CN116138168A - 一种促进悬钩子属种子萌发的培养基及组培育苗的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种促进悬钩子属种子萌发的培养基及组培育苗的方法，属于植物组织培养和种子育苗技术领域。本发明提供了一种促进悬钩子属种子萌发的培养基，以1/2MS培养基为基础培养基，还包括：PVP或活性炭、GA3、IBA、NAA、蔗糖和琼脂；培养基pH为5.85～5.95。所述培养基应用于悬钩子属种子萌发可以提高种子萌发率，缩短种子萌发时间，解决种子因体积小和内果皮厚而导致的萌发率低、萌发周期长、苗势弱等关键问题，为悬钩子属育种子代成苗、种子组培体系建立、组培幼苗移栽炼苗等研究奠定了坚实的技术基础。
Description
技术领域
本发明属于植物组织培养和种子育苗技术领域，具体涉及一种促进悬钩子属种子萌发的培养基及组培育苗的方法。
背景技术
蔷薇科(Rosaceae)悬钩子属(Rubus)植物全世界约有750个种，分布遍及五大洲。中国约有194个种88个变种，分布遍及全国各地。该属很多植物均具有开发利用价值，有些种类的果实柔嫩多汁，营养丰富，可食用。其中黑莓(Rubusplicatus)和树莓(Rubuscorchorifolius L.f.)果实富含维生素A、B1、B2、C、E、花色苷、有机酸和钙、铁、锌等营养成分，成为极具发展潜力的特种经济林树种之一，也是“第三代水果”的重要成员之一；有些种类的果实、种子、根及叶可入药，具有活血化瘀、清热解毒、止血止痛等功效。
悬钩子属植物种子具有深度休眠特性，给选育种及物种保护等工作造成一定困难。已有研究表明，悬钩子属植物种子休眠原因复杂多样，包括硬质种皮(实为内果皮)妨碍透水透气和胚生长，种皮或胚乳内含萌发抑制物质，胚发育不充分等。因此，打破休眠、提高种子萌发率进而增加优株出现的频率和增强实生苗的长势对悬钩子属育种具有非常重要的意义。
现在提高悬钩子属种子萌发率的常规方法通常包括对种子进行化学试剂浓硫酸处理或者采用低温层积处理。但是以上方法处理种子往往萌发率低(最高60％左右)，且萌发出来的芽比较弱、生长差，效果均不理想，尤其是低温层积方法，耗时长达几个月，萌发率还不足10％。目前仍缺乏悬钩子属植物萌发率高的种子处理方法且相关培养基的报道相对较少。
发明内容
本发明的目的在于提供一种促进悬钩子属种子萌发的培养基，能够解决悬钩子属植物种子萌发率低、萌发处理时间长的问题。
本发明提供了一种促进悬钩子属种子萌发的培养基，所述培养基以1/2MS培养基为基础培养基，还包括以下质量浓度的组分：0.5～1.5g/LPVP或0.2～0.5g/L活性炭、0.3～0.8mg/L GA3、0.02～0.07mg/LIBA、0.02～0.07mg/LNAA、20～30g/L蔗糖和5.5～6.5g/L琼脂；
所述培养基的pH为5.85～5.95。
优选的，所述培养基以1/2MS培养基为基础培养基，还包括以下质量浓度的组分：0.3g/L活性炭、0.6mg/L GA3、0.05mg/L IBA、0.05mg/L NAA、20g/L蔗糖和6g/L琼脂；
所述培养基的pH为5.9。
本发明提供了一种促进悬钩子属种子萌发的方法，包括如下步骤：
将悬钩子属种子进行切割，得到露出种胚的种子；
将露出种胚的种子接种于上述技术方案所述的培养基中进行培养。
优选的，所述培养的时间为25～40d；所述培养依次包括暗培养和光培养；
所述暗培养的时间为7～10d；所述暗培养的温度为24℃～26℃；
所述光培养的温度为24℃～26℃；所述光培养的光照强度为500～1500lx；所述光培养的光照时间为14h/d～16h/d。
优选的，所述消毒的试剂包括次氯酸钠水溶液；所述消毒的时间为0.8～1.2h。
优选的，所述切割包括将种子从中间切开；或者将种子在近胚乳端切开。
本发明提供了一种组培幼苗育苗的方法，包括以下步骤：
将上述技术方案所述方法培养得到的组培幼苗根系于多菌灵和IBA混合溶液中进行速蘸，得到预处理组培幼苗；
将所述预处理组培幼苗移栽于营养土中进行炼苗。
优选的，所述混合溶液中，多菌灵与水的质量比为1:(1000～2000)；IBA的质量浓度为0.5～1mg/L；所述速蘸的时间为20～40s。
优选的，所述营养土包括蛭石、珍珠岩和椰糠；所述蛭石、珍珠岩和椰糠的体积比为1:(1～1.5):(3～4)；所述营养土中还包括花多多速溶肥。
优选的，炼苗时环境的温度为24℃～26℃；环境湿度为80～90％；光照强度为1000～2000lx；光照时间为14h/d～16h/d。
本发明的有益效果：
