JP2004065088A

JP2004065088A - Pathogenic gene cluster of xanthomonas oryzae pv. oryzae and use thereof

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Publication number: JP2004065088A
Application number: JP2002228163A
Authority: JP
Inventors: Hisatoshi Kako; 加来　久敏; Hirokazu Ochiai; 落合　弘和; Masaru Takeya; 竹谷　勝; Yasuhiro Inoue; 井上　康宏
Original assignee: National Institute of Agrobiological Sciences
Current assignee: National Institute of Agrobiological Sciences
Priority date: 2002-08-06
Filing date: 2002-08-06
Publication date: 2004-03-04
Also published as: WO2004013331A1

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method for simply diagnosing bacterial leaf blight of rice plant, with which a gene related to pathogenicity of Xanthomonas oryzae pv. oryzae being an important pathogenic bacterium of rice plant is identified and presence of a gene related to the pathogenicity of Xanthomonas oryzae pv. oryzae with respect to a rice plant to be examined is used as an index. <P>SOLUTION: DNAs of a pathogenic gene cluster and its neighborhood domain are cloned from Xanthomonas oryzae pv. oryzae and 14 new genes related to pathogenicity of bacterial leaf blight of rice plant are found. The presence of the DNAs of the gene is used as the index to simply and accurately diagnose bacterial leaf blight of rice plant with respect to the rice plant to be examined. <P>COPYRIGHT: (C)2004,JPO

