CN103103254B - 一种鉴定鲤鱼基因拷贝数的方法 - Google Patents
一种鉴定鲤鱼基因拷贝数的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103103254B CN103103254B CN201210440095.XA CN201210440095A CN103103254B CN 103103254 B CN103103254 B CN 103103254B CN 201210440095 A CN201210440095 A CN 201210440095A CN 103103254 B CN103103254 B CN 103103254B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- gene
- copy
- quantitative pcr
- carp
- target gene
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 89
- 241000252233 Cyprinus carpio Species 0.000 title claims abstract description 28
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 16
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims abstract description 30
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims abstract description 30
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 claims abstract description 21
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 claims abstract description 11
- 101150014408 MINDY3 gene Proteins 0.000 claims description 24
- 101100005010 Mus musculus Ca8 gene Proteins 0.000 claims description 24
- 101150111716 ankrd1 gene Proteins 0.000 claims description 24
- 102100039939 Growth/differentiation factor 8 Human genes 0.000 claims description 4
- 108050006583 Growth/differentiation factor 8 Proteins 0.000 claims description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 3
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 abstract description 7
- 238000009395 breeding Methods 0.000 abstract description 4
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 abstract description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 abstract description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 abstract 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 abstract 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 20
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 8
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 8
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 5
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 4
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 3
- 241000252210 Cyprinidae Species 0.000 description 2
- 102000000393 Ghrelin Receptors Human genes 0.000 description 2
- 108010016122 Ghrelin Receptors Proteins 0.000 description 2
- 102100020948 Growth hormone receptor Human genes 0.000 description 2
- 101000760977 Homo sapiens 5'-AMP-activated protein kinase subunit gamma-3 Proteins 0.000 description 2
- 108010056852 Myostatin Proteins 0.000 description 2
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 description 2
- 108010068542 Somatotropin Receptors Proteins 0.000 description 2
