CN103103254B - 一种鉴定鲤鱼基因拷贝数的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公布了一种鉴定鲤鱼基因拷贝数的方法，包括以下步骤：（1）提取鲤鱼总DNA；（2）选取已知的鲤鱼单、双拷贝基因作为对照基因，设计其定量PCR引物，并设计目的基因的定量PCR引物；（3）以鲤鱼总DNA为模板，以单、双拷贝对照基因引物和目的基因的定量PCR引物为引物进行实时定量PCR；（4）比较目的基因和对照基因的扩增曲线，确定目的基因的拷贝数。运用本发明所述的方法，可以在分子水平快速准确地鉴定目的基因的单双拷贝数，为鲤鱼染色体间遗传物质交流或分子育种等研究提供直接、有效的分子证据。
Description
技术领域
本发明属于鱼类生物技术领域，涉及一种鉴定鲤鱼基因拷贝数的方法。
背景技术
鲤鱼(Cyprinus carpio L ．)是世界性重要的淡水养殖鱼类，分布广，养殖历史悠久。鲤鱼染色体数目 (2n=100)是大部分鲤科鱼类染色体数目 (2n=42~50)的两倍左右，因此科学家认为鲤鱼是四倍体，上世纪90年代始，鲤鱼微卫星及功能基因分离中，均发现基因数为鲤科模式鱼、斑马鱼等两倍体鱼的2倍，如鲤鱼存在两个POMC基因位点，此外肌肉抑制素 (MSTNs)、生长激素受体 (GHRs)、生长激素促泌素受体 (GHS-Rs)等时也发现类似情况，这些说明鲤鱼进化过程中存在染色体四倍化过程，而且两套染色体存在一定的差异，可以推测鲤鱼物种的形成是由两种遗传距离相近的鱼杂交后染色体加倍形成的，也有可能鱼类性细胞中存在的比例很少的两倍体性细胞杂交的结果。以鲤鱼DNA为模板，应用荧光定量PCR的分析，可以快速、准确地鉴定鲤鱼体内基因拷贝数，确定目的基因为单拷贝基因或双拷贝基因，为鲤鱼染色体间遗传物质交流或分子育种等研究提供直接、有效的分子证据。
发明内容
本发明的目的是提供一种鉴定鲤鱼基因拷贝数的方法，有助于快速、准确鉴定目的基因为单拷贝基因或双拷贝基因，在鲤鱼分子育种过程中如分子标记的筛选具有重要的指导意义。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种鉴定鲤鱼基因拷贝数的方法，包括以下步骤：
（1）提取鲤鱼总DNA；
（2）选取已知的鲤鱼单、双拷贝基因作为对照基因，设计其定量PCR引物，并设计目的基因的定量PCR引物；
（3）以鲤鱼总DNA为模板，以单、双拷贝对照基因引物和目的基因的定量PCR引物为引物进行实时定量PCR；
（4）比较目的基因和对照基因的扩增曲线，确定目的基因的拷贝数。
步骤（2）中，所述对照基因可为任何已知的鲤鱼基因，可以是不同的基因，也可以是同一种基因的不同拷贝数。若为同一种基因的不同拷贝数，设计的每对引物必须只能扩增出一种唯一拷贝数的基因，如本实验室已分离的肌肉抑制素基因（MSTN）的单拷贝基因MSTN2a，定量PCR引物M2aF：CCACAGAACGTAAGTACCAAGATGC，M2aR： GCTGAAT
GAATGAACCACTATTGTGG；双拷贝基因MSTN2s，定量PCR引物M2sF：GCATCTGTGACGACTGGAGACGAC，M2sR：GATGGTCTCACTGCTGCCTTGTTC。
步骤（3）中， 实时定量PCR反应总体积20 µL, 内含2 µL cDNA模板，引物各0.8 µL (引物浓度10 µmol/L)，反应条件：95℃ 30sec，95℃ 5sec，61℃ 30 sec，40个循环， Tm曲线。
步骤（4）中，确定目的基因的拷贝数的方法为：若目的基因的扩增曲线与单拷贝对照基因的扩增曲线基本重合，则为单拷贝基因；若目的基因的扩增曲线与双拷贝对照基因的扩增曲线基本重合，则为双拷贝基因。
运用本发明所述的方法，可以在分子水平快速准确地鉴定目的基因的单双拷贝数，为鲤鱼染色体间遗传物质交流或分子育种等研究提供直接、有效的分子证据。
附图说明
图1为1号个体原液DNA为模板的实时定量PCR扩增曲线图；
图2为2号个体5倍稀释液为模板的实时定量PCR扩增曲线图；
图3为3号个体125倍稀释液为模板的实时定量PCR扩增曲线图；
其中：a为双拷贝对照MSTN2s基因
b为PRKAG3II基因
c为GH1a基因
d为单拷贝对照MSTN2a基因
具体实施方式：
下列以生长激素基因GH1a与PRKAG3 II(protein kinase,
