JP2015532124A - アミロース含量が増加した高品質デュラムコムギの生成 - Google Patents

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Abstract

【課題】デュラムコムギ中のアミロースを改変する組成物及び方法に対する大きい必要性が存在する。【解決手段】 本発明は、デュラムコムギ表現型を変更／改善する組成物及び方法を提供する。さらに、デュラムコムギ及び／又はその他の密接に関係する種を育種して、表現型が変更又は改善された植物を生成する方法が提供される。【選択図】図４

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１２年１２月１２日に出願された米国仮特許出願第６１／７３６，１３６号及び２０１２年１０月２３日に出願された米国仮特許出願第６１／７１７，３５７号の利益を主張し、これらの出願は、参照によりそれらの全体が全ての目的のために本明細書に組み込まれている。
電子的に提出されたテキストファイルについての記載
本明細書とともに電子的に提出されたテキストファイルの内容は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれている：配列表のコンピュータ読み取り可能フォーマットコピー（ファイル名:MONT_135_01WO_Seq_List.txt、記録日時:2013年10月10日;ファイルサイズ:136キロバイト）。
本発明は、全般的に、デュラムコムギの最終生成物の品質特性を改善することに関する。より具体的には、本発明は、１種又は複数のデンプン合成遺伝子を改変することにより、コムギの１又は複数の最終生成物の品質特性を改善するための組成物及び方法に関する。
デンプンは、穀物の穀粒の乾燥重量のおよそ７０％を占めており、２種の形態のグルコースポリマーである、α−１，４結合を有する直鎖状アミロースと、α−１，４結合及びα−１，６分枝点を有する分枝状アミロペクチンと、で構成される。パンコムギでは、アミロースはデンプンのおよそ２５％を占め、アミロペクチンは残りの７５％を占める（Tetlow 2006において検討されている）。デンプン粒の合成は、複合体において関連するいくつかの酵素が関与する複雑なプロセスである（Tetlowら2008;Tetlowら2004b）。パンコムギでは、遺伝子Ｗｘ−Ａｌａ、Ｗｘ−Ｂｌａ及びＷｘ−Ｄｌａによりコードされる「モチ様」タンパク質（顆粒結合型デンプン合成酵素I）が、ＡＤＰ−グルコースピロホスホリラーゼ（AGPアーゼ）によるＡＤＰ−グルコースの生成の後のアミロース合成を単独で担っている（Denyerら1995;Miuraら1994;Yamamoriら1994）。対照的に、アミロペクチン合成は、ＡＧＰアーゼ、デンプン合成酵素（SS）Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、デンプン分枝酵素（SBE）Ｉ及びＩＩ並びにデンプン脱分枝酵素のような多数の酵素が関与している（Tetlowら2004a）。
デュラムコムギのほとんどは、パスタ及びパスタ製品に用いられるが、麺製品のためにデュラムコムギを研究することに興味が持たれている。デュラム麺製品に対する興味が持たれるのにはいくつかの理由がある。第一に、デュラム麺製品により、デュラムコムギ穀粒についてのさらなる市場がもたらされるであろうこと。デュラムコムギは、時間の経過とともに麺類を灰色又は茶色にする酵素であるポリフェノール酸化酵素の量がパンコムギより低いこと。最後に、デュラムコムギ中に存在する高レベルのカロテノイドは、アルカリ性麺類の黄色を増進できることである。アミロースとアミロペクチンとの割合は、デュラムコムギにおける最終生成物特性を決定することにおける重要な因子である。アジアの麺類の質に対するパンコムギ中のアミロースの減少の影響を決定するために多くの注意が払われている。最終生成物の質に対するデュラムコムギ中のアミロースのわずかな増加が与える影響についての情報が欠如している。よって、デュラムコムギ中のアミロースを改変する組成物及び方法に対する大きい必要性が存在する。本発明は、通常の植物育種及び／又は分子的方法論により、改善されたデュラムコムギ植物を生成するための組成物及び方法を提供する。