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、作物病害診断および作物育種に関する。
【０００２】
【従来の技術】
Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｉｎｆｌｕｅｎｚａ菌（Ｆｌｅｉｓｃｈｍａｎｎ，　Ｒ．Ｄ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９９５）．　Ｗｈｏｌｅ−ｇｅｎｏｍｅ　ｒａｎｄｏｍ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ａｎｄ　ａｓｓｅｍｂｌｙ　ｏｆ　Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ　Ｒｄ．　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２６９：４９６−５１２）の全ゲノム配列が報告されて以来、モデル微生物である大腸菌や枯草菌の全ゲノム配列、動物病原細菌をはじめとした多様な細菌の全ゲノム配列が報告されている。細菌は、ゲノムサイズが動物・植物に比べ遙かに小さく、また、同じ微生物である糸状菌に比べてもゲノムサイズは約１／１０以下であることから、近年の解析技術の向上とともに急速にゲノム解析が進展している。
【０００３】
ゲノム解析は、遺伝情報の根源であるゲノムを塩基配列レベルで明らかにすることによって、ゲノム上に存在するすべての遺伝子を解析し、そして遺伝子間のネットワークや相互作用等の生命現象全体を理解する上で貴重な情報をもたらすものと期待され、多種多様な生物で全世界的に盛んに行われている。特に動物病原細菌の分野においては、ヒトへの感染や疾病等の病原性機構解明やそこで得られる知見から、ゲノム創薬等様々な研究展開・応用が期待され、現在では、結核菌（Ｃｏｌｅ，　Ｓ．Ｔ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９９８）．　Ｄｅｃｉｐｈｅｒｉｎｇ　ｔｈｅ　ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ｃｏｍｐｌｅｔｅ　ｇｅｎｏｍｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ．　Ｎａｔｕｒｅ　３９３：５３７−４４）をはじめとして大腸菌Ｏ−１５７（Ｈａｙａｓｈｉ，　Ｔ．　ｅｔ　ａｌ．　（２００１）．　Ｃｏｍｐｌｅｔｅ　ｇｅｎｏｍｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆＥｎｔｅｒｏｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ　Ｅｓｃｈｅｌｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｏ１５７：Ｈ７　ａｎｄ　ｇｅｎｏｍｉｃ　ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ　ｗｉｔｈ　ａ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｓｔｒａｉｎ　Ｋ−１２．　ＤＮＡ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　８：１１−２２）等、多くの種で全ゲノム配列が明らかとなりつつある。
【０００４】
一方、植物病原細菌の分野においては、１９９８年の第７回国際植物病理学会でゲノム解析に関する緊急ミーティングが開かれ、今後の展開に関して議論が行われた。植物病原細菌においても、動物病原細菌と同じ観点からゲノム解析に大きな期待がもたれ、今後の重要な研究の方向性として認識されつつある。当時、植物病原細菌のゲノム解析では、ブラジルのグループが先鞭をつけ、Ｘｙｌｅｌｌａ　ｆａｓｔｉｄｉｏｓａの解析が進行しており、また、フランスのグループでは、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ　ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍの解析が予定されている。日本でも、イネ白葉枯病菌を候補としてゲノム解析を行うことが提案され、現在、ほぼ完了している。
【０００５】
イネ白葉枯病（ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ｌｅａｆ　ｂｌｉｇｈｔ　ｏｆ　ｒｉｃｅ）は、日本のみならずアジアの稲作地帯をはじめ、アフリカ、オーストラリア、ラテンアメリカ及び米国において発生する世界的に重要なイネの病害である。
【０００６】
本病を引き起こす病原細菌は、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ　ｏｒｙｚａｅ　ｐｖ．　ｏｒｙｚａｅ（イネ白葉枯病菌）で、イネ品種に対して病原性が異なる多数のレースの存在が知られ、病原性が高度に分化した細菌である。
【０００７】
葉枯れを引き起こす病原細菌は、主に葉縁に分布する水孔から通道管を通って導管内へ侵入し増殖する。増殖した細菌が水分の上昇を妨げるために、葉は局部的に萎ちょうし、葉枯れ（ｌｅａｆ　ｂｌｉｇｈｔ）の症状が起こるものと考えられている。白葉枯病の発症メカニズムについては、毒素説などが知られているが、その詳細は不明であり、今後解明すべき問題の一つである。
【０００８】
また、本細菌が属するＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ属は、多様な植物に病気を引き起こす細菌で構成され、且つその種類も非常に多いことが知られ、農業上重要な細菌群である。
【０００９】
一方、感染相手（宿主）であるイネは、重要な穀物であると同時に、育種、病害抵抗性機構をはじめとした様々な植物の分子生物学的研究の一大モデルとして世界的に精力的に研究がなされているモデル植物である。
【００１０】
一般に、植物病原細菌が植物に病気を引き起こす過程には、宿主認識／感染成立と発病因子放出／発病という２つの過程があり、そこには多くの遺伝子が関与すると考えられている。しかし、詳細については未だ不明な点が多い。
【００１１】
現在までに、イネ白葉枯病菌においては、いくつかの病原性関連遺伝子がクローン化され、それらの機能解析が行われている。しかしながら、病原性関連遺伝子群の全体像を網羅的に把握し、またゲノム上での分布・位置関係を特定するといった分子生物学的基盤の確立を目指した総合的な解析は行われていない。
【００１２】
これまでイネ白葉枯病菌には有効な農薬等の資材がないため、その防除対策としては主にイネ白葉枯病抵抗性遺伝子を育種によって導入することで、イネ白葉枯病抵抗性品種を育成し栽培してきた。しかし、抵抗性遺伝子を導入した耐病性品種の栽培は新たな病原型（レース）を示す病原菌の出現とともに罹病化する、所謂、抵抗性の崩壊が報告されている。
【００１３】
また、病原菌の検出法としてはイネ白葉枯病菌に特異的に感染するファージを検出することによって、発生予察を行う方法が知られている。しかし、ＤＮＡの検出による簡便なイネ白葉枯病の診断技術はこれまでのところ知られていない。
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、イネの重要な病原細菌であるイネ白葉枯病菌の病原性に関わる遺伝子を同定することを目的とする。より詳しくは、イネ白葉枯病菌の病原性に関わる遺伝子の有無を指標とすることにより、被検イネについてイネ白葉枯病を簡便に診断することができる方法の提供を課題とする。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
一般に、植物、動物を問わず病原細菌は、病原を引き起こす遺伝子群をゲノムあるいはプラスミド上に大きなクラスター（病原性アイランド）を形成して存在させていることが知られている。本発明のイネ白葉枯病菌においても、そのような病原性遺伝子クラスターを形成している可能性が予測された。そこで、本発明者らは、特にイネ白葉枯病菌をはじめとした植物病原細菌において、病原性を発現する上で重要な病原性分泌装置（タイプＩＩＩ分泌装置）をコードするｈｒｐ遺伝子クラスターと、レース分化等の病原性の多様化に関わる非病原性遺伝子（ａｖｒｉｌｕｃｅｎｃｅ　ｇｅｎｅ）の解析を中心に、鋭意研究を行った。
【００１６】
まず本発明者らは、植物−微生物相互作用における微生物側の病原性発現機構や応答機構解明のための分子生物学的基盤の確立をはかることに着手した。詳しくは、イネゲノム研究で得られる病害抵抗性遺伝子の解析を通して、植物−微生物相互作用の研究に応用展開されることを視野におき、本発明者らは、イネ白葉枯病菌のゲノム解析を行った。ゲノム解析に用いた菌株としては、イネゲノム研究においてイネ白葉枯病抵抗性遺伝子Ｘａ１（Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ，　Ｓ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９９８）．　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　Ｘａ１，　ａ　ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ｂｌｉｇｈｔ−ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　ｇｅｎｅ　ｉｎ　ｒｉｃｅ，　ｉｓ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｂｙ　ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ．　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　Ｕ．Ｓ．Ａ．　９５：１６６３−８）が単離され、その構造解析が行われていた点、即ち相互作用を解明するに当たり、抵抗性遺伝子（Ｘａ１）に対して非病原性遺伝子（ａｖｒＸａ１）を有する菌株を対象に、さらに多数の非病原性遺伝子を有すると考えられる（病原性スペクトラムが狭い）点を考慮した結果、日本のレースＩの代表菌株であるＭＡＦＦ３１１０１８（Ｔ７１７４）を供試した。
【００１７】
迅速かつ簡便的な病原菌の診断には、イネ白葉枯病菌に特異的な遺伝子領域等を増幅するＰＣＲによる検出が有効である。また、病害抵抗性品種には、病原菌由来の病原性遺伝子を植物体に導入することによって、植物側に常時抵抗性誘導させることが有効である。本発明者らは農業資源研究所で保存してある日本産のイネ白葉枯病菌から病原性遺伝子群及びその近傍領域のＤＮＡをクローン化し、その塩基配列を決定した結果、既存のデータベース上に有意な相同性を示さないイネ白葉枯病菌固有の１４の新規病原性遺伝子を同定することに成功した。これらの遺伝子はイネゲノム中には見出されないことから、被検イネについて、これらの新規病原性遺伝子の有無を指標とすることにより、簡便かつ正確にイネ白葉枯病の診断を行うことが可能である。従って、本発明者らによって見出された新規遺伝子は、非常に有用性の高いものと言える。本発明者らは実際に、該新規病原性遺伝子にハイブリダイズし、該遺伝子を増幅可能なＰＣＲプライマーセットを用いて、被検イネについてイネ白葉枯病菌を特異的に検出することに成功した。
【００１８】
また、本発明によって得られたイネ白葉枯病菌のゲノム解析に関する情報は、病原性機構解明のための有力な情報になるとともに、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ属細菌の病原性の多様性をはじめとした遺伝的多様性の解析や分類研究において有効な知見となるものと期待される。
【００１９】
即ち本発明は、イネ白葉枯病菌の新規病原性遺伝子群およびその利用に関し、より詳しくは、
〔１〕　イネ白葉枯病菌に由来する、下記（ａ）から（ｄ）のいずれかに記載のＤＮＡ。
（ａ）配列番号：２から２８のいずれかの偶数番号に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｂ）配列番号：１から２７のいずれかの奇数番号に記載の塩基配列のコード領域を含むＤＮＡ。
（ｃ）配列番号：２から２８のいずれかの偶数番号に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｄ）配列番号：１から２７のいずれかの奇数番号に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ。
〔２〕　下記（ａ）または（ｂ）のいずれかに記載のＤＮＡ。
（ａ）〔１〕に記載のＤＮＡの転写産物と相補的なアンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡ。
（ｂ）〔１〕に記載のＤＮＡの転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有するＲＮＡをコードするＤＮＡ。
〔３〕　〔１〕または〔２〕に記載のＤＮＡを含むベクター。
〔４〕　〔１〕または〔２〕に記載のＤＮＡまたは〔３〕に記載のベクターを保持する形質転換細胞。
〔５〕　植物細胞である、〔４〕に記載の形質転換細胞
〔６〕　〔５〕に記載の形質転換細胞を含む形質転換植物体。
〔７〕　〔６〕に記載の形質転換植物体の子孫またはクローンである、形質転換植物体。
〔８〕　〔６〕または〔７〕に記載の形質転換植物体の繁殖材料。
〔９〕　配列番号：１から２７のいずれかの奇数番号に記載の塩基配列若しくはその相補配列における少なくとも１５の連続する塩基配列を含むオリゴヌクレオチド。
〔１０〕　配列番号：１から２７のいずれかの奇数番号に記載の塩基配列からなるＤＮＡと特異的にハイブリダイズし、少なくとも１５塩基の鎖長を有するオリゴヌクレオチド。
〔１１〕　イネがイネ白葉枯病菌に感染しているか否かを診断する方法であって、
（ａ）イネ植物体若しくはその一部から核酸試料を調製する工程、
（ｂ）該核酸試料における、〔１〕に記載のＤＮＡまたはその発現産物の存在を検出する工程、を含み、
工程（ｂ）において〔１〕に記載のＤＮＡまたはその発現産物の存在が検出された場合に、診断対象であるイネがイネ白葉枯病菌に感染していると判定される方法、を提供するものである。
【００２０】
【発明の実施の形態】
本発明者らは、イネ白葉枯病菌の新規な１４の病原性遺伝子を同定した。本発明はまず、イネ白葉枯病菌に由来するＤＮＡを提供する。
【００２１】
本発明に含まれる、本発明者らにより単離されたイネ白葉枯病菌病原性遺伝子の塩基配列を配列番号：１から２７の奇数番号に、それぞれの塩基配列によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号：２から２８の偶数番号に示す。即ち本発明は、イネ白葉枯病菌に由来する配列番号：２から２８のいずれかの偶数番号に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、および、配列番号：１から２７のいずれかの奇数番号に記載の塩基配列のコード領域を含むＤＮＡを提供する。
【００２２】
また、本発明は、配列番号：２から２８のいずれかの偶数番号に記載のタンパク質と構造的に類似しているタンパク質をコードするＤＮＡも提供する。このようなＤＮＡとしては、該タンパク質において１または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡが挙げられる。
【００２３】
上記のＤＮＡを調製するために、当業者によく知られた方法としては、ハイブリダイゼーション技術（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，　ＥＭ．，　Ｊ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ，　１９７５，　９８，　５０３．）やポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術（Ｓａｉｋｉ，　ＲＫ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｓｃｉｅｎｃｅ，　１９８５，　２３０，　１３５０．、Ｓａｉｋｉ，　ＲＫ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｓｃｉｅｎｃｅ，　１９８８，　２３９，　４８７．）の他に、例えば、該ＤＮＡに対し、ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ法（Ｋｒａｍｅｒ，　Ｗ．　＆　Ｆｒｉｔｚ，　ＨＪ．，　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ，　１９８７，　１５４，　３５０．）により変異を導入する方法が挙げられる。また、自然界においても、塩基配列の変異によりコードするタンパク質のアミノ酸配列が変異することは起こり得ることである。また、塩基配列が変異していても、その変異がタンパク質中のアミノ酸の変異を伴わない場合（縮重変異）があり、このような縮重変異ＤＮＡも本発明に含まれる。
【００２４】
本発明のＤＮＡには、天然あるいは単離・精製されたゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、および化学合成ＤＮＡが含まれる。ゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡの調製は、当業者にとって常套手段を利用して行うことが可能である。ゲノムＤＮＡは、例えば、配列番号：２から２８のいずれかの偶数番号に記載のタンパク質をコードする遺伝子を有する生物からゲノムＤＮＡを抽出し、ゲノミックライブラリー（ベクターとしては、プラスミド、ファージ、コスミド、ＢＡＣ、ＰＡＣ等が利用できる）を作成し、これを展開して、該タンパク質をコードするＤＮＡを基に調製したプローブを用いてコロニーハイブリダイゼーションあるいはプラークハイブリダイゼーションを行うことにより調製することが可能である。また、配列番号：２から２８のいずれかの偶数番号に記載のタンパク質をコードするＤＮＡに特異的なプライマーを作成し、これを利用したＰＣＲを行うことによって調製することも可能である。また、ｃＤＮＡは、例えば、該タンパク質をコードする遺伝子を有する生物から抽出したｍＲＮＡを基にｃＤＮＡを合成し、これをλＺＡＰ等のベクターに挿入してｃＤＮＡライブラリーを作成し、これを展開して、上記と同様にコロニーハイブリダイゼーションあるいはプラークハイブリダイゼーションを行うことにより、また、ＰＣＲを行うことにより調製することが可能である。このように、ハイブリダイゼーション技術やＰＣＲ技術によって単離し得る、配列番号：１から２７のいずれかの奇数番号に記載の塩基配列からなるＤＮＡとハイブリダイズするＤＮＡもまた、本発明のＤＮＡに含まれる。
【００２５】
このようなＤＮＡを単離するためには、好ましくはストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーション反応を行う。本発明においてストリンジェントなハイブリダイゼーション条件とは、６Ｍ　尿素、０．４％　ＳＤＳ、０．５×ＳＳＣの条件またはこれと同等のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件を指す。よりストリンジェンシーの高い条件、例えば、６Ｍ　尿素、０．４％　ＳＤＳ、０．１×ＳＳＣの条件下では、より相同性の高いＤＮＡを単離できることが期待される。こうして単離されたＤＮＡは、アミノ酸レベルにおいて、列番号：２から２８のいずれかの偶数番号に記載のアミノ酸配列と高い相同性を有すると考えられる。高い相同性とは、アミノ酸配列全体で少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の配列の同一性を指す。
【００２６】
アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、カーリンおよびアルチュールによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｅｉ．　ＵＳＡ，　１９９０，　８７，　２２６４−２２６８．、Ｋａｒｌｉｎ，Ｓ．　＆　Ａｌｔｓｃｈｕｌ，　ＳＦ．，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｅｉ．　ＵＳＡ，　１９９３，　９０，　５８７３．）を用いて決定できる。ＢＬＡＳＴのアルゴリズムに基づいたＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸと呼ばれるプログラムが開発されている（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，　ＳＦ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ，　１９９０，　２１５，　４０３．）。ＢＬＡＳＴＮを用いて塩基配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばｓｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２とする。また、ＢＬＡＳＴＸを用いてアミノ酸配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ　ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）。
【００２７】
また本発明は、本発明のＤＮＡの転写産物と相補的なアンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡ、および本発明のＤＮＡの転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有するＲＮＡをコードするＤＮＡを提供する。
【００２８】
本発明の好ましい態様においては、上記ＤＮＡを用いて、例えば、本発明のＤＮＡの発現が抑制されたイネ白葉枯病抵抗性植物の作出を行うことができる。
【００２９】
本発明のＤＮＡの発現が抑制された形質転換植物体を作製する場合には、本発明のＤＮＡの発現を抑制するためのＤＮＡを適当なベクターに挿入して、これを植物細胞に導入し、これにより得られた形質転換植物細胞を再生させる。「本発明のＤＮＡの発現抑制」には、遺伝子の転写の抑制、および／またはタンパク質への翻訳の抑制が含まれる。また、ＤＮＡの発現の完全な停止のみならず発現の減少も含まれる。
【００３０】
植物における特定の遺伝子の発現を抑制する方法としては、アンチセンス技術を利用する方法が当業者に最もよく利用されている。植物細胞におけるアンチセンス効果は、電気穿孔法で導入したアンチセンスＲＮＡが植物においてアンチセンス効果を発揮することをエッカーらが示したことで初めて実証された（Ｅｃｋｅｒ　ＪＲ＆　Ｄａｖｉｓ　ＲＷ：　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　８３：　５３７２，　１９８６）。その後、タバコやペチュニアにおいてもアンチセンスＲＮＡの発現により標的遺伝子の発現が低下した例が報告されており（ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｋｒｏｌ　ＡＲ，　ｅｔ　ａｌ：　Ｎａｔｕｒｅ　３３３：　８６６，　１９８８）、現在では、アンチセンス技術は植物における遺伝子発現を抑制させる手段として確立している。
【００３１】
アンチセンス核酸が標的遺伝子の発現を抑制する作用としては、以下のような複数の要因が存在する。すなわち、三重鎖形成による転写開始阻害、ＲＮＡポリメラーゼによって局部的に開状ループ構造が作られた部位とのハイブリッド形成による転写阻害、合成の進みつつあるＲＮＡとのハイブリッド形成による転写阻害、イントロンとエクソンとの接合点におけるハイブリッド形成によるスプライシング阻害、スプライソソーム形成部位とのハイブリッド形成によるスプライシング阻害、ｍＲＮＡとのハイブリッド形成による核から細胞質への移行阻害、キャッピング部位やポリ（Ａ）付加部位とのハイブリッド形成によるスプライシング阻害、翻訳開始因子結合部位とのハイブリッド形成による翻訳開始阻害、開始コドン近傍のリボソーム結合部位とのハイブリッド形成による翻訳阻害、ｍＲＮＡの翻訳領域やポリソーム結合部位とのハイブリッド形成によるペプチド鎖の伸長阻害、および核酸とタンパク質との相互作用部位とのハイブリッド形成による遺伝子発現阻害などである。このようにアンチセンス核酸は、転写、スプライシングまたは翻訳など様々な過程を阻害することで、標的遺伝子の発現を抑制する（平島および井上：　新生化学実験講座２　核酸ＩＶ　遺伝子の複製と発現（日本生化学会編，　東京化学同人）ｐｐ．３１９−３４７，　１９９３）。
【００３２】
本発明で用いられるアンチセンス配列は、上記のいずれの作用により標的遺伝子の発現を抑制してもよい。一つの態様としては、遺伝子のｍＲＮＡの５’端近傍の非翻訳領域に相補的なアンチセンス配列を設計すれば、遺伝子の翻訳阻害に効果的と考えられる。また、コード領域もしくは３’側の非翻訳領域に相補的な配列も使用することができる。このように、遺伝子の翻訳領域だけでなく非翻訳領域の配列のアンチセンス配列を含むＤＮＡも、本発明で利用されるアンチセンスＤＮＡに含まれる。使用されるアンチセンスＤＮＡは、適当なプロモーターの下流に連結され、好ましくは３’側に転写終結シグナルを含む配列が連結される。このようにして調製されたＤＮＡは、公知の方法を用いることで、所望の植物へ形質転換できる。アンチセンスＤＮＡの配列は、本発明のイネ白葉枯病の病原遺伝子またはその一部と相補的な配列であることが好ましいが、遺伝子の発現を有効に抑制できる限りにおいて、完全に相補的でなくてもよい。転写されたＲＮＡは、標的遺伝子の転写産物に対して好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相補性を有する。アンチセンス配列を用いて標的遺伝子の発現を効果的に抑制するには、アンチセンスＤＮＡの長さは少なくとも１５塩基以上であり、好ましくは１００塩基以上であり、さらに好ましくは５００塩基以上である。通常用いられるアンチセンスＤＮＡの長さは５ｋｂよりも短く、好ましくは２．５ｋｂよりも短い。
【００３３】
遺伝子の発現の抑制は、また、リボザイムをコードするＤＮＡを利用して行うことも可能である。リボザイムとは触媒活性を有するＲＮＡ分子のことを指す。リボザイムには種々の活性を有するものが存在するが、中でもＲＮＡを切断する酵素としてのリボザイムに焦点を当てた研究により、ＲＮＡを部位特異的に切断するリボザイムの設計が可能となった。リボザイムには、グループＩイントロン型やＲＮａｓｅＰに含まれるＭ１　ＲＮＡのように４００ヌクレオチド以上の大きさのものもあるが、ハンマーヘッド型やヘアピン型と呼ばれる４０ヌクレオチド程度の活性ドメインを有するものもある（小泉誠および大塚栄子：　蛋白質核酸酵素，　３５：　２１９１，　１９９０）。
【００３４】
例えば、ハンマーヘッド型リボザイムの自己切断ドメインは、Ｇ１３Ｕ１４Ｃ１５という配列のＣ１５の３’側を切断するが、その活性にはＵ１４とＡ９との塩基対形成が重要とされ、Ｃ１５の代わりにＡ１５またはＵ１５でも切断され得ることが示されている（Ｋｏｉｚｕｍｉ　Ｍ，　ｅｔ　ａｌ：　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ　２２８：　２２８，　１９８８）。基質結合部位が標的部位近傍のＲＮＡ配列と相補的なリボザイムを設計すれば、標的ＲＮＡ中のＵＣ、ＵＵまたはＵＡという配列を認識する制限酵素的なＲＮＡ切断リボザイムを作出することができる（ＫｏｉｚｕｍｉＭ，　ｅｔ　ａｌ：　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ　２３９：　２８５，　１９８８、小泉誠および大塚栄子：　蛋白質核酸酵素　３５：　２１９１，　１９９０、　Ｋｏｉｚｕｍｉ　Ｍ，　ｅｔ　ａｌ：　Ｎｕｃｌ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ　１７：　７０５９，　１９８９）。
