ES2623147T3 - Secuencias polipeptídicas inductoras de cuerpos proteicos - Google Patents

Secuencias polipeptídicas inductoras de cuerpos proteicos Download PDF

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Mª Inmaculada LLOP
María Dolores LUDEVID MUGICA
Blanca Llompart Royo
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Margarita Torrent Quetglas
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Abstract

Una secuencia polipeptídica inductora de cuerpos proteicos (PBIS) recombinante que comprende (i) una estructura de poliprolina II (PPII) que tiene al menos 36 aminoácidos de longitud; en donde la estructura PPII está localizada entre al menos dos cisteínas en el extremo N y al menos dos cisteínas en el extremo C; en donde no más del 10% de los aminoácidos en la estructura PPII son lisina o arginina; y en donde la estructura PPII es una secuencia no anfipática y comprende la menos una repetición seleccionada del grupo que consiste en PPPVAL (SEQ ID NO:16), PPPVTL (SEQ ID NO:20), PPPVSL (SEQ ID NO:36), PPPVVL (SEQ ID NO:37) y PPPVLL (SEQ ID NO: 17), o (ii) una secuencia rica en prolina que tiene al menos 36 aminoácidos de longitud, en donde de la secuencia rica en prolina está localizada entre al menos dos cisteínas en el extremo N y al menos dos cisteínas en el extremo C; en donde no más del 10% de los aminoácidos en la secuencia rica en prolina son lisina o arginina; y en donde la secuencia rica en prolina es una secuencia no anfipática y comprende la menos una repetición seleccionada del grupo que consiste en PPPVAL (SEQ ID NO:16), PPPVTL (SEQ ID NO:20), PPPVSL (SEQ ID NO:36), PPPVVL (SEQ ID NO:37) y PPPVLL (SEQ ID NO: 17).

Description

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DESCRIPCION
Secuencias polipeptidicas inductoras de cuerpos proteicos Campo de la invencion
La presente invencion contempla peptidos que son capaces de inducir la formacion de un ensamblaje recombinante similar a cuerpos proteicos (RPBLA, por sus siglas en ingles) en una celula eucariota. Ademas, polipeptidos heterologos que estan fusionados a secuencias que median la induccion de la formacion de ensamblajes recombinantes similares a cuerpos proteicos (RPBLA), se expresan de forma estable y se acumulan en sistemas huespedes.
Antecedentes de la invencion
Hace varias decadas, se describieron las prolaminas como protemas de almacenamiento muy especializadas implicadas en la formacion de cuerpos proteicos naturales (PB, por sus siglas en ingles) en el endospermo de cereales (Sherry et al., 1990, Biochem. J. 267:1-12). Sin embargo, hasta la fecha, se sabe poco sobre los mecanismos y requisitos para inducir este tipo de organulo.
El endospermo es un tejido vegetal especializado que parece tener una mayor tendencia a transportar protemas a los PB que otros tejidos y tipos celulares. Esto es cierto incluso cuando las protemas no estan fusionadas a prolaminas. Por ejemplo, la protema fitasa recombinante, que se secreta de las celulas de hoja de arroz, se retiene en los PB cuando se expresa en el endospermo. Drakakaki et al., 2006, Plant Physiology, 141, 578-586. De forma similar, la glucoprotema (gB) principal del citomegalovirus humano (Wright et al., 2001, Transgenic Research 10: 177-181) y lisozima (Yang et al., 2003, Planta 216: 597-603) tambien se acumular en los PB en endospermos de plantas dicotiledoneas y monocotiledoneas incluso cuando no estan fusionadas a prolaminas. De forma interesante, incluso cuando lisozima estaba fusionada a un peptido senal no relacionado con prolamina y se expreso bajo el control de un promotor no de prolamina (puroindolina b) se acumulo en los PB en endospermo de arroz. Hennegan et al., 2005, Transgenic Research 14:583-592. Estos datos sugieren que la acumulacion de protemas en PB podna requerir el medio de almacenamiento especializado del endospermo.
La propension aumentada a ser transportado en endospermo tambien se demuestra por experimentos usando protemas recombinantes etiquetadas con KDEL (SEQ ID NO: 110). La etiqueta KDEL tambien se conoce como una “senal de retencion en el RE” porque ayuda a mantener protemas en el retmulo endoplasmico (RE). Por tanto, cuando seroalbumina se fusiona a la etiqueta KDEL, se localiza en la luz del RE en celulas de hojas. Sin embargo, cuando se expresa en el endospermo, la seroalbumina humana etiquetada con KDEL se deposito en agregados de prolamina dentro de vacuolas. Ademas, un anticuerpo monoclonal etiquetado con KDEL, que se retiene eficazmente en el retmulo endoplasmico en hojas, se secreto parcialmente y se transporto parcialmente a vacuolas de almacenamiento de protemas en semillas. Petruccelli et al, 2006, Plant Biotechnol J. 4:511-27.
Por tanto, el transporte de protemas en celulas de endospermo de cereal esta afectado por el medio espedfico del endospermo, incluyendo la abundancia de cuerpos proteicos vacuolares y derivados del retmulo endoplasmico (RE). Segun esto, las protemas que se transportan a PB en el endospermo pueden no ser transportadas allf en otras celulas o tejidos, y las secuencias y estructuras que son suficientes para inducir la formacion de PB en el endospermo pueden no ser necesariamente suficientes para la formacion de PB en otras celulas y tejidos.
Ademas, las secuencias y estructuras espedficas que son suficientes para inducir la formacion de PB no se han identificado. De hecho, cuando se comparan todas las protemas implicadas en la formacion PB, no es evidente ninguna homologfa clara en terminos de secuencias, estructura o caractensticas ffsicas y qrnmicas.
La gamma zema es un constituyente principal de los cuerpos proteicos en mafz (Ludevid et al., 1984, Plant Mol. Biol. 3, 227-234). El dominio N-terminal de gamma zema contiene una region Pro-X (P-X) y una secuencia muy repetitiva (PPPVHL)s (SEQ ID NO: 27) (RD) necesarias para el transporte de zema en el RE (Geli, et al. Plant Cell 6/1911 (1994)) y para la formacion de cuerpos proteicos. Vease tambien, la solicitud publicada de EE UU No. 2007/0243198. Un estudio de dicndsmo circular de una serie de peptidos sinteticos de la secuencia (VHLPPP)n (SEQ ID NO: 28) (n=3, 5, 8) en agua a pH 5, mostro que estos peptidos adoptan una helice de poliprolina II (PPII) (Rabanal, Biopolymers 33: 1019-28 (1993)). Ademas, se ha mostrado que la secuencia PPPVaL (SEQ ID nO: 16) adopta conformacion PPII en solucion acuosa, aunque no se ha divulgado la formacion de cuerpos proteicos (Dalcol, et al., 1996 Journal of Organic Chemistry, vol. 61, no. 20, 1996, paginas 6775-6782). La gamma zema tambien contiene varias cistemas que se mostro que se requenan para la formacion de PB estables (Pompa, Plant Cell 18: 2608-2621 (2006)). Los documentos WO2007096192, WO2004/003207 y WO2006/056484 divulgan una secuencia que induce cuerpos proteicos que contiene la secuencia (PPPVHL)6 (SEQ ID NO: 29), una secuencia anfipatica, flanqueada por dos cistemas en el extremo N o C y el documento WO2004/003207 tambien divulga una secuencia que induce cuerpos proteicos que comprende el P4 que contiene una repeticion PPPVHL (SEQ ID NO: 4), una secuencia rica en prolina anfipatica flanqueada por dos cistemas en el extremo N y el C.
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La helice PPII del RD de gamma zema tiene un marcado caracter anfipatico. Estudios previos han sugerido que la naturaleza anfipatica de la helice PPII era importante para la formacion de PB estables, y se han demostrado las propiedades tensoactivas de la helice PPII anfipatica (VhLPPP)b (SEQ ID NO: 27) mediante varios planteamientos (Kogan et al., 2001, J. Mol. Biol. 312, 907-913003; Kogan et al., 2002, Biophysical Journal. Volumen 83. 1194-1204). Por ejemplo, se ha mostrado que el peptido octamerico sintetico (VHLPPP)b era capaz de disminuir la tension de superficie del agua, debido en gran parte a la adsorcion del anfffilo a la interfaz aire-agua con la fraccion hidrofobica orientada lejos de la fase acuosa (Ludevid et al., 1984, Plant Mol. Biol. 3, 227-234). Tambien se demostro que este peptido anfipatico interacciona con liposomas de fosfatidilcolina de soja y se ensambla para formar dominios extendidos sobre la membrana, lo que aumenta su estabilidad y permeabilidad (Kogan et al., 2004, Biopolymers, Vol. 73, 258-268). El ensamblaje anfipatico espontaneo de (VHlPpP)b (SEQ ID NO: 27) en la membrana sugiere un mecanismo de deposicion de gamma zema dentro de los cuerpos proteicos de mafz. Basado en las caractensticas anfipaticas del rD de gamma zema, se ha propuesto que esta protema interacciona con la cara interna de la membrana del RE induciendo un recubrimiento interno que podna ser un elemento clave en el mecanismo de induccion de PB (Ludevid et al., 1984, Plant Mol. Biol. 3, 227-234). Este recubrimiento se podna estabilizar despues covalentemente a traves de entrecruzamiento disulfuro intramolecular que implica residuos de cistema que flanquean la secuencia repetitiva de gamma zema.
Mientras que se han caracterizado algunas de las caractensticas de la protema gamma zema, no se entendfa previamente cual de estas caractensticas o combinacion de caractensticas era relevante para la formacion de cuerpos proteicos. Ademas, otras secuencias inductoras de cuerpos proteicos contienen poca o ninguna similitud estructural o de secuencia con gamma zema. Como se describe en mas detalle posteriormente, se ha identificado una secuencia minima capaz de inducir cuerpos proteicos. Ademas, se han identificado secuencias recombinantes inductoras de cuerpos proteicos con propiedades mejoradas, tales como una capacidad mejorada para formar ensamblajes recombinantes similares a cuerpos proteicos (RPBLA) y capacidad de formar RPLBA con caractensticas mejoradas.
Breve compendio de la invencion
En un aspecto, la invencion se refiere a una secuencia polipeptfdica recombinante inductora de cuerpos proteicos (PBIS, por sus siglas en ingles) que comprende
(i) una estructura de poliprolina II (PPII) que tiene al menos 36 aminoacidos de longitud;
en donde la estructura PPII se localiza entre al menos dos cistemas en el extremo N y al menos dos cistemas en el extremo C;
en donde no mas del 10% de los aminoacidos en la estructura PPII son lisina o arginina; y en donde la estructura PPII es una secuencia no anfipatica y comprende al menos una repeticion seleccionada del grupo que consiste en PPPVAL (SEQ ID NO:16), PPPVTL (SEQ ID NO:20), PPPVSL (SEQ ID NO:36), PPPVVL (SEQ ID NO:37) y PPPVLL (SEQ ID NO:17), o
(ii) una secuencia rica en prolina que tiene al menos 36 aminoacidos de longitud;
en donde la secuencia rica en prolina se localiza entre al menos dos cistemas en el extremo N y al menos dos cistemas en el extremo C;
en donde no mas del 10% de los aminoacidos en la secuencia rica en prolina son lisina o arginina; y en donde la secuencia rica en prolina es una secuencia no anfipatica y comprende al menos una repeticion seleccionada del grupo que consiste en PPPVAL (SEQ ID NO:16), PPPVTL (SEQ ID NO:20), PPPVSL (SEQ ID NO:36), PPPVVL (SEQ ID NO:37) y PPPVLL (SEQ ID NO:17).
En otro aspecto, la invencion se refiere a una protema de fusion que comprende la PBIS recombinante segun la invencion y una protema heterologa.
En aspectos adicionales, la invencion se refiere a una molecula de acido nucleico que comprende una secuencia que codifica la PBIS recombinante segun la invencion o la protema de fusion segun la invencion.
En otro aspecto, la invencion se refiere a un RPBLA que comprende la PBIS recombinante segun la invencion o la protema de fusion segun la invencion. En otro aspecto, la invencion se refiere a una celula huesped que comprende la PBIS recombinante de la invencion, la protema de fusion segun la invencion, el acido nucleico segun la invencion o el RPBLA segun la invencion.
En aspectos adicionales, la invencion se refiere a metodos para producir el RPBLA segun la invencion y a un metodo para purificar una protema de fusion segun la invencion.
En aspectos adicionales, la invencion se refiere a una composicion farmaceutica que comprende una cantidad terapeuticamente eficaz del RPBLA de la invencion, a una vacuna que comprende una cantidad inmunologicamente eficaz del RPBLA de la invencion y a un producto alimenticio que comprende el RPBLA segun la invencion.
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Breve descripcion de los dibujos/figuras
Figura 1. (A) Representacion esquematica del dominio de repeticion (RD) de diferentes variantes de peptidos RX3 fusionados a una protema fluorescente indicadora, y transformadas mediante agroinfliltracion en hojas de tabaco. La posicion relativa de los aminoacidos diferentes de prolina en la helice PPII se representa mediante un triangulo. Se muestra una lmea de puntos que separa el lado hidrofobico (abajo) del lado hidrofflico (arriba) en variantes con una helice antipatica. Se muestra el dominio de repeticion de RX3 salvaje en el centro (caja gris). Las variantes completamente hidrofobicas donde los residuos de histidina se han cambiado por alanina o leucina (RX3(A) y RX3(L), respectivamente) se muestran a la derecha. Las variantes anfipaticas cargadas positivamente donde los residuos de histidina se han cambiado por arginina o lisina (RX3(R) y RX3(K), respectivamente) se muestran a la izquierda. (B) Analisis por inmunotransferencia de cantidades equivalentes de homogeneizados de hojas de tabaco que expresan RX3-GFP, RX3(R)-GFP, RX3-ECFP y RX3(K)-EcFp, probados con anticuerpo anti-GFP. La punta de flecha blanca marca las protemas de fusion y la punta de flecha negra marca una protema fluorescente parcialmente degradada. (C) Imagenes de microscopfa confocal de celulas de hoja de tabaco que expresan el peptido RX3 salvaje fusionado a GFP (RX3-GFP) o diferentes variantes del peptido RX3 en las que los residuos de histidina del dominio repetitivo se mutaron a alanina, leucina, arginina o lisina (RX3(A)-GFP, RX3(L)-GFP, RX3(R)-GFP y RX3(K)-ECFP, respectivamente). Las flechas marcan la fluorescencia correspondiente a protema secretada. Las puntas de flecha blancas marcan los RPBLA derivados del RE y las puntas de flecha negras senalan cloroplastos. Las barras corresponden a 5 micrometros.
Figura 2. (A) Fotograffas de los resultados de gradiente de densidad por capas para varias protemas de fusion (RX3-GFP, RX3(A)-GFP y RX3(L)-GFP) expresadas en hojas de tabaco y analizadas mediante inmunotransferencia usando un anticuerpo anti-GFP. (B) Tincion con azul de Coomassie que muestra el enriquecimiento en RX3(A)-GFP despues de un gradiente de densidad en capas. Se indican las diferentes fracciones del gradiente de densidad ((H) homogeneizado, (S) sobrenadante, (f) interfaz encima del colchon de Optiprep™ correspondiente).
Figura 3. (A) Recuperacion de RPBLA mediante centrifugacion a baja velocidad. El panel izquierdo muestra tincion con plata de SDS-pAGE despues del aislamiento de RPBLA de RX3-GFP y RX3(A)-GFP expresados en hojas de tabaco. El panel derecho muestra tincion con plata de SDS-PAGE de RPBLA de RX3-GFP y RX3(A)-GFP lavados en condiciones moderadas (borato 50 mM pH 10, bME 10 mM). (B) La tincion con azul de Coomassie (izquierda) y la inmunotransferencia (derecha; anticuerpo anti-GFP) muestran la recuperacion mediante centrifugacion a baja velocidad de los RPBLA inducidos en plantas de tabaco por la expresion de RX3(H)-GFP. (H0) homogeneizado preclarificado, (H1) homogeneizado clarificado mediante filtracion, (SN) sobrenadante despues de la recuperacion de los RPBLA mediante centrifugacion, (Ws) sobrenadante del paso de lavado, (wPB) RPBLA recuperados mediante centrifugacion despues del paso de lavado, (sPB) protema de fusion solubilizada de wPB e (iPB) fraccion insoluble despues del paso de solubilizacion. Las puntas de flecha indican las protemas de fusion monomericas correspondientes. El asterisco indica las formas multimericas de la protema de fusion.
Figura 4. (A) Representacion esquematica del dominio de repeticion (RD) de RX3(A3) como se describe en la figura 1. (B) Imagenes de microscopfa confocal de celulas de hoja de tabaco 3 y 6 dfas despues de la infiltracion (dpi) con el vector que expresa RX3(A3)-ECFP. Los RPBLA se indican con flechas. Las barras corresponden a 2 micrometres.
Figura 5. (A) Representacion esquematica del dominio de repeticion de variantes anfipaticas cargadas negativamente del peptido RX3 (RX3(E) y RX3(D)) como se describe para la figura 1. (B) Inmunotransferencia con anti-GFP en cantidades equivalentes de homogeneizados de hojas de tabaco que expresan RX3-GFP, RX3(E)-GFP, RX3-ECFP y RX3(D)-ECFp. (C) Imagenes de microscopfa confocal de celulas de hoja de tabaco que expresan RX3(E)-GFP (izquierda) y RX3(D)-ECFP (derecha). Los RPBLA se indican con flechas. Las barras corresponden a 2 micrometros.
Figura 6. (A) Representacion esquematica del dominio de repeticion de variantes polares sin carga de peptidos RX3 (RX3(T), RX3(N) y RX3(Q)) como se describe para la figura 1. (B) Imagenes de RPBLA inducidos por la expresion de estos peptidos ensambladores fusionados a ECFP 3 y 6 dfas despues de la agroinfiltracion (dpi). Las barras mostradas en las imagenes de 3 y 6 dpi corresponden a 5 y 2 micrometros, respectivamente.
Figura 7. (A) Alineamiento de secuencia de peptidos ensambladores RX3 maduro, PP y PA. La identidad entre los tres peptidos se indica en negrita, y los residuos de cistema se indican mediante cajas grises. SP indica peptido senal. (B) Inmunotransferencia con anti-GFP de cantidades equivalentes de homogeneizados de hojas de tabaco que expresan PP-ECFP, PA-ECFP y RX3-ECFP. Las flechas marcan las protemas de fusion. (C) Imagenes de microscopfa confocal de celulas de hoja de tabaco que expresan RX3-ECFP, PP-ECFP y PA-ECFP. Los RPBLA se indican con flechas.
Figura 8. (A) Diagrama que muestra las posiciones de los residuos de cistema en el peptido ensamblador RX3 fusionado a ECFP. (B) SDS-PAGE/tincion con azul de Coomassie (panel superior) e inmunotransferencia con anti- GFP (panel inferior) que muestran el analisis de protemas totales de hojas de tabaco: tabaco sin transformar (carril
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1); tabaco que expresa RX3-ECFP (carril 2); tabaco que expresa RX3 Cys7 (carril 3); tabaco que expresa RX3 Cys9 (carril 4); tabaco que expresa RX3 Cys64 (carril 5); tabaco que expresa RX3 Cys82 (carril 6); tabaco que expresa RX3 Cys84 (carril 7); tabaco que expresa RX3 Cys92 (carril 8); tabaco que expresa RX3 Cys7-Cys9 (carril 9); y tabaco que expresa RX3 Cys82- Cys84- Cys92- (carril 10). Las flechas indican las bandas electroforeticas de RX3- ECFP y mutantes Cys de RX3-ECFP y la punta de flecha indica una banda inmunorreactiva adicional. (C-K) Imagenes confocales que muestran el patron de fluorescencia de celulas epidermicas transformadas con los mutantes RX3-Cys fusionados a ECFP. Las barras en C-H corresponden a 10 pm. Las barras en I-K corresponden a 20 pm.
Figura 9. (A) Alineamiento de secuencia de PP maduro y PP2. La identidad entre los dos peptidos se indica en negrita y los residuos de cistema se indican mediante una caja gris. SP indica peptido senal. (B) Representacion esquematica de la helice PPII de PP y PP2. Se indican los residuos de cistema. (C) Imagenes de microscopfa confocal de celulas de hoja de tabaco que expresan PP2-GFP. El panel izquierdo es un aumento del panel derecho.
Figura 10. (A) Representacion esquematica del peptido RX3 fusionado a ECFP que presenta una reduccion progresiva en el numero de unidades en el RD. Las unidades se muestran en cajas grises numeradas y los residuos de cistema se indican mediante asteriscos. (B) Gel de SDS-PAGE tenido con azul de Coomassie que muestra el patron de protemas de cantidades equivalentes de homogeneizados de hojas de tabaco que expresan protemas de fusion RX3- R8(4C)-, R7(4C)-, R6(4C)- y R4(4C)-ECFP (flechas). (C) Imagenes de microscopfa confocal de celulas de hoja de tabaco que expresan R8(4C)-, R6(4C)- y R4(4C)-ECFP. Las flechas en los recuadros marcan los RPBLA. Las barras corresponden a 20 micrometros en la imagen completa y a 5 micrometros en los recuadros.
Figura 11. (A, B y C) Imagenes de microscopfa confocal de celulas de hoja de tabaco que expresan la protema fluorescente mCherry fusionada a los peptidos RX3, RX3(A) y RX(E) (A, B y C, respectivamente). (A', B' y C') Mayor aumento de las imagenes en A, B y C para senalar los RPBLA (puntas de flecha). Las flechas muestran RX3- mCherry secretada. Las barras corresponden a 5 micrometros.
Figura 12. (A) Inmunotransferencia que compara la recuperacion mediante centrifugacion a baja velocidad de RPBLA inducidos por la expresion de RX3-, RX3(E)- y rX3(A)-EGF. Se muestran el homogeneizado clarificado (carril 1), el sobrenadante despues de la recuperacion de RPBLA mediante centrifugacion (carril 2), el sobrenadante del paso de lavado (carril 3) y los RPBLA recuperados mediante centrifugacion despues del paso de lavado (carril 4). (B) Inmunotransferencia que muestra RX3(E)-EGF (carril 1), RX3(A)-EGF (carril 2) y RX3-EGF (carril 3) solubilizadas despues de incubar en condiciones moderadas. La fraccion no solubilizada de la protema de fusion correspondiente se recupero mediante centrifugacion a 16000 x g durante 10' y se muestra en los carriles 4, 5 y 6, respectivamente. (C) Analisis por inmunotransferencia de cantidades equivalentes de homogeneizados de hojas de tabaco que expresan PP-, PA-, RX3(E)- y RX3-EGF. (D) Inmunotransferencias que muestran las protemas de fusion RX3(E)-EGF (carril 2), PP-EGF (carril 5) y PA-EGF (carril 8) solubilizadas de los correspondientes RPBLA aislados mediante centrifugacion a baja velocidad (carriles 1, 4 y 7, respectivamente). La protema de fusion restante no solubilizada se muestra en los carriles 3, 6 y 9.
Figura 13. (A) Tincion con plata de SDS-PAGE del proceso posterior de RX3(E)-EGF del aislamiento de RPBLA mediante centrifugacion a baja velocidad al corte de la protema de fusion por digestion con FXa: marcador molecular (carril 1); homogeneizado preclarificado (carril 2); homogeneizado clarificado por centrifugacion (carril 3); sobrenadante despues de recuperar los RPBLA mediante centrifugacion (carril 4); sobrenadante del paso de lavado (carril 5, 6); RPBLA recuperados mediante centrifugacion despues del paso de lavado (carril 7); fraccion insoluble despues del paso de solubilizacion (carril 8); protema de fusion solubilizada del wPB (carril 9); y protema de fusion RX3(E)-EGF cortada (carril 10). (B) Cromatograma de la purificacion de EGF por FPLC de fase reversa. La flecha indica el pico de EGF que corresponde al 30% de acetonitrilo. (C) Tincion con azul de Coomassie que muestra el aporte a RF-FPLC (carril 1) y las dos fracciones (carriles 2-3) que contienen el EGF puro y que corresponden al pico indicado por una flecha en (B).
Figura 14. (A) La tincion con azul de Coomassie de SDS-PAGE (izquierda) y la inmunofluorescencia (derecha) muestran RPBLA de RX3(A)-hGH aislados. (B) Inmunofluorescencia con anti-hGH que muestra la eficacia de solubilizacion de RX3-hGH y RX3(A)-hGH. (H0) homogeneizado preclarificado, (H1) homogeneizado clarificado mediante filtracion, (SN) sobrenadante despues de la recuperacion de los RPBLA mediante centrifugacion, (Ws) sobrenadante del paso de lavado, (wPB) RPBLA recuperados mediante centrifugacion despues del paso de lavado, (sPB) protema de fusion solubilizada de wPB e (iPB) fraccion insoluble despues del paso de solubilizacion.
Figura 15. (A y B) Representacion esquematica de las protemas de fusion que indican la secuencia inductora de cuerpos proteicos (PBIS), el enlazador de 5 glicinas ((Gly)s), el sitio de corte (CS), Intein MxeGyrA de New England Biolabs (I) y la protema de interes (PDI). Los CS son el sitio de corte de la enteroquinasa (EK) y el sitio de corte de FXa (FXa). Las PDI son hormona de crecimiento humana (hGH), factor de crecimiento epidermico (EGF), protema fluorescente cian mejorada (ECFP), proteasa enteroquinasa (EKp), xilanasa (Xyl) y protema fluorescente verde (GFP). Las protemas de fusion Zera(Adh) son las protemas de fusion basadas en las siguientes PBIS derivadas de un fragmento de adhesina que forma una helice PPII: Z(Adh), Z(Adh2), Z(Adh)Px y Z(Adh2)Px. Las protemas de
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fusion Zera(Col) son las protemas de fusion basadas en las siguientes PBIS derivadas de un fragmento de colageno que forma una helice PPII: Z(Col), Z(Col2), Z(Col)Px y Z(Col2)Px.
Figura 16. (A) En el panel superior, tincion con azul de Coomassie de 20 microgramos de protema total de homogeneizados preclarificados de hojas de tabaco que expresan RX3ACys64,82,84,92-ECFP-KDEL (carril 1), RX3-ECFP (carril 2), y SP-ECFP-KDEL (carril 3). En la parte inferior, inmunotransferencia de los mismos homogeneizados mediante anticuerpo anti-GFP. La flecha indica las protemas de fusion. (B) Imagenes de microscopfa confocal de hojas de tabaco que expresan RX3ACys64,82,84,92-ECFP-KDEL, tres y siete dfas despues de la infiltracion (dpi). Las barras blancas corresponden a 5 micrometros. (C) Determinacion de la densidad de RX3- ECFP (izquierda) y RX3ACys64,82,84,92-EcFp-KDEL (derecha) por gradiente de densidad por capas. Se analizaron cantidades equivalentes de las fracciones recuperadas por tincion con azul de Coomassie (paneles superiores) e inmunotransferencia usando anticuerpo anti-GFP (paneles inferiores). Los carriles muestran: (1) muestra cargada en el gradiente de densidad Optiprep™, (2) sobrenadante recuperado de encima del colchon de Optiprep™ al 18%, (3) fraccion entre el 18-30%, (4) fraccion entre el 30-34%, (5) fraccion entre el 34-38%, (6) fraccion entre el 38-42%, (7) fraccion entre el 42-46%; y (8) fraccion recuperada en el precipitado.
Figura 17. (A) Alineamiento de secuencia de los peptidos ensambladores Z(Adh) (SEQ ID NO:98), Z(Adh)Px (SEQ ID NO:94), Z(Col) (SEQ ID NO:100), y Z(Col)Px (SEQ ID NO:96). El peptido senal (de gamma zema de 27 KDa en todos los casos) no se muestra. Los aminoacidos subrayados (Adh - SEQ ID NO: 128; Col - SEQ ID NO: 129) corresponden a los fragmentos de protema de los genes de adhesina o colageno. La barra negra indica los fragmentos con una alta propension a adoptar una estructura PPII. (B) Tincion con azul de Coomassie de homogeneizados preclarificados que provienen de cantidades equivalentes (20 microgramos de protema total) de hojas de tabaco que expresan Z(Adh)Px-GFP, Z(Col)Px-GFp, Z(Adh)-GFP y Z(Col)-GFP (carriles 1 a 4, respectivamente). Las flechas marcan las protemas de fusion. (C) De izquierda a derecha, imagenes de microscopfa confocal de hojas de tabaco que expresan Z(Adh)-GFP, Z(Col)-GFP, Z(Adh)Px-GFP, y Z(Col)Px-GFP. Las barras blancas corresponden a 5 micrometres. (D) Proceso posterior de la recuperacion de los RPBLA por medio de centrifugacion a baja velocidad a 1500xg analizado por tincion con azul de Coomassie. El homogeneizado preclarificado (carril 1) se centrifugo a 1500xg y el sobrenadante (carril 2) se desecho. Despues de tres rondas de pasos de lavados (carriles 3-5), se obtuvo el precipitado correspondiente a la fraccion de los RPBLA (carril 6). Se muestra el proceso se realizo en cantidades equivalentes de hojas de tabaco que expresan Z(Adh)-GFP (D1), Z(Col)-GFP (D2), Z(Adh)Px-GFP (D3), y Z(Col)Px-GFP (D4).
Figura 18. (A) Representacion esquematica de los peptidos ensambladores maduros: (i) RX3 y (ii) RX3 invertido (iRX3). La orientacion de los diferentes dominios: (N) fragmento N-terminal, (RD, en gris) dominio repetitivo y (PX) dominio Pro-X se indica mediante flechas. Tambien se muestra la posicion de los residuos de cistema. (B) Imagenes de microscopfa confocal de celulas de hojas de tabaco que expresan RX3-ECFP, ECFP-RX3, iRX3-ECFP y ECFP- iRX3. Los RPBLA se indican con flechas. Las barras corresponden a 5 micrometros. (C) Determinacion de la densidad de los RPBLA de plantas de tabaco que expresan RX3-ECFP, ECFP-RX3, iRX3-ECFP y ECFP-iRX3. El homogeneizado (carril 1) se cargo en la parte superior de un gradiente de densidad Optiprep multicapa, y se recogieron las siguientes fracciones a 80.000xg: (carril 2) sobrenadante, (carril 3) interfase por encima del colchon de 1,117 g/cm3, (carril 4) interfase por encima del colchon de 1,175 g/cm3, (carril 5) interfase por encima del colchon de 1,21 g/cm3, (carril 4) interfase por encima del colchon de 1,233 g/cm3, (carril 7) interfase por encima del colchon de 1,26 g/cm3 y (carril 8) precipitado en el fondo del tubo. Se analizaron cantidades volumetricas equivalentes de cada fraccion por inmunotransferencia por medio de anticuerpo anti-RX3.
Figura 19. (A) Acumulacion de hGH-iRX3 en RPBLA en celulas CHO. El panel izquierdo muestra la determinacion de la densidad de los RPBLA inducidos por la expresion de hGH-iRX3 en celulas CHO. El homogeneizado (H) se cargo en un gradiente de densidad de sacarosa multicapa y se recogieron las siguientes fracciones despues de centrifugacion a 80.000xg: (S) sobrenadante, (F27) interfase por encima del colchon de sacarosa al 27%, (F35) interfase por encima del colchon de sacarosa al 35%, (F42) interfase por encima del colchon de sacarosa al 42%, (F56) interfase por encima del colchon de sacarosa al 56%, y (P) precipitado en el fondo del tubo. Los marcadores moleculares se indican a la izquierda en kDa y la posicion esperada de la protema de fusion hGH-iRX3 y hGH se indican a la derecha por puntas de flecha. El anticuerpo usado en la inmunotransferencia corresponde a anti-hGH. El panel derecho muestra inmunohistoqmmica de la protema de fusion hGH-iRX3 en celulas de mairnfero CHO. Imagenes de microscopfa confocal de celulas CHO que expresan hGH-iRX3 que se incubaron con un anticuerpo anti-hGH muestran la acumulacion de la protema de fusion en RPBLA intracelulares (flechas). (B) Inmunohistoqmmica de protemas de fusion EK-RX3 y DsRED-iRX3 en celulas de mamffero CHO. El panel izquierdo muestra imagenes de microscopfa confocal de celulas CHO que expresan EK-RX3 incubadas con un anticuerpo anti-RX3 (aR8). El panel derecho muestra que los RPBLA se pueden observar directamente por la fluorescencia intrmseca de DsRED-iRX3. Los RPBLA intracelulares que contienen la protema de fusion DsRED-iRX3 se muestran mediante flechas. N corresponde al nucleo celular. (C) Induccion de RPBLA por la expresion de hGH-iRX3 en celulas de insecto Sf9. El panel izquierdo muestra imagenes de microscopfa confocal de celulas de insecto que expresan hGH-iRX3 e incubadas con anticuerpo anti-hGH. La imagen superior corresponde a celulas Sf9 no infectadas que muestran marcaje de fondo. La imagen inferior muestra una celula Sf9 que expresa la protema de fusion hGH-iRX3 en RPBLA (flechas). El panel derecho muestra la recuperacion de RPBLA por centrifugacion a baja
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velocidad. Un homogeneizado preclarificado de celulas de insecto Sf9 que expresan hGH-I-RX3 (carril 1) se centrifugo a 5000xg. El sobrenadante (carril 2) se desecho y el correspondiente precipitado que contiene los RPBLA (carril 3) se obtuvo despues de varios pasos de lavado (carril 3). La punta de flecha indica la posicion de la protema de fusion hGH-I-RX3.
Descripcion detallada de la invencion
A continuacion se proporciona una descripcion de secuencias inductoras de cuerpos proteicos (PBIS) recombinantes que son utiles para la formacion de ensamblajes recombinantes similares a cuerpos proteicos (RPBLA). Las PBIS recombinantes se pueden fusionar a protemas de interes y los RPBLA formados por la expresion de las protemas de fusion en las celulas se pueden usar para purificar de forma sencilla y eficaz grandes cantidades de la protema de interes. Ademas, los RPBLA se pueden usar en terapeutica tal como vacunaciones.