本発明は、高アミロースデュラムコムギ穀粒を提供する。いくつかの実施形態では、穀粒は、本発明のデュラムコムギ植物から生成される。いくつかの実施形態では、穀粒は、１種又は複数のデンプン合成遺伝子の１つ又は複数の変異を含むデュラムコムギから生成される。いくつかの実施形態では、穀粒は、デュラムデンプン粒タンパク質−Ｂ１（SGP-B1）遺伝子の１つ又は複数の変異を含むデュラムコムギから生成される。いくつかの実施形態では、本発明は、野生型デュラムコムギ植物のデュラムデンプン粒タンパク質−Ｂ１（SGP-B1）遺伝子の１つ又は複数の変異を含むデュラムコムギ植物から生成される高アミロース穀粒であり、当該高アミロース穀粒中のアミロース含量は、同様の圃場条件で同じ時間栽培した野生型デュラムコムギ植物の穀粒と比較して増加している。いくつかの実施形態では、コムギ穀粒は、デュラムデンプン粒タンパク質−Ｂ１（SGP-B1）遺伝子の１つ又は複数の変異と、デュラムデンプン粒タンパク質−Ａ１（SGP-A1）遺伝子の１つ又は複数の変異とを含むデュラムコムギから生成される。いくつかの実施形態では、穀粒のデンプン中のアミロース含量の割合は、示差走査熱量分析により測定して、少なくとも４０％である。他の実施形態では、デンプン穀粒のアミロース含量は、少なくとも５０％である。いくつかの実施形態では、高アミロース穀粒のデンプン中のアミロース含量は、同様の圃場条件で栽培した適当なデュラムコムギ指標品種（比較品種）の穀粒のデンプンと比較して増加している。いくつかの実施形態では、デュラムコムギ指標品種は、高アミロースデュラムコムギ植物と同じ時間栽培する。
いくつかの実施形態では、１つ又は複数の変異は、野生型デュラムコムギ植物のデンプン粒タンパク質−Ａ１（SGP-A1）対立遺伝子の変異、及び／又は野生型デュラムコムギ植物のデンプン粒タンパク質−Ｂ１（SGP-B1）対立遺伝子の変異からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、高アミロース穀粒の１つ又は複数の変異は、ＳＧＰ−Ａ１遺伝子の第１エキソン中の欠失を含む。いくつかの実施形態では、欠失は、ＳＧＰ−Ａ１遺伝子のヌクレオチド１４５〜１７４位にある。いくつかの実施形態では、高アミロース穀粒の１つ又は複数の変異は、ＳＧＰ−Ｂ１遺伝子のヌクレオチド９７９位及び／又は１８６４位におけるヌクレオチド置換を含む。いくつかの実施形態では、１つ又は複数の遺伝子変異は、少なくとも１つのＳＧＰ−Ａ１遺伝子及び／又は少なくとも１つのＳＧＰ−Ｂ１遺伝子についてのヌル変異を含む。いくつかの実施形態では、ＳＧＰ−Ｂ１変異は、ＳＧＰ−Ｂ１のアミノ酸３２７位におけるアスパラギン酸からアスパラギンへのアミノ酸置換、及び／又はＳＧＰ−Ｂ１のアミノ酸６２２位におけるアスパラギン酸からアスパラギンへのアミノ酸置換を導く。いくつかの実施形態では、ＳＧＰ−Ａ１対立遺伝子又はＳＧＰ−Ｂ１対立遺伝子の変異は、人工的突然変異誘発又は自然の変異により引き起こされる。いくつかの実施形態では、変異は、ヌクレオチド置換、挿入、欠失及び／又はゲノム再構成により引き起こされる。
本発明は、高アミロースコムギの植物細胞も開示する。いくつかの実施形態では、植物細胞は、植物プロトプラスト、コムギ植物をそこから再生できる植物細胞組織培養物、植物カルス、胚、花粉、穀粒、胚珠、果実、花、葉、種子、根、根端などのような任意の植物の部分からの細胞を含む。
本発明の他の実施形態は、デュラムデンプン粒タンパク質−Ｂ１（SGP-B1）遺伝子の１つ又は複数の変異と、デュラムデンプン粒タンパク質−Ａ１（SGP-A1）遺伝子の１つ又は複数の変異とを含むデュラムコムギから生成されるデュラムコムギ穀粒からの小麦粉ベース製品を含む。いくつかの実施形態では、高アミロース穀粒は、小麦粉ベース製品を製造するために用いることができる。いくつかの実施形態では、高アミロース穀粒から製造される製粉製品は、中でも小麦粉、デンプン、セモリナである。いくつかの実施形態では、高アミロース穀粒から製造される小麦粉ベース製品は、中でもパスタ及び麺類である。本発明は、高アミロース穀粒から製造される小麦粉ベース製品を教示する。いくつかの実施形態では、本発明は、高アミロース穀粒から製造される小麦粉を教示する。他の実施形態では、高アミロース穀粒により製造される小麦粉ベース製品は、乾燥パスタである。いくつかの実施形態では、小麦粉ベース製品は、少なくとも１７％のタンパク質含量を有する。他の実施形態では、小麦粉ベース製品は、少なくとも２０％のタンパク質含量を有する。いくつかの実施形態では、小麦粉ベース製品は、少なくとも３％の食物繊維含量を有する。他の実施形態では、小麦粉ベース製品は、少なくとも７％の食物繊維含量を有する。いくつかの実施形態では、小麦粉ベース製品は、少なくとも２％の難消化性デンプン含量を有する。他の実施形態では、小麦粉ベース製品は、少なくとも３％の難消化性デンプン含量を有する。他の実施形態では、小麦粉ベース製品のタンパク質、難消化性デンプン及び食物繊維の含量は、同様の圃場条件で栽培した適当なデュラムコムギ指標系統由来の小麦粉ベース製品と比較して増加している。本発明のいくつかの実施形態では、同様の圃場条件で栽培した適当なデュラムコムギ指標系統に対して比較を行う場合、本発明のコムギ系統及び次いで指標系統を、同じ時間及び／又は場所にて栽培する。