CN102830002B - 一种黄连木芽染色体制片的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种黄连木芽染色体制片的方法，采用0.002mol/L的8-羟基喹啉溶液进行低温预处理；卡诺氏固定液固定；2%纤维素酶30℃水浴锅中酶解40min，再用卡诺氏固定液固定20min，1mol/L盐酸60℃水浴中解离5min，用蒸馏水漂洗；将组织块切割成碎块，卡宝品红染色剂染色15min；压片法制片，镜检，在OLYMPUSCX/MD50显微摄影装置下进行显微照相。本发明的制片方法操作简单方便，确定了进行黄连木芽染色体制片的最佳取材时间、取材部位以及制片方法，使获得的染色体分散均匀，背景浅，易于观察，得出的染色体数目准确度高。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种黄连木芽染色体制片的方法。
背景技术
黄连木(Pistacia chinensis Bunge)原产我国，它雌雄异株，又名楷木、楷树等，属于漆树科黄连木属落叶乔木。它耐干旱、盐碱、瘠薄，适应性强，分布范围广，是一种优良的绿化、用材、观赏、药用和油料树种。黄连木果实含油量35%，是制取生物柴油的上佳原料，已被专家列为未来20年最具有发展潜力的生物柴油原料树种之一，对解决目前及将来的能源危机具有重要的作用。
目前在我国掀起了有关黄连木研究的热潮，现有技术中采用先直接酸解或先酸解再酶解的做法使得染色体分散不均；此外由于黄连木的染色体微小，只有1-2 μm，而现有技术中水解时间控制不当，当水解时间不足时，染色质也着色，会使反差降低；而水解时间过长，细胞质虽不着色，染色体染色也会较淡，无法清晰观察到黄连木的染色体形态及数目。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，找到一种操作简单方便的黄连木芽染色体的制片方法，使获得的染色体分散均匀，背景浅，易于观察，得出的染色体数目准确度高。
本发明提供的技术方案如下：
A、取材：每年四月中上旬上午9-10时取黄连木树上新生的嫩芽，沿嫩芽腹线纵向切割成两部分作为材料；
B、预处理：将切割好的嫩芽用蒸馏水清洗干净，再用吸水纸吸干水分，之后放入浓度为0.002 mol/L的8-羟基喹啉溶液中，放到暗处预处理2 h 50 min；
C、固定：将预处理后的嫩芽用吸水纸吸干，除去残余的预处理液后放入卡诺氏Ⅰ固定液中，在4℃冰箱中固定2 h 20 min，固定好后的材料转入70%乙醇中保存备用；
D、酶解：将固定好的嫩芽用蒸馏水漂洗3次，每次10 min，吸干水分后放入2%纤维素酶溶液中，之后放入30℃水浴锅中酶解40 min；
E、再固定：将酶解后的嫩芽再用卡诺氏Ⅰ固定液固定20 min；
F、解离：将再固定后的材料放入1 mol/L盐酸溶液中，然后放在60℃水浴锅中解离5 min，解离后用蒸馏水漂洗2次，每次5 min；
G、染色：将解离后的嫩芽置于载玻片上，取出呈现乳白色的组织块，用吸水纸吸干组织块周围的水分，再用解剖刀将取下的组织块切割成碎块，滴入1-2滴卡宝品红染色剂，染色15 min，然后用蒸馏水漂洗干净；
H、压片：将材料重新移至载玻片上，捣碎组织块，并使其均匀分散在载玻片上，盖上盖玻片，置于酒精灯上微热，使细胞进一步软化和增强染色，静置片刻，在盖玻片上放一张滤纸，并用左手食指压紧，右手持带橡皮的铅笔的橡皮头端先轻后重的敲击盖片，使细胞压平，然后放置在平整的桌面上，用拇指压紧盖玻片；
I、镜检：将压片置于生物显微镜下观察，选择染色体分散、清晰的细胞在显微摄影装置下进行显微照相，以便进行染色体计数，同时可用记号笔在载玻片和盖玻片上分别做记号,以便再次观察和照相方便查找。
本发明的有益效果是：本发明提供了一种适宜黄连朩芽染色体制片的方法，先用2%纤维素酶溶液将固定好的嫩芽酶解，去掉细胞壁纤维，使细胞分散好，也使染色体分散空间更大。再通过将预处理后的嫩芽放在卡诺氏Ⅰ固定液中，在4℃冰箱中固定，保留了分裂图象，呈现出染色体真实形态及结构。然后将再固定后的材料放入1 mol/L盐酸溶液中，在60℃水浴锅中酸解，可以使分生区组织细胞间的果胶质分解，细胞壁软化或部分分解，使细胞和染色体容易压平。通过采用先酶解再固定最后酸解的方法使得染色体分散均匀；通过HCl水解时间严密的控制，使得染色体和背景颜色反差较大，能够简便、清晰的观察到黄连木的染色体。采用本方法制片得出的黄连木染色体清晰，准确度较高，为后续的核型分析、G带、C带分析等细胞生物学研究打下基础，对于了解黄连木的遗传背景，进而进行有选择的杂交育种具有重要的意义，同时对黄连木细胞遗传学的理论研究也具有重要的意义。