例えば、イネ白葉枯病の病原遺伝子のＤＮＡ（配列番号：１から２７のいずれかの奇数番号に記載）中には、標的となり得る部位が複数存在するものと推定される。
【００３５】
また、ヘアピン型リボザイムも本発明の目的に有用である。このリボザイムは、例えばタバコリングスポットウイルスのサテライトＲＮＡのマイナス鎖に見出される（Ｂｕｚａｙａｎ　ＪＭ：　Ｎａｔｕｒｅ　３２３：　３４９，　１９８６）。ヘアピン型リボザイムからも、標的特異的なＲＮＡ切断リボザイムを作出できることが示されている（Ｋｉｋｕｃｈｉ　Ｙ　＆　Ｓａｓａｋｉ　Ｎ：　Ｎｕｃｌ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ　１９：　６７５１，　１９９１、菊池洋：　化学と生物　３０：　１１２，　１９９２）。
【００３６】
標的を切断できるように設計されたリボザイムは、植物細胞中で転写されるように、カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーターなどのプロモーターおよび転写終結配列に連結される。このとき、転写されたＲＮＡの５’端や３’端に余分な配列が付加されていると、リボザイムの活性が失われることがあるが、こういった場合は、転写されたリボザイムを含むＲＮＡからリボザイム部分だけを正確に切り出すために、リボザイム部分の５’側や３’側にシスに働く別のトリミングリボザイムを配置させることも可能である（Ｔａｉｒａ　Ｋ，　ｅｔ　ａｌ：　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｎｇ　３：　７３３，　１９９０、Ｄｚｉａｎｏｔｔ　ＡＭ　＆　Ｂｕｊａｒｓｋｉ　ＪＪ：　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　８６：　４８２３，　１９８９、Ｇｒｏｓｓｈａｎｓ　ＣＡ　＆　Ｃｅｃｈ　ＴＲ：　Ｎｕｃｌ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ　１９：　３８７５，　１９９１、Ｔａｉｒａ　Ｋ，　ｅｔ　ａｌ：　Ｎｕｃｌ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ　１９：　５１２５，　１９９１）。また、このような構成単位をタンデムに並べ、標的遺伝子内の複数の部位を切断できるようにすることで、より効果を高めることもできる（Ｙｕｙａｍａ　Ｎ，　ｅｔ　ａｌ：　Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ｒｅｓ　Ｃｏｍｍｕｎ　１８６：　１２７１，１９９２）。このように、リボザイムを用いて本発明における標的遺伝子の転写産物を特異的に切断することで、該遺伝子の発現を抑制することができる。
【００３７】
また、本発明のＤＮＡを植物体に導入することによって、植物側に常時抵抗性を誘導させることも有効である。
【００３８】
本発明のＤＮＡは、例えば、組み換えタンパク質の調製に利用することが可能である。
【００３９】
組み換えタンパク質を調製する場合には、通常、本発明のＤＮＡを適当な発現ベクターに挿入し、該ベクターを適当な細胞に導入し、形質転換細胞を培養して発現させたタンパク質を精製する。組み換えタンパク質は、精製を容易にするなどの目的で、他のタンパク質との融合タンパク質として発現させることも可能である。例えば、大腸菌を宿主としてマルトース結合タンパク質との融合タンパク質として調製する方法（米国Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　ＢｉｏＬａｂｓ社発売のベクターｐＭＡＬシリーズ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として調製する方法（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ社発売のベクターｐＧＥＸシリーズ）、ヒスチジンタグを付加して調製する方法（Ｎｏｖａｇｅｎ社のｐＥＴシリーズ）などを利用することが可能である。宿主細胞としては、組み換えタンパク質の発現に適した細胞であれば特に制限はなく、上記の大腸菌の他、発現ベクターを変えることにより、例えば、酵母、種々の動植物細胞、昆虫細胞などを用いることが可能である。宿主細胞へのベクターの導入には、当業者に公知の種々の方法を用いることが可能である。例えば、大腸菌への導入には、カルシウムイオンを利用した導入方法（Ｍａｎｄｅｌ，　Ｍ．　＆　Ｈｉｇａ，　Ａ．，　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　１９７０，　５３，　１５８−１６２．、Ｈａｎａｈａｎ，　Ｄ．，　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　１９８３，　１６６，　５５７−５８０．）を用いることができる。宿主細胞内で発現させた組み換えタンパク質は、該宿主細胞またはその培養上清から、当業者に公知の方法により精製し、回収することができる。組み換えタンパク質を上記したマルトース結合タンパク質などとの融合タンパク質として発現させた場合には、容易にアフィニティー精製を行うことが可能である。このようにして作製される本発明のＤＮＡによってコードされるタンパク質もまた、本発明に含まれる。
【００４０】
得られた組み換えタンパク質を用いることにより、これに結合する抗体を調製することも可能である。該抗体は、後述のイネ白葉枯病菌に感染しているか否かを診断する方法に使用することができる。
【００４１】
ポリクローナル抗体は、例えば、精製した本発明のタンパク質若しくはその一部のペプチドをウサギなどの免疫動物に免疫し、一定期間の後に血液を採取し、血ぺいを除去した血清より調製することが可能である。また、モノクローナル抗体は、上記タンパク質もしくはペプチドで免疫した動物の抗体産生細胞と骨腫瘍細胞とを融合させ、目的とする抗体を産生する単一クローンの細胞（ハイブリドーマ）を単離し、該細胞から抗体を得ることにより調製することができる。これにより得られた抗体は、本発明のタンパク質の精製や検出などに利用することが可能である。本発明の抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、およびこれら抗体の断片が含まれる。
【００４２】
また本発明は、上記ＤＮＡを含むベクター、該ベクターを保持する形質転換細胞、植物細胞である形質転換細胞、該形質転換細胞を含む形質転換植物体、該形質転換植物体の子孫またはクローンである形質転換植物体、および該形質転換植物体の繁殖材料を提供する。
【００４３】
本発明のＤＮＡまたは核酸の植物細胞への導入は、当業者においては、公知の方法、例えばアグロバクテリウム法、電気穿孔法（エレクトロポーレーション法）、パーティクルガン法により実施することができる。
【００４４】
上記アグロバクテリウム法を用いる場合、例えばＮａｇｅｌらの方法（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　Ｌｅｔｔ．，　１９９０，　６７，　３２５．）が用いられる。この方法によれば、組み換えベクターをアグロバクテリウム細菌中に形質転換して、次いで形質転換されたアグロバクテリウムを、リーフディスク法等の公知の方法により植物細胞に導入する。上記ベクターは、例えば植物体に導入した後、本発明のＤＮＡが植物体中で発現するように、発現プロモーターを含む。一般に、該プロモーターの下流には本発明のＤＮＡが位置し、さらに該ＤＮＡの下流にはターミネーターが位置する。この目的に用いられる組み換えベクターは、植物への導入方法、または植物の種類に応じて、当業者によって適宜選択される。上記プロモーターとして、例えばカリフラワーモザイクウイルス由来のＣａＭＶ３５Ｓ、トウモロコシのユビキチンプロモーター（特開平２−７９９８３号公報）等を挙げることができる。
【００４５】
また、上記ターミネーターは、カリフラワーモザイクウイルス由来のターミネーター、あるいはノパリン合成酵素遺伝子由来のターミネーター等を例示することができるが、植物体中で機能するプロモーターやターミネーターであれば、これらに限定されない。
【００４６】
また、本発明のＤＮＡまたは核酸を導入する植物は、外植片であってもよく、これらの植物から培養細胞を調製し、得られた培養細胞に導入してもよい。本発明の「植物細胞」は、例えば葉、根、茎、花および種子中の胚盤等の植物細胞、カルス、懸濁培養細胞等が挙げられる。
【００４７】
また、本発明のＤＮＡまたは核酸の導入により形質転換した植物細胞を効率的に選択するために、上記組み換えベクターは、適当な選抜マーカー遺伝子を含む、もしくは選抜マーカー遺伝子を含むプラスミドベクターと共に植物細胞へ導入するのが好ましい。この目的に使用する選抜マーカー遺伝子は、例えば抗生物質ハイグロマイシンに耐性であるハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、カナマイシンまたはゲンタマイシンに耐性であるネオマイシンホスホトランスフェラーゼ、および除草剤ホスフィノスリシンに耐性であるアセチルトランスフェラーゼ遺伝子等が挙げられる。
【００４８】
組み換えベクターを導入した植物細胞は、導入された選抜マーカー遺伝子の種類に従って適当な選抜用薬剤を含む公知の選抜用培地に置床し培養する。これにより形質転換された植物培養細胞を得ることができる。
【００４９】
次いで、本発明のＤＮＡまたは核酸を導入した形質転換細胞から植物体を再生する。植物体の再生は植物細胞の種類に応じて当業者に公知の方法で行うことが可能である（Ｔｏｋｉ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ，　１９９５，　１００，　１５０３−１５０７．）。例えばイネにおいては、形質転換植物体を作出する手法については、ポリエチレングリコールによりプロトプラストへ遺伝子導入し、植物体（インド型イネ品種が適している）を再生させる方法（Ｄａｔｔａ，　Ｓ　Ｋ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｉｎ　Ｇｅｎｅ　Ｔｒａｎｓｆｅｒ　Ｔｏ　Ｐｌａｎｔｓ　（Ｐｏｔｒｙｋｕｓ　Ｉ　ａｎｄ　Ｓｐａｎｇｅｎｂｅｒｇ　Ｅｄｓ．），　１９９５，　６６−７４．）、電気パルスによりプロトプラストへ遺伝子導入し、植物体（日本型イネ品種が適している）を再生させる方法（Ｔｏｋｉ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ，　１９９２，　１００，　１５０３−１５０７．）、パーティクルガン法により細胞へ遺伝子を直接導入し、植物体を再生させる方法（Ｃｈｒｉｓｔｏｕ，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，　１９９１，　９，　９５７−９６２．）およびアグロバクテリウムを介して遺伝子を導入し、植物体を再生させる方法（Ｈｉｅｉ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｐｌａｎｔ　Ｊ，　１９９４，６，　２７１−２８２．）等、いくつかの技術が既に確立し、本願発明の技術分野において広く用いられている。本発明においては、これらの方法を好適に用いることができる。
【００５０】
形質転換細胞から再生させた植物体は、次いで順化用培地で培養する。その後、順化した再生植物体を、通常の栽培条件で栽培すると、植物体が得られ、成熟して結実して種子を得ることができる。
【００５１】
なお、このように再生され、かつ栽培した形質転換植物体中の導入された外来ＤＮＡまたは核酸の存在は、公知のＰＣＲ法やサザンハイブリダイゼーション法によって、または植物体中の核酸の塩基配列を解析することによって確認することができる。この場合、形質転換植物体からのＤＮＡまたは核酸の抽出は、公知のＪ．Ｓａｍｂｒｏｏｋらの方法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，　第２版，　Ｃｏｌｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，　１９８９）に準じて実施することができる。
【００５２】
再生させた植物体中に存在する本発明のＤＮＡよりなる外来遺伝子を、ＰＣＲ法を用いて解析する場合には、上記のように再生植物体から抽出した核酸を鋳型として増幅反応を行う。また、本発明の核酸がＤＮＡである場合には、該ＤＮＡの塩基配列に従って適当に選択された塩基配列をもつ合成したオリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、これらを混合させた反応液中おいて増幅反応を行うこともできる。増幅反応においては、ＤＮＡの変性、アニーリング、伸張反応を数十回繰り返すと、本発明のＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片の増幅生成物を得ることができる。増幅生成物を含む反応液を、例えばアガロース電気泳動にかけると、増幅された各種のＤＮＡ断片が分画されて、そのＤＮＡ断片が本発明のＤＮＡに対応することを確認することが可能である。
【００５３】
一旦、染色体内に本発明のＤＮＡが導入された形質転換植物体が得られれば、該植物体から有性生殖または無性生殖により子孫を得ることが可能である。また、該植物体やその子孫あるいはクローンから繁殖材料（例えば種子、果実、切穂、塊茎、塊根、株、カルス、プロトプラスト等）を得て、それらを基に該植物体を量産することも可能である。
【００５４】
また、本発明は、配列番号：１から２７のいずれかの奇数番号に記載の塩基配列若しくはその相補配列における少なくとも１５の連続する塩基配列を含むオリゴヌクレオチドを提供する。ここで「相補配列」とは、Ａ：Ｔ、Ｇ：Ｃの塩基対からなる２本鎖ＤＮＡの一方の鎖に対する他方の配列を指す。また、少なくとも１５個の連続したヌクレオチド領域で完全に相補配列である場合に限られず、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは９０％、さらに好ましくは９５％以上の塩基配列の同一性を有すればよい。このようなＤＮＡは、本発明のＤＮＡの検出や単離を行うためのプローブとして、また、増幅を行うためのプライマーとして有用である。
【００５５】
さらに、本発明は、配列番号：１から２７のいずれかの奇数番号に記載の塩基配列からなるＤＮＡと特異的にハイブリダイズし、少なくとも１５塩基の鎖長を有するオリゴヌクレオチドを提供する。該オリゴヌクレオチドは、本発明のＤＮＡに特異的にハイブリダイズするものである。ここで「特異的にハイブリダイズする」とは、通常のハイブリダイゼーション条件下、好ましくはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下（例えば、サムブルックら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｕｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ，第２版１９８９に記載の条件）において、他のタンパク質をコードするＤＮＡとクロスハイブリダイゼーションを有意に生じないことを意味する。特異的なハイブリダイズが可能であれば、該オリゴヌクレオチドは、本発明のＤＮＡに対し、完全に相補的である必要はない。
【００５６】
本発明のＤＮＡにハイブリダイズし、少なくとも１５ヌクレオチドの鎖長を有するオリゴヌクレオチドは、本発明のＤＮＡを検出するためのプローブやプライマーとして用いることができる。該オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いる場合、その長さは、通常１５ｂｐ〜１００ｂｐであり、好ましくは１７ｂｐ〜３０ｂｐである。プライマーは、本発明のＤＮＡの少なくとも一部を増幅しうるものであれば、特に制限されない。
【００５７】
また、上記オリゴヌクレオチドをプローブとして使用する場合、該プローブは、本発明のＤＮＡに特異的にハイブリダイズするものであれば、特に制限されない。該プローブは、合成オリゴヌクレオチドであってもよく、通常少なくとも１５ｂｐ以上の鎖長を有する。
【００５８】
本発明のオリゴヌクレオチドをプローブとして用いる場合は、適宜標識して用いることが好ましい。標識する方法としては、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて、オリゴヌクレオチドの５’端を^３２Ｐでリン酸化することにより標識する方法、およびクレノウ酵素等のＤＮＡポリメラーゼを用い、ランダムヘキサマーオリゴヌクレオチド等をプライマーとして^３２Ｐ等のアイソトープ、蛍光色素、またはビオチン等によって標識された基質塩基を取り込ませる方法（ランダムプライム法等）を例示することができる。
【００５９】
さらに本発明は、イネがイネ白葉枯病菌に感染しているか否かを診断する方法を提供する。
【００６０】
本発明の上記診断方法においては、まず、（ａ）イネ植物体若しくはその一部から核酸試料を調製する。次いで、（ｂ）該核酸試料における本発明のＤＮＡまたはその発現産物の存在を検出する。（ｂ）において、発現産物が検出された場合は、診断対象であるイネがイネ白葉枯病菌に感染していると判定される。なお、上記「その一部」とは、例えば、植物体組織、細胞、または細胞抽出液等を指す。
【００６１】
本発明の診断方法の一つの態様は、プライマーあるいはプローブを利用してイネ白葉枯病菌タンパク質をコードするＤＮＡを検出する。このようなプローブやプライマーとしては、本発明の上記オリゴヌクレオチドを用いることができる。
【００６２】
本発明者らは実際に、本発明の遺伝子にハイブリダイズし、該遺伝子を増幅可能なＰＣＲプライマーセットを用いて、被検イネについてイネ白葉枯病菌を特異的に検出することに成功した。従って、本発明の上記オリゴヌクレオチドは、本発明の診断方法に好適に使用することが可能である。本発明の上記診断方法に用いられるオリゴヌクレオチドの一例としては、後述の実施例５に記載のプライマーセットを示すことができるが、これに限定されない。当業者においては、配列番号：１から２８のいずれかの奇数番号に記載の塩基配列を基に、適宜、本発明のＤＮＡを増幅可能なプライマーセットを設計することが可能である。同様に、配列番号：１から２８のいずれかの奇数番号に記載の塩基配列を基に、本発明のＤＮＡを検出可能なプローブを設計することは、当業者においては容易に実施することが可能である。プライマーやプローブは必要に応じて標識されていてもよい。標識としては、例えば、放射標識が挙げられる。本発明の診断方法に使用可能なプライマーまたはプローブも、本発明に包含される。
【００６３】
本発明の上記診断方法は、例えば、イネ白葉枯病菌に感染したことが疑われるイネ植物体若しくはその一部から核酸試料を調製し、上記のプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法、あるいは上記のプローブを利用したノーザンブロッティング法等により実施することができる。
【００６４】
本発明の診断方法の他の一つの態様は、抗体を利用し、被検イネについて本発明のイネ白葉枯病の病原遺伝子によってコードされるタンパク質の有無を指標として診断する方法である。この診断に用いる抗体は、例えば、上述のようにして調製することができる。抗体は、必要に応じて標識されていてもよい。標識としては、例えば、酵素標識が挙げられる。また、抗体自体を直接標識しなくとも、抗体に結合する物質、例えば、プロテインＡなどを介して標識して、目的のタンパク質を検出してもよい。この診断においては、例えば、イネ白葉枯病菌に感染したことが疑われるイネ植物体若しくはその一部から被検試料を調製し、上記の抗体を用いてＥＬＩＳＡ法あるいはウエスタンブロット法により実施することができる。
【００６５】
【実施例】
以下、本発明を実施例により、さらに具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
【００６６】
〔実施例１〕　ＢＡＣライブラリー作製
ＢＡＣ（ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）は、大きなＤＮＡ断片を安定に取り扱える点、またキメラＤＮＡの生成が少ない点から、数少ないクローンでゲノム全体を網羅することができ、ゲノム解析を行うに当たり有効なツールの一つである。そこで、本発明者らは平均挿入断片長約１００から１２０ｋｂで、約１６ゲノム分のＢＡＣライブラリーを作製した（Ｏｃｈｉａｉ，　Ｈ．，　Ｉｎｏｕｅ，　Ｙ．，　Ｈａｓｅｂｅ，　Ａ．　ａｎｄ　Ｋａｋｕ，　Ｈ．　（２００１）．　Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ　ｏｒｙｚａｅ　ｐｖ．　ｏｒｙｚａｅｂａｃｔｅｒｉａｌ　ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ　ｌｉｂｒａｒｙ．　ＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　Ｌｅｔｔ．　２００：５９−６５）。
【００６７】
〔実施例２〕　ｈｒｐ遺伝子クラスター及び周辺領域の解析
植物病原細菌が植物に病気を引き起こすには、宿主認識／感染成立と発病因子放出／発病という大きく２つの過程が考えられる。ｈｒｐ遺伝子クラスターに含まれる遺伝子群は、このうちの宿主認識／感染成立といった過程において重要な役割を果たす病原性因子分泌機構（ｔｙｐｅＩＩＩ）の構成分子をコードするのみでなく、いくつかの病原性因子をもコードしており、植物病原細菌において最も重要な病原性遺伝子群であることが知られている（Ｂｏｎａｓ，　Ｕ．，　Ｓｃｈｕｌｔｅ，　Ｒ．，　Ｆｅｎｓｅｌａｕ，　Ｓ．，　Ｍｉｎｓａｖａｇｅ，　Ｇ．Ｖ．，　Ｓｔａｓｋａｗｉｃｚ，　Ｂ．Ｊ．，　ａｎｄ　Ｓｔａｌｌ，　Ｒ．Ｅ．　（１９９１）．　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ｇｅｎｅ　ｃｌｕｓｔｅｒ　ｆｒｏｍ　Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ　ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ　ｐｖ．　ｖｅｓｉｃａｔｏｒｉａ　ｔｈａｔ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｓ　ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｔｙ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｅ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｏｎ　ｐｅｐｐｅｒ　ａｎｄ　ｔｏｍａｔｏ．Ｍｏｌ．　Ｐｌａｎｔ−Ｍｉｃｒｏｂｅ　Ｉｎｔｅｒａｃｔ．　４：８１−８８）。
【００６８】
そこで、ＰＣＲスクリーニングで単離したｈｒｐ遺伝子クラスターを有するＢＡＣクローンの塩基配列をショットガン法で決定した。決定した領域はｈｒｐ遺伝子クラスター約３０　ｋｂを含めた約２２０　ｋｂである。この領域における遺伝子予測の結果を図１に示した。Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ属で既知のｈｒｐ遺伝子クラスターを構成する２４遺伝子すべてを含め、合計１７１遺伝子の存在を予測した。
【００６９】
この領域で特徴的なことは、トランスポゼースのホモログ（挿入配列：ＩＳ）がｈｒｐクラスターの内部をはじめ、複数の領域で且つタンデムに挿入されていた点である。予測した遺伝子数１７１に対して、約２割に当たる３６個のトランスポゼースホモログを見出した。また、いくつかのトランスポーターに関連する遺伝子や、グルカン関係の遺伝子クラスターを見出した。一方、予測した遺伝子をｂｌａｓｔ検索した結果、現時点で他に生物と有意な相同性が認められない１４個のイネ白葉枯病菌固有と考えられる遺伝子を発見した。該遺伝子の塩基配列を配列番号：１から２７の奇数番号に、それぞれの塩基配列から予測されるアミノ酸配列をそれぞれ配列番号２から２８の偶数番号に記載する。
【００７０】
〔実施例３〕　ＰＣＲによるイネ白葉枯病菌の特異的検出
イネ白葉枯病菌及びイネ白葉枯病菌と同じ属である各種Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ属細菌のＤＮＡを鋳型に図２Ａに示したプライマーセットを用いたＰＣＲ反応を下記の条件下で行った。ＰＣＲプライマーセットは、配列番号：１９及び２１からそれぞれセンス及びアンチセンスの２０オリゴヌクレオチドのプライマーセットを作製した（図２）。
【００７１】
配列番号：１９におけるＰＣＲプライマー
センスプライマー：５’−ＡＴＧＡＴＣＴＴＧＧＡＡＴＣＧＣＡＣＡＡ（配列番号：２９）
アンチセンスプライマー：５’−ＴＣＡＴＧＡＴＧＣＣＡＣＣＴＣＣＴＧＣＧ（配列番号：３０）
配列番号：２１におけるＰＣＲプライマー
センスプライマー：５’−ＡＴＧＡＡＡＣＴＣＴＣＣＧＧＣＧＧＴＡＴ（配列番号：３１）
アンチセンスプライマー：５’−ＴＣＡＴＧＣＴＣＧＣＣＣＧＣＴＴＴＧＣＣ（配列番号：３２）
【００７２】
ＰＣＲ反応条件は、初期変性９４℃で２分後、変性９４℃１５秒、アニーリング５５℃３０秒、伸長反応７２℃２分のサイクルを３０回行った後、最終伸長反応７２℃７分間を行った。
【００７３】
ＰＣＲ増幅産物は、１％のアガロースグル電気泳動によって行い、エチディウムプロマイド染色後検出した。その結果、イネ白葉枯病菌ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ増幅産物をのせたレーンＡ１３、Ａ１６、Ｂ１５、Ｂ１６及びＣ１５のみに検出された（図３）。
【００７４】
〔実施例４〕　Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ属細菌間におけるゲノム比較解析
２００２年５月、カンキツかいよう病菌（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ　ａｘｏｎｏｐｏｄｉｓ　ｐｖ．　ｃｉｔｒｉ）とキャベツ黒腐病菌（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ　ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ　ｐｖ．　ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）の比較ゲノム解析がブラジルの研究グループによって報告された（ｄａ　Ｓｉｌｖａ，　Ａ．Ｃ．Ｒ．　ｅｔ　ａｌ．　（２００２）．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｇｅｎｏｍｅｓ　ｏｆ　ｔｗｏ　Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ　ｐａｔｈｏｇｅｎｓ　ｗｉｔｈ　ｄｉｆｆｅｒｉｎｇ　ｈｏｓｔ　ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ．　Ｎａｔｕｒｅ　４１７：４５９−４６３）。いくつかの領域においてゲノムの再編成が認められたが、全体として相同性は高いことが明らかとなった。しかしながら、それぞれのゲノム上には１５から１８％（６５０から８００）の遺伝子が互いに存在しない種固有のものであることも明らかにされている。そこで、イネ白葉枯病菌で得られたゲノム情報とゲノミックサザン解析による３菌種間の比較を行った。
