CN112226371A - 一株高产优质广东虫草栽培菌株及其鉴别引物、鉴别方法 - Google Patents

一株高产优质广东虫草栽培菌株及其鉴别引物、鉴别方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株高产优质广东虫草栽培菌株及其鉴别引物、鉴别方法。该高产优质广东虫草为菌株GDGM 30035，保藏编号为：GDMCC No：61208。该菌株具有生长周期短，子实体性状良好等特征，适宜大面积推广。本发明还提供一种鉴别所述的广东虫草栽培菌株GDGM 30035的鉴别引物、鉴别方法，采用该鉴别引物、鉴别方法可准确鉴定出广东虫草栽培菌株GDGM 30035，避免与其他种类的虫草或是生产自广东的其他虫草混淆，杜绝利用其他种类的虫草或是生产自广东的其他虫草冒充广东虫草的市场行为而误导了消费者，从而保障消费者的权益。

Description

一株高产优质广东虫草栽培菌株及其鉴别引物、鉴别方法
技术领域
本发明属于食用菌技术领域，涉及一株高产优质广东虫草栽培菌株及其鉴别引物、鉴别方法。
背景技术
广东虫草Cordyceps guangdongensis T.H.Li,Q.Y.Lin&B.Song，现定名Tolypocladium guangdongense(T.H.Li,Q.Y.Lin&B.Song)V.Papp，由广东省微生物研究所李泰辉研究员发现，并成功驯化栽培。广东虫草子实体墨绿色至灰绿色，细柱状或棒状。2006年保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号：CCTCC No.M206051。2010年经广东省疾病预防与控制中心毒理试验证明，广东虫草子实体安全无毒，并于2013年1月被中华人民共和国卫生部(现为中华人民共和国国家卫生健康委员会)正式批准为“新资源食品”(中华人民共和国卫生部2013年第1号)。广东虫草子实体与冬虫夏草在成分组及含量相似。广东虫草具有显著的防治慢性肾衰竭功效，还具有治疗慢性支气管炎、提高免疫力、延长动物寿命等功效。
市场上的有很多以“广东虫草”命名的商品，实则是其他种类的虫草或是生产自广东的其他虫草，以蛹虫草Cordyceps militaris(L.)Fr.居多，而栽培的蛹虫草子实体一般颜色为金黄、橘黄或橘红色，全长4～8cm，头部椭圆形或或钝圆形或尖形，长1～2cm，粗0.2～1cm；柄长3～6cm，粗0.2～0.3cm，颜色为浅黄色。这种冒充广东虫草的市场行为严重误导了消费者，损害了消费者的权益，因此，极有必要对广东虫草产品正名，也有必要对广东虫草优质生产菌株的性状和分子特征进行说明。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一株广东虫草高产优质栽培菌株Tolypocladiumguangdongense GDGM 30035，其保藏编号为：GDMCC No：61208。该菌株具有生长周期短，子实体性状良好等特征，适宜大面积推广。具体特征在于：
(1)形态特征：菌丝体洁白，稀疏，气生菌丝较少，豆芽马铃薯葡萄糖琼脂培养基(SPDA)上可诱发原基，而其他广东虫草菌株无法在SPDA培养基上诱发出原基(图1)。子实体柱状或棒状，向上生长，全长6～10cm，粗0.1～0.25cm，橄榄绿色至灰绿色。子实体上部逐渐收窄，顶端钝尖；基部略膨大，白色菌丝环绕(图2)。
(2)生物学特征：菌丝初期生长阶段避光培养，栽培室温度控制在23±2.5℃，空气相对湿度控制在65％±5％，空间CO2浓度控制在0.01％～0.02％v/v，培养10～12d，菌丝长满整个栽培容器料面。菌丝长满培养基后，增加散射光照射，采用LED灯带进行补光，光质可以选择白光、蓝光，光照强度200±50lux，每天光照时间10～12h，空气相对湿度保持70％±5％。在3～4d后菌丝由白色转为灰绿色至墨绿色，7～9d后原基出现。现原基时第一次进行通气，即将栽培容器上封口膜刺孔通气，栽培室内CO2浓度控制在0.3％～0.4％v/v，容器内CO2浓度控制在3％～4％v/v。温度控制在23±2.5℃，空气相对湿度85％～90％。每天定期开启内循环通风和外循环风机，保持栽培房空气新鲜，每天光照时间12h，当广东虫草子实体长到1cm左右时，进行第二次通气，即在封口膜上增加刺孔数量，栽培容器内CO2浓度控制在1.5％～2.5％v/v。广东虫草生长60±5d即可采收。从广东虫草基部拔取，按大小等级分别排列，进行保鲜或烘干。
(3)分子生物学特征：利用内部简单序列重复(ISSR)引物UBC822，核苷酸序列为(TC)8A，即：5'-TCTCTCTCTCTCTCTCA-3'(由上海生工生物工程有限公司合成)对广东虫草不同菌株的基因组DNA进行PCR扩增，经凝胶电泳检测，发现仅广东虫草菌株Tolypocladiumguangdongense GDGM 30035在约3500bp和约1800bp有特异性条带，而其他广东虫草菌株没有同时扩增出这两条片段(图3)。
