる。
【００４４】
上記アグロバクテリウム法を用いる場合、例えばＮａｇｅｌらの方法（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｌｅｔｔ．， １９９０， ６７， ３２５．）が用いられる。この方法によれば、組み換えベクターをアグロバクテリウム細菌中に形質転換して、次いで形質転換されたアグロバクテリウムを、リーフディスク法等の公知の方法により植物細胞に導入する。上記ベクターは、例えば植物体に導入した後、本発明のＤＮＡが植物体中で発現するように、発現プロモーターを含む。一般に、該プロモーターの下流には本発明のＤＮＡが位置し、さらに該ＤＮＡの下流にはターミネーターが位置する。この目的に用いられる組み換えベクターは、植物への導入方法、または植物の種類に応じて、当業者によって適宜選択される。上記プロモーターとして、例えばカリフラワーモザイクウイルス由来のＣａＭＶ３５Ｓ、トウモロコシのユビキチンプロモーター（特開平２−７９９８３号公報）等を挙げることができる。
【００４５】
また、上記ターミネーターは、カリフラワーモザイクウイルス由来のターミネーター、あるいはノパリン合成酵素遺伝子由来のターミネーター等を例示することができるが、植物体中で機能するプロモーターやターミネーターであれば、これらに限定されない。
【００４６】
また、本発明のＤＮＡまたは核酸を導入する植物は、外植片であってもよく、これらの植物から培養細胞を調製し、得られた培養細胞に導入してもよい。本発明の「植物細胞」は、例えば葉、根、茎、花および種子中の胚盤等の植物細胞、カルス、懸濁培養細胞等が挙げられる。
【００４７】
また、本発明のＤＮＡまたは核酸の導入により形質転換した植物細胞を効率的に選択するために、上記組み換えベクターは、適当な選抜マーカー遺伝子を含む、もしくは選抜マーカー遺伝子を含むプラスミドベクターと共に植物細胞へ導入するのが好ましい。この目的に使用する選抜マーカー遺伝子は、例えば抗生物質ハイグロマイシンに耐性であるハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、カナマイシンまたはゲンタマイシンに耐性であるネオマイシンホスホトランスフェラーゼ、および除草剤ホスフィノスリシンに耐性であるアセチルトランスフェラーゼ遺伝子等が挙げられる。
【００４８】
組み換えベクターを導入した植物細胞は、導入された選抜マーカー遺伝子の種類に従って適当な選抜用薬剤を含む公知の選抜用培地に置床し培養する。これにより形質転換された植物培養細胞を得ることができる。
【００４９】
次いで、本発明のＤＮＡまたは核酸を導入した形質転換細胞から植物体を再生する。植物体の再生は植物細胞の種類に応じて当業者に公知の方法で行うことが可能である（Ｔｏｋｉ． ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ， １９９５， １００， １５０３−１５０７．）。例えばイネにおいては、形質転換植物体を作出する手法については、ポリエチレングリコールによりプロトプラストへ遺伝子導入し、植物体（インド型イネ品種が適している）を再生させる方法（Ｄａｔｔａ， Ｓ Ｋ． ｅｔ ａｌ．， Ｉｎ Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｔｏ Ｐｌａｎｔｓ （Ｐｏｔｒｙｋｕｓ Ｉ ａｎｄ Ｓｐａｎｇｅｎｂｅｒｇ Ｅｄｓ．）， １９９５， ６６−７４．）、電気パルスによりプロトプラストへ遺伝子導入し、植物体（日本型イネ品種が適している）を再生させる方法（Ｔｏｋｉ． ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ， １９９２， １００， １５０３−１５０７．）、パーティクルガン法により細胞へ遺伝子を直接導入し、植物体を再生させる方法（Ｃｈｒｉｓｔｏｕ， ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， １９９１， ９， ９５７−９６２．）およびアグロバクテリウムを介して遺伝子を導入し、植物体を再生させる方法（Ｈｉｅｉ． ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｊ， １９９４，６， ２７１−２８２．）等、いくつかの技術が既に確立し、本願発明の技術分野において広く用いられている。本発明においては、これらの方法を好適に用いることができる。
【００５０】
形質転換細胞から再生させた植物体は、次いで順化用培地で培養する。その後、順化した再生植物体を、通常の栽培条件で栽培すると、植物体が得られ、成熟して結実して種子を得ることができる。
【００５１】
なお、このように再生され、かつ栽培した形質転換植物体中の導入された外来ＤＮＡまたは核酸の存在は、公知のＰＣＲ法やサザンハイブリダイゼーション法によって、または植物体中の核酸の塩基配列を解析することによって確認することができる。この場合、形質転換植物体からのＤＮＡまたは核酸の抽出は、公知のＪ．Ｓａｍｂｒｏｏｋらの方法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， 第２版， Ｃｏｌｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， １９８９）に準じて実施することができる。
【００５２】
再生させた植物体中に存在する本発明のＤＮＡよりなる外来遺伝子を、ＰＣＲ法を用いて解析する場合には、上記のように再生植物体から抽出した核酸を鋳型として増幅反応を行う。また、本発明の核酸がＤＮＡである場合には、該ＤＮＡの塩基配列に従って適当に選択された塩基配列をもつ合成したオリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、これらを混合させた反応液中おいて増幅反応を行うこともできる。増幅反応においては、ＤＮＡの変性、アニーリング、伸張反応を数十回繰り返すと、本発明のＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片の増幅生成物を得ることができる。増幅生成物を含む反応液を、例えばアガロース電気泳動にかけると、増幅された各種のＤＮＡ断片が分画されて、そのＤＮＡ断片が本発明のＤＮＡに対応することを確認することが可能である。
【００５３】
一旦、染色体内に本発明のＤＮＡが導入された形質転換植物体が得られれば、該植物体から有性生殖または無性生殖により子孫を得ることが可能である。また、該植物体やその子孫あるいはクローンから繁殖材料（例えば種子、果実、切穂、塊茎、塊根、株、カルス、プロトプラスト等）を得て、それらを基に該植物体を量産することも可能である。
【００５４】
また、本発明は、配列番号：１から２７のいずれかの奇数番号に記載の塩基配列若しくはその相補配列における少なくとも１５の連続する塩基配列を含むオリゴヌクレオチドを提供する。ここで「相補配列」とは、Ａ：Ｔ、Ｇ：Ｃの塩基対からなる２本鎖ＤＮＡの一方の鎖に対する他方の配列を指す。また、少なくとも１５個の連続したヌクレオチド領域で完全に相補配列である場合に限られず、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは９０％、さらに好ましくは９５％以上の塩基配列の同一性を有すればよい。このようなＤＮＡは、本発明のＤＮＡの検出や単離を行うためのプローブとして、また、増幅を行うためのプライマーとして有用である。
【００５５】
さらに、本発明は、配列番号：１から２７のいずれかの奇数番号に記載の塩基配列からなるＤＮＡと特異的にハイブリダイズし、少なくとも１５塩基の鎖長を有するオリゴヌクレオチドを提供する。該オリゴヌクレオチドは、本発明のＤＮＡに特異的にハイブリダイズするものである。ここで「特異的にハイブリダイズする」とは、通常のハイブリダイゼーション条件下、好ましくはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下（例えば、サムブルックら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ，第２版１９８９に記載の条件）において、他のタンパク質をコードするＤＮＡとクロスハイブリダイゼーションを有意に生じないことを意味する。特異的なハイブリダイズが可能であれば、該オリゴヌクレオチドは、本発明のＤＮＡに対し、完全に相補的である必要はない。
【００５６】
本発明のＤＮＡにハイブリダイズし、少なくとも１５ヌクレオチドの鎖長を有するオリゴヌクレオチドは、本発明のＤＮＡを検出するためのプローブやプライマーとして用いることができる。該オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いる場合、その長さは、通常１５ｂｐ〜１００ｂｐであり、好ましくは１７ｂｐ〜３０ｂｐである。プライマーは、本発明のＤＮＡの少なくとも一部を増幅しうるものであれば、特に制限されない。
【００５７】
また、上記オリゴヌクレオチドをプローブとして使用する場合、該プローブは、本発明のＤＮＡに特異的にハイブリダイズするものであれば、特に制限されない。該プローブは、合成オリゴヌクレオチドであってもよく、通常少なくとも１５ｂｐ以上の鎖長を有する。
【００５８】
本発明のオリゴヌクレオチドをプローブとして用いる場合は、適宜標識して用いることが好ましい。標識する方法としては、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて、オリゴヌクレオチドの５’端を３２Ｐでリン酸化することにより標識する方法、およびクレノウ酵素等のＤＮＡポリメラーゼを用い、ランダムヘキサマーオリゴヌクレオチド等をプライマーとして３２Ｐ等のアイソトープ、蛍光色素、またはビオチン等によって標識された基質塩基を取り込ませる方法（ランダムプライム法等）を例示することができる。
【００５９】
さらに本発明は、イネがイネ白葉枯病菌に感染しているか否かを診断する方法を提供する。
【００６０】
