CN100384995C

CN100384995C - 生产人胶原的转化蚕

Info

Publication number: CN100384995C
Application number: CNB018232035A
Authority: CN
Inventors: 吉里胜利; 富田正浩; 佐藤勉; 森肇; 田村俊树; 安达敬泰; 宗纲洋人
Original assignee: Japan As Represented By Director General Of Ministry Of Agriculture Forestry An; Terumo Corp; Koken Co Ltd; Hiroshima Industrial Promotion Organization; Japan Science and Technology Corp
Current assignee: Japan As Represented By Director General Of Ministry Of Agriculture Forestry An; Terumo Corp; Koken Co Ltd; Japan Science and Technology Agency; Hiroshima Industrial Promotion Organization
Priority date: 2001-04-18
Filing date: 2001-06-11
Publication date: 2008-04-30
Anticipated expiration: 2021-06-11
Also published as: WO2002086119A1; EP1391509A1; JP4701336B2; US20070083940A1; CN1516734A; EP1391509A4; CA2445011A1; JP2002315580A

Abstract

本发明提供在基因组DNA内含有编码人胶原的多核苷酸，作为茧或丝腺内蛋白质的一部分生产重组人胶原的转化蚕，利用该转化蚕制造重组人胶原的方法，以及在转化蚕制作中使用的重组载体。由于从该转化蚕吐出的茧和丝腺中可以回收人胶原，可以很简便地大量获得高纯度的胶原。另外由于转化蚕生产的重组人胶原没有病毒和朊病毒等病原体混入的危险，是对人没有抗原性的安全人胶原，所以可以在医疗、食品、化妆品等各种各样的产业中应用。

Description

生产人胶原的转化蚕

技术领域

本申请发明涉及到生产重组人胶原的转化蚕。更详细地讲本申请发明是涉及到生产重组人胶原的转化蚕和用于制作该转化蚕的重组载体、以及重组人胶原的制造方法的发明。

背景技术

胶原是构成细胞外基质的代表性蛋白质，除了具有所谓维持成为细胞的立足点的生物体结构的机械上功能以外，还具有调控细胞的增殖、分化、移动等各种各样的生理功能。因此胶原作为用于修复生物体损伤的生物材料(J.Surg.Res.10：485-491，1970)、以及作为用于使某种药剂缓慢释放的载体(J.Controlled Release 33：307-315，1995)被广泛地应用于医疗领域。然而，现在使用的大部分胶原都是来自牛和猪等动物组织的胶原，将这些胶原移植到人，大约在3％的患者中会发生过敏反应(J.Immunol.136：877-882，1986；Biomaterials 11：176-180，1990)。另外在来自动物组织的胶原中混入病毒和朊病毒等病原体的危险性成了近年来的大问题。因此期待着生产无抗原性、以及没有病原体混入危险性的重组人胶原的系统。于是，本申请的发明人发明了通过使插入了编码人胶原的cDNA的重组病毒感染昆虫细胞，制造具有与人体内胶原同样三股螺旋结构的重组人胶原的方法，申请了专利(特开平8-23979号公报)。另外利用哺乳动物细胞或酵母制造人胶原的方法也已设想出来(特表平7-501937公报)。

象上述那样，作为生产重组人胶原的方法，虽然想出了利用昆虫细胞、哺乳动物细胞、酵母的方法等，但如果利用昆虫细胞或哺乳动物细胞的方法使产量提高到在医疗领域能够利用的那样高的产量比较难。而利用酵母的方法由于重组产物产生在菌体内，重组人胶原的纯化未必容易。

本申请发明是鉴于上述那样的问题做成的发明，将消除了以往技术上的问题，提供具备高产率和纯化容易的重组人胶原生产方法以及用于该方法的基因工程材料作为课题。

发明内容

本申请的第1个发明是基因组DNA内含有编码人胶原的多核苷酸，作为蚕茧或丝腺内蛋白质的一部分生产重组人胶原的转化蚕。

本申请的第2个发明是基因组DNA内含有编码人胶原和蚕丝蛋白的融合蛋白的多核苷酸，作为蚕茧或丝腺内蛋白质的一部分生产上述融合蛋白的转化蚕。

在第1发明以及第2发明的转化蚕中包括蚕成虫、幼虫、蛹和卵。

在第1发明以及第2发明的转化蚕中最好的状态是在基因组DNA内含有编码脯氨酸羟化酶α亚基和β亚基中至少一方的多核苷酸。

本申请的第3个发明是重组人胶原的制造方法，其特征是从上述第1发明的转化蚕的茧或丝腺分离、纯化重组人胶原。

本申请的第4个发明是重组人胶原的制造方法，其特征是从上述第2发明的转化蚕的茧或丝腺分离重组人胶原和蚕丝蛋白的融合蛋白，然后从该融合蛋白中分离、纯化重组人胶原。

本申请的第5发明是上述第2发明的转化蚕生产的重组人胶原和蚕丝蛋白的融合蛋白。

本申请的第6发明是来自Autographa californica核多角体病毒的寻靶载体，该载体用于将编码人胶原的多核苷酸与蚕基因组的任意区域进行同源重组，做成生产人胶原的转化蚕。而在本申请的发明中，所谓「编码人胶原的多核苷酸」是表达胶原的人核酸分子，是人基因组DNA、由基因组DNA转录的mRNA、由mRNA合成的cDNA等。

第6发明的寻靶载体的一种模式是在编码人胶原的多核苷酸的两端具有与编码蚕丝蛋白的基因组DNA(蚕丝蛋白基因)的任意区域相同的DNA序列。该寻靶载体将编码人胶原的多核苷酸同源重组在蚕基因组的蚕丝蛋白基因(即内源性的)的表达调控序列(启动子/增强子序列)的下游。

第6发明的寻靶载体的另一种模式是在人胶原表达盒的两端具有与蚕基因组DNA的任意区域相同的DNA序列。该寻靶载体将人胶原表达盒同源重组在蚕基因组的任意区域。而所谓的「表达盒」意思是在蚕丝蛋白基因的表达调控序列的支配下连接了编码人胶原的多核苷酸的融合多核苷酸。

本申请的第7发明是用于将编码脯氨酸羟化酶α亚基和β亚基中至少一种的多核苷酸与蚕基因组的任意区域进行同源重组的来自Autographa californica核多角体病毒的寻靶载体。

本申请的第8发明是在夹在一对来自昆虫DNA型转座子的反向重复序列之间区域内含有人胶原表达盒的重组质粒载体。

本申请的第9发明是在夹在一对来自昆虫DNA型转座子的反向重复序列之间区域内含有编码脯氨酸羟化酶α亚基和β亚基中至少一种的多核苷酸的重组质粒载体。

本申请的第10发明是由上述第8发明的重组质粒载体和具有编码转座子的转座酶的多核苷酸的重组质粒载体构成的载体盒。通过该载体盒的使用，该人胶原表达盒被转移到蚕基因组，做成生产人胶原的转化蚕。

本申请的第11发明是由上述第9发明的重组质粒载体和和具有编码转座子的转座酶的多核苷酸的重组质粒载体构成的载体盒。通过使用该第11发明的载体盒和上述第10发明的载体盒做成生产脯氨酸被羟化的人胶原的转化蚕。

本申请的第12发明是编码具有序列2氨基酸序列的蚕脯氨酸羟化酶α亚基的多核苷酸，具体来说是具有序列1碱基序列的DNA片段。

另外在本申请的各个发明中，编码脯氨酸羟化酶α亚基的多核苷酸优选的形式至少是具有序列1碱基序列的DNA片段的编码区。另外作为人胶原表达盒的最好形式是在蚕丝蛋白基因的表达调控序列的支配下连接了编码人胶原的多核苷酸的融合多核苷酸，或者是在蚕丝蛋白基因的表达调控序列的支配下连接了编码蚕丝蛋白的多核苷酸和编码人胶原的多核苷酸的融合多核苷酸。

附图的简单说明

图1是转移载体pMOSRA-1的限制酶谱。

图2是整合在piggyBac质粒载体中的小胶原基因(pMOSRA-4B、pMOSRA-5、pMOSRA-6)的限制酶谱。

图3是表示以从阳性F1蚕成虫提取的基因组DNA作为模板进行PCR，其扩增产物的电泳图。1和2代表阳性蚕的号码。泳道M是100bp梯形标记(ladder maker)。