本发明的第二个目的是提供一种鉴别广东虫草高产优质栽培菌株Tolypocladiumguangdongense GDGM 30035的ISSR引物，所述的ISSR引物为UBC822，其核苷酸序列为：5'-TCTCTCTCTCTCTCTCA-3'。
本发明的第三个目的是提供一种鉴别广东虫草高产优质栽培菌株Tolypocladiumguangdongense GDGM 30035的方法，该方法包括以下步骤：提取待测菌株的基因组DNA，以上述的ISSR引物5'-TCTCTCTCTCTCTCTCA-3'作为扩增引物，以待测菌株的基因组DNA作为模板进行PCR扩增，将扩增产物进行凝胶电泳，根据目的条带来判别待测菌株是否为广东虫草高产优质栽培菌株Tolypocladium guangdongense GDGM 30035。
所述的根据目的条带来判别待测菌株是否为广东虫草高产优质栽培菌株Tolypocladium guangdongense GDGM 30035，具体为：扩增产物在3500bp和1800bp处同时有目的条带的为广东虫草高产优质栽培菌株Tolypocladium guangdongense GDGM 30035，没有同时扩增出这两条片段的则为其他广东虫草菌株。
所述的PCR反应体系为：25μL总体积，其中Premix TaqTM10μL，ISSR引物0.5μL，模板DNA0.5μL，补足ddH2O至25μL。
所述的PCR反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s、45℃退火60s、72℃延伸60s，40个循环；最后72℃延伸10min。
本发明的第四个目的是提供上述的ISSR引物UBC822在制备鉴别广东虫草高产优质栽培菌株Tolypocladium guangdongense GDGM 30035的试剂盒中的应用。
一种鉴别广东虫草高产优质栽培菌株Tolypocladium guangdongense GDGM30035的试剂盒，其包含上述的ISSR引物UBC822。
本发明进一步提供一种上述的试剂盒在鉴别广东虫草高产优质栽培菌株Tolypocladium guangdongense GDGM 30035中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明提供了一株高产优质广东虫草栽培菌株Tolypocladium guangdongenseGDGM30035，该菌株具有生长周期短，子实体性状良好等特征，适宜大面积推广。本发明还提供一种鉴别所述的广东虫草栽培菌株Tolypocladium guangdongense GDGM 30035的鉴别引物、鉴别方法，采用该鉴别引物、鉴别方法可准确鉴定出广东虫草栽培菌株Tolypocladium guangdongense GDGM 30035，避免与其他种类的虫草或是生产自广东的其他虫草混淆，杜绝利用其他种类的虫草或是生产自广东的其他虫草冒充广东虫草的市场行为而误导了消费者，从而保障消费者的权益。
本发明的广东虫草栽培菌株Tolypocladium guangdongense GDGM 30035于2020年9月23日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为：GDMCC No：61208。
附图说明
图1为广东虫草菌株GDGM 30035与其他广东虫草菌株菌丝状态(SPDA培养皿，暗培养15d)。
图2为广东虫草菌株GDGM 30035成熟子实体形态特征。
图3为广东虫草菌株GDGM 30035分子标记特异性条带。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1：广东虫草菌株GDGM 30035菌丝体生长及特征
SPDA(豆芽马铃薯葡萄糖琼脂培养基)的配方：将去皮的200g土豆切成体积为1cm3的小块，与100g新鲜黄豆芽混合，加入800mL的蒸馏水煮12～15min，8层纱布过滤，滤液中加入20g葡萄糖和15g琼脂，加水定容至1000mL，115℃灭菌20min，备用。
取直径约8mm的广东虫草菌株GDGM 30035菌丝块接种至SPDA平板培养基中央位置。并以接种广东虫草菌株GDGM 33006、GDGM 43414菌丝块作为对照。菌丝生长阶段避光培养，栽培室温度控制在24℃，空气相对湿度控制在65％，空间CO2浓度控制在0.15％v/v，培养10d。结果显示：观察平皿中的广东虫草菌株GDGM 30035菌丝体洁白，稀疏，气生菌丝较少，SPDA培养基上可诱发原基，而其他广东虫草菌株GDGM 33006、GDGM43414无法在SPDA培养基上诱发出原基(图1)。
实施例2：广东虫草菌株GDGM 30035子实体生长及特征
菌丝体长满培养基后，增加散射光照射，采用LED灯带进行补光，光质可以选择白光、蓝光，光照强度220lux，每天光照时间12h，空气相对湿度保持75％。在3～4d后菌丝由白色转为灰墨绿色，9d后原基出现。现原基时第一次进行通气，即将栽培容器上封口膜刺孔通气，栽培室内CO2浓度控制在0.4％v/v，容器内CO2浓度控制在4％v/v。温度控制在23℃，空气相对湿度85％。每天定期开启内循环通风和外循环风机，保持栽培房空气新鲜，每天光照时间12h，当广东虫草子实体长到1cm左右时，进行第二次通气，即在封口膜上增加刺孔数量，栽培容器内CO2浓度控制在2.5％v/v。广东虫草生长60±5d即可采收。从广东虫草基部拔取，按大小等级分别排列，进行保鲜或烘干。
