CN109526745A - 一种以七叶一枝花叶片繁殖种苗的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种以七叶一枝花叶片繁殖种苗的方法，利用无菌苗幼嫩叶片快速诱导愈伤组织成苗，包括在愈伤组织培养基、分化培养基以及壮苗生根培养基中进行培养。采用本发明方法，叶片愈伤组织分化效率达100%，大大提高了无菌芽的获得率，植株生长旺盛，生根长势好，提高了成苗的效率。本发明方法从无菌苗的获得，到愈伤组织诱导及分化，再到壮苗生根成苗只需要2个月时间，极大地提高了种苗获得效率，为实现工厂化育苗提供了技术支撑。因此，该方法是一项有效地种苗繁殖方法，能简便快捷高效率地应用到工厂化生产七叶一枝花种苗，为解决七叶一枝花中药材规模化种植提供技术支撑。

Description

一种以七叶一枝花叶片繁殖种苗的方法
技术领域
本发明属于植物生物技术领域，具体是一种以七叶一枝花叶片繁殖种苗的方法。
背景技术
七叶一枝花百合科重楼属多年生草本植物，最早在《神农本草经》记载的是以药用部位根状茎之名“蚤休”，又名重楼、七叶莲等，是一种重要的中药材，是云南白药、四川抗病毒冲剂、季德胜蛇药片、宫血宁、热毒清等著名中成药的主要原料。
目前，七叶一枝花药材原料主要来自野生，由于长期过度采挖，逐年减少，已面临枯竭；由于七叶一枝花是多年生植物植株生长缓慢,生长年限较长,还未见大规模人工栽培的报道。随着中医药产业的快速发展，以七叶一枝花为原料的生产企业用药量大幅度增加，国内市场需求量达4000吨左右 ，而现供应量仅为1500多吨，供需矛盾日益尖锐，价格持续上涨，已达800-1000元∕kg。因此，研究七叶一枝花的人工栽培技术，加速拓展其种苗繁殖技术和生产规模，迫在眉睫。
目前七叶一枝花种苗繁殖方式为种子繁殖和根状茎切段繁殖方式。七叶一枝花种子具有生理后熟和形态后熟的特征,自然条件下至少2年后才能发芽,而且出苗后当年幼苗会长出主根和萌发的芽鞘,叶片也只有1张,要用于大田栽培至少要等到出苗后2-3年,可见育苗周期长。切段繁殖也很难获得大量种苗，主要是由于七叶一枝花根状茎上芽只有一个，所以切段繁殖的繁殖系数很低，且存在生根率、发芽率低或部分腐烂等问题。因此，国内外学者开始广泛关注七叶一枝花组织培养技术方面的研究。按照植物细胞全能性的理论，植物上的器官和组织都是可以作为外植体来进行研究，但研究中发现，幼嫩的生长较快的器官和组织更适合作为外植体。七叶一枝花的芽是作为外植体研究合适材料，可七叶一枝花每年从上一年的根状茎上只长出一个芽，一个主芽只萌发一个茎单一直立生长，叶片5-11枚，每株植株茎上的花只有一朵。由此可见，七叶一枝花能作为外植体的材料并不多，且由于芽在土壤中生长，灭菌非常困难，严重阻碍了七叶一枝花组培技术应用和推广。
本发明利用七叶一枝花无菌苗的叶片进行愈伤组织诱导，再通过愈伤组织分化出大量的芽，将芽进行生根培养，完成植株再生体系建立。该技术不仅减少七叶一枝花取芽，不与药用争夺资源，还能短时间内获得大量种苗；经过反复培养试验，未发现有变异苗；安全高效，繁殖系数高，减低成本，可为规模化生产提供大量优质的七叶一枝花组培苗。
发明内容
本发明提出一种以七叶一枝花叶片繁殖种苗的方法，利用无菌苗幼嫩叶片诱导出愈伤组织，再通过愈伤组织分化出大量的芽，完成组培苗的培育，繁殖系数较高。
本发明一种以七叶一枝花叶片繁殖种苗的方法，包括以下步骤：
（1）在超净工作台上，将组培瓶中的七叶一枝花无菌苗取出，将叶片切成块，大小为0.5-1.0×0.5-1.0cm，接入愈伤组织培养基中，每瓶接3-5块；将接种好的材料放入培养室培养，前期暗培养5-7天，再进行正常光照培养；
所述培养室温度为20-22℃，光照强度为1000 lx，光照16 h/d；
所述愈伤组织培养基为：MS+6-BA 1.0-2.0 mg/L+2,4-二氯苯氧乙酸0.2-1.0 mg/L+NAA 0.05 mg/L，pH5.8-6.5。
愈伤组织是外植体的增生细胞产生的一团不规则、疏松的薄壁细胞，细胞增殖速度快，在培养基的作用下具有很强的分生能力和再分化能力，根据细胞全能性原理，再分化过程中，一个细胞能分化成完整植株。因此，利用幼嫩叶片进行愈伤组织诱导分化获得无菌苗，该方法具有操作简单、易控制、重复性好、诱导率高、繁殖倍数等优点。
（2）在超净工作台上，将步骤（1）中的愈伤组织取出，放入无菌水中清洗，用无菌滤纸吸干水，接入分化培养基中培养，培养室条件与步骤（1）的培养条件相同；