Los encabezamientos de seccion usados en el presente documento son solo para fines de organizacion y no se deben interpretar en ninguna manera limitantes del objeto descrito.
I. Definiciones
A menos que expresamente se defina de otra manera, los terminos usados en el presente documento se deben entender segun su significado normal en la tecnica. Los terminos usados en singular o referidos como “un” o “una” tambien incluyen el plural y viceversa, a menos que se especifique o indique de otra manera por el contexto. Las tecnicas y procedimientos estandar en general se realizan segun metodos convencionales en la tecnica y varias referencias generales (vease, en general, Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.), que se proporcionan en todo este documento.
Los terminos “polipeptido”, “peptido” y “protema” se usan en el presente documento de forma intercambiable para referirse a polfmeros de aminoacidos de cualquier longitud. El polfmero puede ser lineal o ramificado, puede comprender aminoacidos modificados y puede estar interrumpido por no aminoacidos. Los terminos tambien abarcan un polfmero de aminoacidos que se ha modificado de forma natural o mediante intervencion; por ejemplo, formacion de puentes disulfuro, glucosilacion, lipidacion, acetilacion, fosforilacion o cualquier otra manipulacion o modificacion, tal como conjugacion con un componente marcador. Tambien se incluyen en la definicion, por ejemplo, polipeptidos que contienen uno o mas analogos de un aminoacido (incluyendo, por ejemplo, aminoacidos no naturales, etc.), asf como otras modificaciones conocidas en la tecnica. Se entiende que, puesto que los polipeptidos de esta divulgacion se basan en anticuerpos, en ciertas divulgaciones, los polipeptidos se pueden producir como cadenas unicas o cadenas asociadas.
Un “polipeptido de fusion” o “protema de fusion” es un polipeptido compuesto de al menos dos polipeptidos y opcionalmente una secuencia enlazadora para unir operativamente los dos polipeptidos en un polipeptido continuo. Los dos polipeptidos unidos en un polipeptido de fusion tfpicamente derivan de dos fuentes independientes y por tanto un polipeptido de fusion comprende dos polipeptidos unidos que normalmente no se encuentran unidos en la naturaleza. Los dos polipeptidos pueden estar operativamente unidos directamente por un enlace peptfdico o pueden estar unidos indirectamente a traves de un enlazador descrito aqrn o de otra manera conocido en la tecnica.
Un “acido nucleico”, “polinucleotido” o “molecula de acido nucleico” es un compuesto polimerico compuesto de subunidades covalentemente unidas denominadas nucleotidos. Acido nucleico incluye acido polirribonucleico (ARN) y acido polidesoxirribonucleico (ADN), ambos pueden ser monocatenarios o bicatenarios. El ADN incluye ADNc, ADN genomico, ADN sintetico y ADN semisintetico.
Los terminos “identico” o porcentaje de “identidad” en el contexto de dos o mas acidos nucleicos o polipeptidos, se refiere a dos o mas secuencias o subsecuencias que son iguales o tienen un porcentaje especificado de nucleotidos o residuos de aminoacidos que son iguales, cuando se comparan y alinean (introduciendo huecos, si es necesario) para una correspondencia maxima, sin considerar ninguna sustitucion conservadora de aminoacidos como parte de la identidad de secuencia. Se puede medir el porcentaje de identidad usando software o algoritmos de comparacion de secuencias o mediante inspeccion visual. Se conocen varios algoritmos y software en la tecnica que se pueden usar para obtener alineamientos de secuencias de aminoacidos o nucleotidos. Uno de tales ejemplos no limitantes de un algoritmo de alineamiento de secuencias es el algoritmo descrito en Karlin et al, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci., 87:2264-2268, modificado en Karlin et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci., 90:5873-5877, e incorporado en los programas NBLAST y XBLAST (Altschul et al., 1991, Nucleic Acids Res., 25:3389-3402). En ciertas formas de realizacion, se puede usar Gapped BLAST como describen Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402. BLAST-2, WU-BLAST-2 (Altschul et al., 1996, Methods in Enzymology, 266:460-480), ALIGN, ALIGN-2 (Genentech, South San Francisco, California) o Megalign (DNASTAR) son programas informaticos adicionales publicamente disponibles que se pueden usar para alinear secuencias. En ciertas formas de realizacion, se determina el porcentaje de identidad entre dos secuencias de nucleotidos usando el programa GAP en el software CGC (por ejemplo, usando una matriz NWSgapdna.CMP y un peso de brecha de 40, 50, 60, 70 o 90 y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5 o 6). En ciertas formas de realizacion alternativas, se puede usar el programa GAP en el paquete de
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software CGC, que incorpora el algoritmo de Needleman y Wunsch (J. Mol. Biol. 48:444-453 (1970)) para determinar el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoacidos (por ejemplo, usando una matriz Blossum 62 o una matriz PAM250 y un peso de brecha de 16, 14, 12, 10, 8, 6 o 4 y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5). De forma alternativa, en ciertas formas de realizacion, se determina el porcentaje de identidad entre secuencias de nucleotidos o aminoacidos usando el algoritmo de Myers y Miller (CABIOS, 4:11-17 (1989)). Por ejemplo, se puede determinar el porcentaje de identidad usando el programa ALIGN (version 2.0) y usando PAM120 con una tabla de residuos, una penalizacion por longitud de brecha de 12 y una penalizacion de brecha de 4. Los parametros apropiados para el alineamiento maximo mediante un software de alineamiento particular los puede determinar el experto en la materia. En ciertas formas de realizacion, se usan los parametros por defecto del software de alineamiento. En ciertas formas de realizacion, el porcentaje de identidad “X” de una primera secuencia de aminoacidos respecto a una segunda secuencia de aminoacidos se calcula como 100 x (Y/Z), donde Y es el numero de residuos de aminoacidos puntuados como emparejamientos identicos en el alineamiento de la primera y segunda secuencias (alineadas mediante inspeccion visual o un programa de alineamiento de secuencias particular) y Z es el numero total de residuos en la segunda secuencia. Si la longitud de una primera secuencia es mayor que la segunda secuencia, el porcentaje de identidad de la primera secuencia respecto a la segunda secuencia sera mas largo que el porcentaje de identidad de la segunda secuencia respecto a la primera secuencia.
Como ejemplo no limitante, si cualquier polinucleotido particular tiene un cierto porcentaje de identidad de secuencia (por ejemplo, es al menos el 80% identico, al menos el 85% identico, al menos el 90% identico y en algunas formas de realizacion al menos el 95%, el 96%, el 97%, el 98% o el 99% identico) a una secuencia de referencia se puede determinar, en ciertas formas de realizacion, usando el programa Bestfit (Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 para Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711). Bestfit usa el algoritmo de homologfa local de Smith y Waterman, Advances in Applied Mathematics 2: 482 489 (1981), para determinar el mejor segmento de homologfa entre dos secuencias. Cuando se usa Bestfit o cualquier otro programa de alineamiento de secuencia para determinar si una secuencia particular es, por ejemplo, el 95% identica a una secuencia de referencia segun la presente invencion, los parametros se ajustan de modo que el porcentaje de identidad se calcula en la longitud completa de la secuencia de nucleotidos de referencia y que se permitan brechas en homologfa de hasta el 5% del numero total de nucleotidos en la secuencia de referencia.
En algunas formas de realizacion, dos acidos nucleicos o polipeptidos de la invencion son sustancialmente identicos, lo que significa que tienen al menos el 70%, al menos el 75%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90% y en algunas formas de realizacion al menos el 95%, el 96%, el 97%, el 98%, el 99% de identidad de residuos de nucleotidos o aminoacidos, cuando se comparan y alinean para la maxima correspondencia, medido usando un algoritmo de comparacion de secuencias o mediante inspeccion visual. La identidad puede existir en una region de las secuencias que tiene al menos aproximadamente 10, aproximadamente 20, aproximadamente 40-60 residuos de longitud o cualquier valor integral entre ellos, y puede ser en una region mas larga de 60-80 residuos, por ejemplo al menos aproximadamente 90-100 residuos y en algunas formas de realizacion, las secuencias son sustancialmente identicas en la longitud completa de las secuencias que se comparan, tal como la region codificante de una secuencia de nucleotidos, por ejemplo.
El termino “vector” significa una construccion, que es capaz de administrar y opcionalmente expresar uno o mas gen(es) o secuencia(s) de interes en una celula huesped. Ejemplos de vectores incluyen, pero no estan limitados a, vectores vmcos, vectores de expresion de ADN o ARN desnudo, vectores de plasmidos, cosmidos o fagos, vectores de expresion de ADN o ARN asociados con agentes de condensacion cationicos, vectores de expresion de ADN o ARN encapsulados en liposomas, y ciertas celulas eucariotas, tales como celulas productoras. Los vectores pueden ser estables y pueden ser autoreplicantes. Un “vector de expresion” es un vector que es capaz de dirigir la expresion de genes a los que esta operativamente asociado.
“Promotor” se refiere a un fragmento de ADN capaz de controlar la expresion de una secuencia codificante o ARN funcional. En general, una region codificante se localiza en 3' respecto a un promotor. Los promotores pueden derivar en su totalidad de un gen nativo o estar compuestos de diferentes elementos derivados de diferentes promotores encontrados en la naturaleza o incluso comprender segmentos de ADN sintetico. Los expertos en la materia entienden que diferentes promotores pueden dirigir la expresion de un gen en diferentes tejidos o tipos celulares o en diferentes fases del desarrollo o en respuesta a diferentes condiciones medioambientales o fisiologicas. Los promotores que producen que un gen se exprese en la mayona de los tipos celulares en la mayona de los tiempos comunmente se denominan “promotores constitutivos”. Se reconoce ademas que, puesto que en la mayona de los casos los lfmites exactos de las secuencias reguladoras no se han definido por completo, fragmentos de ADN de diferente longitud pueden tener actividad promotora identica. Un promotor en general esta unido en su extremo 3' al sitio de iniciacion de la transcripcion y se extiende corriente arriba (direccion 5') para incluir el numero mmimo de bases o elementos necesarios para iniciar la transcripcion a niveles detectables sobre el fondo. Dentro del promotor se encontrara un sitio de iniciacion de la transcripcion (convenientemente definido, por ejemplo, mapeando con nucleasa S1), asf como dominios de union de protemas (secuencias consenso) responsables de la union de ARN polimerasa.
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El termino “heterologo” como se usa en el presente documento se refiere a un elemento de un vector, plasmido o celula huesped que deriva de una fuente diferente de la fuente endogena. De esta manera, por ejemplo, una secuencia heterologa pudiera ser una secuencia que deriva de un gen o plasmido diferente del mismo huesped, de una cepa diferente de celula huesped o de un organismo de un grupo taxonomico diferente (por ejemplo, reino, filo, clase, orden, familia, genero o especie diferente o cualquier subgrupo dentro de una de estas clasificaciones). El termino “heterologo” tambien se usa aqu como sinonimo del termino “exogeno”.
Una “region codificante” de ADN o ARN es una molecula de ADN o ARN que se transcribe y/o traduce en un polipeptido en una celula in vitro o in vivo cuando se coloca bajo el control de secuencias reguladoras apropiadas. “Regiones reguladoras adecuadas” se refiere a regiones de acido nucleico localizadas antes (secuencias 5' no codificantes), dentro o despues (secuencias 3' no codificantes) de una region codificante y que influyen en la transcripcion, procesamiento o estabilidad del ARN, o la traduccion de la region codificante asociada. Las regiones codificantes pueden incluir promotores, secuencias lfderes de traduccion, sitio de procesamiento de ARN, sitio de union de efectores y estructura tallo-bucle. Los lfmites de la region codificante se determinan por un codon de iniciacion en el extremo 5' (amino) y un codon de parada en el extremo 3' (carboxilo). Una region codificante puede incluir, pero no esta limitada a, regiones procariotas, ADNc de ARNm, moleculas de ADN genomico, moleculas de ADN sintetico o moleculas de ARN. Si se pretende la region codificante para expresion en una celula eucariota, normalmente una senal de poliadenilacion y secuencia de terminacion de la transcripcion estara localizada en 3' de la region codificante.
“Marco abierto de lectura” se abrevia ORF y significa una longitud de acido nucleico, sea ADN, ADNc o ARN, que comprende una senal de inicio de la traduccion o codon de iniciacion, tal como un ATG o AUG, y un codon de terminacion y se puede traducir potencialmente en una secuencia polipeptfdica.
Una region codificante esta “bajo el control” de elementos de control transcripcional y traduccional en una celula cuando la ARN polimerasa transcribe la region codificante a ARNm, que despues se somete a ayuste en trans del ARN (si la region codificante contiene intrones) y se traduce a la protema codificada por la region codificante.
“Regiones de control transcripcional y traduccional” son regiones reguladoras de ADN, tales como promotores, potenciadores, terminadores y similares, que proporcionan la expresion de una region codificante en una celula huesped. En celulas eucariotas, las senales de poliadenilacion son regiones de control.
Los terminos “operativamente asociado” y “operativamente unido” se refieren a la asociacion de dos moleculas de modo que la funcion de una esta afectada por la otra. Por ejemplo, un promotor esta operativamente asociado con una region codificante cuando es capaz de afectar la expresion de esa region codificante (es decir, que la region codificante esta bajo el control transcripcional del promotor). Las regiones codificantes pueden estar operativamente asociadas a regiones reguladoras en orientacion sentido o antisentido. Dos moleculas estan “operativamente unidas” si estan unidas directa (por ejemplo, una protema de fusion) o indirectamente (por ejemplo, a traves de un enlazador).
Como se usa en el presente documento, el termino “expresion” se refiere a la transcripcion de ARN (por ejemplo, ARNm) a partir de un molde de acido nucleico y/o la traduccion de ARNm a un polipeptido. El termino “expresion aumentada” se pretende que incluya una alteracion en la expresion genica a nivel de produccion aumentada de ARNm y/o a nivel de expresion del polipeptido, que en general produce una cantidad aumentada de un producto genico o protema. En algunos casos, “expresion aumentada” se usa de forma intercambiable con el termino “sobreexpresion” o “sobreexpresado”.
Un “marcador de seleccion” es un gen, cuya expresion crea un fenotipo detectable y que facilita la deteccion de las celulas huesped que contienen un plasmido que tiene el marcador de seleccion. Ejemplos no limitantes de marcadores de seleccion incluyen genes de resistencia a farmacos y marcadores nutricionales. Por ejemplo, el marcador de seleccion puede ser un gen que confiere resistencia a un antibiotico seleccionado del grupo que consiste en: ampicilina, kanamicina, eritromicina, cloranfenicol, gentamicina, kasugamicina, rifampicina, espectinomicina, D-cicloserina, acido nalidfxico, estreptomicina o tetraciclina. Otros ejemplos no limitantes de marcadores de seleccion incluyen adenosina desaminasa, aminoglucosido fosfotransferasa, dihidrofolato reductasa, higromicina-B-fosfotransferasa, timidina quinasa y xantina-guanina fosforribosiltransferasa. Un unico plasmido puede comprender uno o mas marcadores de seleccion.
Como se usan en el presente documento, los terminos “tratar” o “tratamiento” se refieren tanto al tratamiento terapeutico como a medidas profilacticas o preventivas, en donde el objeto es prevenir o ralentizar (reducir) un cambio fisiologico o trastorno no deseado, tal como el desarrollo o extension del cancer. Los resultados clmicos beneficiosos o deseados incluyen, pero no estan limitados a, mejora de smtomas, disminucion de la extension de la enfermedad, enfermedad estabilizada (es decir, sin empeoramiento), retraso o disminucion de la evolucion de la enfermedad, mejora o paliacion de la enfermedad, y remision (parcial o total), ya sean detectables o indetectables. “Tratamiento” tambien puede significar prolongar la supervivencia comparada con la supervivencia esperada si no se
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recibe tratamiento. Esos en necesidad de tratamiento incluyen los que ya tienen la afeccion o trastorno, asf como los propensos a tener la afeccion o trastorno o esos en los que se debe prevenir la afeccion o trastorno.
Mediante “sujeto” o “individuo” o “animal” o “paciente” o “mairnfero” se quiere decir cualquier sujeto, en particular un sujeto mamffero, para el que se desea diagnostico, pronostico o terapia. Los sujetos mamfferos incluyen seres humanos, animales domesticos, animales de granja y animales de zoo, deporte o mascotas tales como perros, gatos, cobayas, conejos, ratas, ratones, caballos, ganado, vacas, etcetera.
II. Secuencias inductoras de cuerpos proteicos (PBIS) recombinantes
Las secuencias inductoras de cuerpos proteicos (PBIS) son secuencias polipeptfdicas que son capaces de mediar la formacion de cuerpos proteicos o RPBLA, que se describen en mas detalle posteriormente, en una celula diferente de tejido de endospermo. La capacidad de una PBIS candidata para mediar la formacion de RPBLA se puede determinar usando tecnicas disponibles para el experto en la materia tales como: (i) deteccion de agregados fluorescentes mediante expresion de una protema de fusion de la PBIS candidata y una protema fluorescente en celulas vegetales como se describe en el ejemplo 1 de la presente invencion; (ii) deteccion de agregados que tienen una densidad de aproximadamente 1,175 hasta aproximadamente 1,194 mediante fraccionamiento de extractos vegetales que expresan la PBIS candidata en un gradiente de densidad como se describe en el ejemplo 2 de la presente invencion; (iii) identificacion de la PBIS candidata mediante inmunotransferencia en el sedimento despues de centrifugacion a baja velocidad (tfpicamente a 10.000 x g durante 30 minutos a 4°C) como se describe en el ejemplo 3 de la presente invencion.
Se ha identificado una PBIS natural en la protema de mafz gamma zema y se describe en mas detalle en la patente de EE UU No. 7.575.898, solicitud publicada de EE UU No. 2006/0121573, solicitud publicada de EE UU No. 2006/0123509 y solicitud publicada de EE UU No. 2007/0243198.
Sorprendentemente, se han identificado PBIS que median la formacion de ensamblajes recombinantes similares a cuerpos proteicos (RPBLA) con propiedades mejoradas y se describen en el presente documento. En algunas formas de realizacion, la PBIS recombinante comprende una estructura poliprolina II (PPII). En algunas formas de realizacion, la PBIS recombinante comprende una secuencia rica en prolina.
En un primer aspecto, la invencion se refiere a una secuencia polipeptfdica inductora de cuerpos proteicos (PBIS) recombinante que comprende
(i) una estructura poliprolina II (PPII) que tiene al menos 36 aminoacidos de longitud;
en donde la estructura PPII se localiza entre al menos dos cistemas en el extremo N y al menos dos cistemas en el extremo C;
en donde no mas del 10% de los aminoacidos en la estructura PPII son lisina o arginina; y
en donde la estructura PPII es una secuencia no anfipatica y comprende al menos una repeticion seleccionada del grupo que consiste en PPPVAL (SEQ ID NO:16), PPPVTL (SEQ ID NO:20), PPPVSL (SEQ ID NO:36), PPPVVL (SEQ ID NO:37) y PPPVLL (SEQ ID NO:17), o
(ii) una secuencia rica en prolina que tiene al menos 36 aminoacidos de longitud;
en donde la secuencia rica en prolina se localiza entre al menos dos cistemas en el extremo N y al menos dos cistemas en el extremo C;
en donde no mas del 10% de los aminoacidos en la secuencia rica en prolina son lisina o arginina; y en donde la secuencia rica en prolina es una secuencia no anfipatica y comprende al menos una repeticion seleccionada del grupo que consiste en PPPVAL (SEQ ID NO:16), PPPVTL (SEQ ID NO:20), PPPVSL (SEQ ID NO:36), PPPVVL (SEQ ID NO:37) y PPPVLL (SEQ ID NO:17).
En una divulgacion preferida, la estructura PPII no consiste en la secuencia P4 como se describe en el documento W02004003207 y que tiene la secuencia QPPPPVHLPPPPCHYPTQPPRPQPHPQPHP (SEQ ID NO:130).
En una divulgacion preferida, la estructura PPII no contiene la secuencia (PPPVHL)6PPPVHVPPPVHL (SEQ ID NO: 2) o no contiene la secuencia (PPPVHL)6PPPVHVPPPVHLPPPPCH (SEQ ID NO: 3).
En una forma de realizacion preferida, la estructura PPII tiene al menos 37, al menos 38, al menos 39 o al menos 40 aminoacidos. En otra forma de realizacion, la estructura PPII no contiene residuos de cistema. En aun otra forma de realizacion, la estructura PPII no contiene mas del 10% de residuos de histidina.
En una divulgacion preferida, la secuencia rica en prolina no consiste en la PBIS de la secuencia P4 como se describe en el documento W02004003207 y que tiene la secuencia QPPPPVHLPPPPCHYPTQPPRPQPHPQPHP (SEQ ID NO:130).
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En una divulgacion preferida, la secuencia rica en prolina no contiene la secuencia (PPPVHL)6PPPVHVPPPVHL (SEQ ID NO: 2) o no contiene la secuencia (PPPVHL)aPPPVHVPPPVHLPPPPCH (SEQ ID NO: 3).
En una forma de realizacion preferida, region rica en prolina tiene al menos 37, al menos 38, al menos 39 o al menos 40 aminoacidos. En otra forma de realizacion, la region rica en prolina no contiene residuos de cistema. En aun otra forma de realizacion, la region rica en prolina no contiene mas del 10% de residuos de histidina o no consiste en la PBIS de la secuencia P4 como se describe en el documento WO2004003207 y que tiene la secuencia QPPPPVHLPPPPCHYPTQPPRPQPHPQPHP (SEQ ID NO:130).
En algunas formas de realizacion, la PBIS recombinante comprende una estructura PPII entre al menos dos cistemas en el extremo N y al menos dos cistemas en el extremo C y comprende ademas una cistema adicional y una secuencia rica en prolina entre la estructura PPII y las dos cistemas C-terminales.
En algunas formas de realizacion, la PBIS recombinante comprende una primera secuencia rica en prolina entre al menos dos cistemas en el extremo N y al menos dos cistemas en el extremo C y comprende ademas una cistema adicional y una segunda secuencia rica en prolina entre la primera secuencia rica en prolina y las dos cistemas C- terminales.
No mas de aproximadamente el 10% de los aminoacidos en la estructura PPII o en la secuencia rica en prolina de la PBIS de la invencion son lisina o arginina. En algunas formas de realizacion, no mas de aproximadamente el 9%, aproximadamente el 8%, aproximadamente el 7%, aproximadamente el 6%, aproximadamente el 5%,
aproximadamente el 4%, aproximadamente el 3%, aproximadamente el 2% o aproximadamente el 1% de los aminoacidos en la estructura PPII o la secuencia rica en prolina son lisina o arginina. En algunas divulgaciones, la estructura PPII o la secuencia rica en prolina no contiene lisina. En algunas divulgaciones, la estructura PPII o la secuencia rica en prolina no contiene arginina. En algunas divulgaciones, la estructura PPII o la secuencia rica en prolina no contiene lisina ni arginina.
En algunas divulgaciones, no mas de aproximadamente el 15% de los aminoacidos en la estructura PPII o la secuencia rica en prolina son histidina. En algunas divulgaciones, no mas de aproximadamente el 14%,
aproximadamente el 13%, aproximadamente el 12%, aproximadamente el 11%, aproximadamente el 10%,
aproximadamente el 9%, aproximadamente el 8%, aproximadamente el 7%, aproximadamente el 6%,
aproximadamente el 5%, aproximadamente el 4%, aproximadamente el 3%, aproximadamente el 2% o aproximadamente el 1% de los aminoacidos en la estructura PPII o la secuencia rica en prolina son histidina. En algunas divulgaciones, la estructura PPII o la secuencia rica en prolina no contiene histidina.
En algunas divulgaciones, la estructura PPII o la secuencia rica en prolina no contiene la secuencia (PPPVHL)6PPPVHVPPPVHL (SEQ ID NO: 2). En algunas divulgaciones, la estructura PPII o la secuencia rica en prolina no contiene la secuencia (PPPVHL)6PPPVHVPPPPVHLPCH (SEQ ID NO: 3). En algunas divulgaciones, la estructura PPII o la secuencia rica en prolina no contiene la secuencia PPPVHL (SEQ ID NO: 4).
En algunas formas de realizacion, la PBIS recombinante es capaz de mediar la formacion de un RPBLA cuando se expresa a una concentracion minima particular. De esta manera, en algunas formas de realizacion, la PBIS recombinante es capaz de mediar la formacion de un RPBLA cuando se expresa a aproximadamente 0,5 gramos/kilogramo de peso fresco de hojas de tabaco.
La capacidad de una secuencia recombinante de funcionar como una PBIS se puede probar segun metodos descritos en el presente documento u otros metodos conocidos en la tecnica.
IN. Estructuras de poliprolina II y secuencias ricas en prolina
Como se ha descrito anteriormente, la PBIS recombinante usada en el presente documento puede comprender una estructura de poliprolina de tipo II (PPII).
El termino “poliprolina II” o “PPII” como se usa en el presente documento, se refiere a un tipo de estructura proteica secundaria helicoidal. Las caractensticas particulares de estructura PPII ejemplares se han descrito, por ejemplo, por Eisenberg et al., J. Mol. Biol. 179: 125-142 (1984), Bicudo et al (2008, Biopolymers, 89:175-178) Fernandez- Carneado, J. Mol. Biol. 372: 708-22 (2004); Bochicchio and Tamburro, Chirality 14:782-92 (2002); Knighton et al. Science 253: 414-420 (1991); y Caldwell et al. Biopolymers 10:1891-1904 (1984.
Una helice PPII es una estructura proteica secundaria. Es una estructura helicoidal a la izquierda con una forma global que recuerda un prisma triangular. Puede estar bastante extendida con un paso helicoidal de 9,3 A/giro, 3 residuos por giro y los angulos O y ^ centrados aproximadamente a -75° y 145°, respectivamente.
La estructura PPII se ha descrito en la bibliograffa (vease, por ejemplo, Eisenberg D, et al. J. Mol. Biol. 179:125-142 (1984). Los residuos de prolina estan muy favorecidos en las helices PPII. Glicina y tirosina en general estan
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desfavorecidas, pero se encuentran en algunas estructuras PPII tal como colageno. El analisis conformacional de peptidos sinteticos de secuencias repetitivas donde la histidina de gamma zema se sustituyo por Ala, Glu y Lys indica que todos estos peptidos adoptaban una estructura de tipo PPII. Por tanto, la conformacion PPII se adopta independientemente tanto del signo de la carga en el aminoacido cargado (Lys o Glu) como de que el residuo este cargado o sin cargar (Ala). Dalcol, J. Org. Chem 61:6775-6782 (1996). La longitud de la secuencia repetitiva, pH acido y altas concentraciones de peptido aumentan el contenido en PPII. A pH 3,0 hay mas contenido en PPII que a pH 7,0, excepto cuando la histidina se sustituyo por acido glutamico. En este caso, la desestabilizacion de PPII probablemente es debida a la protonacion de los grupos carboxilo del acido glutamico a pH 3 y las posteriores interacciones cadena lateral-cadena lateral por puentes de hidrogeno (Dalcol, 1996).
La estructura PPII es un rasgo dinamico de una protema. Bicudo y col (2008, Biopolimers, 89:175-178) analizaron la estructura secundaria de gamma zema purificada de PB de mafz mediante dicrofsmo circular cuando se solubilizaba en agua, SDS y 2-propanol, con y sin agente reductor. La conformacion PPII era solo el 1% en SDS, el 4% en propanol y aproximadamente el 7% en agua. Considerando que el RD representa el 22% de la secuencia total de gamma zema, estos resultados indican que al menos el 30% de este dominio adoptara una estructura PPII en agua. Fernandez-Carneado, J. Mol. Biol. 372: 708-22 (2004); Bicudo, 2007. Ademas, el nivel de PPII puede aumentar mucho mediante las interacciones zema-zema que producen el ensamblaje de protemas y la formacion de PB. Por tanto, se considera que los polipeptidos tienen estructura PPII si tienen propension a formar la estructura PPII.
Los metodos para determinar si una secuencia forma una estructura PPII tambien son conocidos. Por ejemplo, se pueden usar espectroscopfas basadas en actividad optica, tales como dicrofsmo circular (DC), dicrofsmo circular vibratorio (DCV) y actividad optica de Raman (AOR). Vease, por ejemplo, Bochicchio y Tamburro, Chirality 14:78292 (2002). Ademas, la estructura PPII en protemas cristalizadas se puede determinar mediante difraccion de rayos X Knighton et al. Science; 253:414-420 (1991); Caldwell et al. Biopolymers; 10:1891-1904 (1984). El DC es muy sensible a la estructura secundaria. Por tanto, en algunas divulgaciones, el metodo de determinar la estructura PPII es DC. Los espectros de DC de un peptido de aproximadamente 30 a 100 aminoacidos de longitud se puede determinar a aproximadamente pH 7 y a aproximadamente 5°C. La presencia de estructura PPII se puede caracterizar por un patron de DC con un mmimo a aproximadamente A=202 nm y un maximo a aproximadamente A=228 nm. El porcentaje de estructura PPII en un peptido muestra se determinara por la proporcion de las magnitudes [0max]M (la elipticidad molar en el maximo aproximadamente A=228 nm) del peptido muestra comparado con un peptido de referencia H-(Pro)n-OH. Se puede considerar que el peptido de referencia, que tiene una longitud similar al peptido muestra, tiene el 100% de estructura PPII. Se encuentra una descripcion mas detallada del metodo basado en el espectro de DC en Dalcol et al. Org. Chem. 61: 6675-6782 (1996).
Por ejemplo, un peptido poliprolina (H-(Pro)n-OH) se puede considerar como la referencia, y se puede considerar que forma el 100% de helice PPII. En algunas formas de realizacion, la [0max]M de la estructura PPII es al menos
aproximadamente el 25%, al menos aproximadamente el 30%, al menos aproximadamente el 40%, al menos
aproximadamente el 55%, al menos aproximadamente el 60%, al menos aproximadamente el 65%, al menos
aproximadamente el 70%, al menos aproximadamente el 75%, al menos aproximadamente el 80%, al menos
aproximadamente el 85%, al menos aproximadamente el 90%, al menos aproximadamente el 95%, o el 100% de la [0max]M del polipeptido de referencia (H-(Pro)n-OH).
Como se ha descrito anteriormente, la PBIS recombinante puede comprender una secuencia rica en prolina. En algunas divulgaciones, la estructura PPII comprende una secuencia rica en prolina. En algunas divulgaciones, la PBIS recombinante comprende una estructura PPII y una secuencia rica en prolina que no tiene propension a formar una helice PPII. En algunas divulgaciones, una secuencia rica en prolina es capaz de formar una estructura PPII.
El termino “region rica en prolina”, como se usa en el presente documento, se refiere a una secuencia polipeptfdica que contiene una proporcion relativamente alta de prolinas. En algunas divulgaciones, la region rica en prolina comprende al menos el 40%, al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99% o al menos el 100% de prolinas.
En algunas divulgaciones, la estructura PPII o la secuencia rica en prolina tiene al menos 30 aminoacidos de longitud. En algunas divulgaciones, la estructura PPII o la secuencia rica en prolina tiene al menos 38, al menos 40, al menos 42, al menos 44, al menos 46 o al menos 48 aminoacidos de longitud.
En algunas formas de realizacion, la estructura PPII o la secuencia rica en prolina tiene no mas de 100, no mas de 98, no mas de 96, no mas de 94, no mas de 92, no mas 90, no mas de 88, no mas de 86, no mas de 84, no mas de 82, no mas de 80, no mas de 78, no mas de 76, no mas de 74, no mas de 72, no mas de 70, no mas de 68, no mas de 66, no mas de 64, no mas de 62, no mas 60, no mas de 58, no mas de 56, no mas de 54 o no mas de 52 aminoacidos de longitud.
En algunas formas de realizacion, la estructura PPII o la secuencia rica en prolina tiene desde aproximadamente 36 hasta aproximadamente 100 aminoacidos, desde aproximadamente 36 hasta aproximadamente 90, desde
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aproximadamente 36 hasta aproximadamente 80 o desde aproximadamente 36 hasta aproximadamente 70 aminoacidos de longitud. En algunas formas de realizacion, la estructura PPII o la secuencia rica en prolina tiene desde aproximadamente 42 hasta aproximadamente 100 aminoacidos, desde aproximadamente 42 hasta aproximadamente 90, desde aproximadamente 42 hasta aproximadamente 80 o desde aproximadamente 42 hasta aproximadamente 70 aminoacidos de longitud. En algunas formas de realizacion, la estructura PPII o la secuencia rica en prolina tiene desde aproximadamente 48 hasta aproximadamente 100 aminoacidos, desde aproximadamente 48 hasta aproximadamente 90, desde aproximadamente 48 hasta aproximadamente 80 o desde aproximadamente 48 hasta aproximadamente 48 aminoacidos de longitud.
En algunas formas de realizacion, la estructura PPII o la secuencia rica en prolina comprende al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14 o al menos 15 repeticiones PX. En algunas divulgaciones, al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14 o al menos 15 de las repeticiones PX son repeticiones consecutivas. En algunas divulgaciones, al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14 o al menos 15 de las repeticiones PX son homomericas. En algunas divulgaciones, al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14 o al menos 15 de las repeticiones PX son heteromericas.
En algunas divulgaciones, la estructura PPII o la secuencia rica en prolina comprende al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14 o al menos 15 repeticiones de 3 aminoacidos (por ejemplo, PPX, PXP, XPP o PXX). En algunas divulgaciones, al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14 o al menos 15 de las repeticiones de 3 aminoacidos son repeticiones consecutivas. En algunas divulgaciones, al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14 o al menos 15 de las repeticiones de 3 aminoacidos son repeticiones homomericas. En algunas divulgaciones, al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14 o al menos 15 de las repeticiones de 3 aminoacidos son repeticiones heteromericas.