图4是表示用从阳性F1蚕5龄幼虫提取的RNA进行RT-PGR，其扩增产物的电泳图。泳道1和2中阳性蚕的RT-PCR产物电泳，泳道C中野生型蚕的RT-PCR产物电泳。泳道M是100bp梯形标记。

具体实施方式

到目前为止已知胶原中存在着从I型至XIX型的19种不同类型的胶原。这些胶原无论哪一种都是由3个亚基(α链)形成的三聚体分子，其特征是在该分子内具有3股螺旋结构。胶原中，首先合成作为前体的前胶原后，然后转换成成熟型胶原分子。例如I、II、III型胶原等纤维性胶原都是首先合成在作为本体的3股螺旋区域的氨基末端以及羧基末端具有非3股螺旋结构的氨基前肽和羧基前肽的前胶原，然后两个前肽经特异的蛋白水解酶切断后成为成熟的胶原。另外胶原在其合成过程中，要受到包括脯氨酸的羟化、赖氨酸的羟化、赖氨酸以及羟化赖氨酸的氧化(醛化)等各种各样的翻译后修饰。特别是通过脯氨酸羟化酶进行的脯氨酸的羟化对于胶原获得生理温度的稳定性上非常重要。

作为本申请发明对象的人胶原是包括从I型至XIX型胶原的所有胶原，也包括这些胶原的部分氨基酸序列。另外也包括对这些胶原的氨基酸序列的一部分进行改变后的序列以及附加了不是来自于胶原的氨基酸序列的序列。另外除了成熟的胶原外还包括作为前体的前胶原或前肽的一部分被切去后得到的胶原。另外在本申请的发明中，包括脯氨酸羟化在内的翻译后修饰不完全的，或3股螺旋结构不完全的未成熟的胶原分子也作为对象。

蚕一进入吐丝期，吐出大量丝后制作茧。这种丝的主要成分是包括丝心蛋白、P25和丝胶(蛋白)在内的丝蛋白，这些丝蛋白的合成量平均每只蚕也可以达到约0.5g那么大的量。丝蛋白在称之为丝腺的器官中合成。丝腺由后部丝腺、中部丝腺以及前部丝腺构成，在后部丝腺中特异合成分泌丝心蛋白和P25，而在中部丝腺中特异合成分泌丝胶(蛋白)。丝心蛋白是由H链和L链构成的复合物，而在该复合物中又会合了P25(J.Biol.Chem.275：40517-40528，2000)。由后部丝腺分泌的丝心蛋白和P25通过丝腺的蠕动运动慢慢地被送到中部丝腺，在那里周围被分泌的丝胶(蛋白)包被起来，再被送到前部丝腺以丝形式被吐出。因此，蚕丝腺是具有卓越的蛋白质合成能力的器官，预期在该器官使重组人胶原表达时会获得非常高的产率。另外由于丝线被排出体外、构成丝线的丝蛋白质的种类少，以及在丝蛋白中存在量最多的丝心蛋白是不溶于水溶液的，所以从蚕吐出的茧，或从丝腺内的蛋白质中回收和纯化合成的重组人胶原是非常容易的。

于蚕中的瞬时外源基因表达系统确立了利用蚕核型多角体病毒(BmNPV)作为载体的方法(特公平7-97995号公报)。然而，用该方法由于病毒的感染导致蚕致死，所以不能将外源基因传递到下一世代，有用蛋白质的表达只限于一代。因此，每次使外源基因表达都需要进行病毒接种。另外森等人开发了通过使Autographacalifornica核型多角体病毒(AcNPV)感染蚕幼虫，不使蚕致死而导入基因，在感染雌性蚕时有可能通过生殖细胞将外源基因传递到下一世代的方法(特开平6-277051号公报)。另外山尾等人在通过使整合了一部分丝心蛋白L链基因序列的AcNPV感染蚕幼虫，制作利用基因寻靶将外源基因插入到蚕基因组的丝心蛋白L链基因中的转化蚕方面获得了成功(Genes Dev.13：511-516，1999)。

另外，田村等人(Nat.Biotechnol.18：81-84，2000)在通过将整合了来自鳞翅目昆虫Trichoplusia ni的DNA型转座子piggyBac的质粒载体微量注射到蚕卵内，制作插入了外源基因的转化蚕方面获得了成功。

在通过这些方法制作的转化蚕中插入的外源基因不脱落维持在染色体内，通过世代可以永久地表达重组蛋白质。

利用本申请的发明可以将编码人胶原的多核苷酸整合到AcNPV载体，或整合到以DNA型转座子为基础制作的质粒载体中，然后利用这些载体制作将编码人胶原的多核苷酸插入到蚕基因组序列内的转化蚕。

编码人胶原的多核苷酸可以使用人胶原的基因组DNA、mRNA或由mRNA合成的cDNA等，优选是使用cDNA。以下主要就使用cDNA的情况进行说明，但本发明中使用的多核苷酸并不限于cDNA。

人胶原cDNA可以是I型至XIX型胶原中的任一种cDNA。这些cDNA的碱基序列从文献(例如，Essays Biochem.27：49-67，1992；Annu.Rev.Biochem.64：403-434，1995)报道的信息都可以获得。例如，可以通过根据这些cDNA序列制作的多核苷酸作为探针对人cDNA文库进行筛选的方法，或通过以对应于cDNA序列两端的多核苷酸作为引物，以人的基因作为模板的PCR法，或通过以从人细胞中提取的RNA作为模板的RT-PCR法都可以获得人I型～XIX型胶原的各个cDNA。

为了在蚕丝腺细胞中使人胶原cDNA表达，可以利用来自包括丝心蛋白H链、丝心蛋白L链、P25以及丝胶(蛋白)在内的丝蛋白质基因的表达调控序列(启动子和增强子)。通过利用这些丝蛋白质的启动子和增强子构建表达盒，可以使丝腺大量特异地表达重组人胶原。例如，如果利用丝心蛋白H链、丝心蛋白L链、P25的启动子和增强子，可以使人胶原在后部丝腺表达，如果利用丝胶(蛋白)的启动子和增强子可以使人胶原在中部丝腺中表达。另外人胶原表达盒由于很容易做到由丝腺细胞分泌或吐丝，所以通过制作人胶原cDNA和包括丝心蛋白H链、丝心蛋白L链、P25以及丝胶(蛋白)在内的丝蛋白cDNA的融合多核苷酸，将该融合多核苷酸整合到蚕基因组序列内也可以合成人胶原和蚕丝蛋白的融合蛋白质。此时，融合的蛋白质可以是丝蛋白的部分氨基酸序列，也可以是全长氨基酸序列。例如，若使将人胶原信号肽置换为丝蛋白信号肽的融合蛋白质合成，可以很容易做到使人胶原从丝腺细胞中分泌。另外，例如如果使丝心蛋白L链全长和人胶原的融合蛋白质合成，合成的丝心蛋白L链和人胶原的融合蛋白质通过丝心蛋白H链和二硫键形成复合物，可以更有效地被分泌。

基因导入系统是使用AcNPV载体的基因寻靶法时，通过常规方法构建将人胶原cDNA整合到AcNPV基因组DNA内的寻靶载体，然后用该载体感染蚕幼虫，通过同源重组可以将人胶原cDNA整合到蚕基因组DNA内。通过同源重组整合人胶原cDNA的部位，例如可以是包括丝心蛋白H链、丝心蛋白L链、P25以及丝胶(蛋白)在内的丝蛋白基因内，或者是丝蛋白质基因以外的任意的基因组DNA区域。

整合部位在丝蛋白质基因内时，将与该丝蛋白质基因内的两个任意区域相同的DNA序列分别连接在人胶原cDNA的前后，构建AcNPV寻靶载体。通过该寻靶载体的感染将人胶原cDNA整合到蚕内源性的表达调控序列的下游，通过内源性丝蛋白质启动子/增强子的作用由cDNA表达人胶原。另外此时为了合成人胶原cDNA和丝蛋白质的融合蛋白，也可以将人胶原cDNA整合到丝蛋白质基因内。例如，使氨基酸读码框列排在紧靠丝心蛋白L链基因第7外显子内的终止密码子的前面那样整合胶原cDNA，可以使丝心蛋白L链和人胶原的融合蛋白质合成。此时在AcNPV载体内的胶原cDNA的前后分别插入了大约0.5kb～6.0kb的与从丝心蛋白L链第7外显子开始的上游和下游的基因组DNA相同的DNA序列。

