CN101617041A - TRACP5b的生产方法 - Google Patents
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Abstract
制备了一种家蚕，其具有以下的(i)和(ii)的DNA：(i)编码转录调控因子的DNA，该DNA可操作连接在编码丝腺特异性地表达的蛋白质的DNA的启动子的下游；(ii)编码TRACP5的DNA，该DNA可操作连接在该转录调控因子的目标启动子的下游。其结果发现，该家蚕可生产有活性的TRACP5。这表明，TRACP5在丝腺中经历的加工与骨吸收部位的加工相同。
Description
技术领域
本发明涉及利用家蚕来生产酒石酸抗性酸性磷酸酶5b(TRACP5b)的方法。此外，本发明涉及产生TRACP5b的家蚕。
背景技术
血清中的酸性磷酸酶在聚丙烯酰胺凝胶电泳中被分离成从原点起0～5的6个条带。这些条带中的第5个显示酒石酸抗性，被称作Band 5酒石酸抗性酸性磷酸酶(TRACP 5：Tartrate Resistant Acid Phosphatase 5)。
第5个条带在酸性(Acidic)圆盘电泳中被进一步分成2个条带，分别称之为TRACP5a和TRACP5b。TRACP5a是来源于血小板或其它成分的酶，其血中水平不变。另一方面，TRACP5b的血中水平随着骨吸收而变化，因而认为其来源于破骨细胞。在TRACP5b的特异性抑制剂、激活剂或调节剂(modulator)的开发中，为了筛选候选化合物，需要大量的TRACP5b。
因此，目前为止，许多研究人员尝试了进行有用的人TRACP5b的制备。然而，尚没有在体内(in vivo)直接表达TRACP5b获得成功的例子，TRACP5b还必须由大量的破骨细胞瘤纯化(非专利文献1)、或者从大量的新鲜血清中分离(非专利文献2)。另一方面，已知有在昆虫细胞中表达TRACP5(非专利文献3)，在体外用蛋白酶作用于所得的TRACP5，来制备TRACP5b的尝试。然而，现状是仅能获得极少量的目的产物(非专利文献4)。
目前为止，本发明人等对大肠杆菌、昆虫细胞、哺乳动物细胞等进行了各种研究，来尝试进行TRACP5b的生产，但未获成功。其原因是：在这些体系中无法再现TRACP5b的生成中的特殊的翻译后修饰(非专利文献4)。此外，本发明人等尝试了制备TRACP5并在体外用组织蛋白酶K等进行酶处理的方法，但未能建立以工业化角度来看稳定的酶蛋白质的生产方法。
另一方面，近年来开发了利用家蚕生产基因产物的技术，外来基因的导入法、导入基因表达调控方法的研究也取得了进展，其作为一种新的蛋白质生产方法受到期待。例如，已知可以利用重组家蚕制备技术，在丝腺中表达导入的基因，来生产重组蛋白质。由于家蚕是真核生物，所以与大肠杆菌等微生物以及植物相比，它能够制备接近哺乳类的类型的蛋白质。此外，家蚕具有适于制备重组蛋白质的器官即丝腺，因此具有略小于1g/只的蛋白质制备能力。而且，家蚕可用人工饲料进行清洁饲养，并能容易地以数万只的规模进行大量饲养。而且，如果使用自然界中蕴含丰富的桑叶来进行家蚕的大量饲养，则能够廉价地大量获得重组蛋白。
另一方面，还已知数种使用重组杆状病毒制备感染病毒的家蚕幼虫，从其体液获得用于干扰素等医药品(抗肿瘤/抗病毒剂等)等的有用蛋白质的方法。这些也可以说是提供了利用家蚕的蛋白质生成能力来生产蛋白质的新方法。
非专利文献1：J.J.Stepan，K.H.W.Lau，S.Mohan，F.R.Singer，D.J.Baylink，(1990)PURIFICATION AND N-TERMINAL ACID SEQUENCE OFTHE TARTRATE-RESISTANT ACID PHOSPHATASE FROM HUMANOSTEOCLASTOMA：EVIDENCE FOR A SINGLE STRUCTURE.BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS168，792-800.
非专利文献2：K.W.Lam，D.Ted Eastlund，Chin-Yang Li，Lung T.Yam，(1978)Biochemical Properties of Tartrate-Resistant Acid Phosphatase in Serumof Adults and Children CLINICAL CHEMISTRY 24，1105-1108
非专利文献3：Alison R.Hayman，Timotyh M.Cox，(1994)Purple AcidPhosphatase of the Human Macrophage and Osteoclast.THE JOURNAL OFBIOLOGICAL CHEMISTRY 269，1294-1300.
非专利文献4：Jenny Ljusberg，Yunling Wang，Pernilla Lang，MariaNorgard，Robert Dodds，Kjell Hultenby，Barbro Ek-Rylander，Goran Andersson，(2005)Proteolytic Excision of a Repressive Loop Domain in Tartrate-resistantAcid Phosphatase by Cathepsin K in Osteoclasts.THE JOURNAL OFBIOLOGICAL CHEMISTRY 280，28370-28381
发明内容
发明所要解决的问题
如上所述，尽管TRACP5b的重要性日益增加，但其生产上仍存在许多问题。因此，本发明人等利用家蚕的特征，对利用家蚕来表达人TRACP5b进行了研究。即，本发明所要解决的问题是：提供利用家蚕来大量生产TRACP5b的方法。
解决问题的手段
本发明人等为解决上述问题进行了深入研究。结果，在尝试用家蚕大量生产TRACP5、处理该TRACP5来生产TRACP5b时，令人惊奇地发现，从导入了人TRACP5基因的家蚕丝腺中直接生产出了TRACP5b。本发明正是基于这样的经历而完成的。
即，本发明涉及在家蚕的丝腺中生产TRACP5b的方法，其提供以下的〔1〕～〔49〕。
〔1〕一种生产TRACP5b的方法，其包含以下的(a)以及(b)步骤：
(a)生产导入了编码TRACP5的DNA的家蚕的步骤；
(b)从所生产的家蚕回收TRACP5b的步骤；
〔2〕一种生产TRACP5b的方法，其包含以下的(a)以及(b)步骤：
(a)生产这样的家蚕的步骤，所述家蚕具有编码丝腺特异性表达的蛋白质的DNA的启动子，以及直接或间接地受该启动子表达调控的编码TRACP5的DNA，并将TRACP5b分泌至丝腺中；
(b)从所生产的家蚕回收该TRACP5b步骤；
〔3〕〔2〕所述的方法，其中，家蚕为具有以下的(i)和(ii)所述的DNA的家蚕：
(i)编码转录调控因子的DNA，该DNA可操作地连接在编码丝腺特异性表达的蛋白质的DNA的启动子的下游；
(ii)编码TRACP5的DNA，该DNA可操作地连接在该转录调控因子的目标启动子的下游；
〔4〕〔2〕所述的方法，其中，家蚕是通过使以下的(i)和(ii)所述的家蚕交配来生产的：
(i)具有编码转录调控因子的DNA的家蚕，该DNA可操作地连接在编码丝腺特异性表达的蛋白质的DNA的启动子的下游；
(ii)具有编码TRACP5的DNA的家蚕，该DNA可操作地连接在该转录调控因子的目标启动子的下游；
〔5〕〔3〕或〔4〕所述的方法，其中，转录调控因子为GAL4，且目标启动子为UAS；
〔6〕〔2〕～〔5〕中任一项所述的方法，其中，丝腺为中丝腺或后丝腺；
〔7〕〔6〕所述的方法，其中，编码丝腺特异性表达的蛋白质的DNA的启动子是编码丝胶蛋白1蛋白质或丝胶蛋白2蛋白质的DNA的启动子；
〔7-1〕〔7〕所述的方法，其中，编码丝胶蛋白1蛋白质的DNA的启动子为以下的(a)或(b)：
(a)包含SEQ ID NO：7所示的碱基序列的DNA；
(b)包含在SEQ ID NO：7所示的碱基序列中发生1个或多个碱基的取代、缺失、添加和/或插入而得到的碱基序列的DNA；
〔7-2〕〔7〕所述的方法，其中，编码丝胶蛋白2蛋白质的DNA的启动子为以下的(a)或(b)：
(a)包含SEQ ID NO：8所示的碱基序列的DNA；
(b)包含在SEQ ID NO：8所示的碱基序列中发生1个或多个碱基的取代、缺失、添加和/或插入而得到的碱基序列的DNA；
〔8〕〔6〕所述的方法，其中，编码丝腺特异性表达的蛋白质的DNA的启动子为编码丝心蛋白蛋白质的DNA的启动子；
〔8-1〕〔8〕所述的方法，其中，编码丝心蛋白蛋白质的DNA的启动子为以下的(a)或(b)：
(a)包含SEQ ID NO：9所示的碱基序列的DNA、
(b)包含在SEQ ID NO：9所示的碱基序列中发生1个或多个碱基的取代、缺失、添加和/或插入而得到的碱基序列的DNA；
〔9〕〔1〕～〔8-1〕中任一项所述的方法，其中，TRACP5具有信号序列；
〔10〕一种生产分泌TRACP5b的家蚕的方法，其包括将编码TRACP5的DNA导入家蚕的步骤；
〔11〕一种生产分泌TRACP5b的家蚕的方法，其包括将编码TRACP5的DNA导入家蚕卵的步骤；
〔12〕一种生产将TRACP5b分泌至丝腺的家蚕的方法，其包括生产这样的家蚕卵的步骤，所述家蚕卵具有编码丝腺特异性表达的蛋白质的DNA的启动子，以及直接或间接地受该启动子表达调控的编码TRACP5的DNA；
〔13〕〔12〕所述的方法，其中，家蚕为具有以下(i)和(ii)所述的DNA的家蚕：
(i)编码转录调控因子的DNA，该DNA可操作地连接在编码丝腺特异性表达的蛋白质的DNA的启动子的下游；
(ii)编码TRACP5的DNA，该DNA可操作地连接在该转录调控因子的目标启动子的下游；
〔14〕〔12〕所述的方法，其中，家蚕是通过使以下的(i)和(ii)所述的家蚕交配来生产的：
(i)具有编码转录调控因子的DNA的家蚕，该DNA可操作地连接在编码丝腺特异性表达的蛋白质的DNA的启动子的下游；
(ii)具有编码TRACP5的DNA的家蚕，该DNA可操作地连接在该转录调控因子的目标启动子的下游；
〔15〕〔13〕或〔14〕所述的方法，其中，转录调控因子为GAL4，且目标启动子为UAS。
〔16〕〔12〕～〔15〕中任一项所述的方法，其中，丝腺为中丝腺或后丝腺；
〔17〕〔16〕所述的方法，其中，编码丝腺特异性表达的蛋白质的DNA的启动子为编码丝胶蛋白1蛋白质或丝胶蛋白2蛋白质的DNA的启动子；
〔17-1〕〔17〕所述的方法，其中，编码丝胶蛋白1蛋白质的DNA的启动子为以下的(a)或(b)：
(a)包含SEQ ID NO：7所示的碱基序列的DNA；
(b)包含在SEQ ID NO：7所示的碱基序列中发生1个或多个碱基的取代、缺失、添加和/或插入而得到的碱基序列的DNA；
〔17-2〕〔17〕所述的方法，其中，编码丝胶蛋白2蛋白质的DNA的启动子为以下的(a)或(b)：
(a)包含SEQ ID NO：8所示的碱基序列的DNA、
(b)包含在SEQ ID NO：8所示的碱基序列中发生1个或多个碱基的取代、缺失、添加和/或插入而得到的碱基序列的DNA；
〔18〕〔16〕所述的方法，其中，编码丝腺特异性表达的蛋白质的DNA的启动子为编码丝心蛋白蛋白质的DNA的启动子；
〔18-1〕〔18〕所述的方法，其中，编码丝心蛋白蛋白质的DNA的启动子为以下的(a)或(b)：
(a)包含SEQ ID NO：9所示的碱基序列的DNA、
(b)包含在SEQ ID NO：9所示的碱基序列中发生1个或多个碱基的取代、缺失、添加和/或插入而得到的碱基序列的DNA；
〔19〕〔10〕～〔18-1〕中任一项所述的方法，其中，TRACP5具有信号序列；
〔20〕一种分泌TRACP5b的家蚕，其具有编码TRACP5的DNA；
〔21〕一种将TRACP5b分泌至丝腺的家蚕，其具有编码丝腺特异性表达的蛋白质的DNA的启动子，以及直接或间接地受该启动子表达调控的编码TRACP5的DNA；
〔22〕〔21〕所述的家蚕，其具有以下的(i)和(ii)所述的DNA：
(i)编码转录调控因子的DNA，该DNA可操作地连接在编码丝腺特异性表达的蛋白质的DNA的启动子的下游、
(ii)编码TRACP5的DNA，该DNA可操作地连接在该转录调控因子的目标启动子的下游；
〔23〕〔21〕所述的家蚕，其是通过使以下的(i)和(ii)所述的家蚕交配来生产的：
(i)具有编码转录调控因子的DNA的家蚕，该DNA可操作地连接在编码丝腺特异性表达的蛋白质的DNA的启动子的下游、
(ii)具有编码TRACP5的DNA的家蚕，该DNA可操作地连接在该转录调控因子的目标启动子的下游；
〔24〕〔22〕或〔23〕所述的家蚕，其中，转录调控因子为GAL4，且目标启动子为UAS。
〔25〕〔21〕～〔24〕中任一项所述的家蚕，其中，丝腺为中丝腺或后丝腺；
〔26〕〔25〕所述的家蚕，其中，编码丝腺特异性表达的蛋白质的DNA的启动子为编码丝胶蛋白1蛋白质或丝胶蛋白2蛋白质的DNA的启动子；
〔26-1〕〔26〕所述的家蚕，其中，编码丝胶蛋白1蛋白质的DNA的启动子为以下的(a)或(b)：
(a)包含SEQ ID NO：7所示的碱基序列的DNA、
(b)包含在SEQ ID NO：7所示的碱基序列中发生1个或多个碱基的取代、缺失、添加和/或插入而得到的碱基序列的DNA；
〔26-2〕〔26〕所述的家蚕，其中，编码丝胶蛋白2蛋白质的DNA的启动子为以下的(a)或(b)：
(a)包含SEQ ID NO：8所示的碱基序列的DNA；
(b)包含在SEQ ID NO：8所示的碱基序列中发生1个或多个碱基的取代、缺失、添加和/或插入而得到的碱基序列的DNA；
〔27〕〔25〕所述的家蚕，其中，编码丝腺特异性表达的蛋白质的DNA的启动子为编码丝心蛋白蛋白质的DNA的启动子；
〔27-1〕〔27〕所述的家蚕，其中，编码丝心蛋白蛋白质的DNA的启动子为以下的(a)或(b)：
(a)包含SEQ ID NO：9所示的碱基序列的DNA；
(b)包含在SEQ ID NO：9所示的碱基序列中发生1个或多个碱基的取代、缺失、添加和/或插入而得到的碱基序列的DNA；
〔28〕〔20〕～〔27-1〕中任一项所述的家蚕，其中，TRACP5具有信号序列；
〔29〕一种家蚕，其具有可操作地连接在转录调控因子的目标启动子的下游的编码TRACP5的DNA；
〔30〕〔29〕所述的家蚕，其中，转录调控因子为GAL4，且目标启动子为UAS；
〔31〕〔29〕或〔30〕所述的家蚕，其中，TRACP5具有信号序列；
〔32〕〔1〕～〔9〕中任一项所述的方法，其中，TRACP5b用于TRACP5b的特异性抑制剂、激活剂或调节剂的候选化合物的筛选；