本发明提供了一种促进悬钩子属种子萌发的培养基，以1/2MS培养基为基础培养基，包括以下组分：0.5～1.5g/L PVP或0.2～0.5g/L活性炭、0.3～0.8mg/LGA3、0.02～0.07mg/L IBA、0.02～0.07mg/LNAA、20～30g/L蔗糖和5.5～6.5g/L琼脂；所述培养基的pH为5.85～5.95。本发明提供的培养基中所述PVP或者活性炭可以吸附种子休眠分泌的ABA等抑制物质或者伤口分泌的导致种子褐化的酚类物质，从而促进种子打破休眠、降低种子褐化率；GA3进一步打破种子的休眠、促进萌发成苗；NAA、IBA可以促进幼苗生根和生长，NAA还可以进一步促进幼苗生长，两种激素配合使用可以显著促进悬钩子属植物种子的生根和提高植物的生长速度。本发明提供的应用于悬钩子属植物种子萌发的培养基可以促进悬钩子属植物种子萌发，提高种子萌发率，缩短种子萌发时间，促进幼苗生根生长等。通过实施例结果表明，采用本发明提供的培养基对黑莓和树莓种子进行培养，黑莓种子萌发10d时，萌发率已高达90～94％，且随着萌发时间的增加，萌发率仍呈增加趋势，同时也能显著提高树莓种子萌发率。因此，采用本发明提供的培养基进行悬钩子属植物种子培育，解决了悬钩子属植物种子因体积小和内果皮厚等而导致的萌发率低、萌发周期长、苗势弱等关键问题，为悬钩子属植物杂交育种子代成苗、种子组培体系建立、组培幼苗移栽炼苗等研究奠定了坚实的技术基础。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为实施例2-1培养30天时组培苗生长情况图；
图2为实施例2-2培养30天时组培苗生长情况图；
图3为对比例2-1培养30天时组培苗生长情况图；
图4为对比例2-2培养30天时组培苗生长情况图；
图5为对比例2-3培养30天时组培苗生长情况图；
图6为实施例2-2培养30天时组培苗整株的生长情况图；
图7为对比例2-1对照1组培养30天时组培苗整株的生长情况图；
图8为实施例3-1炼苗培养30天时，幼苗生长情况图；
图9为实施例4培养30天时组培苗生长情况图；
图10为对比例4培养30天时组培苗生长情况图；
图11为实施例5炼苗培养30天时，幼苗生长情况图。
具体实施方式
本发明提供了一种促进悬钩子属种子萌发的培养基，所述培养基以1/2MS培养基为基础培养基，还包括以下质量浓度的组分：0.5～1.5g/LPVP或0.2～0.5g/L活性炭、0.3～0.8mg/L GA3、0.02～0.07mg/L IBA、0.02～0.07mg/LNAA、20～30g/L蔗糖和5.5～6.5g/L琼脂；优选以1/2MS培养基为基础培养基，仅还含有以下质量浓度的组分：0.5～1.5g/L PVP或0.2～0.5g/L活性炭、0.3～0.8mg/L GA3、0.02～0.07mg/L IBA、0.02～0.07mg/LNAA、20～30g/L蔗糖和5.5～6.5g/L琼脂；
所述培养基的pH为5.85～5.95。
如无特殊说明，本发明对各组分的来源没有特殊要求，采用本领域技术人员所熟知市售产品即可。
在本发明中，所述培养基以1/2MS培养基为基础培养基，还包括0.5～1.5g/LPVP，优选为0.8～1.2g/L，更优选为1g/L；或者还包括0.2～0.5g/L活性炭，优选为0.3～0.4g/L，更优选为0.3g/L。在本发明中，所述PVP或活性炭作为吸附剂可以吸附种子在休眠状态时分泌ABA等抑制物质，或者吸附种子分泌的导致种子褐化的酚类物质等，从而促进种子打破休眠、降低种子褐化率。在本发明中，所述活性炭优选为粉末状活性炭。
在本发明中，所述培养基以1/2MS培养基为基础培养基，还包括0.3～0.8mg/LGA3，优选为0.5～0.7mg/L，更优选为0.6mg/L。在本发明中，添加适宜浓度的GA3可打破种子休眠、促进种子成苗。
在本发明中，所述培养基以1/2MS培养基为基础培养基，还包括0.02～0.07mg/LIBA，优选为0.03～0.06mg/L，更优选为0.05mg/L。在本发明中，添加适宜浓度的IBA可以促进幼苗生根和生长。
在本发明中，所述培养基以1/2MS培养基为基础培养基，还包括0.02～0.07mg/LNAA，优选为0.03～0.06mg/L，更优选为0.05mg/L。在本发明中，添加适宜浓度的NAA可以促进幼苗生长。
在本发明中，所述培养基以1/2MS培养基为基础培养基，还包括20～30g/L蔗糖，优选为20～25g/L，更优选为20g/L。在本发明中，所述蔗糖可以作为碳源为植物细胞提供能量来源，还可以使培养基形成稳定的渗透压，进而促进种子萌发生长。
在本发明中，所述培养基以1/2MS培养基为基础培养基，还包括5.5～6.5g/L琼脂，优选为5.8～6.2g/L，更优选为6g/L。在本发明中，所述琼脂主要作为培养基的凝固剂。
在本发明中，所述促进悬钩子属种子萌发的培养基的pH值为5.85～5.95，更优选为5.9。本发明所述培养基的pH值适合悬钩子属种子萌发生长。本发明对pH值的调节方式没有特殊限定，采用本领域常规的pH调节方式均可。在本发明中，配置培养基用水优选为去离子水。
