WO2002086119A1

WO2002086119A1 - Ver a soie transforme produisant du collagene humain

Info

Publication number: WO2002086119A1
Application number: PCT/JP2001/004906
Authority: WO
Inventors: Katsutoshi Yoshizato; Masahiro Tomita; Tsutomu Satou; Hajime Mori; Toshiki Tamura; Takahiro Adachi; Hiroto Munetsuna
Original assignee: Japan Science And Technology Corporation; Hiroshima Industrial Technology Organization; Terumo Kabushiki Kaisha; Koken Co., Ltd.; National Institute Of Agrobiological Sciences
Priority date: 2001-04-18
Filing date: 2001-06-11
Publication date: 2002-10-31
Also published as: JP4701336B2; US20070083940A1; EP1391509A1; CA2445011A1; EP1391509A4; CN100384995C; CN1516734A; JP2002315580A

Description

明細 ¾F ヒ卜■コラーゲンを産生する形 S転換カイ

技術分野この出願の発明は、組換えヒ卜 ·コラーゲンを産生する形質転換カイコに関するものである。さらに詳しくは、この出願の発明は、組換えヒ卜 ·コラーゲンを産生する形質転換カイコと、この形質転換カイコを作製するための組換えべクタ一、並びに組換えヒ卜■ コラーゲンの製造方法に関するものである。

背景技術コラーゲンは細胞外基質を構成する代表的タンパク質であり、細胞の足場となつて生体の構造を維持するといつた機械的機能の他、細胞の増殖、分化、移動などを制御する様々な生理的機能を有している。そのためコラーゲンは生体の損傷を修復するためのバイオマテリアルとして（丄 Surg. Res. 10:485-491 , 1970) 、またある種の薬剤を徐放するためのキャリア一として（丄 Controlled Release 33:307-315, 1995) 、医療分野で広く利用されている。しかし、現在用いられているコラーゲンの大部分はゥシゃブタ等の動物組織由来のものであり、これらのコラーゲンをヒ卜に移植した場合、約 3 %の患者にアレルギー反応が生じることが知られている ( J. Immunol.136:877-882, 1986 ； Biomaterials 11 :176-180, 1990) 。また、動物組織由来コラーゲンにおけるウィルスやブリオン等病原体混入の危険性は近年大きな問題となっている。そのため抗原性が無く、また病原体混入の危険性が無い組換え型ヒ卜 ·コラーゲンを生産するシステムが望まれている。そこで、この出願の発明者らは、ヒ卜 ■ コラーゲンをコードする cDNAを揷入した組換えウィルスを昆虫細胞に感染させることにより、ヒ卜生体内のものと同等な三重らせん構造を有する組換えヒ卜 ·コラーゲンを製造する方法を発明し、特許出願している（特開平 8-23979号公報）。また、哺乳動物細胞や酵母を用いてヒ卜■ コラーゲンを製造する方法も考案されている（特表平 7-501937 公報）。前記のとおり、組換えヒ卜 ·コラーゲンを生産する方法として、昆虫細胞、哺乳動物細胞、酵母を用いる方法等が考案されているが、昆虫細胞や哺乳動物細胞を用いる方法では医療分野で用いることが可能なほどの高い生産量を上げることは難しい。また、酵母を用いる方法は、組換え産物が菌体内に産生されるため、組換えヒ卜■コラーゲンの精製は必ずしも容易ではない。この出願の発明は、以土のとおりの事情に鑑みてなされたものであり、従来技術の問題点を解消し、高い生産性と精製の容易さを兼ね備えた組換えヒ卜 · コラ一ゲン生産法と、そのための遺伝子工学材料を提供することを課題といている。

発明の開示この出願の第 1の発明は、ヒ卜■ コラーゲンをコードするポリヌクレオチドをゲノム DNA 内に有し、組換えヒ卜 · コラーゲンを繭または絹糸腺内のタンパク質の一部として産生する形質転換カイコである。この出願の第 2の発明は、ヒ卜 ■ コラーゲンとカイコ絹タンパク質との融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドをゲノム DNA 内に有し、前記融合タンパク質を繭または絹糸腺内のタンパク質の一部として産生する形質転換カイコである。これらの第 1発明および第 2発明の形質転換カイコには、カイコ成虫、幼虫、蛹および卵が含まれる。また、これら第 1発明および第 2発明の形質転換カイコにおいては、プロリン水酸化酵素 αサブュニッ卜および βサブュニッ卜の少なくとも一方をコードするポリヌクレオチドをゲノム DNA内に有することを好ましい態様としている。この出願の第 3の発明は、前記第 1発明の形質転換カイコの繭または絹糸腺から組換えヒト■ コラーゲンを単離、精製することを特徴とする組換えヒ卜 ■ コラ一ゲンの製造方法である。この出願の第 4発明は、前記第 2発明の形質転換カイコの繭または絹糸腺から組換えヒ卜 ·コラーゲンとカイコ絹タンパク質との融合タンパク質を単離し、この融合タンパク質から組換えヒ卜■コラーゲンを分離、精製することを特徴とする組換えヒ卜 ·コラーゲンの製造方法である。この出願の第 5発明は、前記第 2発明の形質転換カイコが産生する組換えヒ卜 · コラーゲンとカイコ絹タンパク質との融合タンパク質である。この出願の第 6の発明は Autographs californica 核多角体ウィルス由来のターゲティングベクターであり、このべクタ一は、ヒト · コラーゲンをコードするポリヌクレオチドをカイコ ■ゲノムの任意領域と相同組換えし、ヒ卜 ·コラーゲンを産生する形質転換カイコを作成するために使用する。なお、この出願の発明において、「ヒ卜 ' コラーゲンをコードするポリヌクレオチド」とは、コラーゲンを発現するヒ卜核酸分子であり、ヒ卜 ·ゲノム DNA、ゲノム DNAから転写される mRNA、 mRNAから合成される cDNA等である。この第 6発明のターゲティングベクターの 1つの態様は、ヒ卜 ■コラーゲンをコードするポリヌクレオチドの両端に、カイコ絹タンパク質をコードするゲノム DNA (カイコ絹タンパク質遺伝子）の任意領域と相同の DNA 配列を有することである。このターゲティングベクターは、ヒ卜 .コラーゲンをコードするポリヌクレオチドを、カイコ ·ゲノムの絹タンパク質遺伝子の（すなわち、内在性の）発現制御配列（プロモーター Zェン八ンサー配列）の下流に相同組換えする。この第 6発明のターゲティングベクタ一の別の態様は、ヒ卜 . コラーゲン発現カセッ卜の両端に、カイコ 'ゲノム DNAの任意領域と相同の DNA配列を有することである。このタ一ゲティングベクターは、ヒ卜 · コラーゲン発現カセットを、カイコ ·ゲノムの任意領域に相同組換えする。なお、この「発現カセット」とは、カイコ絹タンパク質遺伝子の発現制御配列の支配下にヒ卜 · コラーゲンをコードするポリヌクレオチドが連結された融合ポリヌクレオチドを意味する。この出願の第 7の発明は、プロリン水酸化酵素 αサブュニッ卜および βサブュニッ卜の少なくとも一方をコードするポリヌクレオチドをカイコ ■ゲノムの任意領域と相同組換えするための、 Autographa californica 核多角体ウィルス由来の夕一ゲティングベクターである。この出願の第 8の発明は、昆虫由来 DMA型卜ランスポゾンの一対の逆向き反復配列に挟まれた領域に、ヒ卜 ·コラーゲン発現カセッ卜を有する組換えプラスミドベクターである。この出願の第 9の発明は、昆虫由来 DNA型卜ランスポゾンの一対の逆向き反復配列に挟まれた領域に、プロリン水酸化酵素 αサブュニッ卜および βサブュニッ卜の少なくとも一方をコードするポリヌクレオチドを有する組換えプラスミドベクターである。この出願の第 1 0 の発明は、前記第 8発明の組換えプラスミドベクターと、卜ランスポゾンの卜ランスポゼースをコードするポリヌクレオチドを有する組換えプラスミドベクターとからなるベクターセッ卜である。このべクタ一セッ卜の使用によって、ヒ卜 · コラーゲン発現カセットがカイコ ·ゲノムに転移され、ヒ卜 -コラーゲンを産生する形質転換カイコが作成される。この出願の第 1 1 の発明は、前記第 9発明の組換えプラスミドベクターと、卜ランスポゾンのトランスポゼースをコードするポリヌクレオチドを有する組換えプラスミドベクターとからなるベクターセットである。この第 1 1 発明のベクタ一セットと、前記第 10 発明のベクターセットとの使用によって、プロリンが水酸化されたヒ卜■コラーゲンを産生する形質転換カイコが作成される。この出願の第 12 の発明は、配列番号 2のアミノ酸配列を有するカイコ ·プロリン水酸化酵素 αサブュニッ卜をコードするポリヌクレオチドであり、具体的には、配列番号 1の塩基配列を有する DNA断片である。なお、この出願の各発明においては、プロリン水酸化酵素 αサブュニッ卜をコードするポリヌクレオチドが、配列番号 1の塩基配列を有する DNA 断片の少なくともコード領域であることを好ましい態様としている。また、ヒ卜 'コラーゲン発現カセッ卜が、カイコ絹タンパク質遺伝子の発現制御配列の支配下にヒ卜 - コラーゲンをコードするポリヌクレオチドを連結した融合ポリヌクレオチドであること、またはカイコ絹タンパク質遺伝子の発現制御配列の支配下に、カイコ絹タンパク質をコードするポリヌクレオチドとヒ卜 · コラーゲンをコードするポリヌクレオチドを連結した融合ポリヌクレオチドであることを好ましい態様としている。