例えば、いくつかの実施形態では、小麦粉ベース製品は、同様の圃場条件で栽培した適当なデュラムコムギ指標品種の穀粒から製造される小麦粉ベース製品より少なくとも１０％高い、増加したタンパク質含量を有する。他の実施形態では、小麦粉ベース製品は、同様の圃場条件で栽培した適当なデュラムコムギ指標品種の穀粒から製造される小麦粉ベース製品より少なくとも２０％高い、増加したタンパク質含量を有する。他の実施形態では、小麦粉ベース製品は、同様の圃場条件で栽培した適当なデュラムコムギ指標品種の穀粒から製造される小麦粉ベース製品より少なくとも３０％高い、増加したタンパク質含量を有する。いくつかの実施形態では、小麦粉ベース製品は、同様の圃場条件で栽培した適当なデュラムコムギ指標品種の穀粒から製造される小麦粉ベース製品より少なくとも５０％高い、増加した食物繊維含量を有する。他の実施形態では、小麦粉ベース製品は、同様の圃場条件で栽培した適当なデュラムコムギ指標品種の穀粒から製造される小麦粉ベース製品より少なくとも１００％高い、増加した食物繊維含量を有する。他の実施形態では、小麦粉ベース製品は、同様の圃場条件で栽培した適当なデュラムコムギ指標品種の穀粒から製造される小麦粉ベース製品より少なくとも２００％高い、増加した食物繊維含量を有する。いくつかの実施形態では、小麦粉ベース製品は、同様の圃場条件で栽培した適当なデュラムコムギ指標品種の穀粒から製造される小麦粉ベース製品より少なくとも５０％高い、増加した難消化性デンプン含量を有する。他の実施形態では、小麦粉ベース製品は、同様の圃場条件で栽培した適当なデュラムコムギ指標品種の穀粒から製造される小麦粉ベース製品より少なくとも１００％高い、増加した難消化性デンプン含量を有する。他の実施形態では、小麦粉ベース製品は、同様の圃場条件で栽培した適当なデュラムコムギ指標品種の穀粒から製造される小麦粉ベース製品より少なくとも２００％高い、増加した難消化性デンプン含量を有する。いくつかの実施形態では、小麦粉ベース製品は、同様の圃場条件で栽培した適当なデュラムコムギ指標品種の穀粒から製造される小麦粉ベース製品より少なくとも１２％高い、増加したアミロース含量を有する。他の実施形態では、小麦粉ベース製品は、同様の圃場条件で栽培した適当なデュラムコムギ指標品種の穀粒から製造される小麦粉ベース製品より少なくとも２５％高い、増加したアミロース含量を有する。他の実施形態では、小麦粉ベース製品は、同様の圃場条件で栽培した適当なデュラムコムギ指標品種の穀粒から製造される小麦粉ベース製品より少なくとも４０％高い、増加したアミロース含量を有する。いくつかの実施形態では、小麦粉ベース製品は、乾燥パスタであり、パスタは、同様の圃場条件で栽培した適当なデュラムコムギ指標品種の穀粒から製造されるパスタと比較して、調理後の硬さが改善されている。
いくつかの実施形態では、高アミロース穀粒は、８．４未満の小麦粉膨潤度（FSP）を有する。他の実施形態では、高アミロース穀粒は、７．５未満のＦＳＰを有する。
いくつかの実施形態では、高アミロース穀粒中で増加している食物繊維、難消化性デンプン及びタンパク質の含量の割合は、同様の圃場条件で栽培した適当なデュラムコムギ指標品種の穀粒と比較して増加している。いくつかの実施形態では、高アミロース穀粒から作られるデンプンのアミロース含量は、同様の圃場条件で栽培した適当なコムギ指標品種の穀粒から作られるデンプンのアミロース含量より少なくとも１２％高い。他の実施形態では、高アミロース穀粒から作られるデンプンのアミロース含量は、同様の圃場条件で栽培した適当なコムギ指標品種の穀粒から作られるデンプンのアミロース含量より少なくとも２５％高い。他の実施形態では、高アミロース穀粒から作られるデンプンのアミロース含量は、同様の圃場条件で栽培した適当なコムギ指標品種の穀粒から作られるデンプンのアミロース含量より少なくとも４０％高い。いくつかの実施形態では、適当なデュラムコムギ指標品種は、同じ時間及び／又は場所にて栽培する。
いくつかの実施形態では、高アミロース穀粒のデンプンは、同様の圃場条件で栽培した適当なデュラムコムギ指標品種の穀粒からのデンプンと比較して、糊化特性が変化している。
いくつかの実施形態では、高アミロース穀粒から作られるパスタ又は麺類は、同様の圃場条件で栽培した適当なデュラムコムギ指標品種の穀粒から製造されるパスタ又は麺類と比較して、グリセミック指数が低減している。
いくつかの実施形態では、高アミロース穀粒から作られるパスタ又は麺類は、同様の圃場条件で栽培した適当なデュラムコムギ指標品種の穀粒から作られるパスタ又は麺類と比較して、硬さが増加している。
いくつかの実施形態では、高アミロース穀粒から作られるパスタ又は麺類は、同様の圃場条件で栽培した適当なデュラムコムギ指標品種の穀粒から作られるパスタ又は麺類と比較して、加熱過多に対する抵抗性が増加している。