En algunas divulgaciones, la estructura PPII o la secuencia rica en prolina comprende al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14 o al menos 15 repeticiones de 4 aminoacidos (por ejemplo, PPPX (SEQ ID NO:119), PPXX (SEQ ID NO:117), PXXX (SEQ ID NO:137), PPXP (SEQ ID NO:138), PXPP (SEQ ID NO:139)). En algunas divulgaciones, al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14 o al menos 15 de las repeticiones de 4 aminoacidos son repeticiones consecutivas. En algunas divulgaciones, al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14 o al menos 15 de las repeticiones de 4 aminoacidos son repeticiones homomericas. En algunas divulgaciones, al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14 o al menos 15 de las repeticiones de 4 aminoacidos son repeticiones heteromericas.
En algunas divulgaciones, la estructura PPII o la secuencia rica en prolina comprende al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14 o al menos 15 repeticiones de 5 aminoacidos (por ejemplo, PPPXX (SEQ ID NO:140)). En algunas divulgaciones, al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14 o al menos 15 de las repeticiones de 5 aminoacidos son repeticiones consecutivas. En algunas divulgaciones, al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14 o al menos 15 de las repeticiones de 5 aminoacidos son repeticiones homomericas. En algunas divulgaciones, al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14 o al menos 15 de las repeticiones de 5 aminoacidos son repeticiones heteromericas.
En algunas divulgaciones, la estructura PPII o la secuencia rica en prolina comprende al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14 o al menos 15 repeticiones de 6 aminoacidos (por ejemplo, PPPXXX (SEQ ID NO:116) o PPPXPX (SEQ ID NO:141)). En algunas divulgaciones, al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14 o al menos 15 de las repeticiones de 6 aminoacidos son repeticiones consecutivas. En algunas divulgaciones, al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14 o al menos 15 de las repeticiones de 6 aminoacidos son repeticiones
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En algunas divulgaciones, la estructura PPII o la region rica en prolina son moleculas anfipaticas.
Una molecula anfipatica es una molecula que tiene una region con caracter hidrofobico significativamente mayor comparado con el resto de la molecula, que es hidrofobica en comparacion con esa region. El caracter hidrofobico o hidrofflico de una molecula o region de la misma tiene un efecto importante en su comportamiento con respecto al medio circundante. Las superficies hidrofobicas tienden a evitar interaccion con medios acuosos, mientras que las superficies hidrofflicas estan estabilizadas por los mismos. Puesto que una protema es una estructura tridimensional, solo algunos de sus residuos de aminoacidos estan expuestos al medio. Como consecuencia, solo los aminoacidos localizados en la superficie, por tanto, expuestos al medio, se deben considerar al determinar si una protema o region proteica es de caracter hidrofobica, hidrofflica o anfipatica.
Como se ha mencionado en el presente documento, la estructura PPII es una helice a la izquierda extendida con tres aminoacidos por giro. Cada giro individual se puede representar como un triangulo (por ejemplo, figura 1A) con cada uno de los 3 aminoacidos en un giro colocados en uno de los vertices del triangulo en un orden en sentido de las agujas del reloj. Como resultado, el apilado de triangulos consecutivos (giros) de la estructura PPII generara un prisma triangular que representa la estructura entera de la protema o region proteica. En una helice PPII, los aminoacidos se estan colocados en los bordes del prisma triangular estan expuestos al medio y todos se deben considerar en determinaciones hidrofobico/hidrofflico. Una estructura PPII se puede considerar anfipatica cuando uno de los bordes del prisma triangular tiene un caracter hidrofobico significativamente diferente con respecto a los otros dos bordes considerados independientemente.
El caracter hidrofobico/hidrofflico de los aminoacidos se determina por la naturaleza de su cadena lateral. La escala de hidrofobicidad de Kyte-Doolittle (Kyte J., Doolittle R.F., J. Mol. Biol. 157:105-132(1982)) se deriva de las propiedades fisicoqmmicas de las cadenas laterales de los aminoacidos, y es comunmente usada y bien aceptada. Los aminoacidos se clasificaran en tres grupos basados en valores de Kyte-Doolittle: (i) aminoacidos que vaffan de 4,5 a 1,8 que se consideraran como no polares o hidrofobicos (I, V, L, F, C, M y A), (ii) aminoacidos que vaffan de - 0,4 a -1,6 que se consideraran parcialmente polares o parcialmente hidrofflicos (G, S, T, W, Y y P) y aminoacidos que vaffan de -3,2 a -4,5 que se consideraran como polares o hidrofflicos (R, H, D, E, N, Q y K). Entre los aminoacidos del grupo polar, se pueden encontrar aminoacidos que estan positivamente cargados (R, H y K), negativamente cargados (D y E) y no cargados (Q y N). Para simplificar el calculo de la hidrofobicidad de una helice PPII, se ha asignado un valor de polaridad consenso considerando esta clasificacion: (i) 0 para aminoacidos no polares, (ii) 0,5 para aminoacidos parcialmente polares, y (iii) 1 para aminoacidos polares.
El caracter anfipatico de una estructura PPII se puede calcular considerando la clasificacion de aminoacidos descrita en el presente documento en el contexto de la distribucion espacial de aminoacidos en el prisma triangular. El porcentaje de aminoacidos hidrofflicos se puede calcular para cada borde (borde 1: i, i+4, i+7 borde 2: i+1, i+5, i+8 ...; borde 3: i+2, i+6, i+9 ...), y la estructura PPII se puede considerar anfipatica cuando la diferencia del porcentaje de uno de los bordes es al menos aproximadamente 35 con respecto a los otros dos bordes considerados independientemente.
Por tanto, puesto que cada tercer residuo en la estructura PPII esta alineado a lo largo de un lado de la helice, si la hidrofobicidad de los residuos a lo largo de un lado de la helice es diferente de la hidrofobicidad de los residuos a lo largo de otro lado de la helice, la helice PPII sera anfipatica. La helice PPII del RD de gamma zema tiene un caracter anfipatico marcado. Con 3,0 residuos por giro, los residuos de valina y leucina de gamma zema se alinean en el mismo lado de la helice (borde 1 y 2, respectivamente) mientras que los residuos polares de histidina, que estan cargados se alinean en el lado opuesto (borde 3). Esta anfipaticidad esta claramente senalada por el calculo mencionado justo antes, donde el porcentaje de aminoacidos hidrofflicos es 29,4, 29,4 y 78,1 en el borde 1, 2, y 3, respectivamente (vease la tabla 1).
Tabla 1: Valores de anfipaticidad de las PBIS segun la invencion o divulgadas en el presente documento
grupos PPII
PBIS residuos* % de prolina % de identidad** Polaridad de los bordes*** Diferencia en polaridad en los bordes**** carga neta
Anfipaticos positivamente cargados
RX3 11-63 54,7 100 (29,4/29,4/78,1) (0/48,7/48,7) +8
RX3(K)
11-63 54,7 84,9 (29,4/29,4/78,1) (0/48,7/48,7) +8
RX3(R)
11-63 54,7 84,9 (29,4/29,4/78,1) (0/48,7/48,7) +8
Anfipaticos negativamente cargados
RX3(D) 11-63 54,7 84,9 (29,4/29,4/78,1) (0/48,7/48,7) -8
RX3(E)
11-63 54,7 84,9 (29,4/29,4/78,1) (0/48,7/48,7) -8
Anfipaticos no cargados
RX3(N) 11-63 54,7 84,9 (29,4/29,4/78,1) (0/48,7/48,7) 0
RX3(Q)
11-63 54,7 84,9 (29,4/29,4/78,1) (0/48,7/48,7) 0
No anfipaticos
RX3(A) 11-63 54,7 86,8 (29,4/29,4/34,4) (0/5/5) + 1
RX3(A)2
11-63 54,7 84,9 (29,4/29,4/28,1) (0/1,3/1,3) 0
RX3(A3)
11-63 54,7 54,7 (29,4/29,4/28,1) (0/1,3/1,3) 0
RX3(L)
11-63 54,7 84,9 (29,4/29,4/28,1) (0/1,3/1,3) 0
RX3(V)
11-63 54,7 84,9 (29,4/29,4/28,1) (0/1,3/1,3) 0
RX3(T)
11-63 54,7 84,9 (29,4/29,4/53,1) (0/23,7/23,7) 0
PP
11-63 96,2 58,5 (50/52,9/56,3) (0/1,3/1,3) + 1
PP3
11-63 100 54,7 (50/50/50) (0/0/0) 0
PA
11-63 66 58,5 (29,4/29,4/56,7) (0/27,3/27,3) + 1
PA2
11-63 67,9 54,7 (29,4/29,4/53,1) (0/23,7/23,7) 0
Z(Col)
11-63 39,6 38,6 (52,9/52,9/56,3) (0/3,4/3,4) +1
Z(Col2)
11-56 36,9 27,8 (50/50/50) (0/0/0) 0
Z(Adh)
11-63 39,6 35,8 (64,7/61,8/50) (2,9/14,7/11,8) -5
Z(Adh2)
11-56 39,6 27,8 (68,8/65,6/46,7) (4,4/22,1/18,9) -6
* Residuos usados en el analisis (posicion relativa con respecto al extremo N de la proteina madura
** % de aminoacidos identicos tomando RX3 como referenda
*** Porcentaje de aminoacidos polares en el borde 1,2 y 3 de la representacion de prisma triangular de la estructura PPII
**** Diferencias en el porcentaje de aminoacidos polares entre los bordes del prisma triangular de la representacion de prisma triangular de la estructura PPII (borde 1 frente a borde 2, borde 1 frente a borde 3 y borde 2 frente a borde 3)
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En algunas divulgaciones, la estructura PPII o la secuencia rica en prolina es anfipatica y esta cargada negativamente. En algunas divulgaciones, la estructura PPII o la secuencia rica en prolina es anfipatica y no cargada. La estructura PPII o secuencia rica en prolina es no anfipatica.
En algunas formas de realizacion, el porcentaje de prolinas a lo largo de la longitud de la estructura PPII o la secuencia rica en prolina es consistente. Por tanto, por ejemplo, en algunas formas de realizacion, ventanas de 10 aminoacidos a traves de la estructura PPII o secuencia rica en prolina se diferencian en el porcentaje en prolina en no mas de aproximadamente el 50%, aproximadamente el 45%, aproximadamente el 35%, aproximadamente el 30%, aproximadamente el 25%, aproximadamente el 20%, aproximadamente el 15%, aproximadamente el 10%, o aproximadamente el 5%.
En algunas formas de realizacion, los aminoacidos prolina presentes en la estructura PPII o la secuencia rica en prolina pueden estar hidroxilados dando hidroxiprolina (por ejemplo, (2S,4R)-4-hidroxiprolina o L-hidroxiprolina (C5H9O3N)). Esta es una modificacion postraduccional comun de prolina que se diferencia solo por la presencia de un grupo hidroxilo (OH) unido al atomo de carbono gamma de prolina. Hidroxiprolina esta presente en secuencias ricas en prolina tal como colageno. Por ejemplo, en la triada canonica GXY (donde X e Y son independientemente cualquier aminoacido), una prolina que ocupa la posicion Yaa puede estar hidroxilada. Las hidroxiprolinas no interfieren con la formacion de helice PPII.
En algunas divulgaciones, la estructura PPII o la secuencia rica en prolina comprende una secuencia relacionada con colageno. Por tanto, en algunas divulgaciones, la estructura PPII o la secuencia rica en prolina comprende la secuencia (GXY)n, en donde n es al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 12, al menos 14, al menos 16, al menos 18 o al menos 20. En algunas divulgaciones, la secuencia que comprende (GXY)n comprende al menos aproximadamente el 30% de prolinas.
La estructura PPII o la secuencia rica en prolina tiene al menos 36 aminoacidos de longitud. La PBIS recombinante comprende al menos dos cistemas en el extremo amino (extremo N) de la estructura PPII o la secuencia rica en prolina (es decir, dos cistemas antes de la estructura PPII o la region rica en prolina). La PBIS recombinante comprende al menos dos cistemas en el extremo carboxi (extremo C) de la estructura PPII o la secuencia rica en prolina (es decir, dos cistemas despues de la estructura PPII o la region rica en prolina).
En algunas formas de realizacion, al menos aproximadamente el 95%, aproximadamente el 90%, aproximadamente el 85%, aproximadamente el 80%, aproximadamente el 75%, aproximadamente el 70%, aproximadamente el 65%, aproximadamente el 60%, aproximadamente el 55% o aproximadamente el 50% de PBIS muestra estructura de poliprolina II.
Como se ha descrito anteriormente, la PBIS recombinante puede comprender una secuencia rica en prolina. En algunas formas de realizacion, la estructura PPII comprende una secuencia rica en prolina. En algunas formas de realizacion, la PBIS recombinante comprende una estructura PPII y una secuencia rica en prolina que no es propensa a formar una helice PPII.
Puesto que cada tercer residuo en la estructura PPII se alinea en un lado de la helice, si la hidrofobicidad de los residuos en un lado de la helice es diferente de la hidrofobicidad de los residuos en el otro lado de la helice, la helice PPII sera anfipatica. La helice PPII del RD de gamma zema tiene un marcado caracter anfipatico. Con 3 residuos por giro, los residuos de valina y leucina de la gamma zema se alinean en el mismo lado de la helice mientras que los residuos polares de histidina, que estan cargados dependiendo del pH, se alinean en el lado opuesto.
En algunas divulgaciones, la estructura PPII o la secuencia rica en prolina comprende una repeticion rica en prolina. Como se ha descrito, una repeticion rica en prolina es una secuencia que comprende al menos dos copias de una secuencia que comprende prolina. La repeticion puede tener al menos dos aminoacidos de longitud (por ejemplo, PX), al menos tres aminoacidos de longitud (por ejemplo, PPX, PXP, XPP o PXX), al menos cuatro aminoacidos de longitud (por ejemplo, PPPX (SEQ ID NO:5), PPXX (SEQ ID NO:6), PXXX (SEQ ID NO:7), PPXP (SEQ ID NO:8), PXPP (sEq iD nO:65)), al menos cinco aminoacidos de longitud (por ejemplo, PPPXX (SEQ ID NO:9)), al menos seis aminoacidos de longitud (por ejemplo, PPPXXX (SEQ ID NO:10) o PpPxPX (SEQ ID NO:11)), al menos siete aminoacidos de longitud, al menos ocho aminoacidos de longitud, al menos nueve aminoacidos de longitud o al menos diez aminoacidos de longitud. Las repeticiones enumeradas aqrn se proporcionan solo a modo de ejemplo.
La repeticion rica en prolina puede comprender al menos dos copias, al menos tres copias, al menos cuatro copias, al menos cinco copias, al menos seis copias, al menos siete copias, al menos ocho copias, al menos nueve copias o al menos diez copias de una secuencia que contiene prolina. La repeticion rica en prolina puede contener todas las copias de la misma repeticion (es decir, una repeticion rica en prolina homomerica) o puede contener una combinacion de repeticiones ricas en prolina (es decir, una repeticion rica en prolina heteromerica). A modo de ejemplo, la secuencia PPPAAAPPPAAAPPPAAA (SEQ ID NO:12) es una repeticion rica en prolina homomerica que contiene tres copias de la misma repeticion PPPAAA (SEQ ID NO:13) y la secuencia PPPAAAPPPAAAPPAPPPPPAPPP (SEQ ID NO: 14) es una repeticion rica en prolina heteromerica que contiene
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dos copias de una secuencia, PPPAAA (SEQ ID NO:13) y dos copias de una secuencia diferente, PPAPPP (SEQ ID NO:15).
Algunas estructuras PPII o secuencias ricas en prolina de la invencion consisten esencialmente en aminoacidos seleccionados del grupo que consiste en (i) prolina, (ii) valina, (iii) leucina y (iv) alanina. En algunas divulgaciones, la estructura PPII o la secuencia rica en prolina consisten esencialmente en aminoacidos seleccionados del grupo que consiste en (i) prolina, (ii) valina, (iii) leucina, (iv) acido aspartico y (v) glutamina. En algunas divulgaciones, la estructura PPII o la secuencia rica en prolina consisten esencialmente en aminoacidos seleccionados del grupo que consiste en (i) prolina, (ii) valina, (iii) leucina, (iv) treonina, (v) asparragina y (vi) glutamina. En algunas divulgaciones, la estructura PPII o la secuencia rica en prolina consiste esencialmente en aminoacidos seleccionados del grupo que consiste en (i) prolina, (ii) aminoacidos cargados negativamente (es decir, D y E), (iii) aminoacidos con cadenas laterales polares sin carga (es decir, N y Q), (iv) aminoacidos con cadenas laterales no cargadas parcialmente polares (es decir, S, T, W, Y y G) o con aminoacidos con cadenas laterales no cargadas parcialmente polares (es decir, S, T, y G), (v) aminoacidos con cadenas laterales hidrofobicas (es decir, A, I, L, M, F, y V) o con aminoacidos con cadenas laterales hidrofobicas (es decir, A, I, L, M y V). En algunas divulgaciones, la estructura PPII o la secuencia rica en prolina consiste esencialmente en aminoacidos seleccionados del grupo que consiste en (i) prolina y (ii) alanina.
En algunas formas de realizacion, al menos aproximadamente el 40% de los aminoacidos en la estructura PPII o la secuencia rica en prolina son prolina. En algunas formas de realizacion, al menos aproximadamente el 45%, al menos aproximadamente el 50%, al menos aproximadamente el 55%, al menos aproximadamente el 60%, al menos aproximadamente el 65%, al menos aproximadamente el 70%, al menos aproximadamente el 75%, al menos
aproximadamente el 80%, al menos aproximadamente el 85%, al menos aproximadamente el 90%, al menos
aproximadamente el 95% o el 100% de los aminoacidos en la estructura PPII o la secuencia rica en prolina son prolina.
En algunas divulgaciones, no mas de aproximadamente el 95%, aproximadamente el 90%, aproximadamente el 85%, aproximadamente el 80%, aproximadamente el 75%, aproximadamente el 70%, aproximadamente el 65%, aproximadamente el 60%, aproximadamente el 55% o aproximadamente el 50% de los aminoacidos en la estructura PPII o la secuencia rica en prolina son prolina.
La estructura PPII o la secuencia rica en prolina es no anfipatica. En algunas divulgaciones, la estructura PPII o la
secuencia rica en prolina es anfipatica y negativamente cargada. En algunas divulgaciones, la estructura PPII o la
secuencia rica en prolina es anfipatica y no cargada.
En una divulgacion, la estructura PPII recombinante o la region rica en prolina comprende una secuencia anfipatica negativamente cargada. El termino “secuencia anfipatica negativamente cargada” se ha explicado anteriormente y se usa para referirse a estructuras PPII o regiones ricas en prolina que muestran una carga neta negativa calculada usando el metodo definido anteriormente. En una divulgacion aun mas preferida, la secuencia anfipatica negativamente cargada comprende al menos una repeticion que se selecciona independientemente del grupo que consiste en PPPVDL (SEQ ID NO: 19) y PPPVEL (SEQ ID NO: 18). En una divulgacion preferida, la secuencia anfipatica comprende una secuencia seleccionada de (PPPVEL)n, (sEq ID NO:18) y (PPPVDL)n, (SEQ ID NO:19) en donde n es 4, 5, 6, 7 o 8.
En aun otra divulgacion, la secuencia anfipatica cargada negativamente consiste esencialmente de la secuencia definida a continuacion:
PPPVELPPPP VELPPPVELP PPVELPPPVE LPPPVELPPP VEVPPPVELPPPP (SEQ ID NO:30),
PPPVELPPP VELPPPVELP PPVELPPPVE LPPPVELPPP VELPPPVELPPPP (SEQ ID NO:123),
PPPVDLPPP VDLPPPVDLP PPVDLPPPVD LPPPVDLPPP VDVPPPVDLPPPP (SEQ ID NO:124), y PPPVDLPPP VDLPPPVDLP PPVDLPPPVD LPPPVDLPPP VDLPPPVDLPPPP (SEQ ID NO:31).
En otra divulgacion, la estructura PPII o region rica en prolina que forma parte de la PBIS segun la invencion es una secuencia anfipatica no cargada. El termino “secuencia anfipatica no cargada” se refiere a una secuencia que tiene una carga neta de 0 y en donde los residuos en el borde 2 de la representacion en prisma triangular de la estructura PPII se seleccionan del grupo que consiste en Asn y Gln. En una divulgacion aun mas preferida, la secuencia anfipatica no cargada comprende la menos una repeticion que se selecciona independientemente del grupo PPPVNL (SEQ ID NO:21) y PPPVQL (SEQ ID NO:22). En una divulgacion aun mas preferida, la secuencia anfipatica no cargada comprende seis repeticiones en donde cada repeticion se selecciona independientemente del grupo de PPPVNL (SEQ ID NO:21) y PPPVQL (SEQ ID NO:22). En una divulgacion preferida, la PBIS comprende una secuencia seleccionada de (PPPVNL)n, (SeQ ID NO:21) y (PPPVQL)n, (SEQ ID NO:22) en donde n es 4, 5, 6, 7 o 8.
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En una divulgacion preferida, la secuencia anfipatica no cargada que forma parte de la estructura PPII o la region rica en prolina que forma parte de la PBIS se selecciona independientemente de una secuencia como se define a continuacion:
PPPVNLPPP VNLPPPVNLP PPVNLPPPVN LPPPVNLPPP VNVPPPVNLPPPP (SEQ ID NO:32), PPPVNLPPP VNLPPPVNLP PPVNLPPPVN LPPPVNLPPP VNLPPPVNLPPPP (SEQ ID NO:33), PPPVQLPPP VQLPPPVQLP PPVQLPPPVQ LPPPVQLPPP VQVPPPVQLPPPP (SEQ ID NO:34), y PPPVQLPPP VQLPPPVQLP PPVQLPPPVQ LPPPVQLPPP VQLPPPVQLPPPP (SEQ ID NO:35).
La estructura PPII o la region rica en prolina que forma parte de la PBIS segun la invencion es una secuencia no anfipatica. El termino “secuencia no anfipatica” se refiere a una secuencia que tiene una carga neta de 0 y en donde los residuos en el borde 2 de la representacion en prisma triangular de la estructura PPII se seleccionan independientemente del grupo que consiste en Ala, Leu, Val, Thr, y Ser. La secuencia no anfipatica comprende al menos una repeticion que se selecciona del grupo que consiste en PPPVAL (SEQ ID NO:16), PPPVTL (SEQ ID NO:20), PPPVSL (SEQ ID NO:36), PPPVVL, (SEQ ID NO:37) y PPPVLL (SEQ ID NO:17). En una divulgacion preferida, la PBIS comprende una secuencia seleccionada de (PPPVAL)n, (SeQ ID NO:16), (PPPVTL)n, (SEQ ID NO:20), (PPPVSL)n, (SEQ ID NO:36), (PPPVVL)n, (SEQ ID NO:37) y (PPPVLL)n, (SEQ ID NO:17) en donde n es 4, 5, 6, 7 o 8.
En una forma de realizacion aun mas preferida, la secuencia no anfipatica se selecciona del grupo que consiste en:
PPPVALPPP VALPPPVALP PPVALPPPVA LPPPVALPPP VAVPPPVALPPPP (SEQ ID NO:38),
PPPVALPPP VALPPPVALP PPVALPPPVA LPPPVALPPP VALPPPVALPPPP (SEQ ID NO:39),
PPPVALPPP VALPPPVALP PPVALPPPVA LPPPVALPPP VAVPPPVHLPPPP (SEQ ID NO:40),
PPPVALPPP VALPPPVALP PPVALPPPVA LPPPVALPPP VALPPPVHLPPPP (SEQ ID NO:41),
PPPVLLPPP VLLPPPVLLP PPVLLPPPVL LPPPVLLPPP VLVPPPVLLPPPP (SEQ ID NO:42),
PPPVLLPPP VLLPPPVLLP PPVLLPPPVL LPPPVLLPPP VLLPPPVLLPPPP (SEQ ID NO:43),
PPPVVLPPP VVLPPPVVLP PPVVLPPPVV LPPPVVLPPP VVVPPPVVLPPPP (SEQ ID NO:44),
PPPVVLPPP VVLPPPVVLP PPVVLPPPVV LPPPVVLPPP VVLPPPVVLPPPP (SEQ ID NO:45),
PPPVTLPPP VTLPPPVTLP PPVTLPPPVT LPPPVTLPPP VTVPPPVTLPPPP (SEQ ID NO:46),
PPPVTLPPP VTLPPPVTLP PPVTLPPPVT LPPPVTLPPP VTLPPPVTLPPPP (SEQ ID NO:47),
PPPVSLPPP VSLPPPVSLP PPVSLPPPVS LPPPVSLPPP VSVPPPVSLPPPP (SEQ ID NO:48) y PPPVSLPPP VSLPPPVSLP PPVSLPPPVS LPPPVSLPPP VSLPPPVSLPPPP (SEQ ID NO:49).
En otra divulgacion, la secuencia no anfipatica recombinante consiste esencialmente en los aminoacidos seleccionados del grupo que consiste en prolina y alanina. En una divulgacion preferida, la seceuncia que consiste esencialmente en prolina y alanina comprende al menos una repeticion seleccionada del grupo que consiste en PPPAAA (SEQ ID NO: 13), PPPAPA (SEQ ID NO:23) y PPPPPP (SEQ ID NO:24). En una divulgacion preferida, la secuencia anfipatica comprende una secuencia seleccionada de (PPPAAA)n, (SeQ ID NO:13), (PPPAPA)n (SEQ ID NO:23) y (PPPPPP)n (SEQ ID NO:24) en donde n es 4, 5, 6, 7 o 8.
En aun otra divulgacion mas preferida, la secuencia que consiste esencialmente en aminoacidos seleccionados del grupo que consiste en prolina y alanina se selecciona del grupo:
PPPAAAPPP AAAPPPAAAP PPAAAPPPAA APPPAAAPPP AAAPPPAAAPPPP (SEQ ID NO:50), PPPAAAPPP AAAPPPAAAP PPAAAPPPAA APPPAAAPPP AAAPPPVHLPPPP (SEQ ID NO:51), PPPPPPPPP PPPPPPPPPP PPPPPPPPPP PPPPPPPPPP PPPPPPPPPPPPPPP (SEQ ID NO:52), PPPPPPPP PPPPPPPPPP PPPPPPPPPP PPPPPPPPPP PPPPPPPPVHLPPPP (SEQ ID NO:53), PPPAPAPPP APAPPPAPAP PPAPAPPPAP APPPAPAPPP APAPPPVHLPPPP (SEQ ID NO:54), y PPPAPAPPP APAPPPAPAP PPAPAPPPAP APPPAPAPPP APAPPPAPAPPPP (SEQ ID NO:55).
En otra divulgacion, la secuencia no anfipatica consiste esencialmente en la secuencia (GXY)n, en donde X e Y son independientemente cualquier aminoacido y n es un numero entero de 1 a 20 y en donde la secuencia que comprende (GXY)n comprende al menos el 30% de prolinas. En aun otra divulgacion, la secuencia no anfipatica consiste esencialmente en aminoacidos seleccionados del grupo que consiste en aminoacidos que muestran al menos el 70% de identidad respecto a los aminoacidos 135 a 179 del numero de registro de GenBank CAA34683. En aun otra divulgacion, la secuencia no anfipatica consiste esencialmente en las secuencias:
GPMGPRGPPG PAGAPGPQGF QGNPGEPGEP GVSGPMGPRG PPGPPPVHL (SEQ ID NO:56) y GPMGPRGPPG PAGAPGPQGF QGNPGEPGEP GVSGPMGPRG PPGPP (SEQ ID NO:68)
En otra divulgacion, la secuencia anfipatica consiste esencialmente en aminoacidos que muestran al menos el 70% de identidad respecto a los aminoacidos 884 a 927 de la adhesina de superficie AgI/II (Streptococcus mutans cepa NG8; GenBank: CQ456171. En una divulgacion preferida, la secuencia anfipatica consiste esencialmente en los aminoacidos seleccionados del grupo que consiste en:
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PPTPPTYETE KPLEPAPVEP SYEAEPTPPT RAPDQAEPNK PTPPTPVHLP PPP (SEQ ID NO:69) y PPTPPTYETE KPLEPAPVEP SYEAEPTPPT RAPDQAEPNK PTPPTP (SEQ ID NO:70).
En algunas divulgaciones, la PPII/secuencia rica en Pro contiene cuatro residuos de prolina en el extremo C. Esta secuencia PPPP se encuentra antes de las cistemas C-terminales, es decir, entre el extremo C de la PPII/secuencia rica en Pro y las cistemas C-terminales.
IV. Residuos de cistema
Si no se describe espedficamente de otra manera, la posicion de los residuos de cistema son relativas a los extremos N o C de una estructura PPII, una secuencia rica en poliprolina o tanto una estructura PPII como una secuencia rica en prolina.
Como se ha descrito anteriormente, la PBIS recombinante puede comprender una estructura PPII, una secuencia rica en poliprolina o tanto una estructura PPII como una secuencia rica en prolina entre al menos dos cistemas en el extremo N y al menos dos cistemas en el extremo C. En algunas formas de realizacion, la PBIS recombinante comprende al menos tres cistemas o al menos cuatro cistemas en el extremo C.
En algunas formas de realizacion, la PBIS recombinante comprende multiples estructuras PPII y/o secuencias ricas en prolina separadas por una cistema adicional. A modo de ejemplo solo, la PBIS recombinante puede comprender desde el extremo N al extremo C: dos residuos de cistemas, una estructura PPII, un residuo de cistema, una secuencia rica en prolina y dos residuos de cistema. En otro ejemplo, la PBIS recombinante puede comprender, desde el extremo N al extremo C: dos residuos de cistema, una primera secuencia rica en prolina, un residuo de cistema, una segunda secuencia rica en prolina y dos residuos de cistema.
En algunas formas de realizacion, el numero de aminoacidos entre las dos cistemas en el extremo C es un numero entero de 0 a 20 y/o el numero de aminoacidos entre las dos cistemas en el extremo N es un numero entero desde 0 a 20. Preferiblemente, las dos cistemas en el extremo N pueden estar separadas por al menos 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, o 1 aminoacido o pueden estar adyacentes. Preferiblemente, las dos cistemas en el extremo C pueden estar separadas por al menos 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, o 1 aminoacido o pueden estar adyacentes. En una forma de realizacion preferida, las al menos dos cistemas en el extremo N estan separadas por un aminoacido (es decir, CXC), por dos aminoacidos (es decir, CXXC (SEQ ID NO: 57)).
En algunas formas de realizacion, las dos cistemas en el extremo N de la secuencia PPII o la region rica en prolina y la secuencia PPII o rica en prolina estan separadas por aproximadamente de 0 a 40 aminoacidos (medido como el numero de aminoacidos entre la mas C-terminal de las dos cistemas y el aminoacido N-terminal de la poliprolina II o la region rica en prolina). En algunas formas de realizacion, las dos cistemas en extremo N de la secuencia PPII o la region rica en prolina y la secuencia PPII o rica en prolina estan separadas por al menos 40, al menos, 35, al menos 30, al menos 25, al menos 20, al menos 15, al menos 10, al menos 5 aminoacidos.
En algunas formas de realizacion, las dos cistemas en el extremo C de la secuencia PPII o la region rica en prolina y la secuencia PPII o rica en prolina estan separadas por aproximadamente de 0 a 40 aminoacidos (medido como el numero de aminoacidos entre la mas N-terminal de las dos cistemas y el aminoacido C-terminal de la poliprolina II o la region rica en prolina). En algunas formas de realizacion, las dos cistemas en extremo C de la secuencia PPII o la region rica en prolina y la secuencia PPII o rica en prolina estan separadas por al menos 40, al menos, 35, al menos 30, al menos 25, al menos 20, al menos 15, al menos 10, al menos 5 aminoacidos.
En algunas formas de realizacion, las al menos dos cistemas en el extremo N no estan en un dominio globular. En algunas formas de realizacion, las al menos dos cistemas en el extremo C no estan en un dominio globular. En algunas formas de realizacion, la PBIS recombinante no contiene ninguna cistema en un dominio globular. En una forma de realizacion preferida, cuando la PBIS se proporciona como una protema de fusion a una protema heterologa, las cistemas no forman parte de la protema heterologa.
V. Dominio ProX
En otra forma de realizacion preferida, la PBIS comprende una secuencia como se ha definido en el parrafo previo en donde las cistemas que flanquean la estructura PPII o el dominio rico en prolina se encuentran en secuencias adicionales conocidas como N1 y N2. Estas secuencias N1 y N2 flanquean PPII o la region rica en prolina. Las secuencias N1 y N2 tfpicas que se pueden usar en la presente invencion incluyen sin limitaciones:
Las secuencias N1 adecuadas incluyen THTSGGCGCQ (SEQ ID NO:25), THPPPPCPCP (SEQ ID NO:26) o QCPSPHPQQCPCPHPQPHPQPRPPQTPYHC (SEQ ID NO:126). En una forma de realizacion, la secuencia N1 aparece antes de PPII o la region rica en prolina.
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La secuencia N2 puede ser una region rica en prolina. El termino “region rica en prolina” se ha definido anteriormente como una secuencia que esta predominantemente formada por prolinas. En una forma de realizacion preferida, la region rica en prolina esta predominantemente formada por prolinas y tiene prolinas uniformemente distribuidas todo a lo largo de la secuencia. Por tanto, por ejemplo, en algunas formas de realizacion, cuando se dibujan ventanas de 10 aminoacidos a traves de la longitud de la estructura PPII o la secuencia rica en prolina, entonces cada ventana se diferencia en el porcentaje en prolina en no mas de aproximadamente el 50%, aproximadamente el 45%, aproximadamente el 35%, aproximadamente el 30%, aproximadamente el 25%, aproximadamente el 20%, aproximadamente el 15%, aproximadamente el 10%, o aproximadamente el 5% con respecto a las ventanas restantes. En aun una forma de realizacion mas preferida, la region rica en prolina es una secuencia que esta predominantemente formada por prolinas, en donde las prolinas estan uniformemente distribuidas todo a lo largo de la secuencia y en donde el porcentaje de aminoacidos que tienen una cadena lateral voluminosa (Trp, Tyr y/o Phe) no es mayor del 10% con respecto a la longitud total de la secuencia.