図面の簡単な説明図.1 は、卜ランスラファ一ベクター pMOSRA-1の制限酵素地図である, 図 2は、 piggyBac プラスミドベクターに組み込まれたミニコラーゲン遺伝子 (pMOSRA-4B, p OSRA-5, p OSRA-6) の制限酵素地図である。図 3は、陽性 F1 カイコ成虫から抽出したゲノ厶 DNAを錶型'として PCRを行い、その増幅産物の電気泳動像を示す図である。 1および 2は陽性カイコの番号を表す。レーン Mは 100bpラダーマーカ一である。図 4は、陽性 F1カイコ 5齢幼虫の絹糸腺から抽出した RNAを用いて RT-PCR を行い、その増幅産物の電気泳動像を示す図である。レーン 1および 2には陽性カイコの RT-PCR産物を、レーン Cには野生型カイコの RT-PCR産物を泳動した。レーン Mは 100bpラダ一マ一力一である。

発明を実施するための最良の形態コラーゲンには現在までに I型から XIX型までの 19種の異なった型のものが存在することが知られている。これらのコラーゲンはいずれも 3つのサブュニッ卜（α 鎖）から形成される三量体分子で、その分子内に三重らせん構造をもつことが特徴である。コラーゲンの中には、先ず前駆体であるプロコラーゲンとして合成された後、成熟型のコラーゲン分子に変換されるものがある。例えばし Iし III型コラーゲン等の線維性コラーゲンは、その本体である三重らせん領域のアミノ末端側およびカルボキシル末端側に非三重らせん構造のァミノプロペプチドおよびカルボキシルプロべプチドを有したプロコラーゲンとして合成され、両方のプロペプチドが特異的なプロテア一ゼにより切断された後、成熟したコラーゲンとなる。また、コラーゲンはその生合成過程で、プロリンの水酸化、リジンの水酸化、リジンおよび水酸化リジンの酸化（アルデヒド化）等を含む様々な翻訳後修飾を受ける。特にプロリン水酸化酵素によるプロリンの水酸化は、コラーゲンが生理的温度での安定性を獲得する上で非常に重要である。この出願の発明が対象とするヒ卜 ·コラーゲンは、 I型から XIX型コラーゲンを含むすべてのコラーゲンであり、これらコラーゲンの部分アミノ酸配列も含む。また、これらコラーゲンのアミノ酸配列の一部分を改変したものや、コラーゲンに由来しないアミノ酸配列を付加したものも含む。また、成熟したコラーゲンに加え、前駆体であるプロコラーゲンやプロペプチドの一部が切断されたのもの含む。さらに、この出願の発明では、プロリンの水酸化を含む翻訳後修飾が不完全であったり、三重らせん構造が不完全である未成熟なコラーゲン分子も対象とする。カイコは吐糸期にはいると、大量の絹糸を吐き出して繭を作る。この絹糸の主成分はフイブ口イン、 P25 およびセリシンを含む絹タンパク質であり、これら絹タンパク質の合成量は 1頭のカイコあたり平均で約 0.5 g にも達するほど莫大である。絹タンパク質は絹糸腺と呼ばれる器官で合成される。絹糸腺は後部絹糸腺、中部絹糸腺および前部絹糸腺より構成され、後部絹糸腺ではフイブ口インおよび P25が、中部絹糸腺ではセリシンがそれぞれ特異的に合成 ·分泌される。フイブ口インは H鎖およびし鎖から構成される複合体で、さらにこの複合体に P25が会合している（丄 Biol. Chem. 275:4051 7-40528， 2000) 。後部絹糸腺から分泌されたフイブ口インおよび P25 は、絹糸腺の蠕動運動によって徐々に中部絹糸腺へと送られ、そこで分泌されたセリシンによって周りを被覆され、さらに前部絹糸腺へと送られ絹糸として吐糸される。このように、カイコ絹糸腺は優れたタンパク質合成能力を有した器官であり、この器官で組換えヒ卜 · コラーゲンを発現させた場合、非常に高い生産性が期待できる。さらに、絹糸は体外に排出されること、絹糸を構成する絹タンパク質の種類が少ないこと、および絹タンパク質の中で最も存在量の多いフィプロインは水溶液に不溶性であることから、合成された組換えヒ卜 ·コラーゲンをカイコが吐き出した繭から、または絹糸腺内のタンパク質から回収および精製することは著しく容易である。カイコにおける一過性の外来遺伝子発現システムはカイコ核多角体ウィルス