本发明提供的促进悬钩子属种子萌发的培养基通过各个组分的相互作用，可以促进黑莓和树莓种子萌发，提高黑莓和树莓种子萌发率，缩短黑莓和树莓种子萌发时间，进一步地，采用所述培养基进行悬钩子属种子培育，解决了种子萌发率低、萌发周期长、苗势弱等关键问题，为子代成苗、种子组培体系建立、组培幼苗移栽炼苗等研究奠定了坚实的技术基础。
本发明对上述技术方案所述培养基的制备方法没有特殊限定，采用本领域常规培养基制备方法均可。
本发明提供了一种促进悬钩子属种子萌发的方法，包括如下步骤：
将悬钩子属种子进行切割，得到露出种胚的种子；
将露出种胚的种子接种于上述技术方案所述的培养基中进行培养。
本发明将悬钩子属植物种子进行切割，得到露出种胚的种子。在本发明中，所述种子优选来自于完全成熟、健康、饱满和无病虫害的悬钩子属果实。在本发明中，所述悬钩子属植物优选包括黑莓和树莓；所述黑莓的种子优选包括黑莓杂交种子。本发明实施例中所述黑莓的品种为“黑怡”；所述树莓的品种为“红怡”。在本发明中，所述悬钩子属种子的获取方式优选为将悬钩子属果实放入无菌的纱布中，揉挤果肉后挤出种子。本发明对种子进行切割前优选对种子进行预处理，所述预处理优选包括清洗、筛选和消毒。
本发明所述清洗的方式优选为用清水进行清洗。所述清洗主要去除种子上残余的果肉。本发明对清洗后的种子进行继续培养或者进行保存待用。在本发明中，所述种子保存的方法优选为将种子放于阴凉处风干，然后放入干燥的容器中密封后保存。本发明悬钩子属种子保存的方法可以长期保存种子。
将种子清洗后进行继续培养时，本发明优选进行种子筛选。在本发明中，所述种子筛选的方法优选为浸泡筛选；所述浸泡筛选的方式优选为将种子进行浸泡软化，浸泡软化完成后，留下沉在下面种子。本发明所述浸泡软化优选将种子放入瓶中，加水进行。所述瓶优选为高压灭菌的无菌瓶；所述水优选为无菌水；所述无菌水的温度优选为50～60℃，更优选为60℃。本发明所述浸泡软化的时间优选为12～24h，更优选为12～20h，更优选为12h。本发明所述浸泡软化优选在室温条件下进行。本发明通过浸泡软化能够使干瘪的种子漂浮于水面之上，颗粒饱满、发育良好的种子沉入水底，从而达到种子筛选的目的；通过对种子进行浸泡软化，筛选得到的种子内果皮已经变得相对柔软，方便后续切破内果皮。本发明优选对沉在下面的种子继续进行挑选，得到筛选后的种子。在本发明中，所述挑选优选挑出破损、不饱满、体积小的种子；所述挑选优选采用无菌镊子进行。在本发明中，所述筛选优选在超净工作台进行。
得到筛选后的种子后，本发明优选对种子进行消毒。在本发明中，所述消毒的试剂优选为次氯酸钠水溶液；所述次氯酸钠水溶液中次氯酸钠的质量分数优选为3～4％，更优选为3％；所述消毒的时间优选为0.8～1.2h，更优选为1h。在本发明中，所述消毒期间优选伴随轻轻摇动，使种子充分接触次氯酸钠溶液。本发明通过所述消毒还能够达到进一步使内果皮软化的目的。消毒完成后，本发明优选对消毒后的种子进行冲洗，所述冲洗的次数优选为3～5次，更优选为3～4次。在本发明中，用无菌水进行冲洗的过程中优选不停轻轻晃动。本发明将种子消毒后进行清洗主要去除种子表面残留的消毒试剂，防止消毒试剂对种子萌发和生长产生不利影响。
本发明对悬钩子属种子进行切割的方式优选包括将种子从中间切开；或者将种子在近胚乳端切开。在本发明中，所述切割方式优选根据种子的大小进行选择。当种子较大时，所述较大种子能较容易识别出胚根端和胚乳端，则优选采用将种子在近胚乳端切开的方式进行切割；当种子较小时，所述较小种子不方便识别出胚根端和胚乳端，则优选采用将种子从中间切开的方式进行切割。本发明所述切割优选尽可能多的保留胚乳。本发明所述切割优选采用无菌手术刀进行；所述切割优选在无菌滤纸上进行。本发明对种子进行切割主要是解除内果皮对种胚萌发产生的束缚。
得到露出种胚的种子后，本发明将露出种胚的种子接种于上述技术方案所述的培养基中进行培养。本发明对所述接种的方式没有特殊限定，采用本领域常规的接种方法均可。若种子的体积太小，不容易识别出胚根端和胚乳端时，本发明优选将两端都接种到培养基中。在本发明中，所述培养的时间优选为25～40d，进一步优选为28～35d，更优选为30d。所述培养优选依次包括暗培养和光培养。本发明所述暗培养的时间优选为7～10d，进一步优选为7～9d，更优选为7d；所述暗培养的温度优选为24℃～26℃，更优选为25℃。在本发明中，所述光培养的方法优选为光照培养和暗培养相结合，一次光照培养和暗培养的时间为一天。本发明所述光培养的温度优选为24℃～26℃，更优选为25℃；所述光培养的光照强度优选为500～1500lx，进一步优选为1000～1500lx，更优选为1500lx；所述光培养的光照时间为14h/d～16h/d，更优选为16h/d。所述光培养的时间优选为18～28d，进一步优选为19～28d，更优选为23d。在本发明中，所述暗培养优选在培养箱中进行；所述光培养优选在培养间中进行。
本发明提供的促进悬钩子属种子萌发的方法操作简单，萌发率高，萌发周期短，培养得到的组培幼苗苗势壮，所述方法解决了悬钩子属种子因体积小和内果皮厚等而导致的萌发率低、萌发周期长、苗势弱等关键问题。