本発明の上記診断方法においては、まず、（ａ）イネ植物体若しくはその一部から核酸試料を調製する。次いで、（ｂ）該核酸試料における本発明のＤＮＡまたはその発現産物の存在を検出する。（ｂ）において、発現産物が検出された場合は、診断対象であるイネがイネ白葉枯病菌に感染していると判定される。なお、上記「その一部」とは、例えば、植物体組織、細胞、または細胞抽出液等を指す。
【００６１】
本発明の診断方法の一つの態様は、プライマーあるいはプローブを利用してイネ白葉枯病菌タンパク質をコードするＤＮＡを検出する。このようなプローブやプライマーとしては、本発明の上記オリゴヌクレオチドを用いることができる。
【００６２】
本発明者らは実際に、本発明の遺伝子にハイブリダイズし、該遺伝子を増幅可能なＰＣＲプライマーセットを用いて、被検イネについてイネ白葉枯病菌を特異的に検出することに成功した。従って、本発明の上記オリゴヌクレオチドは、本発明の診断方法に好適に使用することが可能である。本発明の上記診断方法に用いられるオリゴヌクレオチドの一例としては、後述の実施例５に記載のプライマーセットを示すことができるが、これに限定されない。当業者においては、配列番号：１から２８のいずれかの奇数番号に記載の塩基配列を基に、適宜、本発明のＤＮＡを増幅可能なプライマーセットを設計することが可能である。同様に、配列番号：１から２８のいずれかの奇数番号に記載の塩基配列を基に、本発明のＤＮＡを検出可能なプローブを設計することは、当業者においては容易に実施することが可能である。プライマーやプローブは必要に応じて標識されていてもよい。標識としては、例えば、放射標識が挙げられる。本発明の診断方法に使用可能なプライマーまたはプローブも、本発明に包含される。
【００６３】
本発明の上記診断方法は、例えば、イネ白葉枯病菌に感染したことが疑われるイネ植物体若しくはその一部から核酸試料を調製し、上記のプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法、あるいは上記のプローブを利用したノーザンブロッティング法等により実施することができる。
【００６４】
本発明の診断方法の他の一つの態様は、抗体を利用し、被検イネについて本発明のイネ白葉枯病の病原遺伝子によってコードされるタンパク質の有無を指標として診断する方法である。この診断に用いる抗体は、例えば、上述のようにして調製することができる。抗体は、必要に応じて標識されていてもよい。標識としては、例えば、酵素標識が挙げられる。また、抗体自体を直接標識しなくとも、抗体に結合する物質、例えば、プロテインＡなどを介して標識して、目的のタンパク質を検出してもよい。この診断においては、例えば、イネ白葉枯病菌に感染したことが疑われるイネ植物体若しくはその一部から被検試料を調製し、上記の抗体を用いてＥＬＩＳＡ法あるいはウエスタンブロット法により実施することができる。
【００６５】
【実施例】
以下、本発明を実施例により、さらに具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
【００６６】
〔実施例１〕 ＢＡＣライブラリー作製
ＢＡＣ（ｂａｃｔｅｒｉａｌ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）は、大きなＤＮＡ断片を安定に取り扱える点、またキメラＤＮＡの生成が少ない点から、数少ないクローンでゲノム全体を網羅することができ、ゲノム解析を行うに当たり有効なツールの一つである。そこで、本発明者らは平均挿入断片長約１００から１２０ｋｂで、約１６ゲノム分のＢＡＣライブラリーを作製した（Ｏｃｈｉａｉ， Ｈ．， Ｉｎｏｕｅ， Ｙ．， Ｈａｓｅｂｅ， Ａ． ａｎｄ Ｋａｋｕ， Ｈ． （２００１）． Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚａｅ ｐｖ． ｏｒｙｚａｅｂａｃｔｅｒｉａｌ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ｌｉｂｒａｒｙ． ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｌｅｔｔ． ２００：５９−６５）。
【００６７】
〔実施例２〕 ｈｒｐ遺伝子クラスター及び周辺領域の解析
植物病原細菌が植物に病気を引き起こすには、宿主認識／感染成立と発病因子放出／発病という大きく２つの過程が考えられる。ｈｒｐ遺伝子クラスターに含まれる遺伝子群は、このうちの宿主認識／感染成立といった過程において重要な役割を果たす病原性因子分泌機構（ｔｙｐｅＩＩＩ）の構成分子をコードするのみでなく、いくつかの病原性因子をもコードしており、植物病原細菌において最も重要な病原性遺伝子群であることが知られている（Ｂｏｎａｓ， Ｕ．， Ｓｃｈｕｌｔｅ， Ｒ．， Ｆｅｎｓｅｌａｕ， Ｓ．， Ｍｉｎｓａｖａｇｅ， Ｇ．Ｖ．， Ｓｔａｓｋａｗｉｃｚ， Ｂ．Ｊ．， ａｎｄ Ｓｔａｌｌ， Ｒ．Ｅ． （１９９１）． Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｇｅｎｅ ｃｌｕｓｔｅｒ ｆｒｏｍ Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐｖ． ｖｅｓｉｃａｔｏｒｉａ ｔｈａｔ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｓ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｔｙ ａｎｄ ｔｈｅ ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｏｎ ｐｅｐｐｅｒ ａｎｄ ｔｏｍａｔｏ．Ｍｏｌ． Ｐｌａｎｔ−Ｍｉｃｒｏｂｅ Ｉｎｔｅｒａｃｔ． ４：８１−８８）。
【００６８】
そこで、ＰＣＲスクリーニングで単離したｈｒｐ遺伝子クラスターを有するＢＡＣクローンの塩基配列をショットガン法で決定した。決定した領域はｈｒｐ遺伝子クラスター約３０ ｋｂを含めた約２２０ ｋｂである。この領域における遺伝子予測の結果を図１に示した。Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ属で既知のｈｒｐ遺伝子クラスターを構成する２４遺伝子すべてを含め、合計１７１遺伝子の存在を予測した。
【００６９】
この領域で特徴的なことは、トランスポゼースのホモログ（挿入配列：ＩＳ）がｈｒｐクラスターの内部をはじめ、複数の領域で且つタンデムに挿入されていた点である。予測した遺伝子数１７１に対して、約２割に当たる３６個のトランスポゼースホモログを見出した。また、いくつかのトランスポーターに関連する遺伝子や、グルカン関係の遺伝子クラスターを見出した。一方、予測した遺伝子をｂｌａｓｔ検索した結果、現時点で他に生物と有意な相同性が認められない１４個のイネ白葉枯病菌固有と考えられる遺伝子を発見した。該遺伝子の塩基配列を配列番号：１から２７の奇数番号に、それぞれの塩基配列から予測されるアミノ酸配列をそれぞれ配列番号２から２８の偶数番号に記載する。
【００７０】
〔実施例３〕 ＰＣＲによるイネ白葉枯病菌の特異的検出
イネ白葉枯病菌及びイネ白葉枯病菌と同じ属である各種Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ属細菌のＤＮＡを鋳型に図２Ａに示したプライマーセットを用いたＰＣＲ反応を下記の条件下で行った。ＰＣＲプライマーセットは、配列番号：１９及び２１からそれぞれセンス及びアンチセンスの２０オリゴヌクレオチドのプライマーセットを作製した（図２）。
【００７１】
配列番号：１９におけるＰＣＲプライマー
センスプライマー：５’−ＡＴＧＡＴＣＴＴＧＧＡＡＴＣＧＣＡＣＡＡ（配列番号：２９）
アンチセンスプライマー：５’−ＴＣＡＴＧＡＴＧＣＣＡＣＣＴＣＣＴＧＣＧ（配列番号：３０）
配列番号：２１におけるＰＣＲプライマー
センスプライマー：５’−ＡＴＧＡＡＡＣＴＣＴＣＣＧＧＣＧＧＴＡＴ（配列番号：３１）
アンチセンスプライマー：５’−ＴＣＡＴＧＣＴＣＧＣＣＣＧＣＴＴＴＧＣＣ（配列番号：３２）
【００７２】
ＰＣＲ反応条件は、初期変性９４℃で２分後、変性９４℃１５秒、アニーリング５５℃３０秒、伸長反応７２℃２分のサイクルを３０回行った後、最終伸長反応７２℃７分間を行った。
【００７３】
ＰＣＲ増幅産物は、１％のアガロースグル電気泳動によって行い、エチディウムプロマイド染色後検出した。その結果、イネ白葉枯病菌ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ増幅産物をのせたレーンＡ１３、Ａ１６、Ｂ１５、Ｂ１６及びＣ１５のみに検出された（図３）。
【００７４】
〔実施例４〕 Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ属細菌間におけるゲノム比較解析
２００２年５月、カンキツかいよう病菌（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ａｘｏｎｏｐｏｄｉｓ ｐｖ． ｃｉｔｒｉ）とキャベツ黒腐病菌（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐｖ． ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）の比較ゲノム解析がブラジルの研究グループによって報告された（ｄａ Ｓｉｌｖａ， Ａ．Ｃ．Ｒ． ｅｔ ａｌ． （２００２）．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｇｅｎｏｍｅｓ ｏｆ ｔｗｏ Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｉｎｇ ｈｏｓｔ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ． Ｎａｔｕｒｅ ４１７：４５９−４６３）。いくつかの領域においてゲノムの再編成が認められたが、全体として相同性は高いことが明らかとなった。しかしながら、それぞれのゲノム上には１５から１８％（６５０から８００）の遺伝子が互いに存在しない種固有のものであることも明らかにされている。そこで、イネ白葉枯病菌で得られたゲノム情報とゲノミックサザン解析による３菌種間の比較を行った。
【００７５】