いくつかの実施形態では、高アミロース穀粒から作られるパスタ又は麺類は、同様の圃場条件で栽培した適当なデュラムコムギ指標品種の穀粒から作られるパスタ又は麺類と比較して、タンパク質含量が増加している。
変異穀粒から製造されるパスタは、野生型デュラムコムギ植物の穀粒から作られるパスタと比較して、食物繊維、難消化性デンプン及び／又はタンパク質の含量の割合も増加している。
いくつかの実施形態では、穀粒は、野生型デュラムコムギ植物の穀粒と比較して、アミロース含量が増加している。
いくつかの実施形態では、穀粒は、野生型デュラムコムギ植物の穀粒と比較して、食物繊維が増加し、アミロース含量が増加している。
いくつかの実施形態では、穀粒は、野生型デュラムコムギ植物の穀粒と比較して、タンパク質含量が増加し、アミロース含量が増加している。
いくつかの実施形態では、穀粒は、野生型デュラムコムギ植物の穀粒と比較して、食物繊維が増加し、ふすまに対する胚乳の比が減少し、かつ／又は製粉収率が低減している。
いくつかの実施形態では、穀粒は、野生型デュラムコムギ植物の穀粒と比較して、食物繊維が増加し、灰分が増加している。
いくつかの実施形態では、穀粒は、野生型デュラムコムギ植物の穀粒と比較して、タンパク質が増加し、デンプン含量が低減している。
いくつかの実施形態では、変異デュラムコムギデンプンは、野生型デュラムコムギデンプンと比較して、アミロース含量が増加している。いくつかの実施形態では、変異デュラムコムギのアミロース含量は、約３８％〜約５０％である。
いくつかの実施形態では、本発明のデンプンは、同様の圃場条件で栽培した適当なコムギ指標品種のデンプンと比較して、Ｂ型デンプン粒の量において全体として減少している。
いくつかの実施形態では、本発明のデンプンは、野生型デュラムコムギデンプンと比較して、糊化特性が変化している。
いくつかの実施形態では、生成される穀粒がデュラムコムギ植物から製造されるパスタ又は麺類のような食物に与える硬さは、野生型デュラムコムギ植物から製造されるパスタ又は麺類のような食物と比較して、増加している。
いくつかの実施形態では、本発明の穀粒がデュラムコムギ植物から製造されるパスタ又は麺類に与えるグリセミック指数は、野生型デュラムコムギ植物から製造されるパスタ又は麺類と比較して、低減している。
いくつかの実施形態では、本発明の穀粒は、野生型デュラムコムギデンプンと比較して、加熱過多に対する抵抗性が増加している。
本発明は、本発明の穀粒から製造される小麦粉も提供する。
本発明は、本発明の穀粒から製造されるデンプンも提供する。
本発明は、高アミロースデュラムコムギ植物を生成するための方法も提供する。いくつかの実施形態では、方法は、ＳＧＰ−Ａ１変異及び／又はＳＧＰ−Ｂ１変異を含むデュラムコムギ植物に対して突然変異誘発を行うことを含む。いくつかの実施形態では、デュラムコムギ植物は、第１エキソン中に２９ｂｐの欠失を有するＳＧＰ−Ａ１を含む。いくつかの実施形態では、デュラムコムギ植物は、ＳＧＰ−Ｂ１のアミノ酸３２７位から、例えばアスパラギン酸からアスパラギンへのアミノ酸置換、及び／又はＳＧＰ−Ｂ１のアミノ酸６２２位における、例えばアスパラギン酸からアスパラギンへのアミノ酸置換を有するＳＧＰ−Ｂ１を含む。方法は、野生型デュラムコムギ植物と比較して、アミロース含量が上昇しているデュラムコムギ植物を生成する。
本発明は、デュラムデンプン粒タンパク質（SGP-B1）の１つ又は複数の変異を有するデュラムコムギを生成するための方法も提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、デュラムデンプン粒タンパク質（SGP-B1）の１つ又は複数の変異と、デュラムデンプン粒タンパク質−Ａ１（SGP-A1）遺伝子の１つ又は複数の変異とを有するデュラムコムギを生成するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、方法は、デュラムデンプン粒タンパク質−Ａ１（SGP-A1）遺伝子の１つ又は複数の変異を含有するデュラムコムギ穀粒に突然変異を誘発して、突然変異誘発穀粒の個体群を形成することと、突然変異誘発デュラムコムギ穀粒から１種又は複数のデュラムコムギ植物を栽培することと、得られた植物をスクリーニングして、デュラムＳＧＰ−Ｂ１変異遺伝子を有するデュラムコムギ植物を同定することと、デュラムＳＧＰ−Ｂ１変異遺伝子を含有する１種又は複数のデュラムコムギ植物を選択することとを含む。