另外，在丝蛋白质基因以外的任意基因组DNA序列内对人胶原cDNA进行同源重组时，制作在人胶原cDNA的上游连接了丝蛋白基因启动子的人胶原表达盒。然后，将从对表达盒进行同源重组的蚕基因组DNA区域开始的上游以及下游的同样各0.5kb～6.0kb左右的相同DNA序列连接在表达盒的前后，将其整合到AcNPV载体，构建寻靶载体。同源重组部位无论在丝蛋白基因内时，还是在丝蛋白基因以外的任意的基因组序列时，将标记基因与人胶原cDNA一起同时整合，使在第一世代(F1)以至第二世代(F2)中选择转化蚕变得容易也是可能的。作为标记基因如GFP等荧光蛋白质基因等，而作为用于使标记基因表达的启动子可举出例如蚕肌动蛋白启动子和果蝇HSP70启动子等。

用于制作整合了人胶原cDNA的转化蚕的其他方式是利用来自昆虫的DNA型转座子的转化。已知来自piggyBac、mariner(InsectMol.Biol.9：145-155，2000)以及Minos(Insect Mol.Biol.9：277-281，2000)等昆虫DNA型转座子在蚕细胞内表现出转移活性，通过以这些DNA型转座子为基础制作的质粒载体使蚕转化是可能的。特别是以piggyBac为基础制作的质粒载体通过微量注入蚕卵实际上使蚕转化获得了成功(Nat.Biotechnol.18：81-84，2000)。利用来自昆虫的DNA型转座子时，外源基因被整合在蚕基因组内的任意序列。因此为了使整合在蚕基因组序列内的人胶原cDNA在丝腺中表达，首先必须预先制作在人胶原cDNA的上游连接了来自包含丝心蛋白H链、丝心蛋白L链、P25和丝胶(蛋白)的丝蛋白质基因的启动子和增强子的人胶原表达盒。

另外，在整合人胶原和丝蛋白的融合多核苷酸时，预先制作在该融合多核苷酸的上游连接了来自丝蛋白基因的启动子和增强子的表达盒。以下，以piggyBac为例，对其性质以及导入人胶原表达盒的方法进行说明，在本发明中使用的来自昆虫的DNA型转座子并不限定于piggyBac，也可以使用包括mariner以及Minos在内的其他的DNA型转座子。使用piggyBac以外的那些转座子时的导入人胶原表达盒的方法基本上与以下记载的使用piggyBac的方法相同。

PiggyBac是从鳞翅目昆虫Trichoplusia ni的培养细胞TN-368分离的DNA型转座子。由位于中部的转座酶ORF和存在于其两端的13bp的反向重复序列构成，长度约2.5kb。由转座酶ORF合成转座酶蛋白质，通过该酶的作用可以使夹在反向重复序列之间的区域(piggyBac自身)转移到靶序列TTAA(Virology 161：8-17，1989)。在利用这样的piggyBac的性质将人胶原表达盒插入到蚕基因组序列内时，可以利用例如与田村等人的方法(Nat.Biotechnol.18：81-84，2000)同样的方法进行。即将piggyBac的一对反向重复序列整合到适当的质粒载体，插入人胶原表达盒使其被一对反向重复序列夹着。然后将该质粒载体与piggyBac的转座子表达载体(辅助质粒)一起微量注入蚕卵中。该辅助质粒是缺失了piggyBac的反向重复序列的一方或两方，实质上是只整合了piggyBac转座子基因区域的重组质粒载体。在该辅助质粒中，用于使转座酶表达的启动子可以直接利用内源性的转座酶启动子，或者利用蚕肌动蛋白启动子或果蝇HSP70启动子等也可以。为了使下一世代蚕的筛选容易进行，可以在整合了胶原表达盒的载体内预先同时整合标记基因。此时在标记基因的上游可以整合例如蚕肌动蛋白启动子或果蝇HSP70启动子等的启动子序列，通过他们的作用使标记基因表达。

使用来自F1世代的蚕以及AcNPV载体时从F2世代的蚕选拔转化蚕例如可以使用PCR法和sorthern blot法进行。而在整合标记基因的时候，利用其表达性状进行选拔也是可能的。例如作为标记基因利用GFP等荧光蛋白质时，可以用激发光照射F1和F2世代的蚕卵或幼虫，通过检测荧光蛋白发出的荧光进行选拔。这样选拔出来的蚕是在其染色体内整合了人胶原cDNA的转化蚕。因此，在使这些蚕与野生型蚕，或转化蚕之间进行交配的子孙中也可以不消失地传递人胶原cDNA，通过世代可以生产人胶原或胶原和丝蛋白的融合蛋白质。

在生产上述的人胶原的转化蚕中，如果以在丝腺中能够表达编码脯氨酸羟化酶的多核苷酸的形态导入的话，可以在生理温度下生产完全热稳定的人胶原。导入的脯氨酸羟化酶多核苷酸(例如cDNA)可以是来自人或其他动物的多核苷酸，也可以是来自蚕的脯氨酸羟化酶多核苷酸。脯氨酸羟化酶是α亚基和β亚基的复合物，如果不形成复合物就没有酶活性。α亚基是具有催化剂活性的亚基，存在于产生原来胶原的细胞中。而β亚基是与作为催化蛋白质二硫键结构变换的酶蛋白二硫键异构酶相同的多肽，普遍存在于所有的细胞中，而且存在的量比较多。蚕丝腺细胞由于不是大量产生胶原的细胞，所以α亚基存在量很少，但β亚基存在量比较多。为了向蚕中导入脯氨酸羟化酶多核苷酸，使脯氨酸羟化酶在蚕丝腺中表达，有如上述那样利用来自人等动物的脯氨酸羟化酶多核苷酸的方法和利用蚕的脯氨酸羟化酶多核苷酸的方法。使用来自人等动物的脯氨酸羟化酶多核苷酸时，必需分别编码α亚基和β亚基的两种多核苷酸。由于昆虫的β亚基几乎不能与来自人等动物的α亚基形成活性型的复合物，所以不能只通过来自人等动物的α亚基表达使活性型的酶合成。另外，使用蚕的脯氨酸羟化酶多核苷酸时，只使用α亚基就可以。在丝腺中进行表达的α亚基是由于能够与存在量比较多的内源性β亚基形成活性型复合物的缘故。

本申请提供编码蚕的脯氨酸羟化酶α亚基(序列2)的新的多核苷酸。该多核苷酸是具有序列1碱基序列的cDNA以及从基因组DNA中分离、纯化的DNA片段以及RNA片段。基因组DNA片段和RNA片段可以通过利用根据序列1的碱基序列做成的多核苷酸等的筛选或PCR法得到。

在将编码脯氨酸羟化酶的多核苷酸导入蚕染色体内之后使酶在蚕丝腺中表达时，在丝腺中使基因表达利用可能的启动子。作为满足该条件的启动子，可以举出如含有只在丝腺中可以使基因表达的丝心蛋白、P25以及丝胶(蛋白)的丝蛋白的启动子或在任一组织都能表达的启动子-蚕肌动蛋白、果蝇HSP70启动子和AcNPV的IE1等的启动子。为了将脯氨酸羟化酶多核苷酸导入蚕染色体，可以通过与上述的为使人胶原cDNA导入的方法同样的方法，即，使用AcNPV的基因寻靶法或将以piggyBac等的DNA型转座子为基础制作的质粒载体微量注入蚕卵的方法进行。为了制作含有人基因和脯氨酸羟化酶两方的多核苷酸的蚕，可以将脯氨酸羟化酶多核苷酸导入含有人胶原多核苷酸的转化蚕中，反之也可以将人胶原多核苷酸导入含有脯氨酸羟化酶多核苷酸的转化蚕中。或者分别制作只含有人胶原多核苷酸的转化蚕和含有脯氨酸羟化酶多核苷酸的转化蚕，通过使他们交配，选择含有两方的多核苷酸的转化蚕也可以。另外通过AcNPV载体分别导入两方的多核苷酸，或者通过DNA转座子载体分别导入两方的多核苷酸，利用AcNPV寻靶载体导入人胶原多核苷酸，利用DNA转座子型的质粒载体导入脯氨酸羟化酶多核苷酸也可以，或者反向操作也可以。