- VEGOPIRPQIZFRD-UVHWXNHCSA-N [(2s,3r,4r,5r,6s)-3,4,5-trihydroxy-6-methyloxan-2-yl] (e)-3-(4-hydroxyphenyl)prop-2-enoate Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](C)O[C@H]1OC(=O)\C=C\C1=CC=C(O)C=C1 VEGOPIRPQIZFRD-UVHWXNHCSA-N 0.000 description 2
- UDMBCSSLTHHNCD-KQYNXXCUSA-N adenosine 5'-monophosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O UDMBCSSLTHHNCD-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 108060006633 protein kinase Proteins 0.000 description 2
- 102100024628 5'-AMP-activated protein kinase subunit gamma-3 Human genes 0.000 description 1
- UDMBCSSLTHHNCD-UHFFFAOYSA-N Coenzym Q(11) Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(O)=O)C(O)C1O UDMBCSSLTHHNCD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000252212 Danio rerio Species 0.000 description 1
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 description 1
- 102000018997 Growth Hormone Human genes 0.000 description 1
- 108091092878 Microsatellite Proteins 0.000 description 1
- 101150093308 POMC gene Proteins 0.000 description 1
- 208000035199 Tetraploidy Diseases 0.000 description 1
- LNQVTSROQXJCDD-UHFFFAOYSA-N adenosine monophosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(CO)C(OP(O)(O)=O)C1O LNQVTSROQXJCDD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 210000001840 diploid cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000009313 farming Methods 0.000 description 1
- 239000013505 freshwater Substances 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公布了一种鉴定鲤鱼基因拷贝数的方法，包括以下步骤：（1）提取鲤鱼总DNA；（2）选取已知的鲤鱼单、双拷贝基因作为对照基因，设计其定量PCR引物，并设计目的基因的定量PCR引物；（3）以鲤鱼总DNA为模板，以单、双拷贝对照基因引物和目的基因的定量PCR引物为引物进行实时定量PCR；（4）比较目的基因和对照基因的扩增曲线，确定目的基因的拷贝数。运用本发明所述的方法，可以在分子水平快速准确地鉴定目的基因的单双拷贝数，为鲤鱼染色体间遗传物质交流或分子育种等研究提供直接、有效的分子证据。
Description
技术领域
本发明属于鱼类生物技术领域，涉及一种鉴定鲤鱼基因拷贝数的方法。
背景技术
鲤鱼(Cyprinus carpio L ．)是世界性重要的淡水养殖鱼类，分布广，养殖历史悠久。鲤鱼染色体数目 (2n=100)是大部分鲤科鱼类染色体数目 (2n=42~50)的两倍左右，因此科学家认为鲤鱼是四倍体，上世纪90年代始，鲤鱼微卫星及功能基因分离中，均发现基因数为鲤科模式鱼、斑马鱼等两倍体鱼的2倍，如鲤鱼存在两个POMC基因位点，此外肌肉抑制素 (MSTNs)、生长激素受体 (GHRs)、生长激素促泌素受体 (GHS-Rs)等时也发现类似情况，这些说明鲤鱼进化过程中存在染色体四倍化过程，而且两套染色体存在一定的差异，可以推测鲤鱼物种的形成是由两种遗传距离相近的鱼杂交后染色体加倍形成的，也有可能鱼类性细胞中存在的比例很少的两倍体性细胞杂交的结果。以鲤鱼DNA为模板，应用荧光定量PCR的分析，可以快速、准确地鉴定鲤鱼体内基因拷贝数，确定目的基因为单拷贝基因或双拷贝基因，为鲤鱼染色体间遗传物质交流或分子育种等研究提供直接、有效的分子证据。
发明内容
本发明的目的是提供一种鉴定鲤鱼基因拷贝数的方法，有助于快速、准确鉴定目的基因为单拷贝基因或双拷贝基因，在鲤鱼分子育种过程中如分子标记的筛选具有重要的指导意义。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种鉴定鲤鱼基因拷贝数的方法，包括以下步骤：
（1）提取鲤鱼总DNA；
（2）选取已知的鲤鱼单、双拷贝基因作为对照基因，设计其定量PCR引物，并设计目的基因的定量PCR引物；
（3）以鲤鱼总DNA为模板，以单、双拷贝对照基因引物和目的基因的定量PCR引物为引物进行实时定量PCR；
（4）比较目的基因和对照基因的扩增曲线，确定目的基因的拷贝数。
步骤（2）中，所述对照基因可为任何已知的鲤鱼基因，可以是不同的基因，也可以是同一种基因的不同拷贝数。若为同一种基因的不同拷贝数，设计的每对引物必须只能扩增出一种唯一拷贝数的基因，如本实验室已分离的肌肉抑制素基因（MSTN）的单拷贝基因MSTN2a，定量PCR引物M2aF：CCACAGAACGTAAGTACCAAGATGC，M2aR： GCTGAAT
GAATGAACCACTATTGTGG；双拷贝基因MSTN2s，定量PCR引物M2sF：GCATCTGTGACGACTGGAGACGAC，M2sR：GATGGTCTCACTGCTGCCTTGTTC。
