CN112094925A - 对高体雅罗鱼和瓦氏雅罗鱼杂交种进行快速鉴定的方法 - Google Patents

对高体雅罗鱼和瓦氏雅罗鱼杂交种进行快速鉴定的方法 Download PDF

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Abstract

对高体雅罗鱼和瓦氏雅罗鱼杂交种进行快速鉴定的方法，涉及一种对杂交种鱼进行快速鉴定的方法。本发明为了区分高体雅罗鱼和瓦氏雅罗鱼亲本以及杂交种，特别是在苗种幼鱼早期阶段进行鉴别。快速鉴定方法：一、待测样本基因组DNA的提取；二、SSR‑PCR反应；三、凝胶电泳；四、杂交种鉴定：出现2条等位基因条带，其中一条等位基因条带大小为95bp或107bp，另一条等位基因条带大小为101bp，则判定该样品为高体雅罗鱼和瓦氏雅罗鱼杂交种。本发明可操作简便、重复性好、通用性好、不受环境因素的影响，可准确快速的鉴定杂交子代的真实性。

Description

对高体雅罗鱼和瓦氏雅罗鱼杂交种进行快速鉴定的方法
技术领域
本发明涉及一种对杂交种鱼进行快速鉴定的方法。
背景技术
高体雅罗鱼(Leuciscus idus)和瓦氏雅罗鱼(Leuciscus waleckii)是隶属于鲤科、雅罗鱼亚科、雅罗鱼属的两个不同种。高体雅罗鱼在我国主要分布于新疆额尔齐斯河水系，体型宽、生长快；瓦氏雅罗鱼主要分布于黑龙江、黄河、辽河及内陆盐碱湖泊，耐盐碱能力强，能够耐受内蒙古达里湖碱度50mmol/L以上，pH9.6的恶劣水域环境。我国有大约9.6亿亩的低洼盐碱水域，具有高碱度、高pH、离子组成复杂等水质特点，利用率不足2％，大部分处于荒弃状态，因此开发利用盐碱水域迫在眉睫。实践证明，“以渔治碱”是开发利用盐碱水域的有效途径。但是耐盐碱能力强、生长快等性状优良的耐盐碱种质严重匮乏。黑龙江水产研究所收集了分布在我国的5种雅罗鱼，通过十几年的繁育、生长、抗逆性等对比研究，发现高体雅罗鱼和瓦氏雅罗鱼亲本配合力强，杂交子一代杂种优势明显，有望获得生长快、耐盐碱能力强的耐盐碱新品种，为加快盐碱水域的开发利用进程提供优异种源。
鉴于亲本与杂交种苗幼鱼及成鱼阶段表型判定特征不明显，容易造成种质混杂，不利于耐盐碱新品种在盐碱池塘养殖及大水面增养殖等示范应用。
发明内容
本发明为了区分高体雅罗鱼和瓦氏雅罗鱼亲本以及杂交种，特别是在苗种幼鱼早期阶段进行鉴别，提供了一种对高体雅罗鱼和瓦氏雅罗鱼杂交种进行快速鉴定的方法。
本发明对高体雅罗鱼和瓦氏雅罗鱼杂交种进行快速鉴定的方法：
一、待测样本基因组DNA的提取；
二、SSR-PCR反应；
三、凝胶电泳；
四、杂交种鉴定：出现2条等位基因条带，其中一条等位基因条带大小为95bp或107bp，另一条等位基因条带大小为101bp，则判定该样品为高体雅罗鱼和瓦氏雅罗鱼杂交种；
其中，步骤二SSR-PCR反应中特异SSR标记引物为Primer1-F和Primer1-R，
Primer1-F:5’-TGATGGTGGTGGTGGAGATG
Primer1-R:5’-TGCACAGTTCCACTGAGTGT。
本发明高体雅罗鱼和瓦氏雅罗鱼杂交种鉴定用引物对Primer1-F和Primer1-R，
Primer1-F:5’-TGATGGTGGTGGTGGAGATG
Primer1-R:5’-TGCACAGTTCCACTGAGTGT。
本发明方法利用分子标记鉴定技术，可有效从早期苗种阶段鉴定高体雅罗鱼和瓦氏雅罗鱼杂交种，保证苗种纯正，为耐盐碱新品种的推广应用提供强有力的技术支撑。