〔33〕〔32〕所述的方法，其中，TRACP5b的特异性抑制剂、激活剂或调节剂用于与骨吸收的增加相关的疾病的治疗；
〔34〕〔33〕所述的方法，其中，与骨吸收的增加相关的疾病为选自组织障碍(组织障害)、骨代谢病或骨质疏松症的疾病；
〔35〕一种生产TRACP5b的方法，包含以下的(a)以及(b)步骤：
(a)生产将TRACP5b分泌至脂肪体的家蚕的步骤，该家蚕具有编码细胞质肌动蛋白蛋白质的DNA的启动子，以及直接或间接地受该启动子表达调控的编码TRACP5的DNA、
(b)从所生产的家蚕回收该TRACP5b的步骤；
〔36〕〔35〕所述的方法，其中，家蚕为具有以下的(i)和(ii)所述的DNA的家蚕：
(i)编码转录调控因子的DNA，该DNA可操作地连接在编码细胞质肌动蛋白蛋白质的DNA的启动子的下游、
(ii)编码TRACP5的DNA，该DNA可操作地连接在该转录调控因子的目标启动子的下游；
〔37〕〔35〕所述的方法，其中，家蚕是通过使以下的(i)和(ii)所述的家蚕交配来生产的：
(i)具有编码转录调控因子的DNA的家蚕，该DNA可操作地连接在编码细胞质肌动蛋白蛋白质的DNA的启动子的下游；
(ii)具有编码TRACP5b的DNA的家蚕，该DNA可操作地连接在该转录调控因子的目标启动子的下游；
〔38〕〔36〕或〔37〕所述的方法，其中，转录调控因子为GAL4，且目标启动子为UAS；
〔38-1〕〔38〕所述的方法，其中，编码细胞质肌动蛋白蛋白质的DNA的启动子为以下的(a)或(b)：
(a)包含SEQ ID NO：10所示的碱基序列的DNA、
(b)包含在SEQ ID NO：10所示的碱基序列中发生1个或多个碱基的取代、缺失、添加和/或插入而得到的碱基序列的DNA；
〔39〕〔35〕～〔38-1〕中任一项所述的方法，其中，TRACP5具有信号序列；
〔40〕一种生产将TRACP5b分泌至脂肪体的家蚕的方法，其包括生产这样的家蚕卵的步骤，所述家蚕卵具有编码细胞质肌动蛋白蛋白质的DNA的启动子、以及直接或间接地受该启动子表达调控的编码TRACP5的DNA；
〔41〕〔40〕所述的方法，其中，家蚕为具有以下的(i)和(ii)所述的DNA的家蚕：
(i)编码转录调控因子的DNA，该DNA可操作地连接在编码细胞质肌动蛋白蛋白质的DNA的启动子的下游、
(ii)编码TRACP5的DNA，该DNA可操作地连接在该转录调控因子的目标启动子的下游；
〔42〕〔40〕所述的方法，其中，家蚕是通过使以下的(i)和(ii)所述的家蚕交配来生产的：
(i)具有编码转录调控因子的DNA的家蚕，该DNA可操作地连接在编码细胞质肌动蛋白蛋白质的DNA的启动子的下游、
(ii)具有编码TRACP5的DNA的家蚕，该DNA可操作地连接在该转录调控因子的目标启动子的下游；
〔43〕〔41〕或〔42〕所述的方法，其中，转录调控因子为GAL4，且目标启动子为UAS；
〔43-1〕〔43〕所述的方法，其中，编码细胞质肌动蛋白蛋白质的DNA的启动子为以下的(a)或(b)：
(a)包含SEQ ID NO：10所示的碱基序列的DNA、
(b)包含在SEQ ID NO：10所示的碱基序列中发生1个或多个碱基的取代、缺失、添加和/或插入而得到的碱基序列的DNA；
〔44〕〔40〕～〔43-1〕中任一项所述的方法，其中，TRACP5具有信号序列；
〔45〕一种将TRACP5b分泌至脂肪体的家蚕，其具有编码细胞质肌动蛋白蛋白质的DNA的启动子，以及直接或间接地受该启动子表达调控的编码TRACP5的DNA；
〔46〕〔45〕所述的家蚕，其具有以下(i)和(ii)所述的DNA：
(i)编码转录调控因子的DNA，该DNA可操作地连接在编码细胞质肌动蛋白蛋白质的DNA的启动子的下游、
(ii)编码TRACP5的DNA，该DNA可操作地连接在该转录调控因子的目标启动子的下游；
〔47〕〔45〕所述的家蚕，其是通过使以下(i)和(ii)所述的家蚕交配来生产的：
(i)具有编码转录调控因子的DNA的家蚕，该DNA可操作地连接在编码细胞质肌动蛋白蛋白质的DNA的启动子的下游；
(ii)具有编码TRACP5的DNA的家蚕，该DNA可操作地连接在该转录调控因子的目标启动子的下游；
〔48〕〔46〕或〔47〕所述的家蚕，其中，转录调控因子为GAL4，且目标启动子为UAS；
〔48-1〕〔48〕所述的家蚕，其中，编码细胞质肌动蛋白蛋白质的DNA的启动子为以下的(a)或(b)：
(a)包含SEQ ID NO：10所示的碱基序列的DNA、
(b)包含在SEQ ID NO：10所示的碱基序列中发生1个或多个碱基的取代、缺失、添加和/或插入而得到的碱基序列的DNA；
〔49〕〔45〕～〔48-1〕中任一项所述的家蚕，其中，TRACP5具有信号序列。
附图说明
图1显示用于制备重组家蚕的载体pBMCSUASsigTRACP的结构。
图2说明通过Ser1-GAL4株系和UAS-TRACP株系的交配来建立表达人TRACP的家蚕。
图3为带有GAL4基因的个体和带有UAS的个体的荧光立体显微镜照片。
图4为显示利用RT-PCR来确认杂交株系中GAL4基因和TRACP基因的转录的照片。
图5当在酸性圆盘电泳中进行活性染色时，由表达TRACP的家蚕得到的TRACP与人骨来源或者血清一样，条带位于下部阴极侧，由此表明产生了TRACP 5b。
发明的具体实施方式
本发明涉及利用家蚕生产TRACP5b的方法。本发明是基于本发明人成功地在家蚕体内产生有活性的TRACP5b。具体地，本发明提供包含以下的(a)以及(b)步骤的生产TRACP5b的方法：
(a)生产导入了编码TRACP5的DNA的家蚕的步骤。
(b)从所生产的家蚕回收TRACP5b的步骤。
作为用于本发明的TRACP5，可以示例出人来源、小鼠来源、大鼠来源等的TRACP5。在本发明中，对于编码TRACP5的DNA没有限制，只要具有该DNA的家蚕将TRACP5b分泌至丝腺即可，但从应用用途的层面来看，优选人来源的TRACP5。具体地，作为一个例子，可以列举出包含编码SEQID NO：5所示的氨基酸序列的碱基序列的DNA。此外，还可以例示包含下述碱基序列的DNA，所述碱基序列编码具有在SEQ ID NO：5所述的氨基酸序列中发生1个或多个氨基酸的取代、缺失、添加和/或插入而得到的氨基酸序列，且具有酒石酸抗性酸性磷酸酶活性的蛋白质。关于由该DNA获得的蛋白质是否具有TRACP5b的活性，可以通过例如像PCT国际公开2004年59320号公报、PCT国际公开2004年77059号公报、特表2002年510050号公报所述的那样，通过使试样与针对TRACP5b的单克隆抗体结合后，使用TRACP5b用底物在TRACP5b的最适pH下测定结合了的TRACP5b，来予以确定。
作为本领域技术人员熟知的用于制备与给定蛋白质在功能上等同的蛋白质的方法，已知有向多肽导入突变的方法。例如、本领域技术人员能够通过采用定点诱变方法(Hashimoto-Gotoh，T.et al.(1995)Gene 152，271-275、Zoller，MJ，and Smith，M.(1983)Methods Enzymol.100，468-500、Kramer，W.et al.(1984)Nucleic Acids Res.12，9441-9456、Kramer W，and Fritz HJ(1987)Methods.Enzymol.154，350-367、Kunkel，TA(1985)Proc Natl Acad Sci USA.82，488-492、Kunkel(1988)Methods Enzymol.85，2763-2766)等，向TRACP5导入适宜的突变，来制备与TRACP5b在功能上等同的蛋白质。此外，氨基酸的突变在自然界中也可发生。象这样的包含编码具有在TRACP5的氨基酸序列中发生1个或多个氨基酸的突变而得到的氨基酸序列、且与TRACP5在功能上等同的蛋白质的碱基序列的DNA，也能够用于本发明的TRACP5b的生产。而且，可以认为，在这样的突变体中，发生突变的氨基酸数通常为50个氨基酸以内、优选30个氨基酸以内、更优选10个氨基酸以内(例如5个氨基酸以内)。
优选将待突变的氨基酸残基突变为保留氨基酸侧链性质的其它氨基酸。氨基酸侧链性质的例子包括疏水氨基酸(A、I、L、M、F、P、W、Y、V)、亲水氨基酸(R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T)、具有脂肪族侧链的氨基酸(G、A、V、L、I、P)、具有含羟基侧链的氨基酸(S、T、Y)、具有含硫原子侧链的氨基酸(C、M)、具有含羧酸和酰胺侧链的氨基酸(D、N、E、Q)、具有含碱侧链的氨基酸(R、K、H)、具有含芳香族侧链的氨基酸(H、F、Y、W)(各括号中表示的是氨基酸的单字母符号)。
已知具有对某个氨基酸序列进行1个或多个氨基酸残基的缺失、添加和/或取代(利用其它氨基酸进行取代)的修饰而得到的氨基酸序列的多肽可保持其生物学活性(Mark，D.F.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1984)81，5662-5666、Zoller，M.J.&；Smith，M.Nucleic Acids Research(1982)10，6487-6500、Wang，A.et al.，Science 224，1431-1433、Dalbadie-McFarland，G.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1982)79，6409-6413)。
在本发明中，为了保持产生的TRACP5b的活性，或者为了促进分泌、增加回收量，编码TRACP5的DNA可以具有分泌信号(信号序列)。对于分泌蛋白或者膜整合蛋白，在内质网膜结合性核糖体上被合成后，必须通过脂质双分子层。信号序列就是此时所必需的、存在于蛋白质的N末端的氨基酸残基。
对于本发明中的信号序列没有特殊限制，只要具有上述功能即可，可以适宜地使用例如人、小鼠、大鼠、兔、驴、山羊、马、鸟、犬、猫、酵母、昆虫来源的信号序列。
此外，作为本发明的优选信号序列，可以列举例如TRACP5的信号序列。对于TRACP5的来源没有特殊限制，可以列举例如人、小鼠、大鼠、兔、驴、山羊、马、鸟、犬、猫来源的TRACP5。当在本发明中生产人TRACP5b时，特别优选的信号序列是人TRACP5的信号序列。通过使用这些信号序列，可以高效地生产所表达的TRACP5b。
作为人来源的TRACP5的信号序列，可以列举包含SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列的蛋白质。此外，在SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列中发生1个或多个氨基酸的取代、缺失、添加、和/或插入而得到的氨基酸序列，如果其具有与SEQ ID NO：6所示的蛋白质等同的活性，则也可以作为信号序列使用。这里，“功能上等同”是指：对象蛋白质与由SEQ ID NO：6所述的氨基酸序列构成的蛋白质具有相同的生物学或者生物化学活性。
本发明中的信号序列优选结合在TRACP5b的N末端，但不限于此。
而且，对于采用本发明的方法生产的TRACP5b没有任何限制，只要是采用本发明的方法生产的即可，其可以具有信号序列，也可以不具有信号序列。即，采用本发明的生产方法生产的TRACP5b包括具有信号序列的TRACP5b和不具有信号序列的TRACP5b这两者。
对于本发明中生产的TRACP5b没有特殊限制，只要其是从编码TRACP5的DNA转录、且具有破骨细胞来源的TRACP5活性(即TRACP5b活性)的酶即可。至于是否具有TRACP5b活性，可以采用本领域技术人员公知的TRACP5b测定法来判定。本发明中生产的TRACP5b优选用于TRACP5b的特异性抑制剂、激活剂或调节剂的候选化合物的筛选。此外，TRACP5b优选是这样的TRACP5b：当在酸性圆盘电泳中进行活性染色时，其条带位于下部阴极侧，与从破骨细胞获得的酒石酸耐性酸性磷酸酶处于相同的位置。作为编码TRACP5的DNA的一个例子，可以列举由SEQ IDNO：4所示的碱基序列构成的DNA。
以下，对本发明的TRACP5b生产方法进行更具体的说明。在本发明的TRACP5b生产方法中，首先生产导入了编码TRACP5的DNA的家蚕。作为生产导入了编码TRACP5的DNA的家蚕的方法，可以示例例如以下方法，但不限于此：
(i)生产将TRACP5b分泌至丝腺的转基因家蚕的方法，该转基因家蚕具有编码丝腺特异性表达的蛋白质的DNA的启动子以及直接或间接地受该启动子表达调控的编码TRACP5的DNA(第一个例子)，
(ii)制备包含编码TRACP5的DNA的病毒，并使其感染到家蚕体内来进行生产的方法(第二个例子)，等等。
本发明中，作为生产导入了编码TRACP5的DNA的家蚕的方法，当采用制备包含编码TRACP5的DNA的病毒并使其感染到家蚕体内来进行生产的方法(第二个例子)时，可以按照例如特开平7-289270号所述的方法来进行。更具体地，通过制备具有下述碱基序列的病毒、并使其感染到家蚕体内来进行生产：所述碱基序列是将病毒(优选杆状病毒、更优选家蚕核多角体病毒)DNA的蛋白结构基因部分的全部或一部分与TRACP5连接起来而得到的碱基序列。
此外，当使用第二个例子时，作为由生产出的家蚕回收TRACP5b的方法，可以列举提取家蚕的体液来回收TRACP5b的方法。具体地，例如通过切开家蚕的腹部、用冷水提取体液、并进行纯化，可以回收TRACP5b。
而且，在本发明的TRACP5b的生产方法中，从能够大量且简单地生产TRACP5b的观点来看，优选所述的第一个例子。从此以下，对第一个例子进行详细说明。
在本发明的TRACP5b的生产方法的一个具体的优选实施方式中，TRACP5b的特征在于其是在家蚕的丝腺中产生的。即，本发明涉及包含以下的(a)以及(b)步骤的TRACP5b的生产方法。
(a)生产将TRACP5b分泌至丝腺的家蚕的步骤，该家蚕具有编码丝腺特异性表达的蛋白质的DNA的启动子、以及直接或间接地受该启动子表达调控的编码TRACP5的DNA。
(b)从所生产的家蚕回收该TRACP5b的步骤。
在本发明的生产家蚕的步骤中，例如，首先在家蚕卵中导入编码丝腺特异性表达的蛋白质的DNA的启动子、以及直接或间接地受该启动子表达调控的编码TRACP5的DNA。
然后，通过从由生产的家蚕卵产生出的家蚕中选择将TRACP5b分泌至丝腺的家蚕，来生产将TRACP5b分泌至丝腺的家蚕。
本发明中，为了选择家蚕，例如可以利用选择标记来进行。作为本发明的选择标记，可以使用本领域技术人员所常规使用的标记，如CFP、GFP、YFP和DsRed等荧光蛋白。通过使用这些标记，仅利用荧光立体显微镜观察即可检测家蚕。此外，由于荧光的颜色不同，可以同时使用多种标记。