他の実施形態では、方法は、デュラムデンプン粒タンパク質−Ｂ１（SGP-B1）遺伝子の１つ又は複数の変異を含有するデュラムコムギ穀粒に突然変異を誘発して、突然変異誘発穀粒の個体群を形成することと、突然変異誘発デュラムコムギ穀粒から１種又は複数のデュラムコムギ植物を栽培することと、得られた植物をスクリーニングして、デュラムＳＧＰ−Ａ１変異遺伝子を有するデュラムコムギ植物を同定することと、デュラムＳＧＰ−Ａ１変異遺伝子を含有する１種又は複数のデュラムコムギ植物を選択することとを含む。いくつかの実施形態では、得られるデュラムコムギ植物は、デュラムデンプン粒タンパク質−Ｂ１（SGP-B1）遺伝子の１つ又は複数の変異と、デュラムデンプン粒タンパク質−Ａ１（SGP-A1）遺伝子の１つ又は複数の変異とを含み、植物は、高アミロース穀粒を生成する。他の実施形態では、デュラムデンプン粒タンパク質（SGP-B1）の１つ又は複数の変異と、デュラムデンプン粒タンパク質−Ａ１（SGP-A1）遺伝子の１つ又は複数の変異とを有するデュラムコムギ植物を生成するための方法は、デュラムＳＧＰ−Ａ１遺伝子上に１つ又は複数の変異を含有するデュラムコムギ植物と、デュラムＳＧＰ−Ｂ１遺伝子上に１つ又は複数の変異を含有する第２のデュラムコムギ植物とを交配させることと、得られる種子を収穫することと、収穫した種子を栽培することとを含む。いくつかの実施形態では、得られるデュラムコムギ植物は、デュラムデンプン粒タンパク質−Ｂ１（SGP-B1）遺伝子の１つ又は複数の変異と、デュラムデンプン粒タンパク質−Ａ１（SGP-A1）遺伝子の１つ又は複数の変異とを含み、植物は、高アミロース穀粒を生成する。
本発明は、植物組織を培養するための方法も提供する。いくつかの実施形態では、植物組織を培養及び再生する方法は、高アミロースデュラムコムギ植物の少なくとも一部分を、植物再生を促す条件で培養することにより、植物を再生することを含む。本発明は、雑種種子を生成する方法であって、高アミロースデュラムコムギを別の植物と交配させることと、得られる種子を収穫することとを含む方法も提供する。本発明は、高アミロース穀粒を有するデュラムコムギ植物を育種する方法であって、第１の高アミロースデュラム植物と第２植物との間の交雑種を作製して、Ｆ１植物を生成することと、Ｆ１植物を第２植物に戻し交配することと、戻し交配工程を１又は複数回反復して、近同質遺伝子又は同質遺伝子系統を得ることとを含む方法も提供する。いくつかの実施形態では、得られる植物は、第２植物、並びにＳＧＰ−Ａ１及び／又はＳＢＰ−Ｂ１変異を有する第２植物に由来する近同質遺伝子又は同質遺伝子系統のゲノム中にＳＧＰ−Ａ１及びＳＧＰ−Ｂ１変異が組み込まれている。
本発明は、デュラムコムギ穀粒から製造される食品の硬さを増加するための方法も提供する。いくつかの実施形態では、食品は、麺又はパスタである。いくつかの実施形態では、方法は、麺又はパスタをデュラムコムギ植物から製造することを含み、ここで、デュラムコムギ植物は、ＳＧＰ−１タンパク質中に少なくとも１つの変異を含む。デュラムコムギ植物は、野生型デュラムコムギ植物と比較してアミロース含量が上昇している穀粒を生成する。いくつかの実施形態では、このようなデュラムコムギ植物から製造される食品は、野生型デュラムコムギ植物の穀粒から製造される食品と比較して、加熱過多に対する耐性がより高い。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの変異は、デンプン粒タンパク質−Ａ１（SGP-A1）対立遺伝子の変異及びデンプン粒タンパク質−Ｂ１（SGP-B1）対立遺伝子の変異からなる群から選択される。
Ｍｏｕｎｔｒａｉｌ（SSIIa-Aa）及びＰＩ３３０５４６（SSIIa-Ab）並びにそれらの交配からの分離型組換え近交系からのデンプン粒タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す図である。 Ｍｏｕｎｔｒａｉｌ／ＰＩ３３０５４６及びＭｏｕｎｔｒａｉｌ／ＩＧ８６３０４からの組換え近交系についての小麦粉膨潤度と麺硬さとの間の関係を示す図であり、これらの交雑種はともに、ＳＳＩＩａ−Ａａ対ＳＳＩＩａ−Ａｂについて分離型である。応答方程式は、以下のとおりである：ＩＧ８６３０４ ＳＳＩＩａ−Ａａ ｙ＝１０．４８９−０．０５４ｘ±０．０２９；ＩＧ８６３０４ ＳＳＩＩａ−Ａｂ ｙ＝８．３２４＋０．０１８ｘ±０．０５７；ＰＩ３３０５４６ ＳＳＩＩａ−Ａａ ｙ＝１０．６７１−０．０６０ｘ±０．０２６；及びＰＩ３３０５４６ ＳＳＩＩａ−Ａｂ ｙ＝１０．０８０−０．０６９±０．０２６。 Ｍｏｕｎｔｒａｉｌ／ＰＩ−３３０５４６ Ｆ５ ＳＧＰ−１野生型（WT）、Ｍｏｕｎｔｒａｉｌ／ＰＩ−３３０５４６ Ｆ５ ＳＧＰ−Ａ１ヌル（Aヌル）並びにＳＧＰ−１ ２重ヌル遺伝子型ＤＨＡ１７５及びＤＨＡ５５からのデンプン粒タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す図である。