【００７５】
最初に、ｈｒｐ遺伝子クラスターにおけるゲノム構造比較を行った結果、各々の遺伝子間の相同性には若干の相違はあるが、ｈｐａＢ−ｈｒｐＦ領域以外は同じであった（図４）。ｈｐａＢ−ｈｒｐＦ領域に特徴的な点として、イネ白葉枯病菌には、４つのトランスポゼースのホモログが挿入され、長さもほぼ２倍であるのに対して、カンキツかいよう病菌とキャベツ黒腐病菌には認められなかった。また、キャベツ黒腐病菌には、ｈｐａＢの下流にｈｒｐＷが存在するが、他の２菌種には見出されなかった。さらに、キャベツ黒腐病菌では、ｈｒｐＦの下流に存在するｈｐａＦが欠失し、しかもｈｒｐＦの転写方向も逆であった。
【００７６】
【発明の効果】
本発明によって同定されたイネ白葉枯病菌の病原遺伝子は、既知の塩基配列及びアミノ酸配列と有意な相同性を持たないことから、同塩基配列を利用した特異的プローブ、またはＰＣＲプライマーセットを作製してＰＣＲによるイネ白葉枯病菌の簡易検出用としての利用が可能である。
【００７７】
また、この遺伝子を植物体に導入することによって新しい耐病性植物体の育成が期待される。
【００７８】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】ｈｒｐ及び周辺領域の遺伝子マップを示す図である。
【図２】ＰＣＲプライマーセット作成に用いた配列番号：１９および配列番号：２１の配列を表わす。配列を黒枠で示した部分は、各プライマーの配列を示す。
Ａ：配列番号：１９におけるＰＣＲプライマー、Ｂ：配列番号：２１におけるＰＣＲプライマー。
【図３】配列番号：１９の塩基配列を基に設計したプライマーセットによる各種Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ属細菌のＰＣＲ検出の結果を表わす写真である。各レーンの細菌名を写真の下に表わす。
【図４】Ｘ．ｏｒｙｚａｅ　ｐｖ．ｏｒｙｚａｅ、Ｘ．ａｘｏｎｏｐｏｄｉｓ　ｐｖ．ｃｉｔｒｉ、およびＸ．ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ　ｐｖ．ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ間におけるｈｐａＢ−ｈｒｐＦ領域の構造を比較した図である。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to crop disease diagnosis and crop breeding.
[0002]
[Prior art]
Haemophilus influenzae (Fleischmann, RD et al. (1995). Whole-genome random sequencing and assembly of the Haemophilus influenzae. The whole genome sequences of Escherichia coli and Bacillus subtilis, and the whole genome sequences of various bacteria including animal pathogenic bacteria have been reported. Bacteria have a genome size much smaller than animals and plants, and their genome size is about 1/10 or less than that of filamentous fungi, which is the same microorganism. Genome analysis is progressing.
[0003]
Genome analysis analyzes all genes present on the genome by revealing the genome that is the source of genetic information at the nucleotide sequence level, and understands the entire life phenomenon such as networks and interactions between genes. It is expected to bring valuable information on the above, and it is actively performed worldwide with a wide variety of living things. In particular, in the field of animal pathogenic bacteria, various research developments and applications such as genomic drug discovery are expected based on elucidation of the pathogenic mechanism of infection and disease in humans and the knowledge obtained therefrom. Currently, tuberculosis bacteria (Cole, ST et al., (1998) Deciphering the biology of Mycobacterium tuberculosis from the complete genome sequence, Nature et al., 1993, H. E. coli, et al. Genome sequence of Enterohemorrrhagic Escherichia coli O157: H7 and genomic comparison with all Many strains, such as the laboratory strain K-12, DNA Research 8: 11-22), have revealed the entire genome sequence.
[0004]
On the other hand, in the field of plant pathogenic bacteria, an emergency meeting on genomic analysis was held at the 7th International Society for Plant Pathology in 1998, and discussions were held on future developments. For plant pathogenic bacteria, there is great expectation for genome analysis from the same viewpoint as animal pathogenic bacteria, and it is being recognized as an important research direction in the future. At that time, in the genome analysis of plant pathogenic bacteria, the group in Brazil was leading the way, and the analysis of Xylella fastidiosa was in progress, and the group in France is planning to analyze Ralstonia solanacearum. In Japan, it has been proposed to perform a genome analysis on rice blight fungus as a candidate, and it is almost completed at present.
[0005]
BACKGROUND ART Bacterial leaf blight of rice is a globally important rice disease that occurs not only in Japan but also in rice cultivation areas in Asia, Africa, Australia, Latin America and the United States.
[0006]
Pathogenic bacteria causing this disease are described in Xanthomonas oryzae pv. Oryzae (rice blight rot) is a bacterium that is known to have a large number of races with different pathogenicity to rice varieties and highly differentiated in pathogenicity.
[0007]
Pathogenic bacteria that cause leaf withering enter the conduits through water channels mainly from the water holes distributed on the leaf margins, and multiply. It is believed that the leaves are locally wilted and the symptoms of leaf blight occur because the grown bacteria prevent the rise in water. Although there is a known toxin theory about the onset mechanism of Bacterial blight, its details are unknown, and it is one of the problems to be elucidated in the future.
[0008]
The genus Xanthomonas to which the present bacterium belongs is composed of bacteria that cause disease in various plants, and is known to be of a very large variety, and is an agriculturally important group of bacteria.
[0009]
On the other hand, rice, the infection partner (host), is an important crop, and at the same time, has been vigorously used worldwide as a major model for molecular biological research of various plants, including breeding and disease resistance mechanisms. It is a model plant that has been studied.
[0010]
In general, there are two processes in which a plant pathogenic bacterium causes a disease in a plant: host recognition / establishment of infection and pathogen release / genesis, and many genes are considered to be involved in the process. However, details are still unknown.
[0011]
To date, several pathogenicity-related genes have been cloned and their functional analysis has been carried out in the bacterial blight of rice. However, no comprehensive analysis has been conducted with the aim of establishing a molecular biological basis, such as comprehensively understanding the entire picture of the pathogenicity-related genes and identifying the distribution and positional relationship on the genome.
[0012]
Up to now, rice blight disease bacterium has no effective materials such as pesticides, so as a control measure, rice blast blight resistance genes are mainly introduced by breeding to cultivate rice blight resistant varieties. Cultivated. However, it has been reported that the cultivation of disease-resistant varieties into which a resistance gene has been introduced becomes ill with the appearance of pathogenic bacteria exhibiting a new pathogenic type (race), so-called collapse of resistance.
[0013]
As a method for detecting a pathogenic bacterium, there is known a method for predicting the occurrence by detecting a phage that specifically infects the bacterial leaf blight of rice. However, a simple technique for diagnosing rice leaf blight by detecting DNA has not been known so far.
[0014]
[Problems to be solved by the invention]
The present invention has been made in view of such a situation, and an object of the present invention is to identify a gene involved in the pathogenicity of rice bacterial wilt disease, which is an important pathogenic bacterium of rice. More specifically, it is an object of the present invention to provide a method for easily diagnosing rice leaf blight on test rice by using, as an index, the presence or absence of a gene related to the virulence of rice leaf blight fungus.
[0015]
[Means for Solving the Problems]
In general, pathogenic bacteria, both plants and animals, are known to have genes that cause pathogens in the form of large clusters (pathogenic islands) on the genome or plasmid. It was predicted that the bacterial pathogen of the present invention may form such a virulence gene cluster. Therefore, the present inventors have developed an hrp gene cluster encoding a pathogenic secretion apparatus (type III secretion apparatus) that is important for expressing pathogenicity, especially in plant pathogenic bacteria such as rice bacterial wilt, and a race. Intensive research was conducted with a focus on analysis of non-pathogenic genes involved in diversification of pathogenicity such as differentiation.
[0016]
First, the present inventors set out to establish a molecular biological basis for elucidating the pathogenic expression mechanism and response mechanism on the microorganism side in plant-microbe interaction. In detail, through analysis of the disease resistance gene obtained in the rice genome research, the present inventors conducted a genome analysis of the bacterial wilt of rice with a view to applying it to the study of plant-microbe interaction. . As strains used for genome analysis, in rice genome research, rice leaf blight resistance gene Xa1 (Yoshimura, S. et al. (1998). Expression of Xa1, a bacterial brightness in licence in cerebral excise in licence, inc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 166-8) was isolated and subjected to structural analysis, ie, in elucidating the interaction, the resistance gene (Xa1) was used. As a result of considering that the strain having the non-pathogenic gene (avrXa1) has a large number of non-pathogenic genes (narrow pathogenic spectrum), That tried subjected to MAFF311018 (T7174).
[0017]
For rapid and simple diagnosis of pathogenic bacteria, detection by PCR that amplifies a gene region or the like specific to the bacterial wilt of rice is effective. In addition, it is effective to introduce a pathogenic gene derived from a pathogenic bacterium into a plant body to constantly induce resistance in a plant side for a disease resistant variety. The present inventors cloned the DNA of the virulence gene group and the DNA in the vicinity thereof from Japanese rice leaf blight fungus stored at the National Institute for Agricultural Resources, and determined the nucleotide sequence. We succeeded in identifying 14 novel virulence genes unique to rice Bacterial blight that do not show any significant homology. Since these genes are not found in the rice genome, it is possible to easily and accurately diagnose rice leaf blight in test rice by using the presence or absence of these novel pathogenic genes as an index. is there. Therefore, it can be said that the novel gene discovered by the present inventors is very useful. The present inventors have actually succeeded in specifically detecting Bacterial Blight on test rice using a PCR primer set capable of hybridizing to the novel virulence gene and amplifying the gene.
[0018]
In addition, the information on the genome analysis of Bacterial Leaf blight of the present invention obtained by the present invention will be useful information for elucidating the pathogenic mechanism, and the genetic diversity including the pathogenic diversity of Xanthomonas bacteria It is expected to be effective knowledge in the analysis and classification research of.
[0019]
That is, the present invention relates to a novel virulence gene group of rice bacterial wilt and its use, and more specifically,
[1] The DNA according to any one of the following (a) to (d), which is derived from the bacterial wilt of rice.
(A) a DNA encoding a protein consisting of the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 2 to 28;
(B) a DNA comprising the coding region of the nucleotide sequence described in any one of the odd numbers of SEQ ID NOS: 1 to 27;
(C) DNA encoding a protein having an amino acid sequence in which one or more amino acids have been substituted, deleted, inserted, and / or added in any one of the even-numbered amino acid sequences of SEQ ID NOs: 2 to 28.
(D) a DNA that hybridizes under stringent conditions with a DNA consisting of the nucleotide sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 27;
[2] The DNA according to any one of the following (a) or (b):
(A) DNA encoding an antisense RNA complementary to the transcript of the DNA of [1].
(B) DNA encoding RNA having ribozyme activity that specifically cleaves the transcript of the DNA of [1].
[3] A vector containing the DNA of [1] or [2].
[4] A transformed cell that carries the DNA of [1] or [2] or the vector of [3].
[5] the transformed cell of [4], which is a plant cell;
[6] A transformed plant comprising the transformed cell according to [5].
[7] A transformed plant, which is a progeny or clone of the transformed plant of [6].
[8] A propagation material for the transformed plant according to [6] or [7].
[9] an oligonucleotide comprising at least 15 contiguous nucleotides in the nucleotide sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 27 or the complement thereof;