本发明还提供了一种组培育苗的方法，包括以下步骤：
将上述技术方案所述方法培养得到的组培幼苗根系于多菌灵和IBA混合溶液中进行速蘸，得到预处理的组培幼苗；
将所述预处理组培幼苗移栽于营养土中进行炼苗。
本发明将上述技术方案所述方法培养得到的组培幼苗根系于多菌灵和IBA混合溶液中进行速蘸，得到预处理的组培幼苗。
本发明将上述技术方案所述方法培养得到的组培幼苗从培养基中取出时优选轻轻取出。本发明将组培幼苗轻轻从培养基中取出主要是为了防止取出过程中损伤幼苗根系。将所述组培幼苗根系于多菌灵和IBA混合溶液中进行速蘸前，本发明优选对组培幼苗根部进行清洗。本发明优选采用清水对组培幼苗进行清洗。本发明对清洗的方式没有特殊限定，采用常规幼苗清洗方式即可。本发明对组培幼苗进行清洗主要是去除粘留在根部的培养基。在本发明中，所述混合溶液中，多菌灵与水的质量比优选为1：(1000～2000)，进一步优选为1：(1000～1500)，更优选为1：1000；所述混合溶液中，IBA的质量浓度优选为0.5～1.0mg/L，进一步优选为0.8～1.0mg/L，更优选为1.0mg/L。本发明所述速蘸的时间优选为20～40s，更优选为30s。本发明将组培幼苗在多菌灵与IBA溶液中进行速蘸，其中，多菌灵的作用是对根系进行消毒，减少根系腐烂；IBA可以促进根系生长。本发明通过速蘸可以减少根系腐烂、促进根系生长，进而提高移栽成活率和促进生长。
得到预处理的组培幼苗后，本发明将所述预处理组培幼苗移栽于营养土中进行炼苗。
在本发明中，所述营养土优选包括蛭石、珍珠岩和椰糠；所述蛭石、珍珠岩和椰糠的体积比优选为1:(1～1.5):(3～4)；更优选为1:1:4。在本发明中，所述营养土中优选还包括花多多速溶肥；所述花多多速溶肥优选进行稀释后添加到营养土中的其他组分中。在本发明中，所述花多多速溶肥进行稀释时，花多多速溶肥与水的质量比优选为1:(1000～2000)，进一步优选为1：(1000～1500)，更优选为1:1000。本发明对营养土中花多多速溶肥的添加量没有特殊限定，采用本领域常规花多多肥料用量均可。本发明将稀释后的花多多肥料与营养土混合的比例优选使营养土呈半湿半干状态，即手捏成团不散，且无液体流出状态。本发明实施例中所述花多多速溶肥为花多多速溶肥1号，所述花多多速溶肥1号购自于花多多商贸有限公司。在本发明中，所述营养土将上述原料混合均匀后进行使用。本发明对组培幼苗移栽的方式没有特殊限定，采用本领域常规移栽方式均可。在本发明中，所述炼苗优选在光培养条件下进行。在本发明中，所述光培养的方法优选为光照培养和暗培养相结合，一次光照培养和暗培养的时间为一天。本发明所述炼苗时环境的温度优选为24℃～26℃，更优选为25℃；环境湿度优选为80％～90％，更优选为90％；光照强度优选为1000～2000lx，更优选为2000lx；光照时间优选为14h/d～16h/d，更优选为16h/d。本发明所述炼苗优选在人工气候室中进行。
本发明提供的组培育苗的方法炼苗成活率高，炼苗结果苗势壮，为悬钩子属植物杂交育种子代成苗、种子组培体系建立、组培苗移栽炼苗等研究奠定了坚实的技术基础。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的一种促进悬钩子属种子萌发的培养基及其组培育苗的方法进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1-1
一种促进悬钩子属种子萌发的培养基，组分为：1/2MS培养基作为基础培养基还只添加了1g/LPVP、0.6mg/L GA3、0.05mg/L IBA、0.05mg/LNAA、20g/L蔗糖和6g/L琼脂，培养基的pH为5.9。
实施例1-2
一种促进悬钩子属种子萌发的培养基，组分为：1/2MS培养基作为基础培养基还只添加了0.3g/L活性炭、0.6mg/L GA3、0.05mg/L IBA、0.05mg/LNAA、20g/L蔗糖和6g/L琼脂，培养基的pH为5.9。
实施例1-3
一种促进悬钩子属种子萌发的培养基，组分为：1/2MS培养基作为基础培养基还只添加了0.5g/L活性炭、0.8mg/L GA3、0.07mg/L IBA、0.07mg/LNAA、30g/L蔗糖和6.5g/L琼脂，培养基的pH为5.9。
实施例1-4
一种促进悬钩子属种子萌发的培养基，组分为：1/2MS培养基作为基础培养基还只添加了0.2g/L活性炭、0.3mg/L GA3、0.02mg/L IBA、0.02mg/LNAA、20g/L蔗糖和5.5g/L琼脂，培养基的pH为5.9。
实施例1-5
一种促进悬钩子属种子萌发的培养基，组分为：1/2MS培养基作为基础培养基还只添加了0.5g/LPVP、0.6mg/L GA3、0.05mg/LIBA、0.05mg/LNAA、20g/L蔗糖和6g/L琼脂，培养基的pH为5.9。
实施例1-6