所述分化培养基为：MS+6-BA 2.0-3.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L，pH5.8-6.5。
（3）在超净工作台上，将分化出的丛生芽取出，切分成单芽接入壮苗生根培养基中，进行壮苗生根培养，培养室条件与步骤（1）的培养条件相同；
所述壮苗生根培养基为：1/2MS+NAA 0.3-1.0 mg/L+IBA 1.0-1.5 mg/L+KT 0.1-0.2mg/L，pH5.8-6.5。
本发明方法的该培养基中：NAA具有诱导不定根的作用， IBA具有促进不定根的生长，两生长素使用具协同作用，提高根的数量和质量；2,4-二氯苯氧乙酸是植物生长调节剂，具有能促进细胞分裂和伸长以及细胞脱分化和新器官的形成作用，KT具有促进细胞横向增粗，使苗粗壮，与生长素同时使用可提高苗的质量。
上述方法中：
步骤（1）所述愈伤组织培养基优选为：MS+6-BA 1.5 mg/L+2,4-二氯苯氧乙酸1.0 mg/L+ NAA 0.05 mg/L，pH6.0；
步骤（2）所述分化培养基优选为：MS+6-BA2.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L，pH6.0；
步骤（3）所述壮苗生根培养基优选为：1/2MS+NAA 0.3 mg/L+IBA 1.5 mg/L+KT 0.1mg/L，pH6.0。
本申请发明人近三年来一直从事七叶一枝花组培研究，开展了不同组织部位（种子、根状茎、芽、茎段、叶片等）的愈伤组织诱导，都因各种不利情形而失败，直到采用了本申请方法，直接选用七叶一枝花无菌苗的幼嫩叶片进行愈伤组织诱导，在短时间内（20天左右）获得丛生芽，叶片愈伤组织分化效率达100%。本发明从外植体的选择培养到无菌苗的获得，及增殖培养到壮苗生根成苗只需要3个月时间，极大地提高了种苗获得效率，是一项有效地繁殖种苗的方法，能简便快捷地应用到工厂化生产七叶一枝花种苗，为解决七叶一枝花中药材规模化种植提供技术支撑。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明内容作进一步的说明，但不是对本发明的限定。
实施例1
一种以七叶一枝花叶片繁殖种苗的方法，包括以下步骤：
（1）在超净工作台上，将组培瓶中的七叶一枝花无菌苗取出，将叶片切成块，大小约为0.5cm×0.5cm，接入愈伤组织培养基中，每瓶接3-5块，将接种好的材料放入培养室培养；前期培养先用报纸覆盖，暗培才养5-7天，再揭开报纸，进行正常光照培养；大约15天后，接种的叶片全部愈伤化，出愈率100%，25天观察记录，愈伤组织大小是原来接种面积的10倍以上；
所述培养室温度为20-22℃，光照强度为1000 lx，光照16 h/d；
所述愈伤组织培养基为：MS+6-BA 1.0 mg/L+2,4-二氯苯氧乙酸0.2mg/L+ NAA 0.05mg/L，pH6.0；
（2）在超净工作台上，将步骤（1）中的愈伤组织取出，放入无菌水中清洗，用无菌滤纸吸干水，接入分化培养基中培养，7-10 天产生芽点，10-15 天形成丛生芽，20-25 天芽长出叶片，芽粗壮，叶色绿色；植株平均高度约2.9cm，一团愈伤组织分化出丛生芽株数高达16.6；
所述培养室温度为20-22℃，光照强度为1000 lx，光照16 h/d。
所述分化培养基为：MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L，pH6.0。
（3）在超净工作台上，将分化出的丛生芽取出，分成单株芽接入壮苗生根培养基中，进行壮苗生根培养，7天时芽的下端出现突起，12-16天开始长根，发根数多，平均每株有12条根以上，25-40天根长为2-5cm，平均根粗0.46mm；植株粗壮、叶片肥大、深绿色，展开呈圆形，较分化培养的叶片大2倍左右；
所述培养室温度为20-22℃，光照强度为1000 lx，光照16 h/d；
所述壮苗生根培养基为：1/2MS+NAA 0.3 mg/L+IBA 1.0mg/L+KT 0.1mg/L，pH6.0。
实施例2
一种以七叶一枝花叶片繁殖种苗的方法，包括以下步骤：
（1）在超净工作台上，将组培瓶中的七叶一枝花无菌苗取出，将叶片切成块，大小约为0.5cm×0.5cm，接入愈伤组织诱导培养基中，每瓶接3-5块，将接种好的材料全部放入培养室培养；前期培养先用报纸覆盖，暗培才养5-7天，再揭开报纸，进行正常光照培养；大约15天后，接种的叶片全部愈伤化，出愈率100%，25天观察记录，愈伤组织大小是原来接种面积的10倍以上；