附图说明
图1是黄连木(Pistacia chinensis Bunge)的染色体在OLYMPUS CX/MD50（10×100）显微摄影装置照相示意图。
具体实施方式
下面对本发明的实施例做详细说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1
成功观察并统计出了黄连木芽染色体的数目
A、取材：采取黄连木树上新生的嫩芽，沿嫩芽腹线纵向切割成两部分；
B、预处理：将切割好的用蒸馏水清洗干净，吸水纸吸干水分后放入浓度为0.002 mol/L的8-羟基喹啉溶液中，在暗处预处理2 h 50 min；
C、固定：将预处理过的嫩芽用吸水纸吸干，除去残余的预处理液后放入卡诺氏Ⅰ固定液中，在4℃冰箱中固定2 h20 min，固定好后的材料转入70%乙醇中保存备用；
D、酶解：将固定好的嫩芽用蒸馏水漂洗3次，每次10 min，吸干水分后放入2%纤维素酶溶液中，在30℃水浴锅中酶解40 min；
E、再固定：酶解后的嫩芽再用卡诺氏Ⅰ固定液固定20 min；
F、解离：将在固定后的材料用1 mol/L盐酸60℃水浴锅中解离5 min，解离后用蒸馏水漂洗2次，每次5 min；
G、染色：将解离后的嫩芽置于载玻片上，用尖头镊子挑选呈现出乳白色的组织块，用吸水纸吸干组织块周围的水分，解剖刀切割成碎块，滴入2滴卡宝品红染色剂，染色15 min；
H、压片：将材料重新移至载玻片上，用尖头镊子的后端捣碎组织块，并使其均匀分散，盖上盖玻片；置于酒精灯上微热，使细胞进一步软化和增强染色；静置片刻，在盖玻片上放一张滤纸，并用左手食指压紧，右手持带橡皮的铅笔的橡皮头端先轻后重的敲击盖片，使细胞压平，放置在平整的桌面上，用大拇指压紧盖玻片；
I、镜检：将压片置于XSP-35生物显微镜下观察镜检，选择染色体分散、清晰的细胞在OLYMPUS CX/MD50显微摄影装置下进行显微照相，以便进行染色体计数。同时可用记号笔在载玻片和盖玻片上分别做记号，以便再次观察和照相，镜检结果见图1。
上述实施例结果表明，本方法是一种有效的黄连木芽染色体制片的方法，并且该制片方法操作简单方便，染色体分散均匀且背景较浅，染色体数目容易计数，采用本方法制片得出的染色体数目准确度高。
Claims (1)
1.一种黄连木芽染色体制片的方法，其特征是：
A、取材：每年四月中上旬上午9-10时取黄连木树上新生的嫩芽，沿嫩芽腹线切割成两部分；
B、预处理：将切割好的嫩芽用蒸馏水清洗干净，吸水纸吸干水分后放入浓度为0.002 mol/L的8-羟基喹啉溶液中，在暗处预处理2 h 50 min；
C、固定：将预处理后的嫩芽用吸水纸吸干，除去残余的预处理液后放入卡诺氏Ⅰ固定液中，在4℃冰箱中固定2 h 20 min，固定好后的材料转入70%乙醇中保存备用；
D、酶解：将固定好的嫩芽用蒸馏水漂洗3次，每次10 min，吸干水分后放入2%纤维素酶溶液中，在30℃水浴锅中酶解40 min；
E、再固定：将酶解后的嫩芽再用卡诺氏Ⅰ固定液固定20 min；
F、解离：将再固定后的材料放入1 mol/L盐酸溶液中，在60℃水浴锅中解离5 min，解离后用蒸馏水漂洗2次，每次5 min；
G、染色：将解离后的嫩芽置于载玻片上，取呈现出乳白色的组织块，用吸水纸吸干组织块周围的水分，用解剖刀将取下的组织块切割成碎块，滴入1-2滴卡宝品红染色剂，染色15 min，然后用蒸馏水漂洗；
H、压片：将材料重新移至载玻片上，捣碎组织块，并使其均匀分散在载玻片上，盖上盖玻片，置于酒精灯上微热，使细胞进一步软化和增强染色，静置片刻，在盖玻片上放一张滤纸，并用左手食指压紧，右手持带橡皮的铅笔的橡皮头端先轻后重的敲击盖片，使细胞压平，然后放置在平整的桌面上，用拇指压紧盖玻片；
I、镜检：将压片置于生物显微镜下观察，选择染色体分散、清晰的细胞在显微摄影装置下进行显微照相，以便进行染色体计数，同时用记号笔在载玻片和盖玻片上分别做记号。
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