(BmNPV) をべクタ一として利用する方法が確立されている（特公平 7-97995 号公報）。しかし、この方法ではウィルスの感染によりカイコは致死するため、次世代以降に外来遺伝子を伝達することはできず、有用タンパク質の発現は一代限りである。そのため、外来遺伝子を発現させる度にウィルス接種を行う必要がある。一方、森らは iogf/"ap/7a ca//7o/Y7/'ca核多角体病ウィルス（AcNPV) を力ィコ幼虫に感染させることにより、カイコを致死させることなく遺伝子を導入し、メスに感染させた場合には生殖細胞を通じて次世代まで外来遺伝子を伝達することが可能な方法を開発した（特開平 6-277051 号公報）。さらに、山尾らはフィプロイン L鎖遺伝子配列の一部を組み込んだ AcNPVをカイコ幼虫に感染させ、遺伝子ターゲティングにより外来遺伝子をカイコゲノムのフイブ口イン L鎖遺伝子に挿入した形質転換カイコを作製することに成功している（Genes Dev. 13: 51 1 -516， 1999) 。また、田村ら（Nat. Biotechnol. 18:81 -84, 2000) は、鱗翅目昆虫 7>7'c 7op/us/'a mに由来する DNA型トランスポゾンである piggyBacを組み込んだプラスミドべクタ一をカイコ卵に微量注射することにより、外来遺伝子を挿入した形質転換力ィコを作製することに成功している。これらの方法で作出された形質転換カイコにおいて、挿入された外来遺伝子は脱落することなく染色体内に維持され、世代を通じて永続的に組換えタンパク質を発現する。この出願の発明では、ヒ卜 · コラーゲンをコードするポリヌクレオチドを AcNPVベクターへ、または DNA型卜ランスポゾンをもとに作製したプラスミドベクターへ組み込み、これらのベクターを用いてカイコ ·ゲノム配列内にヒ卜 - コラーゲンをコードするポリヌクレオチドを挿入した形質転換カイコを作製する, ヒ卜 ■コラーゲンをコードするポリヌクレオチドは、ヒ卜 ·コラーゲンのゲノ厶 DNA、' mRNAまたは mRNAから合成した cDNA等を用いることができるが、好ましくは cDNAを使用する。以下では、 cDNAを使用した場合について主に説明するが、この発明に使用するポリヌクレオチドは cDNAに限定されるものではない。ヒ卜■コラーゲン cDNAは 1型から XIX型コラーゲンのいずれの cDNAであつてもよい。これらの cDNA の塩基配列は文献（例えば、 Essays Biochem. 27:49-67, 1992； Annu.Rev. Biochem. 64:403-434, 1995) に記載された情報から入手可能である。例えば、これらの cDNA配列に基づいて作製したオリゴヌクレ才チドをプローブとしてヒ卜 cDNAライブラリーをスクリーニングする方法や、あるいは cDNA配列の両端に対応するオリゴヌクレオチドをプライマーとし、ヒ卜の遺伝子を錶型とする PCR法、またはヒ卜細胞から抽出した RNAを錶型とする RT-PCR法によって、ヒ卜 I型〜 XIX型コラーゲンの各 cDNAを得ることがでさる。カイコ絹糸腺細胞にてヒ卜 · コラーゲン cDNAを発現させるために、フイブ口イン H鎖、フィプロイン L鎖、 P25 およびセリシンを含む絹タンパク質遺伝子由来の発現制御配列（プロモーターおよびェン八ンサ一）を利用することができる。これら絹タンパク質のプロモーターおよびェンハンサーを利用して発現カセッ卜を構築することにより、組換えヒ卜 · コラーゲンを絹糸腺特異的に大量に発現させることができる。例えば、フイブ口イン H 鎖、フイブ口イン L鎖、 P25 のプロモータ一およびェンハンサーを利用すれば、ヒ卜 ·コラーゲンを後部絹糸腺で発現させることができ、セリシンのプロモーターおよびェンハンサーを利用すれば、ヒ卜 · コラーゲンを中部絹糸腺で発現させることができる。ヒ卜 · コラ一ゲン発現カセットはまた、絹糸腺細胞からの分泌や吐糸を容易にするために、ヒ卜 ■ コラーゲン cDNAとフイブ口イン H鎖、フイブ口インし鎖、 P25およびセリシンを含む絹タンパク質 CDNAとの融合ポリヌクレオチドを作製し、この融合ポリヌクレオチドをカイコ ·ゲノム配列内に組み込むことにより、ヒ卜 - コラ一ゲンとカイコ絹タンパク質の融合タンパク質を合成させても良い。この場合、融合させるタンパク質は絹タンパク質の部分アミノ酸配列であっても良いし、全長アミノ酸配列であっても良い。例えば、ヒト ·コラーゲンのシグナルペプチドを絹タンパク質のシグナルペプチドと置換した融合タンパク質を合成させれば、ヒ卜，コラーゲンの絹糸腺細胞からの分泌を容易にすることができる。また、例えばフイブ口イン L鎖全長とヒ卜■コラーゲンの融合タンパク質を合成させれば、合成されたフイブ口イン L鎖とヒト 'コラーゲンの融合タンパク質は、フイブ口イン H鎖とジスルフィド結合により複合体を形成し、より効率良く分泌させることができる。遺伝子導入系が AcNPV ベクターを用いた遺伝子ターゲテイング法である場合、ヒ卜■コラーゲン cDNAを定法により AcNPVゲノム DNA内に組み込んでターゲティングベクターを構築し、これをカイコ幼虫に感染させることにより、相同組換えによりカイコ ■ゲノム DNA内にヒ卜 ·コラーゲン cDNAを組み込むことができる。相同組換えによりヒ卜■コラーゲン cDNAを組み込む部位は、例えばフイブ口イン H鎖、フイブ口インし鎖、 P25およびセリシンを含む絹タンパク質遺伝子内であっても良いし、あるいは絹タンパク質遺伝子以外の任意のゲノム DNA領域であっても良い。組み込み部位が絹夕ンパク質遺伝子内の場合は、その絹タンパク質遺伝子内の 2箇所の任意領域と相同の DNA配列を、それぞれヒ卜 ·コラーゲン cDNAの前後に連結して AcNPV ターゲテイングベクターを構築する。このタ一ゲティングベクターの感染によって、カイコ内在性の発現制御配列の下流にヒト ·コラーゲン cDNAが組み込まれ、内在性絹タンパク質プロモーター/ェンハンサ一の作用によって cDNAからヒ卜 ·コラーゲンが発現される。またこの場合、ヒ卜 · コラ一ゲン cDNAと絹タンパク質との融合タンパク質が合成されるように、ヒ卜 - コラーゲン cDNAを絹タンパク質遺伝子内に組み込むこともできる。例えば、フィプロイン L鎖遺伝子第 7ェクソン内の終始コドン直前にアミノ酸フレームが一続きになるようにヒ卜 ·コラーゲン CDNAを組み込み、フイブ口インし鎖とヒ卜 - コラーゲンの融合タンパク質を合成させることができる。この場合の AcNPV ベクタ一内には、コラーゲン cDNAの前後に、フイブ口インし鎖第 7ェクソンから上流および下流のゲノム DNAと相同の DNA配列をそれぞれ 0.5 kb〜6.0 kb程度挿入する。また、絹タンパク質遺伝子以外の任意のゲノム DNA 配列内にヒ卜 ·コラーゲン cDNAを相同組換えする場合には、ヒト ·コラーゲン cDNAの上流に絹タンパク質遺伝子プロモーターを連結したヒ卜 ·コラーゲン発現カセッ卜を作製する。そして発現カセットを相同組換えするカイコ ·ゲノム DNA領域から上流および下流のそれぞれ 0.5 kb〜6.0 kb程度に相同の DNA配列を発現カセッ卜の前後に連結し、これを AcNPV ベクターに組み込んでターゲテイングべクタ一を構築する。相同組換え部位が絹タンパク質遺伝子内の場合、および絹タンパク質遺伝子以外の任意のゲノム配列のどちらの場合でも、ヒ卜 · コラーゲン cDNAと共にマ一力一遺伝子を同時に組み込み、次世代（F1 ) さらに次の世代（F2) での形質転換カイコの選抜を容易にさせることも可能である。マ一カー遺伝子としては、例えば GFP等の蛍光タンパク質遺伝子を挙げることができ、また、マーカー遺伝子を発現させるためのプロモー夕一としては、例えばカイコ ·ァクチンプロモ一夕—やショウジヨウバエ HSP70プロモーター等を挙げることができる。ヒ卜 ·コラーゲン cDNAを組み込んだ形質転換カイコを作製するための別の態様は、昆虫由来 DMA 型卜ランスポゾンを利用した形質転換である。 piggyBac、 mariner (Insect Mol. Biol. 9: 145-155, 2000) 、および Minos (Insect Mol. Biol. 9： 277-281 , 2000) 等の昆虫由来 DNA型卜ランスポゾンは、カイコ細胞内で転移活性を示すことが知られており、これらの DNA型卜ランスポゾンをもとに作製したプラスミドベクターによりカイコを形質転換させることが可能である。特に piggyBac をもとに作製したプラスミドベクターは、カイコ卵に微量注入することにより、実際にカイコを形質転換させることに成功している（Nat. Biotechnol. 1 8： 81 -84, 2000) 。昆虫由来 DNA型卜ランスポゾンを利用する場合、外来遺伝子はカイコ ·ゲノム内の任意の配列に組み込まれる。従って、カイコ ■ゲノム配列内に組み込んだヒ卜 ·コラーゲン cDNAを絹糸腺にて発現させるために、あらかじめヒ卜 ·コラーゲン cDNAの上流にフイブ口イン H鎖、フイブ口イン L鎖、 P25 およびセリシンを含む絹タンパク質遺伝子由来のプロモーターおよびェンハンサ一を連結したヒ卜 · コラーゲン発現カセッ卜を作製しておく必要がある。また、ヒ卜 · コラーゲンと絹タンパク質の融合ポリヌクレオチドを組み込む場合には、この融合ポリヌクレオチドの上流に絹タンパク質遺伝子由来のプロモ一ターおよびェンハンサーを連結した発現カセッ卜を作製しておく。以下に piggyBac を例に挙げて、その性質およびヒ卜 ·コラーゲン発現カセッ卜を導入する方法を説明するが、この発明で使用する昆虫由来 DNA型卜ランスポゾンは piggyBacに限定するものではなく、 marinerおよび Minosを含む他の DNA型卜ランスポゾンを使用しても良い。これら piggyBac 以外の卜ランスポゾンを用いた場合のヒト · コラーゲン発現カセッ卜を導入する方法は、以下に記した piggyBacを用いた方法と基本的に同様である。 piggyBacは、鱗翅目昆虫 Trichoplusia π/'由来の培養細胞である ΤΝ-368から単離された DNA型トランスポゾンである。中央部にある卜ランスポゼース ORFと、その両端に存在する 13 bpの逆向き反復配列から構成されており、長さは約 2.5 kbである。卜ランスポゼース ORFからは卜ランスポゼースタンパク質が合成され、この酵素の作用により、逆向き反復配列にはさまれた領域（piggyBac 自体）を標的配列である TTAAに転移させる（Virology 1 61 : 8-17, 1 989) 。このような piggyBac の性質を利用してカイコ ·ゲノム配列内にヒ卜 -コラーゲン発現カセットを挿入するには、例えば田村らの方法（Nat. Biotechnol. 18: 81 -84, 2000) と同様な方法によって行うことができる。即ち、 piggyBac の一対の逆向き反復配列を適当なプラスミドベクターに組み込み、ヒ卜 · コラーゲン発現カセッ卜を一対の逆向き反復配列で夾むように挿入する。そしてこのプラスミドべクターを、 piggBac の卜ランスポゼース発現ベクター（ヘルパープラスミド）と共にカイコ卵へ微量注入する。このヘルパープラスミドは、 piggyBac の逆向き反復配列の片方または両方を欠いた、実質的には piggyBac の卜ランスポゼース遺伝子領域のみが組み込まれている組換えプラスミドベクターである。このへルパ一プラスミドにおいて、トランスポゼースを発現させるためのプロモータ一は、内在性の卜ランスポゼースプロモータ一をそのまま利用しても良いし、あるいは、カイコ ■ァクチンプロモーターやショウジヨウバエ HSP70 プロモーター等を利用してもよい。次世代カイコのスクリーニングを容易にするために、コラーゲン発現カセットを組み込んだベクター内に同時にマ一カー遺伝子を組み込んでおくこともできる。この場合、マーカー遺伝子の上流に例えばカイコ ·ァクチンプロモーターやショウジヨウバエ HSP70 プロモーター等のプロモーター配列を組み込み、その作用によりマーカー遺伝子を発現させるようにする。