含有人胶原cDNA的转化蚕一达到5龄期(fifth-instarstage)，同时合成内源性丝蛋白和人胶原，作为蚕丝的一部分将人胶原分泌到茧中。茧中的人胶原例如可以通过0.5M醋酸很简单地提取。另外，例如合成人胶原与蚕丝心蛋白L链的融合蛋白时，通过使之变成还原状态，切断融合蛋白质和丝心蛋白H链之间的二硫键可以提取。另外茧中含有的人胶原是纤维性的胶原，在只对三股螺旋区域部分(atelo collager)进行纯化时，用胰蛋白酶等蛋白分解酶对茧中的蛋白质进行处理。通过该操作可以提取没有被蛋白分解酶消化的atelo collagen，而且由于其他许多蛋白质都是受到胰蛋白酶的消化，可以使以后的纯化容易进行。另外用与蚕茧的情况同样的方法也可以从转化蚕的丝腺提取、纯化人胶原。通过解剖蚕可以很简单地对丝腺进行分离，由于含有的蛋白质几乎都是丝蛋白质，可以象蚕茧那样很容易地提取、纯化人胶原。

实施例

以下列举涉及到人III型胶原的制造方法的实施例对申请的发明进行更具体的说明，但该申请发明并不限定于这些实施例。

实施例1

通过使用AcNPV载体的基因寻靶法制作转化蚕

编码人III型前胶原的cDNA根据以本申请的发明人克隆的cDNA(特开平8-23979号公报：GeneBank数据库登录号X14420)为基础，而蚕丝心蛋白L链基因以及其下游的蚕基因组DNA序列以已知的蚕丝心蛋白L链基因的碱基序列(Gene 100：151-158，1992：GeneBank数据库登录号M76430)为基础按照以下方法进行分离。

在以下记载中，人III型前胶原的cDNA以及蚕丝心蛋白L链基因的碱基编号是依据上述GeneBank数据库记载的碱基编号。

(1)蚕丝心蛋白L链基因以及其下游的蚕基因组DNA序列的分离

利用PCR法对丝心蛋白L链内含子6内的基因片段进行扩增。PCR引物使用依据上述数据库的序列合成的多核苷酸(序列3和序列4)，模板使用蚕tokai x asahistrain的基因组DNA。然后用得到的DNA片段作为探针，按照常规方法对通过λEMBL3构建的蚕kinshux showa strain基因组文库进行筛选。结果得到从丝心蛋白L链基因的第9600位碱基开始的下游含有约15kb区域的蚕基因组DNA片段(pRI/10k)。

(2)通过部位特异的突变导入制作限制酶识别序列

为了在蚕丝心蛋白L链基因外显子7内连上III型前胶原cDNA，通过部位特异的突变导入，在丝心蛋白基因中设置新的限制酶切位点。突变导入使用clontech公司的Mutagenests Kit。突变导入用引物(序列5)设计为在紧靠蚕丝心蛋白L链基因外显子7的终止密码的前面设置限制酶XhoI位点(序列5的位置8-12)。对于模板质粒，是使用了将来自pRI/10k的EcoRI-SphI片段(碱基序列12000-14800)亚克隆到pUC18后产物(pRISphI/2.9k)的(MutpRISphI-XhoI)。同样，为了插入蚕丝心蛋白L链基因下游区片段(碱基序列14200-18900)，通过突变导入新设置XbaI位点。突变导入用引物(序列6)设计为在紧靠蚕丝心蛋白L链基因外显子7的终止密码的前面设置XbaI位点(序列6的位置12-17)。对于模板质粒，是使用了与前面同样的pRISphI/2.9k的(Mut pRISphI-XhoI)。

在编码III型前胶原cDNA的氨基前肽的碱基序列内也利用上述同样的部位特异的突变法导入限制酶XhoI的位点。突变导入用引物(序列7)的碱基序列对应于III型前胶原cDNA的292至324号碱基序列，插入限制酶XhoI位点(序列7的位置17-22)。

(3)转移载体的构建

用限制酶SmaI和EcoRI消化Clontech公司的泡病毒转移载体pBacPAK9，接着与从pCaSepR-hsp(GeneBank登录号U59056)切出的果蝇HSP70启动子和连接了EGFP cDNA(Clontech)的DNA片段(EcoRV-EcoRI)进行连接，然后转化大肠杆菌DH5α(pBacPAKhsEGFP)。连接使用TaKaRa公司的Ligation KitVer.1，转化等按照常规方法进行。

从先前完成的突变体质粒Mut pRISphI-XhoI切出插入序列的片段(EcoRV-XhoI)，与III型前胶原cDNA的XhoI位点(通过突变导入构建)连接。然后将通过PCR由pCEP4(Invitrogen公司)扩增的附加SV40 polyA的信号序列插入到胶原cDNA的下游(BgII位点)。然后将完成的丝心蛋白·胶原·附加polyA信号序列片段(EcoRV-BgII)连接到pBacPAKhsEGFP的EcoRV-BgII位点。接下来将丝心蛋白L链基因的内含子2的一部分～外显子7的一部分(碱基序号约10000-13100)插入到EcoRV部位(pBacPAKhsEGFP-Fib1)。

接下来从突变体质粒Mut pRISphI-XbaI切出插入序列的片段EcoRV-SphI 1.7kbp(碱基序号约13100-14800)，插入到pRI/10k的SmaI-SphI(经部分消化)位点。将从完成的Mut RI/10k切出的XbaI消化片段(丝心蛋白基因外显子7的一部分和其下游区/碱基序号约14200-18900)插入到pBacPAKhsEGFP-Fib1(pMOSRA-1：图1)。

(4)重组病毒的制作

通过制作的寻靶载体-pMOSRA-1和泡病毒DNA共转化甘蓝夜蛾培养细胞Sf9，制作重组病毒。向7μl的0.4μg/μl pMOSRA-1、1μl的0.1μg/μl线状泡病毒DNA(Pharmingen)中加入4μl脂(质)转染试剂(Gibco)、4μl水后充分混合，然后滴到置换成无血清培养基SF900-II(Gibco)的1×10⁶个Sf9细胞的上面，进行培养。24小时后添加1ml的加入了10％血清的Grace’s培养基，再培养3天后回收培养上清。

(5)重组病毒的筛选和纯化

将上述病毒液100μl加入到1×10⁶个Sf9细胞中，于28℃下感染1小时。除去上清，加入含有1％低沸点琼脂糖溶液(SEAPLAQUE，FMC)的Grace培养基1ml使其固化。培养3天后，用波长360nm的激发光照射生成的噬斑，将10个发出绿色荧光的噬斑，即表达EGFP的细胞的噬斑分别从琼脂中切出。然后将从这些噬斑中回收的重组病毒再次感染1×10⁶个Sf9细胞，提取细胞内的DNA，进行斑点印迹。探针使用识别丝心蛋白L链基因的探针和识别前胶原cDNA的探针这2种。结果，来自4个噬斑的病毒克隆为阳性。然后使这些阳性病毒感染1×10⁶个Sf9细胞，3日后回收培养上清。同样再用培养上清中的病毒感染Sf9细胞，得到高效价的病毒贮存液。

(6)重组泡病毒对5龄蚕幼虫的感染

向5龄蚕第1天的雌幼虫皮下注射50μl的病毒液(5×10⁶pfu)。接种的幼虫于蛹化后第3～4天给予10μl溶解于甲醇的20-hydroxyecdysone(2mg/ml)。羽化后，与正常雄性蚕蛾交配，使其产卵。

(7)F1蚕的筛选

将一只雌性蚕产的F1卵(100～300粒)作为1组，从各个组取出约50卵粒作为样品，剩下的卵继续饲养。按照常规方法从样品卵中提取DNA，通过PCR法判定有无外源基因。PCR使用引物组(序列8和9)，用于检测附加SV40polyA信号肽，或使用引物组(序列10和11)用于检测HSP70启动子。

对总计1800组的卵进行筛选，结果有15组为阳性。使这些组的剩下的卵孵化，将孵化的F1幼虫饲养到5龄。从处于5龄第3天的各个幼虫采取100μl的体液，通过离心操作从这些体液中分离体液细胞，提取DNA后利用PCR法进行筛选。对总计3400只5龄幼虫进行筛选，结果8只为阳性。这些蚕继续饲养，使羽化后的蚕蛾与正常蚕蛾交配，使其产卵。

(8)F2蚕的筛选

F2蚕的筛选通过绿色荧光进行。对于1龄幼虫期照射波长360nm的激发光，选择发出EGFP绿色荧光的个体，即选择表达作为标记基因插入的EGFP的个体。对8组F2卵进行筛选，结果可以得到2只阳性蚕。

