KR20090094391A

KR20090094391A - ＴＲＡＣＰ５ｂ의 제조방법

Info

Publication number: KR20090094391A
Application number: KR1020097015501A
Authority: KR
Inventors: 이와오 기요카와; 다츠야 오하시; 도시히데 미우라; 가츠히로 가타야마; 도시키 다무라; 이사오 고바야시; 히데키 세즈츠
Original assignee: 니토 보세키 가부시기가이샤; 독립행정법인농업생물자원연구소
Priority date: 2006-12-28
Filing date: 2007-12-28
Publication date: 2009-09-04
Also published as: KR101443937B1; CN101617041A; CN101617041B; WO2008081922A1; EP2119772A4; US20110239313A1; EP2119772A1; JPWO2008081922A1; US8426674B2; JP5177431B2; EP2119772B1

Abstract

(i) 견사선 특이적으로 발현하는 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터 하류에, 기능적으로 결합한 전사제어인자를 코드하는 DNA, 및 (ii) 상기 전사제어인자의 표적 프로모터 하류에, 기능적으로 결합한 타르타르산 저항성 산성 포스파타아제 5b(TRACP5b)를 코드하는 DNA를 갖는 누에를 제작하였다. 그 결과, 상기 누에로부터 활성을 갖는 TRACP5b가 생산되는 것을 알 수 있었다. 이 사실은 상기 누에의 견사선으로부터 생산된 TRACP5는 견사선에서 골 흡수부위에 있어서의 프로세싱과 동일한 프로세싱을 받는 것을 의미한다.

Description

ＴＲＡＣＰ５ｂ의 제조방법{Method for production of TRACP5b}

본 발명은 누에를 이용한 타르타르산 저항성 산성 포스파타아제 5b(TRACP5b)의 제조방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 TRACP5b를 생산하는 누에에 관한 것이다.

혈청 중의 산성 포스파타아제는 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해, 원점으로부터 0~5의 6개의 밴드로 나뉜다. 그 밴드 중에서 5번째의 것은 타르타르산에 저항성을 나타내, Band 5 타르타르산 저항성 산성 포스파타아제(TRACP5: Tartrate Resistant Acid Phosphatase 5)로 불리고 있다.

5번째의 밴드는 또한, Acidic 디스크 전기영동에 의해 2개의 밴드로 나뉘어, 각각 TRACP5a, TRACP5b로 불리고 있다. TRACP5a는 혈소판이나 기타 성분에 유래하는 효소로, 혈중치는 변동되지 않는다. 한편 TRACP5b는 골 흡수에 수반하여 혈중치가 변동되는 것으로부터, 파골세포(osteoclast)에 유래하는 것으로 생각되고 있다. TRACP5b의 특이적 저해제, 활성화제, 또는 모듈레이터의 개발에 있어서, 후보 화합물을 스크리닝하기 위해서는 TRACP5b를 대량으로 필요로 한다.

그 때문에, 지금까지 많은 연구자가 유용한 인간 TRACP5b의 제작을 시도해왔다. 그러나, 인 비보(in vivo)에서 직접 TRACP5b를 발현시킨 성공예는 없고, 대량의 파골세포종(osteoclastoma)으로부터 정제하거나(비특허문헌 1), 신선하고 대량의 혈청으로부터 단리해야만 하였다(비특허문헌 2). 한편, 곤충세포에 TRACP5를 발현시키고(비특허문헌 3), 얻어지는 TRACP5를 인 비트로(in vitro)에서 프로테아제를 작용시켜 TRACP5b를 제작하고자 하는 시도가 알려져 있다. 그러나, 매우 조금밖에 목적물을 얻을 수 없는 것이 실상이다(비특허문헌 4).

지금까지 본 발명자 등은 대장균, 곤충세포, 포유동물세포 등에 다양한 연구를 행하여, TRACP5b를 생산하는 시도를 행해왔지만, 성공하지는 못하였다. 그 이유는 이들의 계(system)에서는 TRACP5b의 생성에 있어서의 특수한 번역 후 수식(비특허문헌 4)을 재현할 수 없는 것에 있다. 또한 본 발명자 등은 TRACP5를 제작하여 인 비트로에서 카텝신 K(cathepsin K) 등에 의한 효소처리를 행하는 방법을 시도하였으나, 공업화라는 관점에서 안정한 효소 단백질의 제조방법을 확립하는 것이 불가능하였다.

한편, 최근, 누에에 의한 유전자산물의 생산기술이 개발되어, 외래유전자의 도입법이나 도입유전자 발현 제어법의 연구가 진행되어, 새로운 단백질 제조법으로서 기대되고 있다. 예를 들면, 재조합 누에 제작기술을 이용하여, 견사선(silk gland) 중에 도입 유전자를 발현시켜, 재조합 단백질을 생산시키는 것이 알려져 있다. 누에는 진핵생물이기 때문에, 대장균 등의 미생물이나 식물과 비교하면, 포유류에 가까운 유형의 단백질을 만들 수 있다. 또한, 누에는 재조합 단백질을 만드는데 적합한 견사선이라는 기관을 가지고 있기 때문에, 한마리당 1 g 조금 안되는 단백질을 만드는 능력이 있다. 또한, 인공사료에 의한 청정사육이 가능하여, 수만 마리 규모에서의 대량사육을 용이하게 행할 수 있다. 또한, 자연계에 풍부하게 있는 뽕잎을 사용하여 누에의 대량사육을 행하면, 재조합 단백질을 저렴하게 대량으로 얻을 수 있다.

한편, 재조합 배큘로바이러스(baculovirus)를 사용하여, 바이러스 감염된 누에 유충을 제작하여, 그 체액으로부터 인터페론 등의 의약품(항종양·항바이러스제 등) 등에 사용되는 유용 단백질을 얻는 방법도 몇 가지 알려져 있다. 이것도 누에의 단백질 생성능력을 살린 새로운 단백질 제조방법을 제공했다 할 수 있다.

발명의 개시

발명이 해결하고자 하는 과제

전술한 바와 같이, TRACP5b의 중요성이 증가하고 있음에도 불구하고, 그 제조에는 수많은 과제가 있다. 이에 본 발명자 등은 누에의 특징을 살려, 누에에 의한 인간 TRACP5b의 발현을 검토하였다. 즉 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 누에를 이용하여 TRACP5b를 대량으로 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

과제를 해결하기 위한 수단

본 발명자 등은 상기의 과제를 해결하기 위해 예의 연구를 행하였다. 그 결과, TRACP5를 누에로 대량으로 제조하고, 그 TRACP5를 처리하여 TRACP5b를 제조하는 것을 시도한바, 놀랍게도 인간 TRACP5 유전자를 도입한 누에의 견사선으로부터 직접 TRACP5b가 생산되는 것을 발견하였다. 본 발명은 이러한 경과에 의해 완성된 것이다.

즉 본 발명은 누에의 견사선에 있어서의 TRACP5b의 제조방법에 관한 것으로, 이하의 [1]~[49]를 제공한다.

[1] 이하의 (a) 및 (b)의 공정을 포함하는, TRACP5b의 제조방법;

(a) TRACP5를 코드하는 DNA가 도입된 누에를 제조하는 공정,

(b) 제조된 누에로부터 TRACP5b를 회수하는 공정,

[2] 이하의 (a) 및 (b)의 공정을 포함하는, TRACP5b의 제조방법;

(a) 견사선 특이적으로 발현하는 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터, 및 이 프로모터에 의해 직접적 또는 간접적으로 발현 제어되는 TRACP5를 코드하는 DNA를 갖는 누에로서, TRACP5b를 견사선에 분비하는 누에를 제조하는 공정,

(b) 제조된 누에로부터 상기 TRACP5b를 회수하는 공정,

[3] 누에가 이하의 (i) 및 (ii)에 기재된 DNA를 갖는 누에인, [2]에 기재된 방법;

(i) 견사선 특이적으로 발현하는 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터 하류에, 기능적으로 결합한 전사제어인자를 코드하는 DNA,

(ii) 상기 전사제어인자의 표적 프로모터 하류에, 기능적으로 결합한 TRACP5를 코드하는 DNA,

[4] 누에가 이하의 (i) 및 (ii)에 기재된 누에를 교배시킴으로써 제조되는, [2]에 기재된 방법,

(i) 견사선 특이적으로 발현하는 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터 하류에, 기능적으로 결합한 전사제어인자를 코드하는 DNA를 갖는 누에,

(ii) 상기 전사제어인자의 표적 프로모터 하류에, 기능적으로 결합한 TRACP5를 코드하는 DNA를 갖는 누에,

[5] 전사제어인자가 GAL4이고, 표적 프로모터가 UAS인, [3] 또는 [4]에 기재된 방법,

[6] 견사선이 중부 견사선 또는 후부 견사선인, [2] 내지 [5] 중 어느 하나에 기재된 방법,

[7] 견사선 특이적으로 발현하는 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터가, 세리신(sericin) 1 단백질 또는 세리신 2 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터인, [6]에 기재된 방법,

[7-1] 세리신 1 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터가 이하의 (a) 또는 (b)인, [7]에 기재된 방법;

(a) 서열번호: 7에 기재된 염기서열을 포함하는 DNA,

(b) 서열번호: 7에 기재된 염기서열에 있어서 1 또는 복수의 염기가 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입된 염기서열을 포함하는 DNA,

[7-2] 세리신 2 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터가 이하의 (a) 또는 (b)인, [7]에 기재된 방법;

(a) 서열번호: 8에 기재된 염기서열을 포함하는 DNA,

(b) 서열번호: 8에 기재된 염기서열에 있어서 1 또는 복수의 염기가 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입된 염기서열을 포함하는 DNA,

[8] 견사선 특이적으로 발현하는 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터가, 피브로인(fibroin) 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터인, [6]에 기재된 방법,

[8-1] 피브로인 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터가 이하의 (a) 또는 (b)인, [8]에 기재된 방법;

(a) 서열번호: 9에 기재된 염기서열을 포함하는 DNA,

(b) 서열번호: 9에 기재된 염기서열에 있어서 1 또는 복수의 염기가 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입된 염기서열을 포함하는 DNA,

[9] TRACP5가 시그널서열을 갖는, [1] 내지 [8-1] 중 어느 하나에 기재된 방법,

[10] TRACP5를 코드하는 DNA를 누에에 도입하는 공정을 포함하는, TRACP5b를 분비하는 누에의 제조방법,

[11] TRACP5를 코드하는 DNA를 누에알에 도입하는 공정을 포함하는, TRACP5b를 분비하는 누에의 제조방법,

[12] 견사선 특이적으로 발현하는 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터, 및 이 프로모터에 의해 직접적 또는 간접적으로 발현 제어되는 TRACP5를 코드하는 DNA를 갖는 누에알을 제조하는 공정을 포함하는, TRACP5b를 견사선에 분비하는 누에의 제조방법,

[13] 누에가 이하의 (i) 및 (ii)에 기재된 DNA를 갖는 누에인, [12]에 기재된 방법;

[14] 누에가 이하의 (i) 및 (ii)에 기재된 누에를 교배시킴으로써 제조되는, [12]에 기재된 방법;

[15] 전사제어인자가 GAL4이고, 표적 프로모터가 UAS인, [13] 또는 [14]에 기재된 방법,

[16] 견사선이 중부 견사선 또는 후부 견사선인, [12] 내지 [15] 중 어느 하나에 기재된 방법,

[17] 견사선 특이적으로 발현하는 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터가, 세리신 1 단백질 또는 세리신 2 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터인, [16]에 기재된 방법,

[17-1] 세리신 1 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터가 이하의 (a) 또는 (b)인, [17]에 기재된 방법;

(a) 서열번호: 7에 기재된 염기서열을 포함하는 DNA,

(b) 서열번호 : 7에 기재된 염기서열에 있어서 1 또는 복수의 염기가 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입된 염기서열을 포함하는 DNA,

[17-2] 세리신 2 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터가 이하의 (a) 또는 (b)인, [17]에 기재된 방법;

(a) 서열번호: 8에 기재된 염기서열을 포함하는 DNA,

(b) 서열번호 : 8에 기재된 염기서열에 있어서 1 또는 복수의 염기가 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입된 염기서열을 포함하는 DNA,

[18] 견사선 특이적으로 발현하는 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터가, 피브로인 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터인, [16]에 기재된 방법,

[18-1] 피브로인 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터가 이하의 (a) 또는 (b)인, [18]에 기재된 방법;

(a) 서열번호: 9에 기재된 염기서열을 포함하는 DNA,

(b) 서열번호 : 9에 기재된 염기서열에 있어서 1 또는 복수의 염기가 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입된 염기서열을 포함하는 DNA,

[19] TRACP5가 시그널서열을 갖는, [10] 내지 [18-1] 중 어느 하나에 기재된 방법,

[20] TRACP5를 코드하는 DNA를 갖는 누에로서, TRACP5b를 분비하는 누에,

[21] 견사선 특이적으로 발현하는 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터, 및 이 프로모터에 의해 직접적 또는 간접적으로 발현 제어되는 TRACP5를 코드하는 DNA를 갖는 누에로서, TRACP5b를 견사선에 분비하는 누에,

[22] 이하의 (i) 및 (ii)에 기재된 DNA를 갖는, [21]에 기재된 누에;

[23] 이하의 (i) 및 (ii)에 기재된 누에를 교배시킴으로써 제조되는, [21]에 기재된 누에;

[24] 전사제어인자가 GAL4이고, 표적 프로모터가 UAS인, [22] 또는 [23]에 기재된 누에,

[25] 견사선이 중부 견사선 또는 후부 견사선인, [21] 내지 [24] 중 어느 하나에 기재된 누에,

[26] 견사선 특이적으로 발현하는 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터가, 세리신 1 단백질 또는 세리신 2 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터인, [25]에 기재된 누에,

[26-1] 세리신 1 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터가 이하의 (a) 또는 (b)인, [26]에 기재된 누에;

(a) 서열번호: 7에 기재된 염기서열을 포함하는 DNA,

[26-2] 세리신 2 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터가 이하의 (a) 또는 (b)인, [26]에 기재된 누에;