F1 世代のカイコからの、および AcNPVベクターを用いた場合はさらに F2世代のカイコからの形質転換カイコの選抜は、例えば PCR法やサザンブロッ卜法を用いて行う。また、マーカ一遺伝子を組み込んだ場合には、その表現形質を利用して選抜することも可能である。例えばマーカー遺伝子として GFP等の蛍光タンパク質遺伝子を利用した場合には、 F1 や F2世代のカイコ卵や幼虫に励起光を照射し、蛍光タンパク質の発する蛍光を検出することにより行うことができる。このようにして選抜されたカイコは、その染色体内にヒ卜■ コラーゲン cDNAが組み込まれている形質転換カイコである。従って、これらのカイコを野生型カイコと、あるいは形質転換カイコどうしで交配させた子孫においてもヒ卜 ·コラーゲン cDNAは消失することなく伝達され、世代を通じてヒ卜 · コラーゲンまたはコラーゲンと絹タンパク質との融合タンパク質を産生させることができる。上記のヒ卜 · コラーゲンを産生する形質転換カイコに、さらにプロリン水酸化酵素をコードするポリヌクレオチドを絹糸腺で発現しうる形態で導入すれば、生理的温度において完全に熱安定なヒ卜 'コラーゲンを生産させることができる。導入するプロリン水酸化酵素ポリヌクレオチド（例えば cDNA) は、ヒ卜ゃ他の動物に由来するポリヌクレオチドであっても良いし、カイコ由来のプロリン水酸化酵素ポリヌクレオチドでも良い。プロリン水酸化酵素は αサブユニットと βサブュニッ卜の複合体であり、この複合体を形成しなければ酵素活性は生じない。 α サブユニットは触媒活性を有するサブユニットであり、本来コラーゲンを産生する細胞に存在する。一方、 β サブュニッ卜はタンパク質のジスルフィド結合の構造変換を触媒する酵素であるプロテインジスルフィドイソメラーゼと同一のポリペプチドであり、全ての細胞に普遍的にかつ比較的多量に存在する。カイコ絹糸腺細胞は、コラーゲンを多量に産生する細胞ではないので αサブュニッ卜の存在量はわずかであるが、 β サブユニットは比較的多量に存在する。カイコにプロリン水酸化酵素ポリヌクレオチドを導入し、カイコ絹糸腺にてプロリン水酸化酵素を発現させるには、上記のようにヒ卜等の動物由来のプロリン水酸化酵素ポリヌクレオチドを用いる方法と、カイコのプロリン水酸化酵素ポリヌクレオチドを用いる方法がある。ヒ卜等動物由来のプロリン水酸化酵素ポリヌクレオチドを用いる場合、 αサブュニッ卜および βサブュニッ卜のそれぞれをコードする 2種類のポリヌクレオチドが必要である。昆虫の βサブュニッ卜はヒ卜等動物由来の α サブユニットとほとんど活性型の複合体を形成しないため、ヒト等動物由来の α サブユニットの発現のみでは活性型の酵素を合成させることができない。一方、カイコのプロリン水酸化酵素ポリヌクレオチドを用いる場合は、 α サブユニットのものだけでよい。絹糸腺にて発現する αサブユニットは、比較的多量に存在する内在性の βサブュニッ卜と活性型の複合体を形成することができるからである。この出願は、カイコ ·プロリン水酸化酵素 αサブユニット（配列番号 2 ) をコードする新規なポリヌクレオチドを提供する。このポリヌクレオチドは、配列番号 1の塩基配列を有する cDNA、およびゲノム DNAから単離 ·精製された DNA 断片および RNA断片である。ゲノム DNA断片や RNA断片は、配列番号 1の塩基配列に基づいて作成したオリゴヌクレ才チド等を用いたスクリ一二ングゃ PCRによって得ることができる。プロリン水酸化酵素をコードするポリヌクレオチドをカイコ染色体内に導入してカイコ絹糸腺で酵素を発現させるためには、絹糸腺で遺伝子を発現させることが可能なプロモーターを利用する。この条件を満たすプロモーターとしては、例えば絹糸腺だけで遺伝子を発現させることができるフイブ口イン、 P25、およびセリシンを含む絹タンパク質のプロモーターや、どの組織でも発現可能なプロモ一ターであるカイコ ·ァクチン、ショウジヨウバエ HSP70、 AcNPVの IE1 等のプロモーターを挙げることができる。プロリン水酸化酵素ポリヌクレオチドを力ィコ染色体に導入するには、前記のヒ卜■コラーゲン CDNAを導入するための方法と同様な方法、即ち、 AcNPV を用いた遺伝子ターゲティング法あるいは、 piggyBac等の DNA型トランスポゾンを基に作製したプラスミドベクターをカイコ卵にマイクロインジェクションする方法によって行うことができる。ヒ卜 -コラーゲンとプロリン水酸化酵素の両方のポリヌクレオチドを有するカイコを作製するためには、ヒ卜 ' コラーゲンポリヌクレオチドを有する形質転換カイコにプロリン水酸化酵素ポリヌクレオチドを導入しても良いし、逆にプロリン水酸化酵素ポリヌクレオチドを有する形質転換カイコにヒ卜 · コラーゲンポリヌクレ才チドを導入しても良い。あるいは、ヒ卜 'コラーゲンポリヌクレオチドのみを有する形質転換カイコと、プロリン水酸化酵素ポリヌクレオチドを有する形質転換カイコを別々に作製し、これらを交配させることによって、両方のポリヌクレオチドを有する形質転換カイコを選抜しても良い。なお、 AcNPV ベクタ一によって両方のポリヌクレオチドをそれぞれ導入し、あるいは DNA 型卜ランスポゾンベクターによって両方のポリヌクレオチドをそれぞれに導入することができるが、 AcNPV夕一ゲティングベクターを用いてヒ卜 . コラーゲンポリヌクレオチドを導入し、 DNA 卜ランスポゾン型のプラスミドベクターを用いてプロリン水酸化酵素ポリヌクレオチドを導入してもよく、あるいはその逆であってもよいヒ卜 · コラーゲン cDNAを有する形質転換カイコは、 5齢期に達すると、内在性の絹タンパク質と共にヒ卜 · コラーゲンを合成し、絹糸の一部として繭中にヒト ·コラーゲンを分泌する。繭中のヒ卜 ·コラーゲンは例えば 0.5M 酢酸等によつて簡単に抽出することができる。また、例えばヒ卜 · コラーゲンをカイコ ·フイブ口インし鎖との融合タンパク質として合成させた場合には、還元状態にすることにより融合タンパク質とフイブ口イン H鎖間のジスルフィド結合を切断し抽出することができる。また、繭中に含まれるヒ卜 ·コラーゲンが線維性コラーゲンであり、三重らせん領域部分（ァテロコラーゲン）のみを精製する場合には、繭のタンパク質をペプシン等のタンパク質分解酵素で処理する。この操作により夕ンパク質分解酵素で消化されることのないァテロコラーゲンが抽出でき、かつ他の多くのタンパク質はペプシンの消化を受けるため、その後の精製を容易に行うことができる。また、ヒ卜 ·コラーゲンを形質転換カイコの絹糸腺から繭の場合と同様の方法で抽出■精製することもきる。絹糸腺はカイコを解剖することにより簡単に分離することができ、含まれる夕ンパク質のほとんどが絹夕ンパク質であるため、繭の場合同様、容易にヒ卜 ' コラーゲンを抽出 ·精製することが可能である。