最初に、ｈｒｐ遺伝子クラスターにおけるゲノム構造比較を行った結果、各々の遺伝子間の相同性には若干の相違はあるが、ｈｐａＢ−ｈｒｐＦ領域以外は同じであった（図４）。ｈｐａＢ−ｈｒｐＦ領域に特徴的な点として、イネ白葉枯病菌には、４つのトランスポゼースのホモログが挿入され、長さもほぼ２倍であるのに対して、カンキツかいよう病菌とキャベツ黒腐病菌には認められなかった。また、キャベツ黒腐病菌には、ｈｐａＢの下流にｈｒｐＷが存在するが、他の２菌種には見出されなかった。さらに、キャベツ黒腐病菌では、ｈｒｐＦの下流に存在するｈｐａＦが欠失し、しかもｈｒｐＦの転写方向も逆であった。
【００７６】
【発明の効果】
本発明によって同定されたイネ白葉枯病菌の病原遺伝子は、既知の塩基配列及びアミノ酸配列と有意な相同性を持たないことから、同塩基配列を利用した特異的プローブ、またはＰＣＲプライマーセットを作製してＰＣＲによるイネ白葉枯病菌の簡易検出用としての利用が可能である。
【００７７】
また、この遺伝子を植物体に導入することによって新しい耐病性植物体の育成が期待される。
【００７８】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】ｈｒｐ及び周辺領域の遺伝子マップを示す図である。
【図２】ＰＣＲプライマーセット作成に用いた配列番号：１９および配列番号：２１の配列を表わす。配列を黒枠で示した部分は、各プライマーの配列を示す。
Ａ：配列番号：１９におけるＰＣＲプライマー、Ｂ：配列番号：２１におけるＰＣＲプライマー。
【図３】配列番号：１９の塩基配列を基に設計したプライマーセットによる各種Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ属細菌のＰＣＲ検出の結果を表わす写真である。各レーンの細菌名を写真の下に表わす。
【図４】Ｘ．ｏｒｙｚａｅ ｐｖ．ｏｒｙｚａｅ、Ｘ．ａｘｏｎｏｐｏｄｉｓ ｐｖ．ｃｉｔｒｉ、およびＸ．ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐｖ．ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ間におけるｈｐａＢ−ｈｒｐＦ領域の構造を比較した図である。
【発明の属する技術分野】
本発明は、作物病害診断および作物育種に関する。
【０００２】
【従来の技術】
Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ菌（Ｆｌｅｉｓｃｈｍａｎｎ， Ｒ．Ｄ． ｅｔ ａｌ． （１９９５）． Ｗｈｏｌｅ−ｇｅｎｏｍｅ ｒａｎｄｏｍ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎｄ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ Ｒｄ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６９：４９６−５１２）の全ゲノム配列が報告されて以来、モデル微生物である大腸菌や枯草菌の全ゲノム配列、動物病原細菌をはじめとした多様な細菌の全ゲノム配列が報告されている。細菌は、ゲノムサイズが動物・植物に比べ遙かに小さく、また、同じ微生物である糸状菌に比べてもゲノムサイズは約１／１０以下であることから、近年の解析技術の向上とともに急速にゲノム解析が進展している。
【０００３】
ゲノム解析は、遺伝情報の根源であるゲノムを塩基配列レベルで明らかにすることによって、ゲノム上に存在するすべての遺伝子を解析し、そして遺伝子間のネットワークや相互作用等の生命現象全体を理解する上で貴重な情報をもたらすものと期待され、多種多様な生物で全世界的に盛んに行われている。特に動物病原細菌の分野においては、ヒトへの感染や疾病等の病原性機構解明やそこで得られる知見から、ゲノム創薬等様々な研究展開・応用が期待され、現在では、結核菌（Ｃｏｌｅ， Ｓ．Ｔ． ｅｔ ａｌ． （１９９８）． Ｄｅｃｉｐｈｅｒｉｎｇ ｔｈｅ ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ． Ｎａｔｕｒｅ ３９３：５３７−４４）をはじめとして大腸菌Ｏ−１５７（Ｈａｙａｓｈｉ， Ｔ． ｅｔ ａｌ． （２００１）． Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆＥｎｔｅｒｏｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ Ｅｓｃｈｅｌｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｏ１５７：Ｈ７ ａｎｄ ｇｅｎｏｍｉｃ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｗｉｔｈ ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｓｔｒａｉｎ Ｋ−１２． ＤＮＡ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ８：１１−２２）等、多くの種で全ゲノム配列が明らかとなりつつある。
【０００４】
一方、植物病原細菌の分野においては、１９９８年の第７回国際植物病理学会でゲノム解析に関する緊急ミーティングが開かれ、今後の展開に関して議論が行われた。植物病原細菌においても、動物病原細菌と同じ観点からゲノム解析に大きな期待がもたれ、今後の重要な研究の方向性として認識されつつある。当時、植物病原細菌のゲノム解析では、ブラジルのグループが先鞭をつけ、Ｘｙｌｅｌｌａ ｆａｓｔｉｄｉｏｓａの解析が進行しており、また、フランスのグループでは、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍの解析が予定されている。日本でも、イネ白葉枯病菌を候補としてゲノム解析を行うことが提案され、現在、ほぼ完了している。
【０００５】
イネ白葉枯病（ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｌｅａｆ ｂｌｉｇｈｔ ｏｆ ｒｉｃｅ）は、日本のみならずアジアの稲作地帯をはじめ、アフリカ、オーストラリア、ラテンアメリカ及び米国において発生する世界的に重要なイネの病害である。
【０００６】
本病を引き起こす病原細菌は、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚａｅ ｐｖ． ｏｒｙｚａｅ（イネ白葉枯病菌）で、イネ品種に対して病原性が異なる多数のレースの存在が知られ、病原性が高度に分化した細菌である。
【０００７】
葉枯れを引き起こす病原細菌は、主に葉縁に分布する水孔から通道管を通って導管内へ侵入し増殖する。増殖した細菌が水分の上昇を妨げるために、葉は局部的に萎ちょうし、葉枯れ（ｌｅａｆ ｂｌｉｇｈｔ）の症状が起こるものと考えられている。白葉枯病の発症メカニズムについては、毒素説などが知られているが、その詳細は不明であり、今後解明すべき問題の一つである。
【０００８】
また、本細菌が属するＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ属は、多様な植物に病気を引き起こす細菌で構成され、且つその種類も非常に多いことが知られ、農業上重要な細菌群である。
【０００９】
一方、感染相手（宿主）であるイネは、重要な穀物であると同時に、育種、病害抵抗性機構をはじめとした様々な植物の分子生物学的研究の一大モデルとして世界的に精力的に研究がなされているモデル植物である。
【００１０】
一般に、植物病原細菌が植物に病気を引き起こす過程には、宿主認識／感染成立と発病因子放出／発病という２つの過程があり、そこには多くの遺伝子が関与すると考えられている。しかし、詳細については未だ不明な点が多い。
【００１１】
現在までに、イネ白葉枯病菌においては、いくつかの病原性関連遺伝子がクローン化され、それらの機能解析が行われている。しかしながら、病原性関連遺伝子群の全体像を網羅的に把握し、またゲノム上での分布・位置関係を特定するといった分子生物学的基盤の確立を目指した総合的な解析は行われていない。
【００１２】
これまでイネ白葉枯病菌には有効な農薬等の資材がないため、その防除対策としては主にイネ白葉枯病抵抗性遺伝子を育種によって導入することで、イネ白葉枯病抵抗性品種を育成し栽培してきた。しかし、抵抗性遺伝子を導入した耐病性品種の栽培は新たな病原型（レース）を示す病原菌の出現とともに罹病化する、所謂、抵抗性の崩壊が報告されている。
【００１３】
また、病原菌の検出法としてはイネ白葉枯病菌に特異的に感染するファージを検出することによって、発生予察を行う方法が知られている。しかし、ＤＮＡの検出による簡便なイネ白葉枯病の診断技術はこれまでのところ知られていない。
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、イネの重要な病原細菌であるイネ白葉枯病菌の病原性に関わる遺伝子を同定することを目的とする。より詳しくは、イネ白葉枯病菌の病原性に関わる遺伝子の有無を指標とすることにより、被検イネについてイネ白葉枯病を簡便に診断することができる方法の提供を課題とする。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
一般に、植物、動物を問わず病原細菌は、病原を引き起こす遺伝子群をゲノムあるいはプラスミド上に大きなクラスター（病原性アイランド）を形成して存在させていることが知られている。本発明のイネ白葉枯病菌においても、そのような病原性遺伝子クラスターを形成している可能性が予測された。そこで、本発明者らは、特にイネ白葉枯病菌をはじめとした植物病原細菌において、病原性を発現する上で重要な病原性分泌装置（タイプＩＩＩ分泌装置）をコードするｈｒｐ遺伝子クラスターと、レース分化等の病原性の多様化に関わる非病原性遺伝子（ａｖｒｉｌｕｃｅｎｃｅ ｇｅｎｅ）の解析を中心に、鋭意研究を行った。
【００１６】