[10] an oligonucleotide having a chain length of at least 15 bases, which specifically hybridizes with a DNA consisting of the nucleotide sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 27;
[11] A method for diagnosing whether or not rice is infected with Bacterial blight of rice,
(A) preparing a nucleic acid sample from a rice plant or a part thereof;
(B) detecting the presence of the DNA or the expression product thereof according to [1] in the nucleic acid sample,
A method for judging that rice to be diagnosed is infected with Bacterial Leaf blight, when the presence of the DNA or its expression product according to [1] is detected in step (b) It is.
[0020]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
The present inventors have identified 14 novel virulence genes of the bacterial leaf blight fungus. The present invention first provides DNA derived from the bacterial wilt of rice.
[0021]
The amino acid sequence of the protein encoded by each of the nucleotide sequences of the virulence gene of Bacterial Leaf blight of Rice isolated by the present inventors included in the present invention is represented by SEQ ID NOS: 1 to 27. These are shown in the even numbers of SEQ ID NOs: 2 to 28, respectively. That is, the present invention relates to a DNA encoding a protein consisting of the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOS: 2 to 28 derived from the bacterial wilt of rice, and an odd number of any of SEQ ID NOs: 1 to 27. The present invention provides a DNA comprising a coding region having the nucleotide sequence described in the number.
[0022]
The present invention also provides a DNA encoding a protein structurally similar to the protein described in any of the even-numbered SEQ ID NOs: 2 to 28. Examples of such DNA include a DNA encoding a protein consisting of an amino acid sequence in which one or more amino acids have been substituted, deleted, added, and / or inserted in the protein.
[0023]
In order to prepare the DNA, well-known methods to those skilled in the art include hybridization techniques (Southern, EM., J MoI Biol, 1975, 98, 503.) and polymerase chain reaction (PCR) techniques (Saiki). Et al., RK. Et al., Science, 1985, 230, 1350., Saiki, RK. Et al., Science, 1988, 239, 487.) For example, a site-directed mutagenesis method for the DNA. (Kramer, W. & Fritz, HJ., Methods Enzymol, 1987, 154, 350.). Also, in the natural world, it is possible that the amino acid sequence of the encoded protein is mutated due to the mutation of the base sequence. In addition, even if the nucleotide sequence is mutated, the mutation may not accompany the amino acid mutation in the protein (degenerate mutation), and such a degenerate mutant DNA is also included in the present invention.
[0024]
The DNA of the present invention includes natural or isolated / purified genomic DNA, cDNA, and chemically synthesized DNA. Preparation of genomic DNA and cDNA can be performed by a person skilled in the art using conventional means. For example, genomic DNA is extracted from an organism having a gene encoding the protein represented by any of the even-numbered SEQ ID NOs: 2 to 28, and a genomic library (plasmid, phage, cosmid, BAC, PAC, etc.) can be prepared, developed, and subjected to colony hybridization or plaque hybridization using a probe prepared based on the DNA encoding the protein. is there. Alternatively, it can be prepared by preparing a primer specific to a DNA encoding the protein described in any of the even-numbered SEQ ID NOs: 2 to 28, and performing PCR using the primer. For cDNA, for example, a cDNA is synthesized based on mRNA extracted from an organism having a gene encoding the protein, and the cDNA is inserted into a vector such as λZAP to prepare a cDNA library. It can be prepared by performing colony hybridization or plaque hybridization in the same manner as described above, or by performing PCR. As described above, a DNA that can be isolated by a hybridization technique or a PCR technique and that hybridizes with a DNA consisting of the base sequence described in any of the odd-numbered SEQ ID NOs: 1 to 27 is also included in the DNA of the present invention. .
[0025]
In order to isolate such DNA, a hybridization reaction is preferably performed under stringent conditions. In the present invention, stringent hybridization conditions refer to conditions of 6 M urea, 0.4% SDS, 0.5 × SSC or hybridization conditions of a stringency equivalent thereto. Under conditions of higher stringency, for example, under conditions of 6M urea, 0.4% SDS, and 0.1 × SSC, it is expected that DNA with higher homology can be isolated. The DNA isolated in this manner is considered to have high homology at the amino acid level with the amino acid sequence described in any of the even-numbered SEQ ID NOS: 2 to 28. High homology refers to sequence identity of at least 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, and most preferably 95% or more in the entire amino acid sequence.
[0026]
The amino acid sequence and the base sequence identity can be determined by the algorithm BLAST by Carlin and Arthur (Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1990, 87, 2264-2268., Karlin, S. & Altschul, SF., Proc. Natl. Acad.Sei.USA, 1993, 90, 5873.). Programs called BLASTN and BLASTX based on the BLAST algorithm have been developed (Altschul, SF. Et al., J Mol Biol, 1990, 215, 403.). When a base sequence is analyzed using BLASTN, parameters are set to, for example, score = 100 and wordlength = 12. When analyzing an amino acid sequence using BLASTX, parameters are set to, for example, score = 50 and wordlength = 3. When using BLAST and Gapped BLAST programs, the default parameters of each program are used. Specific methods of these analysis methods are known (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/).
[0027]
The present invention also provides a DNA encoding an antisense RNA complementary to a transcript of the DNA of the present invention, and a DNA encoding an RNA having a ribozyme activity that specifically cleaves the transcript of the DNA of the present invention. .
[0028]
In a preferred embodiment of the present invention, the above DNA can be used, for example, to produce a plant resistant to bacterial blight of rice, in which the expression of the DNA of the present invention is suppressed.
[0029]
When preparing a transformed plant in which the expression of the DNA of the present invention is suppressed, a DNA for suppressing the expression of the DNA of the present invention is inserted into an appropriate vector, and this is introduced into plant cells. The transformed plant cells thus obtained are regenerated. "Suppression of expression of the DNA of the present invention" includes suppression of transcription of a gene and / or suppression of translation into a protein. It also includes a complete cessation of DNA expression as well as a decrease in expression.
[0030]
As a method for suppressing the expression of a specific gene in a plant, a method using antisense technology is most often used by those skilled in the art. The antisense effect in plant cells was first demonstrated by Ecker et al. Showing that antisense RNA introduced by electroporation exerts an antisense effect in plants (Ecker JR & Davis RW: Proc. Natl. Acad. ScL USA 83: 5372, 1986). Since then, it has been reported that the expression of the target gene was reduced in tobacco and petunia by the expression of antisense RNA (van der Kroll AR, et al: Nature 333: 866, 1988). It has been established as a means to suppress gene expression in plants.
[0031]
The action of the antisense nucleic acid to suppress the expression of the target gene includes a plurality of factors as described below. That is, inhibition of transcription initiation by triplex formation, inhibition of transcription by hybridization with a site where an open loop structure was locally formed by RNA polymerase, inhibition of transcription by hybridization with RNA that is undergoing synthesis, introns and exons Inhibition by splicing at the junction with DNA, splicing inhibition by hybridization with a spliceosome-forming site, inhibition of translocation from the nucleus to the cytoplasm by hybridization with mRNA, hybridization with a capping site or a poly (A) addition site Inhibition of splicing, translation initiation inhibition by hybridization with the translation initiation factor binding site, translation inhibition by hybridization with the ribosome binding site near the initiation codon, high interaction with the mRNA translation region and polysome binding site Elongation inhibition of peptide chain by a lid formed, and gene expression inhibition by hybrid formation at sites of interaction between nucleic acids and proteins, and the like. As described above, antisense nucleic acids suppress target gene expression by inhibiting various processes such as transcription, splicing and translation (Hirashima and Inoue: Shinsei Kagaku Kenkyusho 2 Nucleic acid IV Gene replication and expression (Edited by the Society, Doujin Kagaku), pp. 319-347, 1993).
[0032]
The antisense sequence used in the present invention may suppress the expression of the target gene by any of the actions described above. In one embodiment, designing an antisense sequence complementary to the untranslated region near the 5 'end of the mRNA of the gene is considered to be effective in inhibiting translation of the gene. In addition, a sequence complementary to the coding region or the 3 ′ untranslated region can also be used. As described above, the antisense DNA used in the present invention includes a DNA containing an antisense sequence not only in the translated region of the gene but also in the untranslated region. The antisense DNA to be used is ligated downstream of an appropriate promoter, and preferably a sequence containing a transcription termination signal is ligated on the 3 ′ side. The DNA thus prepared can be transformed into a desired plant by using a known method. The sequence of the antisense DNA is preferably a sequence that is complementary to the pathogen of rice leaf blight of the present invention or a part thereof, but is not completely complementary as long as gene expression can be effectively suppressed. May be. The transcribed RNA has preferably 90% or more, and most preferably 95% or more complementarity to the target gene transcript. In order to effectively suppress the expression of a target gene using an antisense sequence, the length of the antisense DNA is at least 15 bases or more, preferably 100 bases or more, and more preferably 500 bases or more. The length of commonly used antisense DNA is less than 5 kb, preferably less than 2.5 kb.
[0033]
Suppression of gene expression can also be performed using DNA encoding a ribozyme. Ribozymes refer to RNA molecules having catalytic activity. There are ribozymes having various activities. Among them, research focused on ribozymes as RNA-cleaving enzymes has made it possible to design ribozymes that cleave RNA in a site-specific manner. Some ribozymes have a size of 400 nucleotides or more, such as the group I intron type and M1 RNA contained in RNase P, and others have an active domain of about 40 nucleotides called hammerhead type or hairpin type ( Makoto Koizumi and Eiko Otsuka: Protein Nucleic Acid Enzyme, 35: 2191, 1990).
[0034]
For example, the self-cleaving domain of the hammerhead ribozyme cleaves the 3 'side of C15 in the sequence G13U14C15, but its activity requires base pairing between U14 and A9, and A15 or U15 instead of C15. However, it has been shown that it can be cleaved (Koizumi M, et al: FEBS Lett 228: 228, 1988). By designing a ribozyme whose substrate binding site is complementary to an RNA sequence in the vicinity of the target site, a restriction-enzymatic RNA-cleaving ribozyme that recognizes the sequence UC, UU or UA in the target RNA can be produced (KoizumiM, et al: FEBS Lett 239: 285, 1988, Koizumi Makoto and Otsuka Eiko: Protein Nucleic Acid Enzyme 35: 2191, 1990, Koizumi M, et al: Nucl Acids Res 17: 7059, 1989).
For example, it is presumed that a plurality of target sites exist in the DNA of the pathogen gene of rice leaf blight (described in any odd number of SEQ ID NOS: 1 to 27).
[0035]