実施例以下に、ヒ卜 III型コラーゲンの製造方法に関する実施例を挙げてこの出願の発明をより具体的に説明するが、この出願の発明はこの例に限定されるものではない。実施例 1

AcNPVベクターを用いた »伝子タ一ゲティング法による

形質転換カイコの作製ヒ卜 III型プロコラーゲンをコードする cDNAは、この出願の発明者らがクローニングした cDNA (特開平 8-23979 号公報： GeneBank データベース登録番号 X14420) を、また、カイコ - フイブ口インし鎖遺伝子およびその下流のカイコ 'ゲノム DNA 配列は、既知のカイコ · フイブ口インし鎖遺伝子の塩基配列 (Gene 100:151-158, 1992： GeneBankデータべ-ス登録番号 M76430) を基に以下の方法で単離した。なお、以下の記載において、ヒト III型プロコラーゲン cDNAおよびカイコ -フイブ口インし鎖遺伝子の塩基番号は、前記 GeneBankデータベースに記載記されている塩基番号に準じている。

(1 ) カイコ ·フイブ口インし鎖遺伝子およびその下流域ゲノム D N A配列の単離 PCR 法を用いてフイブ口インし鎖イン卜ロン 6内の遺伝子断片の増幅を行つた。 PCR プライマーは、前記データベースの配列を基に合成したオリゴヌクレォチド（配列番号 3 および配列番号 4) を用い、铸型にはカイコ tokai x asahi strainのゲノム DMAを使用した。次いで、得られた DNA断片をプローグに用いて、 λΕΜΒΙ_3により構築されているカイコ kinshu x showa strainゲノムライブラリ一を定法に従いスクリーニングした。その結果フイブ口イン L鎖遺伝子の塩基番号 9600 から下流に約 15kb の領域を含んでいるカイコ 'ゲノム DNA 断片 (pRI/ 0k) を得た。

(2) 部位特異的突然変異導入による制限酵素認識配列の作製

フイブ口イン L鎖遺伝子ェクソン 7内に III型プロコラーゲン cDNAを繋ぐため、部位特異的突然変異導入によりフイブ口イン遺伝子に新たな制限酵素サイ卜を設けた。突然変異導入はクロンテック社の Mutagenesお Kitを使用した。突然変異導入用プライマー（配列番号 5) はフイブ口イン L鎖遺伝子ェクソン 7のス卜ップコドン直前に制限酵素 Xho I部位（配列番号 5の位置 8— 12) を設けるように設計した。錶型プラスミドには、 pRI/10k から EcoRI— Sphl 断片（塩基番号 12000- 14800) を PUC18 にサブクロ一ニングしたもの（pRISphl/2.9k) を使用した（Mut pRISphl-Xhol) 。同様にして、フイブ口インし鎖遺伝子下流領域フラグメン卜（塩基番号 14200— 18900) を挿入するため、突然変異導入により Xbal 部位を新たに設けた。突然変異導入用プライマー（配列番号 6) はフイブ口インし鎖遺伝子ェクソン 7のストップコドン直前に Xbal部位（配列番号 6の位置 12 - 17) を設けるように設計した。錶型プラスミドには、先と同様の pRISphl/2.9k を使用した (Mut pRISphl-Xhol) 。

111型プロコラーゲン cDNAのァミノプロペプチドをコードする塩基配列内にも、上記同様の部位特異的突然変異法を用いて制限酵素 Xhol のサイ卜を導入した。突然変異導入用プライマー（配列番号 7) の塩基配列は出型プロコラーゲン cDNAの塩基番号 292から 324に対応し、制限酵素 Xhol部位（配列番号 7の位置 17-22) が揷入されている。 (3) 卜ランスファーベクターの構築

クロンテック社のバキュロウィルストランスファ一ベクター pBacPAK9 を制限酵素 Smal および EcoRI で消化し、 pCaSepR-hsp ( GeneBank 登録番号 U59056) から切り出したショウジヨウバエ HSP70プロモーターと EGFP cDNA (クロンテック）を連結した DNA フラグメント（EcoRV— EcoRI) をライゲ一シヨンした後、大腸菌 DH5aに卜ランスフォームした（pBacPAKhsEGFP) 。ラィゲ一シヨンは TaKaRa社 Ligation Kit Ver. 1を使用し、卜ランスフォーメ一ション等は定法に従い行った。

先に完成したミュータン卜プラスミド Mut pRISphl - Xholからインサー卜配列のフラグメント（EcoRV— Xhol ) を切り出し、 III型プロコラーゲン cDNA の Xhol 部位（突然変異導入にょリ搆築）に連結した。続いて PCR によって PCEP4 (インビ卜ロジェン）より増幅した SV40 polyA付加シグナル配列をコラ —ゲン cDNAの下流（Bgll部位）に挿入した。そして、完成したフイブ口イン - コラーゲン · polyA 付加シグナル配列フラグメント（ EcoRV― Bgll ) を pBacPAKhsEGFP の EcoRV—Bgll 部位に連結した。次にフイブ口インし鎖遺伝子のイン卜ロン 2の一部〜ェクソン 7の一部（塩基番号約 10000— 13100) を EcoRV部位に挿入した (pBacPAKhsEGFP- FibD 。

続いてミュータントプラスミド Mut pRISphl -Xbalからインサー卜配列のフラグメント EcoRV— Sphl 1.7kbp (塩基番号約 13100— 14800) を切り出し、 pRI/10k の Smai— Sphl (部分消化によって）部位に挿入した。完成した Mut Rl/10kから切り出した Xbal消化フラグメント（フイブ口イン遺伝子ェクソン 7 の一部およびその下流域/塩基番号約 14200—18900) を pBacPAKhsEGFP— Fib1 に挿入した（pM〇SRA-1 ：図 1 ) 。