(a) 서열번호: 8에 기재된 염기서열을 포함하는 DNA,

[27] 견사선 특이적으로 발현하는 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터가, 피브로인 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터인, [25]에 기재된 누에,

[27-1] 피브로인 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터가 이하의 (a) 또는 (b)인, [27]에 기재된 누에;

(a) 서열번호: 9에 기재된 염기서열을 포함하는 DNA,

[28] TRACP5가 시그널서열을 갖는, [20] 내지 [27-1] 중 어느 하나에 기재된 누에,

[29] 전사제어인자의 표적 프로모터 하류에, 기능적으로 결합한 TRACP5를 코드하는 DNA를 갖는 누에,

[30] 전사제어인자가 GAL4이고, 표적 프로모터가 UAS인, [29]에 기재된 누에,

[31] TRACP5가 시그널서열을 갖는, [29] 또는 [30]에 기재된 누에,

[32] TRACP5b가 TRACP5b의 특이적 저해제, 활성화제, 또는 모듈레이터의 후보 화합물의 스크리닝에 사용되는, [1] 내지 [9] 중 어느 하나에 기재된 방법,

[33] TRACP5b의 특이적 저해제, 활성화제, 또는 모듈레이터가 골 흡수의 증가에 관련된 질환의 치료에 사용되는, [32]에 기재된 방법,

[34] 골 흡수의 증가에 관련된 질환이 조직장애, 골 대사 질환, 또는 골다공증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 질환인, [33]에 기재된 방법,

[35] 이하의 (a) 및 (b)의 공정을 포함하는, TRACP5b의 제조방법;

(a) 세포질 액틴 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터, 및 이 프로모터에 의해 직접적 또는 간접적으로 발현 제어되는 TRACP5를 코드하는 DNA를 갖는 누에로서, TRACP5b를 지방체에 분비하는 누에를 제조하는 공정,

(b) 제조된 누에로부터 상기 TRACP5b를 회수하는 공정,

[36] 누에가 이하의 (i) 및 (ii)에 기재된 DNA를 갖는 누에인, [35]에 기재된 방법;

(i) 세포질 액틴 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터 하류에, 기능적으로 결합한 전사제어인자를 코드하는 DNA,

[37] 누에가 이하의 (i) 및 (ii)에 기재된 누에를 교배시킴으로써 제조되는, [35]에 기재된 방법;

(i) 세포질 액틴 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터 하류에, 기능적으로 결합한 전사제어인자를 코드하는 DNA를 갖는 누에,

(ii) 상기 전사제어인자의 표적 프로모터 하류에, 기능적으로 결합한 TRACP5b를 코드하는 DNA를 갖는 누에,

[38] 전사제어인자가 GAL4이고, 표적 프로모터가 UAS인, [36] 또는 [37]에 기재된 방법,

[38-1] 세포질 액틴 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터가 이하의 (a) 또는 (b)인, [38]에 기재된 방법;

(a) 서열번호: 10에 기재된 염기서열을 포함하는 DNA,

(b) 서열번호 : 10에 기재된 염기서열에 있어서 1 또는 복수의 염기가 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입된 염기서열을 포함하는 DNA,

[39] TRACP5가 시그널서열을 갖는, [35] 내지 [38-1] 중 어느 하나에 기재된 방법,

[40] 세포질 액틴 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터, 및 이 프로모터에 의해 직접적 또는 간접적으로 발현 제어되는 TRACP5를 코드하는 DNA를 갖는 누에알을 제조하는 공정을 포함하는, TRACP5b를 지방체에 분비하는 누에의 제조방법,

[41] 누에가 이하의 (i) 및 (ii)에 기재된 DNA를 갖는 누에인, [40]에 기재된 방법;

[42] 누에가 이하의 (i) 및 (ii)에 기재된 누에를 교배시킴으로써 제조되는, [40]에 기재된 방법;

[43] 전사제어인자가 GAL4이고, 표적 프로모터가 UAS인, [41] 또는 [42]에 기재된 방법,

[43-1] 세포질 액틴 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터가 이하의 (a) 또는 (b)인, [43]에 기재된 방법;

(a) 서열번호: 10에 기재된 염기서열을 포함하는 DNA,

[44] TRACP5가 시그널서열을 갖는, [40] 내지 [43-1] 중 어느 하나에 기재된 방법,

[45] 세포질 액틴 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터, 및 이 프로모터에 의해 직접적 또는 간접적으로 발현 제어되는 TRACP5를 코드하는 DNA를 갖는 누에로서, TRACP5b를 지방체에 분비하는 누에,

[46] 이하의 (i) 및 (ii)에 기재된 DNA를 갖는, [45]에 기재된 누에;

[47] 이하의 (i) 및 (ii)에 기재된 누에를 교배시킴으로써 제조되는, [45]에 기재된 누에;

[48] 전사제어인자가 GAL4이고, 표적 프로모터가 UAS인, [46] 또는 [47]에 기재된 누에,

[48-1] 세포질 액틴 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터가 이하의 (a) 또는 (b)인, [48]에 기재된 누에;

(a) 서열번호: 10에 기재된 염기서열을 포함하는 DNA,

[44] TRACP5가 시그널서열을 갖는, [45] 내지 [48-1] 중 어느 하나에 기재된 누에.

도면의 간단한 설명

도 1은 재조합 누에제작을 위한 벡터 pBMCSUASsigTRACP의 구조를 나타내는 도면이다.

도 2는 Ser1-GAL4 계통과 UAS-TRACP 계통의 교배에 의한 인간 TRACP 발현 누에의 수립을 설명하는 도면이다.

도 3은 GAL4 유전자를 갖는 개체와 UAS를 갖는 개체의 실체 형광현미경 사진이다.

도 4는 RT-PCR에 의한 교잡계통에 있어서의 GAL4 유전자 및 TRACP 유전자의 전사 확인을 나타내는 사진이다.

도 5는 Acidic 디스크 전기영동으로 활성 염색을 행했을 때, TRACP 발현 누에로부터 얻어진 TRACP는 인간 뼈 유래 또는 혈청과 동일하게 하부 음극측에 밴드가 위치한 것으로부터 TRACP5b의 생산을 나타내는 도면이다.

[발명의 실시형태]

본 발명은 누에를 이용한 TRACP5b의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명은 본 발명자 등이 누에의 체내에 있어서 활성을 갖는 TRACP5b를 생산시키는 것에 성공한 것을 토대로 한다. 즉 본 발명은 이하의 (a) 및 (b)의 공정을 포함하는, TRACP5b의 제조방법을 제공한다.

(a) TRACP5를 코드하는 DNA가 도입된 누에를 제조하는 공정.

(b) 제조된 누에로부터 TRACP5b를 회수하는 공정.

본 발명에 사용하는 TRACP5로서는 인간 유래, 마우스 유래, 랫트 유래 등의 TRACP5를 예시할 수 있다. 본 발명에 있어서 TRACP5를 코드하는 DNA는, 그것을 갖는 누에가 견사선에 TRACP5b를 분비하는 한 조금도 제한되지 않지만, 인간 유래의 TRACP5가 그 응용용도의 측면에서 바람직하다. 구체적으로는, 일례로서, 서열번호: 5에 기재된 아미노산 서열을 코드하는 염기서열을 포함하는 DNA를 들 수 있다. 또한, 서열번호: 5에 기재된 아미노산 서열에 있어서 1 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 부가, 및/또는 삽입된 아미노산 서열로서, 타르타르산 저항성 산성 포스파타아제 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기서열을 포함하는 DNA를 예시할 수 있다. 이 DNA로부터 얻어지는 단백질이 TRACP5b의 활성을 갖는지 여부는, 예를 들면, PCT 국제공개 2004년 59320호 공보, PCT 국제공개 2004년 77059호 공보, 일본국 특허공표 제2002년 510050호 공보에 기재된 바와 같이, 샘플을 TRACP5b에 대한 단일클론항체에 결합한 후, 결합한 TRACP5b를, TRACP5b용 기질을 사용하여 그 최적 pH에서 측정함으로써 판정할 수 있다.

어느 단백질과 기능적으로 동등한 단백질을 조제하기 위한, 당업자에게 잘 알려진 방법으로서는, 폴리펩티드에 변이를 도입하는 방법이 알려져 있다. 예를 들면, 당업자라면 부위 특이적 변이 유발법(Hashimoto-Gotoh, T. et al. (1995) Gene 152, 271-275; Zoller, MJ, and Smith, M.(1983) Methods Enzymol. 100, 468-500, Kramer, W. et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456, Kramer W, and Fritz HJ(1987) Methods. Enzymol. 154, 350-367, Kunkel, TA(1985) Proc Natl Acad Sci USA. 82, 488-492, Kunkel (1988) Methods Enzymol. 85, 2763-2766) 등을 사용하여, TRACP5에 적절히 변이를 도입함으로써, TRACP5b와 기능적으로 동등한 단백질을 조제할 수 있다. 또한, 아미노산의 변이는 자연계에서도 발생할 수 있다. 이와 같이, TRACP5의 아미노산 서열에 있어서 1 또는 복수의 아미노산이 변이된 아미노산 서열을 가지고, TRACP5와 기능적으로 동등한 단백질을 코드하는 염기서열을 포함하는 DNA도, 본 발명의 TRACP5b의 제조에 사용된다. 또한, 이와 같은 변이체에 있어서 변이되는 아미노산 수는 통상 50 아미노산 이내이고, 바람직하게는 30 아미노산 이내이며, 더욱 바람직하게는 10 아미노산 이내(예를 들면, 5 아미노산 이내)라고 생각된다.

변이되는 아미노산 잔기에 있어서는, 아미노산 측쇄의 성질이 보존되어 있는 다른 아미노산으로 변이되는 것이 바람직하다. 예를 들면 아미노산 측쇄의 성질로서는, 소수성 아미노산(A, I, L, M, F, P, W, Y, V), 친수성 아미노산(R, D, N, C, E, Q, G, H, K, S, T), 지방족 측쇄를 갖는 아미노산(G, A, V, L, I, P), 수산기 함유 측쇄를 갖는 아미노산(S, T, Y), 황원자 함유 측쇄를 갖는 아미노산(C, M), 카르복실산 및 아미드 함유 측쇄를 갖는 아미노산(D, N, E, Q), 염기 함유 측쇄를 갖는 아미노산(R, K, H), 방향족 함유 측쇄를 갖는 아미노산(H, F, Y, W)을 들 수 있다(괄호 안은 모두 아미노산의 한글자 표기를 나타낸다).

어느 아미노산 서열에 대한 1 또는 복수개의 아미노산 잔기의 결실, 부가 및/또는 다른 아미노산에 의한 치환에 의해 수식된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드가 그 생물학적 활성을 유지하는 것은 이미 알려져 있다(Mark, D. F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1984) 81, 5662-5666, Zoller, M. J. & Smith, M. Nucleic Acids Research (1982) 10, 6487-6500, Wang, A. et al., Science 224, 1431-1433, Dalbadie-McFarland, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1982) 79, 6409-6413).

본 발명에 있어서는 생산되는 TRACP5b의 활성을 유지하기 위해, 또는 분비를 촉진하여 회수량을 많게 하기 위해, TRACP5를 코드하는 DNA는 분비 시그널(시그널서열)을 가지고 있어도 된다. 분비 단백질이나 막 내재성 단백질은 소포체 막결합성 리보솜 상에서 합성된 후에, 지질 이중층을 통과해야만 한다. 시그널서열이란, 이 때 필요한 단백질의 N 말단에 존재하는 아미노산 잔기이다.

본 발명에 있어서의 시그널서열은 상기 기능을 갖는 것이면 특별히 한정되지 않고, 예를 들면 인간, 마우스, 랫트, 토끼, 당나귀, 염소, 말, 새, 개, 고양이, 효모, 곤충 유래의 시그널서열을 적합하게 사용할 수 있다.

또한 본 발명의 바람직한 시그널서열로서, 예를 들면 TRACP5의 시그널서열을 들 수 있다. TRACP5의 유래는 특별히 제한되지 않고, 예를 들면 인간, 마우스, 랫트, 토끼, 당나귀, 염소, 말, 새, 개, 고양이 유래의 TRACP5를 들 수 있다. 본 발명에 있어서 인간 TRACP5b를 제조하는 경우, 특히 바람직한 시그널서열은 인간 TRACP5의 시그널서열이다. 이들 시그널서열을 사용함으로써, 발현한 TRACP5b를 효율적으로 제조시킬 수 있다.

인간 유래의 TRACP5의 시그널서열로서는 서열번호: 6에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 들 수 있다. 또한, 서열번호: 6에 기재된 단백질과 동등한 활성을 갖는 것이면, 서열번호: 6에 기재된 아미노산 서열에 있어서, 1 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 부가, 및/또는 삽입된 아미노산 서열도 시그널서열로서 사용할 수 있다. 여기서 「기능적으로 동등」이란, 대상이 되는 단백질이 서열번호: 6에 기재된 아미노산 서열로 되는 단백질과 동일한 생물학적 또는 생화학적 활성을 갖는 것을 가리킨다.

본 발명에 있어서의 시그널서열은 이것에 제한되는 것은 아니나, TRACP5b의 N 말단에 결합하고 있는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명의 방법에 의해 제조되는 TRACP5b는 본 발명의 방법에 의해 제조되는 한 조금도 한정되지 않고, 시그널서열을 가지고 있어도 되고, 가지고 있지 않아도 된다. 즉, 본 발명의 제조방법에 의해 제조되는 TRACP5b에는, 시그널서열을 가지고 있는 TRACP5b, 시그널서열을 가지고 있지 않은 TRACP5b의 양쪽이 포함된다.