Hairpin ribozymes are also useful for the purpose of the present invention. This ribozyme is found, for example, on the minus strand of satellite RNA of tobacco ring spot virus (Buzyan JM: Nature 323: 349, 1986). It has been shown that a target-specific RNA-cleaving ribozyme can also be produced from a hairpin-type ribozyme (Kikuchi Y & Sasaki N: Nucl Acids Res 19: 6751, 1991, Hiroshi Kikuchi: Chemistry and Biology 30: 112, 1992).
[0036]
A ribozyme designed to cleave the target is ligated to a promoter such as the cauliflower mosaic virus 35S promoter and a transcription termination sequence so that it is transcribed in plant cells. At this time, if an extra sequence is added to the 5 'end or 3' end of the transcribed RNA, the activity of the ribozyme may be lost. In such a case, the RNA containing the transcribed ribozyme may be lost. It is also possible to arrange another trimming ribozyme that acts in cis on the 5 ′ side or 3 ′ side of the ribozyme portion in order to accurately cut out only the ribozyme portion from ribozyme (Taira K, et al: Protein Eng 3: 733, 733). 1990, Dzianott AM & Bujarski JJ: Proc Natl Acad Sci USA 86: 4823, 1989, Grosshans CA & Cech TR: Nucl Acids Res 19: 3875, 1991, Nic. In addition, by arranging such structural units in tandem so that a plurality of sites in the target gene can be cleaved, the effect can be further enhanced (Yuyama N, et al: Biochem Biophys Res Commun 186: 1271, 1992). As described above, by specifically cleaving the transcript of the target gene in the present invention using a ribozyme, expression of the gene can be suppressed.
[0037]
It is also effective to introduce the DNA of the present invention into a plant body to constantly induce resistance on the plant side.
[0038]
The DNA of the present invention can be used, for example, for preparing a recombinant protein.
[0039]
When preparing a recombinant protein, usually, the DNA of the present invention is inserted into an appropriate expression vector, the vector is introduced into appropriate cells, and the expressed protein is purified by culturing the transformed cells to purify the expressed protein. The recombinant protein can be expressed as a fusion protein with another protein for the purpose of facilitating purification or the like. For example, a method for preparing a fusion protein with maltose binding protein using Escherichia coli as a host (vector pMAL series marketed by New England BioLabs, USA) and a method for preparing a fusion protein with glutathione-S-transferase (GST) (Amersham Pharmacia Biotech) It is possible to use a method prepared by adding a histidine tag (vector pGEX series released by the company) (pET series from Novagen), and the like. The host cell is not particularly limited as long as it is a cell suitable for expressing the recombinant protein. In addition to the above-mentioned Escherichia coli, by changing the expression vector, for example, yeast, various animal and plant cells, insect cells, and the like can be used. It is possible. Various methods known to those skilled in the art can be used for introducing a vector into a host cell. For example, for introduction into Escherichia coli, an introduction method using calcium ions (Mandel, M. & Higa, A., Journal of Molecular Biology, 1970, 53, 158-162., Hanahan, D., Journal of Molco Molecule) , 1983, 166, 557-580.). The recombinant protein expressed in the host cell can be purified and recovered from the host cell or a culture supernatant thereof by a method known to those skilled in the art. When the recombinant protein is expressed as a fusion protein with the above-mentioned maltose binding protein or the like, affinity purification can be easily performed. The protein encoded by the DNA of the present invention thus produced is also included in the present invention.
[0040]
By using the obtained recombinant protein, an antibody that binds to the protein can also be prepared. The antibody can be used for a method for diagnosing whether or not the rice is infected with the bacterial leaf blight described below.
[0041]
Polyclonal antibodies can be prepared, for example, from a serum obtained by immunizing an immunized animal such as a rabbit with the purified protein of the present invention or a partial peptide thereof, collecting blood after a certain period of time, and removing blood clots. is there. In addition, monoclonal antibodies are obtained by fusing antibody-producing cells of an animal immunized with the above protein or peptide with bone tumor cells, isolating a single clone cell (hybridoma) producing the desired antibody, and isolating the antibody from the cells. Can be prepared. The antibody thus obtained can be used for purification and detection of the protein of the present invention. The antibodies of the present invention include polyclonal antibodies, monoclonal antibodies, and fragments of these antibodies.
[0042]
The present invention also provides a vector containing the DNA, a transformed cell carrying the vector, a transformed cell that is a plant cell, a transformed plant containing the transformed cell, a progeny or a clone of the transformed plant. Provided are a transformed plant and a propagation material for the transformed plant.
[0043]
A person skilled in the art can introduce the DNA or nucleic acid of the present invention into a plant cell by a known method, for example, an Agrobacterium method, an electroporation method (electroporation method), or a particle gun method.
[0044]
When the Agrobacterium method is used, for example, the method of Nagel et al. (Microbiol. Lett., 1990, 67, 325) is used. According to this method, the recombinant vector is transformed into Agrobacterium bacteria, and then the transformed Agrobacterium is introduced into plant cells by a known method such as a leaf disk method. The above vector contains an expression promoter so that, for example, after introduction into a plant, the DNA of the present invention is expressed in the plant. Generally, the DNA of the present invention is located downstream of the promoter, and a terminator is located downstream of the DNA. The recombinant vector used for this purpose is appropriately selected by those skilled in the art according to the method of introduction into a plant or the type of a plant. Examples of the promoter include CaMV35S derived from cauliflower mosaic virus, and a corn ubiquitin promoter (Japanese Patent Laid-Open No. 2-79983).
[0045]
Examples of the terminator include a cauliflower mosaic virus-derived terminator and a nopaline synthase gene-derived terminator. However, the terminator is not limited to these as long as it is a promoter or a terminator that functions in a plant.
[0046]
The plant into which the DNA or nucleic acid of the present invention is introduced may be an explant, or cultured cells may be prepared from these plants and introduced into the obtained cultured cells. The "plant cells" of the present invention include, for example, plant cells such as leaves, roots, stems, flowers, and scutellum in seeds, calli, suspension cultured cells, and the like.
[0047]
In order to efficiently select a plant cell transformed by introducing the DNA or nucleic acid of the present invention, the above-mentioned recombinant vector contains an appropriate selectable marker gene, or is transformed into a plant cell together with a plasmid vector containing the selectable marker gene. Preferably, it is introduced. Selectable marker genes used for this purpose include, for example, the hygromycin phosphotransferase gene, which is resistant to the antibiotic hygromycin, the neomycin phosphotransferase, which is resistant to kanamycin or gentamicin, and the acetyltransferase gene, which is resistant to the herbicide phosphinothricin. And the like.
[0048]
The plant cells into which the recombinant vector has been introduced are placed and cultured on a known selection medium containing an appropriate selection agent according to the type of the introduced selection marker gene. As a result, transformed plant culture cells can be obtained.
[0049]
Next, a plant is regenerated from the transformed cell into which the DNA or nucleic acid of the present invention has been introduced. Plant regeneration can be performed by a method known to those skilled in the art depending on the type of plant cell (Toki. Et al., Plant Physiol, 1995, 100, 1503-1507.). For example, in the case of rice, a method for producing a transformed plant is described by a method in which a gene is introduced into protoplasts using polyethylene glycol to regenerate a plant (suitable for Indian rice varieties) (Datta, SK. Et al. , In Gene Transfer To Plants (Potrykus I and Spanberg Eds.), 1995, 66-74.), A method of introducing a gene into protoplasts by electric pulse, and regenerating a plant (Japanese rice varieties are suitable). Et al., Plant Physiol, 1992, 100, 1503-1507.), A method of directly introducing a gene into cells by a particle gun method and regenerating a plant (Christou, et al., Bio / techn.). logy, 1991, 9, 957-962.) and a method of regenerating a plant by introducing a gene through Agrobacterium (Hiei. et al., Plant J, 1994, 6, 271-282.). Several techniques have already been established and are widely used in the technical field of the present invention. In the present invention, these methods can be suitably used.
[0050]
The plant regenerated from the transformed cells is then cultured in a conditioned medium. Thereafter, when the regenerated acclimated plant is cultivated under normal cultivation conditions, the plant is obtained, and matured and fruited to obtain a seed.
[0051]
The presence of the introduced foreign DNA or nucleic acid in the transformed and cultivated transformed plant is determined by a known PCR method or Southern hybridization method or by analyzing the nucleotide sequence of the nucleic acid in the plant. Can be confirmed. In this case, extraction of DNA or nucleic acid from the transformed plant is performed by a method described in J. It can be carried out according to the method of Sambrook et al. (Molecular Cloning, 2nd edition, Cold Spring Harbor laboratory Press, 1989).
[0052]
When a foreign gene comprising the DNA of the present invention present in the regenerated plant is analyzed by PCR, an amplification reaction is performed using the nucleic acid extracted from the regenerated plant as a template as described above. When the nucleic acid of the present invention is DNA, a synthetic oligonucleotide having a base sequence appropriately selected according to the base sequence of the DNA is used as a primer, and an amplification reaction is carried out in a reaction mixture in which these are mixed. Can also be performed. In the amplification reaction, when the denaturation, annealing, and extension reactions of DNA are repeated several tens of times, an amplification product of a DNA fragment containing the DNA sequence of the present invention can be obtained. When the reaction solution containing the amplification product is subjected to, for example, agarose electrophoresis, various amplified DNA fragments are fractionated, and it is possible to confirm that the DNA fragments correspond to the DNA of the present invention. .
[0053]
Once a transformed plant in which the DNA of the present invention has been introduced into the chromosome is obtained, progeny can be obtained from the plant by sexual or asexual reproduction. It is also possible to obtain a propagation material (eg, seed, fruit, cutting, tuber, tuber, tuber, strain, callus, protoplast, etc.) from the plant, its progeny or clone, and mass-produce the plant based on them. It is.
[0054]
The present invention also provides an oligonucleotide comprising at least 15 contiguous base sequences in any of the odd-numbered base sequences of SEQ ID NOs: 1 to 27 or a complementary sequence thereof. Here, the “complementary sequence” refers to the other sequence for one strand of a double-stranded DNA consisting of A: T, G: C base pairs. In addition, the sequence is not limited to a completely complementary sequence in at least 15 consecutive nucleotide regions, and is at least 70%, preferably at least 80%, more preferably 90%, and still more preferably 95% or more nucleotide sequence identity. It is only necessary to have Such DNA is useful as a probe for detecting and isolating the DNA of the present invention, and as a primer for performing amplification.
[0055]