(9)重组人胶原的检测

将阳性F2蚕饲养到吐丝期，将他们加到SDS-样品缓冲液(0.125M Tris-HCl缓冲液pH6.8/4％SDS/10％2-巯基乙醇/20％甘油)中，混合后通过于100℃下的5分钟热处理提取蚕茧中的蛋白质。将该样品进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(Nature 227：680-685，1970)，按照Matudaira等人的方法(J.Biol.Chem.261：10035-10038，1987)将电泳后的蛋白质转移到硝酸纤维素膜BA85(S&S公司)上。然后将转移有蛋白质的硝酸纤维素膜用封闭液(3％BSA/50mMTris-HCl缓冲液pH7.5/150mM NaCl)于4℃下处理16小时后，与用封闭液稀释了200倍的抗人/牛III型胶原抗体于室温下反应1小时。用VECTASTAIN ABC试剂盒(Vectorlaboratory公司)检测这些抗体进行反应的蛋白质。结果从茧中检测出人III型胶原。

实施例2

通过向卵微量注入piggyBac载体的方法制作转化蚕

(1)piggyBac质粒载体的制作

将人III型前胶原cDNA(碱基序号92-4550：GeneBank数据库登录号X14420)用XhoI消化，去除碱基编号为1075-3545的碱基序列区后，通过自连接将切断的末端连上，制作小III型胶原cDNA。该小III型胶原cDNA是由氨基前肽、三重螺旋区的一部分(大约为全长胶原三股螺旋区的1/5)以及编码羧基前肽的碱基序列构成的，以此为基础构建以下3种载体。

i)pMOSRA-4B

该载体含有的插入DNA片段由蚕丝胶(蛋白)启动子、小胶原cDNA以及蚕丝心蛋白L链附加polyA信号肽构成。通过使用5’末端附加BgIII切断序列的引物(序列12)和引物(序列13)的蚕基因组DNA作为模板的PCR分离蚕丝胶(蛋白)启动子(碱基编号1299-1622：GeneBank数据库登录号AB007831)，将他连接在小胶原cDNA上游。另外通过引物(序列14)和5’末端附加BgIII切断序列的引物(序列15)的蚕基因组DNA作为模板的PCR分离蚕丝心蛋白L链附加polyA信号肽(碱基编号为14141-14624的碱基序列；GeneBank数据库登录号M76430)，将他连接在小胶原cDNA下游(图2)。用BgIII将这样得到的插入DNA片段的两个末端切断，再用T4DNA聚合酶将切断的末端平末端化，然后插入到用XhoI切断后的切断末端平滑后的pPIGA3GFP载体(Nat.Biotechnol.18：81-84，2000)。另外在pPIGA3GFP载体中整合作为标记的EGFPcDNA和为使该cDNA表达的蚕肌动蛋白(A3)启动子。

ii)pMOSRA-5

该载体含有的插入DNA片段由蚕丝心蛋白L链启动子、蚕丝心蛋白L链信号肽cDNA、小胶原cDNA、以及蚕丝心蛋白L链附加polyA信号肽构成。通过使用引物(序列16)和5’末端整合了XhoI切断序列的引物(序列17)的以蚕丝腺cDNA作为模板的PCR分离蚕丝心蛋白L链信号肽cDNA(碱基编号为28-160的碱基序列；GeneBank数据库登录号X17291)。另外使用与实施例1(2)记载的同样方法将XhoI切断序列导入编码前胶原氨基前肽的区域内，另外将从cDNA5’末端开始到该XhoI切断部位的区域置换为丝心蛋白L链信号肽cDNA。再通过使用5’末端附加XbaI和BgIII切断序列的引物(序列18)和引物(序列19)的以蚕基因组DNA作为模板的PCR分离蚕丝心蛋白L链启动子(碱基号为428-1061的碱基序列；GeneBank数据库登录号M76430)，然后将他连接在蚕丝心蛋白L链信号肽cDNA的上游，而将蚕丝心蛋白L链附加polyA信号肽连接在小胶原cDNA的下游(图2)。用BgIII将上述得到的插入DNA片段的两个末端切断，再用T4DNA聚合酶将切断的末端平末端化，插入到用XhoI切断后的切断末端平滑后的pPIGA3GFP载体。

iii)pMOSRA-6

该载体含有的插入DNA片段由蚕丝心蛋白L链启动子、蚕丝心蛋白L链全长cDNA、小胶原cDNA以及蚕丝心蛋白L链附加polyA信号肽构成。通过使用引物(序列20)和5’末端整合了XhoI切断序列的引物(序列21)的以蚕丝腺cDNA作为模板的PCR分离蚕丝心蛋白L链全长cDNA(碱基编号30-820：Gene Bank数据库登录号X17291)，然后将该cDNA如pMOSRA-5那样置换成从小胶原cDNA5’末端开始直至导入到氨基前肽内的XhoI切断部位的区域。将位于蚕丝心蛋白L链cDNA的上游的蚕丝心蛋白L链启动子与位于小胶原cDNA下游的蚕丝心蛋白L链附加polyA信号肽连接(图2)。用XbaI将这样得到的插入DNA片段的两个末端切断，再用T4DNA聚合酶将切断的末端平末端化，插入到用XhoI切断后的切断末端平滑后的pPIGA3GFP载体。

(2)向蚕卵微量注入质粒载体

用氯化铯超离心法对上述3种小胶原载体(pMOSRA-4B、pMOSRA-5、pMOSRA-6)进行纯化后，将该3种载体与辅助质粒pHA3PIG(Nat.Biotechnol.18：81-84，2000)混合，再进行乙醇沉淀后，溶解于注入缓冲液(0.5mM磷酸缓冲液pH7.0，5mM KCl)中，使小胶原载体的各个浓度为66.7μg/ml(合计200μg/ml)，pHA3PIG的浓度为200μg/ml。将该DNA溶液微量注入产卵后2～8小时的前胚盘叶期的蚕卵(蚕胚)，注入的溶液量为每只卵约15～20nl。对总计1078个卵进行了微量注入。

(3)F1幼蚕的筛选

将微量注入了载体DNA的卵于25℃下进行温育，结果有518个卵孵化。对孵化的卵继续进行饲养，得到了413只可能有生殖能力的成虫，对他们进行交配，得到213组的F1卵块。然后使这些F1卵块孵化，用萤光显微镜对每一组孵化的幼虫进行观察。结果可以从26组中得到发绿色荧光的幼虫。阳性组中含有的阳性蚕数相当于每1组为1头～30头，总计为240头。对这些阳性F1蚕进行饲养，使他们与野生型蚕进行交配，可以得到下一世代(F2)蚕。在F2蚕当中约有1/2的蚕发绿色荧光，整合的EGFP和小胶原基因没有脱落，根据孟德尔法则可以确认已经传递到下一世代。另外从产卵后的F1蚕成虫提取基因组DNA，通过使用引物组(序列22和23)的PCR扩增小胶原DNA片段，或通过使用引物组(序列24和25)的PCR扩增EGFP，结果可以从发绿色荧光的阳性蚕中检测小胶原以及EGFP DNA片段(图3)。另外进行sorthern blot解析，可以确认这些外源基因已经整合到了蚕基因组DNA中。

(4)小胶原mRNA和重组小胶原的检测

对达到5龄期的阳性F1幼虫进行解剖，取出丝腺，利用盐酸胍酚氯仿法提取总RNA，以对其中的200ng的RNA进行逆转录得到的cDNA作为模板，进行30循环的PCR(RT-PCR)，反应条件为94℃1分钟，60℃1分钟，72℃1分钟。引物使用上述引物组(序列号22和23)结果可以检测到小胶原mRNA，证实整合到蚕基因组DNA的小胶原基因在丝腺细胞内进行了表达(图4)。