まず本発明者らは、植物−微生物相互作用における微生物側の病原性発現機構や応答機構解明のための分子生物学的基盤の確立をはかることに着手した。詳しくは、イネゲノム研究で得られる病害抵抗性遺伝子の解析を通して、植物−微生物相互作用の研究に応用展開されることを視野におき、本発明者らは、イネ白葉枯病菌のゲノム解析を行った。ゲノム解析に用いた菌株としては、イネゲノム研究においてイネ白葉枯病抵抗性遺伝子Ｘａ１（Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ， Ｓ． ｅｔ ａｌ． （１９９８）． Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｘａ１， ａ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｂｌｉｇｈｔ−ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｇｅｎｅ ｉｎ ｒｉｃｅ， ｉｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９５：１６６３−８）が単離され、その構造解析が行われていた点、即ち相互作用を解明するに当たり、抵抗性遺伝子（Ｘａ１）に対して非病原性遺伝子（ａｖｒＸａ１）を有する菌株を対象に、さらに多数の非病原性遺伝子を有すると考えられる（病原性スペクトラムが狭い）点を考慮した結果、日本のレースＩの代表菌株であるＭＡＦＦ３１１０１８（Ｔ７１７４）を供試した。
【００１７】
迅速かつ簡便的な病原菌の診断には、イネ白葉枯病菌に特異的な遺伝子領域等を増幅するＰＣＲによる検出が有効である。また、病害抵抗性品種には、病原菌由来の病原性遺伝子を植物体に導入することによって、植物側に常時抵抗性誘導させることが有効である。本発明者らは農業資源研究所で保存してある日本産のイネ白葉枯病菌から病原性遺伝子群及びその近傍領域のＤＮＡをクローン化し、その塩基配列を決定した結果、既存のデータベース上に有意な相同性を示さないイネ白葉枯病菌固有の１４の新規病原性遺伝子を同定することに成功した。これらの遺伝子はイネゲノム中には見出されないことから、被検イネについて、これらの新規病原性遺伝子の有無を指標とすることにより、簡便かつ正確にイネ白葉枯病の診断を行うことが可能である。従って、本発明者らによって見出された新規遺伝子は、非常に有用性の高いものと言える。本発明者らは実際に、該新規病原性遺伝子にハイブリダイズし、該遺伝子を増幅可能なＰＣＲプライマーセットを用いて、被検イネについてイネ白葉枯病菌を特異的に検出することに成功した。
【００１８】
また、本発明によって得られたイネ白葉枯病菌のゲノム解析に関する情報は、病原性機構解明のための有力な情報になるとともに、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ属細菌の病原性の多様性をはじめとした遺伝的多様性の解析や分類研究において有効な知見となるものと期待される。
【００１９】
即ち本発明は、イネ白葉枯病菌の新規病原性遺伝子群およびその利用に関し、より詳しくは、
〔１〕 イネ白葉枯病菌に由来する、下記（ａ）から（ｄ）のいずれかに記載のＤＮＡ。
（ａ）配列番号：２から２８のいずれかの偶数番号に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｂ）配列番号：１から２７のいずれかの奇数番号に記載の塩基配列のコード領域を含むＤＮＡ。
（ｃ）配列番号：２から２８のいずれかの偶数番号に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｄ）配列番号：１から２７のいずれかの奇数番号に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ。
〔２〕 下記（ａ）または（ｂ）のいずれかに記載のＤＮＡ。
（ａ）〔１〕に記載のＤＮＡの転写産物と相補的なアンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡ。
（ｂ）〔１〕に記載のＤＮＡの転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有するＲＮＡをコードするＤＮＡ。
〔３〕 〔１〕または〔２〕に記載のＤＮＡを含むベクター。
〔４〕 〔１〕または〔２〕に記載のＤＮＡまたは〔３〕に記載のベクターを保持する形質転換細胞。
〔５〕 植物細胞である、〔４〕に記載の形質転換細胞
〔６〕 〔５〕に記載の形質転換細胞を含む形質転換植物体。
〔７〕 〔６〕に記載の形質転換植物体の子孫またはクローンである、形質転換植物体。
〔８〕 〔６〕または〔７〕に記載の形質転換植物体の繁殖材料。
〔９〕 配列番号：１から２７のいずれかの奇数番号に記載の塩基配列若しくはその相補配列における少なくとも１５の連続する塩基配列を含むオリゴヌクレオチド。
〔１０〕 配列番号：１から２７のいずれかの奇数番号に記載の塩基配列からなるＤＮＡと特異的にハイブリダイズし、少なくとも１５塩基の鎖長を有するオリゴヌクレオチド。
〔１１〕 イネがイネ白葉枯病菌に感染しているか否かを診断する方法であって、
（ａ）イネ植物体若しくはその一部から核酸試料を調製する工程、
（ｂ）該核酸試料における、〔１〕に記載のＤＮＡまたはその発現産物の存在を検出する工程、を含み、
工程（ｂ）において〔１〕に記載のＤＮＡまたはその発現産物の存在が検出された場合に、診断対象であるイネがイネ白葉枯病菌に感染していると判定される方法、を提供するものである。
【００２０】
【発明の実施の形態】
本発明者らは、イネ白葉枯病菌の新規な１４の病原性遺伝子を同定した。本発明はまず、イネ白葉枯病菌に由来するＤＮＡを提供する。
【００２１】
本発明に含まれる、本発明者らにより単離されたイネ白葉枯病菌病原性遺伝子の塩基配列を配列番号：１から２７の奇数番号に、それぞれの塩基配列によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号：２から２８の偶数番号に示す。即ち本発明は、イネ白葉枯病菌に由来する配列番号：２から２８のいずれかの偶数番号に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、および、配列番号：１から２７のいずれかの奇数番号に記載の塩基配列のコード領域を含むＤＮＡを提供する。
【００２２】
また、本発明は、配列番号：２から２８のいずれかの偶数番号に記載のタンパク質と構造的に類似しているタンパク質をコードするＤＮＡも提供する。このようなＤＮＡとしては、該タンパク質において１または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡが挙げられる。
【００２３】
上記のＤＮＡを調製するために、当業者によく知られた方法としては、ハイブリダイゼーション技術（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ， ＥＭ．， Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ， １９７５， ９８， ５０３．）やポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術（Ｓａｉｋｉ， ＲＫ． ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， １９８５， ２３０， １３５０．、Ｓａｉｋｉ， ＲＫ． ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， １９８８， ２３９， ４８７．）の他に、例えば、該ＤＮＡに対し、ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ法（Ｋｒａｍｅｒ， Ｗ． ＆ Ｆｒｉｔｚ， ＨＪ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ， １９８７， １５４， ３５０．）により変異を導入する方法が挙げられる。また、自然界においても、塩基配列の変異によりコードするタンパク質のアミノ酸配列が変異することは起こり得ることである。また、塩基配列が変異していても、その変異がタンパク質中のアミノ酸の変異を伴わない場合（縮重変異）があり、このような縮重変異ＤＮＡも本発明に含まれる。
【００２４】
本発明のＤＮＡには、天然あるいは単離・精製されたゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、および化学合成ＤＮＡが含まれる。ゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡの調製は、当業者にとって常套手段を利用して行うことが可能である。ゲノムＤＮＡは、例えば、配列番号：２から２８のいずれかの偶数番号に記載のタンパク質をコードする遺伝子を有する生物からゲノムＤＮＡを抽出し、ゲノミックライブラリー（ベクターとしては、プラスミド、ファージ、コスミド、ＢＡＣ、ＰＡＣ等が利用できる）を作成し、これを展開して、該タンパク質をコードするＤＮＡを基に調製したプローブを用いてコロニーハイブリダイゼーションあるいはプラークハイブリダイゼーションを行うことにより調製することが可能である。また、配列番号：２から２８のいずれかの偶数番号に記載のタンパク質をコードするＤＮＡに特異的なプライマーを作成し、これを利用したＰＣＲを行うことによって調製することも可能である。また、ｃＤＮＡは、例えば、該タンパク質をコードする遺伝子を有する生物から抽出したｍＲＮＡを基にｃＤＮＡを合成し、これをλＺＡＰ等のベクターに挿入してｃＤＮＡライブラリーを作成し、これを展開して、上記と同様にコロニーハイブリダイゼーションあるいはプラークハイブリダイゼーションを行うことにより、また、ＰＣＲを行うことにより調製することが可能である。このように、ハイブリダイゼーション技術やＰＣＲ技術によって単離し得る、配列番号：１から２７のいずれかの奇数番号に記載の塩基配列からなるＤＮＡとハイブリダイズするＤＮＡもまた、本発明のＤＮＡに含まれる。
【００２５】