一种促进悬钩子属种子萌发的培养基，组分为：1/2MS培养基作为基础培养基还只添加了1.5g/LPVP、0.6mg/L GA3、0.05mg/LIBA、0.05mg/LNAA、20g/L蔗糖和6g/L琼脂，培养基的pH为5.9。
对比例1-1
一种培养基，组分为：1/2MS培养基作为基础培养基还只添加了20g/L蔗糖和6g/L琼脂，培养基的pH为5.9。
对比例1-2
一种培养基，组分为：1/2MS培养基作为基础培养基还仅添加了0.6mg/LGA3、1g/LPVP、20g/L蔗糖和6g/L琼脂，培养基的pH为5.9。
对比例1-3
一种培养基，组分为：1/2MS培养基作为基础培养基还仅添加了0.05mg/LIBA、0.05mg/LNAA、1g/L PVP、20g/L蔗糖和6g/L琼脂，培养基的pH为5.9。
对比例1-4
一种培养基，组分为：1/2MS培养基作为基础培养基还仅添加了0.6mg/LGA3、0.05mg/L IBA、0.05mg/LNAA、20g/L蔗糖和6g/L琼脂，培养基的pH为5.9。
对比例1-5
一种培养基，组分为：1/2MS培养基作为基础培养基还仅添加了0.3mg/LGA3、20g/L蔗糖和6g/L琼脂，培养基的pH为5.9。
对比例1-6
一种培养基，组分同实施例1，区别在于PVP的质量浓度为0.3g/L。
对比例1-7
一种培养基，组分同实施例1，区别在于GA3的质量浓度为0.2mg/L。
对比例1-8
一种培养基，组分同实施例1，区别在于IBA的质量浓度为0.01mg/L，NAA质量浓度为0.01mg/L。
对比例1-9
一种培养基，组分同实施例1，区别在于，不包括NAA。
对比例1-10
一种培养基，组分同实施例1，区别在于，不包括IBA。
对比例1-11
一种培养基，组分为1/2MS培养基作为基础培养基还只添加了1g/LPVP、20g/L蔗糖和6g/L琼脂，培养基的pH为5.9。
实施例2-1
悬钩子属植物黑莓“黑怡”种子培养。
1.种子的清洗与保存
采集黑莓品种“黑怡”完全成熟、健康、饱满、无病虫害的新鲜果实放入无菌的纱布中，揉烂果肉后挤出种子；将种子用清水清洗干净，直至种子表面没有残留的果肉。
取部分种子进行萌发处理，剩余种子放在阴凉处风干，然后放入干燥的容器中密封后保存，以备长期使用。
2.种子的筛选与消毒
在无菌超净台中，将种子放入经高压灭菌的瓶中，加入60℃无菌温水浸泡12h后，去除漂在水面的干瘪种子，用无菌镊子进一步挑除破损、不饱满、体积小的种子。
用质量百分含量为3％次氯酸钠溶液对筛选后的种子进行消毒，消毒的时间为1h，期间经常摇动；消毒后用无菌水对种子进行冲洗，冲洗的次数为3次。
3.种子切割
把种子放到灭菌的滤纸上，用无菌手术刀从中间切开种子。
4.将切割后的种子接种于培养基中进行种子培养。
具体为：把两端都接种到不同试验组的培养基中，以接种50粒种子为例，萌发率的计算方法为(出芽的个数/50)×100％。
其中，以实施例1-1中的培养基对黑莓种子进行培养作为试验1组，试验组接种50粒种子；
种子培养的过程为：
先在25℃培养箱中暗培养7天，然后再转移到温度25℃、光照时间16h/天、光照强度为1500lx的培养间进行光培养，生根培养30d，得到组培幼苗。
实施例2-2
种子培养方法同实施例2-1，区别在于，以实施例1-2中的培养基对黑莓种子进行培养作为试验2组。
实施例2-3
种子培养方法同实施例2-1，区别在于，以实施例1-3中的培养基对黑莓种子进行培养作为试验3组。
实施例2-4
种子培养方法同实施例2-1，区别在于，以实施例1-4中的培养基对黑莓种子进行培养作为试验4组。
实施例2-5
种子培养方法同实施例2-1，区别在于，以实施例1-5中的培养基对黑莓种子进行培养作为试验5组。
实施例2-6
种子培养方法同实施例2-1，区别在于，以实施例1-6中的培养基对黑莓种子进行培养作为试验6组。
对比例2-1
种子培养方法同实施例2-1，区别在于，以对比例1-1中的培养基对黑莓种子进行培养作为对照1组。
对比例2-2
种子培养方法同实施例2-1，区别在于，以对比例1-2中的培养基对黑莓种子进行培养作为对照2组。
对比例2-3
种子培养方法同实施例2-1，区别在于，以对比例1-3中的培养基对黑莓种子进行培养作为对照3组。
对比例2-4
种子培养方法同实施例2-1，区别在于，以对比例1-4中的培养基对黑莓种子进行培养作为对照4组。
对比例2-5
种子培养方法同实施例2-1，区别在于，以对比例1-5中的培养基对黑莓种子进行培养作为对照5组。
对比例2-6
种子培养方法同实施例2-1，区别在于，以对比例1-6中的培养基对黑莓种子进行培养作为对照6组。
对比例2-7
种子培养方法同实施例2-1，区别在于，以对比例1-7中的培养基对黑莓种子进行培养作为对照7组。
对比例2-8
种子培养方法同实施例2-1，区别在于，以对比例1-8中的培养基对黑莓种子进行培养作为对照8组。
对比例2-9
种子培养方法同实施例2-1，区别在于，以对比例1-9中的培养基对黑莓种子进行培养作为对照9组。