アクリルアミドゲルを銀染色し、ＷＴの系列希釈を用いてローディング曲線を作出した。デュラムでの両方のＳＧＰ−１タンパク質の削除は、ＳＧＰ−２及びＳＧＰ−３の結合の低減をもたらす。 Ｍｏｕｎｔｒａｉｌ／ＰＩ−３３０５４６ Ｆ５（SGP-1野生型）、Ｍｏｕｎｔｒａｉｌ／ＰＩ−３３０５４６ Ｆ５（SGP-A1ヌル）及びＳＧＰ−１ ２重ヌル遺伝子型ＤＨＡ１７５からのデンプン粒のＦＥＭ顕微鏡写真を示す図である。 Ｍｏｕｎｔｒａｉｌ／ＰＩ−３３０５４６ Ｆ５ ＳＧＰ−１野生型、Ｍｏｕｎｔｒａｉｌ／ＰＩ−３３０５４６ Ｆ５ ＳＧＰ−Ａ１ヌル並びにＳＧＰ−１ ２重ヌル遺伝子型ＤＨＡ１７５及びＤＨＡ５５からのデンプンのＤＳＣサーモグラムを示す図である。試料あたりデンプンおよそ１０ｍｇ（実際の重量を記録した）を、ｄｄＨ２Ｏ ５５μＬとともに高圧ステンレス鋼のパンに入れた。パンをＯリングで密閉して覆い、デンプンを放置して室温にて１晩水和させた。試料を次の日に再秤量し、次いで、２５℃に２分間置いて平衡化した後に、１２０℃まで１０℃／分にて加熱した。試料中の熱伝導を、参照としての空のステンレス鋼のパンと比較した。Ｐｙｒｉｓソフトウェアを用いてサーモグラムを作製し、遷移温度及び物理的遷移熱を算出した。アミロースは、Ｐｏｌａｓｋｅら（２００５）に記載される方法を用いてＤＳＣにより決定した。アミロース含量についての統計解析は、ＳＡＳ９．０（SAS Institute、Cary、NC）での０．０５のアルファを用いるＰＲＯＣ ＧＬＭ及びｔ検定を用いて行った。ＳＧＰ−１ ２重ヌル系統は、より低い温度で生じるアミロペクチン糊化プロファイルの変化を示し、野生型及びＳＧＰ−Ａ１ヌル対照と比較して、エンタルピーが減少した。 ＤＨＡ１７５及び野生型対照コムギのパスタについてのグリセミック指数を示す図である。グリセミック指数は、１２時間の絶食及びＤＨＡ１７５又は野生型デュラムパスタの摂取後の、２時間血糖応答曲線下面積（AUC）の増加を算出することにより決定した。ＤＨＡ１７５デュラムコムギパスタは、野生型パスタより低いグリセミック指数を示す。 １２時間の絶食及びＤＨＡ１７５又は野生型デュラムパスタの摂取後の、１２０分間の期間にわたる血漿グルコース曲線を示す図である。ＤＨＡ１７５パスタはまた、野生型対照デュラムと比較して、より低いグルコースピークと、９０及び１２０分でのより高い持続性のグルコースレベルとを有する血漿グルコース曲線を示した。
配列
配列番号１〜配列番号２４についての配列表は、本出願の一部であり、参照により本明細書に組み込まれている。配列表は、この書類の最後に示す。
全ての図面及び添付物を含む全ての出版物、特許及び特許出願、並びに本明細書でＧｅｎＢａｎｋ受託番号により識別される全ての核酸配列及びポリペプチド配列は、それぞれ個別の出版物又は特許出願が参照により組み込まれると具体的かつ個別的に示されているのと同じ程度で参照により組み込まれている。
以下の記載は、本発明の理解において有用であり得る情報を含む。本明細書に示す任意の情報が本願で請求する発明の従来技術若しくは本願で請求する発明に関連すること、又は具体的若しくは暗示的に参照する任意の出版物が従来技術であることを認めるものではない。
定義
本明細書で用いる場合、本記載及び特許請求の範囲において用いる「含む」との動詞並びにその活用形は、この語句の後に続く項目が含まれるが、具体的に言及していない項目が除外されないことを意味する、非限定的な意味で用いる。
本発明は、植物の最終生成物の品質特性を改善するための組成物及び方法を提供する。本明細書で用いる場合、「植物」との用語は、別段の特定のない限り、コムギ（例えばパンコムギ又はデュラムコムギ）のことをいう。
本明細書で用いる場合、「植物」との用語は、植物全体、又は植物細胞、植物プロトプラスト、コムギ植物をそこから再生できる植物細胞組織培養物、植物カルス、胚、花粉、穀粒、胚珠、果実、花、葉、種子、根、根端などのようなその任意の部分若しくは派生物も含む。
本明細書で用いる場合、「適当なデュラムコムギ指標」との用語は、本発明の実験植物の評価のための基礎を与えるデュラムコムギ植物を表すことを意味する。適当な指標は、実験系統と同じ環境条件で栽培し、実験系統とほぼ同じ成熟度のものである。「適当なデュラムコムギ指標」との用語は、実験系統において試験される改変又は因子について対照系統を代表するように選択された、複数の適当な品種を実際に反映することがある。いくつかの実施形態では、適当なデュラムコムギ指標品種は、実験変異を有さない野生型デュラムコムギ品種であり得る。いくつかの実施形態では、デュラムコムギ指標系統は、「Ｍｏｕｎｔｒａｉｌ」、「Ｄｉｖｉｄｅ」、「Ｓｔｒｏｎｇｆｉｅｌｄ」又は「Ａｌａｚｄａ」野生型品種であり得る。