而且，作为编码TRACP5的DNA的一个例子，可以列举由SEQ ID NO：4所示的碱基序列构成的DNA。通过将插入了这样的DNA的载体导入家蚕，能够将TRACP5b分泌到家蚕的丝腺中。
在本发明中，TRACP5b被分泌到丝腺中。丝腺是在家蚕体内成对存在的一种器官，是丝蛋白的合成器官。丝腺可以分为后丝腺、中丝腺和前丝腺，丝蛋白的合成是在后丝腺和中丝腺中进行的。本发明中优选的丝腺是中丝腺和后丝腺。
作为本发明中的具有编码丝腺特异性表达的蛋白质的DNA的启动子、以及直接受该启动子表达调控的编码TRACP5的DNA的家蚕卵，可以列举例如：具有在编码丝腺特异性表达的蛋白质的DNA的启动子的下游可操作地连接编码TRACP5的DNA而得到的DNA的家蚕卵。这样的家蚕卵可以通过将在编码丝腺特异性表达的蛋白质的DNA的启动子的下游可操作地连接编码TRACP5的DNA而得到的DNA导入家蚕卵来生产。
此外，作为本发明中的具有编码丝腺特异性表达的蛋白质的DNA的启动子、以及间接受该启动子表达调控的编码TRACP5的DNA的家蚕卵，可以列举例如：具有
(i)在编码丝腺特异性表达的蛋白质的DNA的启动子的下游可操作地连接编码转录调控因子的DNA而得到的DNA、和
(ii)在该转录调控因子的目标启动子的下游可操作地连接编码TRACP5的DNA而得到的DNA
的家蚕卵。
而且，在本发明中，为了促进TRACP5b的分泌、提高回收量，直接地或间接地受编码丝腺特异性表达的蛋白质的DNA的启动子表达调控的编码TRACP5的DNA可以具有信号序列。信号序列的具体实施方式如上述。
上述“可操作地连接”是指：将启动子和DNA以这样的方式连接起来，以使得存在于该启动子下游的该DNA的表达能够被转录调控因子与该启动子的结合所诱导。因此，即使该DNA是与其它基因相连接并且形成与其它基因产物的融合蛋白，只要该融合蛋白的表达受转录调控因子与该启动子的结合的诱导，则也包含在上述的“可操作地连接”的意义中。
作为上述转录调控因子与目标序列的组合，可以列举GAL4和UAS、TetR和TRE等。通过使用GAL4和UAS、或TetR和TRE，可以准确调控目的基因的表达部位、时期、量，并可以容易地在多个组织中进行表达。此外，即使所表达的基因是致死性基因，仍有可能制备株系。
可以选择各种方法作为制备上述家蚕卵的方法。例如，可以将上述的(i)和(ii)中的DNA导入到不同的家蚕卵中。从分别导入了每一种DNA的家蚕卵孵化家蚕，使这些家蚕交配，可以获得含有两种DNA的家蚕卵。在此情况下，由于可以通过转录调控因子来决定表达的组织、时期、表达量等，因此具有下述优点：通过与导入了需要表达的基因的株系杂交，即可以改变表达的各个组织、时期、表达量等，而不需制备很多株系。即使在目标基因的表达会引起不育的情况下，仍有可能进行实验。另一个优点是，与使用单独的启动子相比，从导入基因得到的产物量更高。此外，具有上述(i)和(ii)的DNA的家蚕卵，可以通过将其中一种DNA人工导入到由已经导入了另一种DNA的家蚕所产的卵中来获得。此外，通过将上述(i)和(ii)的DNA导入到同一枚卵中，也可以获得具有这两种DNA的家蚕卵(Imamura，M.，Nakai，J.，Inoue，S.，Quan，G.-X.，Kanda，T.and Tamura，T.(2003)Targeted geneexpression using the GAL4/UAS system in the silkworm Bombyx mori.FourthInternational Workshop on Transgenesis and Genomics of InvertegrateOrganisms，Asilomar，P53.)。
家蚕卵中DNA的导入，例如可以按照将转座子作为载体注射到发育早期的家蚕卵中的方法来进行(Tamura，T.，Thibert，C.，Royer，C.，Kanda，T.，Abraham，E.，Kamba，M.，Komoto，N.，Thomas，J.-L.，Mauchamp，B.，Chavancy，G.，Shirk，P.，Fraser，M.，Prudhomme，J.-C.and Couble，P.，2000，NatureBiotechnology 18，81-84)。例如，将上述DNA插入到转座子的末端反向重复序列之间而成的载体(Handler AM，McCombs SD，Fraser MJ，Saul SH.(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95(13)：7520-5)与包含编码转座酶的DNA的载体(辅助载体)一起导入到家蚕卵中。辅助载体包括例如pHA3PIG(Tamura，T.，Thibert，C.，Royer，C.，Kanda，T.，Abraham，E.，Kamba，M.，Komoto，N.，Thomas，J.-L.，Mauchamp，B.，Chavancy，G.，Shirk，P.，Fraser，M.，Prudhomme，J.-C.andCouble，P.，2000，Nature Biotechnology 18，81-84)，但不局限于此。
本发明中的转座子的优选实例是piggyBac，但不局限于此。还可以使用mariner和minos等(Shimizu，K.，Kamba，M.，Sonobe，H.，Kanda，T.，Klinakis，A.G.，Savakis，C.and Tamura，T.(2000)Insect Mol.Biol.，9，277-281；Wang W，Swevers L，Iatrou K.(2000)Insect Mol Biol 9(2)：145-55)。
此外，作为本发明中的编码丝腺特异性表达的蛋白质的DNA的启动子，在中丝腺中，可以列举例如编码丝胶蛋白1蛋白质或丝胶蛋白2蛋白质的DNA的启动子。作为编码丝胶蛋白1蛋白质或丝胶蛋白2蛋白质的DNA的启动子，可以列举包含SEQ ID NO：7或8所示的碱基序列的DNA。作为包含SEQ ID NO：7或8所示的碱基序列的DNA，可以列举由SEQ ID NO：7或8所示的碱基序列构成的DNA、包含由SEQ ID NO：7或8所示的碱基序列构成的DNA的上游区域、下游区域的DNA等，但不限于此。由SEQ IDNO：7或8所示的碱基序列构成的DNA的上游区域或下游区域见于文献(Okamoto，H.，Ishikawa，E.and Suzuki，Y.(1982)Structural analysis of sericingenes.Homologies with fibroin gene in the 5′flanking nucleotide sequences.JBiol Chem，257，15192-15199.、Garel，A.，Deleage，G.and Prudhomme，J.C.(1997)Structure and organization of the Bombyx mori sericin 1 gene and of thesericins 1 deduced from the sequence of the Ser 1B cDNA.Insect Biochem MolBiol，27，469-477.、Michaille，J.J.，Garel，A.and Prudhomme，J.C.(1990)Cloning and characterization of the highly polymorphic Ser2gene of Bombyxmori.Gene，86，177-184.)。
此外，作为本发明中的编码中丝腺特异性表达的蛋白质的DNA的启动子，还可以列举：与包含SEQ ID NO：7或8所示的碱基序列的DNA结构上类似、且具有等同于或优于包含SEQ ID NO：7或8所示的碱基序列的DNA的启动子活性的DNA。作为这样的DNA，可以示例出例如：包含在SEQ IDNO：7或8所示的碱基序列中发生1个或多个碱基的取代、缺失、添加和/或插入而得到的碱基序列的DNA。该DNA可以通过杂交技术、聚合酶链式反应(PCR)技术、定点诱变、DNA合成等方法来制备。所制备的DNA是否具有启动子活性，本领域技术人员可以采用使用报道基因的公知的报道分子分析法等来进行考察。
对于该报道基因没有特殊限制，只要其表达是可检测的即可，报道基因包括CAT基因，lacZ基因，萤光素酶基因，β-葡糖醛酸糖苷酶基因(GUS)以及GFP基因等，这些基因为本领域技术人员所广泛使用。报道基因表达水平可以依照报道基因的类型使用本领域技术人员所熟知的方法来测量。例如，当报道基因是CAT基因时，可以通过测定该基因产物的氯霉素乙酰化作用来确定报道基因的表达水平。下述报道基因的表达水平可以通过以下各种方法测量：当报道基因是lacZ基因时，测定该基因表达产物催化的色素化合物的生色反应；当报道基因是萤光素酶基因时，测定该基因表达产物催化的荧光化合物的荧光；当报道基因是β-葡糖醛酸糖苷酶基因(GUS)时，测定该基因表达产物催化的Glucuron(ICN)的发光或测定5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡萄糖醛酸苷(X-Gluc)的生色反应；而当报道基因是GFP基因时，测定GFP蛋白的荧光。
另一方面，作为本发明中的编码后丝腺特异性表达的蛋白质的DNA的启动子，可以列举例如：编码丝心蛋白L链蛋白的DNA的启动子。作为编码丝心蛋白L链蛋白的DNA的启动子，可以列举包含SEQ ID NO：9所示的碱基序列的DNA。作为包含SEQ ID NO：9所示的碱基序列的DNA，可以列举由SEQ ID NO：9所示的碱基序列构成的DNA、包含由SEQ ID NO：9所示的碱基序列构成的DNA的上游区域或下游区域的DNA等，但不限于此。由SEQ ID NO：9所示的碱基序列构成的DNA的上游区域、下游域见于文献(KIKUCHI，Y.，K.MORI，S.SUZUKI，K.YAMAGUCHI and S.MIZUNO，1992Structure of the Bombyx mori fibroin light-chain-encoding gene：upstreamsequence elements common to the light and heavy chain.Gene 110：151-158.)。
此外，作为本发明中的编码后丝腺特异性表达的蛋白质的DNA的启动子，还可以列举：与包含SEQ ID NO：9所示的碱基序列的DNA结构上类似、且具有等同于或优于包含SEQ ID NO：9所示的碱基序列的DNA的启动子活性的DNA。这些启动子可以通过上述方法制备。
本发明的TRACP5b生产方法包括回收在家蚕体内合成的TRACP5b的步骤。合成的TRACP5b没有不溶化，而是以其有活性的状态分泌到中丝腺或后丝腺中。这样，就可以从中丝腺或后丝腺中回收TRACP5b。作为从中丝腺或后丝腺中回收TRACP5b的方法，例如：解剖吐丝期的家蚕，在20mMTris-HCl pH7.4中将中丝腺或后丝腺分离出来，然后利用镊子或者手术刀将丝腺切开来回收丝腺中的TRACP5b，但不限于此。
对于由丝腺提取得到的蛋白质溶液，可以采用例如以下操作来从其中纯化TRACP5b。将提取液上样于CM-Sepharose柱，以改变盐浓度的线性梯度进行洗脱，测定该洗脱级分的TRACP5b活性，回收有TRACP5b活性的级分，用旋转柱进行浓缩。接下来，将所得的TRACP5b活性液用Superdex200柱进行凝胶过滤，同样回收有TRACP5b活性的级分并进行浓缩。然后，在肝素柱(HiTrap Heparin HP、GE-HEALTHCARE)上以改变盐浓度的线性梯度进行纯化，同样用旋转柱浓缩有TRACP5b活性的级分。对于这些级分，例如通过酸性电泳能够确认TRACP5b的有无、纯化状况。
此外，本发明的TRACP5b也可以从例如家蚕所织的茧中回收。回收方法的例子包括本领域技术人员所熟知的方法，例如将茧溶解在60％LiSCN中，然后在含有20mM Tris和5M尿素的溶液中透析来回收的方法(Inoue，S.，Tsuda，H.，Tanaka，H.，Magoshi，Y and Mizuno(2001)Sericologia 4，157-163.)，但不限于此。其它回收方法包括使用例如表面活性剂的方法和用水溶液溶解的方法等。
此外，对于本发明的家蚕没有特殊限制。然而，为了生产大量的TRACP5b，优选使用这样的家蚕，其中构成蚕丝的蛋白质(例如丝心蛋白蛋白质等)的生产因编码构成蚕丝的蛋白质的DNA区域(包括编码区，启动子区和非翻译区)的突变而受到抑制。这样的家蚕的例子包括构成蚕丝的蛋白质的生产因编码这些蛋白的DNA区域的突变而受到抑制的突变的家蚕株系；并且优选地包括其中构成蚕丝的蛋白质的生产因这样的突变而被抑制的家蚕离蛹株系；或者更优选地包括Nd-sD，但不限于此。对于本发明的家蚕而言，只要构成蚕丝的蛋白质的产量被抑制，任何的家蚕都是合适的，不论该类蛋白产量的抑制是否是人工造成的，或者是否依赖于自然界中发生的突变。
该类家蚕的一个实施方案是丝胶蛋白家蚕，其是本领域技术人员所熟知的。使用丝胶蛋白家蚕可以在中丝腺大量生产TRACP5b，并且由导入染色体中的编码TRACP5b的DNA所合成的TRACP5b的纯化变得更容易。此外，当在后丝腺中生产TRACP5b时，从产量的方面看优选丝胶蛋白家蚕。
此外，作为本发明的家蚕可以使用具有产非滞育卵的特性的家蚕，也可以使用具有产滞育卵的特性的家蚕(例如，实际应用中的家蚕种类包括Gunma(ぐんま)，200，Shunrei(春嶺)，Shogetsu(鍾月)，Kinshu(錦秋)以及Showa(鍾和)等)。此处，“滞育卵”是指在产卵之后胚胎发育短暂停止的卵，“非滞育卵”是指产卵之后胚胎发育没有停止而孵化成幼虫的卵。
当使用具有产滞育卵的特性的家蚕时，产出非滞育卵后将DNA导入到该卵中。作为产出非滞育卵的方法，例如，对于Gunma型家蚕，可以在15℃～21℃培养滞育卵来诱导由滞育卵孵化成的成虫产非滞育卵，优选的方法是通过在16℃～20℃培养滞育卵来诱导由滞育卵孵化成的成虫产非滞育卵，更优选的方法是在18℃培养滞育卵来诱导由滞育卵孵化成的成虫产非滞育卵，最优选的方法是在18℃培养滞育卵，并且在持续光照下饲养由滞育卵孵化出来的幼虫，来诱导长成的成虫产非滞育卵。对于200型家蚕，所采用的方法可以为在15℃～21℃培养滞育卵来诱导由滞育卵孵化成的成虫产非滞育卵，优选的方法是在16℃～20℃培养滞育卵来诱导由滞育卵孵化成的成虫产非滞育卵，更优选的方法是在18℃培养滞育卵来诱导由滞育卵孵化成的成虫产非滞育卵，或者在持续光照下饲养由滞育卵孵化出来的幼虫来诱导长成的成虫产非滞育卵，最优选的方法是在25℃培养滞育卵，并且在持续光照下饲养由滞育卵孵化出来的幼虫，来诱导由滞育卵孵化成的成虫产非滞育卵。