Las regiones ricas en prolina adecuadas que se pueden usar en la presente invencion incluyen el dominio ProX encontrado en Y-zema HYPYQPPRPQPHPQPHPCPC (SEQ ID NO:71) o una secuencia modificada seleccionada del grupo que consiste en las secuencias:
CHYPTQPPRPQPHPQPHPCPCQQPHPS (SEQ ID NO:72),
CPPPPPPPPPPPPPPPPPCPCPPPPPPPCP (SEQ ID NO:73),
CPPPPPPPPPPPPPPPPPCPPCPPPPPCPP (SEQ ID NO:74),
CPPPAPAPPPAPAPPPAPCPCPAPAPP (SEQ ID NO:75),
CHYPPAPAPPAPAPPAPACPCAAPAPSPCQ (SEQ ID NO:76) y CHYPTAPARPAPAPAPAPCPCAAPAPSPCQ (SEQ ID NO:127)
La secuencia N2 se puede encontrar despues o antes de la region PPII o de la region rica en prolina. En una forma de realizacion preferida, la secuencia N2 se encuentra despues de la region PPII.
Por tanto, en una divulgacion preferida, la PBIS comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en:
THTSGGCGCQP(PPPVEL)nPPPPCHYPTQPPRPQPHPQPHPCPCQQPHPSPCQ (SEQ ID NO:107), THTSGGCGCQP(PPPVDL)nPPPPCHYPTQPPRPQPHPQPHPCPCQQPHPSPCQ (SEQ ID NO:108), THTSGGCGCQP(PPPVNL)nPPPPCHYPTQPPRPQPHPQPHPCPCQQPHPSPCQ (SEQ ID NO:109), THTSGGCGCQP(PPPVQL)nPPPPCHYPTQPPRPQPHPQPHPCPCQQPHPSPCQ (SEQ ID NO:111), THTSGGCGCQP(PPPVAL)nPPPPCHYPTQPPRPQPHPQPHPCPCQQPHPSPCQ (SEQ ID NO:112), THTSGGCGCQP(PPPVTL)nPPPPCHYPTQPPRPQPHPQPHPCPCQQPHPSPCQ (SEQ ID NO:113), THTSGGCGCQP(PPPVSL)nPPPPCHYPTQPPRPQPHPQPHPCPCQQPHPSPCQ (SEQ ID NO:114), THTSGGCGCQP(PPPVLL)nPPPPCHYPTQPPRPQPHPQPHPCPCQQPHPSPCQ (SEQ ID NO:115), THTSGGCGCQP(PPPVVL)nPPPPCHYPTQPPRPQPHPQPHPCPCQQPHPSPCQ (SEQ ID NO:116), THTSGGCGCQP(PPPAAA)nPPPPCHYPTQPPRPQPHPQPHPCPCQQPHPSPCQ (SEQ ID NO:117), THTSGGCGCQP(PPPAAA)nPPPAPAPPPAPAPPPAPCPCPAPAPPPCP (SEQ ID NO:118), THTSGGCGCQP(PPPPPP)nPPPPCHYPTQPPRPQPHPQPHPCPCQQPHPSPCQ (SEQ ID NO:119), THTSGGCGCQP(PPPPPP)nPPPCPPPPPPPPPPPPPPPPPCPCPPPPPPPCP (SEQ ID NO:120), THTSGGCGCQP(PPPAPA)nPPPPCHYPTQPPRPQPHPQPHPCPCQQPHPSPCQ (SEQ ID NO:121), y THTSGGCGCAP(PPPAAA)nPPPPCHYPPAPAPPAPAPPAPACPCAAPAPSPCQ (SEQ ID NO:122)
en donde n es 4, 5, 6, 7, o 8. En una forma de realizacion preferida n es 8.
En otra divulgacion, la PBIS consiste esencialmente de las secuencias mencionadas en la tabla 2.
PBIS
SEQ ID NO:
PBIS
THTSGGCGCQP(PPPVEL)6PPPVEVPPPVELPPPPCHYPTQPPRPQPHPQPHPCPCQQPHPSPCQ
77 RX3(E)
THTSGGCGCQPPPPVDL)6PPPVDVPPPVDLPPPPCHYPTQPPRPQPHPQPHPCPCQQPHPSPCQ
78 RX3(D)
THTSGGCGCQP(PPPVNL)6PPPVNVPPPVNLPPPPCHYPTQPPRPQPHPQPHPCPCQQPHPSPCQ
79 RX3(N)
THTSGGCGCQP(PPPVQL)6PPPVQVPPPVQLPPPPCHYPTQPPRPQPHPQPHPCPCQQPHPSPCQ
80 RX3(Q)
THTSGGCGCQP(PPPVAL)6PPPVAVPPPVHLPPPPCHYPTQPPRPQPHPQPHPCPCQQPHPSPCQ
81 RX3(A)
THTSGGCGCQP(PPPVAL)6PPPVAVPPPVALPPPPCHYPTQPPRPQPHPQPHPCPCQQPHPSPCQ
82 RX3(A)2
THTSGGCGCQP(PPPVTL)6PPPVTVPPPVTLPPPPCHYPTQPPRPQPHPQPHPCPCQQPHPSPCQ
85 RX3(T)
THTSGGCGCQP(PPPVSL)6PPPVSVPPPVSLPPPPCHYPTQPPRPQPHPQPHPCPCQQPHPSPCQ
86 RX3(S)
THTSGGCGCQP(PPPVLL)6PPPVLVPPPVLLPPPPCHYPTQPPRPQPHPQPHPCPCQQPHPSPCQ
83 RX3(L)
THTSGGCGCQP(PPPVVL)6PPPVVVPPPVVLPPPPCHYPTQPPRPQPHPQPHPCPCQQPHPSPCQ
84 RX3(V)
THTSGGCGCQP(PPPAAA)8PPPPCHYPTQPPRPQPHPQPHPCPCQQPHPSPCQ
87 RX3(A3)
THTSGGCGCQP(PPPPPP)7PPPHLPPPP7PPPPHLPPPPCPPPPPPPPPPPPPPPPPCPCPPPPPPPCP
88 PP
THPPPPCPPCP(PPPPPP)7PPPHLPPPP7PPPPHLPPPPCPPPPPPPPPPPPPPPPPCPPCPPPPPCPP
125 PP2
THTSGGCGCQ(PPPPPP)8PPPPCPPPPPPPPPPPPPPPPPCPCPPPPPPPCP
89 PP3
THTSGGCGCQP(PPPAPA)7PPPAHLPPPPCPPPAPAPPPAPAPPPAPCPCPAPAPPPCP
90 PA
THTSGGCGCQP(PPPAPA)sPPPPCPPPAPAPPPAPAPPPAPCPCPAPAPPPCP
91 PA2
THPPPPCPCPP(PPPPPP)7PPPHLPPPPCPPPPPPPPPPPPPPPPPCPCPPPPPPPCP
92 NPP
THPPPPCPCPP(PPPAPA)7PPPAHLPPPPCPPPAPAPPPAPAPPPAPCPCPAPAPPPCP
93 NPA
THTSGGCGCQPPPTPPTYETE KPLEPAPVEP SYEAEPTPPT RAPDQAEPNK PTPPTPVHLP PPPPPTPPTYETEKPLEPAPVEPSYEAEPTPPTRAPDQAEPNKPTPPTPVHLPPPP CHYPTQPPRPQPHPQPHPCPCQQPHPSPCQ
94 Z(Adh)Px
THTSGGCGCQPPPTPPTYETE KPLEPAPVEP SYEAEPTPPT RAPDQAEPNK PTPPTP CHYPTQPPRPQPHPQPHPCPCQQPHPSPCQ
95 Z(Adh2)Px
THTSGGCGCQPGPMGPRGPPGPAGAPGPQGFQGNPGEPGEPGVSGPMGPRGPPGPPPVHLPPPP CHYPTQPPRPQPHPQPHPCPCQQPHPSPCQ
96 Z(col)Px
THTSGGCGCQPGPMGPRGPPGPAGAPGPQGFQGNPGEPGEPGVSGPMGPRGPPGPP CHYPTQPPRPQPHPQPHPCPCQQPHPSPCQ
97 Z(col2)Px
THTSGGCGCQPPTPPTYETEKPLEPAPVEPSYEAEPTPPTRAPDQAEPNKPTPPTPVHLPPPPCPPCPTPPTYETEKPLEPAP VEPSYEAEPTPPTRAPDQAEPNKPTPPTPVHLPPPPCPPC
98 Z(Adh)
THTSGGCGCQPPTPPTYETEKPLEPAPVEPSYEAEPTPPTRAPDQAEPNKPTPPTPCPPCPTPPTYETEKPLEPAPVEPSYEA EPTPPTRAPDQAEPNKPTPPTPCPPC
99 Z(Adh)2
THTSGGCGCQPGPMGPRGPPGPAGAPGPQGFQGNPGEPGEPGVSGPMGPRGPPGPPPVHLCPPCGPMGPRGPPGPAGA PGPQGFQGNPGEPGEPGVSGPMGPRGPPGPPPVHLCPPC
100 Z(col)
THTSGGCGCQ PGPMGPRGPPGPAGAPGPQGFQGNPGEPGEPGVSGPMGPRGPPGPPCPPCGPMGPRGPPGPAGAPGPQGFQGNPGEP GEPGVSGPMGPRGPPGPPCPPC
101 Z(col2)
Tabla 2: Resumen de PBIS ejemplares de la presente invencion o divulgadas en el presente documento indicando la secuencia N1, PPII/rica en prolina y la segunda secuencia rica en prolina. Esas PBIS que no tienen segunda secuencia rica en prolina contienen las dos cisteinas C-terminales unidas a la region PPII/rica en prolina como un tetrapeptido CPPC.
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Tambien se divulga una PBIS que comprende una region N1 (que comprende las dos cistemas N-terminales) y una region PPII/rica en prolina que comprende todo o parte de PPII de RX3, pero que carece de la segunda region rica en prolina. Para proporcionar las cistemas C-terminales necesarias, esta PBIS comprende dos cistemas que forman un tetrapeptido CPPC que esta directamente unido al extremo C de la region PPII. Por tanto, tambien se divulga una PBIS que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en:
R8(4C) (SEQ ID NO:102):
THTSGGCGCQ PPPPVHLPPP VHLPPPVHLP PPVHLPPPVH LPPPVHLPPP VHVPPPVHLC PPC R7(4C) (SEQ ID NO:103):
THTSGGCGCQ PPPPVHLPPP VHLPPPVHLP PPVHLPPPVH LPPPVHLPPP VHVCPPC R6(4C) (SEQ ID NO:104):
THTSGGCGCQ PPPPVHLPPP VHLPPPVHLP PPVHLPPPVH LPPPVHLCPP C R4(4C) (SEQ ID NO:105):
THTSGGCGCQ PPPPVHLPPP VHLPPPVHLP PPVHLPPPVH LCPPC
Tambien se divulga una PBIS que comprende una region N1 (que comprende las dos cistemas N-terminales), una region PPII/rica en Pro que comprende todo o parte de PPII de RX3 y una region N2, pero en donde la region N1 comprende los aminoacidos del dominio ProX encontrado en RX3 en la orientacion inversa y en donde la region N2 comprende los aminoacidos encontrados en la region N1 de RX3 en la orientacion inversa. Por tanto, tambien se divulga una PBIS que comprende seleccionado del grupo que consiste en:
iRX3 (SEQ ID NO:106)
QCPSPHPQQC PCPHPQPHPQ PRPPQTPYHC PPPPVHLPPP VHLPPPVHLP PPVHLPPPVH LPPPVHLPPP VHLPPPVHLP PPPQCGCGGS THT
VI. Protemas de fusion de PBIS
Como se describe en el presente documento, la PBIS recombinante se puede fusionar a cualquier producto de interes. Por tanto, en otro aspecto, la invencion se refiere a una protema de fusion que comprende la PBIS recombinante de la invencion y una protema heterologa. El termino “protema heterologa” se usa de forma intercambiable en el presente documento con “producto de interes” o “PDI” y puede ser, por ejemplo, una protema o peptido. La PBIS recombinante se puede fusionar en el extremo N o C a una protema o peptido de interes. Ademas, la PBIS recombinante se puede fusionar directamente a la protema o peptido de interes o se puede fusionar indirectamente, por ejemplo, a traves de un espaciador, a la protema o peptido de interes.
Por tanto, la PBIS recombinante se puede fusionar, por ejemplo, a una enzima, una hormona, tales como calcitonina, eritropoyetina, trombopoyetina, hormona del crecimiento humana, factor de crecimiento epidermico, y similares, un interferon o una citoquina. Otros ejemplos de protemas o peptidos de interes incluyen cualquier protema que tenga uso terapeutico, nutraceutico, agncola o industrial. Por ejemplo, en algunas formas de realizacion, la PBIS recombinante se puede fusionar a peptidos enriquecidos en aminoacidos esenciales. Actividades ilustrativas de tales otras protemas incluyen (a) captura y emision de luz como proporcionan la protema fluorescente verde (GFP), protema fluorescente cian mejorada (ECFP), protema fluorescente roja (DsRed) y similares; (b) actividad enzimatica que se puede asociar con senalizacion intracelular primaria y secundaria y rutas metabolicas, ejemplificadas por enteroquinasa, beta-glucoronidasa (GUS), fitasa, anhidrasa carbonica y enzimas industriales (hidrolasas, glucosidasas, celulasas, oxido-reductasas y similares); (c) interaccion protema-protema, protema-receptor y protema-ligando tales como, por ejemplo, anticuerpos (Acm tales como IgG, IgM, IgA, etc.) y fragmentos de los mismos, hormonas (calcitonina, hormona del crecimiento humana (hGH), factor de crecimiento epidermico (EGF) y similares), inhibidores de proteasas, antibioticos, antimicrobianos, inhibidores de la entrada de VIH (Ryser et al., 2005 Drug Discov Today. 10:1085-1094), colageno, lactoferrina humana y citoquinas; (d) antfgenos proteicos y peptfdicos para vacunas (virus de la inmunodeficiencia humana, VIH; antfgenos de pre- superficie, superficie y nucleo de hepatitis B; gen P1 de poliprotema estructural del virus de la fiebre aftosa (FMDV) (Dus Santos et al., 2005 Vaccine.23:1838-1843), peptidos estimuladores de celulas T de la patente de EE UU No. 4.882.145, coronavirus de la gastroenteritis, virus del papiloma humano y similares); (e) interacciones protema-no protema tales como fitohemaglutinina (PHA), la subunidad B de la toxina ricina (RTB) y otras lectinas.
Como se describe en el presente documento, el producto de interes puede mantener su actividad funcional cuando se expresa como una fusion con la PBIS recombinante o cuando se purifica de un RPBLA. Los ensayos para la bioactividad de tales polipeptidos expresados se conocen bien en la tecnica y estan disponibles en una o mas publicaciones. Por ejemplo, se puede medir la actividad de ECFP cuantificando la fluorescencia emitida a una longitud de onda de 470-530 nm cuando la protema se ha excitado a 458 nm. Vease Richards et al., 2003 Plant Cell Rep. 22:117-121. Se puede medir la actividad de la enteroquinasa (EK), por ejemplo, con dos enfoques diferentes.
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La actividad se puede determinar analizando el corte de una protema de fusion que contenga el sitio de corte espedfico de enteroquinasa mediante inmunotransferencia, como se discute en el catalogo de Invitrogen Life Technologies (E180-01 y E180-2) y tambien cuantificando la actividad EK usando un sustrato peptfdico fluorogenico para EK (Sigma G-5261, CAS RN 70023-02-8); se mide la actividad enzimatica mediante un aumento de la fluorescencia (excitacion a 337 nm, emision a 420 nm) producida por la liberacion de p-naftilamina del peptido durante el tiempo. Vease, LaVallie et al., 1993 J. Biol. Chem. 268:23311-23317. La actividad de la enzima beta- glucuronidasa (GUS) se puede medir mediante la conversion del sustrato MUG (4-metil umbeliferil glucuronido) en el producto MU. Este producto se puede cuantificar midiendo la fluorescencia con excitacion a 365 nm, emision a 455 nm en un espectrofluonmetro. Vease, Pai-Hsiang et al., 2001 J. Plant Physiol. 158:247-254 y Jefferson et al., 1987 EMBO J. 6:3901-3907. Los ensayos de fitasa se llevan a cabo mediante la cuantificacion de ortofosfatos inorganicos liberados del reactivo AAM que consiste en acetona, acido sulfurico 5,0 N y molibdato de amonio 10 mM. Vease Ullah et al., 1999 Biochem. Biophys. Res. Commun. 264:201-206.
Ensayos similares estan disponibles para otras protemas biologicas. Los ensayos de actividad de RTB se pueden realizar midiendo la union de RTB a asialofetuma, lactosa y galactosa, como se describe en Reed et al., 2005 Plant Cell Rep. 24:15-24. EGF es un factor de crecimiento implicado en proliferacion de fibroblastos. La actividad de EGF se puede ensayar mediante la cuantificacion de la induccion de la smtesis de ADN medida mediante la incorporacion del analogo de pirimidina 5-bromo-2'-desoxiuridina (BrdU), en lugar de timidina, en el ADN de celulas en proliferacion usando el kit de proliferacion celular ELISA. Oliver, et al., 2004 Am. J. Physiol. Cell Physiol. 286:11181129; No. de Catalogo. 1647229, Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania.
Se advierte que la captura y emision de luz constituye un tipo separado y especial de “actividad biologica” que es la actividad luminiscente. Estas protemas son utiles, por ejemplo, como moleculas indicadoras en muchos tipos de ensayos o cribados usados en el analisis o descubrimiento de moleculas biologicamente importantes, y su actividad luminiscente requiere la presencia de la estructura proteica secundaria y terciaria correcta.
En algunas formas de realizacion, la protema de fusion de PBIS recombinante comprende una secuencia de aminoacidos espaciadora. La secuencia espaciadora de aminoacidos puede ser una secuencia de aminoacidos cortable por medios enzimaticos o qmmicos, o no cortable. Mediante “no cortable” se quiere decir que no se produce el corte del espaciador sin destruccion de parte o todo el polipeptido biologicamente activo.
El espaciador se puede colocar entre la PBIS recombinante y el polipeptido biologicamente activo. Un espaciador ilustrativo es una secuencia de aminoacidos que es cortable por una proteasa tal como enteroquinasa, endoproteasa Arg-C, endoproteasa Glu-C, endoproteasa Lys-C, Factos Xa, proteasas SUMO (Tauseef et al., 2005 Protein Expr. Purif. 43:1-9) y similares. El espaciador tambien puede corresponder a una secuencia autocortable tal como la secuencia 2A autoprocesable vmca de FMDV, intrones proteicos (intemas) tales como la interna Ssp ADNb y similares, comercialmente disponibles de New England Biolabs y otros. El uso de un enlazador interna puede ser ventajoso porque se puede inducir a que tales secuencias produzcan selectivamente ayuste de protemas y por tanto se eliminan a sf mismas de una protema expresada, recuperada. Las intemas son particularmente interesantes puesto que no requieren grandes enzimas proteicas para alcanzar su sitio diana para cortar la PBIS recombinante de la protema de interes. Esta propiedad puede ser particularmente util para el aislamiento directo de protemas de interes a partir de RPBLA intactos. De forma alternativa, un espaciador puede ser una secuencia de aminoacidos que es espedficamente cortable por un reactivo qmmico, tal como, por ejemplo, bromuro de cianogeno que corta en residuos de metionina.
En una forma de realizacion preferida, el espaciador esta compuesto de un peptido pentaglicina. En una forma de realizacion aun mas preferida, el espaciador comprende un peptido pentaglicina seguido por un sitio de corte de proteasa. En una forma de realizacion aun mas preferida, el sitio de corte de la proteasa se selecciona del grupo del sitio de corte de la enteroquinasa (D-D-D-D-K, que corta despues del residuo K) y el sitio de corte del factor Xa (I- D/E-G-R, que corta despues del residuo R).
VII. Acidos nucleicos que codifican PBIS recombinante y protemas de fusion de PBIS recombinante
Tambien se describen en el presente documento polinucleotidos que codifican una PBIS recombinante. De forma similar, tambien se describen polinucleotidos que codifican una protema de fusion que comprende una PBIS recombinante. Los polinucleotidos de la invencion pueden estar en forma de ARN o en forma de ADN. ADN incluye ADNc, ADN genomico y ADN sintetico; y puede ser bicatenario o monocatenario y si es monocatenario puede ser la hebra codificante o la hebra no codificante (antisentido). En ciertas formas de realizacion, los polinucleotidos estan aislados. En ciertas formas de realizacion, los polinucleotidos estan sustancialmente puros. En ciertas formas de realizacion, los polinucleotidos tienen codones optimizados para el huesped en donde se van a expresar los RPBLA.
Los polinucleotidos segun la presente invencion pueden comprender ademas una secuencia que codifica una secuencia senal que dirige la PBIS o la protema de fusion al retmulo endoplasmico, en donde dicha secuencia senal esta en el mismo marco abierto de lectura que la PBIS o la protema de fusion.
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Como se ha descrito anteriormente, la PBIS recombinante puede comprender una senal que dirige la PBIS recombinante a una localizacion particular en la celula. Por ejemplo, la PBIS recombinante se puede dirigir a la luz del retmulo endoplasmico (RE) a traves de un peptido senal.
La senal puede ser cualquier dominio que dirija la PBIS recombinante al RE. A modo de ejemplo solo, un dominio de senalizacion a RE puede ser un peptido de senalizacion a RE derivado de una protema zema tal como gamma-zema o alfa-zema, una protema gliadina tal como alfa-gliadina o gamma-gliadina, o la protema relacionada con patogenesis de PR10 clase 25. En una forma de realizacion preferida, la secuencia senal comprende la secuencia MRVLLVALALLALAASATS (SEQ ID NO:58). Alternativamente, la secuencia senal puede derivar del gen relacionado con patogenesis, en particular el gen PR-10 y, lo mas preferiblemente, la protema PR-2 de tabaco (Veroverd et al., Plant Physiol., 1995, 109:1199-1205). En una forma de realizacion preferida, la secuencia senal comprende la secuencia MFLKSPFYAFLCFGQYFVAVTHA (SEQ ID NO:59).
Las caractensticas de los peptidos senal responsables para dirigir la protema al RE se han estudiado extensamente (von Heijne et al., 2001 Biochim. Biophys. Acta 1541:114-119). Los peptidos senal no comparten homologfa en la estructura primaria, pero tienen una estructura tripartita comun: una region h hidrofobica central y regiones flanqueantes N- y C-terminales hidrofflicas. Estas similitudes, y el hecho de que las protemas se translocan a traves de la membrana del RE usando rutas aparentemente comunes, permite el intercambio de los peptidos senal entre diferentes protemas o incluso de diferentes organismos que pertenecen a diferentes filos. Vease, Martoglio et al., 1998 Trends Cell Biol. 8:410-415.
El peptido senal se puede cortar una vez que la PBIS recombinante ha alcanzado la localizacion celular adecuada, por ejemplo, el RE. En la mayona de los eucariotas, el peptido senal se corta co-traduccionalmente, por tanto, la gran mayona de la protema encontrada en el compartimento de endomembrana (por ejemplo, el RE, Golgi, vacuolas) es la protema madura, esto es, la protema sin el peptido senal. En consecuencia, la protema madura es la responsable de inducir la formacion de los RPBLA. En una divulgacion preferida, la secuencia senal es el peptido senal de gamma zema que tiene la secuencia MRVLLVALALLALAASATS (SEQ ID NO:58).
Tales polinucleotidos se pueden, por ejemplo, incorporar en un vector de expresion para producir una PBIS recombinante o una protema de fusion que comprende una PBIS recombinante en una celula. Los vectores de expresion son construcciones de ADN replicables que tienen fragmentos de ADN sintetico o derivados de ADNc que codifican una PBIS recombinante o una protema de fusion que comprende una PBIS recombinante, operativamente unidos a elementos reguladores transcripcionales o traduccionales adecuados. Los elementos reguladores transcripcionales o traduccionales pueden derivar, por ejemplo, de mairnfero, microbio, virus, insecto o genes. Una unidad transcripcional en general comprende un ensamblaje de (1) un elemento o elementos genetico(s) que tiene(n) un papel regulador en la expresion genica, por ejemplo, promotores o potenciadores de transcripcion, (2) una secuencia estructural o codificante que se transcribe a ARNm y se traduce a protema, y (3) secuencias apropiadas de iniciacion y terminacion de transcripcion y traduccion, como se describe en detalle posteriormente. Tales elementos reguladores pueden incluir una secuencia operadora para controlar la transcripcion. Se puede incorporar adicionalmente la capacidad para replicarse en un huesped, normalmente conferida por un origen de replicacion, y un gen de seleccion para facilitar el reconocimiento de transformantes. Las regiones de ADN estan operativamente unidas cuando estan funcionalmente relacionadas entre sf. Por ejemplo, el ADN para un peptido senal esta operativamente unido al ADN para un polipeptido si se expresa como un precursor que participa en la secrecion del polipeptido; un promotor esta operativamente unido a una secuencia codificante si controla la transcripcion de la secuencia; o un sitio de union al ribosoma esta operativamente unido a una secuencia codificante si esta colocado de modo que permite la traduccion.
La eleccion de la secuencia de control de la expresion y el vector de expresion dependera de la eleccion del huesped. Se puede emplear una gran variedad de combinaciones de huesped/vector de expresion. Los vectores de expresion utiles para huespedes eucariotas incluyen, por ejemplo, vectores que comprenden secuencias de control de expresion de SV40, virus del papiloma bovino, adenovirus y citomegalovirus. Los vectores de expresion utiles para huespedes bacterianos incluyen plasmidos bacterianos conocidos, tales como plasmidos de Escherichia coli, incluyendo pCR1, pBR322, pMB9 y sus derivados, plasmidos de gama de huespedes mas amplia, tales como M13 y fagos filamentosos de ADN monocatenario.
En algunas formas de realizacion, el vector que comprende un polinucleotido que codifica una PBIS recombinante comprende ademas un sitio multiple de clonacion. Un sitio multiple de clonacion es una secuencia de polinucleotido que comprende uno o mas sitios de restriccion unicos. Ejemplos no limitantes de sitios de restriccion incluyen EcoRI, SacI, KpnI, SmaI, XmaI, BamHI, XbaI, HincII, PstI, SphI, HindIII, AvaI o cualquier combinacion de los mismos.
Los sitios multiples de clonacion se pueden usar en vectores que comprenden un polinucleotido que codifica una PBIS recombinante para simplificar la insercion de un polinucleotido que codifica una protema o peptido de interes en el vector de modo que el vector se pueda usar para expresar una protema de fusion que comprende la PBIS recombinante y la protema o peptido de interes. En algunas formas de realizacion, el polinucleotido que codifica la
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PBIS recombinante esta en 5' respecto al sitio multiple de clonacion. En algunas formas de realizacion, el polinucleotido que codifica la PBIS recombinante esta en 3' respecto al sitio multiple de clonacion.
Los vectores pueden comprender al menos un promotor. El promotor puede ser cualquier secuencia que sea adecuada para dirigir la expresion de una PBIS recombinante o protema de fusion que comprende una PBIS recombinante. En una divulgacion particular, el promotor dirige la expresion en hojas de tabaco.
Con frecuencia diferentes huespedes tienen preferencias para usar un codon particular para codificar un residuo particular de aminoacido. Tales preferencias de codones se conocen bien y se puede cambiar una secuencia de ADN que codifica una secuencia de protema de fusion deseada, usando mutagenesis in vitro, por ejemplo, de modo que se utilicen los codones preferidos por el huesped para un huesped particular en el que se va a expresar la protema de fusion.
Tambien se contempla una molecula recombinante de acido nucleico tal como una molecula de ADN, que comprende un vector genico o construccion que contiene una o mas secuencias reguladoras (elementos de control) tal como un promotor adecuado para dirigir la expresion del gen en un organismo celular eucariota huesped operativamente unido a un segmento de acido nucleico exogeno (por ejemplo, un segmento o secuencia de aDn) que define un gen que codifica una protema de fusion contemplada, como se ha discutido anteriormente. Mas en particular, tambien se contempla una molecula recombinante de ADN que comprende un vector genico que comprende un promotor para dirigir la expresion de la protema de fusion en celulas de un organismo huesped operativamente unido a un segmento de ADN que define un gen que codifica una secuencia inductora de cuerpos proteicos (PBIS) unida a un polipeptido de interes. Esa molecula de ADN recombinante, tras transfeccion y expresion adecuadas en una celula eucariota huesped, proporciona una protema de fusion contemplada como RPLBA.
Como se sabe bien en la tecnica, siempre que el acido nucleico requerido, ilustrativamente secuencia de ADN, este presente (incluyendo senales de iniciacion y parada), normalmente pueden estar presentes pares de bases adicionales en cualquier extremo del segmento de ADN y ese segmento se puede utilizar todavfa para expresar la protema. Esto, por supuesto, presume la ausencia en el segmento de una secuencia de ADN operativamente unida que reprima la expresion, exprese un producto adicional que consuma la protema de fusion deseada a ser expresada, exprese un producto que consuma un producto de reaccion querido producido por esa protema de fusion deseada o interfiera de otra manera con la expresion del gen del segmento de ADN.
Por tanto, siempre que el segmento de ADN este libre de tales secuencias interferentes de ADN, un segmento de ADN puede tener de aproximadamente 500 hasta aproximadamente 1.500 pares de bases de longitud. El tamano maximo de una molecula recombinante de ADN, particularmente un vector de expresion, esta regido principalmente por conveniencia y el tamano del vector que puede acomodar una celula huesped, una vez que todas las secuencias mmimas de ADN requeridas para replicacion y expresion, cuando se desea, estan presentes. Los tamanos mmimos de vectores se conocen bien.
Un segmento de ADN que codifica una protema de fusion anteriormente descrita se puede sintetizar mediante tecnicas qmmicas, por ejemplo, el metodo del fosfotriester de Matteucci et al., 1981 J. Am. Chem. Soc., 103:3185. Por supuesto, mediante la smtesis qmmica de la secuencia codificante, se puede hacer cualquier modificacion deseada simplemente sustituyendo las bases apropiadas por las que codifican la secuencia nativa de residuos de aminoacidos.
Los segmentos de ADN que contienen un gen que codifica la protema de fusion tambien se pueden obtener de moleculas recombinantes de ADN (vectores plasmidos) que contienen ese gen.
Un vector que dirige la expresion de un gen de una protema de fusion se denomina en el presente documento un “vector de expresion”. Un vector de expresion contiene elementos de control de la expresion incluyendo el promotor. El gen codificante de la protema de fusion esta operativamente unido al vector de expresion para permitir que la secuencia promotora dirija la union de la ARN polimerasa y la expresion del gen codificante de la protema de fusion. Utiles en la expresion de genes que codifican polipeptidos son promotores que son inducibles, vmcos, sinteticos, constitutivos como describen Paszkowski et al., 1989 EMBO J., 3:2719 y Odell et al., 1985 Nature, 313:810, asf como temporalmente regulados, espacialmente regulados y regulados espaciotemporalmente como se da en Chua et al., 1989 Science, 244:174-181.
En el presente documento se contemplan vectores de expresion compatibles con celulas eucariotas, tales como los que son compatibles con celulas de mairnfero, algas o insectos y similares. Tales vectores de expresion tambien se pueden usar para formar las moleculas recombinantes de ADN de la presente invencion. Los vectores de expresion de celulas eucariotas se conocen bien en la tecnica y estan disponibles de varias fuentes comerciales. Normalmente, tales vectores contienen uno o mas sitios de restriccion convenientes para la insercion del segmento de ADN y secuencias promotoras deseadas. Opcionalmente, tales vectores contienen un marcador de seleccion espedfico para su uso en celulas eucariotas.
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La eleccion de que vector de expresion y por ultimo a que promotor se une operativamente un gen que codifica una protema de fusion depende directamente de las propiedades funcionales deseadas, por ejemplo, la localizacion y el momento de la expresion proteica y la celula huesped que se va a transformer. Estas son limitaciones bien conocidas inherentes en la tecnica de construccion de moleculas recombinantes de ADN. Sin embargo, un vector util en practicar la presente invencion puede dirigir la replicacion y preferiblemente tambien la expresion (para un vector de expresion) del gen de la protema de fusion incluido en el segmento de ADN al que se fusiona operativamente.
Vectores tfpicos utiles para la expresion de genes en celulas de plantas y mamnferos superiores son bien conocidos en la tecnica e incluyen vectores vegetales derivados del plasmido inductor de tumores (Ti) de Agrobacterium tumefaciens descrito por Rogers et al. (1987) Meth. in Enzymol., 153:253-277 y vectores de expresion en mairnferos pKSV-10, anteriormente, y pCI-neo (Promega Corp., #E1841, Madison, Wis.). Sin embargo, se sabe que algunos otros sistemas de vectores de expresion funcionan en plantas incluyendo el vector de control de transferencia pCaMVCN descrito por Fromm et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:58-24. El plasmido pCaMVCN (disponible de Pharmacia, Piscataway, N.J.) incluye el promotor del virus del mosaico de la coliflor CaMV 35S.