步骤（3）中， 实时定量PCR反应总体积20 µL, 内含2 µL cDNA模板，引物各0.8 µL (引物浓度10 µmol/L)，反应条件：95℃ 30sec，95℃ 5sec，61℃ 30 sec，40个循环， Tm曲线。
步骤（4）中，确定目的基因的拷贝数的方法为：若目的基因的扩增曲线与单拷贝对照基因的扩增曲线基本重合，则为单拷贝基因；若目的基因的扩增曲线与双拷贝对照基因的扩增曲线基本重合，则为双拷贝基因。
运用本发明所述的方法，可以在分子水平快速准确地鉴定目的基因的单双拷贝数，为鲤鱼染色体间遗传物质交流或分子育种等研究提供直接、有效的分子证据。
附图说明
图1为1号个体原液DNA为模板的实时定量PCR扩增曲线图；
图2为2号个体5倍稀释液为模板的实时定量PCR扩增曲线图；
图3为3号个体125倍稀释液为模板的实时定量PCR扩增曲线图；
其中：a为双拷贝对照MSTN2s基因
b为PRKAG3II基因
c为GH1a基因
d为单拷贝对照MSTN2a基因
具体实施方式：
下列以生长激素基因GH1a与PRKAG3 II(protein kinase,
AMP-activated, gamma 3 subunit gene,一磷酸腺苷蛋白激酶γ3基因)为例，对发明的方案做进一步地说明，但不构成对本发明的限制。
实施例中基因组DNA的提取均使用鲤鱼尾静脉采血，AxyPrep血基因组DNA小量试剂盒 (Axygen)进行，以保证模板DNA的质量。
实施例1
随机取鲤鱼1尾（1号个体），尾静脉采血，使用AxyPrep血基因组DNA小量试剂盒 (Axygen)严格按照说明书来抽提基因组DNA。单拷贝对照基因MSTN2a，定量PCR引物M2aF：CCACAGAACGTAAGTACCAAGATGC，M2aR： GCTGAAT
GAATGAACCACTATTGTGG；双拷贝对照基因MSTN2s，定量PCR引物M2sF：GCATCTGTGACGACTGGAGACGAC，M2sR：GATGGTCTCACTGCTGCCTTGTTC。目的基因GH1a定量PCR引物GF：GTGAAATGTGCTTAGGACTCACCTGT，GR：CTTCTGTGTTTCA TCTTTTCCAGCA；目的基因PRKAG3定量PCR引物PF：AGGACACCATCCGTCATCTCATTAG，PR：GCAGACA GCCATTAACTTGAGCTC。摸索各对引物的最佳退火温度，以温度变化1℃时Ct值基本一致为标准。实时定量PCR反应总体积20 µL, 内含2 µL原液DNA模板，单、双拷贝对照基因MSTN2a、MSTN2s引物及目的基因GH1a、PRKAG3II引物各0.8 µL (引物浓度10 µmol/L)，反应条件：95℃ 30sec，95℃ 5sec， 61℃ 30 sec，40个循环，Tm曲线。使用TAKARA SYBR®Premix Ex
TaqTM II试剂盒，在mini-BIO-RAD定量PCR仪进行实时定量PCR。扩增曲线如图1所示，目的基因GH1a的扩增曲线与单拷贝对照基因MSTN2a的扩增曲线基本重合，为单拷贝基因；目的基因PRKAG3II的扩增曲线与双拷贝对照基因MSTN2s的扩增曲线基本重合，为双拷贝基因。
实施例2
随机取鲤鱼1尾（2号个体），尾静脉采血，使用AxyPrep血基因组DNA小量试剂盒 (Axygen)严格按照说明书来抽提基因组DNA，并在超净台上对所抽提DNA进行5倍梯度稀释用于定量PCR的模板。使用如实施例1中相同的引物及方法，进行实时定量PCR。所得扩增曲线如图2所示，5倍稀释DNA为模板的定量结果与原液DNA为模板的扩增结果一致，目的基因GH1a的扩增曲线与单拷贝对照基因MSTN2a的扩增曲线基本重合，为单拷贝基因；目的基因PRKAG3II的扩增曲线与双拷贝对照基因MSTN2s的扩增曲线基本重合，为双拷贝基因。
实施例3
随机取鲤鱼1尾（3号个体），尾静脉采血，使用AxyPrep血基因组DNA小量试剂盒 (Axygen)严格按照说明书来抽提基因组DNA，并在超净台上对所抽提DNA进行125倍梯度稀释用于定量PCR的模板。使用如实施例1中相同的引物及方法，进行实时定量PCR。所得扩增曲线如图3所示，125倍稀释DNA为模板的定量结果与原液及5倍稀释的DNA为模板的扩增结果一致，目的基因GH1a的扩增曲线与单拷贝对照基因MSTN2a的扩增曲线基本重合，为单拷贝基因；目的基因PRKAG3II的扩增曲线与双拷贝对照基因MSTN2s的扩增曲线基本重合，为双拷贝基因。
Claims (1)
1.一种鉴定鲤鱼基因拷贝数的方法，包括以下步骤：
（1）提取鲤鱼总DNA；
（2）选取已知的鲤鱼单、双拷贝基因作为对照基因，设计其定量PCR引物，并设计目的基因的定量PCR引物；
（3）以鲤鱼总DNA为模板，以单、双拷贝对照基因引物和目的基因的定量PCR引物为引物进行实时定量PCR；
（4）比较目的基因和对照基因的扩增曲线，若目的基因的扩增曲线与单拷贝对照基因的扩增曲线基本重合，则为单拷贝基因；若目的基因的扩增曲线与双拷贝对照基因的扩增曲线基本重合，则为双拷贝基因；
其特征在于：所述步骤（2）中，所述对照基因为MSTN，其单拷贝定量PCR引物为：M2aF：CCACAGAACGTAAGTACCAAGATGC，M2aR：GCTGAATGAATGAACCACTATTGTGG；其双拷贝定量PCR引物为M2sF：GCATCTGTGACGACTGGAGACGAC，M2sR：GATGGTCTCACTGCTGCCTTGTTC。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201210440095.XA CN103103254B (zh) | 2012-11-07 | 2012-11-07 | 一种鉴定鲤鱼基因拷贝数的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201210440095.XA CN103103254B (zh) | 2012-11-07 | 2012-11-07 | 一种鉴定鲤鱼基因拷贝数的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN103103254A CN103103254A (zh) | 2013-05-15 |