Further, the present invention provides an oligonucleotide having a chain length of at least 15 bases, which specifically hybridizes with a DNA consisting of the base sequence described in any one of SEQ ID NOs: 1 to 27. The oligonucleotide specifically hybridizes to the DNA of the present invention. The term "specifically hybridizes" as used herein means a normal hybridization condition, preferably a stringent hybridization condition (for example, Sambrook et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA). (2nd edition, 1989)) means that no significant cross-hybridization occurs with DNAs encoding other proteins. The oligonucleotide need not be completely complementary to the DNA of the present invention, as long as specific hybridization is possible.
[0056]
Oligonucleotides that hybridize to the DNA of the present invention and have a chain length of at least 15 nucleotides can be used as probes and primers for detecting the DNA of the present invention. When the oligonucleotide is used as a primer, its length is usually 15 bp to 100 bp, preferably 17 bp to 30 bp. The primer is not particularly limited as long as it can amplify at least a part of the DNA of the present invention.
[0057]
When the oligonucleotide is used as a probe, the probe is not particularly limited as long as it specifically hybridizes to the DNA of the present invention. The probe may be a synthetic oligonucleotide and usually has a chain length of at least 15 bp.
[0058]
When the oligonucleotide of the present invention is used as a probe, it is preferable to appropriately label and use it. As a method for labeling, the T4 polynucleotide kinase is used to label the 5 ′ end of the oligonucleotide. ³² A method of labeling by phosphorylation with P, and using a DNA polymerase such as Klenow enzyme, using a random hexamer oligonucleotide or the like as a primer ³² A method of incorporating a substrate base labeled with an isotope such as P, a fluorescent dye, or biotin (eg, a random prime method) can be exemplified.
[0059]
Furthermore, the present invention provides a method for diagnosing whether or not rice is infected with the bacterial wilt of rice.
[0060]
In the diagnostic method of the present invention, first, (a) a nucleic acid sample is prepared from a rice plant or a part thereof. Next, (b) the presence of the DNA of the present invention or its expression product in the nucleic acid sample is detected. In (b), when the expression product is detected, it is determined that the rice to be diagnosed is infected with the bacterial wilt of rice. The “part thereof” refers to, for example, a plant tissue, a cell, a cell extract, or the like.
[0061]
In one embodiment of the diagnostic method of the present invention, a DNA encoding a rice bacterial wilt protein is detected using a primer or a probe. The oligonucleotides of the present invention can be used as such probes and primers.
[0062]
The present inventors have actually succeeded in specifically detecting Bacterial Blight on test rice using a PCR primer set capable of hybridizing to the gene of the present invention and amplifying the gene. Therefore, the above-mentioned oligonucleotide of the present invention can be suitably used for the diagnostic method of the present invention. As an example of the oligonucleotide used in the above-mentioned diagnostic method of the present invention, a primer set described in Example 5 described later can be shown, but is not limited thereto. Those skilled in the art can appropriately design a primer set capable of amplifying the DNA of the present invention based on the base sequence described in any one of the odd-numbered SEQ ID NOs: 1 to 28. Similarly, a person skilled in the art can easily design a probe capable of detecting the DNA of the present invention based on the base sequence described in any of the odd-numbered SEQ ID NOs: 1 to 28. It is. Primers and probes may be labeled as necessary. Labels include, for example, radiolabels. Primers or probes that can be used in the diagnostic method of the present invention are also included in the present invention.
[0063]
The diagnostic method of the present invention includes, for example, a method of preparing a nucleic acid sample from a rice plant or a part thereof suspected of being infected with the bacterial leaf blight fungus, and a polymerase chain reaction (PCR) method using the above primer, or It can be carried out by the Northern blotting method or the like using the above-mentioned probe.
[0064]
Another embodiment of the diagnostic method of the present invention is a method of diagnosing a test rice using an antibody by using the presence or absence of the protein encoded by the pathogenic gene of rice leaf blight of the present invention as an index. The antibody used for this diagnosis can be prepared, for example, as described above. The antibody may be labeled if necessary. Examples of the label include an enzyme label. Instead of directly labeling the antibody itself, the target protein may be detected by labeling with a substance that binds to the antibody, for example, protein A or the like. In this diagnosis, for example, it is possible to prepare a test sample from a rice plant or a part thereof suspected to have been infected with Bacterial blight of rice, and to carry out the ELISA or Western blotting using the above antibody. it can.
[0065]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.
[0066]
[Example 1] Preparation of BAC library
BAC (Bacterial Artificial Chromosome) is one of effective tools for genome analysis because it can cover the entire genome with a few clones because it can handle large DNA fragments stably and generate less chimeric DNA. It is. Therefore, the present inventors have prepared a BAC library for about 16 genomes with an average insert fragment length of about 100 to 120 kb (Ochiai, H., Inoue, Y., Hasebe, A. and Kaku, H. (2001). Construction and Characterization of a Xanthomonas oryzae pv. Oryzaebacterial artificial chromosomal library.FEMS Microbiol.
[0067]
[Example 2] Analysis of hrp gene cluster and peripheral region
In order for plant pathogenic bacteria to cause disease in plants, two major processes can be considered, namely, host recognition / infection establishment and pathogen release / pathogenesis. The gene group included in the hrp gene cluster not only encodes a constituent molecule of the virulence factor secretion mechanism (type III) that plays an important role in the process of host recognition / infection establishment, but also several virulence factors. And is known to be the most important virulence gene group in plant pathogenic bacteria (Bonas, U., Schulte, R., Fenselau, S., Minsavage, GV, Staswickicz). , BJ, and Stall, RE (1991) Isolation of a gene cluster from xanthomonas campestris pv. Vesicator that determinants traitogeneticity. . Persensitive response on pepper and tomato.Mol Plant-Microbe Interact 4:. 81-88).
[0068]
Therefore, the base sequence of the BAC clone having the hrp gene cluster isolated by PCR screening was determined by the shotgun method. The determined region is about 220 kb including about 30 kb of the hrp gene cluster. The results of gene prediction in this region are shown in FIG. The presence of a total of 171 genes was predicted, including all 24 genes constituting the known hrp gene cluster in the genus Xanthomonas.
[0069]
What is characteristic in this region is that the transposase homologue (insertion sequence: IS) was inserted in multiple regions and in tandem, including inside the hrp cluster. 36 transposase homologs corresponding to about 20% of the predicted number of genes of 171 were found. We also found several transporter-related genes and glucan-related gene clusters. On the other hand, as a result of a blast search of the predicted gene, 14 genes that are considered to be unique to Bacterial Blight Leaf Blight, which have no significant homology with other organisms at present, were found. The nucleotide sequence of the gene is described in odd numbers of SEQ ID NOs: 1 to 27, and the amino acid sequence predicted from each nucleotide sequence is described in even numbers of SEQ ID NOs: 2 to 28, respectively.
[0070]
[Example 3] Specific detection of bacterial bacterial wilt of rice by PCR
A PCR reaction was performed under the following conditions using the primer set shown in FIG. 2A with the DNAs of the rice wilt fungus and various Xanthomonas bacteria belonging to the same genus as the rice wilt fungus. As PCR primer sets, primer sets of 20 oligonucleotides of sense and antisense were prepared from SEQ ID NOs: 19 and 21, respectively (FIG. 2).
[0071]
PCR primer in SEQ ID NO: 19
Sense primer: 5'-ATGATCTTGGAATCGCACAA (SEQ ID NO: 29)
Antisense primer: 5'-TCATGATGCCACCCTCCTGCG (SEQ ID NO: 30)
PCR primer in SEQ ID NO: 21
Sense primer: 5'-ATGAAACTCTCCGGCGGTAT (SEQ ID NO: 31)
Antisense primer: 5'-TCATGCTCGCCCGCTTTGCC (SEQ ID NO: 32)
[0072]
The PCR reaction conditions were as follows: initial denaturation at 94 ° C. for 2 minutes, 30 cycles of denaturation at 94 ° C. for 15 seconds, annealing at 55 ° C. for 30 seconds, and extension reaction at 72 ° C. for 2 minutes, followed by final extension reaction at 72 ° C. for 7 minutes. Was.
[0073]
PCR amplification products were performed by 1% agarose glue electrophoresis and detected after ethidium bromide staining. As a result, it was detected only in lanes A13, A16, B15, B16 and C15 on which the PCR amplification product using the rice bacterial wilt disease DNA as a template was placed (FIG. 3).
[0074]
[Example 4] Comparative analysis of genomes among bacteria belonging to the genus Xanthomonas
In May 2002, a comparative genomic analysis of the citrus canker fungus (Xanthomonas axonopodis pv. Citri) and the cabbage black rot fungus (Xanthomonas campestris pv. Campestris) was reported by a research group in Brazil (da. et al. (2002) Comparison of the genomes of two Xanthomonas pathogens with differing host specialties. Nature 417: 459-463). Genome rearrangement was observed in some regions, but the overall homology was high. However, it has also been found that 15 to 18% (650 to 800) of the genes on each genome are species-specific and non-existent. Therefore, genomic information obtained from the bacterial blight of rice was compared with the three bacterial species by genomic Southern analysis.
[0075]
First, as a result of comparison of the genomic structure in the hrp gene cluster, there was a slight difference in the homology between the respective genes, but the homology was the same except for the hpaB-hrpF region (FIG. 4). A characteristic feature of the hpaB-hrpF region is that four transposase homologs are inserted into rice Bacterial blight fungus and their length is almost doubled, whereas citrus scab and cabbage black rot are observed. I couldn't. In cabbage black rot fungi, hrpW was present downstream of hpaB, but was not found in the other two bacterial species. Furthermore, in cabbage black rot fungus, hpaF existing downstream of hrpF was deleted, and the transcription direction of hrpF was also reversed.
[0076]
【The invention's effect】
Since the pathogenic gene of Bacterial blight of the rice plant identified by the present invention has no significant homology with the known nucleotide sequence and amino acid sequence, a specific probe using the same nucleotide sequence or a PCR primer set was prepared. Thus, it can be used for simple detection of the bacterial wilt of rice by PCR.
[0077]
In addition, by introducing this gene into plants, it is expected that new disease-resistant plants will be grown.
[0078]
[Sequence list]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a diagram showing a gene map of hrp and peripheral regions.
FIG. 2 shows the sequences of SEQ ID NO: 19 and SEQ ID NO: 21 used for preparing a PCR primer set. The portion where the sequence is indicated by a black frame indicates the sequence of each primer.
A: PCR primer in SEQ ID NO: 19; B: PCR primer in SEQ ID NO: 21.
FIG. 3 is a photograph showing the results of PCR detection of various Xanthomonas bacteria by a primer set designed based on the base sequence of SEQ ID NO: 19. Bacterial names in each lane are shown below the photograph.
FIG. oryzae pv. oryzae, X .; axonopodis pv. citri, and X. campestris pv. It is a figure which compared the structure of the hpaB-hrpF area | region between Campestris.