对比例2-10
种子培养方法同实施例2-1，区别在于，以对比例1-10中的培养基对黑莓种子进行培养作为对照10组。
对比例2-11
种子培养方法同实施例2-1，区别在于，以对比例1-11中的培养基对黑莓种子进行培养作为对照11组。
应用例1
(1)分别在培养基培养(即种子培养)的第3天，第10天，第15天，分别统计种子的污染率、褐化率和萌发率；在培养基培养(即种子培养)的第30天统计成苗率、株高和根长。
其中，萌发的标准为2片子叶展开；成苗的标准为至少具有2片真叶。
所述污染率、褐化率、萌发率、成苗率、平均株高和平均根长的计算公式如下：
污染率(％)＝(污染的种子数/接种的总种子数)×100％；
褐化率(％)＝(褐化且未污染的种子数/接种的总种子数)×100％；
萌发率(％)＝(2片子叶展开且未污染的种子数/接种的总种子数)×100％；
成苗率(％)＝(长出2片以上真叶且未污染的种子数/接种的总种子数)×100％；
平均株高＝所有成苗的黑莓株高/成苗的总株数；
平均根长＝所有成苗的黑莓根长/成苗的总株数。
实施例2-1～实施例2-6和对比例2-1～对比例2-11不同培养基培养过程中黑莓种子生长情况如表1所示。
将实施例2-1和实施例2-2及对比例2-1～对比例2-3中的种子进行生根培养30天后的生长情况进行拍照；同时对实施例2-2和对比例2-1的整株进行拍照。
其中，实施例2-1试验1组培养30天时组培苗生长情况如图1所示；实施例2-2试验2组培养30天时组培苗生长情况如图2所示；对比例2-1对照1组培养30天时组培苗生长情况如图3所示；对比例2-2对照2组培养30天时组培苗生长情况如图4所示；对比例2-3对照3组培养30天时组培苗生长情况如图5所示。实施例2-2试验2组培养30天时组培苗整株的生长情况如图6所示，对比例2-1对照1组培养30天时组培苗整株的生长情况如图7所示。
表1黑莓种子在不同培养基中进行种子培养的生长情况
整个培养过程中试验组和对照组的污染率均为0。由表1和图1～图7可得，通过比较试验组和对照组试验黑莓的褐化率、萌发率、成苗率、株高、根长，结果表明无论是PVP还是活性炭，都具有明显的抑制褐化的作用，而活性炭更能促进黑莓解除休眠和生长；通过对比对照4组与试验1组黑莓的萌发率、成苗率、株高、根长，结果表明吸附剂PVP可以显著抑制黑莓种子褐化，并可以提高黑莓的萌发率和成苗率，对黑莓的生长和生根具有一定的促进作用，应该为吸附剂可以吸附一些抑制物质、解除种子的休眠，从而促进黑莓生长；通过对比试验1组与试验2组黑莓的萌发率、成苗率、株高、根长，结果表明吸附剂活性炭也可以显著抑制黑莓种子褐化，并且对黑莓的促生作用要稍优于PVP；通过对比对照3组与对照1组黑莓的萌发率、成苗率、株高、根长，结果表明吸附剂PVP和IBA、NAA联合使用对黑莓的生长和生根具有显著的促进作用，并显著提高成苗率；通过对照2组和对照3组的比较，结果表明相对于IBA、NAA联合使用，GA3能有效地促进种子萌发，而相对于GA3，IBA、NAA联合使用能更有效地促进培养30天的株高和根长。
通过对比实施例2-1和对比例2-2、对比例2-3黑莓的萌发率、成苗率、株高、根长，结果表明GA3、IBA、NAA 3种激素结合使用，解除种子休眠、促进生根和生长的效果比单独使用时更好，能够起到协同增效的技术效果。对照5组是目前常用的树莓种子萌发培养基，通过对比对照5组和实施例2，可以得出增加吸附剂、提高GA3浓度、增加IBA和NAA激素的使用能显著提高对黑莓解除种子休眠、促进生根、生长的效果。
实施例3-1
将实施例2-1生根培养30天的组培幼苗进行炼苗培养。
具体为：将培养30天的“黑怡”组培幼苗从培养基中轻轻取出，用清水洗净根部残留的培养基后，把根系放到含有多菌灵与水的质量比为1:1000和质量浓度为1mg/L IBA混合溶液中速蘸30s；速蘸完成后，将组培幼苗移栽至营养土中，进行炼苗，每组随机选择20株进行移栽。
营养土的组分为体积比为1:1:4的蛭石、珍珠岩和椰糠以及花多多肥料1号。其中花多多肥料1号与水以质量比为1:1000的比例混合稀释后，浇于蛭石、珍珠岩和椰糠的混合体系中，将营养土中的各组分搅拌均匀后使用。
炼苗在人工气候室中进行，炼苗培养的温度25℃、湿度80～90％、光照时间16h/天、光照强度为2000lx。炼苗培养30天时，幼苗生长情况如图8所示。
实施例3-2
炼苗培养方法同实施例3-1，区别在于，将实施例2-2培养得到的组培幼苗进行炼苗培养。
实施例3-3
炼苗培养方法同实施例3-1，区别在于，将实施例2-3培养得到的组培幼苗进行炼苗培养。
实施例3-4
炼苗培养方法同实施例3-1，区别在于，将实施例2-4培养得到的组培幼苗进行炼苗培养。
实施例3-5
炼苗培养方法同实施例3-1，区别在于，将实施例2-5培养得到的组培幼苗进行炼苗培养。
实施例3-6
炼苗培养方法同实施例3-1，区别在于，将实施例2-6培养得到的组培幼苗进行炼苗培养。
对比例3-1