VIM. Ensamblajes recombinantes similares a cuerpos proteicos (RPBLA), celulas huesped y metodos de hacer ensamblajes recombinantes similares a cuerpos proteicos (RPBLA)
Los cuerpos proteicos naturales se han descrito en el endospermo de cereales. Se inducen por la expresion de prolaminas y glutelinas. Los cuerpos proteicos son organulos que estan muy enriquecidos en protemas ensambladas (por ejemplo, prolaminas y glutelinas) y rodeados por una membrana, que puede derivar del RE o la vacuola. La mayona de los cuerpos proteicos son estructuras de forma redonda (generalmente esfericos), con diametros desde aproximadamente 0,5 hasta aproximadamente 3,0 micrometros.
Los ensamblajes recombinantes similares a cuerpos proteicos (RPBLA) se pueden formar por la expresion de una PBIS recombinante en una celula. De forma similar a los cuerpos proteicos naturales, que son organulos que estan muy enriquecidos en PBIS, los RPBLA son organulos recombinantes que estan muy enriquecidos en PBIS recombinantes. La PBIS ensamblada o PBIS recombinante en los organulos estan rodeados por una membrana. En celulas, los RPBLA tfpicamente se encuentran en el citoplasma de la celula y, por tanto, estan rodeados de una membrana adicional (membrana plasmatica). Estas membranas (membrana plasmatica y la membrana del organulo) se pueden eliminar durante el proceso de recuperacion de RPBLA, y el organulo aun se considera un RPBLA.
Cuando se expresan en celulas animales, los RPBLA en general tienen forma esferica, tienen diametros desde aproximadamente 0,5 hasta aproximadamente 3,0 micrometros y tienen una membrana que los rodea. Los RPBLA expresados en celulas vegetales normalmente tambien son en general esfericos, tienen diametros desde aproximadamente 0,5 hasta aproximadamente 2,0 micrometros y estan rodeados por una membrana. Sin embargo, los RPBLA pueden algunas veces tener forma amorfa y tamano no uniforme.
En algunas formas de realizacion, los RPBLA tienen al menos aproximadamente 0,3, al menos aproximadamente 0,4 o al menos aproximadamente 0,5 micrometros. En algunas formas de realizacion, los RPBLA tienen aproximadamente 3 micrometros o menos, aproximadamente 2,5 micrometros o menos, o aproximadamente 2 micrometros o menos. En algunas formas de realizacion, los RPBLA tienen desde aproximadamente 0,3 hasta aproximadamente 3,0 micrometros, desde aproximadamente 0,3 hasta aproximadamente 2,5 micrometros o desde aproximadamente 0,3 hasta aproximadamente 2 micrometros. En algunas formas de realizacion, los RPBLA tienen desde aproximadamente 0,5 hasta aproximadamente 3,0 micrometros, desde aproximadamente 0,5 hasta aproximadamente 2,5 micrometros o desde aproximadamente 0,5 hasta aproximadamente 2 micrometros.
En algunas formas de realizacion, los RPBLA tienen una densidad predeterminada que puede ser diferente entre diferentes protemas de fusion, pero es predecible en huespedes para una protema de fusion particular que se prepara. Esa densidad predeterminada de los RPBLA es tfpicamente mayor que esa de sustancialmente todas las protemas endogenas de la celula huesped presente en el homogeneizado y es tfpicamente desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 1,4 g/ml. La alta densidad de los RPBLA se debe a la capacidad general de las protemas de fusion recombinantes de autoensamblarse y acumularse en agregados ordenados asociados con membranas.
En algunas formas de realizacion, un RPBLA tiene una densidad de al menos aproximadamente 1,0 g/ml. En algunas formas de realizacion, el RPBLA tiene una densidad desde aproximadamente 1,1 hasta aproximadamente 1,4 g/ml, desde aproximadamente 1,15 hasta aproximadamente 1,35 g/ml o desde aproximadamente 1,0 hasta aproximadamente 1,3 g/ml. En algunas formas de realizacion, el RPBLA tiene una densidad que no es mas de 1,4 g/ml.
Los RPBLA contemplados se pueden caracterizar por su densidad como se apunto anteriormente y su tamano y forma. El gradiente de densidad iodixanol (Optiprep®) en colchon por capas descrito en los ejemplos y materiales y metodos es un metodo util para determinar la densidad de RPBLA determinados. Otros metodos complementarios o
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adecuados que se pueden usar para determinar la densidad de los RPBLA incluyen gradientes de densidad en colchon por capas que se basan en otros solutos que proporcionan densidad tal como sacarosa, glicerol y Percoll.
Tambien se divulga un metodo para producir un RPBLA que comprende:
(i) transformar un sistema huesped vegetal con el acido nucleico o vector segun la divulgacion;
(ii) generar plantas a partir de dicho sistema vegetal transformado; y
(iii) hacer crecer dichas plantas en condiciones adecuadas parta la formacion de RPBLA.
En algunas formas de realizacion, los RPBLA se producen en una celula eucariota. Por ejemplo, se pueden producir RPBLA en plantas, animales, insectos u hongos. Las celulas huesped adecuadas para la produccion de RPBLA incluyen, a modo de ejemplo, plantas superiores (por ejemplo, tomate, tabaco, Arabidopsis, alfalfa), celulas de mairnfero (por ejemplo, celulas CHO, COS y 293T), hongos filamentosos (por ejemplo, Tricoderma resei y Aspergillum sp.), celulas de insecto. Vease tambien la patente de EE UU No. 7.575.898 y la solicitud publicada de EE UU No. 2006/0121573, que se incorporan en el presente documento mediante referencia y describen otras celulas huesped de ejemplo que se pueden usar para producir un RPBLA como se describe en el presente documento. En algunas formas de realizacion, se expresa un RPBLA en una celula de planta de tabaco.
En aun otras formas de realizacion, la celula huesped es una celula eucariota superior. Las celulas eucariotas superiores incluyen lmeas celulares establecidas de marnfferos. Se emplean de forma ventajosa varios sistemas de cultivo de celulas de mamffero para expresar RPBLA porque las protemas en general se pliegan correctamente, se modifican apropiadamente y son completamente funcionales. Los ejemplos de lmeas celulares huesped de mamfferos incluyen las lmeas COS-7 de celulas de rinon de mono, descritas por Gluzman (Cell 23:175, 1981) y otras lmeas celulares capaces de expresar un vector apropiado incluyendo, por ejemplo, celulas L, lmeas celulares C127, 3T3, de ovario de hamster chino (CHO), HeLa y BHK. Se revisan los sistemas de baculovirus para la produccion de protemas heterologas en celulas de insecto en Luckow y Summers, Bio/Technology 6:47 (1988).
Tambien se pueden producir RPBLA en diferentes tejidos tales como hojas, granos, rames y cotiledones. En algunas formas de realizacion, se expresa un RPBLA en una celula de hoja de tabaco.
Como se describe en mas detalle posteriormente, se puede producir un RPBLA cultivando una celula huesped que comprende un polinucleotido que codifica una PBIS recombinante o una protema de fusion que comprende una PBlS recombinante en condiciones adecuadas para la formacion de RPBLA. Por ejemplo, se puede producir un RPBLA en una celula huesped vegetal transformando una celula huesped vegetal con un polinucleotido que comprende una secuencia que codifica una PBIS recombinante o una protema de fusion que comprende una PBlS recombinante, generando plantas transformadas a partir de la celula huesped y haciendo crecer las plantas en condiciones que son adecuadas para la formacion de RPBLA.
Se describen ciertas condiciones que son adecuadas para la formacion de RPBLA en los ejemplos posteriores. Los expertos en la materia pueden determinar otras condiciones que sean adecuadas para la formacion de RPBLA expresando la PBIS recombinante como se describe en el presente documento y evaluando la capacidad de tal PBIS recombinante conocida para formar un RPBLA en las condiciones ensayadas.
IX. Purificacion de RPBLA, de las protemas de fusion que comprenden PBIS recombinante y de las protemas de interes
Los RPBLA segun la invencion se pueden purificar usando metodos conocidos. En particular, puesto que los RPBLA son densos relativos a otras protemas presentes en las celulas huesped, los RPBLA son particularmente susceptibles de ser recogidos por centrifugacion de un homogeneizado celular.
Tambien se divulga un metodo para purificar un RPBLA que comprende (i) cultivar una celula huesped segun la invencion en condiciones adecuadas para la formacion de RPBLA; y (ii) purificar el cuerpo proteico recombinante. En aun otra divulgacion, el metodo para producir un RPBLA ademas comprende
(i) transformar un sistema huesped vegetal con el acido nucleico o vector segun la divulgacion;
(ii) generar plantas a partir de dicho sistema vegetal transformado;
(iii) hacer crecer dichas plantas en condiciones adecuadas para la formacion de RPBLA y
(iv) purificar el RPBLA.
Por tanto, en una divulgacion preferida, la purificacion del RPBLA comprende
(i) preparar un homogeneizado celular acuoso;
(ii) formar regiones de diferente densidad en el homogeneizado celular acuoso para proporcionar una region que contenga una concentracion aumentada de los RPBLA y una region que contenga una concentracion disminuida de los RPBLA; y
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(iii) separar la region con RPBLA disminuidos de la region de concentracion relativamente aumentada de RpBLA, purificando mediante ello el RPBLA.
Por tanto, se forman regiones de diferente densidad en el homogeneizado para proporcionar una region que contiene una concentracion relativamente aumentada de los RPBLA y una region que contiene una concentracion relativamente disminuida de los RPBLA. La region con RPBLA disminuidos se separa de la region de concentracion relativamente aumentada de RPBLA, purificandose de esta manera dichos RPBLA.
Una vez se purifican los RPBLA, los RPBLA recogidos se usan como estan, sin necesidad de aislar la protema de fusion, como donde los RPBLA se usan como una vacuna oral. Sin embargo, la region de concentracion relativamente aumentada se puede recoger despues de ello o se puede tratar con uno o mas reactivos o someter a uno o mas procedimientos antes del aislamiento de los RPBLA o la protema de fusion en los mismos. Por tanto, en otro aspecto, la invencion se refiere a un metodo de purificar una protema de fusion que comprende
(i) proporcionar RPBLA que comprenden una protema de fusion encerrada por una membrana, en donde la protema de fusion es una protema de fusion segun la invencion;
(ii) poner en contacto los RPBLA con un tampon acuoso que contiene una cantidad de un tensioactivo que desensambla la membrana;
(iii) mantener el contacto durante un periodo de tiempo suficiente para desensamblar la membrana y a una temperatura que no desnaturalice la protema de fusion para separar la membrana de la protema de fusion; y
(iv) recoger la protema de fusion separada.
La protema de fusion que contiene el polipeptido biologicamente activo se puede obtener de los RPBLA recogidos por disolucion de la membrana que la rodea en tampon acuoso que contiene un detergente y/o un agente reductor. Los agentes reductores ilustrativos incluyen 2-mercaptoetanol, acido tioglicolico y sales de tioglicolato, ditiotreitol (DTT), iones sulfito o bisulfito, seguido por metodos de aislamiento de protemas habituales. Dodecilsulfato de sodio (SDS) es el detergente preferido, aunque se pueden usar otros tensioactivos ionicos (desoxicolato, N-laurilsarcosina, y similares), no ionicos (Tween 20, Nonidet P-40, glucosido de octilo y similares), y dipolares (CHAPS, Zwittergent.TM, serie 3-X y similares). Se utiliza una cantidad minima de tensioactivo que disuelve o dispersa la protema de fusion.
La PBIS recombinante o protemas de fusion que comprenden la PBIS recombinante se pueden purificar segun cualquier otro metodo adecuado. Los metodos estandar incluyen cromatograffa (por ejemplo, cromatograffa de intercambio ionico, de afinidad y en columna portamano), centrifugacion, solubilidad diferencial o mediante cualquier otra tecnica estandar para purificacion de protemas. Se pueden unir a la protema etiquetas de afinidad tales como hexahistidina, dominio de union a maltosa, secuencia de recubrimiento de la gripe y glutation S-transferasa para permitir la purificacion facil mediante paso por una columna de afinidad adecuada.
Las protemas aisladas se pueden caracterizar ffsicamente usando tecnicas conocidas tales como proteolisis, resonancia magnetica nuclear y cristalograffa de rayos X.
Tambien se divulga un metodo de purificar una protema que comprende
(i) proporcionar RPBLA que comprenden una protema de fusion encerrada por membrana, en donde la protema de fusion es la protema de fusion segun la invencion;
(ii) poner en contacto los RPBLA con un tampon acuoso que contiene una cantidad de un tensioactivo que desensambla la membrana;
(iii) mantener el contacto durante un periodo de tiempo suficiente para desensamblar la membrana y a una temperatura que no desnaturaliza la protema de fusion para separar la membrana de su protema de fusion;
(iv) recoger la protema de fusion separada; y
(v) cortar el sitio de corte entre la PBIS recombinante y la protema heterologa.
Se pueden preparar protemas de fusion segun un metodo que comprende transformar un sistema de celulas huesped eucariotas tal como un animal, cultivo de celulas animales, planta o cultivo de celula vegetales, cultivo de hongos, cultivo de celulas de insecto o cultivo de algas con una secuencia de acido nucleico (ADN o ARN) que comprende (i) un primer acido nucleico que codifica una PBIS recombinante que esta operativamente unida a (ii) una segunda secuencia de acido nucleico que codifica un producto polipeptfdico de interes que es biologicamente activo. Tambien se divulga el uso de medios indirectos para introducir el ADN, tal como mediante transduccion o infeccion vmca, y se debe usar de forma intercambiable con metodos de administracion directa de ADN tal como transfeccion.
La celula o entidad huesped transformada se mantiene durante un periodo de tiempo y en condiciones de cultivo adecuadas para la expresion de la protema de fusion y ensamblaje de la protema de fusion expresada en RPBLA. Tras la expresion, la protema de fusion resultante se acumula en el sistema huesped transformado como RPBLA. La protema de fusion se puede recuperar despues de las celulas huesped o se pueden usar las celulas huesped que
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contienen la protema fusion como se desee, como para un pienso animal que contiene un nutriente o suplemento anadido. La protema de fusion se puede aislar como parte de los RPBLA o libre de los RPBLA.
Las condiciones de cultivo adecuadas para la expresion de la protema de fusion son tipicamente diferentes para cada tipo de entidad huesped o celula huesped. Sin embargo, esas condiciones las conoce el experto en la materia y se determinan facilmente. De forma similar, la duracion del mantenimiento puede ser diferente con las celulas huesped y con la cantidad de protema de fusion deseada a preparar. De nuevo, esas condiciones son bien conocidas y se pueden determinar facilmente en situaciones espedficas. Ademas, se pueden obtener condiciones espedficas de cultivo de las citas y ejemplos en el presente documento.
En otra divulgacion particular, se prepara una protema de fusion segun un metodo que comprende transformar el sistema de celula huesped tal como un animal, cultivo de celulas animales, planta, cultivo de celulas vegetales, hongos o algas con una secuencia de acido nucleico que comprende ademas de las secuencias de acidos nucleicos
(i) y (ii) anteriormente mencionadas, una secuencia de acido nucleico en el mismo marco de lectura (iii) que codifica una secuencia espaciadora de aminoacidos. La secuencia espaciadora de aminoacidos puede ser una secuencia de aminoacidos cortable por medios enzimaticos o qmmicos, o no cortable, como se apunto anteriormente. En una divulgacion particular, la secuencia de acido nucleico (iii) se coloca entre dichas secuencias de acido nucleico (i) y
(ii) , por ejemplo, el extremo 3' de la tercera secuencia de acido nucleico (iii) esta unido al extremo 5' de la segunda secuencia de acido nucleico (ii). En otra forma de realizacion, el extremo 5' de la tercera secuencia de acido nucleico
(iii) esta unido al extremo 3' de la segunda secuencia de acido nucleico (ii).
Tambien se puede usar un sistema de celulas de insecto para expresar una protema de fusion contemplada. Por ejemplo, en uno de tales sistemas se usa el virus de la poliedrosis nuclear de Autographa californica (AcNPV) o baculovirus como vector para expresar genes exogenos en celulas de Spodoptera frugiperda o en larvas de Trichoplusia. Las secuencias que codifican una protema de fusion se pueden clonar en una region no esencial del virus, tal como el gen de la poliedrina, y colocar bajo el control del promotor de la poliedrina. La insercion exitosa de una secuencia de protema de fusion inactiva el gen de la poliedrina y produce virus recombinantes que carecen de protema de recubrimiento. Los virus recombinantes se pueden usar despues para infectar, por ejemplo, celulas de S. frugiperda o larvas de Trichoplusia en las que se puede expresar la protema de fusion, por ejemplo, como se describe en Engelhard et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 91:3224-3227 y V. Luckow, “Insect Cell Expression Technology”, paginas 183-218, en Protein Engineering: Principles and Practice, J. L. Cleland et al. eds., Wiley-Liss, Inc, 1996). Los genes heterologos colocados bajo el control del promotor de la poliedrina del virus de la poliedrosis nuclear de Autographa californica (AcNPV) con frecuencia se expresan a niveles altos durante las ultimas fases de la infeccion.
Los baculovirus recombinantes que contienen el gen de la protema de fusion se construyen usando el sistema de vector lanzadera de baculovirus (Luckow et al., 1993 J. Virol., 67:4566-4579], vendido comercialmente como el sistema de expresion de baculovirus Bac-To-Bac.TM. (Life Technologies). Se preparan soluciones madre de virus recombinantes y la expresion de la protema recombinante se controla mediante protocolos estandar (O'Reilly et al., Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual, W.H. Freeman and Company, Nueva York, 1992 y King et al., The Baculovirus Expression System: A Laboratory Guide, Chapman & Hall, Londres, 1992). El uso de baculovirus u otros vectores de administracion en celulas de mairnfero, tal como el sistema 'BacMam' descrito por T. Kost y colaboradores (vease, por ejemplo, Merrihew et al., 2004 Methods Mol. Biol. 246:355-365) u otros de tales sistemas los conoce el experto en la materia y tambien se contemplan en la presente divulgacion.
Los sistemas de expresion vegetales tfpicamente proporcionan expresion sistemica o constitutiva de un transgen insertado. La expresion sistemica puede ser util cuando la mayona o toda la planta se usa como fuente de los RPBLA y sus protemas de fusion. Sin embargo, puede ser mas eficaz expresar los RPBLA y su contenido en protema de fusion en un organo de almacenamiento de la planta tal como una rafz, semilla o fruto del que las partmulas se pueden aislar o ingerir mas facilmente.
Una manera de alcanzar expresion en un organo de almacenamiento es usar un promotor que exprese su gen controlado en uno o mas organos vegetales no fotosinteticos preseleccionados o predeterminados. La expresion en uno o mas organos de almacenamiento preseleccionados con poca o ninguna expresion en otros organos tales como rames, semilla o fruto frente a hojas o tallos se denomina en el presente documento expresion mejorada o preferente. La expresion en sustancialmente solo un organo de almacenamiento y sustancialmente sin expresion en otros organos de almacenamiento se denomina expresion espedfica de organo; es decir, una relacion de productos de expresion en un organo de almacenamiento relativo a otro de aproximadamente 100:1 o mayor indica especificidad de organo. Los promotores espedficos de organos de almacenamiento son por tanto miembros de la clase de promotores mejorados de organos de almacenamiento.
Los organos de almacenamiento vegetales de ejemplo incluyen las rafces de zanahorias, taro o yuca, tuberculos de patata y la carne de frutos tales como guayaba roja, fruta de la pasion, mango, papaya, tomate, aguacate, cereza, clementina, mandarina, palma, melones tal como cantalupo y sandfas y otros frutos carnosos tales como
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calabacines, pepinos, mangos, albaricoques, melocotones, as^ como las semillas de ir^z, soja, arroz, aceite de semillas de colza y similares.
La transfeccion de celulas vegetales usando Agrobacterium tumefaciens tipicamente se lleva a cabo mejor en plantas dicotiledoneas. Las monocotiledoneas normalmente se transforman mas facilmente por la denominada transferencia genica directa de protoplastos. La transferencia genica directa normalmente se lleva a cabo mediante electroporacion, mediante transferencia mediada por polietilenglicol o bombardeo de celulas por microproyectiles que llevan el ADN necesitado. Estos metodos de transfeccion se conocen bien en la tecnica y no necesitan discusion adicional en el presente documento. Los metodos para regenerar plantas enteras a partir de celulas transfectadas y protoplastos tambien son bien conocidos, como lo son las tecnicas para obtener una protema deseada de tejidos vegetales. Vease tambien, las patentes de EE UU No, 5.618.988 y 5.679.880 y las citas en las mismas.
Una planta transgenica formada usando transformacion con Agrobacterium, electroporacion u otros metodos tfpicamente contiene un unico gen en un cromosoma. Una planta transgenica tambien puede ser homocigota para el gen estructural anadido, es decir, una planta transgenica que contiene dos genes anadidos, un gen en el mismo locus en cada cromosoma de un par de cromosomas. Se puede obtener una planta transgenica homocigota apareando sexualmente (autofecundacion) una planta transgenica segregante independiente que contiene un unico gen anadido, germinando algunas de las semillas producidas y analizando las plantas resultantes producidas por la acumulacion mejorada de partfculas quimeras relativo a una planta control (nativa, no transgenica) o transgenica segregante independiente. Una planta transgenica homocigota muestra acumulacion mejorada de partmulas quimeras comparada tanto con una planta nativa no transgenica como con una planta transgenica segregante independiente.
Un experto en la materia apreciara que la eleccion de la protema o peptido que se puede producir usando la invencion como se ha descrito es grande y variada. Pueden ser, por ejemplo, enzimas industriales, antfgenos, citoquinas, receptores, agonistas, protemas nutraceuticas, un producto con valor anadido, protema farmaceuticamente activa y similares. Esto incluye, sin limitacion, 16ESH, CTB, Gb, Les, TB, PAP, Cap, E2, Np, Her, glucosa oxidasa, glucosa isomerasa, peroxidasa, oxidasa alternativa, GOOX, beta-galactosidasa, glucosa amilasa, lipasa, lipasa versatil, cloroperoxidasa, xilosa isomerasa, Mn peroxidasa, catalasa, formiato deshidrogenasa, alcohol deshidrogenasa, alfa-1-antitripsina, defensina, hormona del crecimiento humana, GM-CSF, EGF, factor de crecimiento de hepatocitos. Se apreciara que esta lista no es en ninguna manera exhaustiva.
X. Usos de los RPBLA como farmacos
Como se describe en el presente documento, la formacion de RPBLA permite purificar protemas de fusion que comprenden una PBIS recombinante usando tecnicas muy sencillas. Por tanto, las protemas de fusion que comprenden una PBIS recombinante y una protema de interes se pueden expresar y purificar facilmente. En algunas divulgaciones, la protema de interes es una protema terapeutica. Como tal, se puede formular un farmaco purificando una protema de fusion que comprende una PBIS recombinante y una protema de interes y opcionalmente eliminando la PBIS recombinante usando metodos descritos en el presente documento o conocidos en la tecnica. La protema de interes aislada se puede formular despues para uso farmaceutico segun tecnicas conocidas.
Por tanto, en algunas divulgaciones, la protema de fusion o protema de interes obtenida mediante los metodos descritos en el presente documento se formula en una forma “farmaceuticamente aceptable”. “Farmaceuticamente aceptable” se refiere a un bioproducto que es, en el ambito del juicio medico razonable, adecuado para contacto con los tejidos de seres humanos y animales sin toxicidad excesiva u otras complicaciones equivalentes a una relacion beneficio/riesgo razonable.
La protema de fusion o protema de interes obtenida por los metodos descritos en el presente documento se puede formular en composiciones farmaceuticas para administracion a mamfferos, incluyendo seres humanos. Las composiciones farmaceuticas usadas en los metodos de esta invencion comprenden soportes farmaceuticamente aceptables, incluyendo, por ejemplo, intercambiadores de iones, alumina, estearato de aluminio, lecitina, protemas de suero, tal como seroalbumina humana, sustancias reguladoras tal como fosfatos, glicina, acido sorbico, sorbato de potasio, mezclas de gliceridos parciales de acidos grasos vegetales saturados, agua, sales o electrolitos tales como sulfato de protamina, hidrogenofosfato disodico, hidrogenofosfato de potasio, cloruro de sodio, sales de zinc, sflice coloidal, trisilicato de magnesio, polivinilpirrolidona, sustancias basadas en celulosa, polietilenglicol, carboximetilcelulosa sodica, poliacrilatos, ceras, polfmeros en bloque de polietileno-polioxipropileno, polietilenglicol y lanolina.
Las composiciones usadas en los metodos de la presente invencion se pueden administrar por cualquier metodo adecuado, por ejemplo, por via parenteral, intraventricular, oral, por aerosol de inhalacion, por via topica, rectal, nasal, bucal, vaginal o mediante un deposito implantado. El termino “parenteral” como se usa aqrn incluye tecnicas
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de inyeccion o infusion subcutanea, intravenosa, intramuscular, intraarticular, intrasinovial, intraesternal, intratecal, intrahepatica, intralesion e intracraneal.
Una dosis y pauta de tratamiento espedficas para cualquier paciente particular dependera de una variedad de factores, incluyendo el anticuerpo particular usado, la edad, peso corporal, salud general, sexo y dieta del paciente, y el tiempo de administracion, velocidad de excrecion, combinacion de farmacos y la gravedad de la enfermedad particular que se trata. El juicio de tales factores entre los profesionales medicos esta dentro de de las habilidades de la tecnica. La cantidad tambien dependera del paciente individual que se va a tratar, la via de administracion, el tipo de formulacion, las caractensticas del compuesto usado, la gravedad de la enfermedad y el efecto deseado. La cantidad usada se puede determinar mediante principios farmacologicos y farmacocineticos bien conocidos en la tecnica.
Ademas, los RPBLA se pueden usar terapeuticamente ellos mismos. Por ejemplo, el uso de RPBLA en vacunas e inoculos se ha descrito previamente en la solicitud publicada de EE UU No. 2007/0243198.
Los RPBLA se pueden usar como el inmunogeno de un inoculo o vacuna en un paciente humano u otro huesped animal adecuado tal como un chimpance, raton, rata, caballo, oveja, bovino, perro, gato o similar. Un inoculo puede inducir una respuesta de celulas B o celulas T (estimulacion) tal como la produccion de anticuerpos que inmunorreaccionan con el epftopo inmunogenico o determinante antigenico, o la activacion de celulas T a tal epftopo, mientras que una vacuna proporciona proteccion contra la entidad de la que deriva el inmunogeno mediante una o ambas de una respuesta de celulas B o celulas T.
Los RPBLA de una vacuna contemplada pueden actuar en celulas presentadoras de antfgeno (CPA) tal como celulas dendrfticas y monocitos/macrofagos que engullen los RPBLA y procesan su contenido. Al actuar sobre estos tipos celulares, los RPBLA pueden mejorar la administracion de antfgeno a celulas presentadoras de antfgeno. Esos RPBLA tambien pueden mejorar el procesamiento y la presentacion del antfgeno a celulas presentadoras de antfgeno.
Por tanto, se puede producir una vacuna o inoculo disolviendo o dispersando una cantidad inmunogenica eficaz de ensamblajes recombinantes similares a cuerpos proteicos (RPBLA) en un diluyente farmaceuticamente aceptable. Los RPBLA pueden contener una protema de fusion recombinante que ella misma comprende dos secuencias unidas: una secuencia es una PBIS recombinante y la otra es un polipeptido biologicamente activo contra el que se va a inducir una respuesta inmunologica mediante dicha vacuna o inoculo.
La activacion de celulas T se puede medir mediante varias tecnicas. En la practica normal, un animal huesped se inocula con una vacuna de RPBLA contemplada y despues de ello se recogen las celulas mononucleares de sangre perifericas (CMSP). Esas CMSP se cultivan despues in vitro en presencia del polipeptido biologicamente activo (inmunogeno de celulas T) durante un periodo de tiempo de aproximadamente tres a cinco dfas. Se ensayan despues la proliferacion o secrecion de una citoquina tales como IL-2, GM-CSF o IFN-gamma de las CMSP cultivadas. Los ensayos para la activacion de celulas T son bien conocidos en la tecnica. Vease, por ejemplo, la patente de EE UU No. 5.478.726 y la tecnica citada en ella.
Un inoculo o vacuna divulgados comprende una cantidad inmunologicamente eficaz de RPBLA que se disuelven o dispersan en una composicion diluyente farmaceuticamente aceptable que tipicamente tambien contiene agua. Cuando se administra a un animal huesped en el que se va a inducir una respuesta inmunologica contra el peptido biologicamente activo por la vacuna o inoculo, tal como un animal huesped en necesidad de inmunizacion o en el que se desea que se induzcan anticuerpos, tal como un mamfero (por ejemplo, un raton, pero, cabra, oveja, caballo, bovino, mono, simio o ser humano) o ave (por ejemplo, un pollo, pavo, pato o ganso), un inoculo induce anticuerpos que inmunorreaccionan con uno o mas determinantes antigenicos del polipeptido diana biologicamente activo.
La cantidad de inmunogeno de RPBLA utilizado en cada inmunizacion se denomina una cantidad inmunogenicamente eficaz y puede variar ampliamente, dependiendo entre otros, del inmunogeno de RPBLA, paciente inmunizado y la presencia de un adyuvante en la vacuna. Cantidades inmunogenicamente eficaces para una (i) vacuna y un (ii) inoculo proporcionan la (i) proteccion o (ii) anticuerpo o actividad de celulas T, respectivamente, discutidas aqrn anteriormente.
Las vacunas o inoculos tfpicamente contienen una concentracion de inmunogeno de RPBLA desde aproximadamente 1 microgramo hasta aproximadamente 1 miligramo por inoculacion (dosis unitaria) y preferiblemente desde aproximadamente 10 microgramos hasta aproximadamente 50 microgramos por dosis unitaria. El termino “dosis unitaria” perteneciente a una vacuna o inoculo de la presente invencion se refiere a unidades ffsicamente discretas adecuadas como dosis unitarias para animales, cada unidad contiene una cantidad predeterminada de material activo calculada para producir de forma individual o colectiva el efecto inmunogenico deseado en asociacion con el diluyente requerido, es decir, soporte o vehfculo.
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Las vacunas o inoculos tipicamente se preparan a partir de un inmunogeno de RPBLA recuperado dispersando el inmunogeno, en forma particulada, en un vehmulo diluyente fisiologicamente tolerable (aceptable) tales como agua, solucion salina, solucion salina tamponada en fosfato (PBS), solucion salina tamponada en acetato (ABS), solucion de Ringer o similares para formar una composicion acuosa. El vehmulo diluyente tambien puede incluir materiales oleaginosos tales como aceite de cacahuete, escualano o escualeno como se discute en el presente documento posteriormente.
La preparacion de inoculos y vacunas que contienen materiales proteicos como principios activos tambien esta bien entendida en la tecnica. Tfpicamente, tales inoculos o vacunas se preparan como parenterales, sea como soluciones o suspensiones lfquidas; tambien se pueden preparar formas solidas adecuadas para solucion en, o suspension en, lfquido antes de la inyeccion. La preparacion tambien se puede emulsionar.
Los RPBLA inmunogenicamente activos con frecuencia se mezclan con excipientes que son farmaceuticamente aceptables y compatibles con el principio activo. Los excipientes adecuados son, por ejemplo, agua, solucion salina, dextrosa, glicerol, etanol o similares y combinaciones de los mismos. Ademas, si se desea, un inoculo o vacuna puede contener cantidades minoritarias de sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsionantes, agentes reguladores del pH que aumentan la eficacia inmunogenica de la composicion.
XI. Uso de los RPBLA como productos alimenticios
Los RPBLA tambien se pueden usar para aumentar el valor nutricional de productos alimenticios. Por ejemplo, protemas de fusion que comprenden una PBIS recombinante y una protema o peptido con valor nutricional (por ejemplo, peptidos enriquecidos en aminoacidos esenciales) y se pueden expresar en un producto alimenticio. Tales protemas de fusion pueden, en algunas divulgaciones, incluir una PBIS recombinante que sea menos alergenica que una PBIS de tipo salvaje. Los autores de la presente invencion han observado que la PBIS segun la presente invencion muestra una alergenicidad predicha reducida cuando se compara con la PBIS de zema no modificada (RX3). Ademas, basado en esta observacion, los autores de la presente invencion tambien han desarrollado PBIS nuevas que muestran alergenicidad reducida, denominados de aqu en adelante RX3-LA1 y RX3-LA2.
Por tanto, la divulgacion tambien se refiere a una version no alergenica de la PBIS, en donde dicha PBIS se selecciona del grupo de RX3-LA1 (SEQ ID NO: 60) y RX3-LA2 (SEQ ID NO: 61).
RX3-LA1 (SEQ ID NO:60)
THTSGGCGCA PPPPAAAPPP AAAPPPAAAP PPAAAPPPAA APPPAAAPPP AAAPPPAAAP PPPCHYPTAP
ARPAPAPAPA PCPCAAPAPS PCQ
RX3-LA2 (SEQ ID NO:61)
THTSGGCGCA PPPPAAAPPP AAAPPPAAAP PPAAAPPPAA APPPAAAPPP AAAPPPAAAP PPPCHYPPAP
APPAPAPPAP ACPCAAPAPS PCQ
En algunas divulgaciones, la PBIS recombinante es menos alergenica que una PBIS de tipo salvaje, por ejemplo, la PBIS de la gamma-zema del mafz.
La alergenicidad se puede determinar segun metodos descritos en el presente documento u otros metodos conocidos en la tecnica. Por ejemplo, se ha usado la homologfa de la secuencia de aminoacidos para evaluar el
potencial alergenico. Se pueden usar comparaciones de homologfa de secuencia para determinar el grado al que
una protema recien expresada o identificada es similar en estructura a un alergeno conocido. Esta informacion puede predecir si esa protema tiene potencial alergenico. Estas comparaciones se pueden realizar usando varios algoritmos tal como FASTA o BLASTP para predecir similitudes estructurales globales. La reactividad cruzada de IgE entre la protema recien expresada o identificada y un alergeno conocido se puede considerar una posibilidad cuando hay mas del 35 por ciento de identidad en un segmento de 80 o mas aminoacidos (Organizacion de las Naciones Unidas para la Alimentacion y la Agricultura (FAO) y la Organizacion Mundial de la Salud (OMS), 2001). Tambien se pueden usar otros criterios cientfficamente justificados para predecir la reactividad cruzada de IgE.