广东虫草菌株GDGM 30035子实体向上生长，均匀变窄，柱状或棒状，不分叉，橄榄绿色至灰绿色，长度5.5～10.0cm，平均7.5cm，直径0.1～0.25cm，平均0.15cm，抗逆性强(图2)，而其他广东虫草菌株GDGM 33006、GDGM 43414卷曲生长，畸形，常分叉，黄绿色至黄色，不等长，平均长度小于4cm，抗逆性差，易感染杂菌。
实施例3：广东虫草菌株GDGM 30035分子生物学特征
提取广东虫草菌株GDGM 30035子实体基因组DNA：称取0.15g广东虫草菌株GDGM30035子实体样品置于无菌的EP管中，将液氮倒入并快速研磨，选用Magen公司的HiPure Fungal DNA Mini Kit(广州美基生物科技有限公司，编号D3171-03)，提取广东虫草菌株GDGM 30035基因组DNA。
采用ISSR核酸分子引物UBC822，核苷酸序列为(TC)8A，即：5'-TCTCTCTCTCTCTCTCA-3'(由上海生工生物工程有限公司合成)，以广东虫草菌株GDGM 30035基因组DNA为模板进行PCR扩增。具体如下：利用Premix TaqTM(TaKaRa TaqTMVersion 2.0)试剂盒(大连宝生生物Takara，编号：R004A)进行PCR反应。反应体系为25μL总体积，其中Premix TaqTM10μL，UBC822引物0.5μL，模板DNA0.5μL，补足ddH2O至25μL。PCR反应程序为95℃5min预变性，95℃30s，45℃60s，72℃60s，40个循环，72℃10min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳。
按照上述的步骤，分别提取其它广东虫草菌株GDGM 43414、GDGM 76241、GDGM33006的基因组DNA，并按照上述的条件进行PCR扩增，结果显示：仅广东虫草菌株GDGM30035在约3500bp和约1800bp有特异性条带，而其他广东虫草菌株(GDGM 43414、GDGM76241、GDGM 33006)没有同时扩增出这两条片段(图3)。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一株广东虫草高产优质栽培菌株Tolypocladium guangdongense GDGM 30035，其保藏编号为：GDMCC No：61208。
2.一种鉴别广东虫草高产优质栽培菌株Tolypocladium guangdongense GDGM 30035的ISSR引物，其特征在于，所述的ISSR引物的核苷酸序列为：5'-TCTCTCTCTCTCTCTCA-3'。
3.一种鉴别广东虫草高产优质栽培菌株Tolypocladium guangdongense GDGM 30035的方法，其特征在于，包括以下步骤：提取待测菌株的基因组DNA，以权利要求2所述的ISSR引物作为扩增引物，以待测菌株的基因组DNA作为模板进行PCR扩增，将扩增产物进行凝胶电泳，根据目的条带来判别待测菌株是否为广东虫草高产优质栽培菌株Tolypocladiumguangdongense GDGM 30035。
4.根据权利要求3所述的鉴别方法，其特征在于，所述的根据目的条带来判别待测菌株是否为广东虫草高产优质栽培菌株Tolypocladium guangdongense GDGM 30035，具体为：扩增产物在3500bp和1800bp处同时有目的条带的为广东虫草高产优质栽培菌株Tolypocladium guangdongense GDGM 30035，没有同时扩增出这两条片段的则为其他广东虫草菌株。
5.根据权利要求3所述的鉴别方法，其特征在于，所述的PCR反应体系为：25μL总体积，其中Premix TaqTM 10μL，ISSR引物0.5μL，模板DNA 0.5μL，补足ddH2O至25μL。
6.根据权利要求3所述的鉴别方法，其特征在于，所述的PCR反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s、45℃退火60s、72℃延伸60s，40个循环；最后72℃延伸10min。
7.权利要求2所述的引物在制备鉴别广东虫草高产优质栽培菌株Tolypocladiumguangdongense GDGM 30035的试剂盒中的应用。
8.一种鉴别广东虫草高产优质栽培菌株Tolypocladium guangdongense GDGM 30035的试剂盒，其特征在于，包含权利要求2所述的引物。
9.权利要求8所述的试剂盒在鉴别广东虫草高产优质栽培菌株Tolypocladiumguangdongense GDGM 30035中的应用。
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