AMP-activated, gamma 3 subunit gene,一磷酸腺苷蛋白激酶γ3基因)为例，对发明的方案做进一步地说明，但不构成对本发明的限制。
实施例中基因组DNA的提取均使用鲤鱼尾静脉采血，AxyPrep血基因组DNA小量试剂盒 (Axygen)进行，以保证模板DNA的质量。
实施例1
随机取鲤鱼1尾（1号个体），尾静脉采血，使用AxyPrep血基因组DNA小量试剂盒 (Axygen)严格按照说明书来抽提基因组DNA。单拷贝对照基因MSTN2a，定量PCR引物M2aF：CCACAGAACGTAAGTACCAAGATGC，M2aR： GCTGAAT
GAATGAACCACTATTGTGG；双拷贝对照基因MSTN2s，定量PCR引物M2sF：GCATCTGTGACGACTGGAGACGAC，M2sR：GATGGTCTCACTGCTGCCTTGTTC。目的基因GH1a定量PCR引物GF：GTGAAATGTGCTTAGGACTCACCTGT，GR：CTTCTGTGTTTCA TCTTTTCCAGCA；目的基因PRKAG3定量PCR引物PF：AGGACACCATCCGTCATCTCATTAG，PR：GCAGACA GCCATTAACTTGAGCTC。摸索各对引物的最佳退火温度，以温度变化1℃时Ct值基本一致为标准。实时定量PCR反应总体积20 µL, 内含2 µL原液DNA模板，单、双拷贝对照基因MSTN2a、MSTN2s引物及目的基因GH1a、PRKAG3II引物各0.8 µL (引物浓度10 µmol/L)，反应条件：95℃ 30sec，95℃ 5sec， 61℃ 30 sec，40个循环，Tm曲线。使用TAKARA SYBR®Premix Ex
TaqTM II试剂盒，在mini-BIO-RAD定量PCR仪进行实时定量PCR。扩增曲线如图1所示，目的基因GH1a的扩增曲线与单拷贝对照基因MSTN2a的扩增曲线基本重合，为单拷贝基因；目的基因PRKAG3II的扩增曲线与双拷贝对照基因MSTN2s的扩增曲线基本重合，为双拷贝基因。
实施例2
随机取鲤鱼1尾（2号个体），尾静脉采血，使用AxyPrep血基因组DNA小量试剂盒 (Axygen)严格按照说明书来抽提基因组DNA，并在超净台上对所抽提DNA进行5倍梯度稀释用于定量PCR的模板。使用如实施例1中相同的引物及方法，进行实时定量PCR。所得扩增曲线如图2所示，5倍稀释DNA为模板的定量结果与原液DNA为模板的扩增结果一致，目的基因GH1a的扩增曲线与单拷贝对照基因MSTN2a的扩增曲线基本重合，为单拷贝基因；目的基因PRKAG3II的扩增曲线与双拷贝对照基因MSTN2s的扩增曲线基本重合，为双拷贝基因。
实施例3
随机取鲤鱼1尾（3号个体），尾静脉采血，使用AxyPrep血基因组DNA小量试剂盒 (Axygen)严格按照说明书来抽提基因组DNA，并在超净台上对所抽提DNA进行125倍梯度稀释用于定量PCR的模板。使用如实施例1中相同的引物及方法，进行实时定量PCR。所得扩增曲线如图3所示，125倍稀释DNA为模板的定量结果与原液及5倍稀释的DNA为模板的扩增结果一致，目的基因GH1a的扩增曲线与单拷贝对照基因MSTN2a的扩增曲线基本重合，为单拷贝基因；目的基因PRKAG3II的扩增曲线与双拷贝对照基因MSTN2s的扩增曲线基本重合，为双拷贝基因。
Claims (1)
1.一种鉴定鲤鱼基因拷贝数的方法，包括以下步骤：
（1）提取鲤鱼总DNA；
（2）选取已知的鲤鱼单、双拷贝基因作为对照基因，设计其定量PCR引物，并设计目的基因的定量PCR引物；
（3）以鲤鱼总DNA为模板，以单、双拷贝对照基因引物和目的基因的定量PCR引物为引物进行实时定量PCR；
（4）比较目的基因和对照基因的扩增曲线，若目的基因的扩增曲线与单拷贝对照基因的扩增曲线基本重合，则为单拷贝基因；若目的基因的扩增曲线与双拷贝对照基因的扩增曲线基本重合，则为双拷贝基因；
其特征在于：所述步骤（2）中，所述对照基因为MSTN，其单拷贝定量PCR引物为：M2aF：CCACAGAACGTAAGTACCAAGATGC，M2aR：GCTGAATGAATGAACCACTATTGTGG；其双拷贝定量PCR引物为M2sF：GCATCTGTGACGACTGGAGACGAC，M2sR：GATGGTCTCACTGCTGCCTTGTTC。
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