虫卵的培养可以例如在18℃～25℃的孵卵器或者在恒温室中进行。幼虫的饲养可以在饲养室中在20℃～29℃条件下利用人工饲料进行。
上述的本发明的滞育卵可以按照本领域技术人员常用的培养家蚕卵的方法来培养。例如，可以利用在“文部省(1978)蚕种制造pp 193，实教出版社，东京”中描述的方法来进行培养。本发明的家蚕幼虫可以利用本领域技术人员所熟知的方法来饲养。例如，可以按照“文部省(1978)蚕种制造pp193，实教出版社，东京”中描述的方法来进行饲养。
在本发明中，所产的卵是否是非滞育卵可以通过卵的颜色来确定。通常知道，滞育卵呈浓茶褐色，而非滞育卵是黄白色。因此，在本发明中，如果所产的卵的颜色不是浓茶褐色(优选是黄白色)，则判定为非滞育卵。
以下，对将DNA导入家蚕卵的方法的例子进行描述，但是本发明中的将DNA导入家蚕卵的方法并不局限于此。例如，可以利用DNA注射管将DNA直接导入家蚕卵。在优选实施方案中，预先在卵壳上用化学或者物理学的方法开孔，然后通过该孔将DNA导入。在该例子中，可以通过调整DNA注射管插入的角度使DNA注射管基本上垂直于卵的腹侧面来将DNA注射管通过该孔插入到卵中。
在本发明中，在卵壳上开孔的物理学方法的例子包括利用针，显微激光等方法开孔。优选可以通过利用针的方法在卵壳上开孔。对针的材质、强度等没有特殊限制，只要该针能够在家蚕卵壳上开孔即可。此外，在本发明中的针通常是指具有尖锐端部的棒状针，但不局限于此形状。只要针能够在卵壳上开孔，对其整体形状没有特别的限制。例如，具有锋利尖端的金字塔形状的物质，或者具有尖锐端部的三角锥形的物质也包含在本发明的“针”的定义中。在本发明中，可以理想地使用钨针。至于本发明的针的粗度(直径)，只要能够打出允许下文描述的毛细管通过的孔即可，通常为2到20μm，优选5到10μm。另一方面，在卵壳上开孔的化学方法的例子包括使用化学试剂(例如，次氯酸)开孔的方法等。
在本发明中，对开孔的位置没有特殊限制，只要通过该孔插入DNA注射管时，相对于卵的腹侧面的插入角度基本上能够是垂直的即可；优选的是腹侧面或者其对侧面；更优选的是腹侧面；进一步优选的是腹侧面中心部分微偏向后端的位置。
在本发明中，术语“基本上垂直”意味着70°～120°，优选的是80°～90°。在本发明中，术语“将来会成为生殖细胞的位置”通常指卵的腹侧面接近卵表面的位置(通常距卵表面0.01mm到0.05mm)，优选的位置是卵的腹侧面中心部分微偏向后极并接近卵表面的位置。
在本发明中，对用于注射DNA的管子的材料、强度、内径等没有特殊限制，但优选的是，当在插入DNA注射管之前通过物理学或者化学的方法在卵壳上开孔时，该管具有这样的粗度(外径)，使其能够穿过打出的孔。在本发明中，DNA注射管的例子包括玻璃毛细管等。
在本发明DNA导入方法的优选实施方案中，使用装备了针和DNA注射管的一体化操作装置来进行下列步骤：在上述家蚕卵上物理地或者化学地开孔；以基本上垂直于卵的腹侧面的插入角度通过该孔将DNA注射管插入到卵中；并且注射DNA。通常，利用含有操作装置作为其构成要素之一的仪器来实施本发明是优选的。
这样的仪器由解剖显微镜、照明装置、可移动台、利用金属配件固定在显微镜上的粗操作装置、该操作装置上附带的微操作装置、以及能够调节用于DNA注射的空气压力的注射器组成。该注射器所使用的压力是由氮气罐提供的，并且可以使用脚踩开关来打开压力的开关。注射是在对固定在载玻片等基片上的卵上进行，并且可以使用可移动台来调节卵的位置。微操作装置的玻璃毛细管通过用四个管子连接的操作部分来操控。在实际程序中，通过粗操作装置确定钨针相对于卵的位置，然后通过利用操作台控制杆在水平方向上移动卵来开孔。接下来，操纵显微操作器的操作部分的控制杆将玻璃毛细管的尖端引导到该孔的位置，并且再次利用操作台控制杆将毛细管插入到卵中。在此情况下，玻璃毛细管必须相对于卵的腹侧面垂直地插入。然后开启脚踩开关来注射DNA，然后操纵控制杆将毛细管从卵中拔出。利用瞬间粘合剂等物质将所开的孔封闭，并且将该卵保存在恒温恒湿的孵化器中。在本发明中所使用的装置优选的是在特许第1654050号中描述的装置或者该装置的改进装置。
此外，在本发明的一个实施方案中，优选将用于导入DNA的家蚕卵固定在基片上。在本发明中所使用的基片的例子包括载玻片和塑料片材，但不局限于此。在本发明的这个实施方案中，优选的是将卵方向一致地固定，以便于将DNA准确地注射到家蚕卵中将来会成为生殖细胞的位置。此外，在该实施方案中，对固定在基片上的家蚕卵的数目没有特殊限制。当使用多个家蚕卵时，优选的是将家蚕卵按背腹取向一定的方向固定在基片上。在本发明中，可以通过例如下述方法来将家蚕卵固定在基片上：促使家蚕在预先涂有水性胶水的市售卡片(各种排卵卡片)上排卵，然后向卡片上加水来将卵剥下，并将湿的卵排列在基片上，然后风干。优选的是将这些卵以同一方向固定在玻璃片上。卵在基片上的固定也可以使用双面胶带，粘合剂等完成。
为了确认DNA是否已经被成功导入到家蚕卵中，可以使用例如将注入的DNA从卵中重新提取出来并进行分析的方法(Nagaraju，J.，Kanda，T.，Yukuhiro，K.，Chavancy，G.，Tamura，T.and Couble，P.(1996)Attempt oftransgenesis of the silkworm(Bombyx mori L)by egg-injection of foreign DNA.Appl.Entomol.Zool.，31，589-598)，或观察注入的DNA在卵中的表达的方法(Tamura，T.，Kanda，T.，Takiya，S.，Okano，K.and Maekawa，H.(1990)Transient expression of chimeric CAT genes injected into early embryos of thedomesticated silkworm，Bombyx mori.Jpn.J.Genet.，65，401-410)。
在本发明的TRACP5b生产方法的其它具体实施方式中，TRACP5b以在家蚕的脂肪体中产生为特征。更具体地说，本发明涉及包含以下的(a)以及(b)步骤的生产TRACP5b的方法。
(a)生产将TRACP5b分泌至脂肪体的家蚕的步骤，该家蚕具有编码细胞质肌动蛋白蛋白质的DNA的启动子、以及直接或间接地受该启动子表达调控的编码TRACP5的DNA。
(b)从所生产的家蚕回收该TRACP5b步骤。
在本发明的生产家蚕的步骤中，首先生产具有编码细胞质肌动蛋白蛋白质的DNA的启动子、以及直接或间接地受该启动子表达调控的编码TRACP5的DNA的家蚕卵。然后，对于由所生产的家蚕卵产生的家蚕，从中选择将TRACP5b分泌至脂肪体的家蚕。家蚕的选择可以按照上述方法进行。
作为本发明中的具有编码细胞质肌动蛋白蛋白质的DNA的启动子以及直接受该启动子表达调控的编码TRACP5的DNA的家蚕卵，可以列举例如具有在编码细胞质肌动蛋白蛋白质的DNA的启动子的下游可操作地连接编码TRACP5的DNA而得到的DNA的家蚕卵。这样的家蚕卵可以通过将在编码细胞质肌动蛋白蛋白质的DNA的启动子的下游可操作地连接编码TRACP5的DNA而得到的DNA导入家蚕卵来生产。
此外，作为本发明中的具有编码细胞质肌动蛋白蛋白质的DNA的启动子以及间接受该启动子表达调控的编码TRACP5的DNA的家蚕卵，可以列举例如具有下述(i)和(ii)的家蚕卵：(i)在编码细胞质肌动蛋白蛋白质的DNA的启动子的下游可操作地连接编码转录调控因子的DNA而得到的DNA；以及(ii)在该转录调控因子的目标启动子的下游可操作地连接编码TRACP5的DNA而得到的DNA。“可操作地连接”的定义如上述。此外，转录调控因子与目标序列的组合也可例举上述那些。
家蚕卵的生产可以按照上述的方法进行。例如，将上述(i)和(ii)的DNA导入不同的家蚕卵。而对于含有两种DNA的家蚕卵，可以这样获得：从导入了各自DNA的家蚕卵产生家蚕，使这些家蚕交配。此外，具有上述(i)和(ii)的DNA的家蚕卵可以通过将其中一种DNA人工导入到由已经导入了另一种DNA的家蚕所产的卵中来获得。此外，具有上述两种DNA的家蚕卵也可以通过将上述(i)的DNA和上述(ii)的DNA导入到同一枚卵中而获得。家蚕卵中DNA的导入可以用上文所述的方法来进行。
作为上述编码细胞质肌动蛋白蛋白质的DNA的启动子，可以列举包含SEQ ID NO：10所示的碱基序列的DNA。作为包含SEQ ID NO：10所示的碱基序列的DNA，可以列举由SEQ ID NO：10所示的碱基序列构成的DNA、包含由SEQ ID NO：10所示的碱基序列构成的DNA的上游区域或下游区域的DNA等，但不限于此。
此外，作为本发明中的编码细胞质肌动蛋白蛋白质的DNA的启动子，还可以列举与包含SEQ ID NO：10所示的碱基序列的DNA在结构上类似，且具有等同于或优于包含SEQ ID NO：10所示的碱基序列的DNA的启动子活性的DNA。这些启动子也可以采用上述的方法来制备。由SEQ ID NO：10所示的碱基序列构成的DNA的上游区域或下游区域见于文献(MANGE，A.，E.JULIEN，J.C.PRUDHOMME and P.COUBLE，1997A strong inhibitoryelement down-regulates SRE-stimulated transcription of the A3 cytoplasmicactin gene of Bombyx mori.J Mol Biol 265：266-274.)。
上述转录调控因子与目标序列的组合可以使用上文所述的那些组合。而且，将在编码细胞质肌动蛋白的DNA的启动子的下游连接GAL4基因而得到的DNA插入到家蚕基因组中而得到的家蚕(由具有上述(i)的DNA的家蚕卵制备的家蚕)的具体实施方式和制备方法见于文献(IMAMURA，M.，J.NAKAI，S.INOUE，G.X.QUAN，T.KANDA et al.，2003 Targeted geneexpression using the GAL4/UAS system in the silkworm Bombyx mori.Genetics165：1329-1340.)。
而且，在本发明中，直接或间接地受编码细胞质肌动蛋白蛋白质的DNA的启动子表达调控的编码TRACP5的DNA可以具有信号序列。信号序列的具体实施方式如上述。
上述方法制备的TRACP5b可以从例如脂肪体中回收。可以使用本领域技术人员公知的方法从脂肪体回收TRACP5b，例如，从幼虫体内分离脂肪体，并在用于蛋白提取的缓冲液中将该脂肪体匀浆，或者诱导脂肪体中的蛋白分泌到体液中，然后将体液分级。
此外，TRACP5b与TRACP5a的分离也可以按上述方法进行。
而且，对通过本发明的方法所制备的TRACP5b没有特殊限制，只要是通过本发明的方法制备的即可，并且该TRACP5b可以包含也可以不包含信号序列。即，利用本发明的TRACP5b生产方法生产的TRACP5b既包括含有信号序列的TRACP5b也包括不含有信号序列的TRACP5b。
此外，本发明涉及具有编码TRACP5的DNA、且分泌TRACP5b的家蚕。具体地，本发明涉及将TRACP5b分泌至丝腺的家蚕，该家蚕具有编码丝腺特异性表达的蛋白质的DNA的启动子，以及直接或间接地受该启动子表达调控的编码TRACP5的DNA。或者，本发明提供具有(i)和(ii)的家蚕：(i)编码转录调控因子的DNA，该DNA可操作地连接在编码丝腺特异性表达的蛋白质的DNA的启动子的下游，以及(ii)编码TRACP5的DNA，该DNA可操作地连接在该转录调控因子的目标启动子的下游。或者，本发明提供具有在编码丝腺特异性表达的蛋白质的DNA的启动子的下游可操作地连接编码TRACP5的DNA而得到的DNA的家蚕。
而且，在本发明中，为了促进TRACP5b分泌、提高回收量，直接或间接地受编码丝腺特异性表达的蛋白质的DNA的启动子表达调控的编码TRACP5的DNA可以具有信号序列。信号序列的具体实施方式如上述。
而且，本发明涉及将TRACP5b分泌至脂肪体的家蚕，该家蚕具有编码细胞质肌动蛋白蛋白质的DNA的启动子、以及直接或间接地受该启动子表达调控的编码TRACP5的DNA。具体地，本发明提供具有(i)和(ii)的家蚕：(i)编码转录调控因子的DNA，该DNA可操作地连接在编码细胞质肌动蛋白蛋白质的DNA的启动子的下游；以及(ii)编码TRACP5的DNA，该DNA可操作地连接在该转录调控因子的目标启动子的下游。或者，本发明提供具有在编码细胞质肌动蛋白蛋白质的DNA的启动子的下游可操作地连接编码TRACP5的DNA而得到的DNA的家蚕。
而且，在本发明中，为了促进TRACP5b分泌、提高回收量，直接或间接地受编码细胞质肌动蛋白蛋白质的DNA的启动子表达调控的编码TRACP5的DNA可以具有信号序列。信号序列的具体实施方式如上述。此外，本发明的家蚕中还包括本发明的家蚕的卵。
这些家蚕可以采用上述的方法来制备。此外，对于本发明的家蚕的状态没有特殊限制，例如，可以是卵的状态。通过使用本发明的家蚕，能够大量地生产TRACP5b。
此外，本发明还提供具有可操作地连接在转录调控因子的目标启动子的下游的编码TRACP5的DNA的家蚕。作为转录调控因子、目标启动子，可以列举上文所述的那些。这样的家蚕可以用于具有上述(i)和(ii)的DNA的家蚕的生产或其卵的生产。
而且，在本发明中，为了促进TRACP5b分泌、提高回收量，直接或间接地受编码丝腺特异性表达的蛋白质的DNA的启动子表达调控的编码TRACP5的DNA可以具有信号序列。信号序列的具体实施方式如上述。
此外，本发明还提供由本发明的家蚕所织的茧。此类茧作为含有大量的TRACP5b的茧是有用的。本发明还提供由上述蚕茧所生产的含有TRACP5b的蚕丝。此外，可以利用已知的方法制备含有本发明的蚕丝的丝织物，例如含有TRACP5b的丝织物。本发明还提供此类丝织物。
此外，本发明提供用于本发明的方法的DNA。作为这样的DNA，可以列举：(a)编码转录调控因子的DNA，该DNA可操作地连接在编码丝胶蛋白或丝心蛋白的DNA的启动子的下游，(b)编码TRACP5的DNA，该DNA可操作地连接在该转录调控因子的目标启动子的下游，(c)在编码丝胶蛋白或丝心蛋白的DNA的启动子的下游可操作地连接编码TRACP5的DNA而得到的DNA，等等；本发明还提供包含它们的组合的试剂盒。此外，本发明还提供在转座子的反向末端重复序列之间插入(a)～(c)的DNA而得到的载体。而且，本发明提供包含该载体以及具有编码转座酶的DNA的载体(辅助载体)的试剂盒。
而且，可操作地连接在转录调控因子的目标启动子的下游的编码TRACP5的DNA、以及将编码TRACP5的DNA可操作地连接在编码丝胶蛋白或丝心蛋白的DNA的启动子的下游而得到的DNA，为了促进TRACP5b分泌、提高回收量，可以具有信号序列。信号序列的具体实施方式如上述。