炼苗培养方法同实施例3-1，区别在于，将对比例2-1培养得到的组培幼苗进行炼苗培养。
对比例3-2
炼苗培养方法同实施例3-1，区别在于，将对比例2-2培养得到的组培幼苗进行炼苗培养。
对比例3-3
炼苗培养方法同实施例3-1，区别在于，将对比例2-3培养得到的组培幼苗进行炼苗培养。
对比例3-4
炼苗培养方法同实施例3-1，区别在于，将对比例2-4培养得到的组培幼苗进行炼苗培养。
对比例3-5
炼苗培养方法同实施例3-1，区别在于，将对比例2-5培养得到的组培幼苗进行炼苗培养。
对比例3-6
炼苗培养方法同实施例3-1，区别在于，将对比例2-6培养得到的组培幼苗进行炼苗培养。
对比例3-7
炼苗培养方法同实施例3-1，区别在于，将对比例2-7培养得到的组培幼苗进行炼苗培养。
对比例3-8
炼苗培养方法同实施例3-1，区别在于，将对比例2-8培养得到的组培幼苗进行炼苗培养。
对比例3-9
炼苗培养方法同实施例3-1，区别在于，将对比例2-9培养得到的组培幼苗进行炼苗培养。
对比例3-10
炼苗培养方法同实施例3-1，区别在于，将对比例2-10培养得到的组培幼苗进行炼苗培养。
对比例3-11
炼苗培养方法同实施例3-1，区别在于，将对比例2-11培养得到的组培幼苗进行炼苗培养。
对比例3-12
炼苗培养方式同实施例3-1，区别在于，不在多菌灵与IBA混合溶液中进行速蘸。
对比例3-13
炼苗培养方式同实施例3-1，区别在于，进行速蘸的溶液组成为多菌灵与水的质量比为1:1000，速蘸溶液中不添加IBA。
对比例3-14
炼苗培养方式同实施例3-1，区别在于，进行速蘸的溶液组成为IBA质量浓度为1mg/L，速蘸溶液中不添加多菌灵。
应用例2
炼苗移栽10天后统计成活率。
炼苗成活率的计算公式如下：
炼苗成活率(％)＝(成活的株数/炼苗的总株数)×100％。
实施例3-1～实施例3-6和对比例3-1～对比例3-14进行炼苗培养的炼苗成活率如表2所示。
表2实施例3-1～实施例3-6和对比例3-1～对比例3-14进行炼苗培养的炼苗成活率
| 实验组 | 炼苗成活率(％) |
| 实施例3-1 | 100 |
| 实施例3-2 | 100 |
| 实施例3-3 | 100 |
| 实施例3-4 | 95 |
| 实施例3-5 | 100 |
| 实施例3-6 | 100 |
| 对比例3-1 | 70 |
| 对比例3-2 | 85 |
| 对比例3-3 | 90 |
| 对比例3-4 | 100 |
| 对比例3-5 | 80 |
| 对比例3-6 | 95 |
| 对比例3-7 | 100 |
| 对比例3-8 | 85 |
| 对比例3-9 | 95 |
| 对比例3-10 | 95 |
| 对比例3-11 | 75 |
| 对比例3-12 | 65 |
| 对比例3-13 | 95 |
| 对比例3-14 | 85 |
由表2可得，通过比较对比例3-2和对比例3-1黑莓移栽的成活率，结果表明PVP和GA3联合使用可以提高黑莓成苗后的移栽成活率；通过比较对比例3-3和对比例3-1黑莓移栽的成活率，结果表明PVP和IBA、NAA两种激素混合使用可以提高黑莓成苗后的移栽成活率；通过比较实施例3-1、对比例3-2和对比例3-3黑莓移栽的成活率，结果表明GA3、IBA和NAA三种激素联合使用提高黑莓成苗后的移栽成活率效果最为显著，应该为黑莓在三种激素的联合使用的培养基中生长最佳从而影响移栽成活率；通过比较对比例3-13和对比例3-14黑莓移栽的成活率，结果表明使用多菌灵浸泡可以明显提高黑莓移栽成活率，应该为多菌灵杀死根部的菌，减少了根的腐烂，从而提高成活率；通过比较对比例3-14和对比例3-12黑莓移栽的成活率，结果表明使用IBA浸泡可以明显提高黑莓移栽成活率，应该为IBA促进了根的生长，从而提高成活率；通过比较实施例3-1和对比例3-12～对比例3-14黑莓移栽的成活率，结果表明使用多菌灵和IBA联合使用进行浸泡提高黑莓移栽成活率效果最佳；通过比较所有实施例和对比例移栽前的黑莓苗的长势和移栽的成活率，结果表明移栽时幼苗植株高、根长的黑莓移栽成活率较高，而植株矮、根短的黑莓移栽成活率低，因此一种能促进黑莓幼苗生长和生根的培养基，仍能显著提高幼苗移栽的成活率。
实施例4
对红树莓“红怡”种子进行培养，培养方法同实施例2-2，采用实施例1-2中的培养基对树莓种子进行培养。
对比例4
对红树莓“红怡”种子进行培养，培养方法同对比例2-1，采用对比例1-1中的培养基对树莓种子进行培养。
应用例3
(1)分别在培养基培养(即种子培养)的第3天，第10天，第15天，分别统计种子的污染率、褐化率和萌发率；在培养基培养(即种子培养)的第30天统计成苗率、株高和根长。
其中，萌发的标准为2片子叶展开；成苗的标准为至少具有2片真叶。
所述污染率、褐化率、萌发率、成苗率、平均株高和平均根长的计算公式同上。
实施例4和对比例4不同培养基培养过程中树莓种子萌发情况如表3所示。