所述培养室温度为20-22℃，光照强度为1000 lx，光照16 h/d；
所述愈伤组织培养基为：MS+6-BA 1.5mg/L+2,4-二氯苯氧乙酸1.0mg/L+ NAA 0.05mg/L，pH6.0；
（2）在超净工作台上，将步骤（1）中的愈伤组织取出，放入无菌水中清洗，用无菌滤纸吸干水，接入分化培养基中培养，5-10 天产生芽点，10-15 天形成丛生芽，20-25 天芽长出叶片，芽粗壮，叶色绿色；植株平均高度约3.6cm，一团愈伤组织分化出丛生芽株数高达26株，平均分化出丛生芽株数18.5；
所述培养室温度为20-22℃，光照强度为1000 lx，光照16 h/d；
所述分化培养基为：MS+6-BA 2.5mg/L+NAA 0.5 mg/L，pH6.0；
（3）在超净工作台上，将分化出的丛生芽取出，分成单株芽接入壮苗生根培养基中，进行壮苗生根培养，7天时芽的下端出现突起，12-16天开始长根，发根数多，25-40天根长为2-5cm，平均根粗0.62mm；植株粗壮、叶片肥大、深绿色，展开呈圆形，较增殖培养的叶片大2倍左右；
所述培养室温度为20-22℃，光照强度为1000 lx，光照16 h/d；
所述壮苗生根培养基为：1/2MS+NAA 0.3 mg/L+IBA 1.0mg/L+KT 0.1mg/L，pH6.0。
实施例3
对照试验：在超净工作台上，将组培瓶中的七叶一枝花无菌苗取出，分成单株芽接入增殖培养基中，进行增殖培养，将接种好的材料放入培养室培养；10-15天单株芽周围长出新的丛生芽，高矮不一，大约25天后，植株平均高度约3.2cm，增殖倍数为5.9倍；
所述培养室温度为20-22℃，光照度为1000 lx，光照16 h/天；
所述增殖培养基为：MS+6-BA 2.5mg/L+NAA 0.5 mg/L，pH5.8。
通过对照试验：采用本发明方法，叶片愈伤组织分化效率达100%，分化成丛生芽最高达26株，统计5瓶成苗数，平均达18.5株，比实施例3以丛生芽增殖倍数（5.9倍）还高3.14倍，大大提高了成苗的效率。

Claims (2)

1.一种以七叶一枝花叶片繁殖种苗的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）在超净工作台上，将组培瓶中的七叶一枝花无菌苗取出，将叶片切成块，大小为0.5-1.0×0.5-1.0cm，接入愈伤组织培养基中，每瓶接3-5块；将接种好的材料放入培养室培养，前期暗培养5-7天，再进行正常光照培养；
所述培养室温度为20-22℃，光照强度为1000 lx，光照16 h/d；
所述愈伤组织培养基为：MS+6-BA 1.0-2.0 mg/L+2,4-二氯苯氧乙酸0.2-1.0 mg/L+NAA 0.05 mg/L，pH5.8-6.5；
（2）在超净工作台上，将步骤（1）中的愈伤组织取出，放入无菌水中清洗，用无菌滤纸吸干水，接入分化培养基中培养，培养室条件与步骤（1）的培养条件相同；
所述分化培养基为：MS+6-BA 2.0-3.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L，pH5.8-6.5；
（3）在超净工作台上，将分化出的丛生芽取出，分成单株芽接入壮苗生根培养基中，进行壮苗生根培养，培养室条件同步骤（1）的培养条件；
所述壮苗生根培养基为：1/2MS+NAA 0.3-1.0 mg/L+IBA 1.0-1.5 mg/L+KT 0.1-0.2mg/L，pH5.8-6.5。
2.根据权利要求1所述的一种以七叶一枝花叶片繁殖种苗的方法，其特征在于：
步骤（1）所述愈伤组织培养基为：MS+6-BA 1.5 mg/L+2,4-二氯苯氧乙酸1.0 mg/L+NAA 0.05 mg/L，pH6.0；
步骤（2）所述分化培养基优选为：MS+6-BA2.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L，pH6.0；
步骤（3）所述壮苗生根培养基优选为：1/2MS+NAA 0.3 mg/L+IBA 1.5 mg/L+KT 0.1mg/L，pH6.0。
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