본 발명에 있어서 제조되는 TRACP5b는 TRACP5를 코드하는 DNA로부터 전사되고, 파골세포 유래의 TRACP5 활성, 즉 TRACP5b 활성을 갖는 효소이면, 특별히 한정되지 않는다. TRACP5b 활성을 갖는지 여부는 당업자에게 주지의 TRACP5b 측정법에 의해 판정하는 것이 가능하다. 본 발명에 있어서 제조되는 TRACP5b는 바람직하게는 TRACP5b의 특이적 저해제, 활성화제, 또는 모듈레이터의 후보 화합물의 스크리닝에 사용된다. 또한 TRACP5b는 Acidic 디스크 전기영동으로 활성 염색을 행했을 때, 하부 음극측에 밴드가 위치하고, 파골세포로부터 입수한 타르타르산 내성 산성 포스파타아제와 동일한 곳에 위치하는 것이 바람직하다. 또한, TRACP5를 코드하는 DNA의 일례로서, 서열번호: 4에 기재된 염기서열로 되는 DNA를 들 수 있다.

이하, 본 발명의 TRACP5b의 제조방법을 보다 구체적으로 설명한다. 본 발명의 TRACP5b의 제조방법에 있어서는 먼저, TRACP5를 코드하는 DNA가 도입된 누에를 제조한다. TRACP5를 코드하는 DNA가 도입된 누에를 제조하는 방법으로서는, 예를 들면,

(i) 견사선 특이적으로 발현하는 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터, 및 이 프로모터에 의해 직접적 또는 간접적으로 발현 제어되는 TRACP5를 코드하는 DNA를 갖는 트랜스제닉 누에로서, TRACP5b를 견사선에 분비하는 트랜스제닉 누에를 제조하는 방법(제1예),

(ii) TRACP5를 코드하는 DNA를 포함하는 바이러스를 제작하여 그것을 누에 생체 내에 감염시켜 제조하는 방법(제2예)

등을 예시할 수 있으나, 이들에 한정되지 않는다.

본 발명에 있어서, TRACP5를 코드하는 DNA가 도입된 누에를 제조하는 방법으로서, TRACP5를 코드하는 DNA를 포함하는 바이러스를 제작하여 그것을 누에 생체 내에 감염시켜서 제조하는 방법(제2예)을 사용하는 경우, 예를 들면, 일본국 특허공개 평7-289270호에 기재된 방법에 의해 행할 수 있다. 보다 구체적으로는, 바이러스(바람직하게는 배큘로바이러스, 더욱 바람직하게는 누에 핵다각체병 바이러스) DNA의 단백구조 유전자 부분의 전부 또는 일부와 TRACP5를 연결시킨 염기서열을 갖는 바이러스를 제작하고, 그것을 누에 생체 내에 감염시킴으로써 제조할 수 있다.

또한 제2예를 사용하는 경우, 제조된 누에로부터 TRACP5b를 회수하는 방법으로서는 누에의 체액을 추출하여 TRACP5b를 회수하는 방법을 들 수 있다. 구체적으로는, 예를 들면 누에의 복부를 잘라, 냉수로 체액을 추출하여 정제함으로써, TRACP5b를 회수할 수 있다.

또한 본 발명의 TRACP5b의 제조방법에 있어서는 TRACP5b를 대량으로 또한 간단하게 제조할 수 있는 측면에서, 상기 제1예가 바람직하다. 이 이후, 제1예에 관해서 상세하게 설명한다.

본 발명의 TRACP5b의 제조방법의 하나의 구체적인 바람직한 태양에 있어서는, TRACP5b는 누에의 견사선에 있어서 생산되는 것을 특징으로 한다. 즉 본 발명은 이하의 (a) 및 (b)의 공정을 포함하는, TRACP5b의 제조방법에 관한 것이다.

(a) 견사선 특이적으로 발현하는 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터, 및 이 프로모터에 의해 직접적 또는 간접적으로 발현 제어되는 TRACP5를 코드하는 DNA를 갖는 누에로서, TRACP5b를 견사선으로 분비하는 누에를 제조하는 공정.

(b) 제조된 누에로부터 상기 TRACP5b를 회수하는 공정.

본 발명의 누에를 제조하는 공정에 있어서는, 예를 들면 먼저, 누에알에 견사선 특이적으로 발현하는 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터, 및 이 프로모터에 의해 직접적 또는 간접적으로 발현 제어되는 TRACP5를 코드하는 DNA를 도입한다.

이어서, 제조된 누에알로부터 발생한 누에 중에서, TRACP5b를 견사선에 분비하는 누에를 선택함으로써, TRACP5b를 견사선에 분비하는 누에를 제조한다.

본 발명에 있어서, 누에를 선택하기 위해서는, 예를 들면 선택 마커를 사용하여 행할 수 있다. 본 발명에 있어서의 선택 마커로서는 당업자에게 있어서 일반적으로 사용되는 마커, 예를 들면 CFP, GFP, YFP, DsRed 등의 형광 단백질을 사용할 수 있다. 이들의 마커를 사용함으로써, 실체 형광현미경으로 관찰하는 것만으로 누에를 검출할 수 있다. 또한, 형광색이 다르기 때문에, 복수의 마커를 동시에 사용하는 것도 가능하다.

또한, TRACP5를 코드하는 DNA의 일례로서, 서열번호: 4에 기재된 염기서열로 되는 DNA를 들 수 있다. 이와 같은 DNA가 삽입된 벡터를 누에에 도입함으로써, 누에의 견사선 중에 TRACP5b를 분비하는 것이 가능하다.

본 발명에 있어서는 TRACP5b는 견사선에 분비된다. 견사선이란 누에의 채내에 2개 1조(組)로서 존재하는 기관으로, 견사단백질(silk protein)의 합성기관이다. 견사선은 후부 견사선, 중부 견사선, 전부 견사선으로 나뉘고, 견사단백질의 합성은 후부 견사선 및 중부 견사선에서 행해진다. 본 발명에 있어서 바람직한 견사선은 중부 견사선 및 후부 견사선이다.

본 발명에 있어서의 견사선 특이적으로 발현하는 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터, 및 이 프로모터에 의해 직접적으로 발현 제어되는 TRACP5를 코드하는 DNA를 갖는 누에알로서는, 예를 들면, 견사선 특이적으로 발현하는 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터 하류에, TRACP5를 코드하는 DNA가 기능적으로 결합한 DNA를 갖는 누에알을 들 수 있다. 이와 같은 누에알은 견사선 특이적으로 발현하는 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터 하류에, TRACP5를 코드하는 DNA가 기능적으로 결합한 DNA를 누에알에 도입함으로써 제조할 수 있다.

또한, 본 발명에 있어서의 견사선 특이적으로 발현하는 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터, 및 이 프로모터에 의해 간접적으로 발현 제어되는 TRACP5를 코드하는 DNA를 갖는 누에알로서는, 예를 들면,

(i) 견사선 특이적으로 발현하는 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터 하류에, 전사제어인자를 코드하는 DNA가 기능적으로 결합한 DNA, 및

(ii) 상기 전사제어인자의 표적 프로모터 하류에, TRACP5를 코드하는 DNA가 기능적으로 결합한 DNA,

를 갖는 누에알을 들 수 있다.

또한 본 발명에 있어서는 견사선 특이적으로 발현하는 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터에 의해 직접적 또는 간접적으로 발현 제어되는 TRACP5를 코드하는 DNA는, TRACP5b의 분비를 촉진하여 회수량을 많게 하기 위해, 시그널서열을 가지고 있어도 된다. 시그널서열의 구체적인 태양은 전술한 바와 같다.

상기 「기능적으로 결합한」이란, 프로모터에 전사제어인자가 결합함으로써, 프로모터 하류에 존재하는 DNA의 발현이 유도되도록, 상기 프로모터와 상기 DNA가 결합하고 있는 것을 말한다. 따라서, 상기 DNA가 다른 유전자와 결합하고 있고, 다른 유전자산물과의 융합 단백질을 형성하는 경우라도, 상기 프로모터에 전사제어인자가 결합함으로써, 상기 융합 단백질의 발현이 유도되는 것이라면, 상기 「기능적으로 결합한」의 의미에 포함된다.

상기 전사제어인자와 표적 서열의 조합으로서는 GAL4와 UAS, TetR과 TRE 등을 들 수 있다. GAL4와 UAS, 또는 TetR과 TRE를 사용함으로써, 목적으로 하는 유전자의 발현부위나 시기, 양을 정확하게 제어할 수 있어, 많은 조직에서 용이하게 발현시킬 수 있다. 또한, 발현시키는 유전자가 치사성의 유전자라도 계통의 제작이 가능하다.

상기 누에알을 제조하는 방법으로서는 각종 방법을 선택할 수 있다. 예를 들면, 상기 (i) 및 (ii)의 DNA를 각각의 누에알에 도입한다. 양쪽의 DNA를 갖는 누에알은 각각의 DNA가 도입된 누에알로부터 발생한 누에끼리를 교배시킴으로써 얻을 수 있다. 이 경우, 전사제어인자에 의해, 발현하는 조직, 시기, 양 등을 결정할 수 있기 때문에, 발현시키고자 하는 유전자를 도입한 계통과 교배시킴으로써, 많은 계통을 만들지 않고, 각 조직이나 시기, 양 등을 바꿀 수 있는 이점이 있다. 또한, 목적 유전자를 발현시킨 경우, 불임이 되는 경우라도 실험이 가능하다. 또한, 단독의 프로모터를 사용한 경우보다, 도입 유전자로부터의 생산물의 양이 증가한다는 이점도 있다. 또한, 상기 (i) 및 (ii)의 DNA를 갖는 누에알은 한쪽의 DNA가 도입된 누에가 산란한 알에, 다른 한쪽의 DNA를 인위적으로 도입함으로써 얻는 것도 가능하다. 또한, 상기 (i)의 DNA와 상기 (ii)의 DNA를 동일한 알에 도입하는 것에 의해도, 양쪽의 DNA를 갖는 누에알을 얻을 수 있다(Imamura, M., Nakai, J., Inoue, S., Quan, G.-X., Kanda, T. and Tamura, T. (2003) Targeted gene expression using the GAL4/UAS system in the silkworm Bombyx mori. Fourth International Workshop on Transgenesis and Genomics of Invertegrate Organisms, Asilomar, P53.).

누에알로의 DNA의 도입은, 예를 들면 누에의 발생초기 알로, 트랜스포존(transposon)을 벡터로서 주사하는 방법(Tamura, T., Thibert, C., Royer, C., Kanda, T., Abraham, E., Kamba, M., Komoto, N., Thomas, J.-L., Mauchamp, B., Chavancy, G., Shirk, P., Fraser, M., Prudhomme, J.-C. and Couble, P., 2000, Nature Biotechnology 18, 81-84)에 따라서 행할 수 있다. 예를 들면, 트랜스포존의 역위 말단 반복서열(Handler AM, McCombs SD, Fraser MJ, Saul SH. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95(13): 7520-5) 사이에 상기 DNA를 삽입한 벡터와 함께, 트랜스포존 전이효소를 코드하는 DNA를 갖는 벡터(헬퍼 벡터)를 누에알에 도입한다. 헬퍼 벡터로서는, pHA3PIG(Tamura, T., Thibert, C., Royer, C., Kanda, T., Abraham, E., Kamba, M., Komoto, N., Thomas, J.-L., Mauchamp, B., Chavancy, G., Shirk, P., Fraser, M., Prudhomme, J.-C. and Couble, P., 2000, Nature Biotechnology 18, 81-84)를 들 수 있으나, 이것에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서의 트랜스포존으로서는 piggyBac이 바람직하나, 이것에 한정되는 것은 아니고, 마리너(mariner), 미노스(minos) 등을 사용하는 것도 가능하다(Shimizu, K., Kamba, M., Sonobe, H., Kanda, T., Klinakis, A. G., Savakis, C. and Tamura, T. (2000) Insect Mol. Biol., 9, 277-281; Wang W, Swevers L, Iatrou K. (2000) Insect Mol Biol 9 (2): 145-55).

또한 본 발명에 있어서의 견사선 특이적으로 발현하는 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터로서는, 중부 견사선에 있어서는, 예를 들면 세리신 1 단백질 또는 세리신 2 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터를 들 수 있다. 세리신 1 단백질 또는 세리신 2 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터로서는, 서열번호: 7 또는 8에 기재된 염기서열을 포함하는 DNA를 들 수 있다. 서열번호: 7 또는 8에 기재된 염기서열을 포함하는 DNA로서는, 서열번호: 7 또는 8에 기재된 염기서열로 되는 DNA, 서열번호: 7 또는 8에 기재된 염기서열로 되는 DNA의 상류역이나 하류역을 포함하는 DNA 등을 들 수 있으나, 이들에 한정되는 것은 아니다. 서열번호: 7 또는 8에 기재된 염기서열로 되는 DNA의 상류역이나 하류역은, 문헌(Okamoto, H., Ishikawa, E. and Suzuki, Y. (1982) Structural analysis of sericin genes. Homologies with fibroin gene in the 5’ flanking nucleotide sequences. J Biol Chem, 257, 15192-15199., Garel, A., Deleage, G. and Prudhomme, J. C. (1997) Structure and organization of the Bombyx mori sericin 1 gene and of the sericins 1 deduced from the sequence of the Ser 1B cDNA. Insect Biochem Mol Biol, 27, 469-477., Michaille, J. J., Garel, A. and Prudhomme, J. C. (1990) Cloning and characterization of the highly polymorphic Ser2 gene of Bombyx mori. Gene, 86, 177-184.)에 개시되어 있다.

또한, 본 발명에 있어서의 중부 견사선 특이적으로 발현하는 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터로서는, 서열번호: 7 또는 8에 기재된 염기서열을 포함하는 DNA와 구조적으로 유사하고, 또한 서열번호: 7 또는 8에 기재된 염기서열을 포함하는 DNA와 동등 또는 개선된 프로모터 활성을 갖는 DNA도 들 수 있다. 이와 같은 DNA로서는, 예를 들면, 서열번호: 7 또는 8에 기재된 염기서열에 있어서 1 또는 복수의 염기가 치환, 결실, 부가, 및/또는 삽입된 염기서열을 포함하는 DNA를 예시할 수 있다. 이 DNA는 하이브리다이제이션 기술이나 폴리머라아제 연쇄반응(PCR) 기술, 특정 부위 돌연변이법(site-directed mutagenesis), DNA 합성 등의 방법으로 조제하는 것이 가능하다. 조제된 DNA가 프로모터 활성을 갖는지 여부는, 당업자에게 있어서는 리포터 유전자를 사용한 주지의 리포터 어세이법 등에 의해 검토하는 것이 가능하다.