このようなＤＮＡを単離するためには、好ましくはストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーション反応を行う。本発明においてストリンジェントなハイブリダイゼーション条件とは、６Ｍ 尿素、０．４％ ＳＤＳ、０．５×ＳＳＣの条件またはこれと同等のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件を指す。よりストリンジェンシーの高い条件、例えば、６Ｍ 尿素、０．４％ ＳＤＳ、０．１×ＳＳＣの条件下では、より相同性の高いＤＮＡを単離できることが期待される。こうして単離されたＤＮＡは、アミノ酸レベルにおいて、列番号：２から２８のいずれかの偶数番号に記載のアミノ酸配列と高い相同性を有すると考えられる。高い相同性とは、アミノ酸配列全体で少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の配列の同一性を指す。
【００２６】
アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、カーリンおよびアルチュールによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｅｉ． ＵＳＡ， １９９０， ８７， ２２６４−２２６８．、Ｋａｒｌｉｎ，Ｓ． ＆ Ａｌｔｓｃｈｕｌ， ＳＦ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｅｉ． ＵＳＡ， １９９３， ９０， ５８７３．）を用いて決定できる。ＢＬＡＳＴのアルゴリズムに基づいたＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸと呼ばれるプログラムが開発されている（Ａｌｔｓｃｈｕｌ， ＳＦ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ， １９９０， ２１５， ４０３．）。ＢＬＡＳＴＮを用いて塩基配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばｓｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２とする。また、ＢＬＡＳＴＸを用いてアミノ酸配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）。
【００２７】
また本発明は、本発明のＤＮＡの転写産物と相補的なアンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡ、および本発明のＤＮＡの転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有するＲＮＡをコードするＤＮＡを提供する。
【００２８】
本発明の好ましい態様においては、上記ＤＮＡを用いて、例えば、本発明のＤＮＡの発現が抑制されたイネ白葉枯病抵抗性植物の作出を行うことができる。
【００２９】
本発明のＤＮＡの発現が抑制された形質転換植物体を作製する場合には、本発明のＤＮＡの発現を抑制するためのＤＮＡを適当なベクターに挿入して、これを植物細胞に導入し、これにより得られた形質転換植物細胞を再生させる。「本発明のＤＮＡの発現抑制」には、遺伝子の転写の抑制、および／またはタンパク質への翻訳の抑制が含まれる。また、ＤＮＡの発現の完全な停止のみならず発現の減少も含まれる。
【００３０】
植物における特定の遺伝子の発現を抑制する方法としては、アンチセンス技術を利用する方法が当業者に最もよく利用されている。植物細胞におけるアンチセンス効果は、電気穿孔法で導入したアンチセンスＲＮＡが植物においてアンチセンス効果を発揮することをエッカーらが示したことで初めて実証された（Ｅｃｋｅｒ ＪＲ＆ Ｄａｖｉｓ ＲＷ： Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８３： ５３７２， １９８６）。その後、タバコやペチュニアにおいてもアンチセンスＲＮＡの発現により標的遺伝子の発現が低下した例が報告されており（ｖａｎ ｄｅｒ Ｋｒｏｌ ＡＲ， ｅｔ ａｌ： Ｎａｔｕｒｅ ３３３： ８６６， １９８８）、現在では、アンチセンス技術は植物における遺伝子発現を抑制させる手段として確立している。
【００３１】
アンチセンス核酸が標的遺伝子の発現を抑制する作用としては、以下のような複数の要因が存在する。すなわち、三重鎖形成による転写開始阻害、ＲＮＡポリメラーゼによって局部的に開状ループ構造が作られた部位とのハイブリッド形成による転写阻害、合成の進みつつあるＲＮＡとのハイブリッド形成による転写阻害、イントロンとエクソンとの接合点におけるハイブリッド形成によるスプライシング阻害、スプライソソーム形成部位とのハイブリッド形成によるスプライシング阻害、ｍＲＮＡとのハイブリッド形成による核から細胞質への移行阻害、キャッピング部位やポリ（Ａ）付加部位とのハイブリッド形成によるスプライシング阻害、翻訳開始因子結合部位とのハイブリッド形成による翻訳開始阻害、開始コドン近傍のリボソーム結合部位とのハイブリッド形成による翻訳阻害、ｍＲＮＡの翻訳領域やポリソーム結合部位とのハイブリッド形成によるペプチド鎖の伸長阻害、および核酸とタンパク質との相互作用部位とのハイブリッド形成による遺伝子発現阻害などである。このようにアンチセンス核酸は、転写、スプライシングまたは翻訳など様々な過程を阻害することで、標的遺伝子の発現を抑制する（平島および井上： 新生化学実験講座２ 核酸ＩＶ 遺伝子の複製と発現（日本生化学会編， 東京化学同人）ｐｐ．３１９−３４７， １９９３）。
【００３２】
本発明で用いられるアンチセンス配列は、上記のいずれの作用により標的遺伝子の発現を抑制してもよい。一つの態様としては、遺伝子のｍＲＮＡの５’端近傍の非翻訳領域に相補的なアンチセンス配列を設計すれば、遺伝子の翻訳阻害に効果的と考えられる。また、コード領域もしくは３’側の非翻訳領域に相補的な配列も使用することができる。このように、遺伝子の翻訳領域だけでなく非翻訳領域の配列のアンチセンス配列を含むＤＮＡも、本発明で利用されるアンチセンスＤＮＡに含まれる。使用されるアンチセンスＤＮＡは、適当なプロモーターの下流に連結され、好ましくは３’側に転写終結シグナルを含む配列が連結される。このようにして調製されたＤＮＡは、公知の方法を用いることで、所望の植物へ形質転換できる。アンチセンスＤＮＡの配列は、本発明のイネ白葉枯病の病原遺伝子またはその一部と相補的な配列であることが好ましいが、遺伝子の発現を有効に抑制できる限りにおいて、完全に相補的でなくてもよい。転写されたＲＮＡは、標的遺伝子の転写産物に対して好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相補性を有する。アンチセンス配列を用いて標的遺伝子の発現を効果的に抑制するには、アンチセンスＤＮＡの長さは少なくとも１５塩基以上であり、好ましくは１００塩基以上であり、さらに好ましくは５００塩基以上である。通常用いられるアンチセンスＤＮＡの長さは５ｋｂよりも短く、好ましくは２．５ｋｂよりも短い。
【００３３】
遺伝子の発現の抑制は、また、リボザイムをコードするＤＮＡを利用して行うことも可能である。リボザイムとは触媒活性を有するＲＮＡ分子のことを指す。リボザイムには種々の活性を有するものが存在するが、中でもＲＮＡを切断する酵素としてのリボザイムに焦点を当てた研究により、ＲＮＡを部位特異的に切断するリボザイムの設計が可能となった。リボザイムには、グループＩイントロン型やＲＮａｓｅＰに含まれるＭ１ ＲＮＡのように４００ヌクレオチド以上の大きさのものもあるが、ハンマーヘッド型やヘアピン型と呼ばれる４０ヌクレオチド程度の活性ドメインを有するものもある（小泉誠および大塚栄子： 蛋白質核酸酵素， ３５： ２１９１， １９９０）。
【００３４】
例えば、ハンマーヘッド型リボザイムの自己切断ドメインは、Ｇ１３Ｕ１４Ｃ１５という配列のＣ１５の３’側を切断するが、その活性にはＵ１４とＡ９との塩基対形成が重要とされ、Ｃ１５の代わりにＡ１５またはＵ１５でも切断され得ることが示されている（Ｋｏｉｚｕｍｉ Ｍ， ｅｔ ａｌ： ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ ２２８： ２２８， １９８８）。基質結合部位が標的部位近傍のＲＮＡ配列と相補的なリボザイムを設計すれば、標的ＲＮＡ中のＵＣ、ＵＵまたはＵＡという配列を認識する制限酵素的なＲＮＡ切断リボザイムを作出することができる（ＫｏｉｚｕｍｉＭ， ｅｔ ａｌ： ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ ２３９： ２８５， １９８８、小泉誠および大塚栄子： 蛋白質核酸酵素 ３５： ２１９１， １９９０、 Ｋｏｉｚｕｍｉ Ｍ， ｅｔ ａｌ： Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １７： ７０５９， １９８９）。
例えば、イネ白葉枯病の病原遺伝子のＤＮＡ（配列番号：１から２７のいずれかの奇数番号に記載）中には、標的となり得る部位が複数存在するものと推定される。
【００３５】
また、ヘアピン型リボザイムも本発明の目的に有用である。このリボザイムは、例えばタバコリングスポットウイルスのサテライトＲＮＡのマイナス鎖に見出される（Ｂｕｚａｙａｎ ＪＭ： Ｎａｔｕｒｅ ３２３： ３４９， １９８６）。ヘアピン型リボザイムからも、標的特異的なＲＮＡ切断リボザイムを作出できることが示されている（Ｋｉｋｕｃｈｉ Ｙ ＆ Ｓａｓａｋｉ Ｎ： Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １９： ６７５１， １９９１、菊池洋： 化学と生物 ３０： １１２， １９９２）。
【００３６】