本发明方法中用于鉴定的SSR标记能够在高体雅罗鱼和瓦氏雅罗鱼群体中扩增出差异明显的特征带，扩增条带清晰、非特异性片段少、重复性好。利用该SSR标记检测出既含有高体雅罗鱼又含有瓦氏雅罗鱼特有等位基因的杂合等位基因，可以快速判断二者杂交种的真实性。本发明操作简便、重复性好、通用性好、不受环境因素的影响，可准确快速的鉴定杂交子代的真实性。
微卫星标记的特点之一便是多态性高，这意味着每个个体都可能有多个不同的等位基因。因此筛选出多态性低，又在不同群体有明显差异的谱带十分难得。
附图说明
图1是实施例1对高体雅罗鱼和瓦氏雅罗鱼各20条进行检测的结果；其中，M为2000bp DNA marker(最小片段大小为100bp)；高体雅罗鱼1-20；瓦氏雅罗鱼1-20。
图2是实施例2对90尾高体雅罗鱼和瓦氏雅罗鱼杂交种进行检测的结果；其中，M为2000bp DNA marker(最小片段大小为100bp)；杂交种1-90；高体雅罗鱼亲本1-2；瓦氏雅罗鱼亲本1-2。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。
具体实施方式一：本实施方式对高体雅罗鱼和瓦氏雅罗鱼杂交种进行快速鉴定的方法：
一、待测样本基因组DNA的提取；
二、SSR-PCR反应；
三、凝胶电泳；
四、杂交种鉴定：出现2条等位基因条带，其中一条等位基因条带大小为95bp或107bp，另一条等位基因条带大小为101bp，则判定该样品为高体雅罗鱼和瓦氏雅罗鱼杂交种；
其中，步骤二SSR-PCR反应中特异SSR标记引物为Primer1-F和Primer1-R，
Primer1-F:5’-TGATGGTGGTGGTGGAGATG
Primer1-R:5’-TGCACAGTTCCACTGAGTGT。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一的不同点是：步骤二SSR-PCR反应体系为15μL，由10.8μL自制混合buffer、0.5μL正向检测引物、0.5μL反向检测引物、2μL样本DNA、0.2μL酶活为1U的Taq DNA聚合酶和1μL去离子无菌水组成；其中，0.5μL正向鉴定引物中含正向鉴定引物Primer1-F 10mmol/L，0.5μL反向鉴定引物中含反向鉴定引物Primer1-R10mmol/L；10.8μL自制混合buffer中含50mmol/L的KCl、10mmol/L的Tris-HCl、0.1％体积的TritonX-100、1.5mmol/L的MgCl2、0.1％体积的NP-40、0.01％体积的明胶和200μmol/L的4种dNTP混合液。其它步骤及参数与实施方式一相同。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二的不同点是：步骤二SSR-PCR反应体系中2μL样本DNA中含样本DNA 50ng。其它步骤及参数与实施方式一或二相同。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一或二或三的不同点是：步骤二SSR-PCR反应程序为94℃预变性5min；变性94℃30s、退火60℃30s、延伸72℃30s，共25个循环；延伸72℃7min。其它步骤及参数与实施方式一或二或三相同。
实施例1
采用具体实施方式一的方法，分别对高体雅罗鱼和瓦氏雅罗鱼各20条进行检测：
一、待测样本基因组DNA的提取；
二、SSR-PCR反应；
三、凝胶电泳；
其中，步骤二SSR-PCR反应中特异SSR标记引物为Primer1-F和Primer1-R，
Primer1-F:5’-TGATGGTGGTGGTGGAGATG
Primer1-R:5’-TGCACAGTTCCACTGAGTGT