상기 리포터 유전자로서는 그 발현이 검출 가능한 것이라면 특별히 제한되지 않고, 예를 들면, 당업자에게 있어서 일반적으로 사용되는 CAT 유전자, lacZ 유전자, 루시페라아제 유전자, β-글루쿠로니다제 유전자(GUS) 및 GFP 유전자 등을 들 수 있다. 리포터 유전자의 발현 레벨은 이 리포터 유전자에 종류에 따라서, 당업자에게 공지의 방법으로 측정할 수 있다. 예를 들면, 리포터 유전자가 CAT 유전자인 경우에는, 상기 유전자산물에 의한 클로람페니콜의 아세틸화를 검출함으로써, 리포터 유전자의 발현 레벨을 측정할 수 있다. 리포터 유전자가 lacZ 유전자인 경우에는, 상기 유전자 발현산물의 촉매작용에 의한 색소화합물의 발색을 검출함으로써, 또한 루시페라아제 유전자인 경우에는, 상기 유전자 발현산물의 촉매작용에 의한 형광화합물의 형광을 검출함으로써, 또한 β-글루쿠로니다제 유전자(GUS)인 경우에는, 상기 유전자 발현산물의 촉매작용에 의한 Glucuron(ICN사)의 발광이나 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-β-글루쿠로니드(X-Gluc)의 발색을 검출함으로써, 또한 GFP 유전자인 경우에는, GFP 단백질에 의한 형광을 검출함으로써, 리포터 유전자의 발현 레벨을 측정할 수 있다.

한편, 본 발명에 있어서의 후부 견사선 특이적으로 발현하는 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터로서는, 예를 들면 피브로인 L 사슬 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터를 들 수 있다. 피브로인 L 사슬 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터로서는, 서열번호: 9에 기재된 염기서열을 포함하는 DNA를 들 수 있다. 서열번호: 9에 기재된 염기서열을 포함하는 DNA로서는, 서열번호: 9에 기재된 염기서열로 되는 DNA, 서열번호: 9에 기재된 염기서열로 되는 DNA의 상류역이나 하류역을 포함하는 DNA 등을 들 수 있으나, 이들에 한정되는 것은 아니다. 서열번호: 9에 기재된 염기서열로 되는 DNA의 상류역이나 하류역은, 문헌(KIKUCHI, Y., K. MORI, S. SUZUKI, K. YAMAGUCHI and S. MIZUNO, 1992 Structure of the Bombyx mori fibroin light-chain-encoding gene: upstream sequence elements common to the light and heavy chain. Gene 110: 151-158.)에 개시되어 있다.

또한, 본 발명에 있어서의 후부 견사선 특이적으로 발현하는 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터로서, 서열번호: 9에 기재된 염기서열을 포함하는 DNA와 구조적으로 유사하고, 또한 서열번호: 9에 기재된 염기서열을 포함하는 DNA와 동등 또는 개선된 프로모터 활성을 갖는 DNA도 들 수 있다. 이들의 프로모터는 전술한 방법에 의해 조정하는 것이 가능하다.

본 발명의 TRACP5b의 제조방법은, 누에 체내에서 합성된 TRACP5b를 회수하는 공정을 포함한다. 합성된 TRACP5b는 불용화되지 않고, 활성이 있는 상태로, 중부 견사선 또는 후부 견사선에 분비된다. 따라서, TRACP5b는 중부 견사선 또는 후부 견사선으로부터 회수하는 것이 가능하다. TRACP5b를 중부 견사선 또는 후부 견사선으로부터 회수하는 방법으로서는, 예를 들면, 토사기(吐絲期)가 된 누에를 해부하여, 중부 견사선 또는 후부 견사선을 20 mM Tris-HCl pH 7.4 중에 적출하고, 견사선을 핀셋이나 메스로 상처를 냄으로써 견사선 중의 TRACP5b를 회수할 수 있으나, 이것에 한정되지 않는다.

견사선으로부터 추출한 단백질 용액으로부터 TRACP5b를 정제하기 위해서는, 예를 들면 이하와 같이 하면 된다. 추출액을 CM-Sepharose 칼럼에 어플라이하여, 염농도를 변화시킨 리니어 그래디언트로 용출하고, 이 용출분획의 TRACP5b 활성을 측정하여, TRACP5b 활성이 있는 분획을 회수하고, 스핀 칼럼으로 농축한다. 계속해서, 얻어지는 TRACP5b 활성액을 Superdex200 칼럼으로 겔 여과를 행하고, 마찬가지로 TRACP5b 활성을 갖는 분획을 회수하여 농축한다. 또한, 헤파린 칼럼(HiTrap Heparin HP, GE 헬스케어사)으로 염농도를 변화시킨 리니어 그래디언트로 정제하고, 마찬가지로 TRACP5b 활성을 갖는 분획을 스핀 칼럼으로 농축한다. 이들의 분획은, 예를 들면 산성 전기영동으로 TRACP5b의 유무, 정제상황을 확인할 수 있다.

또한 본 발명의 TRACP5b는, 예를 들면 누에가 토사한 고치로부터 회수하는 것도 가능하다. 회수방법으로서는 당업자에게 주지의 방법, 예를 들면 고치를 60% LiSCN으로 용해하여, 20 mM Tris, 5 M urea로 투석함으로써 회수하는 방법(Inoue, S., Tsuda, H., Tanaka, H., Magoshi, Y and Mizuno (2001) Sericologia 4, 157-163.)을 사용할 수 있으나, 이것에 한정되지 않는다. 또한, 기타 회수법으로서는, 예를 들면 계면활성제를 사용하는 방법이나 수용액으로 용해하는 방법 등이 가능하다.

또한, 본 발명에 있어서의 누에로서는 특별히 제한은 없지만, TRACP5b의 대량생산을 위해, 피브로인 단백질 등의 견사를 구성하는 단백질을 코드하는 DNA 영역(코드 영역, 프로모터 영역, 비번역 영역을 포함한다)의 변이에 의해, 견사를 구성하는 단백질의 생산이 억제되어 있는 누에를 사용하는 것이 바람직하다. 이와 같은 누에로서는, 견사를 구성하는 단백질을 코드하는 DNA 영역의 변이에 의해 견사를 구성하는 단백질의 생산이 억제되어 있는 돌연변이 계통의 누에, 바람직하게는 상기 변이에 의해 견사를 구성하는 단백질의 생산이 억제되어 있는 나용 계통의 누에, 보다 바람직하게는 Nd-s^D를 들 수 있으나, 이들에 한정되지 않는다. 본 발명의 누에는 견사를 구성하는 단백질의 생산억제의 원인이 인위적인지 여부, 또한 자연계에 있어서 발생한 변이에 의존하는지 여부에 관계없이, 견사를 구성하는 단백질의 생산이 억제되어 있는 누에이면 된다.

이와 같은 누에의 일태양은 세리신잠(sericin silkworm)으로서 당업자에게는 주지의 누에이다. 세리신잠을 이용함으로써, 중부 견사선에 있어서의 TRACP5b의 대량생산이 가능해져, 염색체에 도입된 TRACP5를 코드하는 DNA로부터 합성되는 TRACP5b의 정제도 용이해진다. 또한, 후부 견사선에 있어서 TRACP5b를 생산시킬 때에도 생산량의 측면에서 세리신잠을 사용하는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명에 있어서의 누에로서는, 비휴면란을 산란하는 성질을 갖는 누에, 휴면란을 산란하는 성질을 갖는 누에(예를 들면 실용품종인 군마, 200, 순레이, 쇼게츠, 긴슈, 쇼와 등)를 사용할 수 있다. 여기서, 휴면란이란 산란 후 배발생(embryogenesis)이 일시적으로 정지하는 알을 말하고, 비휴면란이란 산란 후 배발생이 정지하지 않고, 유충이 부화하는 알을 말한다.

휴면란을 산란하는 성질을 갖는 누에를 사용하는 경우는 비휴면란을 산란시켜, 이 비휴면란에 DNA를 도입한다. 비휴면란을 산란시키는 방법으로서는, 예를 들면 군마에 있어서는 휴면란을 15℃~21℃에서 배양함으로써 이 휴면란으로부터 발생한 성충에 비휴면란을 산란시키는 방법, 바람직하게는 휴면란을 16℃~20℃에서 배양함으로써 이 휴면란으로부터 발생한 성충에 비휴면란을 산란시키는 방법, 보다 바람직하게는 휴면란을 18℃에서 배양함으로써 이 휴면란으로부터 발생한 성충에 비휴면란을 산란시키는 방법, 가장 바람직하게는 휴면란을 18℃에서 배양함으로써 이 휴면란으로부터 발생한 유충을 전명(全明)에서 사육하고, 생육한 성충에 비휴면란을 산란시키는 방법을 들 수 있다. 또한, 200에 있어서는 휴면란을 15℃~21℃에서 배양함으로써 이 휴면란으로부터 발생한 성충에 비휴면란을 산란시키는 방법, 바람직하게는 휴면란을 16℃~20℃에서 배양함으로써 이 휴면란으로부터 발생한 성충에 비휴면란을 산란시키는 방법, 보다 바람직하게는 휴면란을 18℃에서 배양함으로써 이 휴면란으로부터 발생한 성충에 비휴면란을 산란시키는 방법, 또는 휴면란으로부터 발생한 유충을 전명에서 사육하고, 생육한 성충에 비휴면란을 산란시키는 방법, 가장 바람직하게는 휴면란을 25℃에서 배양함으로써 이 휴면란으로부터 발생한 유충을 전명에서 사육하고, 생육한 성충에 비휴면란을 산란시키는 방법을 들 수 있으나, 이들에 한정되지 않는다.

알의 배양은, 예를 들면 18℃~25℃의 인큐베이터, 또는 일정한 온도의 방에 넣음으로써 행할 수 있고, 유충의 사육은 20℃~29℃의 사육실에서 인공사료를 사용하여 행할 수 있다.

본 발명의 상기 휴면란의 배양은, 당업자에게 있어서는 일반적인 누에알의 배양법에 따라서 행할 수 있다. 예를 들면, 「문부성(1978) 잠종제조. pp193, 짓쿄 출판사, 도쿄」에 기재된 방법에 따라서 배양을 행한다. 또한, 본 발명에 있어서의 누에 유충의 사육은, 당업자에게 있어서는 주지의 방법으로 행할 수 있다. 예를 들면 「문부성(1978) 잠종제조. pp193, 짓쿄 출판사, 도쿄」에 기재된 방법에 따라서 사육을 행한다.

본 발명에 있어서, 산란된 알이 비휴면란인지 여부는 알의 색으로 판정할 수 있다. 일반적으로 휴면란은 짙은 다갈색으로 착색되고, 비휴면란은 황백색인 것이 알려져 있다. 따라서 본 발명에 있어서는 짙은 다갈색이 아닌 것, 보다 바람직하게는 황백색인 것으로 산란된 알이 비휴면란이라고 판정한다.

이하, 누에알로의 DNA의 도입방법의 구체예를 기술하나, 본 발명에 있어서의 누에알로의 DNA의 도입방법은 이 방법에 한정되는 것은 아니다. 예를 들면, 누에알로 DNA 주입용 관을 사용하여 직접 알 내로 DNA를 도입하는 것이 가능하나, 바람직한 형태로서는 사전에 물리적 또는 화학적으로 난각에 구멍을 뚫어, 이 구멍으로부터 DNA를 도입한다. 이때, DNA 주입용 관을 삽입각도가 상기 알의 복측의 측면에 대해서 거의 수직이 되도록 상기 구멍으로부터 알 내에 삽입할 수 있다.

본 발명에 있어서, 물리적으로 난각에 구멍을 뚫는 방법으로서는, 예를 들면 바늘, 미소 레이저 등을 사용해서 구멍을 뚫는 방법을 들 수 있다. 적합하게는 바늘을 사용한 방법에 의해 난각에 구멍을 뚫을 수 있다. 상기 바늘은 누에의 난각에 구멍을 뚫을 수 있는 것이면, 그 바늘의 재질, 강도 등은 특별히 제한되지 않는다. 또한, 본 발명에 있어서의 바늘이란, 통상 선단이 뾰족한 봉형상의 바늘을 가리키나, 이 형상에 한정되지 않고, 난각에 구멍을 뚫을 수 있는 것이면, 전체의 형상은 특별히 제한되지 않는다. 예를 들면, 선단이 뾰족한 피라미드형 물질, 또는 선단이 뾰족한 삼각뿔 형상의 물질도 또한 본 발명의 「바늘」에 포함된다. 본 발명에 있어서는 텅스텐 바늘을 적합하게 사용할 수 있다. 본 발명의 바늘의 굵기(직경)는 후술하는 캐필러리가 통과 가능한 구멍을 뚫을 수 있을 정도의 굵기이면 되고, 통상 2~20 ㎛, 바람직하게는 5~10 ㎛이다. 한편, 화학적으로 난각에 구멍을 뚫는 방법으로서는, 예를 들면 약품(차아염소산 등) 등을 사용해서 구멍을 뚫는 방법을 들 수 있다.

본 발명에 있어서, 구멍을 뚫는 위치로서는, 상기 구멍으로부터 DNA 주입용 관을 삽입한 경우에 알의 복측의 측면에 대한 삽입각도를, 거의 수직으로 할 수 있는 위치이면 특별히 제한은 없지만, 바람직하게는 복측의 측면 또는 그 반대측이고, 보다 바람직하게는 복측의 측면이며, 더욱 바람직하게는 알의 복측 측면의 다소 후단(後端)에 가까운 중앙부이다.