(4) 組換えウィルスの作製

作製したターゲティングベクター pMOSRA-1 とバキュロウィルス DMAをョトゥガ培養細胞 Sf9にコ · トランスフエクシヨンすることにより組換えウィルスの作製を行った。 pMOSRA-1 0.4Mg/pl を 7 μし線状バキュロウィルス D N A

(Pharmingen) Ο. Ι μς/μΙを 1 μΙにリポフエクチン (Gibco) 4μΚ 水 4μΙを加え良く混合した後、無血清培地 SF900— II (Gibco) に置き換えた Sf9 細胞 1 χ 10⁵ cellsの上に滴下し培養した。 24時間後 10%血清入り Grace培地を 1 ml添加してさらに 3日間培養した後培養上清を回収した。

(5) 組換えウィルスのスクリーニングおよび純化

1 x 10^s個の Sf9細胞に上記のウィルス液 100μΙ を加え、 28°Cで 1時間感染させた。上清を除き、 1 %低沸点ァガロース溶液（SEAPLAQUE, FMC) を含む Grace培地 1 mlを加え固化させた。培養 3日後、生じたプラークに波長 360 nm の励起光を照射し、緑色蛍光を発しているプラーク、すなわち EGFPを発現している細胞のプラークを 10 個、寒天ごと切り出した。次にこれらのプラークから回収した組換えウィルスを再び 1 O⁶個の Sf9細胞に感染させ、細胞内の DNA を抽出し、ドットプロットを行った。プローブにはフイブ口インし鎖遺伝子を認識するプローブとプロコラーゲン cDNAを認識するプローブの 2種類を用いた。その結果、 4つのプラークに由来するウィルスクローンが陽性であった。次にこれら陽性ウィルスを 1 χ 10⁶個の Sf9 細胞に感染させ、 3日後に培養上清を回収した。培養上清中のウィルスを同様にして再び Sf9細胞に感染させ、高力価のゥィルスストックを得た。

(6) 組換えバキュロウィルスのカイコ 5齢幼虫への感染

カイコ 5齢 1 日目のメス幼虫に 50μΙ のウィルス液（5 x 10 ^s pfu) を皮下注射した。接種した幼虫が踊化してから 3〜4日目にメタノールに溶解した 20- hydroxyecdysone (2 mg/ml) を 10μ1投与した。羽化後、正常カイコガの才スと交配させ、産卵させた。

(7) F1カイコのスクリーニング

Ί頭のメスカイコが生んだ F1卵（100~300粒）を 1グループとし、各グループから約 50 粒の卵をサンプリングし、残りの卵については飼育を続けた。サンプリングした卵から定法により DNAを抽出し PCR法により外来遺伝子の有無を判定した。 PCR は、プライマーセッ卜（配列番号 8 および 9) を用いて SV40 polyA付加シグナルを検出するように、またはプライマーセット（配列番号 10 および 11 ) を用いて HSP70プロモーターを検出するように行った。

合計 1800グループの卵をスクリーニングした結果、 15グループが陽性であり、これらのグループの残りの卵を孵化させ、孵化した F1 幼虫を 5齢まで飼育した。 5齢 3日目に各幼虫より約 100μΙの体液を採取し、これらの体液から遠心操作により体液細胞を分離し、 DNA を抽出した後、 PCR 法によりスクリーニングを行つた。合計 3400 匹の 5齢幼虫をスクリーニングした結果、 8匹が陽性であった。これらのカイコは飼育を続け、羽化したカイコガを正常カイガと交配させ産卵させた。

(8) F2カイコのスクリ一二ング

F2 カイコのスクリーニングは緑色蛍光により行った。 1齢幼虫期に波長 360 nm の励起光をあて、 EG FP の緑色蛍光を発する個体、すなわちマ一カー遺伝子として挿入した EGFPを発現している個体を選別した。 8グループの F2卵をスクリーニングした結果、 2匹の陽性カイコを得ることが出来た。

(9) 組換えヒ卜コラーゲンの検出

陽性 F2 カイコを吐糸期まで飼育し、繭中のタンパク質を SDS-サンプル緩衝液（0.125M 卜リス塩酸緩衝液、 pH 6.8Z 4 % S D S /10% 2—メルカプトエタノール/ 20%グリセロール）を加えて混合し 5分間 100°Cで熱処理することにより抽出した。この試料を S D Sポリアクリルアミドゲル電気泳動（Nature 227:680-685, 1970) に供し、 Matudaira らの方法 (J. Biol. Che . 261 :10035- 10038, 1987) に準じて、泳動されたタンパク質を二卜ロセルロース膜 B A 8 5 ( S & S社）に転写した。次に、タンパク質が転写された二卜ロセルロース膜をブロッキング液（3 % BSA/50 mM トリス塩酸緩衝液 ρΗ 7.5/ 50 mM NaCI) で 4 °Cにおいて 16時間処理した後、ブロッキング液で 200倍に希釈した抗ヒ卜 Zゥシ III型コラーゲン抗体と室温で 1時間反応させた。これらの抗体が反応するタンパク質をべクタスティン ABC キット（ベクターラボラトリー社）で検出した。その結果、繭中からヒト III型コラーゲンを検出した。

実施例 2 piggyBacベクターの卵への微量注入法による

形 K転換カイコの作製 (1 ) piggyBacプラスミドベクターの作製

ヒト III型プロコラーゲン cDNA (塩基番号 92— 4550: GeneBankデータベース登録番号 X14420) を Xholで消化し塩基番号 1075-3545の領域を取り除いた後、切断末端をセルフライゲ一ションにより繋ぐことにより、ミニ川型コラーゲン cDNAを作製した。このミニコラーゲン cDNAは、ァミノプロペプチド、三重らせん領域の一部（全長コラーゲン三重らせん領域の約 1/5) 、およびカルボキシルプロペプチドをコードする塩基配列から構成されるものであり、これをもとにして、以下の 3種類のベクターを構築した。 i) pMOSRA-4B

このベクターに含まれるインサー卜 DNA 断片は、カイコ ·セリシンプロモーター、ミニコラーゲン cDNA、およびカイコ -フィプロインし鎖 polyA付加シグナルより構成される。カイコ ·セリシンプロモーター（塩基番号 1299-1622 : GeneBankデータベース登録番号 AB007831 ) を 5'末端に Bglll切断配列を付加したプライマ一（配列番号 12) およびプライマ一（配列番号 13) を用いたカイコ ·ゲノム DNA を錶型とする PCR によって単離し、これをミニコラーゲン cDNA上流に連結した。また、カイコ · フイブ口イン L鎖 polyA付加シグナル (塩基番号 14141— 14624 ： GeneBankデ一夕ベース登録番号 M76430) をプライマ一（配列番号 14) および 5'末端に Bglll切断配列を付加したプライマー（配列番号 15) を用いたカイコ ·ゲノム DNAを錶型とする PCR によって単離し、ミニコラーゲン cDNAの下流に連結した（図 2 ) 。このようにして得られたインサ一卜 DNA断片の両末端を Bglllで切断し、さらに切断末端を T4DNAポリメラーゼで平滑化した後、 Xhol で切断した後切断末端を平滑化した pPIGA3GFP ベクタ一（Nat. Biotechnol. 18: 81 -84, 2000) に挿入した。なお、 pPIGA3GFPべク夕一には、マーカーとしての EGFP cDNAとこの cDNAを発現させるためのカイコ -ァクチン（A3) プロモーターが組み込まれている。 ii) pMOSRA-5