将实施例4和对比例4进行生根培养30天后的生长情况进行拍照；同时对实施例4和对比例4的整株进行拍照。
其中，实施例4培养30天时组培苗生长情况如图9所示；对比例4培养30天时组培苗生长情况如图10所示。
表3实施例4和对比例4的树莓种子在不同培养基中进行种子培养的种子生长情况
整个培养过程中试验组和对照组的污染率均为0。由表3和图9～图10可得，本发明优选的最佳培养基不仅对黑莓有打破休眠和促进生长作用，对树莓也能显著抑制种子褐化率，并提高种子萌发率和成苗率、促进植株和根生长。
实施例5
将实施例4培养得到的组培幼苗进行炼苗培养，炼苗培养方法同实施例3-1，区别在于，移栽株数为15株。炼苗培养30天时，幼苗生长情况如图11所示。
对比例5
将对比例4培养得到的组培幼苗进行炼苗培养，炼苗培养方法同实施例3-1，区别在于，移栽株数为15株。
应用例4
炼苗移栽10天后统计成活率。
炼苗成活率的计算公式同上。
实施例5和对比例5进行炼苗培养的炼苗成活率如表4所示。
表4实施例5和对比例5进行炼苗培养的炼苗成活率
| 实验组 | 炼苗成活率(％) |
| 实施例5 | 93.33 |
| 对比例5 | 60 |
由表4可得，通过比较实施例5和对比例5树莓移栽的成活率，结果表明GA3、IBA和NAA三种激素混合使用同样也可以明显提高树莓成苗后的移栽成活率。
综上所述，本发明提供的培养基和培养方法对悬钩子属进行培养可以显著提高生根和生长速度，促进种子萌发，提高种子萌发率，缩短种子萌发时间等。采用本发明提供的培养基进行悬钩子属种子培育，解决了悬钩子属植物种子因体积小和内果皮厚而导致的萌发率低、萌发周期长、苗势弱等关键问题，为黑莓杂交育种子代成苗、种子组培体系建立、组培幼苗移栽炼苗等研究奠定了坚实的技术基础。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
Claims (10)
1.一种促进悬钩子属种子萌发的培养基，其特征在于，所述培养基以1/2MS培养基为基础培养基，还包括以下质量浓度的组分：0.5～1.5g/LPVP或0.2～0.5g/L活性炭、0.3～0.8mg/L GA3、0.02～0.07mg/L IBA、0.02～0.07mg/LNAA、20～30g/L蔗糖和5.5～6.5g/L琼脂；
所述培养基的pH为5.85～5.95。
2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述培养基以1/2MS培养基为基础培养基，还包括以下质量浓度的组分：0.3g/L活性炭、0.6mg/L GA3、0.05mg/LIBA、0.05mg/LNAA、20g/L蔗糖和6g/L琼脂；
所述培养基的pH为5.9。
3.一种促进悬钩子属种子萌发的方法，其特征在于，包括如下步骤：
将悬钩子属种子进行切割，得到露出种胚的种子；
将露出种胚的种子接种于权利要求1或2所述的培养基中进行培养。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述培养的时间为25～40d；所述培养依次包括暗培养和光培养；
所述暗培养的时间为7～10d；所述暗培养的温度为24℃～26℃；
所述光培养的温度为24℃～26℃；所述光培养的光照强度为500～1500lx；所述光培养的光照时间为14h/d～16h/d。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述消毒的试剂包括次氯酸钠水溶液；所述消毒的时间为0.8～1.2h。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述切割包括将种子从中间切开；或者将种子在近胚乳端切开。
7.一种组培幼苗育苗的方法，其特征在于，包括以下步骤：
将权利要求3～6任一项所述方法培养得到的组培幼苗根系于多菌灵和IBA混合溶液中进行速蘸，得到预处理组培幼苗；
将所述预处理组培幼苗移栽于营养土中进行炼苗。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述混合溶液中，多菌灵与水的质量比为1:(1000～2000)；IBA的质量浓度为0.5～1mg/L；所述速蘸的时间为20～40s。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述营养土包括蛭石、珍珠岩和椰糠；所述蛭石、珍珠岩和椰糠的体积比为1:(1～1.5):(3～4)；所述营养土中还包括花多多速溶肥。
10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，炼苗时环境的温度为24℃～26℃；环境湿度为80～90％；光照强度为1000～2000lx；光照时间为14h/d～16h/d。
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