본 발명에 있어서「거의 수직」이란, 70°~120°를 의미하고, 바람직하게는 80°~90°를 의미한다. 본 발명에 있어서, 「장래적으로 생식세포가 되는 위치」로서는, 통상 알의 복측의 난표(卵表)에 가까운 위치(통상, 난표로부터 0.01 ㎜~0.05 ㎜의 위치)이고, 바람직하게는 알의 복측 중앙의 난표에 가까운 위치에서 다소 후극(後極)에 가까운 위치이다.

본 발명의 DNA 주입용 관의 재질, 강도, 내경 등은 특별히 제한되지 않지만, DNA 주입용 관을 삽입하기 전에, 물리적 또는 화학적으로 난각에 구멍을 뚫는 경우는, 뚫린 구멍을 통과할 수 있는 굵기(외경)인 것이 바람직하다. 본 발명의 DNA 주입용 관으로서는, 예를 들면 유리 캐필러리 등을 들 수 있다.

본 발명의 DNA의 도입방법에 있어서 바람직한 태양으로서는, 상기의 누에알에 물리적 또는 화학적으로 구멍을 뚫어, DNA 주입용 관을 삽입각도가 상기 알의 복측의 측면에 대해 거의 수직이 되도록 상기 구멍으로부터 알 내에 삽입하고, DNA를 주입하는 공정을, 바늘과 DNA 주입용 관이 일체형으로 된 머니퓰레이터(manipulator)를 사용하여 행한다. 통상, 상기 머니퓰레이터를 구성요소의 하나로 하는 장치를 사용하여 본 발명은 적합하게 시행된다.

이와 같은 장치로서는, 해부현미경, 조명장치, 가동식 스테이지, 현미경에 금구(metal fitting)로 고정한 조동 머니퓰레이터(coarse manipulator), 이 머니퓰레이터에 부착한 마이크로머니퓰레이터, DNA를 주사하기 위한 공기압을 조정하는 인젝터로 구성되어 있다. 인젝터에 사용하는 압력은 질소 봄베로부터 공급되고, 압력의 스위치는 풋 스위치에 의해 넣을 수 있다. 주사는 유리 슬라이드 등의 기판 상에 고정한 알에 대해 행하고, 알의 위치는 이동식 스테이지에 의해 결정한다. 또한, 마이크로머니퓰레이터의 유리 캐필러리는 4개의 튜브로 연결된 조작부에 의해 조작한다. 실제의 순서는 알에 대한 텅스텐 바늘의 위치를 조동 머니퓰레이터로 정하고, 스테이지의 레버로 수평방향으로 알을 움직여 구멍을 뚫는다. 계속해서, 마이크로머니퓰레이터의 조작부의 레버를 조작하여, 구멍의 위치에 유리 캐필러리의 선단을 유도하고, 다시 스테이지의 레버에 의해 캐필러리를 알에 삽입한다. 이 경우, 알의 복측 측면에 대해 수직으로 유리 캐필러리가 삽입될 필요가 있다. 풋 스위치를 넣어 DNA를 주사하고, 레버를 조작하여 알로부터 캐필러리를 뺀다. 뚫은 구멍을 순간접착제 등으로 막고, 일정한 온도 및 일정한 습도의 인큐베이터에서 보호한다. 본 발명에 사용되는 장치로서는, 바람직하게는 일본국 특허 제1654050호에 기재된 장치 또는 이 장치를 개량한 장치를 들 수 있다.

또한, 본 발명의 태양에 있어서는, DNA의 도입에 사용하는 누에알이 기판에 고정되어 있는 것이 바람직하다. 본 발명의 기판으로서, 예를 들면 슬라이드글라스, 플라스틱판 등을 사용할 수 있으나, 이들에 특별히 제한되지 않는다. 본 발명의 상기 태양에 있어서는, 누에알 내의 장래적으로 생식세포가 되는 위치에 정확하게 DNA를 주사하기 위해, 알의 방향을 맞춰 고정하는 것이 바람직하다. 또한, 상기 태양에 있어서는, 기판으로 고정하는 누에알의 수에는 특별히 제한은 없다. 또한, 복수개의 누에알을 사용하는 경우, 누에알을 기판으로 고정하는 방향성으로서는, 바람직하게는 배복 방향(dorsoventral direction)이 일정해지는 방향이다. 본 발명의 상기 누에알의 기판으로의 고정은, 예를 들면 수성 풀을 미리 도포한 시판의 대지(臺紙)(다양한 대지) 상에 산란시켜, 대지에 물을 첨가하여 알을 벗겨내고, 이어서 젖은 상태의 알을 기판에 정렬시켜, 풍건함으로써 행한다. 알은 슬라이드글라스 상에 알의 방향을 맞춰 고정하는 것이 바람직하다. 또한, 알의 기판으로의 고정은 양면 테이프나 접착제 등을 사용하는 것에 의해도 가능하다.

누에알에 DNA가 도입되었는지 여부는, 예를 들변 주사한 DNA를 알에서 다시 추출하여 측정하는 방법(Nagaraju, J., Kanda, T., Yukuhiro, K., Chavancy, G., Tamura, T. and Couble, P. (1996) Attempt of transgenesis of the silkworm (Bombyx mori L) by egg-injection of foreign DNA. Appl. Entomol. Zool., 31, 589-598)이나, 주사한 DNA의 알 내에서의 발현을 보는 방법(Tamura, T., Kanda, T., Takiya, S., Okano, K. and Maekawa, H. (1990). Transient expression of chimeric CAT genes injected into early embryos of the domesticated silkworm, Bombyx mori. Jpn. J. Genet., 65, 401-410) 등에 의해 확인할 수 있다.

본 발명의 TRACP5b의 제조방법의 다른 구체적인 태양에 있어서는, TRACP5b는 누에의 지방체에 있어서 생산되는 것을 특징으로 한다. 즉 본 발명은 이하의 (a) 및 (b)의 공정을 포함하는, TRACP5b의 제조방법에 관한 것이다.

(a) 세포질 액틴 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터, 및 이 프로모터에 의해 직접적 또는 간접적으로 발현 제어되는 TRACP5를 코드하는 DNA를 갖는 누에로서, TRACP5b를 지방체에 분비하는 누에를 제조하는 공정.

(b) 제조된 누에로부터 상기 TRACP5b를 회수하는 공정.

본 발명의 누에를 제조하는 공정에 있어서는, 먼저 세포질 액틴 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터, 및 이 프로모터에 의해 직접적 또는 간접적으로 발현 제어되는 TRACP5를 코드하는 DNA를 갖는 누에알을 제조한다. 이어서, 제조된 누에알로부터 생산된 누에 중에서, TRACP5b를 지방체에 분비하는 누에를 선택한다. 누에의 선택은 전술한 방법으로 행하는 것이 가능하다.

본 발명에 있어서의 세포질 액틴 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터, 및 이 프로모터에 의해 직접적으로 발현 제어되는 TRACP5를 코드하는 DNA를 갖는 누에알로서는, 예를 들면 세포질 액틴 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터 하류에, TRACP5를 코드하는 DNA가 기능적으로 결합한 DNA를 갖는 누에알을 들 수 있다. 이와 같은 누에알은 세포질 액틴 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터 하류에, TRACP5를 코드하는 DNA가 기능적으로 결합한 DNA를 누에알에 도입함으로써 제조할 수 있다.

또한, 본 발명에 있어서의 세포질 액틴 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터, 및 이 프로모터에 의해 간접적으로 발현 제어되는 TRACP5를 코드하는 DNA를 갖는 누에알로서는, 예를 들면 (i) 세포질 액틴 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터 하류에, 전사제어인자를 코드하는 DNA가 기능적으로 결합한 DNA, 및 (ii) 상기 전사제어인자의 표적 프로모터 하류에, TRACP5를 코드하는 DNA가 기능적으로 결합한 DNA를 갖는 누에알을 들 수 있다. 「기능적으로 결합한」의 정의는 전술한 바와 같다. 또한, 전사제어인자와 표적 서열의 조합도 전술한 것을 들 수 있다.

누에알의 제조는 전술한 방법으로 행하는 것이 가능하다. 예를 들면, 상기 (i) 및 (ii)의 DNA를 각각의 누에알에 도입한다. 양쪽의 DNA를 갖는 누에알은, 각각의 DNA가 도입된 누에알로부터 발생한 누에끼리를 교배시킴으로써 얻을 수 있다. 또한, 상기 (i) 및 (ii)의 DNA를 갖는 누에알은, 한쪽의 DNA가 도입된 누에가 산란한 알에, 다른 한쪽의 DNA를 인위적으로 도입함으로써 얻을 수 있다. 더 나아가서는, 상기 (i)의 DNA와 상기 (ii)의 DNA를 동일한 알에 도입하는 것에 의해도 양쪽의 DNA를 갖는 누에알을 얻을 수 있다. 누에알로의 DNA의 도입은 전술한 방법으로 행할 수 있다.

상기 세포질 액틴 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터로서는, 서열번호: 10에 기재된 염기서열을 포함하는 DNA를 들 수 있다. 서열번호: 10에 기재된 염기서열을 포함하는 DNA로서는, 서열번호: 10에 기재된 염기서열로 되는 DNA, 서열번호: 10에 기재된 염기서열로 되는 DNA의 상류역이나 하류역을 포함하는 DNA 등을 들 수 있으나, 이들에 한정되는 것은 아니다.

또한, 본 발명에 있어서의 세포질 액틴 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터로서, 서열번호: 10에 기재된 염기서열을 포함하는 DNA와 구조적으로 유사하고, 또한 서열번호: 10에 기재된 염기서열을 포함하는 DNA와 동등 또는 개선된 프로모터 활성능을 갖는 DNA도 들 수 있다. 이들의 프로모터도 또한, 전술한 방법으로 조제하는 것이 가능하다. 서열번호: 10에 기재된 염기서열로 되는 DNA의 상류역이나 하류역은, 문헌(MANGE, A., E. JULIEN, J. C. PRUDHOMME and P. COUBLE, 1997 A strong inhibitory element down-regulates SRE-stimulated transcription of the A3 cytoplasmic actin gene of Bombyx mori. J Mol Biol 265: 266-274.)에 개시되어 있다.

상기 전사제어인자와 표적 서열의 조합은 전술한 것을 사용하는 것이 가능하다. 또한, 세포질 액틴을 코드하는 DNA의 프로모터 하류에, GAL4 유전자를 연결한 것을 누에 게놈에 삽입한 누에(상기 (i)의 DNA를 갖는 누에알로 제작된 누에)의 구체적인 태양 및 제작방법은, 문헌(IMAMURA, M., J. NAKAI, S. INOUE, G. X. QUAN, T. KANDA et al., 2003 Targeted gene expression using the GAL4/UAS system in the silkworm Bombyx mori. Genetics 165: 1329-1340.)에 개시되어 있다.

또한 본 발명에 있어서는, 세포질 액틴 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터에 의해 직접적 또는 간접적으로 발현 제어되는 TRACP5를 코드하는 DNA는 시그널서열을 가지고 있어도 된다. 시그널서열의 구체적인 태양은 전술한 바와 같다.

상기의 방법으로 생산되는 TRACP5b는, 예를 들면 지방체로부터 회수할 수 있다. 지방체로부터의 TRACP5b의 회수는 당업자이면 공지의 방법, 예를 들면 유충체 내에서 지방체를 적출하여, 단백질 추출을 위한 완충액으로 호모지나이즈하는 것이나 지방체로부터 체액으로 분비시키고, 체액을 분취함으로써 행하는 것이 가능하다.

또한, TRACP5b와 TRACP5a의 분리도 전술한 방법으로 행하는 것이 가능하다.

또한, 본 발명의 방법으로 제조되는 TRACP5b는 본 발명의 방법으로 제조되는 한 조금도 한정되지 않고, 시그널서열을 가지고 있어도 되고, 가지고 있지 않아도 된다. 즉, 본 발명의 TRACP5b의 제조방법으로 제조되는 TRACP5b에는 시그널서열을 가지고 있는 TRACP5b, 시그널서열을 가지고 있지 않은 TRACP5b의 양쪽이 포함된다.

또한, 본 발명은 TRACP5를 코드하는 DNA를 갖는 누에로서, TRACP5b를 분비하는 누에에 관한 것이다. 구체적으로는, 견사선 특이적으로 발현하는 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터, 및 이 프로모터에 의해 직접적 또는 간접적으로 발현 제어되는 TRACP5를 코드하는 DNA를 갖는 누에로서, TRACP5b를 견사선에 분비하는 누에에 관한 것이다. 또한, (i) 견사선 특이적으로 발현하는 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터 하류에, 기능적으로 결합한 전사제어인자를 코드하는 DNA, 및 (ii) 상기 전사제어인자의 표적 프로모터 하류에, 기능적으로 결합한 TRACP5를 코드하는 DNA를 갖는 누에, 또는 견사선 특이적으로 발현하는 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터 하류에, TRACP5를 코드하는 DNA가 기능적으로 결합한 DNA를 갖는 누에를 제공한다.

또한 본 발명에 있어서는, 견사선 특이적으로 발현하는 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터에 의해 직접적 또는 간접적으로 발현 제어되는 TRACP5를 코드하는 DNA는, TRACP5b의 분비를 촉진하여 회수량을 많게 하기 위해, 시그널서열을 가지고 있어도 된다. 시그널서열의 구체적인 태양은 전술한 바와 같다.

또한 본 발명은, 세포질 액틴 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터, 및 이 프로모터에 의해 직접적 또는 간접적으로 발현 제어되는 TRACP5를 코드하는 DNA를 갖는 누에로서, TRACP5b를 지방체에 분비하는 누에에 관한 것이다. 구체적으로는, (i) 세포질 액틴 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터 하류에, 기능적으로 결합한 전사제어인자를 코드하는 DNA, 및 (ii) 상기 전사제어인자의 표적 프로모터 하류에, 기능적으로 결합한 TRACP5를 코드하는 DNA를 갖는 누에, 또는 세포질 액틴 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터 하류에, TRACP5를 코드하는 DNA가 기능적으로 결합한 DNA를 갖는 누에를 제공한다.