このベクターに含まれるインサ一卜 DNA断片は、カイコ ' フイブ口イン L鎖プロモーター、カイコ ·フイブ口インし鎖シグナルペプチド cDNA、ミニコラ一ゲン CDNA、およびカイコ ·フィプロインし鎖 polyA付加シグナルより構成される。カイコ 'フイブ口インし鎖シグナルペプチド cDNA (塩基番号 28— 160 ： GeneBankデータベース登録番号 X17291 ) をプライマー（配列番号 16) および 5'末端に Xhol切断配列を組み込んだプライマー（配列番号 17) を用いたカイコ絹糸腺由来 cDNAを錶型とする PCRによって単離した。また、実施例 1 (2)に記した方法と同様にして、プロコラーゲンァミノプロペプチドをコードする領域内に Xhol 切断配列を導入し、 CDNA5'末端からこの Xhol切断部位までの領域を、フイブ口インし鎖シグナルペプチド cDNAと置換した。さらに、カイコ - フイブ口インし鎖プロモータ一（塩基番号 428— 1061 ： GeneBankデータベース登録番号 M76430) を 5'末端に Xbalおよび Bglll切断配列を付加したプライマー（配列番号 18) およびプライマー（配列番号 19) を用いたカイコ ■ゲノム DNA を錶型とする PCR によって単離した後、これをカイコ ■フイブ口インし鎖シグナルペプチド cDNAの上流に連結し、また、カイコ ·フイブ口イン L鎖 polyA付加シグナルをミニコラーゲン cDNAの下流に連結した（図 2 ) 。このようにして得られたインサー卜 DNA断片の両末端を Bglllで切断し、さらに切断末端を T4DNA ポリメラーゼで平滑化した後、 Xhol で切断した後切断末端を平滑化した pPIGA3GFPベクターに挿入した。

III) pMOSRA-6

このベクターに含まれるインサー卜 DMA断片は、カイコ ·フイブ口インし鎖プロモータ一、カイコ ■フイブ口インし鎖全長 cDNA、ミニコラーゲン cDNA、およびカイコ ·フイブ口イン L鎖 polyA付加シグナルより構成される。カイコ - フイブ口イン L鎖全長 cDNA (塩基番号 30—820 ： GeneBankデータベース登録番号 X17291 ) は、プライマー（配列番号 20) および 5'末端に Xhol切断配列を組み込んだプライマー（配列番号 21 ) を用いたカイコ絹糸腺由来 cDNA を錶型とする PCRによって単離した。次にこの cDNAを、 pMOSRA-5の場合と同様にして、ミニコラーゲン cDNA の 5'末端からァミノプロペプチド内に導入した Xhol切断部位までの領域と置換した。さらに、カイコ ·フイブ口イン L鎖 cDNA の上流にカイコ 'フイブ口インし鎖プロモータ一を、ミニコラーゲン cDNAの下流にカイコ ·フイブ口インし鎖 polyA付加シグナルを連結した（図 2 ) 。このようにして得られたインサー卜 DNA断片の両末端を Xbalで切断し、さらに切断末端を T4DNAポリメラーゼで平滑化した後、 Xholで切断した後切断末端を平滑化した pPIGA3GFPベクターに挿入した。 (2) プラスミドベクターのカイコ卵への微量注入

上記の 3種類のミニコラーゲンベクター（ pMOSRA-4B， pMOSRA-5, pMOSRA-6) を塩化セシウム超遠心法で精製した後、この 3種類のベクタ一とへルパープラスミドである pHA3PIG (Nat. Biotechnol. 18: 81 -84， 2000) を混合し、さらにエタノール沈殿を行った後、ミニコラ一ゲンベクターそれぞれの濃度が 66.7 g/mi (合計で 200 pg/ml) 、 pHA3PIGの濃度が 200 g/mlなるようにインジェクシヨンバッファ一（0.5 mMリン酸バッファー pH 7.0, 5 mM KCI) に溶解した。この DNA 溶液を、産卵後 2 ~ 8時間の前胚盤葉期のカイコ卵（カイコ胚）に、一つの卵あたり約 15~20 nlの液量で微量注入した。合計 1078個の卵に微量注入を行った。

(3) F1幼虫のスクリ一二ング

ベクター DNAを微量注入した卵を 25°Cでインキュベートしたところ 518個の卵が孵化した。孵化したカイコの飼育を続け、 413 頭の生殖可能な成虫が得られたためこれらを交配し、 213グループの F1卵塊を得た。次に、これら F1卵を孵化させ、孵化した幼虫をグループ毎に蛍光顕微鏡で観察した。その結果、 26 グループから緑色蛍光を発する幼虫を得ることができた。陽性グループに含まれる陽性カイコの数は、 1グループあたり 1 頭〜 30 頭であり、これらを合計すると 240頭であった。これら陽性 F1 カイコを飼育し野生型カイコと交配させ、さらに次の世代（F2) カイコを得た。 F2 カイコのうち約 1/2 のカイコは緑色蛍光を発しており、組み込まれた EGFPおよびミニコラーゲン遺伝子は、脱落することなく、メンデルの法則に従って次世代へ伝達されることが確認された。さらに、産卵後の F1カイコ成虫からゲノム DNAを抽出し、プライマーセット（配列番号 22および 23) を用いた PCRによりミニコラ一ゲン DNA断片を、またプライマ一セット（配列番号 24および 25) を用いた PCRにより EGFP断片を増幅したところ、緑色蛍光を発する陽性カイコからミニコラ一ゲンおよび EGFP DNA 断片を検出することができた（図 3 ) 。さらにサザンプロット解析を行い、これら外来遺伝子がカイコ ·ゲノム DNA内に組み込まれていることを確認した。

(4) ミニコラーゲン mRNAおよび組換えミニコラーゲンの検出

5齢期に達した陽性 F1 幼虫を解剖して絹糸腺を取りだし、酸グァニジンフエノールクロ口ホルム法により total RNAを抽出し、そのうちの 200 ng分の RNA を逆転写して得られた CDNAを錶型とし PCRを 94°C 1 分、 60°C 1 分、 72°C1 分の反応条件で 30 サイクル行った（RT-PCR) 。プライマーは、上記のプライマ一セット（配列番号 22および 23) を用いた。その結果、ミニコラーゲン mRNA を検出することができ、カイコ 'ゲノム DNA に組み込まれたミニコラーゲン遺伝子が、絹糸腺細胞内で発現していることが確かめられた（図 4 ) 。

次に、組換えミニコラーゲンタンパク質の検出を試みた。陽性 F1 カイコを吐糸期まで飼育し、吐き出した繭中のタンパク質を SDS-サンプル緩衝液（0.125M 卜リス塩酸緩衝液、 pH 6.8 4 0/0 503 θ% 2—メルカプトエタノール/ 20%グリセロール）を加えて混合し 5分間 100°Cで熱処理することにより抽出した。この試料を SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動（Nature 227:680-685, 1 970) に供し、 Matudairaらの方ミ去 (J . Biol. Chem. 261 :10035-1 0038, 1 987) に準じて、泳動されたタンパク質をニトロセルロース膜 BA85 (S&S社）に転写した。次に、タンパク質が転写された二卜ロセルロース膜をブロッキング液（3 0/₀ BSA/50 mM 卜リス塩酸緩衝液 PH7.5Z150 mM NaCI) で 4 °Cにおいて 16時間処理した後、ブロッキング液で 200倍に希釈した抗ヒ卜/ゥシ III型コラーゲン抗体と室温で 1 時間反応させた。これらの抗体が反応するタンパク質をべクタスティン ABC キット（ベクターラボラトリー社）で検出した。その結果、繭中から組換えミニコラーゲンタンパク質を検出することが出来た。実施例 3 カイコ 'プロリン水酸化酵素 αサブュニッ卜 cDNA