通过本发明的生产方法获得的TRACP5b，可以用于例如TRACP5b的特异性抑制剂、激活剂或调节剂的候选化合物的筛选。TRACP5b的特异性抑制剂、激活剂或调节剂可用于与骨吸收的增加相关的疾病的治疗。作为与骨吸收的增加相关的疾病，可以列举组织障碍、骨代谢病、骨质疏松症等，但不限于此。
TRACP5b的特异性抑制剂、激活剂或调节剂的候选化合物的筛选可以例如按照包含以下的(a)～(c)的步骤的方法来进行。
(a)在针对TRACP5b的底物的存在下，将采用本发明的方法生产的TRACP5b与受试化合物混合的步骤，
(b)测定TRACP5b活性的步骤，
(c)选择与不存在受试化合物的条件下相比较、改变TRACP5b活性的受试化合物的步骤。
在TRACP5b的特异性抑制剂、激活剂或调节剂的候选化合物的筛选中，首先在针对TRACP5b的底物的存在下，将采用本发明的方法生产的TRACP5b与受试化合物混合。对于本发明的方法中的受试化合物没有特殊限制，可以列举例如：天然化合物、有机化合物、无机化合物、蛋白质、肽等单一化合物，以及化合物文库、基因文库的表达产物，细胞提取物，细胞培养上清，发酵微生物产生物，海洋生物提取物，植物提取物，原核细胞提取物，真核单细胞提取物或动物细胞提取物等。
此外，作为针对TRACP5b的底物，可以列举对硝基苯基磷酸酯等合成底物，但不限于此。
TRACP5b活性的测定，例如可以这样进行：使用对硝基苯基磷酸酯作为底物，测定TRACP5b与其底物反应生成的羟基化合物、即对硝基苯酚的量。对硝基苯酚的量例如可以通过测定波长405nm的吸光度来测定，通过测定该波长的吸光度的变化，可以测定TRACP5b活性。
最后，将上述测定的TRACP5b活性与不存在受试化合物的条件下的TRACP5b活性相比较。比较的结果，将改变了TRACP5b活性的受试化合物作为TRACP5b的调节剂选择出来。特别地，将比较结果为减少了TRACP5b活性的受试化合物，作为TRACP5b的特异性抑制剂的候选化合物选择出来。此外，将比较结果为增加了TRACP5b活性的受试化合物，作为TRACP5b的激活剂的候选化合物选择出来。
此外，本说明书中引用的全部现有技术文献均并入本说明书作为参考。
实施例
以下，通过实施例更具体地说明本发明，但本发明不受这些实施例的限制。
材料与方法
[载体构建]
在本发明中，首先制备了用于在重组家蚕中表达人TRACP的质粒载体pBMCSUASsigTRACP(图1和SEQ ID NO：1)。在该用于制备重组家蚕的载体中，在启动子UAS(其在酵母转录调控因子GAL4的存在下促进基因表达)的下游，具有插入到转座子piggyBac的反向末端重复序列之间的人TRACP基因。此外，作为用于鉴定重组家蚕茧的标记基因，该载体具有绿色荧光蛋白基因3xP3GFP，该基因与能够促进在胚的单眼、蛾的复眼以及神经来源组织中表达的启动子相连接(Horn，C.，and E.A.Wimmer，(2000)Dev GenesEvol 210：630-637；Murizio et al.(1994)Protein Science，3：1476-1484)。
[重组家蚕的制备和重组蛋白质表达株系的建立]
为了制备重组家蚕，将质粒载体pBMCSUASsigTRACP和辅助质粒注射到461个家蚕早期胚中。查卵蛾数为60，对其检查带有标记基因的早期胚，结果确认了5窝(5蛾区)的重组家蚕(表1)。最终，将其中的3窝的重组体建立了株系。在本发明中，作为用于在丝腺中表达人酒石酸抗性酸性磷酸酶基因的GAL4株系，使用了已经建立的Ser1-GAL4株系(田村等，日蚕講要74、p51)。该重组家蚕在胚的单眼和蛾的复眼中红色荧光蛋白的表达。而且，该重组家蚕仅在中丝腺表达GAL4基因，因而确认了表达受UAS调控的导入基因(田村等，2004)。因此，如图2所示，为了表达导入的人TRACP基因，将所得UAS-TRACP株系的3窝中的2个株系与上述的Ser1-GAL4株系进行了交配。这里使用的Ser1-GAL4株系在胚的单眼中表达红色荧光蛋白。对于UAS-TRACP株系与Ser1-GAL4株系交配所得得子代产出的卵，在产卵后第6日天用荧光立体显微镜进行观察，鉴定出了具有红色荧光蛋白和绿色荧光蛋白这两者的Ser1-GAL4/UAS-TRACP个体(图3)。饲养Ser1-GAL4/UAS-TRACP个体，从5龄吐丝期的家蚕分离丝腺，用20mMTris-HCl 100mM NaCl pH7.4提取蛋白质。同样地，作为对照，对于不携带人TRACP基因的Ser1-GAL4株系的5龄吐丝期第0天的家蚕，也分离丝腺并提取蛋白质。
[表1]
| 载体 | 注射卵数 | 孵化卵数 | 查卵蛾数 | 重组体蛾窝数 |
| pBMCSUASsigTRACP | 461 | 185 | 60 | 5 |
[RT-PCR]
为了确认人TRACP基因的转录，如下所述地进行了RT-PCR。如前述，饲养同时具有GAL4和UAS这两种基因的个体，并且从5龄吐丝期的家蚕中分离出中丝腺。同样地，作为对照，对于Ser1-GAL4株系的5龄吐丝第0天的家蚕同样地分离了丝腺。然后，将分离的中丝腺转移到玻璃匀浆器(WHEATON)中，并且利用ISOGEN(Nippon Gene)提取总RNA。利用DEPC水将该总RNA制备成50μg/20μl，然后利用First-strand cDNA Synthesis Kit(GE-HEALTHCARE)按照所附文件的说明反转录为cDNA。利用该反转录产物作为模板，按照下述方法进行PCR。即，添加TaKaRa Ex Taq HS(TAKARA)附带的10×PCR缓冲液5μl、150μM的质粒载体pBMCSUASsigTRACP(SEQID NO：1)、150μM的引物(SEQ ID NO：2和3)、0.2mM dNTPs，使得EX TaqHS为2单位，并将体系总量调整为50μl。利用eppendorf公司的DNA热循环仪，进行如下反应：98℃2分钟1轮，98℃10秒、57.5℃30秒、72℃30秒的循环40轮、72℃4分钟的延伸反应1轮。
[活性测定]
TRACP5b如下进行测定。在用识别人TRACP5b的单克隆抗体Trk62(保藏号IPOD FERMBP7890)致敏的微平板上，使从Ser1-GAL4/UAS-TRACP个体或作为对照的Ser1-GAL4个体的丝腺提取的蛋白质溶液于室温反应1小时。然后在进行清洗操作之后，加入含酒石酸和氯代硝基苯基磷酸酯(chloronitrophenyl phosphate)的底物缓冲液，于37℃温育1小时，通过测定405nm的吸光度，测定了TRACP5b(表2)。
[利用酸性圆盘电泳确认TRACP5b的产生]
酸性圆盘电泳按以下程序进行。在圆盘电泳装置(ATTO公司)的毛细玻璃管中层积45mm的7.5％丙烯酰胺分离凝胶，再于其上层积4mm的2.5％丙烯酰胺浓缩凝胶。将从Ser1-GAL4/UAS-TRACP个体即本发明的家蚕的丝腺中提取的蛋白质溶液上样于CM-Sepharose柱，用10mM Tris-HClpH7.2、NaCl 0-0.5M的线性梯度进行洗脱。测定该洗脱级分的TRACP活性，回收有TRACP活性的级分，用旋转柱进行浓缩。然后，用Superdex200柱进行凝胶过滤，同样回收了具有TRACP活性的级分，并进行了浓缩。而且，对于具有TRACP活性的级分使用肝素柱(HiTrap Heparin HP、GE-HEALTHCARE)以含NaCl的20mM Tris-HCl pH7.2的线性梯度(0.35M-1M)进行了纯化。同样地，将具有TRACP活性的包含峰1及峰2的级分分别用旋转柱浓缩至20U/L。在该浓缩试样50μL中加入BSA和甘油，上样于毛细管上部。然后，在35mM β-丙氨酸pH4.0的电泳缓冲液中，以毛细管上部为阳极，以4mA/毛细管通电90分钟。通电结束后，将其浸泡在由α-萘甲酸(naphthylic acid)、Fast Garnet GBC、含酒石酸的0.1M柠檬酸缓冲液(pH5.0)构成的染色液中，进行能够了活性染色。同样地，对于作为对照的人血清也进行了相同的电泳。其结果如图5所示，可知从Ser1-GAL4/UAS-TRACP个体提取的重组蛋白质，与人骨来源TRACP5b或人血清一样产生TRACP5b。
结果
图1为用于制备人酒石酸抗性酸性磷酸酶基因重组家蚕的质粒载体。将该质粒载体和辅助质粒pA3PIG(Tamura et al.，Nature Biotechnology(2000)18，81-84.)注射到了461个家蚕卵中。用荧光显微镜对子代的胚的单眼中表达的绿色荧光蛋白进行观察的结果，可以确认5窝蛾的重组体(表1)。饲养这些重组家蚕，对其中的3窝建立了株系。如图2所示，使所得UAS-TRACP株系与Ser1-GAL4株系交配，从而建立了表达重组人酒石酸抗性酸性磷酸酶的Ser1-GAL4/UAS-TRACP株系。这里，对于交配后的雌蛾所产的卵，在产卵后第6天，用荧光立体显微镜对胚进行观察，如图3所示，确认了单眼中具有绿色荧光蛋白以及红色荧光蛋白二者的个体。饲养该Ser1-GAL4/UAS-TRACP株系，从5龄吐丝期的丝腺提取总RNA。对于所得的总RNA进行了RT-PCR，结果如图4所示确认了GAL4基因与TRACP基因的转录。
在Ser1-GAL4/UAS-TRACP株系的2窝的丝腺来源的蛋白质中存在TRACP5b，而在对照中不存在TRACP5b。此外，由以毛细管上部为阳极的酸性电泳也可知，从本发明的家蚕的丝腺中提取的液体中能够得到TRACP5b。
[表2]
| 人TRACP5b活性(U/L) | |
| Ser1-GAL4/UAS-TRACP 01 | 17.6 |
| Ser1-GAL4/UAS-TRACP 02 | 8.9 |
| 对照 | 0.0 |
工业实用性
本发明提供利用家蚕生产TRACP5b的方法。传统上，为了获得TRACP5b，需要从因受伤等原因而无保留必要的人骨中提取TRACP5b。但是，该方法仅能获得极少量的TRACP5b。而另一方面，如下所示，采用本发明能够大量生产TRACP5b。
首先，生产TRACP5b的家蚕具有适于制备蛋白质的器官——丝腺，具备数百mg/只的蛋白质生产能力。而且，家蚕可以使用人工饲料来清洁饲养，能够容易地进行数万只规模的大量饲养。而且，家蚕的大量饲养可以利用自然界中蕴含丰富的桑叶来进行，因此，能够廉价地生产TRACP5b。
采用本发明的方法获得的TRACP5b可以用于例如TRACP5b的特异性抑制剂、激活剂或调节剂的候选化合物的筛选。
序列表
<110>日东纺绩株式会社(NITTO BOSEKI CO.，LTD.)
独立行政法人农业生物资源研究所(NATIONAL INSTITUTE OF AGROBIOLOGICAL SCIENCES)
<120>TRACP5b的生产方法
<130>MOA-A0608P
<150>JP 2006-353542
<151>2006-12-28
<160>10
<170>PatentIn version 3.4
<210>1
<211>7330
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的核苷酸序列
<400>1
gacgaaaggg cctcgtgata cgcctatttt tataggttaa tgtcatgata ataatggttt 60
cttagacgtc aggtggcact tttcggggaa atgtgcgcgg aacccctatt tgtttatttt 120
tctaaataca ttcaaatatg tatccgctca tgagacaata accctgataa atgcttcaat 180
aatattgaaa aaggaagagt atgagtattc aacatttccg tgtcgccctt attccctttt 240
ttgcggcatt ttgccttcct gtttttgctc acccagaaac gctggtgaaa gtaaaagatg 300
ctgaagatca gttgggtgca cgagtgggtt acatcgaact ggatctcaac agcggtaaga 360
tccttgagag ttttcgcccc gaagaacgtt ttccaatgat gagcactttt aaagttctgc 420
tatgtggcgc ggtattatcc cgtattgacg ccgggcaaga gcaactcggt cgccgcatac 480
actattctca gaatgacttg gttgagtact caccagtcac agaaaagcat cttacggatg 540
gcatgacagt aagagaatta tgcagtgctg ccataaccat gagtgataac actgcggcca 600
acttacttct gacaacgatc ggaggaccga aggagctaac cgcttttttg cacaacatgg 660
gggatcatgt aactcgcctt gatcgttggg aaccggagct gaatgaagcc ataccaaacg 720
acgagcgtga caccacgatg cctgtagcaa tggcaacaac gttgcgcaaa ctattaactg 780
gcgaactact tactctagct tcccggcaac aattaataga ctggatggag gcggataaag 840
ttgcaggacc acttctgcgc tcggcccttc cggctggctg gtttattgct gataaatctg 900
gagccggtga gcgtgggtct cgcggtatca ttgcagcact ggggccagat ggtaagccct 960
cccgtatcgt agttatctac acgacgggga gtcaggcaac tatggatgaa cgaaatagac 1020
agatcgctga gataggtgcc tcactgatta agcattggta actgtcagac caagtttact 1080
catatatact ttagattgat ttaaaacttc atttttaatt taaaaggatc taggtgaaga 1140
tcctttttga taatctcatg accaaaatcc cttaacgtga gttttcgttc cactgagcgt 1200
cagaccccgt agaaaagatc aaaggatctt cttgagatcc tttttttctg cgcgtaatct 1260