分别选取高体雅罗鱼和瓦氏雅罗鱼各20条按上述步骤进行重复性验证，扩增结果稳定可靠(如图1所示)，证明本发明方法可用于二者杂交种的鉴定。
微卫星标记属于共显性标记，显性和隐性等位基因都能展现出来。本发明方法扩增的等位基因不复杂，只有三种等位基因，大小分别为95bp、101bp和107bp；瓦氏雅罗鱼亲本在该标记位点出现了三种基因型，分别为95bp/107bp杂合型，95bp/95bp纯合型，107bp/107bp纯合型；而高体雅罗鱼在该标记位点只表现出一种基因型，101/101纯合型(如图1所示)。依据孟德尔等位基因自由组合定律，杂交个体应该是父母本等位基因自由组合的体现。如图2所示，杂交个体表现出优异的杂合性，符合孟德尔遗传定律，只出现两种基因型95bp/101bp或101bp/107bp，容易进行判别。
实施例2
采用具体实施方式一的方法，对随机挑选的2月龄高体雅罗鱼和瓦氏雅罗鱼杂交种90尾个体鳍条进行检测：
一、待测样本基因组DNA的提取；
二、SSR-PCR反应；
三、凝胶电泳；
四、鉴定：出现2条等位基因条带，其中一条等位基因条带大小为95bp或107bp，另一条等位基因条带大小为101bp，则判定该样品为高体雅罗鱼和瓦氏雅罗鱼杂交种；
其中，步骤二SSR-PCR反应中特异SSR标记引物为Primer1-F和Primer1-R，
Primer1-F:5’-TGATGGTGGTGGTGGAGATG
Primer1-R:5’-TGCACAGTTCCACTGAGTGT；
步骤二SSR-PCR反应体系为15μL，由10.8μL自制混合buffer、0.5μL正向检测引物、0.5μL反向检测引物、2μL样本DNA、0.2μL酶活为1U的Taq DNA聚合酶和1μL去离子无菌水组成；其中，0.5μL正向鉴定引物中含正向鉴定引物Primer1-F 10mmol/L，0.5μL反向鉴定引物中含反向鉴定引物Primer1-R 10mmol/L；10.8μL自制混合buffer中含50mmol/L的KCl、10mmol/L的Tris-HCl、0.1％体积的TritonX-100、1.5mmol/L的MgCl2、0.1％体积的NP-40、0.01％体积的明胶和200μmol/L的4种dNTP混合液。
步骤二SSR-PCR反应体系中2μL样本DNA中含样本DNA 50ng。
步骤二SSR-PCR反应程序为94℃预变性5min；变性94℃30s、退火60℃30s、延伸72℃30s，共25个循环；延伸72℃7min；
步骤三凝胶电泳(PCR产物用8％的非变性PAGE电泳检测)：
3.1清洗玻璃板：用洗涤剂把玻璃板反复擦洗干净，用双蒸水擦洗两遍，再用无水酒精擦洗，晾干；
3.2组装胶板：用无屑纸巾在晾干的长板上均匀涂抹0.2％Binding Silane，在短板上均匀涂抹2％Repel Silane；干燥5min之后，将长板涂有Binding Silane的一面与短板涂有Repel Silane的一面相扣，两侧用夹子夹紧，水平放置；
3.3灌胶：取21.8mL双蒸水，加入8.2mL 5×TBE，10.6ml的30％非变性胶配置成8％的非变性胶，向其中加入40μL TEMED和400μL 10％的过硫酸铵(APS)，缓慢混匀，把胶沿灌胶口灌进，灌胶过程中注意防止出现气泡；然后插入梳子，静置使其聚合60min；
3.4加电泳缓冲液：取出梳子，将聚合好的胶板组装到电泳槽上，然后将电泳槽连好导线并将导线接入电泳仪中，再将配置好的1×TBE缓冲液加入电泳槽内，注意让缓冲液没过梳子孔；插上电源，调节电压至160V预电泳30min；