のクローニング先ず、混合プライマーを用いた degenerate PCR法によって、カイコ ·プロりン水酸化酵素 αサブュニッ卜 cDNAの部分配列をクローニングした。すでに報告されているヒ卜、ショウジヨウバエ、および線虫のプロリン水酸化酵素 αサブュニット遺伝子のアミノ酸配列を比較し、種間で保存されている領域をもとに、ァミノ酸配列から推定される塩基配列をもつ混合プライマー Ρ3 (配列番号 26) 、 Ρ5ΙΙ (配列番号 27) を設計した。なお、混合プライマー配列中、 ηは a、 c、 gまたは t、 rは aま/こは g、 yは cまたは t、 s cまたは g、 wは aまには tであることを示す。続いて PCRの錶型とするため、カイコ培養細胞である BmN4細胞とカイコ 2齢幼虫からそれぞれ total RNAを抽出した。そのうちの 200 ng分の RNAを逆転写して得られた cDNAを錶型とし PCRを 94°C 1分、 58°C 1分、 72°C 1 分の反応条件で 40サイクル行った。その結果、 BmN4細胞とカイコ 2齢幼虫ともに電気泳動で約 1 50bp の増幅産物が確認でき、その増幅産物をインビ卜ロジェン社 PCR2.1 にサブクロ一ニングし、ジデ才キシ法によって塩基配列を決定したところ、この cDNA断片は塩基配列レベル、そこから予想されるアミノ酸配列レベルともに他動物のプロリン水酸化酵素 αサブュニッ卜と高い相同性をもち、カイコ ■プロリン水酸化酵素 cDNAの部分断片であることが明らかになった。続いて、全長 cDNAをクローニングするため、得られたカイコ ·プロリン水酸化酵素 α サブュニッ卜 cDNA 断片の上流、下流を RACE (Rapid Amplification cDNA Ends)法によって単離した。 cDNA 断片の塩基配列から 5'RACE 用プライマー GSP1 (配列番号 28) 、 3'RACE用プライマー GSP2 (配列番号 29) を設計した。 RACEはクロンテック社 SMARTTM RACE cDNA Amplification Kitを使用して行った。 RACE の結果、電気泳動で、 5'領域約 1 .7kb、 3'領域約 1 .2kb の cDNA断片を確認することができた。これらの cDNA断片を上記同様にサブクロ一二ングし、その塩基配列を解析したところ、カイコ ·プロリン水酸化酵素 αサブュニッ卜をコードする配列を全て含んでいた。得られた全長 cDNAの塩基配列を配列番号〗に、この cDNAがコードするカイコ ·プロリン水酸化酵素 αサブュニッ卜のアミノ酸配列を配列番号 2に示す。

産業上の利用可能性以上詳しく説明したとおり、この出願の発明によって、組換えヒ卜，コラーゲンを繭または絹糸腺に含まれるタンパク質の一部として生産する形質転換カイコと、このカイコが生産する組換えヒ卜 ·コラーゲンが提供される。組換えヒ卜 - コラーゲンは、形質転換カイコの吐き出す繭または絹糸腺から回収するため、抽出しやすく、純度の高いコラーゲンを容易に得ることができる。また、形質転換カイコの生産する組換えヒ卜 ·コラーゲンは、ウィルスやプリオン等の病原体混入の危険が無く、またヒ卜に対して抗原性の無い安全ヒ卜 · コラーゲンであるため、医療、食品、化粧品等の様々な産業分野で利用することが可能である。

Claims

請求の範囲

1 . ヒ卜 ■コラーゲンをコードするポリヌクレオチドをゲノム DNA 内に有し、組換えヒ卜 ■コラーゲンを繭または絹糸腺内のタンパク質の一部として産生する形質転換カイコ。

2 . プロリン水酸化酵素 αサブュニッ卜および βサブュニッ卜の少なくとも一方をコードするポリヌクレオチドを、さらにゲノム DNA 内に有する請求項 1の形質転換カイコ。

3 . プロリン水酸化酵素 αサブユニットをコードするポリヌクレオチドが、配列番号 1の塩基配列を有する DNA 断片の少なくともコード領域である請求項 2 の形質転換カイコ。

4 . ヒ卜 'コラーゲンとカイコ絹タンパク質との融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドをゲノム DNA 内に有し、前記融合タンパク質を繭または絹糸腺内のタンパク質の一部として産生する形質転換カイコ。

5 . プロリン水酸化酵素 αサブュニッ卜および βサブュニッ卜の少なくとも一D 方をコードするポリヌクレオチドをさらにゲノム DNA 内に有する請求項 4の形質転換カイコ。

6 . プロリン水酸化酵素 αサブユニットをコードするポリヌクレオチドが、配列番号 1の塩基配列を有する DNA 断片の少なくともコード領域である請求項 55 の形質転換カイコ。

7 . 請求項 1 、 2または 3の形質転換カイコの繭または絹糸腺から組換えヒ卜■コラーゲンを単離、精製することを特徴とする組換えヒ卜 · コラーゲンの製造方法。

8 . 請求項 4、 5または 6の形質転換カイコの繭または絹糸腺から組換えヒ卜 · コラーゲンとカイコ絹タンパク質との融合タンパク質を単離し、この融合夕ンパク質から組換えヒ卜 · コラーゲンを分離、精製することを特徴とする組換えヒ卜■ コラーゲンの製造方法。

9 . 請求項 4、 5または 6の形質転換カイコが産生する組換えヒ卜 · コラーゲンとカイコ絹タンパク質との融合タンパク質。

1 0. ヒ卜 - コラーゲンをコードするポリヌクレオチドを有する、 Autographs ca//fo 77/ca核多角体ウィルス由来のターゲティングベクター。

1 1 . ポリヌクレオチドがヒ卜 · コラーゲン発現カセッ卜である請求項 1 0 の夕ーゲティングベクター。

1 2. ヒ卜 ·コラーゲン発現カセットが、カイコ絹タンパク質遺伝子の発現制御配列の支配下にヒ卜 ·コラーゲンをコードするポリヌクレオチドを連結した融合ポリヌクレオチドである請求項 1 1のターゲティングベクター。

D

13- ヒ卜 ·コラーゲン発現カセッ卜が、カイコ絹タンパク質遺伝子の発現制御配列の支配下に、カイコ絹タンパク質をコードするポリヌクレオチドとヒ卜 · コラーゲンをコードするポリヌクレオチドを連結した融合ポリヌクレオチドである請求項 1 1のターゲティングベクター。

5

1 4. プロリン水酸化酵素 α サブュニッ卜および β サブュニッ卜の少なくとも —方をコードするポリヌクレオチドを有する、 Autographs californica 核多角体ウィルス由来の夕ーゲティングベクター。

15. プロリン水酸化酵素 αサブュニッ卜をコードするポリヌクレオチドが、配列番号 1の塩基配列を有する DNA断片の少なくともコード領域である請求項 14 の夕ーゲティングベクター。

16. 昆虫由来 DNA型卜ランスポゾンの一対の逆向き反復配列に挟まれた領域に、ヒト ·コラーゲン発現カセッ卜を有する組換えプラスミドベクタ一。

17. ヒ卜 ·コラーゲン発現カセッ卜が、カイコ絹タンパク質遺伝子の発現制御配列の支配下にヒ卜 ·コラーゲンをコードするポリヌクレオチドを連結した融合ポリヌクレオチドである請求項 16の組換えプラスミドベクタ一。

18. ヒ卜 · コラーゲン発現カセッ卜が、カイコ絹タンパク質遺伝子の発現制御配列の支配下に、カイコ絹タンパク質をコードするポリヌクレオチドとヒ卜 ·コラーゲンをコードするポリヌクレオチドを連結した融合ポリヌクレオチドである請求項 16の組換えプラスミドベクター。

19. 昆虫由来 DNA型卜ランスポゾンの一対の逆向き反復配列に挟まれた領域に、プロリン水酸化酵素 aサブュニッ卜および βサブュニッ卜の少なくとも一方をコードするポリヌクレオチドを有する組換えプラスミドベクター。

20. プロリン水酸化酵素 aサブユニットをコードするポリヌクレオチドが、配列番号 1の塩基配列を有する DNA断片の少なくともコード領域である請求項 19 の組換えプラスミドべクタ一。

21 . 請求項 16、 17 または 18 の組換えプラスミドベクターと、トランスポゾンの卜ランスポゼ一スをコ一ドするポリヌクレオチドを有する組換えプラスミドベクタ一とからなるベクタ一セッ卜。

22. 請求項 19 または 20 の組換えプラスミドベクターと、卜ランスポゾンの卜ランスポゼースをコードするポリヌクレオチドを有する組換えプラスミドべク夕一とからなるベクターセッ卜。

23. 配列番号 2のアミノ酸配列を有するカイコ 'プロリン水酸化酵素 αサブュニッ卜をコードするポリヌクレオチド。

24. 配列番号 1の塩基配列を有する DNA 断片である請求項 23 のポリヌクレォチド。