以下尝试对重组小胶原蛋白质进行检测。将阳性F1蚕饲养到吐丝期，加SDS-样品缓冲液(0.125M Tris-HCl缓冲液pH6.8/4％SDS/10％2-巯基乙醇/20％甘油)，混合后通过100℃下的5分钟热处理提取吐出的茧中的蛋白质。将该样品进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(Nature 227：680-685，1970)，按照Matudaira等人的方法(J.Biol.Chem.261：10035-10038，1987)将电泳后的蛋白质转移到硝酸纤维素膜BA85(S&S公司)上。然后将转移有蛋白质的硝酸纤维素膜用封闭液(3％BSA/50mMTris-HCl缓冲液pH7.5/150mMNaCl)于4℃下处理16小时后，与用封闭液稀释了200倍的抗人/牛III型胶原抗体于室温下反应1小时。用VECTASTAIN ABC试剂盒(Vector laboratory公司)检测这些抗体进行反应的蛋白质。结果从茧中可以检测出重组小胶原蛋白质。

实施例3

蚕脯氨酸羟化酶α亚基cDNA的克隆

首先通过使用混合引物的简并PCR法对蚕脯氨酸羟化酶α亚基cDNA的部分序列进行克隆。对已经报道的人、果蝇以及线虫的脯氨酸羟化酶α亚基基因的氨基酸序列进行比较，以种间保守区为基础，设计具有由氨基酸序列推定的碱基序列的混合引物P3(序列26)、P5II(序列27)。而在混合引物序列中，n表示a、c、g或t，r表示a或g，y表示c或t，s表示c或g，w表示a或t。接下来为了制作PCR的模板，从蚕培养细胞BmN4细胞和蚕2龄幼虫分别提取总RNA。以对其中的200ng的RNA进行逆转录得到的cDNA作为模板，进行40循环的PCR，反应条件为94℃1分钟，58℃1分钟，72℃1分钟。结果无论BmN4细胞还是蚕2龄幼虫都能通过电泳可以确认约150bp的扩增产物，将该扩增产物亚克隆到Invitrogen公司的pCR2.1中，利用双脱氧法确定碱基序列，结果该cDNA片段无论是在碱基序列水平，还是在由碱基序列推测的氨基酸序列水平与其他动物的脯氨酸羟化酶α亚基都有很高的同源性，显然是蚕脯氨酸羟化酶cDNA的部分片段。

接下来，为了对全长cDNA进行克隆，利用RACE(RapidAmplification cDNA Ends)法对得到的蚕脯氨酸羟化酶α亚基cDNA片段的上游、下游进行分离。由cDNA片段的碱基序列设计5’RACE用引物GSP1(序列28)、3’RACE用引物GSP2(序列29)。RACE使用clontech公司SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit进行。RACE的结果通过电泳可以确认5’区约1.7kb、3’区约1.2kb的cDNA片段。将这些cDNA片段象上述那样进行亚克隆，对其碱基序列进行解析，结果含有全部编码蚕脯氨酸羟化酶α亚基的序列。得到的全长cDNA碱基序列如序列1所示，该cDNA编码的蚕脯氨酸羟化酶α亚基的氨基酸序列如序列2所示。

就象上述详细说明的那样，通过本申请的发明可以提供作为茧或丝腺内所含蛋白质的一部分生产重组人胶原的转化蚕，该蚕生产的重组人胶原。重组人胶原由于从转化蚕吐出的茧或丝腺中回收，容易提取，所以可以容易地得到纯度高的胶原。另外转化蚕生产的重组人胶原没有病毒和朊病毒等病原体混入的危险，另外由于是对人没有抗原性的安全人胶原，所以可以在医疗、食品、化妆品等各种各样的产业中利用。

序列表

<110>科学技术振兴集团；

财团法人广岛产业振兴机构；

泰尔茂株式会社；

株式会社高研；和

独立行政法人农业生物资源研究所

<120>生产人胶原的转化蚕

<130>01-F-027PCT

<140>PCT/JP01/04906

<141>2001-06-11

<150>JP2000-361563

<151>2000-11-28

<160>29

<170>PatentIn Ver.2.1

<210>1

<211>2483

<212> DNA

<213>家蚕

<220>

<221>CDS

<222>(228)..(1880)