3.5点样：用移液枪反复冲洗加样孔，然后将PCR产物加上溴酚蓝3μL点样，每一个加样孔点样量为1μL，Marker为1μL，电泳缓冲液为1×TBE；
3.6电泳：160V电压电泳150min。
3.7银染(硝酸银法染色)：
3.7.1脱色：将玻璃板放入0.5％的冰醋酸，在转速为60rpm的摇床上轻摇10min至胶完全脱色；
3.7.2染色：加入0.1％硝酸银染色液，在转速为60rpm的摇床上轻摇染色10min；
3.7.3漂洗：倒掉染色液后，加入漂洗液清洗30s，倒掉后再加入800mL双蒸水，进行第二次漂洗，洗30s后倒掉；
3.7.4显色：向胶板中加入显色液，轻摇，直至产物条带出现；
3.7.5观察照相，记录；
3.7.6亲本特有等位基因片段的回收测序。
凝胶电泳结果如图2所示，所有个体呈现杂合状态，说明本发明方法可以快速准确地鉴定高体雅罗鱼和瓦氏雅罗鱼及其杂交种的真实性，可以实现对杂交群体的早期筛选。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明做出了描述，若在本发明基础上做出一些修改或改进，而其并不偏离本发明之精神，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (5)

1.对高体雅罗鱼和瓦氏雅罗鱼杂交种进行快速鉴定的方法，其特征在于该鉴定方法按以下步骤进行：
一、待测样本基因组DNA的提取；
二、SSR-PCR反应；
三、凝胶电泳；
四、杂交种鉴定：出现2条等位基因条带，其中一条等位基因条带大小为95bp或107bp，另一条等位基因条带大小为101bp，则判定该样品为高体雅罗鱼和瓦氏雅罗鱼杂交种；
其中，步骤二SSR-PCR反应中特异SSR标记引物为Primer1-F和Primer1-R，
Primer1-F:5’-TGATGGTGGTGGTGGAGATG
Primer1-R:5’-TGCACAGTTCCACTGAGTGT。
2.根据权利要求1所述的对高体雅罗鱼和瓦氏雅罗鱼杂交种进行快速鉴定的方法，其特征在于步骤二SSR-PCR反应体系为15μL，由10.8μL自制混合buffer、0.5μL正向检测引物、0.5μL反向检测引物、2μL样本DNA、0.2μL酶活为1U的Taq DNA聚合酶和1μL去离子无菌水组成；其中，0.5μL正向鉴定引物中含正向鉴定引物Primer1-F 10mmol/L，0.5μL反向鉴定引物中含反向鉴定引物Primer1-R 10mmol/L；10.8μL自制混合buffer中含50mmol/L的KCl、10mmol/L的Tris-HCl、0.1％体积的TritonX-100、1.5mmol/L的MgCl2、0.1％体积的NP-40、0.01％体积的明胶和200μmol/L的4种dNTP混合液。
3.根据权利要求2所述的对高体雅罗鱼和瓦氏雅罗鱼杂交种进行快速鉴定的方法，其特征在于步骤二SSR-PCR反应体系中2μL样本DNA中含样本DNA 50ng。
4.根据权利要求1或2所述的对高体雅罗鱼和瓦氏雅罗鱼杂交种进行快速鉴定的方法，其特征在于步骤二SSR-PCR反应程序为94℃预变性5min；变性94℃30s、退火60℃30s、延伸72℃30s，共25个循环；延伸72℃7min。
5.高体雅罗鱼和瓦氏雅罗鱼杂交种鉴定用引物对，其特征在该引物为Primer1-F和Primer1-R，
Primer1-F:5’-TGATGGTGGTGGTGGAGATG
Primer1-R:5’-TGCACAGTTCCACTGAGTGT。
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