標的を切断できるように設計されたリボザイムは、植物細胞中で転写されるように、カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーターなどのプロモーターおよび転写終結配列に連結される。このとき、転写されたＲＮＡの５’端や３’端に余分な配列が付加されていると、リボザイムの活性が失われることがあるが、こういった場合は、転写されたリボザイムを含むＲＮＡからリボザイム部分だけを正確に切り出すために、リボザイム部分の５’側や３’側にシスに働く別のトリミングリボザイムを配置させることも可能である（Ｔａｉｒａ Ｋ， ｅｔ ａｌ： Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ ３： ７３３， １９９０、Ｄｚｉａｎｏｔｔ ＡＭ ＆ Ｂｕｊａｒｓｋｉ ＪＪ： Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８６： ４８２３， １９８９、Ｇｒｏｓｓｈａｎｓ ＣＡ ＆ Ｃｅｃｈ ＴＲ： Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １９： ３８７５， １９９１、Ｔａｉｒａ Ｋ， ｅｔ ａｌ： Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １９： ５１２５， １９９１）。また、このような構成単位をタンデムに並べ、標的遺伝子内の複数の部位を切断できるようにすることで、より効果を高めることもできる（Ｙｕｙａｍａ Ｎ， ｅｔ ａｌ： Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ １８６： １２７１，１９９２）。このように、リボザイムを用いて本発明における標的遺伝子の転写産物を特異的に切断することで、該遺伝子の発現を抑制することができる。
【００３７】
また、本発明のＤＮＡを植物体に導入することによって、植物側に常時抵抗性を誘導させることも有効である。
【００３８】
本発明のＤＮＡは、例えば、組み換えタンパク質の調製に利用することが可能である。
【００３９】
組み換えタンパク質を調製する場合には、通常、本発明のＤＮＡを適当な発現ベクターに挿入し、該ベクターを適当な細胞に導入し、形質転換細胞を培養して発現させたタンパク質を精製する。組み換えタンパク質は、精製を容易にするなどの目的で、他のタンパク質との融合タンパク質として発現させることも可能である。例えば、大腸菌を宿主としてマルトース結合タンパク質との融合タンパク質として調製する方法（米国Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ社発売のベクターｐＭＡＬシリーズ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として調製する方法（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社発売のベクターｐＧＥＸシリーズ）、ヒスチジンタグを付加して調製する方法（Ｎｏｖａｇｅｎ社のｐＥＴシリーズ）などを利用することが可能である。宿主細胞としては、組み換えタンパク質の発現に適した細胞であれば特に制限はなく、上記の大腸菌の他、発現ベクターを変えることにより、例えば、酵母、種々の動植物細胞、昆虫細胞などを用いることが可能である。宿主細胞へのベクターの導入には、当業者に公知の種々の方法を用いることが可能である。例えば、大腸菌への導入には、カルシウムイオンを利用した導入方法（Ｍａｎｄｅｌ， Ｍ． ＆ Ｈｉｇａ， Ａ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， １９７０， ５３， １５８−１６２．、Ｈａｎａｈａｎ， Ｄ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， １９８３， １６６， ５５７−５８０．）を用いることができる。宿主細胞内で発現させた組み換えタンパク質は、該宿主細胞またはその培養上清から、当業者に公知の方法により精製し、回収することができる。組み換えタンパク質を上記したマルトース結合タンパク質などとの融合タンパク質として発現させた場合には、容易にアフィニティー精製を行うことが可能である。このようにして作製される本発明のＤＮＡによってコードされるタンパク質もまた、本発明に含まれる。
【００４０】
得られた組み換えタンパク質を用いることにより、これに結合する抗体を調製することも可能である。該抗体は、後述のイネ白葉枯病菌に感染しているか否かを診断する方法に使用することができる。
【００４１】
ポリクローナル抗体は、例えば、精製した本発明のタンパク質若しくはその一部のペプチドをウサギなどの免疫動物に免疫し、一定期間の後に血液を採取し、血ぺいを除去した血清より調製することが可能である。また、モノクローナル抗体は、上記タンパク質もしくはペプチドで免疫した動物の抗体産生細胞と骨腫瘍細胞とを融合させ、目的とする抗体を産生する単一クローンの細胞（ハイブリドーマ）を単離し、該細胞から抗体を得ることにより調製することができる。これにより得られた抗体は、本発明のタンパク質の精製や検出などに利用することが可能である。本発明の抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、およびこれら抗体の断片が含まれる。
【００４２】
また本発明は、上記ＤＮＡを含むベクター、該ベクターを保持する形質転換細胞、植物細胞である形質転換細胞、該形質転換細胞を含む形質転換植物体、該形質転換植物体の子孫またはクローンである形質転換植物体、および該形質転換植物体の繁殖材料を提供する。
【００４３】
本発明のＤＮＡまたは核酸の植物細胞への導入は、当業者においては、公知の方法、例えばアグロバクテリウム法、電気穿孔法（エレクトロポーレーション法）、パーティクルガン法により実施することができる。
【００４４】
上記アグロバクテリウム法を用いる場合、例えばＮａｇｅｌらの方法（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｌｅｔｔ．， １９９０， ６７， ３２５．）が用いられる。この方法によれば、組み換えベクターをアグロバクテリウム細菌中に形質転換して、次いで形質転換されたアグロバクテリウムを、リーフディスク法等の公知の方法により植物細胞に導入する。上記ベクターは、例えば植物体に導入した後、本発明のＤＮＡが植物体中で発現するように、発現プロモーターを含む。一般に、該プロモーターの下流には本発明のＤＮＡが位置し、さらに該ＤＮＡの下流にはターミネーターが位置する。この目的に用いられる組み換えベクターは、植物への導入方法、または植物の種類に応じて、当業者によって適宜選択される。上記プロモーターとして、例えばカリフラワーモザイクウイルス由来のＣａＭＶ３５Ｓ、トウモロコシのユビキチンプロモーター（特開平２−７９９８３号公報）等を挙げることができる。
【００４５】
また、上記ターミネーターは、カリフラワーモザイクウイルス由来のターミネーター、あるいはノパリン合成酵素遺伝子由来のターミネーター等を例示することができるが、植物体中で機能するプロモーターやターミネーターであれば、これらに限定されない。
【００４６】
また、本発明のＤＮＡまたは核酸を導入する植物は、外植片であってもよく、これらの植物から培養細胞を調製し、得られた培養細胞に導入してもよい。本発明の「植物細胞」は、例えば葉、根、茎、花および種子中の胚盤等の植物細胞、カルス、懸濁培養細胞等が挙げられる。
【００４７】
また、本発明のＤＮＡまたは核酸の導入により形質転換した植物細胞を効率的に選択するために、上記組み換えベクターは、適当な選抜マーカー遺伝子を含む、もしくは選抜マーカー遺伝子を含むプラスミドベクターと共に植物細胞へ導入するのが好ましい。この目的に使用する選抜マーカー遺伝子は、例えば抗生物質ハイグロマイシンに耐性であるハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、カナマイシンまたはゲンタマイシンに耐性であるネオマイシンホスホトランスフェラーゼ、および除草剤ホスフィノスリシンに耐性であるアセチルトランスフェラーゼ遺伝子等が挙げられる。
【００４８】
組み換えベクターを導入した植物細胞は、導入された選抜マーカー遺伝子の種類に従って適当な選抜用薬剤を含む公知の選抜用培地に置床し培養する。これにより形質転換された植物培養細胞を得ることができる。
【００４９】
次いで、本発明のＤＮＡまたは核酸を導入した形質転換細胞から植物体を再生する。植物体の再生は植物細胞の種類に応じて当業者に公知の方法で行うことが可能である（Ｔｏｋｉ． ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ， １９９５， １００， １５０３−１５０７．）。例えばイネにおいては、形質転換植物体を作出する手法については、ポリエチレングリコールによりプロトプラストへ遺伝子導入し、植物体（インド型イネ品種が適している）を再生させる方法（Ｄａｔｔａ， Ｓ Ｋ． ｅｔ ａｌ．， Ｉｎ Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｔｏ Ｐｌａｎｔｓ （Ｐｏｔｒｙｋｕｓ Ｉ ａｎｄ Ｓｐａｎｇｅｎｂｅｒｇ Ｅｄｓ．）， １９９５， ６６−７４．）、電気パルスによりプロトプラストへ遺伝子導入し、植物体（日本型イネ品種が適している）を再生させる方法（Ｔｏｋｉ． ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ， １９９２， １００， １５０３−１５０７．）、パーティクルガン法により細胞へ遺伝子を直接導入し、植物体を再生させる方法（Ｃｈｒｉｓｔｏｕ， ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， １９９１， ９， ９５７−９６２．）およびアグロバクテリウムを介して遺伝子を導入し、植物体を再生させる方法（Ｈｉｅｉ． ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｊ， １９９４，６， ２７１−２８２．）等、いくつかの技術が既に確立し、本願発明の技術分野において広く用いられている。本発明においては、これらの方法を好適に用いることができる。
【００５０】
形質転換細胞から再生させた植物体は、次いで順化用培地で培養する。その後、順化した再生植物体を、通常の栽培条件で栽培すると、植物体が得られ、成熟して結実して種子を得ることができる。
【００５１】