En algunas divulgaciones la alergenicidad de una PBIS recombinante se determina usando la Base de Datos Allergen Online (version 10.0, Enero 2010;
http://www.allergenonline.com) desarrollada por Food Allergy Research and Resource Program. Por tanto, en algunas divulgaciones, la PBIS recombinante contiene menos resultados con mas del 35% de identidad a peptidos alergenicos que la PBIS de la gamma-zema de mafz en la Base de Datos Allergen Online.
En algunas divulgaciones, la PBIS recombinante contiene no mas de 9 resultados con al menos el 35% de identidad a un peptido alergenico conocido. En algunas divulgaciones, la PBIS recombinante contiene no mas de 8 resultados con al menos el 35% de identidad a un peptido alergenico conocido. En algunas divulgaciones, la PBIS recombinante contiene no mas de 7 resultados con al menos el 35% de identidad a un peptido alergenico conocido. En algunas divulgaciones, la PBIS recombinante contiene no mas de 6 resultados con al menos el 35% de identidad
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a un peptido alergenico conocido. En algunas divulgaciones, la PBIS recombinante contiene no mas de 5 resultados con al menos el 35% de identidad a un peptido alergenico conocido. En algunas divulgaciones, la PBIS recombinante contiene no mas de 4 resultados con al menos el 35% de identidad a un peptido alergenico conocido. En algunas divulgaciones, la PBIS recombinante contiene no mas de 3 resultados con al menos el 35% de identidad a un peptido alergenico conocido. En algunas divulgaciones, la PBIS recombinante contiene no mas de 2 resultados con al menos el 35% de identidad a un peptido alergenico conocido. En algunas divulgaciones, la PBIS recombinante contiene no mas de 1 resultado con al menos el 35% de identidad a un peptido alergenico conocido. En algunas divulgaciones, la PBIS recombinante no contiene ningun resultado con al menos el 35% de identidad a un peptido alergenico conocido.
En algunas divulgaciones, la PBIS recombinante contiene no mas de 9 resultados con al menos el 30% de identidad a un peptido alergenico conocido. En algunas divulgaciones, la PBIS recombinante contiene no mas de 8 resultados con al menos el 30% de identidad a un peptido alergenico conocido. En algunas divulgaciones, la PBIS recombinante contiene no mas de 7 resultados con al menos el 30% de identidad a un peptido alergenico conocido. En algunas divulgaciones, la PBIS recombinante contiene no mas de 6 resultados con al menos el 30% de identidad a un peptido alergenico conocido. En algunas divulgaciones, la PBIS recombinante contiene no mas de 5 resultados con al menos el 30% de identidad a un peptido alergenico conocido. En algunas divulgaciones, la PBIS recombinante contiene no mas de 4 resultados con al menos el 30% de identidad a un peptido alergenico conocido. En algunas divulgaciones, la PBIS recombinante contiene no mas de 3 resultados con al menos el 30% de identidad a un peptido alergenico conocido. En algunas divulgaciones, la PBIS recombinante contiene no mas de 2 resultados con al menos el 30% de identidad a un peptido alergenico conocido. En algunas divulgaciones, la PBIS recombinante contiene no mas de 1 resultado con al menos el 30% de identidad a un peptido alergenico conocido. En algunas divulgaciones, la PBIS recombinante no contiene ningun resultado con al menos el 30% de identidad a un peptido alergenico conocido.
Se han desarrollado varias tecnicas para determinar la respuesta alergenica desarrollada despues de la administracion de un alergeno. Por ejemplo, la presencia de IgE, una inmunoglobulina asociada con alergenicidad, se puede determinar por ensayos de ELISA y por pruebas competitivas de ELISA. Kim et al., Yonsei Medical Journal 47: 505-12 (2006); Fritsche, Toxicology letters 140-141:303-309 (2003. En algunas divulgaciones, la PBIS recombinante genera una respuesta de anticuerpos IgE disminuida in vivo comprada con la PBIS de la gamma-zema de mafz. En algunas divulgaciones, la PBIS recombinante genera una respuesta disminuida en una prueba de puncion comparada con la PBIS de la gamma-zema de mafz.
Ademas, se ha observado resistencia a digestion con pepsina en varios alergenos alimenticios. Por tanto, existe una correlacion entre resistencia a digestion con pepsina y potencial alergenico. El metodo esbozado en la Farmacopea de los Estados Unidos (1995) se uso en el establecimiento de la correlacion. Astwood et al. Nat Biotechnol 14:126973 (1996. Por tanto, la resistencia de una protema a degradacion en presencia de pepsina en condiciones apropiadas indica que una protema puede tener potencial alergenico. En algunas divulgaciones, la PBIS recombinante es menos resistente a degradacion proteica en presencia de pepsina que la PBIS de la gamma-zema de mafz.
Se pueden realizar analisis adicionales para determinar la probabilidad del potencial alergenico de la protema recien expresada o identificada. Tambien se han descrito procedimiento ex vivo como prueba para alergenicidad usando cultivo de celulas o tejido. Evaluation of Allergenicity of Genetically Modified Foods: Report of Joint FAO/WHO Expert Consultation on Allergenicity of Foods Derived from Biotechnology; Organizacion de las Naciones Unidas para Alimentacion y Agricultura (FAO); Roma Italia (2001). Una de estas tecnicas se basa en el hecho de que se puede medir la capacidad de provocar celulas cebadas mediada por IgE de epttopos alergenicos usando un ensayo in vitro funcional. Basado en celulas cebadas peritoneales de ratas sensibilizadas pasivamente con IgE de rata espedfica y marcadas con 3H-serotinina, las celulas se provocan para liberacion de mediadores con diluciones estandar del alergeno. Fritsche, Toxicology letters 140-141:303-309 (2003). Por tanto, en algunas divulgaciones, la PBIS recombinante genera liberacion de mediadores disminuida comparado con la PBIS de la gamma-zema de mafz.
La reaccion alergica dependiente de IgE esta compuesta de dos fases. La primera fase es un paso de induccion, donde el sistema inmunitario del huesped se sensibiliza por el alergeno. Como resultado, se producen anticuerpos IgE anti-alergeno espedficos, y los anticuerpos se fijan despues por las celulas cebadas en organos diana. La segunda fase es una fase de desencadenamiento mediada por la union del alergeno a estos anticuerpos IgE y estimulando la liberacion de mediador (histamina) de las celulas cebadas. Para evaluar la alergenicidad de antfgenos, se pueden examinar una o ambas fases mediante pruebas in vivo apropiadas, esencialmente como se describe en Fritsche, Toxicology letters 140-141:303-309 (2003). Por tanto, por ejemplo, en algunas divulgaciones, la PBIS recombinante genera una produccion de anticuerpos IgE disminuida comparada con la PBIS de la gamma- zema de mafz. En algunas divulgaciones, la PBIS recombinante genera una liberacion de mediador disminuida de celulas cebadas comparada con la PBIS de la gamma-zema de mafz.
La divulgacion tambien proporciona alimentos, suplementos alimenticios, preparaciones cosmeticas, formulaciones nutricionales que contienen los RPBLA segun la invencion o materiales derivados de celulas u organismos
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huespedes que comprenden dichos RPBLA. Los RPBLA pueden estar formados por la PBIS como tales o por protemas de fusion que comprenden los RPBLA. En una divulgacion preferida, el RPBLA que forma parte del producto alimenticio se forma mediante el ensamblaje de una protema de fusion que comprende una PBIS seleccionada del grupo de PA, RX3(A3), R8(4C), RX3-LAl, RX3-LA2 y una combinacion de las mismas.
El termino “producto alimenticio” como se usa en el presente documento, se refiere a una sustancia o composicion que es adecuada para consumo humano y/o animal. El termino “producto alimenticio” como se usa en el presente documento puede significar un producto alimenticio en una forma que esta lista para consumir. De forma alternativa o adicional, sin embargo, el termino producto alimenticio como se usa en el presente documento puede significar uno o mas materiales alimenticios que se usan en la preparacion de un producto alimenticio. A modo de ejemplo solo, el termino producto alimenticio abarca tanto productos horneados producidos de masa como la masa usada en la preparacion de tales productos horneados.
El producto alimenticio segun la presente invencion puede derivar de todo o una parte de los organismos recombinantes que expresan los RPBLA segun la invencion. Por ejemplo, el producto alimenticio puede derivar del endospermo de una planta que expresa el RPBLA. Los productos alimenticios y suplementos alimenticios que contienen el material propagante de la invencion, o partes del mismo, pueden incluir alimentos basados en cereales, por ejemplo, cereales de desayuno, harinas y alimentos que contienen estas harinas, por ejemplo, panes, pan rallado, masa lfquida, tartas, pasteles, galletas, productos de panadena y pasta. Ademas, tambien se proporcionan alimentos y suplementos alimenticios que contienen el material propagante de vegetales, o partes de los mismos, por ejemplo, tuberculos y names. El producto alimenticio se puede, por ejemplo, seleccionar de (a) un alimento infantil o leche maternizada, o (b) un producto de panadena (por ejemplo, un pan, productos con levadura o una tarta); (c) un producto de suministro de panadena (por ejemplo, crema o un relleno o recubrimiento de pastelena); (d) una masa lfquida; o (e) un empanado; o (f) un cereal; o (g) un dulce, o (h) un saborizante o bebida en emulsion; o (i) un relleno de fruta; o (j) una salsa concentrada, sopa, salsa o espesante alimenticio; o (k) una comida o componente de comida; o (l) un producto carnico; o (m) un pienso para mascotas; o (n) un farmaco o nutraceutico, (o) un producto de patata o name; o (p) un producto lacteo (por ejemplo un postre o yogur); o (q) un alino de ensalada; o (r) un aperitivo o galleta; o (s) una pasta untable; o (t) un producto de pasta (por ejemplo fideos).
Las plantas transgenicas de esta divulgacion como se han descrito anteriormente son aplicables a seres humanos, asf como a animales domesticos, aves de corral, mascotas y otros animales.
La invencion se describe en detalle a continuacion por medio de los siguientes ejemplos que se deben considerar como meramente ilustrativos y no limitantes del ambito de la invencion.
Ejemplos
Materiales y metodos
Construccion de plasmidos para transformacion de plantas
Todas las construcciones de plasmidos se hicieron clonando un fragmento de ADN que codifica una protema de fusion mostrado en las figuras 15a y 15b mediante digestion con SalI/BamHI en el vector pC2300 (AF234315) abierto con las mismas enzimas de restriccion.
Material vegetal
Se hicieron crecer plantas de tabaco (Nicotiana benthamiana) en una camara de crecimiento in vitro a 24-26°C con un fotoperiodo de 16 horas. Las plantas adultas se hicieron crecer en un invernadero entre 18-28°C. La humedad se mantuvo entre el 55 y el 65% con un fotoperiodo medio de 16 horas.
Las plantulas para agroinfiltracion (Vaquero et al., 1999 Proc. Natl. Acad. Sci., USA 96(20):11128-11133; Kapila et al., 1997 Plant Sci. 122:101-108) se hicieron crecer de semillas durante 4-6 semanas en las condiciones in vitro descritas anteriormente.
Agroinfiltracion de tabaco por vach
Se hizo crecer la cepa EHA 105 de A. tumefaciens que contema una construccion deseada en medio LB (Triptona 10 g/l, extracto de levadura 5 g/l, NaCl 10 g/l) suplementado con kanamicina (50 mg/ml) y rifampicina (100 mg/l) a 28°C con agitacion (250 rpm) durante la noche (aproximadamente 18 horas). Despues se inocularon las agrobacterias en 30 ml de lB tambien suplementado con kanamicina (50 mg/ml) y rifampicina (100 mg/l). Despues de cultivar durante la noche (aproximadamente 18 horas) a 28°C, las celulas agrobacterianas se recogieron por centrifugacion durante 10 minutos a 3.000 x g y se resuspendieron en 10 ml de medio MS lfquido con MES (Sigma Chemical) 4,9 g/l y sacarosa 30 g/l a pH 5,8. El cultivo bacteriano se ajusto a una DO600 final de 0,1 para la
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agroinfiltracion. Despues, el cultivo celular se suplemento con acetosiringona a una concentracion final de 0,2 mM y se incubo durante 90 minutos a 28°C (Torrent, M., Llop-Tous, I. y Ludevid, M.D. (2009) En Recombinant Proteins from plants. Methods in Molecular Biology. Vol. 483. Ed por Gomord V y Faye L, Springer Verlag, Humana Press, Heidelberg; pp. 193-208; Voinnet, O., Rivas, S., Mestre, P. y Baulcombe, D. (2003) Plant J. 33, 949-956). Se mezclaron cultivos individuales de Agrobacterium que llevaban las construcciones de RX3 y las construcciones supresoras de silenciador HC-Pro (Goytia et al., 2006). Las plantas se cubrieron totalmente con la suspension y se aplico vado (100 KPa) durante 5-6 segundos. La suspension se retiro y las plantas se mantuvieron en el invernadero. El material vegetal se recupero y la extraccion de protema total se analizo mediante inmunotransferencia usando un anticuerpo apropiado.
Agroinfiltracion de tabaco con jeringuilla
Se hizo crecer la cepa EHA 105 de Agrobacterium tumefaciens a 28°C en caldo L suplementado con kanamicina 50 |jg ml-1 y rifampicina 50 |jg ml-1 hasta fase estacionaria. Las bacterias se sedimentaron por centrifugacion a 5000 g durante 15 minutos a temperatura ambiente y se resuspendieron en tampon MES 10 mM pH 5,6, MgCl2 10 mM y acetosiringona 200 jM hasta una DO600 final de 0,2. Las celulas se dejaron en su medio durante 3 horas a temperatura ambiente. Se mezclaron cultivos individuales de Agrobacterium que llevaban las construcciones de RX3 y las construcciones supresoras de silenciador HC-Pro (Goytia et al., 2006) y se infiltraron en la cara abaxial de hojas de plantas de Nicotiana benthamiana de 2-4 semanas de edad.
Extraccion de prote^na y prote^na total o analisis de inmunotransferencia
Se extrajeron las protemas solubles totales (PST) de hojas transformadas en tampon Tris-HCl 100 mM pH 7,5 que contema NaCl 100 mM, SDS al 0,5% y DTT 200 mM durante 1 hora a temperatura ambiente. Los extractos resultantes se centrifugaron a 10.000 x g durante 30 minutos a 4°C y las PST se separaron en geles de SDS- poliacrilamida. Las protemas se detectaron por tincion con azul de Coomassie o tincion con plata o por inmunotransferencia usando el antisuero anti-R8 (Torrent, M., Llompart, B., Lasserre-Ramassamy, S., Llop-Tous, I., Bastida, M., Marzabal, P., Westerholm-Pavinen, A., Saloheimo, M., Heifetz, P. B. y Ludevid, M.D. (2009) BMC Biology 7, 5), un anti-GFP o un anti-hGH producidos en conejos inyectados con una protema recombinante GFP o hGH expresada y purificada de celulas de E. coli y un anti-EGF comercial (Abcam).
Fraccionamiento subcelular y determinacion de la densidad de RPBLA
Se molieron tejidos de hojas de tabaco agroinfiltrados en un mortero a 0°C en el tampon de homogenizacion HB (Tris 10 mM pH 8,0, sacarosa 0,25 M e inhibidores de proteasas). El homogeneizado se filtro a traves de dos capas de Miracloth (22-24 micrometres, Calbiochem) para eliminar restos de tejido antes de centrifugar a 50 x g durante 5 minutos a 4°C. Los homogeneizados clarificados resultantes de los diferentes tejidos se cargaron en gradientes de densidad multicapa de iodixanol (Optiprep, Sigma) (capas preferidas para el calculo de densidad: 1,11, 1,17, 1,19, 1,21, 1,23 y 1,25 g/cm3) tamponados con el tampon HB. Los gradientes se centrifugaron a 4°C durante 2 horas a 80.000 x g en un rotor SW40 Ti de Beckman. Se analizaron alfcuotas equivalentes del sobrenadante, fracciones de interfase y precipitado mediante SDS-PAGE e inmunotransferencia usando anticuerpos espedficos.
Como se indica anteriormente, esta tecnica es una tecnica adecuada para determinar la densidad de los RPBLA. La siguiente tabla proporciona una relacion detallada entre el % de iodixanol (peso/volumen) en el colchon determinado y la densidad correspondiente:
Porcentaje de iodixanol (peso/volumen)
Densidad (g/ml) Porcentaje de iodixanol (peso/volumen) Densidad (g/ml)
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1,069 30 1,175
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1,079 32 1,185
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1,088 34 1,194
14
1,098 36 1,204
16
1,107 38 1,214
18
1,117 40 1,223
20
1,127 42 1,233
22
1,136 44 1,243
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1,146 46 1,252
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1,156 48 1,262
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1,165 50 1,272
Tabla 3: Relacion entre el % de iodixanol (peso/volumen) en el colchon determinado y la densidad correspondiente. Inmunocitoqu^mica e imagenes: microscop^a confocal
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Se montaron secciones de tejido de hoja de tabaco transformado con secuencias fluorescentes en agua para observacion confocal directa. Se obtuvieron micrograffas usando el microscopio confocal de barrido laser Leica TCS SP (Heidelberg, Alemania). Se recogieron imagenes fluorescentes verdes despues de excitacion a 515 nm usando una ventana de emision de 530-630 nm. Se recogieron imagenes fluorescentes cian a una excitacion de 458 nm y una ventana de emision de 470-530 nm. Se recogieron imagenes de protema fluorescente verde a excitacion de 488 nm con el laser ionico de argon usando una ventana de emision ajustada a 495-535 nm. Se recogieron imagenes fluorescentes rojas despues de excitacion a 543 nm con un laser de HeNe y una ventana de emision de 550-600 nm. Las secciones opticas teman 0,5 pm de espesor. Se registraron imagenes y proyecciones digitales usando el software del microscopio confocal. Las imagenes presentadas en las figuras de microscopfa son representativas de al menos cinco experimentos independientes.
Determinacion del numero y tamano de los RPBLA por microscop^a confocal
Se determino la distribucion por tamano (en porcentaje relativo) de los PB durante el tiempo midiendo los diametros aparentes de aproximadamente 500 PB por tiempo (2, 4, 7 y 10 dpi). Se analizaron tres plantas transformadas independientes por tiempo y se uso el software Olympus fluoview v. 1.6a para medir los PB fluorescentes observados en el microscopio confocal FV1000 de Olympus. Para la determinacion del numero de PB, se usaron proyecciones confocales correspondientes a 105 pm3 (70 x 70 x 20) de tejido transformado. Se analizaron cuarenta imagenes confocales de 8 plantas transformadas independientes por tiempo. Los resultados se analizaron estadfsticamente mediante analisis de varianza (ANOVA) unidireccional y la prueba de comparaciones multiples de Bonferroni (p<0,05 se considero significativamente diferente).
Aislamiento de RPBLA a centrifugacion de baja densidad
Se molio aproximadamente 1 gramo de tejidos de hoja de tabaco agroinfiltrados en un mortero a 0°C en 5 ml de tampon de homogenizacion PBP3 (Tris 100 mM pH 8,0, KCl 50 mM, MgCl2 6 mM, EDTA 10 mM y NaCl 0,5 M). El homogeneizado (H0) se filtro a traves de una capa de Miracloth (22-24 micrometres, Calbiochem). Los homogeneizados clarificados resultantes de los homogeneizados preclarificados (H1) se centrifugaron a baja velocidad (1.500 x g) durante 10 minutos y se analizaron el precipitado y sobrenadante (SN) resultantes. El precipitado de la centrifugacion a baja velocidad se resuspendio mediante sonicacion moderada (ciclo del 50%, control de salida 3, 10 segundos, Branson sonifier 250) en 3-5 ml de tampon de lavado (Triton® X-100 al 0,5%) y por ultimo se incubaron durante 15-60 minutos a temperatura ambiente. Despues de una segunda centrifugacion a baja velocidad, se analizaron cantidades equivalentes del precipitado (wPB) y sobrenadante (Ws) resultantes.
Purificacion de EGF
Se solubilizo una fraccion wPB de 80 gramos (peso fresco) de hojas de planta de tabaco agroinfiltradas con Zera(E)- EGF como se indica anteriormente y se corto con 30 microlitros de FXa (Qiagen) en presencia de CaCl2 2 mM a 37°C. La reaccion se paro despues de 3 horas anadiendo EDTA 50 mM. La muestra se diluyo luego 5 veces en tampon A. El EGF se purifico por medio de una columna de 3 ml de fase inversa Resource de Amersham. Se realizo el gradiente de acetonitrilo con 20 volumenes de columna con tampon A (acetato 10 mM pH 4, bME 2 mM y acetonitrilo al 5%) y tampon B (acetato 10 mM pH 4, bME 2 mM y acetonitrilo al 75%). Se recupero EGF puro en dos fracciones a aproximadamente el 40% de acetonitrilo y se dializo contra Tris 50 mM pH 8, bME 2 mM y NaCl 100 mM durante la noche a 4°C en una membrana de dialisis de 3,5 kDA.
Ensayo de actividad de EGF
Se sembraron celulas de la lmea celular de carcinoma epitelial humano (A431), que sobreexpresa el receptor de EGF, en placas (P-35) a 0,5x105 celulas/placa. Las celulas se incubaron 48 horas en medio de cultivo (MEMx1, glutamina 2 mM, aminoacidos no esenciales al 1%) y SBF (suero bovino fetal) al 10%. Despues de ello se ayunaron durante la noche en medio de cultivo sin SBF. A continuacion, se anadieron el EGF estandar (de 0 a 10 ng EGF/ml) de Promega y las muestras correspondientes (RX3(E)-EGF y EGF solubilizados) en el mismo intervalo de concentraciones y las celulas se incubaron durante 9 minutos. Despues, las celulas se lavaron dos veces con PBS fno y se congelaron en N2 lfquido para detener el metabolismo celular. Para analizar la fosforilacion del receptor de EGF, las celulas se levantaron y se analizaron cantidades equivalentes de protema total mediante el kit de ELISA sandwich PathScan® Phospho-EGF Receptor (Tyr1068) esencialmente como describe el fabricante.
Ejemplo 1: Acumulacion de RX3-GFP, RX3(R)-GFP, RX3(K)-ECFP, RX3(A)-GFP y RX3(L)-GFP en RPBLA de plantas de tabaco transformadas
Se ha descrito que la anfipaticidad del dominio de repeticion de RX3 es esencial en el autoensamblaje y la formacion de RPBLA (Ludevid et al., Plant Mol. Biol. (1984) 3:277-234; Kogan et al., J. Mol. Biol. (2001) 312:907-913). Para caracterizar la importancia de la anfipaticidad en la capacidad de induccion de RPBLA, se analizaron un conjunto de etiquetas de RX3 fusionadas a una protema fluorescente indicadora (GFP o ECFP) (Fig. 1A): RX3 nativo con histidinas (PPPVHL)s (SEQ ID NO:62) [RX3], dos variantes de RX3 con un caracter anfipatico aumentado obtenidas
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por la sustitucion de las histidinas por arginina (PPPVRL)8 (SEQ ID NO:63) [RX3(R)] y lisina (PPPVKL)8 (SEQ ID NO:64) [RX3(K)] y dos variantes de RX3 con un RD completamente hidrofobico donde las histidinas se cambiaron por alanina (PPPVAL)8 (SEQ ID NO:66) [RX3(A)] y leucina y (PPPVLL)8 (SEQ ID NO:67) [RX3(L)].
Como se esperaba, las plantas de tabaco transformadas con RX3-GFP acumularon un gran numero de RPBLA fluorescentes de forma redonda de aproximadamente 1 micrometro de diametro en la celula. Sorprendentemente, a pesar de la ausencia de un RD anfipatico, las protemas de fusion RX3(A)-GFP y RX3(L)-GFP tambien se retuvieron dentro del retmulo endoplasmico (RE) de la celula y formaron RPBLA (Fig. 1C).
La protema de fusion RX3(A)-GFP se acumulo en grandes RPBLA, que eran ligeramente mayores que los RPBLA obtenidos de la expresion de RX3-GFP. Los RPBLA de RX3(L)-GFP median aproximadamente 0,5 micrometros. No se observo fluorescencia en la superficie de la celula, lo que indica que la protema se acumulo eficazmente en RPBLA y no se secretaba. Estos estudios tambien indican que las etiquetas de RX3 con un RD completamente hidrofobico son capaces de ensamblarse e inducir la formacion de RPBLA en plantas.
Basado en los sorprendentes resultados obtenidos con las etiquetas de RX3 que conteman RD hidrofobico, se decidio caracterizar mas la importancia de la anfipaticidad de RD de las etiquetas de RX3 analizando la acumulacion de RX3 anfipatico en la que todas las histidinas se cambiaron por argininas [RX3(R)] o lisinas [RX3(K)]. Arginina y lisina tiene un pKa alto (12 y 10,5, respectivamente) comparadas con histidina. De esta manera, estas sustituciones produjeron un RD con mayor carga neta positiva al valor de pH del retmulo endoplasmico, una carga neta positiva aumentada y una anfipaticidad aumentada del RD. Sorprendentemente, el analisis de microscopia confocal mostro fluorescencia muy baja al usar estas construcciones. Cuando se aplicaron las mismas condiciones usadas para las otras variantes de RX3 a RX3(R)-GFP y RX3(K)-ECFP, no se observo senal significativa. De forma similar, se observo baja acumulacion de protemas de fusion RX3(R)-GFP y RX3(K)-ECFP mediante inmunotransferencia usando un anticuerpo anti-GFP. Como se muestra en la figura 1B, RX3(R)-GFP se acumulo poco comparada con RX3-GFP, y no se observo protema de fusion RX3(K)-ECFP. De forma interesante, en los homogeneizados que expresan RX3(K)-ECFP, solo se observo una banda de mayor movilidad electroforetica que era inmunorreactiva con el anticuerpo anti-GFP. Esta banda probablemente corresponde a ECFP parcialmente degradada (Fig. 1B, carril 4, punta de flecha negra). Las imagenes muy expuestas de hojas de tabaco agroinfiltradas con pRX3(R)-GFP o pRX3(K)-ECFP, mostraron que la protema no se retiene eficazmente en los RPBLA derivados del RE. La expresion de RX3(R)-GFP produjo la secrecion de la mayona de la protema de fusion y solo se acumularon en el interior de la celula unos pocos RPBLA muy pequenos (Fig. 1C). Respecto a RX3(K)-ECFP los resultados fueron incluso mas sorprendentes, porque no se observaron RPBLA y la fluorescencia se asociaba a cloroplastos y secrecion (Fig. 1C, recuadro). Basado en este experimento y en el hecho de que parece que la mayona de la protema de fusion se degrada, es posible que la fluorescencia asociada con cloroplastos se deba a ECFP parcialmente degradada. Es poco probable que RX3(K)-ECFP se transporte a este organulo.
En conjunto, estos resultados indican que, al contrario de lo que se sugiere en la bibliograffa, la anfipaticidad de RX3 no es un elemento clave necesario para el ensamblaje de protemas e induccion de RPBLA. Ademas, el aumento de la anfipaticidad de RD por la sustitucion de histidina con arginina o lisina reduce significativamente la capacidad de estos peptidos de inducir la formacion de RPBLA.
Ejemplo 2: Caracterizacion de la densidad de RPBLA inducidos por RX3-GFP, RX3(A)-GFP y RX3(L)-GFP en plantas de tabaco
Una caractenstica de los RPBLA es su alta densidad, que se puede determinar mediante gradientes de densidad en capas (Torrent, BMC Biology 2009, 7:5). En el presente estudio, se llevaron a cabo gradientes de Optiprep™ cargando homogeneizados de plantas filtrados en los siguientes colchones de Optiprep™:
Optiprep™ %
Densidad (g/ml)
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1,117
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1,175
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1,194
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Tabla 4: Tabla de correspondencia de concentracion de Optiprep (%) y densidad (g/ml).
Los microsomas (RE, Golgi, etc.) sedimentan en la fraccion f18, la interfase por encima del colchon de baja densidad con el 18% de Optiprep™. Tfpicamente, los RPBLA son mas densos que los microsomas y se recuperan de fracciones mas densas del 26-28% de Optiprep™.
Como se muestra en la figura 2, cuando el homogeneizado de una planta de tabaco que expresa la protema de fusion RX3-GFP se ultrcentrifugo en el gradiente densidad en capa determinado, como se esperaba, la mayona de
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la protema se recupero en las fracciones densas f34 y f38. Este resultado demuestra que la protema de fusion se ensambla estrechamente dentro del RE y forma RPBLA densos. Tambien se observa algo de RX3-GFP en la fraccion de baja densidad f18 que corresponde a microsomas, pero esto probablemente representa protema de fusion reden sintetizada que aun no esta totalmente ensamblada en estructuras densas.
Como se ha mencionado anteriormente, dos de las construcciones analizadas teman un RD completamente hidrofobico (RX3(A)-GFP y RX3(L)-GFP) y ambos indudan la formacion de RPBLA dentro de la celula. Cuando se analizo RX3(A)-GFP mediante gradiente de densidad, la mayona de la protema de fusion se acumulo en fracciones densas (f30 y f34), confirmando que RX3(A)-GFP se acumula en RPBLA densos. Se obtuvieron resultados similares cuando se analizaron homogeneizados clarificados de hojas de tabaco transformadas con RX3(L)-GFP. En ese caso, incluso aunque los RPBLA eran menos densos que los inducidos por la expresion de RX3(A)-GFP, se recupero una fraccion significativa de los mismos en fracciones densas (Fig. 2B; f30 y f34).
Estos datos muestran que, a pesar de la ausencia de un RD anfipatico, RX3(A)-GFP y en algun grado RX3(L)-GFP, son capaces de autoensamblarse eficazmente en RPBLA que son lo suficientemente densos para ser aislados de la mayona de los contaminantes celulares. El analisis por tincion con azul de Coomassie de volumenes equivalentes de las fracciones recuperadas de un gradiente de densidad cargado con homogeneizado de RX3(A)-GFP se muestra en la figura 2B. Se puede ver que mientras que la mayona de los contaminantes celulares se recuperan en las fracciones S y f18, f30 y f34 conteman una fraccion muy pura de RX3(A)-GFP.
Ejemplo 3: Procedimiento posterior para el aislamiento de RPBLA de plantas de tabaco mediante centrifugacion a baja velocidad
La centrifugacion en gradiente de densidad es un procedimiento analttico apropiado para la determinacion de la densidad de los RPBLA, pero no es adecuado para purificar estos organulos a gran escala. Se ha desarrollado un proceso posterior basado en una simple centrifugacion a baja velocidad y algunos pasos de lavado del sedimento recuperado (vease los procedimientos experimentales) que permite la recuperacion de una fraccion limpia de RPBLA.
Este sencillo proceso posterior se aplico a plantas de tabaco transformadas con RX3-GFP y RX3(A)-GFP, y se analizaron cantidades equivalentes de los diferentes pasos del proceso mediante inmunotransferencia y SDS-PAGE tenido con azul de Coomassie. Como se muestra en la figura 3A, casi toda la protema de fusion presente en los homogeneizados correspondientes (H0) se recupero en la fraccion de RPBLA (wPB). El rendimiento en ambos casos fue similar y muy alto ya que no se pierde protema de fusion en el sobrenadante (SN) y paso de lavado (Ws). Esta observacion se confirmo por inmunotransferencia. El hecho de que se recupere mas protema de fusion RX3(A)- GFP que RX3-GFP (Fig. 3A, comparense las fracciones wPB) de la misma cantidad de biomasa procesada no refleja un rendimiento de recuperacion mejor, sino una mayor velocidad de acumulacion de RX3(A)-GFP en las hojas de tabaco. La eficaz recuperacion es un resultado bastante sorprendente dado que los RPBLA de RX3(A)- gFp son menos densos que RX3-GFP.
El enriquecimiento alcanzado en el proceso tambien es muy alto. La mayona de los contaminantes presentes en el homogeneizado (H0) se eliminan durante el proceso y la fraccion correspondiente a los RPBLA lavados (wPB) contema casi exclusivamente la protema de fusion. Se observan varias bandas en la fraccion wPB, pero corresponden a varios estados de oligomerizacion de la misma protema de fusion y no a impurezas proteicas.
La recuperacion posterior de los RPBLA de RX3(L)-GFP se adapto centrifugando el homogeneizado correspondiente a una velocidad mayor (4.000-5.000 x g) para recuperar mas eficazmente los organulos pequenos y menos densos que conteman esta protema de fusion (Fig. 2). Sorprendentemente, incluso para RX3(L)-GFP, el rendimiento fue muy eficaz y la mayona de la protema de fusion se recupero en la fraccion de los RPBLA (wPB), como se puede observar en la figura 3B (panel derecho). El hecho de que se necesite una velocidad mayor para recuperar los RPBLA que contienen RX3(L)-GFP no afecta significativamente el enriquecimiento del proceso como se demostro mediante geles de SDS-PAGE tenidos con azul de Coomassie (Fig. 3B, panel izquierdo). Estos resultados confirman que etiquetas de RX3 con un RD completamente hidrofobico son adecuadas para la produccion y purificacion de protemas de protemas mediante aislamiento de RPBLA.
Ejemplo 4: Solubilizacion de protemas de fusion de RX3
La solubilizacion de protemas de fusion basadas en RX3 de la fraccion de los RPBLA es uno de los pasos clave en el procesamiento posterior de los RPBLA. Se usaron las fracciones de RPBLA recuperadas mediante centrifugacion a baja velocidad esencialmente como se muestra en el ejemplo 3 para comparar la solubilidad de RX3-GFP y RX3(A)-GFP. Se esperaba que la sustitucion de histidinas por alaninas en el RD disminuyera la solubilidad de las protemas de fusion en solucion acuosa porque se reduce la polaridad total de la protema, pero sorprendentemente, RX3(A)-GFP era mucho mas soluble en cada una de las condiciones ensayadas.