<400>1

tacgcggggg aaccgaccga cgtcgggctg cgtggacgca cgtatctttg ccagattgtc 60

gctttattta acgtttataa ttgtgaattg attgcaattc aatttgtggt gaatgaggtt 120

aaactgcaat acgtttttct aataatcctt aatgatgtac gtttgtctgt aaaacaattt 180

gctgatctgc aagttctaga atcgttttca tatttatttc tgcaaaa atg gaa aca 236

Met Glu Thr

1

gta aga gcg ata gct ttt ttg ctt ctg ttt ttc ttt act tgg gcc aaa 284

Val Arg Ala Ile Ala Phe Leu Leu Leu Phe Phe Phe Thr Trp Ala Lys

5 10 15

gca gag cta ttc aca gcc ata acg gat gtt gaa ccg cta ctg gaa acc 332

Ala Glu Leu Phe Thr Ala Ile Thr Asp Val Glu Pro Leu Leu Glu Thr

20 25 30 35

cac aag agg atc ata gac gat tta gat gat tac ctg caa aaa gaa gag 380

His Lys Arg Ile Ile Asp Asp Leu Asp Asp Tyr Leu Gln Lys Glu Glu

40 45 50

agg aga ctt ttc act ttg aag aaa cac ttg aat tta tat aaa agg gaa 428

Arg Arg Leu Phe Thr Leu Lys Lys His Leu Asn Leu Tyr Lys Arg Glu

55 60 65

cac gaa agg gct atg gat gac atc cct aac tac ctc ggc aac ccg atc 476

His Glu Arg Ala Met Asp Asp Ile Pro Asn Tyr Leu Gly Asn Pro Ile

70 75 80

aat gct ttc acg ttg ata aaa aga tta acg gcc gac ctt gat ttt ata 524

Asn Ala Phe Thr Leu Ile Lys Arg Leu Thr Ala Asp Leu Asp Phe Ile

85 90 95

gag gat agc att aaa att gga aca gaa tac ata aag aac gtc aca atg 572

Glu Asp Ser Ile Lys Ile Gly Thr Glu Tyr Ile Lys Asn Val Thr Met

100 105 110 115

aac cac gtg gac gtg aaa tat ccg tca ttg gaa gat ctg acg gga gca 620

Asn His Val Asp Val Lys Tyr Pro Ser Leu Glu Asp Leu Thr Gly Ala

120 125 130

gct cag gcg ctg act cgg ttg cag gaa acc tac tat tta aat gta cac 668

Ala Gln Ala Leu Thr Arg Leu Gln Glu Thr Tyr Tyr Leu Asn Val His

135 140 145

gat cta gcc gag ggt ata ttg aat gga gtt tca tac agt act cct atg 716

Asp Leu Ala Glu Gly Ile Leu Asn Gly Val Ser Tyr Ser Thr Pro Met

150 155 160

acg gcg agc gat tgt tac gaa ctc ggc cgg act cta tac aac gat aaa 764

Thr Ala Ser Asp Cys Tyr Glu Leu Gly Arg Thr Leu Tyr Asn Asp Lys

165 170 175

gat tac aca aac gcc ttg gcc tgg atg aaa gaa gcg cta agg aaa tat 812

Asp Tyr Thr Asn Ala Leu Ala Trp Met Lys Glu Ala Leu Arg Lys Tyr

180 185 190 195

aaa gat gaa aac gtc atg tac ccg ttc acc gaa gtc gat atc ttg gaa 860

Lys Asp Glu Asn Val Met Tyr Pro Phe Thr Glu Val Asp Ile Leu Glu

200 205 210

tat ata gga ttc gca tat tat tta aac gga gac gtc aaa acc gct ctg 908

Tyr Ile Gly Phe Ala Tyr Tyr Leu Asn Gly Asp Val Lys Thr Ala Leu

215 220 225

gaa tgg act cag aga ctt ctg tcc gtc gat ccg aag cac gta cga gcg 956

Glu Trp Thr Gln Arg Leu Leu Ser Val Asp Pro Lys His Val Arg Ala

230 235 240

cgg ggc aac ata ccg cac tat cag aag acg ata gcc gaa caa gag gcc 1004

Arg Gly Asn Ile Pro His Tyr Gln Lys Thr Ile Ala Glu Gln Glu Ala

245 250 255

gaa tta aag aag caa caa cgt ggg gaa acc tcg gat gag cct gaa gaa 1052

Glu Leu Lys Lys Gln Gln Arg Gly Glu Thr Ser Asp Glu Pro Glu Glu

260 265 270 275

gaa gat ggt caa gat tac gaa tta tca gag tac gca aag gaa cgc aaa 1100

Glu Asp Gly Gln Asp Tyr Glu Leu Ser Glu Tyr Ala Lys Glu Arg Lys

280 285 290

gtt tac gaa tcg ctg tgt cgg gga gaa atg gaa ata ccc cat gag att 1148

Val Tyr Glu Ser Leu Cys Arg Gly Glu Met Glu Ile Pro His Glu Ile

295 300 305

act aag agg ttg aaa tgt tgg tac gtc acc gac acg cat ccg ttt tta 1196

Thr Lys Arg Leu Lys Cys Trp Tyr Val Thr Asp Thr His Pro Phe Leu

310 315 320

aag ttg gcc cca atc aaa gtg gag cag atg tac gtg aag ccc gac ata 1244

Lys Leu Ala Pro Ile Lys Val Glu Gln Met Tyr Val Lys Pro Asp Ile

325 330 335

ttt atg ttc cac gaa gtg atg acc gac gac gag att gag ttc atc aaa 1292

Phe Met Phe His Glu Val Met Thr Asp Asp Glu Ile Glu Phe Ile Lys

340 345 350 355

aaa cga gca aag ccg agg ttc aaa cgg gct gtc gtt cac gac cct aaa 1340

Lys Arg Ala Lys Pro Arg Phe Lys Arg Ala Val Val His Asp Pro Lys

360 365 370

act ggt gag ctg aca ccg gcc cat tac cgc atc agc aag tcg tcg tgg 1388

Thr Gly Glu Leu Thr Pro Ala His Tyr Arg Ile Ser Lys Ser Ser Trp

375 380 385

ctc cgc gac gag gag tct ccg gtc ata gcg cgc atc acg cag cgc gtc 1436

Leu Arg Asp Glu Glu Ser Pro Val Ile Ala Arg Ile Thr Gln Arg Val

390 395 400

acc gac atg acc ggg ctc agc atg ctg cac gcc gag gag ctt cag gtc 1484

Thr Asp Met Thr Gly Leu Ser Met Leu His Ala Glu Glu Leu Gln Val

405 410 415

gtc aac tac ggc ata ggg gga cac tac gaa ccg cac ttc gac ttc gct 1532

Val Asn Tyr Gly Ile Gly Gly His Tyr Glu Pro His Phe Asp Phe Ala

420 425 430 435

agg aaa cgt gag aat cca ttc acg aaa ttc ggc ggc aac aga ata gcc 1580

Arg Lys Arg Glu Asn Pro Phe Thr Lys Phe Gly Gly Asn Arg Ile Ala

440 445 450

acc gtc ctc ttc tac atg tct gac gtg gcg cag ggc ggc gct aca gtg 1628

Thr Val Leu Phe Tyr Met Ser Asp Val Ala Gln Gly Gly Ala Thr Val

455 460 465

ttc acc gaa ctt gga ctc agt ttg ttt cca ata aaa cga gct gcg gcg 1676

Phe Thr Glu Leu Gly Leu Ser Leu Phe Pro Ile Lys Arg Ala Ala Ala

470 475 480

ttc tgg ttg aac ctg cac gcg tcg ggc gaa gga gac ctc gcc acc agg 1724

Phe Trp Leu Asn Leu His Ala Ser Gly Glu Gly Asp Leu Ala Thr Arg

485 490 495

cat gcc gcc tgc ccc gtg ctc agg gga tcc aag tgg gtg tca aat aaa 1772

His Ala Ala Cys Pro Val Leu Arg Gly Ser Lys Trp Val Ser Asn Lys

500 505 510 515

tgg ata cat caa ggc ggg caa gag ctg ttg agg ccc tgc gac ctt gag 1820

Trp Ile His Gln Gly Gly Gln Glu Leu Leu Arg Pro Cys Asp Leu Glu

520 525 530

tac cag gag gag ggc atc atc cgc aag att cct cgt cca gtg ccg aag 1868

Tyr Gln Glu Glu Gly Ile Ile Arg Lys Ile Pro Arg Pro Val Pro Lys

535 540 545

aca tcc agg tag actccgagca acgtgtgacc gaacggaact gatcataaat 1920

Thr Ser Arg

550

tgttcggtat agtgcatttt ttttttaaat aaaatagatt aaatattaca tagtataata 1980

gaatgttggg tctgtgtagt acacgtattc gacttctgtg tctcgtgcga ttttacgaat 2040

aaccacaagc ataatcgact agaatgcata atttttaatt agttatgggt caagaaagaa 2100

gattctcatt atgaaagacg ccaagaaaat tacgccaact aacttttagg agatgtttta 2160

aataaccaat aatttgagtg caatttatac tatactttta atatatttat taaattgttc 2220

caatttcttt actttcccct atttagaacg tatagtttaa gttaacgttg atttgtttga 2280

ttgtaaaata ttaacagtaa actcacacca ggcacacaca aaaaaccatc tattgttgcg 2340

aacaaattca caaataaaca tatctaataa aaaaaaatgt taaataataa ataagttgca 2400

atgaaacact aatatatttt aacatattat atattatagt gatatcttag aataaaccat 2460

cgtggctcga tggctcgtgg cta 2483

<210>2

<211>550

<212>PRT

<213>家蚕

<400>2

Met Glu Thr Val Arg Ala Ile Ala Phe Leu Leu Leu Phe Phe Phe Thr

1 5 10 15

Trp Ala Lys Ala Glu Leu Phe Thr Ala Ile Thr Asp Val Glu Pro Leu

20 25 30

Leu Glu Thr His Lys Arg Ile Ile Asp Asp Leu Asp Asp Tyr Leu Gln

35 40 45

Lys Glu Glu Arg Arg Leu Phe Thr Leu Lys Lys His Leu Asn Leu Tyr

50 55 60

Lys Arg Glu His Glu Arg Ala Met Asp Asp Ile Pro Asn Tyr Leu Gly

65 70 75 80

Asn Pro Ile Asn Ala Phe Thr Leu Ile Lys Arg Leu Thr Ala Asp Leu

85 90 95

Asp Phe Ile Glu Asp Ser Ile Lys Ile Gly Thr Glu Tyr Ile Lys Asn

100 105 110