또한 본 발명에 있어서는, 세포질 액틴 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터에 의해 직접적 또는 간접적으로 발현 제어되는 TRACP5를 코드하는 DNA는, TRACP5b의 분비를 촉진하여 회수량을 많게 하기 위해, 시그널서열을 가지고 있어도 된다. 시그널서열의 구체적인 태양은 전술한 바와 같다. 또한 본 발명의 누에에는 그 알도 포함된다.

이들의 누에는 전술한 방법으로 제작할 수 있다. 또한 본 발명의 누에의 상태에 특별히 제한은 없고, 예를 들면 알의 상태여도 된다. 본 발명의 누에를 사용함으로써 TRACP5b를 대량으로 생산할 수 있다.

또한, 본 발명은 전사제어인자의 표적 프로모터 하류에, 기능적으로 결합한 TRACP5를 코드하는 DNA를 갖는 누에도 제공한다. 전사제어인자, 표적 프로모터로서는 전술한 것을 들 수 있다. 이와 같은 누에는 상기 (i) 및 (ii)의 DNA를 갖는 누에의 제조나, 그 알의 제조에 이용할 수 있다.

또한 본 발명에 있어서는, 견사선 특이적으로 발현하는 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터에 의해 직접적 또는 긴접적으로 발현 제어되는 TRACP5를 코드하는 DNA는, TRACP5b의 분비를 촉진하여 회수량을 많게 하기 위해, 시그널서열을 가지고 있어도 된다. 시그널서열의 구체적인 태양은 전술한 바와 같다.

또한, 본 발명은 본 발명의 누에에 의해 토사된 고치를 제공한다. 이와 같은 고치는 TRACP5b를 대량으로 함유하는 고치로서 유용하다. 또한, 본 발명은 상기 고치로부터 제조되는 견사로서, TRACP5b를 포함하는 견사를 제공한다. 또한, 공지의 수법으로 본 발명의 견사를 함유하는 견직물, 예를 들면 TRACP5b를 함유하는 견직물을 제작할 수 있다. 본 발명은 이와 같은 견직물도 제공하는 것이다.

또한, 본 발명은 본 발명의 방법에 사용하기 위한 DNA를 제공한다. 이와 같은 DNA로서는, (a) 세리신 또는 피브로인을 코드하는 DNA의 프로모터 하류에, 기능적으로 결합한 전사제어인자를 코드하는 DNA, (b) 상기 전사제어인자의 표적 프로모터 하류에, 기능적으로 결합한 TRACP5를 코드하는 DNA, (c) 세리신 또는 피브로인을 코드하는 DNA의 프로모터 하류에, TRACP5를 코드하는 DNA가 기능적으로 결합한 DNA 등을 들 수 있고, 이들의 조합으로 되는 키트로서 제공해도 된다. 또한, 본 발명은 트랜스포존의 역위 말단 반복서열 사이에, (a)~(c)의 DNA를 삽입한 벡터를 제공한다. 또한, 이 벡터와 트랜스포존 전이효소를 코드하는 DNA를 갖는 벡터(헬퍼 벡터)를 포함하는 키트를 제공한다.

또한, 전사제어인자의 표적 프로모터 하류에, 기능적으로 결합한 TRACP5를 코드하는 DNA, 및 세리신 또는 피브로인을 코드하는 DNA의 프로모터 하류에, TRACP5를 코드하는 DNA가 기능적으로 결합한 DNA는, TRACP5b의 분비를 촉진하여 회수량을 많게 하기 위해, 시그널서열을 가지고 있어도 된다. 시그널서열의 구체적인 태양은 전술한 바와 같다.

본 발명의 제조방법으로 얻어지는 TRACP5b는, 예를 들면 TRACP5b의 특이적 저해제, 활성화제, 또는 모듈레이터의 후보 화합물의 스크리닝에 사용하는 것이 가능하다. TRACP5b의 특이적 저해제, 활성화제, 또는 모듈레이터는 골 흡수의 증가에 관련된 질환의 치료에 유용하다. 골 흡수의 증가에 관련된 질환으로서는 조직장애, 골 대사 질환, 골다공증 등을 들 수 있으나 이들에 한정되지 않는다.

TRACP5b의 특이적 저해제, 활성화제, 또는 모듈레이터의 후보 화합물의 스크리닝은, 예를 들면 이하의 (a)~(c)의 공정을 포함하는 방법으로 행할 수 있다.

(a) TRACP5b에 대한 기질의 존재하에 있어서, 본 발명의 방법으로 제조된 TRACP5b와 피검 화합물을 혼합하는 공정

(b) TRACP5b 활성을 측정하는 공정

(c) 피검 화합물의 비존재하와 비교하여, TRACP5b 활성을 변화시킨 피검 화합물을 선택하는 공정

TRACP5b의 특이적 저해제, 활성화제, 또는 모듈레이터의 후보 화합물의 스크리닝에 있어서는, 먼저 TRACP5b에 대한 기질의 존재하에 있어서, 본 발명의 방법에 의해 제조된 TRACP5b와 피검 화합물을 혼합한다. 본 발명의 방법에 있어서의 피검 화합물로서는 특별히 제한은 없고, 예를 들면 천연화합물, 유기화합물, 무기화합물, 단백질, 펩티드 등의 단일화합물, 및 화합물 라이브러리, 유전자 라이브러리의 발현산물, 세포추출물, 세포배양상청, 발효 미생물 생산물, 해양생물 추출물, 식물 추출물, 원핵세포 추출물, 진핵단세포 추출물 또는 동물세포 추출물 등을 들 수 있다.

또한, TRACP5b에 대한 기질로서는 p-니트로페닐인산에스테르 등의 합성기질을 들 수 있으나, 이들에 한정되지 않는다.

TRACP5b 활성의 측정은, 예를 들면 기질로서 p-니트로페닐인산에스테르를 사용하여, TRACP5b와 그 기질의 반응에 의해 생성되는 히드록시화합물, 즉 p-니트로페놀의 양을 측정함으로써 행한다. p-니트로페놀의 양은, 예를 들면 파장 405 ㎚의 흡광도를 측정함으로써 측정할 수 있고, 그 파장의 흡광도의 변화를 측정함으로써, TRACP5b 활성을 측정할 수 있다.

마지막으로, 상기에서 측정된 TRACP5b 활성과, 피검 화합물의 비존재하에 있어서의 TRACP5b 활성을 비교한다. 비교 결과, TRACP5b 활성을 변화시킨 피검 화합물은 TRACP5b의 모듈레이터로서 선택된다. 특히, 비교 결과, TRACP5b 활성을 감소시킨 피검 화합물은 TRACP5b의 특이적 저해제의 후보 화합물로서 선택된다. 또한, 비교 결과, TRACP5b 활성을 증가시킨 피검 화합물은 TRACP5b의 활성화제의 후보 화합물로서 선택된다.

또한 본 명세서에 있어서 인용된 모든 선행기술문헌은 참조로서 본 명세서에 포함된다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 보다 구체적으로 설명하나 본 발명은 이들 실시예에 제한되는 것은 아니다.

재료와 방법

[벡터 구축]

본 발명에서는 먼저, 인간 TRACP를 재조합 누에에 발현시키기 위해 사용하는 플라스미드 벡터 pBMCSUASsigTRACP(도 1 및 서열번호: 1)를 제작하였다. 이 재조합 누에 제작을 위한 벡터는, 효모의 전사제어인자 GAL4의 존재하에서 유전자 발현을 촉진하는 프로모터 UAS의 하류에, 트랜스포존 piggyBac의 역위 말단 반복서열 사이에 삽입된 인간 TRACP 유전자를 갖는다. 또한 이 벡터는 재조합 누에를 동정하기 위한 마커 유전자로서, 배(embryo)의 홑눈이나 나방의 곁눈, 신경 유래의 조직에서의 발현을 촉진하는 프로모터에 연결된 녹색형광단백질 유전자 3xP3GFP를 가지고 있다(Horn, C., and E. A. Wimmer, (2000) Dev Genes Evol 210: 630-637; Murizio et al. (1994) Protein Science, 3: 1476-1484).

[재조합 누에의 제작, 및 재조합 단백질 발현 계통의 수립]

재조합 누에의 제작을 위해, 플라스미드 벡터 pBMCSUASsigTRACP와 헬퍼 플라스미드를 누에 초기 배 461개에 인젝션하였다. 60의 탐란(探卵) 나방수로부터 마커 유전자를 갖는 초기 배를 조사한 결과, 5 나방구의 재조합 누에를 확인하였다(표 1). 최종적으로, 이 중에서 3 나방구의 재조합체를 계통화할 수 있었다. 본 발명에 있어서는, 인간 타르타르산 저항성 산성 포스파타아제 유전자를 견사선에 발현시키기 위한 GAL4 계통으로서, 이미 계통화되어 있는 Ser1-GAL4 계통(다무라 등, 일본 누에 강요 74, p51)을 사용하였다. 이 재조합 누에는 배의 홑눈 및 나방의 곁눈에 적색형광단백질을 발현한다. 또한 이 재조합 누에는 중부 견사선에서만 GAL4 유전자를 발현하고 있는 것으로부터, UAS에 제어되는 도입 유전자를 발현하는 것이 확인되어 있다(다무라 등, 2004). 이에, 도 2에 나타내는 바와 같이, 도입한 인간 TRACP 유전자를 발현시키기 위해, 얻어진 UAS-TRACP 계통의 3 나방구 중에서 2계통을, 상기의 Ser1-GAL4 계통과 교배하였다. 여기서 사용한 Ser1-GAL4 계통은 배의 홑눈에서 적색형광단백질을 발현하고 있다. UAS-TRACP 계통과 Ser1-GAL4 계통을 교배하여 얻어진 차세대의 산란 후 6일째의 알을 실체 형광현미경으로 관찰하여, 적색형광단백질과 녹색형광단백질의 양쪽을 갖는 Ser1-GAL4/UAS-TRACP 개체를 동정하였다(도 3). Ser1-GAL4/UAS-TRACP 개체를 사육하여, 5령(令) 토사기의 누에로부터 견사선을 적출하여, 20 mM Tris-HCl 100 mM NaCl pH 7.4로 단백질을 추출하였다. 마찬가지로, 대조로서 인간 TRACP 유전자를 갖지 않는 Ser1-GAL4 계통의 5령 토사 0일째의 누에에 대해서도 견사선을 적출하여 단백질을 추출하였다.

[RT-PCR]

인간 TRACP 유전자의 전사를 확인하기 위해, RT-PCR은 이하와 같이 행하였다. 전술한 바와 같이, GAL4와 UAS의 양쪽 유전자를 갖는 개체를 사육하여, 5령 토사기의 누에로부터 중부 견사선을 적출하였다. 마찬가지로, 대조로서 Ser1-GAL4 계통의 5령 토사 0일째의 누에에 대해서도 견사선을 적출하였다. 이어서, 적출한 중부 견사선을 유리 호모지나이저(WHEATON사)로 옮기고, ISOGEN(닛폰 진사)을 사용하여 total RNA를 추출하였다. 이 total RNA를 DPEC수로 50 ㎍/20 ㎕로 조제하고, First-strand cDNA Synthesis Kit(GE 헬스케어사)를 사용하여, 첨부문서에 따라서 cDNA로의 역전사를 행하였다. 이 역전사산물을 주형으로 하여 이하의 PCR을 행하였다. 즉, TaKaRa Ex Taq HS(다카라바이오사)에 첨부의 10×PCR 버퍼를 5 ㎕, 150 μM의 플라스미드 벡터 pBMCSUASsigTRACP(서열번호: 1), 150 μM의 프라이머(서열번호: 2 및 3), 0.2 mM dNTPs를 2 단위 EX Taq HS가 되도록 첨가하여, 전량 50 ㎕로 하였다. eppendorf사의 DNA 써멀 사이클러로 98℃ 2분 1회, 98℃ 10초, 57.5℃ 30초, 72℃ 30초의 사이클을 40회, 72℃ 4분 1회의 신장반응을 행하였다.

[활성측정]

TRACP5b는 다음과 같이 하여 측정하였다. 인간 TRACP5b를 인식하는 단일클론항체 Trk62(수탁번호 IPOD FERMBP7890)를 감작한 마이크로플레이트에, Ser1-GAL4/UAS-TRACP 개체 또는 대조인 Ser1-GAL4 개체의 견사선으로부터 추출한 단백질 용액을 실온에서 1시간 반응시켰다. 계속해서 세정조작을 행한 후, 타르타르산 및 클로로니트로페닐인산을 포함하는 기질 완충액을 첨가하여 37℃에서 1시간 인큐베이션하고, 405 ㎚의 흡광도를 측정함으로써 TRACP5b를 측정하였다(표 2).

[Acidic 디스크 전기영동에 의한 TRACP5b 생산의 확인]

Acidic 디스크 전기영동은 이하의 순서로 행하였다. 디스크 전기영동장치(ATTO사)의 캐필러리 유리관에 7.5% 아크릴아미드 분리 겔을 45 ㎜ 적층하고, 그 위에 2.5% 아크릴아미드 농축 겔 4 ㎜를 중층하였다. 여기에, Ser1-GAL4/UAS-TRACP 개체, 즉 본 발명의 누에의 견사선으로부터 추출한 단백질 용액을 CM-Sepharose 칼럼에 어플라이하여, 10 mM Tris-HCl pH 7.2, NaCl 0-0.5 M의 리니어 그래디언트로 용출하였다. 이 용출 분획의 TRACP 활성을 측정하여, TRACP 활성이 있는 분획을 회수하고, 스핀 칼럼으로 농축하였다. 계속해서, Superdex200 칼럼으로 겔 여과를 행하고, 마찬가지로 TRACP 활성을 갖는 분획을 회수하여 농축하였다. 또한, TRACP 활성을 갖는 분획을 헤파린 칼럼(HiTrap Heparin HP, GE 헬스케어사)을 사용하여, NaCl을 포함하는 20 mM Tris-HCl pH 7.2의 리니어 그래디언트(0.35 M-1 M)로 정제하였다. 마찬가지로 TRACP 활성을 갖는 피크 1 및 피크 2로 되는 분획을 각각 스핀 칼럼으로 20 U/L가 되도록 농축하였다. 이 농축 샘플 50 μL에 BSA 및 글리세롤을 첨가하여, 캐필러리 상부에 어플라이하였다. 그리고, 35 mM β-알라닌 pH 4.0의 영동 버퍼로 캐필러리 상부가 양극이 되도록 4 mA/캐필러리로 90분간 통전(通電)하였다. 통전 종료 후, α-나프틸산, Fast Garnet GBC, 타르타르산을 포함하는 0.1 M 구연산 완충액(pH 5.0)으로 되는 염색액 중에 침지하여, 활성 염색을 행하였다. 마찬가지로, 대조로서 인간 혈청에 대해서도 동일한 전기영동을 행하였다. 그 결과, 도 5에 나타내는 바와 같이 Ser1-GAL4/UAS-TRACP 개체로부터 추출한 재조합 단백질은, 인간 뼈 유래 TRACP5b 또는 인간 혈청과 동일하게 TRACP5b를 생산하고 있는 것이 명확해졌다.