なお、このように再生され、かつ栽培した形質転換植物体中の導入された外来ＤＮＡまたは核酸の存在は、公知のＰＣＲ法やサザンハイブリダイゼーション法によって、または植物体中の核酸の塩基配列を解析することによって確認することができる。この場合、形質転換植物体からのＤＮＡまたは核酸の抽出は、公知のＪ．Ｓａｍｂｒｏｏｋらの方法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， 第２版， Ｃｏｌｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， １９８９）に準じて実施することができる。
【００５２】
再生させた植物体中に存在する本発明のＤＮＡよりなる外来遺伝子を、ＰＣＲ法を用いて解析する場合には、上記のように再生植物体から抽出した核酸を鋳型として増幅反応を行う。また、本発明の核酸がＤＮＡである場合には、該ＤＮＡの塩基配列に従って適当に選択された塩基配列をもつ合成したオリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、これらを混合させた反応液中おいて増幅反応を行うこともできる。増幅反応においては、ＤＮＡの変性、アニーリング、伸張反応を数十回繰り返すと、本発明のＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片の増幅生成物を得ることができる。増幅生成物を含む反応液を、例えばアガロース電気泳動にかけると、増幅された各種のＤＮＡ断片が分画されて、そのＤＮＡ断片が本発明のＤＮＡに対応することを確認することが可能である。
【００５３】
一旦、染色体内に本発明のＤＮＡが導入された形質転換植物体が得られれば、該植物体から有性生殖または無性生殖により子孫を得ることが可能である。また、該植物体やその子孫あるいはクローンから繁殖材料（例えば種子、果実、切穂、塊茎、塊根、株、カルス、プロトプラスト等）を得て、それらを基に該植物体を量産することも可能である。
【００５４】
また、本発明は、配列番号：１から２７のいずれかの奇数番号に記載の塩基配列若しくはその相補配列における少なくとも１５の連続する塩基配列を含むオリゴヌクレオチドを提供する。ここで「相補配列」とは、Ａ：Ｔ、Ｇ：Ｃの塩基対からなる２本鎖ＤＮＡの一方の鎖に対する他方の配列を指す。また、少なくとも１５個の連続したヌクレオチド領域で完全に相補配列である場合に限られず、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは９０％、さらに好ましくは９５％以上の塩基配列の同一性を有すればよい。このようなＤＮＡは、本発明のＤＮＡの検出や単離を行うためのプローブとして、また、増幅を行うためのプライマーとして有用である。
【００５５】
さらに、本発明は、配列番号：１から２７のいずれかの奇数番号に記載の塩基配列からなるＤＮＡと特異的にハイブリダイズし、少なくとも１５塩基の鎖長を有するオリゴヌクレオチドを提供する。該オリゴヌクレオチドは、本発明のＤＮＡに特異的にハイブリダイズするものである。ここで「特異的にハイブリダイズする」とは、通常のハイブリダイゼーション条件下、好ましくはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下（例えば、サムブルックら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ，第２版１９８９に記載の条件）において、他のタンパク質をコードするＤＮＡとクロスハイブリダイゼーションを有意に生じないことを意味する。特異的なハイブリダイズが可能であれば、該オリゴヌクレオチドは、本発明のＤＮＡに対し、完全に相補的である必要はない。
【００５６】
本発明のＤＮＡにハイブリダイズし、少なくとも１５ヌクレオチドの鎖長を有するオリゴヌクレオチドは、本発明のＤＮＡを検出するためのプローブやプライマーとして用いることができる。該オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いる場合、その長さは、通常１５ｂｐ〜１００ｂｐであり、好ましくは１７ｂｐ〜３０ｂｐである。プライマーは、本発明のＤＮＡの少なくとも一部を増幅しうるものであれば、特に制限されない。
【００５７】
また、上記オリゴヌクレオチドをプローブとして使用する場合、該プローブは、本発明のＤＮＡに特異的にハイブリダイズするものであれば、特に制限されない。該プローブは、合成オリゴヌクレオチドであってもよく、通常少なくとも１５ｂｐ以上の鎖長を有する。
【００５８】
本発明のオリゴヌクレオチドをプローブとして用いる場合は、適宜標識して用いることが好ましい。標識する方法としては、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて、オリゴヌクレオチドの５’端を３２Ｐでリン酸化することにより標識する方法、およびクレノウ酵素等のＤＮＡポリメラーゼを用い、ランダムヘキサマーオリゴヌクレオチド等をプライマーとして３２Ｐ等のアイソトープ、蛍光色素、またはビオチン等によって標識された基質塩基を取り込ませる方法（ランダムプライム法等）を例示することができる。
【００５９】
さらに本発明は、イネがイネ白葉枯病菌に感染しているか否かを診断する方法を提供する。
【００６０】
本発明の上記診断方法においては、まず、（ａ）イネ植物体若しくはその一部から核酸試料を調製する。次いで、（ｂ）該核酸試料における本発明のＤＮＡまたはその発現産物の存在を検出する。（ｂ）において、発現産物が検出された場合は、診断対象であるイネがイネ白葉枯病菌に感染していると判定される。なお、上記「その一部」とは、例えば、植物体組織、細胞、または細胞抽出液等を指す。
【００６１】
本発明の診断方法の一つの態様は、プライマーあるいはプローブを利用してイネ白葉枯病菌タンパク質をコードするＤＮＡを検出する。このようなプローブやプライマーとしては、本発明の上記オリゴヌクレオチドを用いることができる。
【００６２】
本発明者らは実際に、本発明の遺伝子にハイブリダイズし、該遺伝子を増幅可能なＰＣＲプライマーセットを用いて、被検イネについてイネ白葉枯病菌を特異的に検出することに成功した。従って、本発明の上記オリゴヌクレオチドは、本発明の診断方法に好適に使用することが可能である。本発明の上記診断方法に用いられるオリゴヌクレオチドの一例としては、後述の実施例５に記載のプライマーセットを示すことができるが、これに限定されない。当業者においては、配列番号：１から２８のいずれかの奇数番号に記載の塩基配列を基に、適宜、本発明のＤＮＡを増幅可能なプライマーセットを設計することが可能である。同様に、配列番号：１から２８のいずれかの奇数番号に記載の塩基配列を基に、本発明のＤＮＡを検出可能なプローブを設計することは、当業者においては容易に実施することが可能である。プライマーやプローブは必要に応じて標識されていてもよい。標識としては、例えば、放射標識が挙げられる。本発明の診断方法に使用可能なプライマーまたはプローブも、本発明に包含される。
【００６３】
本発明の上記診断方法は、例えば、イネ白葉枯病菌に感染したことが疑われるイネ植物体若しくはその一部から核酸試料を調製し、上記のプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法、あるいは上記のプローブを利用したノーザンブロッティング法等により実施することができる。
【００６４】
本発明の診断方法の他の一つの態様は、抗体を利用し、被検イネについて本発明のイネ白葉枯病の病原遺伝子によってコードされるタンパク質の有無を指標として診断する方法である。この診断に用いる抗体は、例えば、上述のようにして調製することができる。抗体は、必要に応じて標識されていてもよい。標識としては、例えば、酵素標識が挙げられる。また、抗体自体を直接標識しなくとも、抗体に結合する物質、例えば、プロテインＡなどを介して標識して、目的のタンパク質を検出してもよい。この診断においては、例えば、イネ白葉枯病菌に感染したことが疑われるイネ植物体若しくはその一部から被検試料を調製し、上記の抗体を用いてＥＬＩＳＡ法あるいはウエスタンブロット法により実施することができる。
【００６５】
【実施例】
以下、本発明を実施例により、さらに具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
【００６６】
〔実施例１〕 ＢＡＣライブラリー作製
ＢＡＣ（ｂａｃｔｅｒｉａｌ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）は、大きなＤＮＡ断片を安定に取り扱える点、またキメラＤＮＡの生成が少ない点から、数少ないクローンでゲノム全体を網羅することができ、ゲノム解析を行うに当たり有効なツールの一つである。そこで、本発明者らは平均挿入断片長約１００から１２０ｋｂで、約１６ゲノム分のＢＡＣライブラリーを作製した（Ｏｃｈｉａｉ， Ｈ．， Ｉｎｏｕｅ， Ｙ．， Ｈａｓｅｂｅ， Ａ． ａｎｄ Ｋａｋｕ， Ｈ． （２００１）． Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚａｅ ｐｖ． ｏｒｙｚａｅｂａｃｔｅｒｉａｌ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ｌｉｂｒａｒｙ． ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｌｅｔｔ． ２００：５９−６５）。
【００６７】
〔実施例２〕 ｈｒｐ遺伝子クラスター及び周辺領域の解析