Val Thr Met Asn His Val Asp Val Lys Tyr Pro Ser Leu Glu Asp Leu

115 120 125

Thr Gly Ala Ala Gln Ala Leu Thr Arg Leu Gln Glu Thr Tyr Tyr Leu

130 135 140

Asn Val His Asp Leu Ala Glu Gly Ile Leu Asn Gly Val Ser Tyr Ser

145 150 155 160

Thr Pro Met Thr Ala Ser Asp Cys Tyr Glu Leu Gly Arg Thr Leu Tyr

165 170 175

Asn Asp Lys Asp Tyr Thr Asn Ala Leu Ala Trp Met Lys Glu Ala Leu

180 185 190

Arg Lys Tyr Lys Asp Glu Asn Val Met Tyr Pro Phe Thr Glu Val Asp

195 200 205

Ile Leu Glu Tyr Ile Gly Phe Ala Tyr Tyr Leu Asn Gly Asp Val Lys

210 215 220

Thr Ala Leu Glu Trp Thr Gln Arg Leu Leu Ser Val Asp Pro Lys His

225 230 235 240

Val Arg Ala Arg Gly Asn Ile Pro His Tyr Gln Lys Thr Ile Ala Glu

245 250 255

Gln Glu Ala Glu Leu Lys Lys Gln Gln Arg Gly Glu Thr Ser Asp Glu

260 265 270

Pro Glu Glu Glu Asp Gly Gln Asp Tyr Glu Leu Ser Glu Tyr Ala Lys

275 280 285

Glu Arg Lys Val Tyr Glu Ser Leu Cys Arg Gly Glu Met Glu Ile Pro

290 295 300

His Glu Ile Thr Lys Arg Leu Lys Cys Trp Tyr Val Thr Asp Thr His

305 310 315 320

Pro Phe Leu Lys Leu Ala Pro Ile Lys Val Glu Gln Met Tyr Val Lys

325 330 335

Pro Asp Ile Phe Met Phe His Glu Val Met Thr Asp Asp Glu Ile Glu

340 345 350

Phe Ile Lys Lys Arg Ala Lys Pro Arg Phe Lys Arg Ala Val Val His

355 360 365

Asp Pro Lys Thr Gly Glu Leu Thr Pro Ala His Tyr Arg Ile Ser Lys

370 375 380

Ser Ser Trp Leu Arg Asp Glu Glu Ser Pro Val Ile Ala Arg Ile Thr

385 390 395 400

Gln Arg Val Thr Asp Met Thr Gly Leu Ser Met Leu His Ala Glu Glu

405 410 415

Leu Gln Val Val Asn Tyr Gly Ile Gly Gly His Tyr Glu Pro His Phe

420 425 430

Asp Phe Ala Arg Lys Arg Glu Asn Pro Phe Thr Lys Phe Gly Gly Asn

435 440 445

Arg Ile Ala Thr Val Leu Phe Tyr Met Ser Asp Val Ala Gln Gly Gly

450 455 460

Ala Thr Val Phe Thr Glu Leu Gly Leu Ser Leu Phe Pro Ile Lys Arg

465 470 475 480

Ala Ala Ala Phe Trp Leu Asn Leu His Ala Ser Gly Glu Gly Asp Leu

485 490 495

Ala Thr Arg His Ala Ala Cys Pro Val Leu Arg Gly Ser Lys Trp Val

500 505 510

Ser Asn Lys Trp Ile His Gln Gly Gly Gln Glu Leu Leu Arg Pro Cys

515 520 525

Asp Leu Glu Tyr Gln Glu Glu Gly Ile Ile Arg Lys Ile Pro Arg Pro

530 535 540

Val Pro Lys Thr Ser Arg

545 550

<210>3

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<213>人工序列描述：合成的寡核苷酸

<400>3

tcgtaactgc ctacacgttt gc 22

<210>4

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<213>人工序列描述：合成的寡核苷酸

<400>4

agacgtgaac ctggctggct 20

<210>5

<211>15

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<213>人工序列描述：合成的寡核苷酸

<400>5

tttagactcg agcct 15

<210>6

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<213>人工序列描述：合成的寡核苷酸

<400>6

tacagttctt atctagacgt gaacc 25

<210>7

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<213>人工序列描述：合成的寡核苷酸

<400>7

gacataatat gtgacgctcg agaattagac tgc 33

<210>8

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<213>人工序列描述：合成的寡核苷酸

<400>8

ggatccagac atgataagat ac 22

<210>9

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<213>人工序列描述：合成的寡核苷酸

<400>9

gatcataatc agccatacca c 21

<210>10

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<213>人工序列描述：合成的寡核苷酸

<400>10

gatcccccta gaatcccaaa ac 22

<210>11

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<213>人工序列描述：合成的寡核苷酸

<400>11

cttagcgacg tgttcacttt gc 22

<210>12

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<213>人工序列描述：合成的寡核苷酸

<400>12

agatctagtc gaatttcgac tctgcg 27

<210>13

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<213>人工序列描述：合成的寡核苷酸

<400>13

cccgatgata agacgactat g 21

<210>14

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<213>人工序列描述：合成的寡核苷酸

<400>14

ccaggttcac gtctaaataa g 21

<210>15

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<213>人工序列描述：合成的寡核苷酸

<400>15

agatctcatg acaacagtac cgaaatc 27

<210>16

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<213>人工序列描述：合成的寡核苷酸

<400>16

taacagacca ctaaaatgaa g 21

<210>17

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<213>人工序列描述：合成的寡核苷酸

<400>17

ctcgagtagc ttttccatca tcaatgt 27

<210>18

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<213>人工序列描述：合成的寡核苷酸

<400>18

tctagaagat ctggtacggt tcgtaaagtt cac 33

<210>19

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<213>人工序列描述：合成的寡核苷酸

<400>19

gtctgttatg tgaccaatcg g 21

<210>20

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<213>人工序列描述：合成的寡核苷酸

<400>20

acagaccac t aaaatgaagc c 21

<210>21

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<213>人工序列描述：合成的寡核苷酸

<400>21

ctcgagcctg gctggctgct tgtgcaa 27

<210>22

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<213>人工序列描述：合成的寡核苷酸

<400>22

tgttccacgg aaacactggt g 21

<210>23

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<213>人工序列描述：合成的寡核苷酸

<400>23

catcctccag aactgtgtag g 21

<210>24

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<213>人工序列描述：合成的寡核苷酸

<400>24

cacaacgtct atatcatggc cg 22

<210>25

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<213>人工序列描述：合成的寡核苷酸

<400>25

atgttgtggc ggatcttgaa g 21

<210>26

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<213>人工序列描述：合成的寡核苷酸

<400>26

tncargtngc naaytaygg 19

<210>27

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<213>人工序列描述：合成的寡核苷酸

<400>27

cnccnccngc nswnacrtc 19

<210>28

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<213>人工序列描述：合成的寡核苷酸

<400>28

gaggacggtg gctattctgt tgccg 25

<210>29

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<213>人工序列描述：合成的寡核苷酸

<400>29

ggcatagggg gacactacga accgc 25

Claims

1.作为蚕茧或者丝腺内的蛋白质的一部分产生重组人胶原的转化蚕的制作方法，包括以下步骤：

(a)构建在夹在一对来自昆虫DNA型转座子的反向重复序列之间区域内含有在蚕丝蛋白质基因的表达调控序列的支配下连接了编码人胶原的多核苷酸的融合多核苷酸的重组质粒载体的步骤；

(b)将含有编码上述转座子的转座酶的多核苷酸的重组质粒载体和步骤(a)的重组质粒载体注入蚕卵中的步骤；

(c)将具有重组质粒载体的蚕卵在蚕中发育的步骤；

(d)鉴定其基因组DNA中掺入了步骤(a)所构建的重组质粒载体的融合多核苷酸的蚕的步骤。

2.作为蚕茧或者丝腺内的蛋白质的一部分生产重组人胶原和蚕丝蛋白质的融合蛋白质的转化蚕的制作方法，包括以下步骤：

(a)构建在夹在一对来自昆虫DNA型转座子的反向重复序列之间区域内含有在蚕丝蛋白质基因的表达调控序列的支配下连接了编码蚕丝蛋白质的多核苷酸和编码人胶原的多核苷酸的融合多核苷酸的重组质粒载体的步骤；

(c)将分别注入了上述重组质粒载体的蚕卵在蚕中发育的步骤；

(d)分离其基因组DNA中掺入了步骤(a)所构建的重组质粒载体的融合多核苷酸的蚕的步骤。

3.重组人胶原的制造方法，其特征在于是从转化蚕的茧或者丝腺分离、纯化重组人胶原，所述转化蚕是用权利要求1的方法制作的转化蚕，在基因组DNA中含有在蚕丝蛋白质基因的表达调控序列的支配下，连接了编码人胶原的多核苷酸的融合多核苷酸，作为蚕茧或者丝腺内蛋白质的一部分生产重组人胶原的转化蚕。

4.重组人胶原的制造方法，其特征在于是从转化蚕的茧或者丝腺分离重组人胶原和蚕丝蛋白质的融合蛋白质，从该融合蛋白质分离、纯化重组人胶原，所述转化蚕是用权利要求2的方法制作的转化蚕，在基因组DNA内有在蚕丝蛋白质基因的表达调控序列的支配下连接了编码蚕丝蛋白质的多核苷酸和编码人胶原的多核苷酸的融合多核苷酸，作为蚕茧或者丝腺内蛋白质的一部分生产重组人胶原和蚕丝蛋白质的融合蛋白质的转化蚕。

5.产生转化蚕的重组人胶原和蚕丝蛋白质的融合蛋白质，所述转化蚕是用权利要求2的方法制作的转化蚕，在基因组DNA内有在蚕丝蛋白质基因的表达调控序列的支配下连接了编码蚕丝蛋白质的多核苷酸和编码人胶原的多核苷酸的融合多核苷酸，作为蚕茧或者丝腺内蛋白质的一部分生产重组人胶原和蚕丝蛋白质的融合蛋白质的转化蚕。

6.重组质粒载体，其在夹在一对来自昆虫DNA型转座子的反向重复序列之间区域，具有在蚕丝蛋白质基因的表达调控序列的支配下连接了编码人胶原的多核苷酸的融合多核苷酸的。

7.重组质粒载体，其在夹在一对来自昆虫DNA型转座子的反向重复序列之间区域，具有在蚕丝蛋白质基因的表达调控序列的支配下连接了编码蚕丝蛋白质的多核苷酸和编码人胶原的多核苷酸的融合多核苷酸。

8.由权利要求6或者7的重组质粒载体和具有编码转座子的转座酶的多核苷酸的重组质粒载体构成的载体盒。