결과

도 1은 인간 타르타르산 저항성 산성 포스파타아제 유전자 재조합 누에를 제작하기 위한 플라스미드 벡터이다. 이 플라스미드 벡터와 헬퍼 플라스미드 pA3PIG (Tamura et al., Nature Biotechnology (2000) 18, 81-84.)를 461개의 누에알에 주사하였다. 차세대 배의 홑눈에 발현한 녹색형광단백질을 형광현미경으로 관찰한 결과, 5 나방구의 재조합체를 확인할 수 있었다(표 1). 이들의 재조합 누에를 사육하여, 3 나방구에 대해서 계통화할 수 있었다. 도 2에 나타내는 바와 같이, 얻어진 UAS-TRACP 계통을 Ser1-GAL4 계통과 교배하여, 재조합 인간 타르타르산 저항성 산성 포스파타아제를 발현하는 Ser1-GAL4/UAS-TRACP 계통을 수립하였다. 여기서 교배한 암나방이 산란한 산란 후 6일째의 배를 실체 형광현미경으로 관찰하여, 도 3과 같이 홑눈에 녹색형광단백질 및 적색형광단백질의 양쪽을 갖는 개체를 확인하였다. 이 Ser1-GAL4/UAS-TRACP 계통을 사육하여, 5령 토사기의 견사선으로부터 total RNA를 추출하였다. 얻어진 total RNA에 대해서 RT-PCR을 행한바, 도 4와 같이 GAL4 유전자와 TRACP 유전자의 전사가 확인되었다.

2 나방구의 Ser1-GAL4/UAS-TRACP 계통의 견사선 유래의 단백질에서는 TRACP5b가 존재하는 것에 반해, 대조에서는 존재하지 않았다. 또한, 캐필러리 상부를 양극으로 하는 산성 전기영동에 의해서도, 본 발명의 누에의 견사선으로부터 추출한 액체로부터, TRACP5b를 얻을 수 있는 것이 명확해졌다.

본 발명에 의해, 누에를 이용한 TRACP5b의 제조방법이 제공되었다. 종래, TRACP5b를 입수하기 위해서는 부상 등 어떠한 이유로 불필요해진 인간의 뼈로부터 TRACP5b를 추출할 필요가 있었다. 그러나 이 방법으로는 극소량의 TRACP5b가 얻어지는 것에 불과하다. 한편, 본 발명을 사용하면, 이하에 나타내는 바와 같이, TRACP5b를 대량으로 제조하는 것이 가능하다.

먼저, TRACP5b를 제조하는 누에는 단백질을 만드는데 적합한 견사선이라는 기관을 가져, 한마리당 수백 ㎎의 단백질을 만드는 능력이 있다. 또한 누에는 인공사료에 의한 청정사육이 가능하여, 수만마리 규모로의 대량사육을 용이하게 행할 수 있다. 이뿐아니라, 누에의 대량사육은 자연계에 풍부하게 있는 뽕잎을 사용하여 행할 수 있기 때문에, 저렴하게 TRACP5b를 제조하는 것이 가능하다.

본 발명의 방법으로 얻어지는 TRACP5b는, 예를 들면 TRACP5b의 특이적 저해제, 활성화제, 또는 모듈레이터의 후보 화합물의 스크리닝에 사용 가능하다.

SEQUENCE LISTING <110> NITTO BOSEKI CO., LTD. NATIONAL INSTITUTE OF AGROBIOLOGICAL SCIENCES <120> Method for producing TRACP5b <130> MOA-A0608P <150> JP 2006-353542 <151> 2006-12-28 <160> 10 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 7330 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized nucleotide sequence <400> 1 gacgaaaggg cctcgtgata cgcctatttt tataggttaa tgtcatgata ataatggttt 60 cttagacgtc aggtggcact tttcggggaa atgtgcgcgg aacccctatt tgtttatttt 120 tctaaataca ttcaaatatg tatccgctca tgagacaata accctgataa atgcttcaat 180 aatattgaaa aaggaagagt atgagtattc aacatttccg tgtcgccctt attccctttt 240 ttgcggcatt ttgccttcct gtttttgctc acccagaaac gctggtgaaa gtaaaagatg 300 ctgaagatca gttgggtgca cgagtgggtt acatcgaact ggatctcaac agcggtaaga 360 tccttgagag ttttcgcccc gaagaacgtt ttccaatgat gagcactttt aaagttctgc 420 tatgtggcgc ggtattatcc cgtattgacg ccgggcaaga gcaactcggt cgccgcatac 480 actattctca gaatgacttg gttgagtact caccagtcac agaaaagcat cttacggatg 540 gcatgacagt aagagaatta tgcagtgctg ccataaccat gagtgataac actgcggcca 600 acttacttct 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ctcttatact ttgcactctg cgttaatacg cgttcgtgta 6540 cagacgtaat catgttttct tttttggata aaactcctac tgagtttgac ctcatattag 6600 accctcacaa gttgcaaaac gtggcatttt ttaccaatga agaatttaaa gttattttaa 6660 aaaatttcat cacagattta aagaagaacc aaaaattaaa ttatttaatc gaccagttaa 6720 tcaacgtgta cactgacgcg tcggcaaaaa acacgcagcc cgacgtgttg gctaaaatta 6780 ttaaatcaac ttgtgttata gtcacggatt tgccgtccaa cgtgttcctc aaaaagttga 6840 agaccaacaa gtttacggac actattaatt atttgatttt gccccacttc attttgtggg 6900 atcacaattt tgttatattt taaacaaagc ttggcactgg ccgtcgtttt acaacgtcgt 6960 gactgggaaa accctggcgt tacccaactt aatcgccttg cagcacatcc ccctttcgcc 7020 agctggcgta atagcgaaga ggcccgcacc gatcgccctt cccaacagtt gcgcagcctg 7080 aatggcgaat ggcgcctgat gcggtatttt ctccttacgc atctgtgcgg tatttcacac 7140 cgcatatggt gcactctcag tacaatctgc tctgatgccg catagttaag ccagccccga 7200 cacccgccaa cacccgctga cgcgccctga cgggcttgtc tgctcccggc atccgcttac 7260 agacaagctg tgaccgtctc cgggagctgc atgtgtcaga ggttttcacc gtcatcaccg 7320 aaacgcgcga 7330 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized nucleotide sequence <400> 2 gggtgcagac ttcatcctgt 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized nucleotide sequence <400> 3 gtttcttgag ccaggacagc 20 <210> 4 <211> 978 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 atggacatgt ggacggcgct gctcatcctg caagccttgt tgctaccctc cctggctgat 60 ggtgccaccc ctgccctgcg ctttgtagcc gtgggtgact ggggaggggt ccccaatgcc 120 ccattccaca cggcccggga aatggccaat gccaaggaga tcgctcggac tgtgcagatc 180 ctgggtgcag acttcatcct gtctctaggg gacaattttt acttcactgg tgtgcaagac 240 atcaatgaca agaggttcca ggagaccttt gaggacgtat tctctgaccg ctcccttcgc 300 aaagtgccct ggtacgtgct agccggaaac catgaccacc ttggcaatgt ctctgcccag 360 attgcatact ctaagatctc caagcgctgg aacttcccca gccctttcta ccgcctgcac 420 ttcaagatcc cacagaccaa tgtgtctgtg gccattttta tgctggacac agtgacacta 480 tgtggcaact cagatgactt cctcagccag cagcctgaga ggccccgaga cgtgaagctg 540 gcccgcacac agctgtcctg gctcaagaaa cagctggcgg cggccaggga ggactacgtg 600 ctggtggctg gccactaccc cgtgtggtcc atagccgagc acgggcctac ccactgcctg 660 gtcaagcagc tacggccact gctggccaca tacggggtca ctgcctacct gtgcggccac 720 gatcacaatc tgcagtacct gcaagatgag aatggcgtgg gctacgtgct gagtggggct 780 gggaatttca tggacccctc aaagcggcac cagcgcaagg tccccaacgg ctatctgcgc 840 ttccactatg ggactgaaga ctcactgggt ggctttgcct atgtggagat cagctccaaa 900 gagatgactg tcacttacat cgaggcctcg ggcaagtccc tctttaagac caggctgccg 960 aggcgagcca ggccctga 978 <210> 5 <211> 325 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Met Asp Met Trp Thr Ala Leu Leu Ile Leu Gln Ala Leu Leu Leu Pro 1 5 10 15 Ser Leu Ala Asp Gly Ala Thr Pro Ala Leu Arg Phe Val Ala Val Gly 20 25 30 Asp Trp Gly Gly Val Pro Asn Ala Pro Phe His Thr Ala Arg Glu Met 35 40 45 Ala Asn Ala Lys Glu Ile Ala Arg Thr Val Gln Ile Leu Gly Ala Asp 50 55 60 Phe Ile Leu Ser Leu Gly Asp Asn Phe Tyr Phe Thr Gly Val Gln Asp 65 70 75 80 Ile Asn Asp Lys Arg Phe Gln Glu Thr Phe Glu Asp Val Phe Ser Asp 85 90 95 Arg Ser Leu Arg Lys Val Pro Trp Tyr Val Leu Ala Gly Asn His Asp 100 105 110 His Leu Gly Asn Val Ser Ala Gln Ile Ala Tyr Ser Lys Ile Ser Lys 115 120 125 Arg Trp Asn Phe Pro Ser Pro Phe Tyr Arg Leu His Phe Lys Ile Pro 130 135 140 Gln Thr Asn Val Ser Val Ala Ile Phe Met Leu Asp Thr Val Thr Leu 145 150 155 160 Cys Gly Asn Ser Asp Asp Phe Leu Ser Gln Gln Pro Glu Arg Pro Arg 165 170 175 Asp Val Lys Leu Ala Arg Thr Gln Leu Ser Trp Leu Lys Lys Gln Leu 180 185 190 Ala Ala Ala Arg Glu Asp Tyr Val Leu Val Ala Gly His Tyr Pro Val 195 200 205 Trp Ser Ile Ala Glu His Gly Pro Thr His Cys Leu Val Lys Gln Leu 210 215 220 Arg Pro Leu Leu Ala Thr Tyr Gly Val Thr Ala Tyr Leu Cys Gly His 225 230 235 240 Asp His Asn Leu Gln Tyr Leu Gln Asp Glu Asn Gly Val Gly Tyr Val 245 250 255 Leu Ser Gly Ala Gly Asn Phe Met Asp Pro Ser Lys Arg His Gln Arg 260 265 270 Lys Val Pro Asn Gly Tyr Leu Arg Phe His Tyr Gly Thr Glu Asp Ser 275 280 285 Leu Gly Gly Phe Ala Tyr Val Glu Ile Ser Ser Lys Glu Met Thr Val 290 295 300 Thr Tyr Ile Glu Ala Ser Gly Lys Ser Leu Phe Lys Thr Arg Leu Pro 305 310 315 320 Arg Arg Ala Arg Pro 325 <210> 6 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Met Asp Met Trp Thr Ala Leu Leu Ile Leu Gln Ala Leu Leu Leu Pro 1 5 10 15 Ser Leu Ala Asp Gly 20 <210> 7 <211> 1935 <212> DNA <213> Bombyx mori <400> 7 gaaattctta gctacatcta gcccagactg taagagtttc ttaggagctt tagaagttaa 60 agaagtacct ttgtgttgct gatccttcta tatcatctgg tcctagtaaa ggtactctct 120 tataatctcc ttcctaattc cttacctgct atttatcgat tgtaggtcgt cttggaaacc 180 agtaccactg tacaaactcg cgccccatta gtaacgtgat ttgaacggcc aaccaattga 240 tgttttaatg caattaatat cgtatcttta accccaacgt ggttctgcgt taactaagtg 300 ctcaccgctg tcaacagcaa taaaaccatt tttgaaataa taacatcatt acactaacat 360 agtgagctag tcgcaaaatg tatgtagaga gaaaacaaac cttctttggg gtgttgagag 420 gaaatcgctg gattagaact atcgtgaaga ccattcactg atcctgtgta cttaaattcg 480 cggattcagc attaagcgcc ggatctcagt tccatcgtaa tcccagttaa agaggtgaaa 540 ttagctatca cttcgatatc tgttctgaaa gcaatgttcc acttgtaaaa gcataagcgg 600 tcagaaacct tgttaaccaa tagagccaaa tatagttaac acaatagaaa tttatccaaa 660 tattattcgt gtattgttta tagcctttgt caagtctttt acaaggcaag ataataagta 720 atattccgtg attggacgta acatttcccg gaagatcctt agccgataag tcgaagagcc 780 gcatgtggct agagagacgc gggtttccga ccactggctt aggcgcttat tccgccataa 840 tagatgtacg tgttcacaat tagcacccga aattcgtaat agctacgaga agtatcgaat 900 atcaaaaatc tatatattaa tacgtgaagc aaaaactttg tatccctttt tacgaaaatt 960 gcgaggacgg aggagtatga aatttcccac acttatagag aatacagaga agaagtgcac 1020 aatgctaata tttttttaaa ataatgcata aaagatactt taaatcaata aagaaaacag 1080 cacacacact acataccatg tatttgacgc acacacgcat gtatactatt tattgtcaaa 1140 cttttgttct tgacgtctgt gttcaaactg agaatagatt aaatattgtt tgtctttatt 1200 aatatttttt aatagtgtag tcttggcgaa atttgtgatt atagaagtat aaaatacaat 1260 cataatagtg tacaaactta caattcccaa ttaattatag tcgaatttcg actactgcgg 1320 gacctctagt attaataatt ctctttaaaa aaaaacagag catcaaatac tgtcacaaat 1380 gtcaagcggg tctcaacgag ccatgaataa attagaaatc aattaataac ataaaatagg 1440 caaacaaaat aaaaccattt acatagagaa cgtttgttga acaaaaacaa taacttgtat 1500 acattgtttg cacaaatgtt tgaaccgaaa atttattact ctctacgtaa gcttgatcaa 1560 acttcgtttt cgtataaaac gcgttggccc aaccactttg gcatagtcgt cttatcatcg 1620 ggtctctaag gatcaagcga tccaaagacc gccaacatgc gtttcgttct gtgctgcact 1680 ttgattgcgt tggctgtgag tatcattgct tcgttatcaa caatgacgta tttactaaga 1740 acactcttag atatgccttc aaattaaagc tttcaaagct ctgaagttca ccaaatgcga 1800 ctgttttagc gtaagcattt ctatccccca acagccattt agcgactacc cgaaaatcac 1860 tcgatttaac ttgggagttt ctgcaattta aaagttcaca ggtcgtctcc gattatactt 1920 ttaaacgctt cgcgc 1935 <210> 8 <211> 2036 <212> DNA <213> Bombyx mori <400> 8 cagaatctac cacgatcgga aacgcgaccc actgagaaga tccggcgaga aactcagtga 60 gctgtgtcta tgggttaatt tactcgtcga gccctgttta ctgtttaggg cgacgtcgac 120 tgttaccatt cggtctacag gatcgagtgt gcattcttgt atcatcgttc tattatcacg 180 agtcattttg cgttttttcg gatcccctgg aagtcgtcgt ggcctaagag ataagaagtc 240 cggtgcattc gtgttgagcg atgcacctgt gttcgaatcc taggcgggta ccaatttttc 300 taatgaatta cgtacccaac aaatgttcac gattgccttc cacggtgaag gaataacatc 360 gtgcaataaa agtgaaaccc gcaaaatccg gtgcttttaa gcttttcaag caccggtcac 420 catcctcgtt gaactcatcg atctacaagc gatctaatct atagacccaa tccactaaga 480 tctcaccgga tcttctcagt ggttcgcatt ccagtggtag attcaattcg ctgctcttgc 540 tagggctagt gttagcaaat tccttcgggt taagcccgag agctcaccta tccgtccgcg 600 ctaagctgga aaagcccctt aagctgtttt ttttttgtat agcctttatt gctaatacta 660 aacaataact aataatttta catacagtaa caaattgttt taacttaaat ctaatacatc 720 ggatttcccg gttcagtgat cagcgtgtcc tgtgacacat aggcctcttc cagctgcttt 780 catttttctc tattggtagc ttttcttgac cagattgtct ctccaatcat cttgatatcg 840 tctgtccatc ttctagcttg cctggctctt ttcctttaaa ccaggggtcg tgaattcaat 900 cctcacagga agccgggatt aggtgggaga atatagttcc gatgttttga atgctttata 960 ttttctgtgg tcgaaaatga tactagagct acgcgtcgac aattgaatat tatgctaact 1020 accctctatt tattaaaaga cttttacgat tcatttcgca cagaaccaat cgactgggtt 1080 tagaggttta gcagtttgtt gaatgaactc gttttcatct tcacgattag aggatcccag 1140 gtgttaggta aaggatattc tagattgcag gagatttttc ataaataatc acgcgatgga 1200 gcggtaatca gccaacatag tcgatcggca tcattattgg agaccaaaca acacttcagt 1260 tatccaagcg cgtcttaagt cgcattcgga taatcttgaa tagcctggaa gtgaattttt 1320 aaaaagtttg tctcgaacaa acatcaatta ctttgtaatt gaaccgaaaa aagaggataa 1380 acattattag cattcgttgt aatgaaatat aatgttgaca cagtttgacc gacgtgcact 1440 gtcttttgtg gcaccggcta tataaaggtg gtctgtccgt tctgagccac acgagtcatc 1500 atgaagatcc catacgtctt gctgttcctt gtggtgagtt gctttcgttt ttgatatgct 1560 ggttcctcag gagtctgtac taatgcttct gtttttattg tataaatgtg agcacttcac 1620 ggcctacgta accagctggt tacaatcacc gtccacgccg aaaaaatgag gcctgtatct 1680 aaattgtaac ataatttttg cacatttgat tctcatccca cgattttatt tatctttcat 1740 tcatttttac tggtggtagg acgtcttgtg agtccgcacg tgcaccacct cacctatttc 1800 agccgtgaag cagtaatgcg cttcggtttg aagggtgggg cagccgttgt actttataaa 1860 cggagacctt agaactcatg tcccgagatg ggtggcagca tttacgttgc agatgtctat 1920 gggctccggt aaccacttaa catttttttt ttttcttttt tttttttttt tatcacgcta 1980 cgttaattgg tcccgtgata agttcgtaaa gaacttgtgt tacaggtacc agataa 2036 <210> 9 <211> 1027 <212> DNA <213> Bombyx mori <400> 9 gaattcaaat aacaaagtgg tgcctatccc actttttttg atccagacaa agaaaataag 60 tgttttcggt gagctgaaaa attaatttca ggaaacaaca aaaataatga cgcaaaagta 120 caccggagtg aaaataaaca ctaagaaagt aatcgctaaa aattattcat ctcgtgaatt 180 gattgagcgc gataataacg cagtactatt ggagagattc tatgtttaat atattaatga 240 tatgatataa aaaagggtgc gtgtacttat gtacgcgcgt aagaagttat actttatttt 300 cattaaattt atttcttttt ttttatttca attttaatca atttgaaaaa aaatcgaata 360 aacaacatcc tcaaacatgc atattggaca tcccttttct tgacatcgta taaattcggt 420 aattctcggt acggttcgta aagttcacct gcggctatat tccgactcgc caagttacgt 480 cagtcgtatt gtaatgagcg atttagtggg caacttcatt ctgttaattt tgtgtcacgg 540 tgcgcgcgca tcgtaaaact tcactctcat agatttttca taacgcgcct aaagaagtat 600 aacttcaata atttaaattt aaaaaaaaac atgcatagaa taattatatg aattatttaa 660 aatgtcattt accgacattg acataacaga cgacgttaac actacaaaac attttaattc 720 cacattgtta catattcaac agttaaattt gcgttaattc tcgatgcgaa caaatataag 780 aacaatcgga tcaattagat cgctttgttt cgaacaacac ttagtttaac tagaggcgta 840 cacctcaaga aatcatcttc attagaaact aaaccttaaa atcgcaataa taaagcatag 900 tcaattttaa ctgaaatgca aagtcttttg aacgttagat gctgtcagcg ttcgttggta 960 cagttgtttg atatttattt taattgtctt tttatatata aatagtggaa cattaatcac 1020 ggaatcc 1027 <210> 10 <211> 51 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 10 atggatttac aggtgcagat tatcagcttc ctgctaatca ttgtcacagt c 51