gctgcttgca aacaaaaaaa ccaccgctac cagcggtggt ttgtttgccg gatcaagagc 1320
taccaactct ttttccgaag gtaactggct tcagcagagc gcagatacca aatactgtcc 1380
ttctagtgta gccgtagtta ggccaccact tcaagaactc tgtagcaccg cctacatacc 1440
tcgctctgct aatcctgtta ccagtggctg ctgccagtgg cgataagtcg tgtcttaccg 1500
ggttggactc aagacgatag ttaccggata aggcgcagcg gtcgggctga acggggggtt 1560
cgtgcacaca gcccagcttg gagcgaacga cctacaccga actgagatac ctacagcgtg 1620
agcattgaga aagcgccacg cttcccgaag ggagaaaggc ggacaggtat ccggtaagcg 1680
gcagggtcgg aacaggagag cgcacgaggg agcttccagg gggaaacgcc tggtatcttt 1740
atagtcctgt cgggtttcgc cacctctgac ttgagcgtcg atttttgtga tgctcgtcag 1800
gggggcggag cctatggaaa aacgccagca acgcggcctt tttacggttc ctggcctttt 1860
gctggccttt tgctcacatg ttctttcctg cgttatcccc tgattctgtg gataaccgta 1920
ttaccgcctt tgagtgagct gataccgctc gccgcagccg aacgaccgag cgcagcgagt 1980
cagtgagcga ggaagcggaa gagcgcccaa tacgcaaacc gcctctcccc gcgcgttggc 2040
cgattcatta atgcagctgg cacgacaggt ttcccgactg gaaagcgggc agtgagcgca 2100
acgcaattaa tgtgagttag ctcactcatt aggcacccca ggctttacac tttatgcttc 2160
cggctcgtat gttgtgtgga attgtgagcg gataacaatt tcacacagga aacagctatg 2220
accatgatta cgaattgatc ctctagctag agtcgacgct cgcgcgactt ggtttgccat 2280
tctttagcgc gcgtcgcgtc acacagcttg gccacaatgt ggtttttgtc aaacgaagat 2340
tctatgacgt gtttaaagtt taggtcgagt aaagcgcaaa tcttttttaa ccctagaaag 2400
atagtctgcg taaaattgac gcatgcattc ttgaaatatt gctctctctt tctaaatagc 2460
gcgaatccgt cgctgtgcat ttaggacatc tcagtcgccg cttggagctc ccgtgaggcg 2520
tgcttgtcaa tgcggtaagt gtcactgatt ttgaactata acgaccgcgt gagtcaaaat 2580
gacgcatgat tatcttttac gtgactttta agatttaact catacgataa ttatattgtt 2640
atttcatgtt ctacttacgt gataacttat tatatatata ttttcttgtt atagatatca 2700
agcttatcga taccgtcgac ctcgaccgct agtgccgagt ctctgcactg aacattgtca 2760
gatctcgagc tcaagcttgc atgcctgcag gtcggagtac tgtcctccga gcggagtact 2820
gtcctccgag cggagtactg tcctccgagc ggagtactgt cctccgagcg gagtactgtc 2880
ctccgagcgg agactctagc gagcgccgga gtataaatag aggcgcttcg tctacggagc 2940
gacaattcaa ttcaaacaag caaagtgaac acgtcgctaa gcgaaagcta agcaaataaa 3000
caagcgcagc tgaacaagct aaacaatctg cagtaaagtg caagttaaag tgaatcaatt 3060
aaaagtaacc agcaaccaag taaatcaact gcaactactg aaatctgcca agaagtaatt 3120
attgaataca agaagagaac tctgaatagg gaattggcct agtagaccta gaatgaaatt 3180
cttagtcaac gttgcccttg tttttatggt cgtatacatt tcttacatct atgccggcat 3240
gcatatggcc acccctgccc tgcgctttgt agccgtgggt gactggggag gggtccccaa 3300
tgccccattc cacacggccc gggaaatggc caatgccaag gagatcgctc ggactgtgca 3360
gatcctgggt gcagacttca tcctgtctct aggggacaat ttttacttca ctggtgtgca 3420
agacatcaat gacaagaggt tccaggagac ctttgaggac gtattctctg accgctccct 3480
tcgcaaagtg ccctggtacg tgctagccgg aaaccatgac caccttggca atgtctctgc 3540
ccagattgca tactctaaga tctccaagcg ctggaacttc cccagccctt tctaccgcct 3600
gcacttcaag atcccacaga ccaatgtgtc tgtggccatt tttatgctgg acacagtgac 3660
actatgtggc aactcagatg acttcctcag ccagcagcct gagaggcccc gagacgtgaa 3720
gctggcccgc acacagctgt cctggctcaa gaaacagctg gcggcggcca gggaggacta 3780
cgtgctggtg gctggccact accccgtgtg gtccatagcc gagcacgggc ctacccactg 3840
cctggtcaag cagctacggc cactgctggc cacatacggg gtcactgcct acctgtgcgg 3900
ccacgatcac aatctgcagt acctgcaaga tgagaatggc gtgggctacg tgctgagtgg 3960
ggctgggaat ttcatggacc cctcaaagcg gcaccagcgc aaggtcccca acggctatct 4020
gcgcttccac tatgggactg aagactcact gggtggcttt gcctatgtgg agatcagctc 4080
caaagagatg actgtcactt acatcgaggc ctcgggcaag tccctcttta agaccaggct 4140
gccgaggcga gccaggccct aatctaggtc agccatacca catttgtaga ggttttactt 4200
gctttaaaaa acctcccaca cctccccctg aacctgaaac ataaaatgaa tgcaattgtt 4260
gttgttaact tgtttattgc agcttataat ggttacaaat aaagcaatag catcacaaat 4320
ttcacaaata aagcattttt ttcactgcat tctagttgtg gtttgtccaa actcatcaat 4380
gtatcttaag gcgtaaattg taagcgttaa tattttgtta aaattcgcgt taaatttttg 4440
ttaaatcagc tcatttttta accaataggc cgaaatcggc aaaatccctt ataaatcaaa 4500
agaatagacc gagatagggt tgagtgttgt tccagtttgg aacaagagtc cactattaaa 4560
gaacgtggac tccaacgtca aagggcacta gcggtcgagc tcaagcttgc atgcctgcag 4620
gaattctgag tttggacaaa ccacaactag aatgcagtga aaaaaatgct ttatttgtga 4680
aatttgtgat gctattgctt tatttgtaac cattataagc tgcaataaac aagttaacaa 4740
caacaattgc attcatttta tgtttcaggt tcagggggag gtgtgggagg ttttttaaag 4800
caagtaaaac ctctacaaat gtggtatggc tgattatgat ctagagtcgc ggccgcttta 4860
cttgtacagc tcgtccatgc cgagagtgat cccggcggcg gtcacgaact ccagcaggac 4920
catgtgatcg cgcttctcgt tggggtcttt gctcagggcg gactgggtgc tcaggtagtg 4980
gttgtcgggc agcagcacgg ggccgtcgcc gatgggggtg ttctgctggt agtggtcggc 5040
gagctgcacg ctgccgtcct cgatgttgtg gcggatcttg aagttcacct tgatgccgtt 5100
cttctgcttg tcggccatga tatagacgtt gtggctgttg tagttgtact ccagcttgtg 5160
ccccaggatg ttgccgtcct ccttgaagtc gatgcccttc agctcgatgc ggttcaccag 5220
ggtgtcgccc tcgaacttca cctcggcgcg ggtcttgtag ttgccgtcgt ccttgaagaa 5280
gatggtgcgc tcctggacgt agccttcggg catggcggac ttgaagaagt cgtgctgctt 5340
catgtggtcg gggtagcggc tgaagcactg cacgccgtag gtcagggtgg tcacgagggt 5400
gggccagggc acgggcagct tgccggtggt gcagatgaac ttcagggtca gcttgccgta 5460
ggtggcatcg ccctcgccct cgccggacac gctgaacttg tggccgttta cgtcgccgtc 5520
cagctcgacc aggatgggca ccaccccggt gaacagctcc tcgcccttgc tcaccatggt 5580
ggcgaccggt ggatcccggg cccgcggtac cgtcgactct agcggtaccc cgattgttta 5640
gcttgttcag ctgcgcttgt ttatttgctt agctttcgct tagcgacgtg ttcactttgc 5700
ttgtttgaat tgaattgtcg ctccgtagac gaagcgcctc tatttatact ccggcggtcg 5760
agggttcgaa atcgataagc ttggatccta attgaattag ctctaattga attagtctct 5820
aattgaatta gatccccggg cgagctcgaa ttaaccattg tgggaaccgt gcgatcaaac 5880
aaacgcgaga taccggaagt actgaaaaac agtcgctcca ggccagtggg aacatcgatg 5940
ttttgttttg acggacccct tactctcgtc tcatataaac cgaagcgaat tcgatggcgc 6000
gccataaaag ttttgttact ttatagaaga aattttgagt ttttgttttt ttttaataaa 6060
taaataaaca taaataaatt gtttgttgaa tttattatta gtatgtaagt gtaaatataa 6120
taaaacttaa tatctattca aattaataaa taaacctcga tatacagacc gataaaacac 6180
atgcgtcaat tttacgcatg attatcttta acgtacgtca caatatgatt atctttctag 6240
ggttaaataa tagtttctaa tttttttatt attcagcctg ctgtcgtgaa taccgtatat 6300
ctcaacgctg tctgtgagat tgtcgtattc tagccttttt agtttttcgc tcatcgactt 6360
gatattgtcc gacacatttt cgtcgatttg cgttttgatc aaagacttga gcagagacac 6420
gttaatcaac tgttcaaatt gatccatatt aacgatatca acccgatgcg tatatggtgc 6480
gtaaaatata ttttttaacc ctcttatact ttgcactctg cgttaatacg cgttcgtgta 6540
cagacgtaat catgttttct tttttggata aaactcctac tgagtttgac ctcatattag 6600