本発明は、植物の部分を提供する。本明細書で用いる場合、「植物の部分」との用語は、限定されないが、シュート、根、茎、種子、托葉、葉、花弁、花、胚珠、苞葉、枝、葉柄、節間、樹皮、軟毛、分蘖、根茎、葉状体、葉身、花粉、雄蕊、植物細胞などを含む植物の任意の部分のことをいう。
「ａ」又は「ａｎ」との用語は、その実体の１又は複数のことをいう。例えば「遺伝子（a gene）」は、１種若しくは複数の遺伝子又は少なくとも１種の遺伝子のことをいう。よって、「ａ」（又は「an」）、「１つ又は複数」及び「少なくとも１」は、本明細書において交換可能に用いられる。さらに、不定冠詞「ａ」又は「ａｎ」により「要素（an element）」に言及することは、文脈が１つだけの要素があることを明確に要求するのでない限り、１より多い要素が存在する可能性を除外しない。
本発明は、選択マーカーを提供する。本明細書で用いる場合、「植物選択又はスクリーニングマーカー」との句は、植物細胞において機能性の遺伝子マーカーのことをいう。選択マーカーは、そのマーカーを含有及び発現する細胞が、マーカーを発現しない細胞の成長にとって好ましくない条件下で成長することを可能にする。スクリーニングマーカーは、そのマーカーを発現する細胞の同定を容易にする。
本発明は、近交系植物を提供する。本明細書で用いる場合、「近交系」及び「近交系植物」との用語は、本発明の関係において用いる。これは、その近交系の任意の単一遺伝子変換も含む。
「単一対立遺伝子変換植物」との用語は、本明細書で用いる場合、戻し交配とよばれる植物育種技術により発育させた植物のことをいい、この技術では、戻し交配技術により近交系に移行された単一対立遺伝子に加えて、近交系の本質的に全ての所望の形態学的及び生理的な特徴が取り戻される。
本発明は、植物試料を提供する。本明細書で用いる場合、「試料」との用語は、植物、植物の部分、植物細胞から、若しくは伝播ベクターからの試料、又は土壌、水若しくは空気試料を含む。
本発明は、子植物を提供する。本明細書で用いる場合、「子」との用語は、１若しくは複数の親植物又はその子孫からの栄養生殖又は有性生殖から後代として得られる任意の植物のことをいう。例えば、子植物は、親植物のクローニング若しくは自家受精、又は２つの親植物の交配により得ることができ、自家受精体及びＦ１又はＦ２又はまださらなる世代を含む。Ｆ１は、親の少なくとも一方が形質のドナーとして第１回目に用いられる親から生成される第１世代の子であるが、第２世代（F2）又は後続の世代（F3、F4など）の子は、Ｆ１、Ｆ２などの自家受精から生成される標本である。Ｆ１は、よって（そして通常は）、２つの固定種の親（固定種は、形質についてホモ接合性である）の間の交雑種から得られる雑種であり得るが、Ｆ２は、（通常は）Ｆ１雑種の自家受粉から得られる子であり得る。
本発明は、組換え配列を含む第１植物を第２植物と交配するための方法を提供する。本明細書で用いる場合、「交配する」、「交配」、「他家受粉」又は「交雑する」との用語は、一方の植物にある１つの花の花粉を、別の植物にある花の胚珠（柱頭）に（人工的又は自然に）つけるプロセスのことをいう。
本発明は、植物栽培変種を提供する。本明細書で用いる場合、「栽培変種」との用語は、園芸又は耕種技術により生成された、野生個体群中では通常見出されない植物の品種、株又は種族のことをいう。
本発明は、植物遺伝子を提供する。本明細書で用いる場合、用語「遺伝子」は、生物学的機能と関連するＤＮＡの任意のセグメントのことをいう。よって、遺伝子は、限定されないが、コード配列及び／又はそれらの発現に必要な調節配列を含む。遺伝子は、例えば他のタンパク質のための認識配列を形成する非発現ＤＮＡセグメントも含むことができる。遺伝子は、対象の供給源からのクローニング、又は既知の若しくは予測される配列情報からの合成を含む様々な供給源から得ることができ、所望のパラメータを有するように設計された配列も含むことができる。
本発明は、植物遺伝子型を提供する。本明細書で用いる場合、「遺伝子型」との用語は、個別の細胞、細胞培養物、組織、生物（例えば植物）又は生物の群の遺伝子的構成のことをいう。
いくつかの実施形態では、本発明は、植物のホモ接合体を提供する。本明細書で用いる場合、「ヘミ接合性」との用語は、半数体細胞若しくは生物中の遺伝子、異型配偶子をもつ性における伴性遺伝子、又はパートナーセグメントが欠失された２倍体細胞若しくは生物中の染色体のセグメント中の遺伝子のように、遺伝子が遺伝子型において１だけ存在する細胞、組織又は生物のことをいう。