Claims

이하의 (a) 및 (b)의 공정을 포함하는 TRACP5b의 제조방법;

(a) TRACP5를 코드하는 DNA가 도입된 누에를 제조하는 공정,

(b) 제조된 누에로부터 TRACP5b를 회수하는 공정.
이하의 (a) 및 (b)의 공정을 포함하는 TRACP5b의 제조방법;

(a) 견사선 특이적으로 발현하는 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터, 및 이 프로모터에 의해 직접적 또는 간접적으로 발현 제어되는 TRACP5를 코드하는 DNA를 갖는 누에로서, TRACP5b를 견사선에 분비하는 누에를 제조하는 공정,

(b) 제조된 누에로부터 상기 TRACP5b를 회수하는 공정.
제2항에 있어서,

누에가 이하의 (i) 및 (ii)에 기재된 DNA를 갖는 누에인 방법;

(i) 견사선 특이적으로 발현하는 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터 하류에, 기능적으로 결합한 전사제어인자를 코드하는 DNA,

(ii) 상기 전사제어인자의 표적 프로모터 하류에, 기능적으로 결합한 TRACP5를 코드하는 DNA.
제2항에 있어서,

누에가 이하의 (i) 및 (ii)에 기재된 누에를 교배시킴으로써 제조되는 방법;

(i) 견사선 특이적으로 발현하는 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터 하류에, 기능적으로 결합한 전사제어인자를 코드하는 DNA를 갖는 누에,

(ii) 상기 전사제어인자의 표적 프로모터 하류에, 기능적으로 결합한 TRACP5를 코드하는 DNA를 갖는 누에.
제3항 또는 제4항에 있어서,

전사제어인자가 GAL4이고, 표적 프로모터가 UAS인 방법.
제2항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,

견사선이 중부 견사선 또는 후부 견사선인 방법.
제6항에 있어서,

견사선 특이적으로 발현하는 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터가, 세리신 1 단백질 또는 세리신 2 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터인 방법.
제6항에 있어서,

견사선 특이적으로 발현하는 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터가, 피브로인 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터인 방법.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,

TRACP5가 시그널서열을 갖는 방법.
TRACP5를 코드하는 DNA를 누에에 도입하는 공정을 포함하는, TRACP5b를 분비하는 누에의 제조방법.
TRACP5를 코드하는 DNA를 누에알에 도입하는 공정을 포함하는, TRACP5b를 분비하는 누에의 제조방법.
견사선 특이적으로 발현하는 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터, 및 이 프로모터에 의해 직접적 또는 간접적으로 발현 제어되는 TRACP5를 코드하는 DNA를 갖는 누에알을 제조하는 공정을 포함하는, TRACP5b를 견사선에 분비하는 누에의 제조방법.
제12항에 있어서,

누에가 이하의 (i) 및 (ii)에 기재된 DNA를 갖는 누에인 방법;

(i) 견사선 특이적으로 발현하는 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터 하류에, 기능적으로 결합한 전사제어인자를 코드하는 DNA,

(ii) 상기 전사제어인자의 표적 프로모터 하류에, 기능적으로 결합한 TRACP5를 코드하는 DNA.
제12항에 있어서,

누에가 이하의 (i) 및 (ii)에 기재된 누에를 교배시킴으로써 제조되는 방법;

(i) 견사선 특이적으로 발현하는 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터 하류에, 기능적으로 결합한 전사제어인자를 코드하는 DNA를 갖는 누에,

(ii) 상기 전사제어인자의 표적 프로모터 하류에, 기능적으로 결합한 TRACP5를 코드하는 DNA를 갖는 누에.
제13항 또는 제14항에 있어서,

전사제어인자가 GAL4이고, 표적 프로모터가 UAS인 방법.
제12항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,

견사선이 중부 견사선 또는 후부 견사선인 방법.
제16항에 있어서,

견사선 특이적으로 발현하는 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터가, 세리신 1 단백질 또는 세리신 2 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터인 방법.
제16항에 있어서,

견사선 특이적으로 발현하는 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터가, 피브로인 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터인 방법.
제10항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,

TRACP5가 시그널서열을 갖는 방법.
TRACP5를 코드하는 DNA를 갖는 누에로서, TRACP5b를 분비하는 누에.
견사선 특이적으로 발현하는 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터, 및 이 프로모터에 의해 직접적 또는 간접적으로 발현 제어되는 TRACP5를 코드하는 DNA를 갖는 누에로서, TRACP5b를 견사선에 분비하는 누에.
제21항에 있어서,

이하의 (i) 및 (ii)에 기재된 DNA를 갖는 누에;

(i) 견사선 특이적으로 발현하는 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터 하류에, 기능적으로 결합한 전사제어인자를 코드하는 DNA,

(ii) 상기 전사제어인자의 표적 프로모터 하류에, 기능적으로 결합한 TRACP5를 코드하는 DNA.
제21항에 있어서,

이하의 (i) 및 (ii)에 기재된 누에를 교배시킴으로써 제조되는 누에;

(i) 견사선 특이적으로 발현하는 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터 하류에, 기능적으로 결합한 전사제어인자를 코드하는 DNA를 갖는 누에,

(ii) 상기 전사제어인자의 표적 프로모터 하류에, 기능적으로 결합한 TRACP5를 코드하는 DNA를 갖는 누에.
제22항 또는 제23항에 있어서,

전사제어인자가 GAL4이고, 표적 프로모터가 UAS인 누에.
제21항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서,

견사선이 중부 견사선 또는 후부 견사선인 누에.
제25항에 있어서,

견사선 특이적으로 발현하는 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터가, 세리신 1 단백질 또는 세리신 2 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터인 누에.
제25항에 있어서,

견사선 특이적으로 발현하는 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터가, 피브로인 단백질을 코드하는 DNA의 프로모터인 누에.
제20항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서,

TRACP5가 시그널서열을 갖는 누에.
전사제어인자의 표적 프로모터 하류에, 기능적으로 결합한 TRACP5를 코드하는 DNA를 갖는 누에.
제29항에 있어서,

전사제어인자가 GAL4이고, 표적 프로모터가 UAS인 누에.
제29항 또는 제30항에 있어서,

TRACP5가 시그널서열을 갖는 누에.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,

TRACP5b가 TRACP5b의 특이적 저해제, 활성화제, 또는 모듈레이터의 후보 화합물의 스크리닝에 사용되는 방법.
제32항에 있어서,

TRACP5b의 특이적 저해제, 활성화제, 또는 모듈레이터가 골 흡수의 증가에 관련된 질환의 치료에 사용되는 방법.
제33항에 있어서,

골 흡수의 증가에 관련된 질환이 조직장애, 골 대사 질환, 또는 골다공증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 질환인 방법.