植物病原細菌が植物に病気を引き起こすには、宿主認識／感染成立と発病因子放出／発病という大きく２つの過程が考えられる。ｈｒｐ遺伝子クラスターに含まれる遺伝子群は、このうちの宿主認識／感染成立といった過程において重要な役割を果たす病原性因子分泌機構（ｔｙｐｅＩＩＩ）の構成分子をコードするのみでなく、いくつかの病原性因子をもコードしており、植物病原細菌において最も重要な病原性遺伝子群であることが知られている（Ｂｏｎａｓ， Ｕ．， Ｓｃｈｕｌｔｅ， Ｒ．， Ｆｅｎｓｅｌａｕ， Ｓ．， Ｍｉｎｓａｖａｇｅ， Ｇ．Ｖ．， Ｓｔａｓｋａｗｉｃｚ， Ｂ．Ｊ．， ａｎｄ Ｓｔａｌｌ， Ｒ．Ｅ． （１９９１）． Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｇｅｎｅ ｃｌｕｓｔｅｒ ｆｒｏｍ Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐｖ． ｖｅｓｉｃａｔｏｒｉａ ｔｈａｔ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｓ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｔｙ ａｎｄ ｔｈｅ ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｏｎ ｐｅｐｐｅｒ ａｎｄ ｔｏｍａｔｏ．Ｍｏｌ． Ｐｌａｎｔ−Ｍｉｃｒｏｂｅ Ｉｎｔｅｒａｃｔ． ４：８１−８８）。
【００６８】
そこで、ＰＣＲスクリーニングで単離したｈｒｐ遺伝子クラスターを有するＢＡＣクローンの塩基配列をショットガン法で決定した。決定した領域はｈｒｐ遺伝子クラスター約３０ ｋｂを含めた約２２０ ｋｂである。この領域における遺伝子予測の結果を図１に示した。Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ属で既知のｈｒｐ遺伝子クラスターを構成する２４遺伝子すべてを含め、合計１７１遺伝子の存在を予測した。
【００６９】
この領域で特徴的なことは、トランスポゼースのホモログ（挿入配列：ＩＳ）がｈｒｐクラスターの内部をはじめ、複数の領域で且つタンデムに挿入されていた点である。予測した遺伝子数１７１に対して、約２割に当たる３６個のトランスポゼースホモログを見出した。また、いくつかのトランスポーターに関連する遺伝子や、グルカン関係の遺伝子クラスターを見出した。一方、予測した遺伝子をｂｌａｓｔ検索した結果、現時点で他に生物と有意な相同性が認められない１４個のイネ白葉枯病菌固有と考えられる遺伝子を発見した。該遺伝子の塩基配列を配列番号：１から２７の奇数番号に、それぞれの塩基配列から予測されるアミノ酸配列をそれぞれ配列番号２から２８の偶数番号に記載する。
【００７０】
〔実施例３〕 ＰＣＲによるイネ白葉枯病菌の特異的検出
イネ白葉枯病菌及びイネ白葉枯病菌と同じ属である各種Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ属細菌のＤＮＡを鋳型に図２Ａに示したプライマーセットを用いたＰＣＲ反応を下記の条件下で行った。ＰＣＲプライマーセットは、配列番号：１９及び２１からそれぞれセンス及びアンチセンスの２０オリゴヌクレオチドのプライマーセットを作製した（図２）。
【００７１】
配列番号：１９におけるＰＣＲプライマー
センスプライマー：５’−ＡＴＧＡＴＣＴＴＧＧＡＡＴＣＧＣＡＣＡＡ（配列番号：２９）
アンチセンスプライマー：５’−ＴＣＡＴＧＡＴＧＣＣＡＣＣＴＣＣＴＧＣＧ（配列番号：３０）
配列番号：２１におけるＰＣＲプライマー
センスプライマー：５’−ＡＴＧＡＡＡＣＴＣＴＣＣＧＧＣＧＧＴＡＴ（配列番号：３１）
アンチセンスプライマー：５’−ＴＣＡＴＧＣＴＣＧＣＣＣＧＣＴＴＴＧＣＣ（配列番号：３２）
【００７２】
ＰＣＲ反応条件は、初期変性９４℃で２分後、変性９４℃１５秒、アニーリング５５℃３０秒、伸長反応７２℃２分のサイクルを３０回行った後、最終伸長反応７２℃７分間を行った。
【００７３】
ＰＣＲ増幅産物は、１％のアガロースグル電気泳動によって行い、エチディウムプロマイド染色後検出した。その結果、イネ白葉枯病菌ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ増幅産物をのせたレーンＡ１３、Ａ１６、Ｂ１５、Ｂ１６及びＣ１５のみに検出された（図３）。
【００７４】
〔実施例４〕 Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ属細菌間におけるゲノム比較解析
２００２年５月、カンキツかいよう病菌（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ａｘｏｎｏｐｏｄｉｓ ｐｖ． ｃｉｔｒｉ）とキャベツ黒腐病菌（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐｖ． ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）の比較ゲノム解析がブラジルの研究グループによって報告された（ｄａ Ｓｉｌｖａ， Ａ．Ｃ．Ｒ． ｅｔ ａｌ． （２００２）．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｇｅｎｏｍｅｓ ｏｆ ｔｗｏ Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｉｎｇ ｈｏｓｔ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ． Ｎａｔｕｒｅ ４１７：４５９−４６３）。いくつかの領域においてゲノムの再編成が認められたが、全体として相同性は高いことが明らかとなった。しかしながら、それぞれのゲノム上には１５から１８％（６５０から８００）の遺伝子が互いに存在しない種固有のものであることも明らかにされている。そこで、イネ白葉枯病菌で得られたゲノム情報とゲノミックサザン解析による３菌種間の比較を行った。
【００７５】
最初に、ｈｒｐ遺伝子クラスターにおけるゲノム構造比較を行った結果、各々の遺伝子間の相同性には若干の相違はあるが、ｈｐａＢ−ｈｒｐＦ領域以外は同じであった（図４）。ｈｐａＢ−ｈｒｐＦ領域に特徴的な点として、イネ白葉枯病菌には、４つのトランスポゼースのホモログが挿入され、長さもほぼ２倍であるのに対して、カンキツかいよう病菌とキャベツ黒腐病菌には認められなかった。また、キャベツ黒腐病菌には、ｈｐａＢの下流にｈｒｐＷが存在するが、他の２菌種には見出されなかった。さらに、キャベツ黒腐病菌では、ｈｒｐＦの下流に存在するｈｐａＦが欠失し、しかもｈｒｐＦの転写方向も逆であった。
【００７６】
【発明の効果】
本発明によって同定されたイネ白葉枯病菌の病原遺伝子は、既知の塩基配列及びアミノ酸配列と有意な相同性を持たないことから、同塩基配列を利用した特異的プローブ、またはＰＣＲプライマーセットを作製してＰＣＲによるイネ白葉枯病菌の簡易検出用としての利用が可能である。
【００７７】
また、この遺伝子を植物体に導入することによって新しい耐病性植物体の育成が期待される。
【００７８】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】ｈｒｐ及び周辺領域の遺伝子マップを示す図である。
【図２】ＰＣＲプライマーセット作成に用いた配列番号：１９および配列番号：２１の配列を表わす。配列を黒枠で示した部分は、各プライマーの配列を示す。
Ａ：配列番号：１９におけるＰＣＲプライマー、Ｂ：配列番号：２１におけるＰＣＲプライマー。
【図３】配列番号：１９の塩基配列を基に設計したプライマーセットによる各種Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ属細菌のＰＣＲ検出の結果を表わす写真である。各レーンの細菌名を写真の下に表わす。
【図４】Ｘ．ｏｒｙｚａｅ ｐｖ．ｏｒｙｚａｅ、Ｘ．ａｘｏｎｏｐｏｄｉｓ ｐｖ．ｃｉｔｒｉ、およびＸ．ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐｖ．ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ間におけるｈｐａＢ−ｈｒｐＦ領域の構造を比較した図である。
Claims (11)
- イネ白葉枯病菌に由来する、下記（ａ）から（ｄ）のいずれかに記載のＤＮＡ。
（ａ）配列番号：２から２８のいずれかの偶数番号に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｂ）配列番号：１から２７のいずれかの奇数番号に記載の塩基配列のコード領域を含むＤＮＡ。
（ｃ）配列番号：２から２８のいずれかの偶数番号に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｄ）配列番号：１から２７のいずれかの奇数番号に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ。 - 下記（ａ）または（ｂ）のいずれかに記載のＤＮＡ。
（ａ）請求項１に記載のＤＮＡの転写産物と相補的なアンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡ。
（ｂ）請求項１に記載のＤＮＡの転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有するＲＮＡをコードするＤＮＡ。 - 請求項１または２に記載のＤＮＡを含むベクター。
- 請求項１または２に記載のＤＮＡまたは請求項３に記載のベクターを保持する形質転換細胞。
- 植物細胞である、請求項４に記載の形質転換細胞
- 請求項５に記載の形質転換細胞を含む形質転換植物体。
- 請求項６に記載の形質転換植物体の子孫またはクローンである、形質転換植物体。
- 請求項６または７に記載の形質転換植物体の繁殖材料。
- 配列番号：１から２７のいずれかの奇数番号に記載の塩基配列若しくはその相補配列における少なくとも１５の連続する塩基配列を含むオリゴヌクレオチド。
- 配列番号：１から２７のいずれかの奇数番号に記載の塩基配列からなるＤＮＡと特異的にハイブリダイズし、少なくとも１５塩基の鎖長を有するオリゴヌクレオチド。
- イネがイネ白葉枯病菌に感染しているか否かを診断する方法であって、
（ａ）イネ植物体若しくはその一部から核酸試料を調製する工程、
（ｂ）該核酸試料における、請求項１に記載のＤＮＡまたはその発現産物の存在を検出する工程、を含み、
工程（ｂ）において請求項１に記載のＤＮＡまたはその発現産物の存在が検出された場合に、診断対象であるイネがイネ白葉枯病菌に感染していると判定される方法。
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