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Como ejemplo, en la figura 3A se comparan fracciones solubilizadas (sPB) con no solubilizadas (uPB) despues de incubar la fraccion limpia de RPBLA (wPB) durante 4 horas en tampon moderado (Tris 50 mM pH 8, TCEP 5 mM y 2bME 10 mM). Justo despues del paso de solubilizacion, la muestra se centrifugo a 16.000g durante 10 minutos y se recupero sPB como sobrenadante. Se recupero uPB como precipitado.
Como se esperaba, RX3-GFP solo se solubilizo parcialmente. La mayona de la protema de fusion en forma monomerica se solubiliza en las condiciones dadas (Fig. 3A, comparense sPB frente a uPB, punta de flecha), pero una gran cantidad de las formas multimericas estrechamente agregadas de la protema de fusion permanece en la fraccion no solubilizada (Fig. 3A, asterisco). Por el contrario, en las mismas condiciones de solubilizacion practicamente toda la protema RX3(A)-GFP se solubilizo, independientemente de la forma de agregacion. Este sorprendente resultado, que permite un rendimiento muy alto al recuperar la protema de fusion de los RPBLA lavados se confirmo con un amplio espectro de peptidos ensambladores completamente hidrofobicos fusionados a varias protemas como se muestra posteriormente.
Ejemplo 5: Acumulacion de RX3(A3)-ECFP en RPBLA de plantas de tabaco transformadas
En experimentos previos todas las nuevas variantes de RX3 consistfan en mutaciones unicas de las histidinas presentes en el RD, de modo que el papel de los residuos de valina y lisina antes y despues de las histidinas no se habfa analizado aun. Para hacer eso, todos los residuos de valina, histidina y leucina presentes en el RD se cambiaron por alaninas en una nueva variante no anfipatica de RX3 (RX3(A3)) (Fig. 4A). Se transformaron hojas de tabaco con un vector que expresaba el peptido RX3(A3) fusionado a ECFP y se analizo la formacion de RPBLA mediante microscopfa confocal 3 y 6 dfas despues de la infiltracion (dpi). Incluso en los primeros dfas despues de la infiltracion (3 dpi), se observo la presencia de un gran numero de RPBLA pequenos, lo que sugiere que la variante RX3(A3) era muy eficaz. Esta observacion se confirmo a 6 dpi por la presencia de un inmenso numero de RPBLA grandes organizados en grupos (Fig. 4B) lo que demuestra que este nuevo peptido ensamblador es inesperadamente mas eficaz que RX3 salvaje.
El analisis de la expresion de RX3(A3)-ECFP en plantas indica que los residuos de valina y leucina presentes en el RD no son necesarios para el ensamblaje de protemas y formacion de RPBLA. Una consecuencia clara de esta conclusion es que las valinas, histidinas y leucinas presentes en el RD se pueden sustituir por cualquier otro aminoacido hidrofobico, siempre que la estructura del RD no este desplegada. Los siguientes experimentos demuestran que estos residuos tambien se pueden sustituir por aminoacidos polares sin carga y cargados negativamente.
Ejemplo comparativo 6: Acumulacion de RX3(E)-GFP y RX3(D)-ECFP en RPBLA de plantas de tabaco transformadas
Como se menciona anteriormente, el cambio de los residuos de histidina del RD por lisina o arginina aumenta la carga neta y por consiguiente la anfipaticidad de este dominio. Sorprendentemente, tambien reduce drasticamente la eficacia del peptido ensamblador en terminos de formacion de RPBLA y en acumulacion total de protema. Basado en estos resultados, tambien se esperaba que la sustitucion de histidinas por acido aspartico y glutamico produjera una reduccion en la acumulacion en RPBLA, porque la adicion de estos residuos tambien aumenta la carga neta del RD, por tanto, su anfipaticidad. Sin embargo, como se muestra en la figura 5B, la inmunotransferencia de extractos de protema total de plantas de tabaco transformadas con RX3(E)-GFP y RX3(D)-ECFP y los controles correspondientes (RX3-GFP y RX3-ECFP, respectivamente) indico que las protemas de fusion que teman aminoacidos acidos se acumulaban ligeramente mejor que los controles. La menor movilidad de RX3(E)-GFP y RX3(D)-ECFP se puede explicar por su mayor contenido en aminoacidos acidos, como se ha descrito previamente para otras protemas.
Ademas, las plantas de tabaco transformadas con RX3(E)-GFP y RX3(D)-ECFP indujeron la formacion de un gran numero de RPBLA fluorescentes grandes de forma redonda organizados en grupos (Fig. 5C). De hecho, con frecuencia estan presentes grandes RPBLA de 1 a 2 micrometros en la mayona de las celulas transformadas. De forma interesante, el tamano medio de estos RPBLA era significativamente mayor que los inducidos por la expresion de GFP o ECFP fusionadas a RX3.
Ejemplo 7: Acumulacion de RX3(T)-ECFP, RX3(N)-ECFP y RX3(Q)-ECFP en RPBLA de plantas de tabaco
Los resultados anteriores demuestran que la sustitucion de histidina por aminoacidos hidrofobicos o acidos aumentaba la capacidad del peptido ensamblador de inducir los RPBLA. Ademas, se observo el efecto negativo de aumentar la carga positiva del RD sustituyendo las histidinas por aminoacidos basicos. Sin embargo, el efecto de aminoacidos polares sin carga sobre la funcionalidad del peptido ensamblador era aun desconocido. Por tanto, se crearon tres nuevas construcciones en las que todas las histidinas del RD se cambiaron por residuos de treonina, asparragina y glutamina y se fusionaron a ECFP (RX3(T)-ECFP, RX3(N)-ECFP y RX3(Q)-ECFP, respectivamente). La adicion de estos aminoacidos produce un RD que es anfipatico, pero sin carga neta (Fig. 6A).
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Se analizaron hojas de tabaco que expresaban todas estas construcciones mediante microscopia confocal 3 y 6 dfas despues de la infiltracion (dpi). A 3 dpi, se observo un gran numero de RPBLA pequenos, lo que sugiere que todas estas variantes de RX3 son muy eficaces. Esta observacion se confirmo a 6 dpi por la presencia de muchos RPBLA grandes organizados en grupos (Fig. 4B).
Estos resultados demuestran que la expresion en plantas de variantes de RX3 que tienen aminoacidos polares sin carga produce la formacion de RPBLA.
Ejemplo 8: Acumulacion de PP-ECFP y PA-ECFP en RPBLA de plantas de tabaco transformadas
Los dos dominios principales de RX3 (RD y PX) son ambos secuencias ricas en prolina, que tipicamente adoptan una estructura PPII. El estudio de un RD sintetico mediante dicrofsmo circular confirmo la presencia de la helice PPII en este dominio en solucion acuosa (Dalcol, J. Org. Chem., 1996, 61 (20), pp. 6775-6782). Las protemas que tienen dominios PPII son abundantes en plantas y en otros organismos. Sin embargo, en general no tienen la capacidad de inducir la formacion de RPBLA. Por ejemplo, colageno (Caldwell JW, Applequist J., Biopolymers 1984; 10:18911904), protemas alfa-casema de leche (Syme CD. et al., Eur J Biochem 2002; 269:148-156.) y PKA (Knighton D.R. et al., Science 1991; 253:414-420) son ejemplos de protemas que tienen helices PPII pero que no tienen la capacidad de inducir RPBLA. Como resultado, se esperaba que otros elementos en RX3, ademas de la secuencia con estructura PPII, fueran necesarias para inducir la formacion de los RPBLA.
Para identificar tales elementos en la secuencia de RX3, se sustituyeron los dominios RD y PX por una secuencia basada en prolina sin homologfa a RX3. La estructura PPII se mantuvo y el numero y posicion relativa de los residuos de cistema no se modifico (PP; Fig. 7A). Ademas, se sintetizo un peptido similar, pero mas hidrofobico en el que se cambiaron los dominios RD y PX por el hexapeptido PPPAPA repetido a lo largo de la secuencia (PA; Fig. 7A). Estos dos peptidos tienen esencialmente la misma estructura PPII que RX3, pero no comparten homologfa primaria mas que el alto contenido en prolina y el numero y posicion de las cistemas.
El analisis de hojas de tabaco que sobreexpresaban RX3-ECFP, PP-ECFP o PA-ECFP por inmunotransferencia mostro que sorprendentemente los dos peptidos sinteticos fusionados a ECFP se acumulaban con mayor eficacia que RX3 natural (Fig. 7B; comparense los carriles 1 y 2 frente a 3). PP-ECFP, y en menor grado PA-ECFP, presentaban menor movilidad en el gel de SDS-PAGE que RX3-ECFP, incluso aunque las tres protemas de fusion tienen el mismo numero de aminoacidos. Esto sugiere que PP y PA presentan una helice PPII extendida que es mas estable que RX3, incluso en las condiciones de inmunotransferencia. Como consecuencia, el ensamblaje de estos peptidos sinteticos estana favorecido y la protema mostrana acumulacion aumentada, como se determino por inmunotransferencia. Esta hipotesis se confirmo por la observacion de hojas de tabaco en el microscopio confocal seis dfas despues de la transformacion con vectores que expresaban protemas de fusion RX3-, PP- y PA-ECFP. La figura 7C muestra imagenes confocales de hojas transformadas con PP-ECFP y PA-ECFP, que presentaban un numero mayor de RPBLA comparadas con hojas que expresan RX3-ECFP. Ademas, el tamano medio de los RPBLA inducidos por la expresion de PP- y PA-EcfP era dos veces mayor que el tamano medio de los RPBLA de RX3-ECFP.
La comparacion de secuencia de estas 3 secuencias inductoras de cuerpos proteicos (Fig. 7A), revela que la unica region de homologfa entre ellas es los primeros diez aminoacidos despues del peptido senal (THTSGGCGCQ) (SEQ ID NO:25). Para confirmar que esta secuencia no desempena un papel espedfico en el ensamblaje de protemas, la secuencia se cambio por una secuencia sintetica basada en prolina (THPPPPCPCP) (SEQ ID NO:26). La secuencia basada en prolina mantema las posiciones de las cistemas en el contexto de las construcciones PA-ECFP. Esta construccion (NPA-ECFP) eran tan eficaz en la formacion de RPBLA como PA-ECFP.
Ademas, tambien se cambio el peptido senal de gamma zema de RX3 por el peptido senal de PR10, tambien conocido como PR-S (Veroverd et al., Plant Physiol., 1995, 109:1199-1205). La construccion resultante se fusiono a GFP (RX3(PR10)-GFP). Es improbable que el peptido senal influya en la formacion de RPBLA ya que se corta cotraduccionalmente a la entrada de la protema en el RE y como se esperaba la velocidad de acumulacion y la induccion de RPBLA era completamente independiente del peptido senal usado.
El hecho de que los peptidos PP, PA, NPP y NPA no compartan homologfa de secuencia primaria con RX3 indica que inesperadamente, la capacidad de ensamblarse e inducir RPBLA no depende de la secuencia de RX3, sino de la estructura tridimensional de la misma. La helice PPII extendida presente en los peptidos RX3, PP y PA, y sus variantes, es un rasgo clave responsable de la induccion de los RPBLa.
Debido a razones de clonacion, los peptidos PP y PA mantienen parte de la ultima repeticion del dominio de repeticion de RX3. Para descartar que la ultima unidad de repeticion de RX3 del RD se requiera para formar los RPBLA, se realizaron un nuevo conjunto de construcciones donde esta repeticion esta ausente: PP3 y PA2. Estas dos construcciones mantienen la capacidad para formar RPBLA.
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Ejemplo 9: Determinacion de los residuos de cistema de RX3 implicados en la induccion o estabilizacion de RPBLA en plantas de tabaco transformadas
El trabajo presentado aqu proporciona revelaciones clave en rasgos espedficos de RX3 que permiten su multimerizacion y la formacion de RPBLA. Un rasgo relevante, pero no unico, es la presencia de residuos de cistema que podnan participar en los enlaces inter-disulfuro entre moleculas de RX3.
Se usaron mutaciones puntuales de cada una de las seis cistemas como un modo directo de determinar el papel de los puentes disulfuro en la polimerizacion de RX3. La sobreexpresion de RX3-ECFP que careda de C7 o C9 (RX3C7G-ECFP y RX3C9G-ECFP) claramente perturbo el proceso de multimerizacion de protemas de fusion: ambos mutantes se secretan mucho (Fig. 8C-D). De hecho, en analisis de imagenes celula a celula de celulas epidermicas transformadas con los mutantes individuales C7 o C9, las protemas de fusion principalmente se secretaban y solo unas pocas celulas individuales muy fluorescentes mostraban manchas fluorescentes similares a RPBLA. Esta observacion sugiere que grandes tasas de expresion de la protema recombinante en el RE producen un aumento de la eficacia de agregacion, lo que indica que se necesita una concentracion cntica de protema mayor para la agregacion proteica comparada con RX3 de tipo salvaje (Fig. 8C-D, recuadros). Como se esperaba, cuando se mutaron ambos residuos de cistema al mismo tiempo (Fig. 8I; RX3C7,9G-ECFP) no se observo acumulacion de RPBLA. Estos resultados demuestran que la presencia de dos residuos de cistema cerca del extremo N-terminal del dominio RX3 es necesaria para retener la protema en el RE para inducir la formacion de RPBLA. Sin embargo, el mutante multiple RX3C64,82,84,92G-ECFP, que mantiene exclusivamente las dos primeras cistemas, demostro que C7 y C9 no son suficientes para retener la protema de fusion en el RE y permitirla formar RPBLA (Fig. 8K). De esta manera, algunas de las otras cistemas presentes en el peptido RX3 desempenan un papel en su ensamblaje de protemas apropiado.
La mutacion del residuo de cistema localizado en medio del dominio RX3 (C64) no tuvo efecto significativo en el proceso de oligomerizacion y las protemas acumuladas en los RPBLA (Fig. 8E; RX3C64G-ECFP). Ademas, las mutaciones individuales de los tres residuos de cistema localizados en el extremo C-terminal de RX3 (C82, C84 o C92) no tuvieron efecto significativo en la capacidad de acumularse en RPBLA (Fig. 8F-H; RX3C82G-ECFP, RX3C84G-ECFP o RX3C92G-ECFP, respectivamente). Las capacidades normales de agregacion de estos mutantes individuales apoyan la hipotesis de que ninguno de estos residuos se requiere por sf mismo para inducir y estabilizar RPBLA. Sin embargo, puesto que el mutante multiple de Cys C-terminales (Fig. 8J; RX3C82,84,92G- ECFP) fue incapaz de progresar con la biogenesis de RPBLA, es evidente que RX3 tambien requiere al menos dos residuos de cistema cerca del extremo C-terminal para formar RPBLA.
Ademas, se sabe que la concentracion de protemas es un parametro clave que controla la agregacion de peptidos autoensamblantes (Wetzel, R. (1999) En Methods in Enzymology, vol. 309, Academic Press, San Diego, California). Sin embargo, la expresion de RX3-ECFP y mutantes de Cys de RX3 se visualizo claramente en geles de SDS- PAGE tenidos con azul de Coomassie y no se observaron diferencias significativas en los niveles de protemas entre las protemas que formaban RPBLA y las que se secretaban y no agregaban (Fig. 8B). Por tanto, diferencias en la multimerizacion de protemas de los mutantes de RX3 probados estan relacionadas con diferencias en sus propiedades intrmsecas que afectan las capacidades de agregacion. Las modificaciones de la secuencia de RX3 podnan deteriorar la capacidad de agregacion o aumentar el umbral de concentracion de protema necesario para la oligomerizacion.
La determinacion del numero mmimo de cistemas requeridas para que un peptido ensamblador permita la induccion eficaz de RPBLA es cntica. En primer lugar, los residuos de cistema en un peptido ensamblador pueden afectar negativamente al plegamiento apropiado de la protema de interes, por tanto, su actividad, principalmente cuando esta protema tambien contiene residuos de cistema. Sin embargo, la presencia de cistemas en el peptido ensamblador asegura el entrecruzamiento de la protema de fusion mediante formacion de puentes disulfuro. Este entrecruzamiento produce la estabilizacion y solidez de los RPBLA. Estas caractensticas son deseables porque permiten el aislamiento facil de este organulo. Ademas, cualquier aplicacion industrial en el que se usa el organulo RPBLA dependera del entrecruzamiento mediante la formacion de puentes disulfuro. Como se describe en la introduccion, PBIS diferentes de prolaminas son capaces de inducir la formacion de RPBLA mediante la adicion de una secuencia KDEL en el extremo C de la protema. Incluso aunque este planteamiento permite la formacion de RPBLA, el aislamiento de estos organulos sera diffcil debido a su estabilidad reducida.
Ejemplo 10: La orientacion de los residuos de cistema no afecta la capacidad del peptido PP para acumularse en RPBLA en plantas de tabaco transformadas
La importancia de los residuos de cistema en el ensamblaje de protemas e induccion de RPBLA se demostro mediante mutaciones individuales y multiples de estos residuos en el ejemplo 9. Sin embargo, quedaba por explorar la influencia de la orientacion de estos residuos. Para hacer eso, se sintetizo un nuevo peptido ensamblador (PP2). PP2 es homologo a PP excepto por la posicion de algunos de los residuos de cistema (Fig. 9A; C9^-10, C84^85 y C92^91).
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Los peptidos muy ricos en prolina forman una helice PPII que se caracteriza por tener tres aminoacidos por giro (Brochicchio, 2002, Chrality, 14: 782-92), como se muestra en la figura 9B. En RX3 natural, los residuos de cistema estan orientados hacia cada uno de los tres lados de la helice. Se hipotetizo que esta orientacion podna ser importante para fomentar el ensamblaje y estabilizacion en las tres dimensiones que permite que los naturales y RPBLA formen los organulos habituales grandes (hasta 3 micrometros) de forma redonda llenos de protemas ensambladas y estabilizadas por puentes disulfuro. De esta manera, se diseno PP2 de modo que todos los residuos de cistema esten orientados hacia el mismo lado de la helice. Inesperadamente, PP2 fusionado o GFP fue capaz de acumularse tanto como PP-GFP e incluso mas sorprendentemente, de inducir la formacion de grandes RPBLA (Fig. 9C).
Ejemplo 11: Acumulacion de R8(4C)-ECFP, R7(4C)-ECFP, R6(4C)-ECFP y R4(4C)-ECFP en RPBLA de plantas de tabaco transformadas
Tambien se determino la longitud minima de la PPII requerida para la biogenesis de RPBLA. Para hacer eso, se creo una protema minima derivada de RX3-ECFP, R8(C4)-ECFP, mediante delecion de la secuencia PX de RX3 y adicion de una secuencia minima adicional. De esta manera, R8(C4)-ECFP carece de C82, C84 y C92, pero contiene un nuevo residuo adicional de cistema unido a C64 por dos prolinas para reforzar los puentes disulfuro entre cadenas (Fig. 10A). El patron de distribucion de la protema R8(C4)-ECFP cuando se expresaba en hojas de N. benthamiana se acumulaba en manchas fluorescentes esfericas evidentes que, a gran aumento, paredan ser pequenos RPBLA (Fig. 10C). Mientras que los RPBLA inducidos por RX3-ECFP alcanzaban un diametro medio de 1,4 pm a 4 dpi y aumentaban progresivamente para alcanzar hasta 2 pm a 7 dpi, las manchas fluorescentes inducidas por R8(C4)-ECFP raramente alcanzaban diametros de 1 pm a 7 dpi (vease la tabla posterior). Por tanto, como se ha sugerido anteriormente, el par de cistemas en cada lado de la helice PPII (RD en el contexto de R8(C4)) son suficientes para nuclear agregados de protema que evolucionaran a RPBLA. La observacion de que RX3-ECFP tiene una tendencia mas fuerte a formar RPLBA grandes que R8(C4)-ECFP puede ser debida al hecho de que los oligomeros RX3-ECFP tienen mas probabilidades de crecimiento al aumentar el entrecruzamiento entre cadenas en virtud de sus seis residuos de cistema.
Por tanto, tambien se examino el grado al que la polimerizacion se relaciona con la longitud de la PPII. Estos experimentos se realizaron acortando de forma progresiva el RD. Se generaron tres construcciones mas a partir de R8(C4)-ECFP. El dominio de repeticion se acorto a 7, 6 y 4 unidades de PPPVHL (Fig. 10A). Como se muestra en la figura 10C, las protemas sobreexpresadas que conteman seis o cuatro unidades de repeticion (R6(C4)-ECFP y R4(C4)-ECFP, respectivamente) aun eran capaces de formar pequenos agregados, pero la secrecion aumenta con el acortamiento del dominio de repeticion (Fig. 10B recuadro). R7(C4)-EGF produjo resultados similares a R8(C4)- EGF.
El analisis por tincion de azul de Coomassie de las protemas totales extrafdas de hojas que sobreexpresan las protemas RX3 truncadas (Fig. 10B) mostro que la concentracion de protemas recombinantes era similar en todos los casos. Esto indica que cada una de las protemas de fusion es estable y que un buen nivel de expresion no es una prueba de que los RPBLA se formaran eficazmente. En otras palabras, la menor eficacia de agregacion en mutantes no estaba relacionada con los niveles de expresion de protema. Estos resultados sugieren que hay un tamano cntico que favorece las interacciones optimas del peptido RX3 y determina la eficacia de la formacion de PB.
Protema de fusion
Intervalo de tamano (pm)
4 dpi
7 dpi
RX3-ECFP
1,1-1,85 1,1-1,85
R8(4C)-ECFP
0,4-0,7 0,9-1,3
R7(4C)-ECFP
0,4-0,75 0,78-1,3
R6(4C)-ECFP
0,3-0,6 1-1,4
R4(4C)-ECFP
0,2-0,4 0,75-1
Tabla 5: Tamano de los RPBLA despues de 4 y 7 dfas de la transformacion de las plantas.
Basado en el aumento significativo en la secrecion de protema de fusion de R4(C4)-ECFP comparado con las otras construcciones, R4(C4) marca la longitud minima de un peptido ensamblador eficaz. Estos resultados indican que peptidos mas largos de 24 aminoacidos (longitud del dominio de repeticion de R4(C4)) que adoptan una helice PPII y estan flanqueados por un par de residuos de cistema en cada extremo son suficientes para que se retengan en el RE y para inducir la formacion de RPBLA.
Ejemplo 12: Acumulacion de RX(A)-mCherry, RX(E)-mCherry en RPBLA de plantas de tabaco transformadas
La protema fluorescente mCherry es muy soluble y reticente a acumularse en RPBLA cuando se fusiona a RX3. El analisis microscopico confocal de hojas de tabaco transformadas con un vector que expresaba RX3-mCherry mostro un patron de secrecion claro, como se muestra en la figura 11A donde la mayona de la fluorescencia roja observada se localizaba en la periferia de la celula. De forma interesante, cuando se transformaron hojas de tabaco con
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RX3(A)-mCherry, la mayona de la fluorescencia se observo dentro de la celula, lo que indica que la protema de fusion se retema eficazmente en la celula.
Ademas, se observo un patron particulado claro (Fig. 11B y 11B'), lo que sugiere que la protema de fusion se acumulaba en los RPBLA. El tamano de estos cuerpos proteicos recombinantes (aproximadamente 1 micrometro de diametro) se ajusta a los RPBLA caracterizados previamente en plantas transformadas con varias protemas de fusion (vease, la patente de EE UU No. 7.575.898 y las publicaciones de patente de EE UU No. 20060123509, No. 20060121573 y No. 20070243198).
Este resultado fue inesperado al menos por dos razones. Primero, la eficacia de la formacion de RPBLA aumento cuando mCherry se fusiono a RX3(A) comparada con RX3 no modificado derivado de prolamina que contiene el dominio de repeticion natural. Ademas, se describio que la anfipaticidad del dominio de repeticion de RX3 es importante para la formacion de cuerpos proteicos (Kogan et al., 2001, J. Mol. Biol. 312:907-913) y RX3(A) se muto para tener un dominio de repeticion completamente hidrofobico (vease el ejemplo 1).
Como se indica anteriormente, la alta solubilidad de mCherry podna ser uno de los principales factores que reducen la capacidad de la fusion de mCherry con RX3 natural de formar RPBLA. Para determinar si el mayor rendimiento de RX3(A) se debe al simple aumento en el contenido hidrofobico del RD (sustitucion de histidinas (aminoacidos cargados positivamente) por alaninas hidrofobicas), se expreso una fusion de mCherry con RX3(E). Como se muestra en la figura 11C, RX3(E)-mCherry se retuvo eficazmente en la celula, y ademas, se acumulo en RPBLA que son incluso mayores que los inducidos por la expresion de RX3(A)-mCherry.
El hecho de que RX3(E), que tiene un RD anfipatico cargado, tambien sea capaz de inducir la formacion de RPBLA cuando se fusiona a mCherry, sugiere que el aumento en el rendimiento de RX3(A) comparada con RX3 no es debido a un aumento inespedfico del caracter hidrofobico del peptido, sino que se debe al aumento de la capacidad de ensamblaje y, por tanto, a la capacidad de induccion de cuerpos proteicos de estos dos peptidos sinteticos derivados de RX3.
Ejemplo 13: Acumulacion de EGF fusionado a los peptidos ensambladores RX3, RX3(A), RX3(E), PP y PA en plantas de tabaco transformadas
La produccion y purificacion del factor de crecimiento epidermico (EGF) fusionado a RX3 en plantas de tabaco agroinfiltradas se ha descrito previamente (documento WO2006056484). El proceso de aislamiento de RPBLA mediante centrifugacion de baja velocidad, la solubilizacion y el corte de la protema de fusion RX3-EGF y la posterior purificacion de EGF mediante FPLC de fase inversa (RF) se han desarrollado en el documento WO2007096192. Para probar la eficacia de los nuevos peptidos ensambladores, se fusiono EGF a RX3(A) y RX3(E) y se realizo un proceso posterior equivalente. Los RPBlA inducidos por la expresion de RX3(A)-EGF y RX3(E)-EGF se recuperaron tan eficazmente mediante centrifugacion de baja velocidad como los RPBLA control inducidos por la expresion de RX3-EGF (Fig. 12A). En los tres casos, casi toda la protema de fusion se recupero en la fraccion wPB (Fig. 12A, carril 4) con solo perdidas insignificantes en el sobrenadante (Fig. 12A, carril 2) y el paso de lavado (Fig. 12A, carril 3). A partir de estos resultados, es aparente que casi toda la protema de fusion esta estrechamente ensamblada en los organulos RPBLA se recupera facilmente en la fraccion wPB.
Un punto importante posterior es la solubilizacion de la protema de fusion de los RPBLA. Despues de la solubilizacion de los RPBLA de RX3-EGF en condiciones moderadas (tampon borato 50 mM a pH 10 y bME 10 mM a 25°C durante 4 horas), solo se solubilizo un porcentaje bajo de la protema de fusion. De hecho, solo se solubilizo el 50% del monomero RX3-EGF (Fig. 12B, comparese el carril 3 (sPB) con el carril 6 (iPB)). Sorprendentemente, la solubilizacion de los RPBLA que conteman RX3(A)-EGF o RX3(E)-EGF fue mucho mas eficaz. Casi toda la forma monomerica de RX3(A)-EGF se solubilizo y casi nada de RX3(E)-EGF parece permanecer insoluble en las condiciones usadas (Fig. 12B, comparese el carril 1 (sPB) con el carril 4 (iPB)).
Tambien se examinaron los efectos de PP-EGF y PA-EGF en el procesamiento posterior. La figura 12C muestra que estas dos protemas de fusion se acumulan al mismo nivel que RX3-EGF y RX3(E)-EGF en hojas de tabaco agroinfiltradas. Ademas, despues de recuperar los RPBLA mediante centrifugacion a baja velocidad, PP-EGF y PA- EGF se solubilizaron muy eficazmente, similar a RX3(E)-EGF, en las condiciones moderadas descritas anteriormente (Fig. 12D). Como se ha mencionado anteriormente, las diferencias en la movilidad electroforetica entre todas estas protemas de fusion no estan relacionadas con una diferencia en el tamano de la protema, sino que se deben a ligeras diferencias en la conformacion proteica incluso en condiciones de SDS-PAGE.
Inesperadamente, los nuevos peptidos ensambladores RX3(A), RX3(E), PP y PA aumentan todos mucho la solubilidad de las protemas de fusion sin afectar a su capacidad de ensamblarse e inducir la formacion de RPBLA. Este resultado chocante es de principal importancia en el procesamiento posterior de los RPBLA porque aumenta drasticamente el rendimiento total del proceso (al menos dos veces para RX3(A) y mas de diez veces para RX3(E), PP y PA).
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Para evaluar la conformacion del EGF producido por medio de estos nuevos peptidos ensambladores, se probo la actividad de RX3(E)-EGF solubilizada, as^ como el EGF cortado por Fxa de esta protema de fusion y purificado mediante RF-FPLC. La figura 13A muestra un gel tenido con plata con todos los pasos posteriores desde el homogeneizado no clarificado hasta el paso de corte. Despues de cortar con la proteasa espedfica de sitio Fxa, el EGF liberado se purifico como se describe en materiales y metodos mediante RF-FPLC. La protema EGF se recupero al 30% de acetonitrilo en solo dos fracciones correspondientes al pico agudo indicado por una flecha en la figura 13B. Se estimo la pureza de una mezcla de las dos fracciones recuperadas (figura 13C) en mas del 92% por HPLC. Se midio la actividad del EGF in vitro mediante el analisis de la fosforilacion del receptor de EGF de celulas A431 incubadas con cantidades crecientes de RX3(E)-EGF y EGF. Como control negativo estas celulas se incubaron en paralelo con RX3. Tres experimentos independientes demostraron que RX3(E)-EGF y EGF eran activos al 50% y el 100%, respectivamente comparados con un EGF comercial de Promega (GS02A).
Ejemplo 14: Acumulacion de hGH fusionada a los peptidos ensambladores RX3 y RX3(A) en plantas de tabaco transformadas
Se eligio la hormona del crecimiento humana como un ejemplo adicional para comprobar la capacidad de las variantes de RX3 para aumentar el proceso posterior. Se homogenizaron plantas de tabaco que expresaban la protema de fusion RX3(A)-hGH y los RPBLA inducidos se aislaron mediante centrifugacion a baja velocidad. Como muestra la figura 14A (panel izquierdo), se obtuvo una fraccion muy pura de RPBLA (wPB) del homogeneizado (H0). La protema de fusion RX3(A)-hGH en sus diferentes formas oligomericas es la unica protema observada en esta fraccion cuando se analizo por tincion con Coomassie. De forma interesante, cuando el rendimiento del proceso se analizo por inmunotransferencia, la mayona de la protema de fusion se acumulaba en RPBLA estables estrechamente ensamblados, que se puede recuperar por centrifugacion y solo una pequena cantidad de la misma se pierde en el sobrenadante correspondiente (fig. 14A, panel izquierdo).
Una vez obtenidos los RPBLA que conteman RX3(A)-hGH mediante este sencillo metodo de centrifugacion, se incubaron durante 3 horas en tampon de solubilizacion moderado (borato 50 mM pH 10, beta-mercaptoetanol (bME) 10 mM a temperatura ambiente). Como referencia, se incubaron cantidades equivalentes de RPBLA que conteman RX3-hGH en las mismas condiciones y se analizaron en paralelo mediante inmunotransferencia usando anticuerpos anti-hGH. Sorprendentemente, la protema de fusion RX3(A)-hGH era mucho mas soluble que RX3-hGH, incluso aunque el alto rendimiento en recuperacion de RPBLA sugiere que los organulos inducidos por la expresion de cualquiera de estas dos protemas de fusion son tanto estables como ensamblados estrechamente. El aumento en la solubilidad en agua es sorprendente dado el hecho de que cambiar los residuos de histidina de RX3 con alaninas en RX3(A) aumenta la hidrofobicidad del peptido ensamblador (Eisenberg, 1984, J. Mol. Biol. 179: 125-142).
Ejemplo 15: Dependencia de residuos de Cys en biogenesis de RPBLA densos en plantas de tabaco transformadas
Como se ha mencionado anteriormente, uno de los elementos esenciales de PBIS en la formacion de RPBLA densos es la presencia de al menos 2 residuos de cistema en cada extremo de un dominio poliprolina de tipo II. No obstante, hay otros peptidos ensambladores (por ejemplo, hidrofobina, ELP) que se retienen en el RE y se acumulan en estructuras de tipo vesmula cuando se fusionan a una secuencia KDEL, incluso en ausencia de formacion de puentes disulfuro. La presencia de KDEL en el extremo C-terminal de ciertas protemas ensambladoras es suficiente para retener la molecula en el RE, y la capacidad ensambladora de la protema produce la formacion de estructuras de vesmula.
Para determinar si la adicion de una secuencia de retencion de RE al final del peptido ensamblador RX3 podna sustituir la necesidad de los residuos de cistema, la variante de RX3 RX3ACys64,82,84,92-ECFP, que no era capaz de inducir RPBLA y se secretaba como se muestra en el ejemplo 9, se fusiono a una ECFP que tema un KDEL (RX3ACys64,82,84,92-ECFP-KDEL).