Claims

The DNA according to any one of the following (a) to (d), which is derived from the bacterial wilt of rice.
(A) a DNA encoding a protein consisting of the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 2 to 28;
(B) a DNA comprising the coding region of the nucleotide sequence described in any one of the odd numbers of SEQ ID NOS: 1 to 27;
(C) DNA encoding a protein having an amino acid sequence in which one or more amino acids have been substituted, deleted, inserted, and / or added in any one of the even-numbered amino acid sequences of SEQ ID NOs: 2 to 28.
(D) a DNA that hybridizes under stringent conditions with a DNA consisting of the nucleotide sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 27;

DNA according to any one of the following (a) or (b):
(A) DNA encoding an antisense RNA complementary to a transcript of the DNA of claim 1.
(B) a DNA encoding an RNA having a ribozyme activity that specifically cleaves the transcription product of the DNA according to claim 1;

A vector comprising the DNA according to claim 1.

A transformed cell carrying the DNA according to claim 1 or 2 or the vector according to claim 3.

The transformed cell according to claim 4, which is a plant cell.

A transformed plant comprising the transformed cell according to claim 5.

A transformed plant which is a progeny or clone of the transformed plant according to claim 6.

A propagation material for the transformed plant according to claim 6.

An oligonucleotide comprising at least 15 contiguous base sequences in the odd-numbered base sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 27 or a complement thereof.

An oligonucleotide which specifically hybridizes with a DNA consisting of the nucleotide sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 27 and has a chain length of at least 15 bases.

A method for diagnosing whether or not rice is infected with the bacterial wilt disease,
(A) preparing a nucleic acid sample from a rice plant or a part thereof;
(B) detecting the presence of the DNA according to claim 1 or an expression product thereof in the nucleic acid sample,
A method for determining that the rice to be diagnosed is infected with the bacterial wilt of rice when the presence of the DNA or the expression product thereof according to claim 1 is detected in step (b).