accctcacaa gttgcaaaac gtggcatttt ttaccaatga agaatttaaa gttattttaa 6660
aaaatttcat cacagattta aagaagaacc aaaaattaaa ttatttaatc gaccagttaa 6720
tcaacgtgta cactgacgcg tcggcaaaaa acacgcagcc cgacgtgttg gctaaaatta 6780
ttaaatcaac ttgtgttata gtcacggatt tgccgtccaa cgtgttcctc aaaaagttga 6840
agaccaacaa gtttacggac actattaatt atttgatttt gccccacttc attttgtggg 6900
atcacaattt tgttatattt taaacaaagc ttggcactgg ccgtcgtttt acaacgtcgt 6960
gactgggaaa accctggcgt tacccaactt aatcgccttg cagcacatcc ccctttcgcc 7020
agctggcgta atagcgaaga ggcccgcacc gatcgccctt cccaacagtt gcgcagcctg 7080
aatggcgaat ggcgcctgat gcggtatttt ctccttacgc atctgtgcgg tatttcacac 7140
cgcatatggt gcactctcag tacaatctgc tctgatgccg catagttaag ccagccccga 7200
cacccgccaa cacccgctga cgcgccctga cgggcttgtc tgctcccggc atccgcttac 7260
agacaagctg tgaccgtctc cgggagctgc atgtgtcaga ggttttcacc gtcatcaccg 7320
aaacgcgcga 7330
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>人工合成的核苷酸序列
<400>2
gggtgcagac ttcatcctgt 20
<210>3
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<223>人工合成的核苷酸序列
<400>3
gtttcttgag ccaggacagc 20
<210>4
<211>978
<212>DNA
<213>人类
<400>4
atggacatgt ggacggcgct gctcatcctg caagccttgt tgctaccctc cctggctgat 60
ggtgccaccc ctgccctgcg ctttgtagcc gtgggtgact ggggaggggt ccccaatgcc 120
ccattccaca cggcccggga aatggccaat gccaaggaga tcgctcggac tgtgcagatc 180
ctgggtgcag acttcatcct gtctctaggg gacaattttt acttcactgg tgtgcaagac 240
atcaatgaca agaggttcca ggagaccttt gaggacgtat tctctgaccg ctcccttcgc 300
aaagtgccct ggtacgtgct agccggaaac catgaccacc ttggcaatgt ctctgcccag 360
attgcatact ctaagatctc caagcgctgg aacttcccca gccctttcta ccgcctgcac 420
ttcaagatcc cacagaccaa tgtgtctgtg gccattttta tgctggacac agtgacacta 480
tgtggcaact cagatgactt cctcagccag cagcctgaga ggccccgaga cgtgaagctg 540
gcccgcacac agctgtcctg gctcaagaaa cagctggcgg cggccaggga ggactacgtg 600
ctggtggctg gccactaccc cgtgtggtcc atagccgagc acgggcctac ccactgcctg 660
gtcaagcagc tacggccact gctggccaca tacggggtca ctgcctacct gtgcggccac 720
gatcacaatc tgcagtacct gcaagatgag aatggcgtgg gctacgtgct gagtggggct 780
gggaatttca tggacccctc aaagcggcac cagcgcaagg tccccaacgg ctatctgcgc 840
ttccactatg ggactgaaga ctcactgggt ggctttgcct atgtggagat cagctccaaa 900
gagatgactg tcacttacat cgaggcctcg ggcaagtccc tctttaagac caggctgccg 960
aggcgagcca ggccctga 978
<210>5
<211>325
<212>PRT
<213>人类
<400>5
Met Asp Met Trp Thr Ala Leu Leu Ile Leu Gln Ala Leu Leu Leu Pro
1 5 10 15
Ser Leu Ala Asp Gly Ala Thr Pro Ala Leu Arg Phe Val Ala Val Gly
20 25 30
Asp Trp Gly Gly Val Pro Asn Ala Pro Phe His Thr Ala Arg Glu Met
35 40 45
Ala Asn Ala Lys Glu Ile Ala Arg Thr Val Gln Ile Leu Gly Ala Asp
50 55 60
Phe Ile Leu Ser Leu Gly Asp Asn Phe Tyr Phe Thr Gly Val Gln Asp
65 70 75 80
Ile Asn Asp Lys Arg Phe Gln Glu Thr Phe Glu Asp Val Phe Ser Asp
85 90 95
Arg Ser Leu Arg Lys Val Pro Trp Tyr Val Leu Ala Gly Asn His Asp
100 105 110
His Leu Gly Asn Val Ser Ala Gln Ile Ala Tyr Ser Lys Ile Ser Lys
115 120 125
Arg Trp Asn Phe Pro Ser Pro Phe Tyr Arg Leu His Phe Lys Ile Pro
130 135 140
Gln Thr Asn Val Ser Val Ala Ile Phe Met Leu Asp Thr Val Thr Leu
145 150 155 160
Cys Gly Asn Ser Asp Asp Phe Leu Ser Gln Gln Pro Glu Arg Pro Arg
165 170 175
Asp Val Lys Leu Ala Arg Thr Gln Leu Ser Trp Leu Lys Lys Gln Leu
180 185 190
Ala Ala Ala Arg Glu Asp Tyr Val Leu Val Ala Gly His Tyr Pro Val
195 200 205
Trp Ser Ile Ala Glu His Gly Pro Thr His Cys Leu Val Lys Gln Leu
210 215 220
Arg Pro Leu Leu Ala Thr Tyr Gly Val Thr Ala Tyr Leu Cys Gly His
225 230 235 240
Asp His Asn Leu Gln Tyr Leu Gln Asp Glu Asn Gly Val Gly Tyr Val
245 250 255
Leu Ser Gly Ala Gly Asn Phe Met Asp Pro Ser Lys Arg His Gln Arg
260 265 270
Lys Val Pro Asn Gly Tyr Leu Arg Phe His Tyr Gly Thr Glu Asp Ser
275 280 285
Leu Gly Gly Phe Ala Tyr Val Glu Ile Ser Ser Lys Glu Met Thr Val
290 295 300
Thr Tyr Ile Glu Ala Ser Gly Lys Ser Leu Phe Lys Thr Arg Leu Pro
305 310 315 320
Arg Arg Ala Arg Pro
325
<210>6
<211>21
<212>PRT
<213>人类
<400>6
Met Asp Met Trp Thr Ala Leu Leu Ile Leu Gln Ala Leu Leu Leu Pro
1 5 10 15
Ser Leu Ala Asp Gly
20
<210>7
<211>1935
<212>DNA
<213>家蚕
<400>7
gaaattctta gctacatcta gcccagactg taagagtttc ttaggagctt tagaagttaa 60
agaagtacct ttgtgttgct gatccttcta tatcatctgg tcctagtaaa ggtactctct 120
tataatctcc ttcctaattc cttacctgct atttatcgat tgtaggtcgt cttggaaacc 180
agtaccactg tacaaactcg cgccccatta gtaacgtgat ttgaacggcc aaccaattga 240
tgttttaatg caattaatat cgtatcttta accccaacgt ggttctgcgt taactaagtg 300
ctcaccgctg tcaacagcaa taaaaccatt tttgaaataa taacatcatt acactaacat 360
agtgagctag tcgcaaaatg tatgtagaga gaaaacaaac cttctttggg gtgttgagag 420
gaaatcgctg gattagaact atcgtgaaga ccattcactg atcctgtgta cttaaattcg 480
cggattcagc attaagcgcc ggatctcagt tccatcgtaa tcccagttaa agaggtgaaa 540
ttagctatca cttcgatatc tgttctgaaa gcaatgttcc acttgtaaaa gcataagcgg 600
tcagaaacct tgttaaccaa tagagccaaa tatagttaac acaatagaaa tttatccaaa 660
tattattcgt gtattgttta tagcctttgt caagtctttt acaaggcaag ataataagta 720
atattccgtg attggacgta acatttcccg gaagatcctt agccgataag tcgaagagcc 780
gcatgtggct agagagacgc gggtttccga ccactggctt aggcgcttat tccgccataa 840
tagatgtacg tgttcacaat tagcacccga aattcgtaat agctacgaga agtatcgaat 900
atcaaaaatc tatatattaa tacgtgaagc aaaaactttg tatccctttt tacgaaaatt 960
gcgaggacgg aggagtatga aatttcccac acttatagag aatacagaga agaagtgcac 1020
aatgctaata tttttttaaa ataatgcata aaagatactt taaatcaata aagaaaacag 1080
cacacacact acataccatg tatttgacgc acacacgcat gtatactatt tattgtcaaa 1140
cttttgttct tgacgtctgt gttcaaactg agaatagatt aaatattgtt tgtctttatt 1200
aatatttttt aatagtgtag tcttggcgaa atttgtgatt atagaagtat aaaatacaat 1260
cataatagtg tacaaactta caattcccaa ttaattatag tcgaatttcg actactgcgg 1320
gacctctagt attaataatt ctctttaaaa aaaaacagag catcaaatac tgtcacaaat 1380
gtcaagcggg tctcaacgag ccatgaataa attagaaatc aattaataac ataaaatagg 1440
caaacaaaat aaaaccattt acatagagaa cgtttgttga acaaaaacaa taacttgtat 1500
acattgtttg cacaaatgtt tgaaccgaaa atttattact ctctacgtaa gcttgatcaa 1560
acttcgtttt cgtataaaac gcgttggccc aaccactttg gcatagtcgt cttatcatcg 1620
ggtctctaag gatcaagcga tccaaagacc gccaacatgc gtttcgttct gtgctgcact 1680
ttgattgcgt tggctgtgag tatcattgct tcgttatcaa caatgacgta tttactaaga 1740
acactcttag atatgccttc aaattaaagc tttcaaagct ctgaagttca ccaaatgcga 1800
ctgttttagc gtaagcattt ctatccccca acagccattt agcgactacc cgaaaatcac 1860
tcgatttaac ttgggagttt ctgcaattta aaagttcaca ggtcgtctcc gattatactt 1920
ttaaacgctt cgcgc 1935
<210>8
<211>2036
<212>DNA