| CN103103254B true CN103103254B (zh) | 2014-08-20 |
Family
ID=48311445
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201210440095.XA Expired - Fee Related CN103103254B (zh) | 2012-11-07 | 2012-11-07 | 一种鉴定鲤鱼基因拷贝数的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN103103254B (zh) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111218478A (zh) * | 2020-02-12 | 2020-06-02 | 湖南文理学院 | 一种Tol2转座子介导的转基因鱼纯系建立方法 |
| CN113981104B (zh) * | 2021-09-24 | 2024-07-09 | 华南农业大学 | 苏氏圆腹鲶生长性状相关的snp分子标记及其应用 |
| CN117265085A (zh) * | 2023-10-18 | 2023-12-22 | 华中农业大学 | 一种鉴别中国甜柿基因型的方法 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102534039A (zh) * | 2012-02-28 | 2012-07-04 | 中国科学院水生生物研究所 | 一种转基因鱼纯合子的快速鉴定方法及应用 |
-
2012
- 2012-11-07 CN CN201210440095.XA patent/CN103103254B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102534039A (zh) * | 2012-02-28 | 2012-07-04 | 中国科学院水生生物研究所 | 一种转基因鱼纯合子的快速鉴定方法及应用 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| 一种基于PCR技术鉴定单拷贝转基因烟草的方法;宋锋等;《中国生物工程杂志》;20101231;第30卷(第4期);83-88 * |
| 宋锋等.一种基于PCR技术鉴定单拷贝转基因烟草的方法.《中国生物工程杂志》.2010,第30卷(第4期),83-88. |
| 李兴美等.鲤鱼肌肉生长抑制素基因( MSTN) 的克隆及其组织表达特征.《水生生物学报》.2007,第31卷(第5期),643-648. |
| 鲤鱼肌肉生长抑制素基因( MSTN) 的克隆及其组织表达特征;李兴美等;《水生生物学报》;20070930;第31卷(第5期);643-648 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN103103254A (zh) | 2013-05-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN106434955B (zh) | 与中国山羊产奶性状相关的snp分子标记及其应用 | |
| CN103866009B (zh) | 一种改进的茎环引物qRT-PCR检测miRNA的方法 | |
| CN105886642A (zh) | 与中国绵羊尾型性状相关的snp分子标记及其应用 | |
| CN104561306B (zh) | 一种与猪眼肌面积性状有关的猪unc13b基因snp标志物 | |
| WO2022068215A1 (zh) | 凡纳滨对虾抗弧菌相关est-str标记及其特异性引物和检测方法 | |
| CN108410996A (zh) | 与山羊产绒性状相关的InDel分子标记及其应用 | |
| CN108410866A (zh) | 与中国家马高海拔适应性性状相关的snp标记及其应用 | |
| CN103740855A (zh) | 基于dna条形码的鳗鱼物种鉴别方法 | |
| CN104131012A (zh) | 一种鉴定大豆细胞核雄性不育系的分子标记及其鉴定方法 | |
| CN105603092A (zh) | 与绵羊多角性状相关的snp标记及其应用 | |
| CN103103254B (zh) | 一种鉴定鲤鱼基因拷贝数的方法 | |
| CN110541041A (zh) | 与中国家马矮小性状相关的snp标记及其应用 | |
| CN104862312A (zh) | 哺乳类实验动物snp标记筛查的引物对及其应用 | |
| CN103388027B (zh) | 不同类群豹纹鳃棘鲈单核苷酸多态性的鉴别方法 | |
| CN102168136B (zh) | 中国荷斯坦奶牛lhcgr基因作为分子标记的应用 | |
| CN107988385A (zh) | 一种检测肉牛PLAG1基因Indel标记的方法及其专用试剂盒 | |
| CN104789691B (zh) | 一种基于一步pcr技术进行凡纳滨对虾遗传性别鉴定的方法 | |
| CN102321750A (zh) | 一种用分子标记快速筛选边鸡体重增长程度的方法 | |
| CN105274212A (zh) | 人POT1基因rs1034794位点多态性检测方法及试剂盒 | |
| CN108823330A (zh) | 一种大豆hrm-snp分子标记点标记方法及其应用 | |
| CN101597648B (zh) | 大黄鱼异质雌核发育二倍体的筛选方法 | |
| CN118127178A (zh) | 一种与大口黑鲈抗病毒特性相关的snp标记及其应用 | |
| CN103451184B (zh) | 麦二叉蚜特异性ss-coi引物、含有该引物的试剂盒及其检测方法 | |
| CN116042857A (zh) | 一组鉴定黄河鲤遗传雄性的联合分子标记、引物及其应用 | |
| CN105838798A (zh) | 鸡mhc b-g座位全序列测定和snp检测方法及试剂盒 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20140820 |