El analisis de hojas de tabaco que sobreexpresan RX3-ECFP y RX3ACys64,82,84,92-ECFP-KDEL por tincion de Coomassie e inmunotransferencia (figura 16A) mostro que las dos protemas de fusion basadas en RX3 se acumulaban a niveles similares. Para determinar si RX3ACys64,82,84,92-ECFP-KDEL se acumula en RPBLA, se analizaron hojas que expresan esta protema de fusion por microscopfa confocal 3 y 7 dfas despues de la infiltracion (dpi). Como se observo anteriormente en hojas de tabaco que expresan RX3-ECFP, se observaron vesmulas de aproximadamente 1 micrometro de forma redonda inducidas por la expresion de RX3ACys64,82,84,92-ECFP-KDEL incluso solo 3 dpi (Figura 16B). Esta observacion demuestra que la secuencia KDEL unida al extremo C-terminal de ECFP permite una retencion eficaz de la protema de fusion dentro de la celula. Ademas, tambien muestra que la capacidad ensambladora de peptido basado en RX3 permite el autoensamblaje e induccion de estructuras de vesmula. Estas estructuras de vesmula siguen creciendo despues de 3 dpi, y, de forma interesante, a 7 dpi se observaron estructuras de vesmula grandes irregulares, algunas de mas de 5 micrometres (Figura 16B). No se observaron RPBLA de este tamano en hojas de tabaco que sobreexpresan la protema de fusion control RX3-ECFP, lo que sugiere que el mecanismo de autoensamblaje de RX3-ECFP en RPBLA no es el mismo que los mecanismos de ensamblaje de vesfculas de RX3ACys64,82,84,92-ECFP-KDEL.
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Un enfoque tecnico para caracterizar indirectamente lo apretado del ensamblaje de la protema de fusion dentro de estructuras de vesmula es la determinacion de la densidad de las estructuras de vesmulas por gradientes de colchon por capas Optiprep®. Por tanto, estructuras de vesmulas inducidas por la expresion de RX3ACys64,82,84,92-ECFP- KDEL (o RX3-ECFP) en plantas de tabaco se llevaron a cabo cargando homogeneizados de plantas filtrados sobre los siguientes colchones por capas de Optiprep®. La densidad de cada colchon por capas es como se ha definido anteriormente en la tabla 4.
Como se ejemplifica por el gradiente de RX3-ECFP, los RPBLA densos se recuperan de fracciones que tienen densidades de aproximadamente 1,2 g/ml (Fig. 16C, izquierda, carriles 5 y 6), que estan libres de la mayona de las protemas endogenas. De hecho, la densidad y dureza de los RPBLA es de gran interes en el aislamiento de RPBLA como ya se ha descrito en la solicitud publicada en EE UU No. 2006/0123509. Cuando se analizaron estructuras de vesmulas de RX3ACys64,82,84,92-ECFP-KDEL por el mismo medio, sorprendentemente casi toda la protema de fusion se recupero en la fraccion del sobrenadante (Fig. 16C, derecha). Este resultado claramente demuestra que las protemas de fusion RX3ACys64,82,84,92-ECFP-KDEL se acumulan en estructuras similares a vesmulas que no pueden considerar verdaderos RPBLA. Los organulos intracelulares derivados del RE o aparato de Golgi, por ejemplo, tfpicamente sedimentan entre el 18% y 30% de colchones de Optiprep, pero durante el proceso de homogenizacion de tejido una gran proporcion de las protemas solubles presentes en la luz de los microsomas se libera y se recuperara en el sobrenadante. Por tanto, se puede concluir que la protema de fusion RX3ACys64,82,84,92-ECFP- KDEL se retiene en el RE, pero no se ensambla o se ensambla solo debilmente, y no se forman RPBLA densos.
Ejemplo 16: Acumulacion de Z(Adh)-GFP, Z(Adh)Px-Gfp, Z(Col)-Gfp, Z(Col)Px-Gfp en RPBLA de plantas de tabaco transformadas
Se ha demostrado que PBIS con baja homologfa de secuencia a RX3 son capaces de generar RPBLA. PP y PA comparten menos del 60% de identidad con la secuencia RX3 entre los residuos C9 y C64. Por otra parte, es importante senalar que las secuencias PP y PA tienen un alto porcentaje de prolinas (96,2 y 67,9 por ciento, respectivamente); significativamente mayor que RX3 de tipo salvaje (54,7%). Se evaluo la capacidad de induccion de RPBLA de otras secuencias de protemas que adoptan una estructura PPII. Las secuencias cumplfan los siguientes criterios: (i) menos del 40% a RX3 y (ii) menos del 40% de contenido en prolina. Se seleccionaron un fragmento de colageno humano COL2A1 que comprende los aminoacidos 135 a 179 (AccN: CAA34683) y el fragmento 884 a 927 de la adhesina de superficie AgI/II (Streptococcus mutans cepa NG8; GeneBank: GQ456171. AccN: ACV69919). Como se muestra en la figura 17A, tales secuencias se usaron para sustituir RD en R8(C4) (Z(Adh) y Z(Col) o en los peptidos ensambladores de RX3 (Z(Adh)Px y Z(Col)Px).
Estos peptidos ensambladores fusionados a GFP se acumularon a altos niveles en hojas de tabaco y se representaron como una banda principal en homogeneizados preclarificados de estas hojas tenidos por Coomassie (Fig. 17B). Z(Adh)-Gfp y Z(Adh)Px-Gfp, con un MW predicho de 37,7 kDa y 34,6 kDa, respectivamente, tienen menor movilidad en gel de SDS-PAGE. Este cambio en migracion, tambien observado en la mayona de los peptidos ensambladores que adoptan una estructura PPII descritos anteriormente (tal como PP, RX3(E), etc.), se puede atribuir a la fuerte estabilidad de esta estructura secundaria.
El analisis por microscopfa confocal de plantas de tabaco que expresan Z(Adh)-GFP, Z(Adh)Px-GFP, Z(Col)-GFP y Z(Col)Px-GFP mostro que estas protemas de fusion se acumulaban dentro de la celula en RPBLA fluorescentes de forma redonda de aproximadamente 1 micrometro de diametro. A pesar del bajo porcentaje de homologfa respecto a RX3 y el bajo contenido en prolinas, las protemas de fusion tambien se retuvieron dentro del retmulo endoplasmico (RE), y su ensamble indujo eficazmente la formacion de RPBLA (Fig. 17C).
A diferencia de los cuerpos producidos por ELP, hidrofobina o RX3ACys64,82,84,92-ECFP-KDEL, una caractenstica importante de los RPBLA es el empaquetamiento apretado de la protema dentro de los organulos densos. Esta caractenstica permite el aislamiento de RPBLA por centrifugacion. Por tanto, la observacion de que Z(Adh)-GFP, Z(Adh)Px-GFP, Z(Col)-GFP y Z(Col)Px-GFP se recuperan en el precipitado (fraccion de RPBLA) despues de centrifugar a 1500xg (Fig. 17D), demuestra que estas protemas de fusion inducen la formacion de RPBLA densos. La presencia del dominio Px, de ah el aumento del numero de residuos de Cys (de 4 a 6), y tambien el agrandamiento del peptido ensamblador mediante una secuencia rica en prolina, produjo un aumento significativo en lo apretado del ensamblaje y recuperacion de mayor eficacia de RPBLA (comparese Z(Adh)-GFP frente a Z(Adh)Px- GFP y Z(Col)-GFP frente a Z(Col)Px-GFP en la figura 17). Experimentos de gradiente de densidad y FRAP apoyan estos datos.
Como se puede observar de la comparacion de secuencia de Z(Adh)-GFP, Z(Adh)Px-GFP, Z(Col)-GFP y Z(Col)Px- GFP (Fig. 17A), la ultima repeticion del dominio de repeticion de RX3 se mantuvo en todos los casos debido a razones de clonacion. Para descartar que las PPII de Adh y Col necesitan la ultima unidad de repeticion de RX3 del RD para formar RPBLA, se realizo un nuevo conjunto de construcciones donde esta repeticion estaba ausente: Z(Adh2)-GFP, Z(Adh2)Px-GFP, Z(Col2)-GFP y Z(Col2)Px-GFP. Todas estas construcciones nuevas mantuvieron la capacidad para inducir RPBLA.
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Ejemplo 17: Determinacion de la actividad xilanasa en RPBLA inducidos por la expresion de RX3-Xyl, RX3(L)-Xyl, RX3(E)-Xyl, RX3(A)-Xyl, PP-Xyl y PA-Xyl en plantas de tabaco transformadas
Como se ha descrito previamente (documento WO2007/096192A1), los RPBLA inducidos por la expresion de protemas de fusion derivadas de RX3 de tipo salvaje tienen la capacidad de mantener la actividad de la protema de interes (PDI) fusionada a tal PBIS.
Para determinar como los peptidos ensambladores descritos en el presente documento afectan la actividad de las protemas fusionadas a ellos, se estudiaron peptidos ensambladores no anfipaticos (PP, PA, RX3(A) y RX3(L)) y anfipaticos negativamente cargados (RX3(E)). Se eligio la enzima xilanasa (DQ465452) como la PDI indicadora y se fusiono a traves de un enlazador que comprendfa 5 glicinas a todos estos peptidos ensambladores, asf como a RX3 de tipo salvaje como referencia.
Se recogieron hojas de tabaco que sobreexpresaban PP-Xyl, PA-Xyl, RX3(E)-Xyl, RX3(L)-Xyl, RX3(A)-Xyl y RX3-Xyl 6 dfas despues de agroinfiltracion, evitando tejido necrotico para disminuir la inconsistencia y variabilidad. Se llevo a cabo procesamiento posterior por centrifugacion a baja velocidad para cada construccion, y se analizo la fraccion enriquecida en RPBLA en SDS-PAGE por tincion con azul de Coomassie. En todos los casos, la fraccion de RPBLA estaba muy enriquecida en la protema de fusion, que era la protema mas abundante en la fraccion. El contenido en protema se determino mediante el kit de cuantificacion de protema EZQ (Invitrogen, Molecular Probes), y la actividad xilanasa asociada con cada muestra se cuantifico con un sustrato sintetico (DiMUX2), midiendo el correspondiente producto fluorescente cada 2 minutos (longitud de onda: excitacion 360/40 nm, emision 460/40 nm.
Inesperadamente, entre todas las muestra analizadas, la fraccion de RPBLA que tiene la menor actividad espedfica (11,7 nmol/(minuto*microgramo de protema)) correspondfa a la protema de fusion RX3-Xyl. Tomando esta protema de fusion como referencia, RX3(A)-Xyl mostro casi el doble de actividad espedfica; RX3(E)-Xyl y RX3(L)-Xyl mostraron aproximadamente un aumento de 3 veces; y PP-Xyl y PA-Xyl ternan actividades espedficas por encima de 7 veces mayores que la referencia (vease la tabla 4). La actividad se midio usando la misma cantidad de protema de fusion, de modo que la actividad espedfica aumentada de estos ensambladores comparados con RX3 podna estar relacionada con las diferentes propiedades de los RPBLA. Esta observacion es de gran importancia considerando que una alta actividad espedfica es un atributo util en aplicaciones de enzimas
nmol/ min/pg prot Desv Est VECES Desv Est Rel
RX3-Xyl
11,7 0,63 1,0 0,05
PA-Xyl
84,7 0,57 7,3 0,05
PP-Xyl
84,4 4,51 7,2 0,50
RX3(A)-Xyl
21 0,5 1,8 0,05
RX3(E)-Xyl
33,5 2,89 2,9 0,25
RX3(L)-Xyl
41,2 4,00 3,5 0,34
Tabla 6: Actividad espedfica de los RPBLA inducidos por la expresion de distintos peptidos ensambladores.
Ejemplo 18: Independencia de la orientacion del dominio de repeticion de RX3 con respecto a los residuos de cistema en su capacidad para inducir RPBLA en plantas de tabaco y con respecto al polipeptido de interes
El dominio repetitivo (RD) de RX3 de tipo salvaje esta flanqueado por 2 y 4 residuos de cistema localizados en el N- terminal y C-terminal, respectivamente. Esta distribucion asimetrica podna ser de alguna importancia respecto a la capacidad de ensamblaje y/o la eficacia en la induccion de RPBLA. Para probar esto, se genero una nueva construccion (iRX3) de modo que las regiones flanqueantes del RD se intercambiaron y clonaron en la orientacion invertida (Fig. 18A). Cuando hojas de tabaco se agroinfiltraron con una construccion que codifica el peptido ensamblador RX3 invertido fusionado a ECFP (iRX3-ECFP), se observaron RPBLA grandes de forma redonda. Sorprendentemente, el tamano de los RPBLA inducidos era significativamente mayor que los RPBLA correspondientes obtenidos por la expresion de la protema de fusion RX3-ECFP usada como referencia (Fig. 18B). El tamano medio de RX3-ECFP e iRX3-ECFP era aproximadamente 1 y 2,5 micrometres, respectivamente.
La alta densidad y apretura en RPBLA permite el aislamiento eficaz por centrifugacion del resto de los organulos celulares y protemas solubles (solicitud publicada en EE UU No. 2006/0123509), de modo que la densidad de los RPBLA de iRX3-ECFP se determino por un gradiente de densidad multicapa de Optiprep. Una comparacion de la distribucion de los RPBLA a lo largo del gradiente de densidad inducido por la expresion de iRX3-ECFP y RX3- ECFP no mostro diferencias significativas. En ambos casos, la mayona de los RPBLA se formaron 6 dfas despues de agroinfiltracion y se recuperaron de la fraccion de alta densidad que vana de 1,175 a 1,26 g/cm3 (Fig. 18C; carriles 4 a 7). Las fracciones tambien estaban libres de la mayona de las protemas celulares endogenas.
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La importancia de la posicion relativa del peptido ensamblador (RX3 e iRX3) con respecto a la protema de interes (ECFP) tambien se analizo. Se generaron dos construcciones adicionales clonando el peptido ensamblador RX3 o iRX3 en el extremo C-terminal de ECFP (Fig. 18; ECFP-RX3 y ECFP-iRX3). Hojas de tabaco que expresaban estas protemas de fusion fueron capaces de inducir RPBLA, aunque menos eficazmente que las protemas de fusion N- terminales correspondientes (RX3-ECFP e iRX3-ECFP). En la figura 18B, las imagenes confocales muestran que ECFP-RX3 y ECFP-iRX3 inducen un gran numero de pequenos RPBLA, la mayona de ellos de aproximadamente 0,5 micrometros. De forma interesante, a pesar del tamano reducido, algunos RPBLA se recuperaron en las fracciones densas 1,175 y 1,21 g/cm3 (Fig. 18C, carriles 4 y 5), que estaban libres de la mayona de los contaminantes celulares. La presencia de algo de protema de fusion en las fracciones con menor densidad (Fig. 18C, carriles 2 y 3) puede representar la protema de fusion que no se ha ensamblado en RPBLA completos, probablemente debido a una cinetica de ensamblaje mas lenta. Tambien se puede concluir que los RPBLA inducidos por la expresion de protemas de fusion que tienen el peptido ensamblador unido al extremo C-terminal de la protema de interes se pueden aislar por centrifugacion.
Ejemplo comparativo 19: Acumulacion en RPBLA de hGH-I-RX3, DsRED-I-RX3 y EK-RX3 en celulas CHO
Para demostrar que la PBIS fusionada en el extremo C-terminal de la PDI puede inducir la formacion de RPBLA en celulas CHO, se generaron tres construcciones que expresaban las siguientes protemas de fusion: (i) hGH-I-RX3, (ii) EK-RX3, y (iii) DsRED-I-RX3 (vease la figura 19). En los tres casos, despues de transfeccion de celulas CHO, la observacion del patron caractenstico de manchas intracelulares demostro que las correspondientes protemas de fusion se reteman dentro de las celulas en RPBLA (figuras 19A y B). La heterogeneidad de los tamanos de los PRBLA que se puede observar claramente en la figura 19A se puede asociar con diferentes fases de formacion de RPBLA o a diferencias en la eficacia de transfeccion y las diferencias resultantes en los niveles de expresion de las protemas de fusion.
Un enfoque tecnico para caracterizar indirectamente lo apretado del ensamblaje de la protema de fusion dentro del cuerpo proteico es la determinacion de la densidad de los RPBLA por gradientes en colchon por capas de sacarosa. Por tanto, se cargaron RPBLA inducidos por la expresion de hGH-I-RX3 en celulas CHO encima del siguiente gradiente en colchon por capas de sacarosa:
% de sacarosa
Densidad (g/ml)
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1,08
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1,12
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1,16
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Tabla 7: Concentracion de sacarosa (%) y densidad (g/ml)
El analisis de volumenes equivalentes de las diferentes fracciones recuperadas del gradiente de densidad por inmunotransferencia mostro que la mayona de la protema de fusion cargada (Fig. 19A, carril H) se recupero en fracciones densas (Fig. 19A, carril F42 y F56). Una pequena cantidad de protema de fusion no ensamblada tambien se observo en las fracciones S y F27, probablemente debido a cinetica de ensamblaje mas lenta. Como los RPBLA muy densos tfpicamente se recuperan de fracciones que tienen densidades de aproximadamente 1,2 g/ml, se puede concluir que se pueden inducir RPBLA por protemas de fusion que tienen el dominio RX3 en el extremo C-terminal de la protema.
Ejemplo comparativo 20: Acumulacion de RPBLA de hGH-I-RX3 en celulas de insecto SF9
Una demostracion de que protemas de fusion que tienen el peptido ensamblador RX3 en el extremo C-terminal de la protema son capaces de inducir RPBLA en celulas de insecto se realizo con hGH-I-RX3. Celulas de insecto infectadas con un virus recombinante pBacPAK8 que expresa hGH-RX3 mostraron el patron de inmunofluorescencia caractenstico de acumulacion de RPBLA (Figura 19C). Las manchas distribuidas uniformemente a lo largo de la celula corresponden a RPBLA y demostraban que la protema de fusion se retema eficazmente en el RE. Cuando celulas SF9 que expresan hGH-I-RX3 se homogenizaron y centrifugaron a baja velocidad (3000xg), una gran proporcion de la protema de fusion se recupero en la fraccion de los RPBLA (figura 19C, panel derecho, carril 3). Como se observa en protemas de fusion con RX3 N-terminal (Publicacion en EE UU No. 2006/0123509), el ensamblaje apretado en organulos densos (RPBLA) inducido por interacciones RX3:RX3 permite una recuperacion eficaz de una fraccion muy enriquecida en RPBLA.
Ejemplo 21: Acumulacion de RPBLA en celulas de mamifero
Se fusionaron secuencias que codifican las siguientes protemas a secuencias que codifican xilanasa y se clonaron en el vector pcDNA 3.1 (Invitrogen) para expresion en celulas de mairnfero: RX3, RX3(A), RX3(L), RX3(A3), RX3(E), RX3(D), RX3(T), RX3(N), RX3(Q), PP, PA, RX3C64G, RX3C82G, RX3C84G, RX3C92G, PP2, R8(C4), R7(C4),
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R6(C4), R4(C4), Z(Adh), Z(Adh)Px, Z(Col), Z(Col)Px, e iRX3. Los vectores resultantes se introdujeron en celulas 293T, Cos1 y CHO usando el metodo de transfeccion basado en lipofectamina.
Las inmunotransferencias de celulas transfectadas muestran acumulacion de todas las protemas de fusion. Ademas, la localizacion de las protemas de fusion por inmunocitoqmmica indica que las protemas de fusion se acumulan en RPBLA esfericos que tienen diametros desde aproximadamente 0,5 hasta aproximadamente 3 micrometros. La densidad de los RPBLA se determina cargando en colchones por capas de sacarosa y es de aproximadamente 1,1 a aproximadamente 1,4 g/ml. Los RPBLA se purifican usando centrifugacion a baja velocidad (menos de aproximadamente 5000xg), y los RPBLA recuperados son al menos aproximadamente el 95% puros. Los RPBLA se solubilizan incubando en tampon moderado (Tris 50 mM pH 8, TCEP 5 mM y 2bME 10 mM) durante aproximadamente 4 horas y despues centrifugacion a aproximadamente 16.000 g durante aproximadamente 10 minutos. Se recuperan altos rendimientos de protema en la porcion solubilizada. La actividad xilanasa se mide usando un sustrato sintetico (DiMUX2) y se observan altos niveles de actividad.
Ejemplo 22: Acumulacion de RPBLA en celulas de insecto
Se fusionaron secuencias que codifican las siguientes protemas a secuencias que codifican xilanasa y se clonaron en el sistema de vector de expresion de baculovirus pFastBAck (Invitrogen): RX3, RX3(A), RX3(L), RX3(A3), RX3(E), RX3(D), RX3(T), RX3(N), RX3(Q), PP, PA, RX3C64G, RX3C82G, RX3C84G, RX3C92G, PP2, R8(C4), R7(C4), R6(C4), R4(c4), Z(Adh), Z(Adh)Px, Z(Col), Z(Col)Px, e iRX3. El virus recombinante se produce usando el kit de transfeccion BaculoGold (PharMingen, San Diego, California, EE UU). Las celulas Sf9 se dejan adherir al fondo de placas de cultivo y despues de 15 minutos a 1 hora de incubacion, la solucion madre de virus se anade a los cultivos que se mantienen a 27°C en aire humidificado durante desde aproximadamente 30 hasta aproximadamente 36 horas.
Las inmunotransferencias de celulas infectadas muestran acumulacion de todas las protemas de fusion. Ademas, la localizacion de las protemas de fusion por inmunocitoqmmica indica que las protemas de fusion se acumulan en RPBLA esfericos que tienen diametros desde aproximadamente 0,5 hasta aproximadamente 3 micrometres. La densidad de los RPBLA se determina cargando en colchones por capas de sacarosa y es de aproximadamente 1,1 a aproximadamente 1,4 g/ml. Los RPBLA se purifican usando centrifugacion a baja velocidad (menos de aproximadamente 5000xg), y los RPBLA recuperados son al menos aproximadamente el 95% puros. Los RPBLA se solubilizan incubando en tampon moderado (Tris 50 mM pH 8, TCEP 5 mM y 2bME 10 mM) durante aproximadamente 4 horas y despues centrifugacion a aproximadamente 16.000 g durante aproximadamente 10 minutos. Se recuperan altos rendimientos de protema en la porcion solubilizada. La actividad xilanasa se mide usando un sustrato sintetico (DiMUX2) y se observan altos niveles de actividad
Ejemplo 23: Acumulacion de RPBLA en celulas de hongos filamentosos
Se fusionan secuencias que codifican las siguientes protemas a secuencias que codifican xilanasa y se clonaron en vectores de expresion de Trichoderma reesei se introducen en la cepa RutC-30 de T. reesei [Montenecourt BS, Eveleigh DE: Selective screening methods for the isolation of high yielding cellulase mutants of Trichoderma reesei. Adv Chem Ser 1979, 181:289-301] esencialmente como se ha descrito [Penttila M, Nevalainen H, Ratto M, Salminen E, Knowles J: A versatile transformation system for the cellulolytic filamentous fungus Trichoderma reesei. Gene 1987, 61:155-164]: RX3, RX3(A), RX3(L), RX3(A3), RX3(E), RX3(D), RX3(T), RX3(N), RX3(Q), PP, PA, RX3C64G, RX3C82G, RX3C84G, RX3C92G, PP2, R8(C4), R7(C4), R6(C4), R4(C4), Z(Adh), Z(Adh)Px, Z(Col), Z(Col)Px, e iRX3. Se seleccionan transformantes en placas que contienen 125 pg/ml de higromicina B. Las transformantes se extienden en medio selectivo que contiene lactosa para expresion inducida y se criban por microscopfa de fluorescencia. Se recogen micelios de los transformantes que producen las mayores cantidades de las protemas de fusion por filtracion.
Las inmunotransferencias de celulas de micelio transformadas muestran acumulacion de todas las protemas de fusion. Ademas, la localizacion de las protemas de fusion por inmunocitoqmmica indica que las protemas de fusion se acumulan en RPBLA esfericos que tienen diametros desde aproximadamente 0,5 hasta aproximadamente 3 micrometros. La densidad de los RPBLA se determina cargando en colchones por capas de Optiprep y es de aproximadamente 1,1 a aproximadamente 1,4 g/ml. Los RPBLA se purifican usando centrifugacion a baja velocidad (menos de aproximadamente 5000xg), y los RPBLA recuperados son al menos aproximadamente el 95% puros. Los RPBLA se solubilizan incubando en tampon moderado (Tris 50 mM pH 8, TcEp 5 mM y 2bME 10 mM) durante aproximadamente 4 horas y despues centrifugacion a aproximadamente 16.000 g durante aproximadamente 10 minutos. Se recuperan altos rendimientos de protema en la porcion solubilizada. La actividad xilanasa se mide usando un sustrato sintetico (DiMUX2) y se observan altos niveles de actividad.
Ejemplo 24: Resumen de las propiedades de los RPBLA obtenidos usando las PBIS segun la invencion y divulgadas en el presente documento
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Se determinaron el diametro y la densidad de los RPBLA preparados de plantas de tabaco agroinfiltradas con las correspondientes construcciones que expresan protema de fusion de las PBIS de RX3, RX3(E), RX3(D), RX3(Q), RX3(N), RX3(T), RX3(A), RX3(A3), RX3(L), PA, PP e iRX3 y ECFP (cuando se usa la PBIS iRX3, las protemas de fusion se construyeron con ambas orientaciones de la PBIS con respecto a la ECFP) como se ha explicado anteriormente. Los resultados se proporcionan en la tabla 9.
Protemas de fusion
Diametro * RPBLA*
en pm. Densidad (g/ml)
RX3-ECFP
1<d<2 1,21-1,26
RX3(E)-ECFP
1<d<5 1,166-1,185
RX3(D)-ECFP
1<d<2 nd
RX3(Q)-ECFP
0,5<d<2 aproximadamente 1,17
RX3(N)-ECFP
0,5<d<1 nd
RX3(T)-ECFP
0,5<d<1 nd
RX3(A)-ECFP
1<d<2 1,194-1,204
RX3(A3)-ECFP
1<d<2 aproximadamente 1,17
RX3(L)-ECFP
aproximadamente 0,5 1,160-1,204
PA-ECFP
0,5<d<1 1,175-1,204
PP-ECFP
0,5<d<1 1,175-1,204
ECFP-iRX3
0,5<d<1 1,11-1,17
iRX3-ECFP
1<d<3 1,21-1,23
Tabla 8: Diametro y densidad de RPBLA obtenidos usando diferentes construcciones
Ejemplo comparativo 25: Construccion de PBIS no alergenicas
Las protemas prolaminas y peptidos derivados de prolaminas pueden ser alergenicos. De forma interesante, cuando se analizo la putativa alergenicidad del peptido RX3 en la base de datos AllergenOnline (version 10.0, enero, 2010;
http://www.allergenonline.com/), desarrollada por el Programa de Investigacion y Recursos de Alergias Alimenticias (FARRP, por sus siglas en ingles), se encontraron 10 resultados con mas del 35% de identidad a peptidos alergenicos. Este resultado sugiere que RX3 de tipo salvaje tiene potencial alergenico. Versiones poco alergenicas o no alergenicas de este peptido son utiles en varias aplicaciones (es decir, nutricion). Por tanto, el mismo analisis se realizo con diferentes variantes de peptidos RX3 descritos en esta solicitud, y los resultados demostraron que PA y RX3(A), son significativamente menos alergenicos que RX3 de tipo salvaje. El analisis de secuencia de PA y RX3(A) en la base de datos AllergenOnline mostro solo tres y dos resultados con mas del 35% de identidad a peptidos alergenicos, respectivamente. Basado en estas observaciones, se sintetizaron varias versiones nuevas no alergenicas del peptido ensamblador RX3: RX3-(LA1) (SEQ ID NO: 110) y RX3-(LA2) (SEQ ID NO: 111). Estos dos peptidos no tienen resultados con mas del 35% de identidad a peptidos alergenicos, lo que indica que no son alergenicos. Las protemas de fusion de RX3(LA1) y RX3(LA2) con GFP y ECFP se expresaron en hojas de tabaco, y su capacidad de induccion de RPBLA no esta afectada.
RX3-LA1 (SEQ ID NO:60)
THTSGGCGCA PPPPAAAPPP AAAPPPAAAP PPAAAPPPAA APPPAAAPPP AAAPPPAAAP PPPCHYPTAP ARPAPAPAPA PCPCAAPAPS PCQ
RX3-LA2 (SEQ ID NO:61)
THTSGGCGCA PPPPAAAPPP AAAPPPAAAP PPAAAPPPAA APPPAAAPPP AAAPPPAAAP PPPCHYPPAP APPAPAPPAP ACPCAAPAPS PCQ
Notablemente, R8(4C) no tiene resultados con mas del 35% de identidad a peptidos alergenicos, lo que indica que no es alergenico en absoluto. Este resultado indica que la alergenicidad de RX3 se debe principalmente a la secuencia de aminoacidos en el dominio Pro-X. Para evitar putativos efectos alergenicos en los peptidos ensambladores, se han sintetizado varias variantes no alergenicas de R8(4C) y se han probado con exito para la induccion de RPBLA en plantas de tabaco.
*
*
Se debe apreciar que se pretende que se use la seccion Descripcion Detallada, y no las secciones Compendio y Resumen, para interpretar las reivindicaciones. Las secciones Compendio y Resumen pueden explicar una o mas
49

Claims (14)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    55
    60
    65
    1. Una secuencia polipeptfdica inductora de cuerpos proteicos (PBIS) recombinante que comprende
    (i) una estructura de poliprolina II (PPII) que tiene al menos 36 aminoacidos de longitud;
    en donde la estructura PPII esta localizada entre al menos dos cistemas en el extremo N y al menos dos cistemas en el extremo C;
    en donde no mas del 10% de los aminoacidos en la estructura PPII son lisina o arginina; y
    en donde la estructura PPII es una secuencia no anfipatica y comprende la menos una repeticion seleccionada del grupo que consiste en PPPVAL (SEQ ID NO:16), PPPVTL (SEQ ID NO:20), PPPVSL (SEQ ID NO:36), PPPVVL (SEQ ID NO:37) y PPPVLL (SEQ ID NO: 17), o
    (ii) una secuencia rica en prolina que tiene al menos 36 aminoacidos de longitud,
    en donde de la secuencia rica en prolina esta localizada entre al menos dos cistemas en el extremo N y al menos dos cistemas en el extremo C;
    en donde no mas del 10% de los aminoacidos en la secuencia rica en prolina son lisina o arginina; y
    en donde la secuencia rica en prolina es una secuencia no anfipatica y comprende la menos una repeticion seleccionada del grupo que consiste en PPPVAL (SEQ ID NO:16), PpPvTL (SEQ ID NO:20), PPPVSL (SEQ ID NO:36), PPPVVL (SEQ ID NO:37) y PPPVLL (SEQ ID NO: 17).
  2. 2. La PBIS recombinante de la reivindicacion 1 en donde la estructura PPII o la region rica en prolina comprende al menos cinco repeticiones ricas en prolina, en donde cada una de las repeticiones ricas en prolina se selecciona independientemente del grupo que consiste en PPPXXX (SEQ ID No:10), PPXX (SEQ ID NO:6), PX, PPPXX (SEQ ID NO:9), PPPX (SEQ ID NO:5), PPX y PPPXPX (SEQ ID NO:11) en donde X es cualquier aminoacido y/o en donde la longitud de la estructura PPII o la region rica en prolina es de aproximadamente 40 a aproximadamente 60 aminoacidos.
  3. 3. La PBIS recombinante de la reivindicacion 1 en donde la secuencia no anfipatica se selecciona independientemente del grupo que consiste en SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:49.
  4. 4. La PBIS recombinante de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en donde el numero de aminoacidos entre las dos cistemas en el extremo C es un numero entero de 0 a 20 y/o en donde el numero de aminoacidos entre las dos cistemas en el extremo N es un numero entero de 0 a 20 y/o en donde el numero de aminoacidos entre la cistema C-terminal en el extremo N y el extremo N de la estructura PPII o entre la cistema N-terminal en el extremo C y el extremo C de la estructura PPII es un numero entero que se selecciona independientemente desde aproximadamente 1 hasta 30.
  5. 5. La PBIS recombinante de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en donde las dos cistemas en el extremo N o las dos cistemas en el extremo C se encuentran en una segunda region rica en prolina.
  6. 6. La PBIS recombinante de la reivindicacion 5 en donde la segunda secuencia rica en prolina se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO; 73, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:127.
  7. 7. La PBIS recombinante de la reivindicacion 6 en donde la PBIS se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 85 y SEQ ID NO: 86.
  8. 8. Una protema de fusion que comprende la PBIS recombinante de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 y una protema heterologa.
  9. 9. Una molecula de acido nucleico que comprende una secuencia que codifica la PBIS recombinante de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 o la protema de fusion de la reivindicacion 8.
  10. 10. Un ensamblaje similar a cuerpo proteico recombinante (RPBLA) que comprende la PBIS recombinante de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 o la protema de fusion de la reivindicacion 8.
  11. 11. Una celula huesped que comprende la PBIS recombinante de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, la protema de fusion de la reivindicacion 8, el acido nucleico de la reivindicacion 9 o el RPBLA de la reivindicacion 10.
    10
    15
  12. 12. Un metodo para producir un RPBLA que comprende cultivar la celula de la reivindicacion 11 en condiciones adecuadas para la formacion del RPBLA y, opcionalmente purificar el cuerpo proteico recombinante.
  13. 13. Un metodo para purificar una protema de fusion que comprende
    (i) proporcionar RPBLA que comprenden una protema de fusion encerrada por membrana, en donde la protema de fusion es la protema de fusion de la reivindicacion 8;
    (ii) poner en contacto los RPBLA con un tampon acuoso que contiene una cantidad de un tensioactivo que desensambla la membrana;
    (iii) mantener el contacto durante un periodo de tiempo suficiente para desensamblar la membrana y a una temperatura que no desnaturaliza la protema de fusion para separar la membrana de la protema de fusion; y
    (iv) recoger la protema de fusion separada.
  14. 14. Una composicion farmaceutica que comprende una cantidad terapeuticamente eficaz del RPBLA de la reivindicacion 10, una vacuna que comprende una cantidad inmunogenicamente eficaz del RPBLA de la reivindicacion 10 o un producto alimenticio que comprende el RPBLA de la reivindicacion 10.
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