<213>家蚕
<400>8
cagaatctac cacgatcgga aacgcgaccc actgagaaga tccggcgaga aactcagtga 60
gctgtgtcta tgggttaatt tactcgtcga gccctgttta ctgtttaggg cgacgtcgac 120
tgttaccatt cggtctacag gatcgagtgt gcattcttgt atcatcgttc tattatcacg 180
agtcattttg cgttttttcg gatcccctgg aagtcgtcgt ggcctaagag ataagaagtc 240
cggtgcattc gtgttgagcg atgcacctgt gttcgaatcc taggcgggta ccaatttttc 300
taatgaatta cgtacccaac aaatgttcac gattgccttc cacggtgaag gaataacatc 360
gtgcaataaa agtgaaaccc gcaaaatccg gtgcttttaa gcttttcaag caccggtcac 420
catcctcgtt gaactcatcg atctacaagc gatctaatct atagacccaa tccactaaga 480
tctcaccgga tcttctcagt ggttcgcatt ccagtggtag attcaattcg ctgctcttgc 540
tagggctagt gttagcaaat tccttcgggt taagcccgag agctcaccta tccgtccgcg 600
ctaagctgga aaagcccctt aagctgtttt ttttttgtat agcctttatt gctaatacta 660
aacaataact aataatttta catacagtaa caaattgttt taacttaaat ctaatacatc 720
ggatttcccg gttcagtgat cagcgtgtcc tgtgacacat aggcctcttc cagctgcttt 780
catttttctc tattggtagc ttttcttgac cagattgtct ctccaatcat cttgatatcg 840
tctgtccatc ttctagcttg cctggctctt ttcctttaaa ccaggggtcg tgaattcaat 900
cctcacagga agccgggatt aggtgggaga atatagttcc gatgttttga atgctttata 960
ttttctgtgg tcgaaaatga tactagagct acgcgtcgac aattgaatat tatgctaact 1020
accctctatt tattaaaaga cttttacgat tcatttcgca cagaaccaat cgactgggtt 1080
tagaggttta gcagtttgtt gaatgaactc gttttcatct tcacgattag aggatcccag 1140
gtgttaggta aaggatattc tagattgcag gagatttttc ataaataatc acgcgatgga 1200
gcggtaatca gccaacatag tcgatcggca tcattattgg agaccaaaca acacttcagt 1260
tatccaagcg cgtcttaagt cgcattcgga taatcttgaa tagcctggaa gtgaattttt 1320
aaaaagtttg tctcgaacaa acatcaatta ctttgtaatt gaaccgaaaa aagaggataa 1380
acattattag cattcgttgt aatgaaatat aatgttgaca cagtttgacc gacgtgcact 1440
gtcttttgtg gcaccggcta tataaaggtg gtctgtccgt tctgagccac acgagtcatc 1500
atgaagatcc catacgtctt gctgttcctt gtggtgagtt gctttcgttt ttgatatgct 1560
ggttcctcag gagtctgtac taatgcttct gtttttattg tataaatgtg agcacttcac 1620
ggcctacgta accagctggt tacaatcacc gtccacgccg aaaaaatgag gcctgtatct 1680
aaattgtaac ataatttttg cacatttgat tctcatccca cgattttatt tatctttcat 1740
tcatttttac tggtggtagg acgtcttgtg agtccgcacg tgcaccacct cacctatttc 1800
agccgtgaag cagtaatgcg cttcggtttg aagggtgggg cagccgttgt actttataaa 1860
cggagacctt agaactcatg tcccgagatg ggtggcagca tttacgttgc agatgtctat 1920
gggctccggt aaccacttaa catttttttt ttttcttttt tttttttttt tatcacgcta 1980
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<212>DNA
<213>家蚕
<400>9
gaattcaaat aacaaagtgg tgcctatccc actttttttg atccagacaa agaaaataag 60
tgttttcggt gagctgaaaa attaatttca ggaaacaaca aaaataatga cgcaaaagta 120
caccggagtg aaaataaaca ctaagaaagt aatcgctaaa aattattcat ctcgtgaatt 180
gattgagcgc gataataacg cagtactatt ggagagattc tatgtttaat atattaatga 240
tatgatataa aaaagggtgc gtgtacttat gtacgcgcgt aagaagttat actttatttt 300
cattaaattt atttcttttt ttttatttca attttaatca atttgaaaaa aaatcgaata 360
aacaacatcc tcaaacatgc atattggaca tcccttttct tgacatcgta taaattcggt 420
aattctcggt acggttcgta aagttcacct gcggctatat tccgactcgc caagttacgt 480
cagtcgtatt gtaatgagcg atttagtggg caacttcatt ctgttaattt tgtgtcacgg 540
tgcgcgcgca tcgtaaaact tcactctcat agatttttca taacgcgcct aaagaagtat 600
aacttcaata atttaaattt aaaaaaaaac atgcatagaa taattatatg aattatttaa 660
aatgtcattt accgacattg acataacaga cgacgttaac actacaaaac attttaattc 720
cacattgtta catattcaac agttaaattt gcgttaattc tcgatgcgaa caaatataag 780
aacaatcgga tcaattagat cgctttgttt cgaacaacac ttagtttaac tagaggcgta 840
cacctcaaga aatcatcttc attagaaact aaaccttaaa atcgcaataa taaagcatag 900
tcaattttaa ctgaaatgca aagtcttttg aacgttagat gctgtcagcg ttcgttggta 960
cagttgtttg atatttattt taattgtctt tttatatata aatagtggaa cattaatcac 1020
ggaatcc 1027
<210>10
<211>51
<212>DNA
<213>小鼠
<400>10
atggatttac aggtgcagat tatcagcttc ctgctaatca ttgtcacagt c 51
Claims (34)
1.一种生产TRACP5b的方法，其包含以下的(a)以及(b)步骤：
(a)生产导入了编码TRACP5的DNA的家蚕的步骤；
(b)从所生产的家蚕回收TRACP5b的步骤。
2.一种生产TRACP5b的方法，其包含以下的(a)以及(b)步骤：
(a)生产这样的家蚕的步骤，所述家蚕具有编码丝腺特异性表达的蛋白质的DNA的启动子以及直接或间接地受该启动子表达调控的编码TRACP5的DNA，并且将TRACP5b分泌至丝腺；
(b)从所生产的家蚕回收该TRACP5b的步骤。
3.权利要求2所述的方法，其中，所述家蚕为具有以下的(i)和(ii)所述的DNA的家蚕：
(i)编码转录调控因子的DNA，该DNA可操作地连接在编码丝腺特异性表达的蛋白质的DNA的启动子的下游；
(ii)编码TRACP5的DNA，该DNA可操作地连接在该转录调控因子的目标启动子的下游。
4.权利要求2所述的方法，其中所述家蚕是通过使以下的(i)和(ii)所述的家蚕交配来生产的：
(i)具有编码转录调控因子的DNA的家蚕，该DNA可操作地连接在编码丝腺特异性表达的蛋白质的DNA的启动子的下游；
(ii)具有编码TRACP5的DNA的家蚕，该DNA可操作地连接在该转录调控因子的目标启动子的下游。
5.权利要求3或4所述的方法，其中，所述转录调控因子为GAL4，且所述目标启动子为UAS。
6.权利要求2～5中任一项所述的方法，其中，所述丝腺为中丝腺或后丝腺。
7.权利要求6所述的方法，其中，所述编码丝腺特异性表达的蛋白质的DNA的启动子为编码丝胶蛋白1蛋白质或丝胶蛋白2蛋白质的DNA的启动子。
8.权利要求6所述的方法，其中，编码丝腺特异性表达的蛋白质的DNA的启动子为编码丝心蛋白蛋白质的DNA的启动子。
9.权利要求1～8中任一项所述的方法，其中，所述TRACP5具有信号序列。
10.一种生产分泌TRACP5b的家蚕的方法，该方法包括将编码TRACP5的DNA导入家蚕的步骤。
11.一种生产分泌TRACP5b的家蚕的方法，该方法包括将编码TRACP5的DNA导入家蚕卵的步骤。
12.一种生产将TRACP5b分泌至丝腺的家蚕的方法，该方法包括生产这样的家蚕卵的步骤，所述家蚕卵具有编码丝腺特异性表达的蛋白质的DNA的启动子，以及直接或间接地受该启动子表达调控的编码TRACP5的DNA。
13.权利要求12所述的方法，其中所述家蚕为具有以下(i)和(ii)所述的DNA的家蚕：
(i)编码转录调控因子的DNA，该DNA可操作地连接在编码丝腺特异性表达的蛋白质的DNA的启动子的下游；
(ii)编码TRACP5的DNA，该DNA可操作地连接在该转录调控因子的目标启动子的下游。
14.权利要求12所述的方法，其中，所述家蚕是通过使以下(i)和(ii)所述的家蚕交配来生产的：
(i)具有编码转录调控因子的DNA的家蚕，该DNA可操作地连接在编码丝腺特异性表达的蛋白质的DNA的启动子的下游；
(ii)具有编码TRACP5的DNA的家蚕，该DNA可操作地连接在该转录调控因子的目标启动子的下游。
15.权利要求13或14所述的方法，其中，所述转录调控因子为GAL4，所述目标启动子为UAS。
16.权利要求12～15中任一项所述的方法，其中，所述丝腺为中丝腺或后丝腺。
17.权利要求16所述的方法，其中，所述编码丝腺特异性表达的蛋白质的DNA的启动子为编码丝胶蛋白1蛋白质或丝胶蛋白2蛋白质的DNA的启动子。
18.权利要求16所述的方法，其中，所述编码丝腺特异性表达的蛋白质的DNA的启动子为编码丝心蛋白蛋白质的DNA的启动子。
19.权利要求10～18中任一项所述的方法，其中，所述TRACP5具有信号序列。
20.一种分泌TRACP5b的家蚕，该家蚕具有编码TRACP5的DNA。
21.一种将TRACP5b分泌至丝腺的家蚕，该家蚕具有编码丝腺特异性表达的蛋白质的DNA的启动子，以及直接或间接地受该启动子表达调控的编码TRACP5的DNA。
22.权利要求21所述的家蚕，该家蚕具有以下(i)和(ii)所述的DNA：
(i)编码转录调控因子的DNA，该DNA可操作地连接在编码丝腺特异性表达的蛋白质的DNA的启动子的下游；
(ii)编码TRACP5的DNA，该DNA可操作地连接在该转录调控因子的目标启动子的下游。
23.权利要求21所述的家蚕，该家蚕是通过使以下(i)和(ii)所述的家蚕交配来生产的：
(i)具有编码转录调控因子的DNA的家蚕，该DNA可操作地连接在编码丝腺特异性表达的蛋白质的DNA的启动子的下游；
(ii)具有编码TRACP5的DNA的家蚕，该DNA可操作地连接在该转录调控因子的目标启动子的下游。
24.权利要求22或23所述的家蚕，其中，所述转录调控因子为GAL4，所述目标启动子为UAS。
25.权利要求21～24中任一项所述的家蚕，其中，所述丝腺为中丝腺或后丝腺。
26.权利要求25所述的家蚕，其中，所述编码丝腺特异性表达的蛋白质的DNA的启动子为编码丝胶蛋白1蛋白质或丝胶蛋白2蛋白质的DNA的启动子。
27.权利要求25所述的家蚕，其中，所述编码丝腺特异性表达的蛋白质的DNA的启动子为编码丝心蛋白蛋白质的DNA的启动子。
28.权利要求20～27中任一项所述的家蚕，其中，所述TRACP5具有信号序列。
29.具有编码TRACP5的DNA的家蚕，该DNA可操作地连接在转录调控因子的目标启动子的下游。
30.权利要求29所述的家蚕，其中，转录调控因子为GAL4，且目标启动子为UAS。
31.权利要求29或30所述的家蚕，其中，所述TRACP5具有信号序列。
32.权利要求1～9中任一项所述的方法，其中，所述TRACP5b用于TRACP5b的特异性抑制剂、激活剂或调节剂的候选化合物的筛选。
33.权利要求32所述的方法，其中，TRACP5b的特异性抑制剂、激活剂或调节剂用于与骨吸收的增加相关的疾病的治疗。
34.权利要求33所述的方法，其中，所述与骨吸收的增加相关的疾病为选自组织障碍、骨代谢病或骨质疏松症的疾病。
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