いくつかの実施形態では、本発明は、異種核酸を提供する。本明細書で用いる場合、「異種ポリヌクレオチド」又は「異種核酸」又は「外因性ＤＮＡセグメント」との用語は、特定の宿主細胞にとって外来の供給源を起源とするか、又は同じ供給源からであるならば、その元の形態から改変されているポリヌクレオチド、核酸又はＤＮＡセグメントのことをいう。よって、宿主細胞での異種遺伝子は、特定の宿主細胞にとって内因性であるが、改変されている遺伝子を含む。よって、この用語は、細胞にとって外来若しくは異種であるか、又は細胞にとって同種であるがそのエレメントが通常見出されない宿主細胞核酸内の位置にあるＤＮＡセグメントのことをいう。外因性ＤＮＡセグメントは、発現されて、外因性ポリペプチドを産生する。
いくつかの実施形態では、本発明は、異種形質を提供する。本明細書で用いる場合、「異種形質」との用語は、外因性ＤＮＡセグメント、異種ポリヌクレオチド又は異種核酸により形質転換された宿主細胞又はトランスジェニック生物に与えられる表現型のことをいう。
いくつかの実施形態では、本発明は、ヘテロ接合体を提供する。本明細書で用いる場合、「ヘテロ接合体」との用語は、少なくとも１つの遺伝子座に存在する異なる対立遺伝子（ある所定の遺伝子の形）を有する２倍体又は多数体の個別の細胞又は植物のことをいう。
いくつかの実施形態では、本発明は、ヘテロ接合性形質を提供する。本明細書で用いる場合、「ヘテロ接合性」との用語は、特定の遺伝子座での異なる対立遺伝子（ある所定の遺伝子の形）の存在のことをいう。
いくつかの実施形態では、本発明は、ホモログを提供する。本明細書で用いる場合、「ホモログ（homolog）」又は「ホモログ（homologue）」との用語は、共通の起源を有し、別の種からの核酸又はペプチド配列と同様に機能する核酸又はペプチド配列のことをいう。
いくつかの実施形態では、本発明は、ホモ接合体を提供する。本明細書で用いる場合、用語「ホモ接合体」は、１若しくは複数又は全ての遺伝子座にて同じ対立遺伝子を有する個別の細胞又は植物のことをいう。この用語を特定の遺伝子座又は遺伝子との関連で用いる場合、この用語は、少なくともその遺伝子座又は遺伝子が同じ対立遺伝子を有することを意味する。
いくつかの実施形態では、本発明は、ホモ接合性形質を提供する。本明細書で用いる場合、「ホモ接合性」又は「ＨＯＭＯ」は、相同染色体セグメント中の１つ若しくは複数又は全ての遺伝子座での同一対立遺伝子の存在のことをいう。この用語を特定の遺伝子座又は遺伝子との関連で用いる場合、この用語は、少なくともその遺伝子座又は遺伝子が同じ対立遺伝子を有することを意味する。
いくつかの実施形態では、本発明は、雑種を提供する。本明細書で用いる場合、「雑種」との用語は、１種又は複数の遺伝子が異なる親の間の交雑種から得られる任意の個別の細胞、組織又は植物のことをいう。
いくつかの実施形態では、本発明は、変異体を提供する。本明細書で用いる場合、「変異体」又は「変異」との用語は、バリアント表現型をもたらし得る異常な遺伝子構成を有する遺伝子、細胞又は生物のことをいう。
本発明は、放任受粉した個体群を提供する。本明細書で用いる場合、「放任受粉した個体群」又は「放任受粉した品種」との用語は、変動を示し得るが、その個体群又は品種を他のものから区別できる１種又は複数の遺伝子型又は表現型の特徴を有する、通常少なくともいくらかの他家受精が可能で標準のために選択される植物のことをいう。他家受粉に対する障壁がない雑種は、放任受粉した個体群又は放任受粉した品種である。
本発明は、植物胚珠及び花粉を提供する。本明細書で用いる場合、植物について論じる場合の「胚珠」との用語は雌性体のことをいうが、「花粉」との用語は雄性体のことをいう。
本発明は、植物表現型を提供する。本明細書で用いる場合、「表現型」との用語は、個体の遺伝子的構成（すなわち遺伝子型）と環境との間の相互作用に起因する個別の細胞、細胞培養物、生物（例えば植物）又は生物の群の観察可能な特徴のことをいう。
本発明は、植物組織を提供する。本明細書で用いる場合、用語「植物組織」は、植物の任意の部分のことをいう。植物器官の例は、限定されないが、葉、茎、根、塊茎、種子、枝、軟毛、根粒、葉腋、花、花粉、雄蕊、雌蕊、花弁、花柄、柄、柱頭、花柱、苞葉、果実、幹、心皮、萼片、葯、胚珠、小花柄、針状葉、球果、根茎、匍匐枝、シュート、果皮、胚乳、胎座、液果、雄蕊及び葉鞘を含む。
本発明は、自家受粉個体群を提供する。本明細書で用いる場合、「自家受精」、「自家受粉した」又は「自家受粉」との用語は、一方の植物にある１つの花の花粉を、同じ植物にある同じ又は異なる花の胚珠（柱頭）に（人工的又は自然に）つけることを意味する。
本明細書で用いる場合、「アミロース含量」との用語は、コムギデンプン中のアミロースの量のことをいう。アミロースは、比較的少ない側鎖を有する、α−１，４結合したＤ−グルコースの直鎖状ポリマーである。アミロースは、α−１，４結合したＤ−グルコースの直鎖状ポリマーを有しつつ、多くのα−１，６Ｄ−グルコース側鎖を有するアミロペクチンよりゆっくりと消化される。アミロースは、加熱によりアミロペクチンより少ない水を吸収し、よりゆっくりと消化される。アミロース含量は、ヨウ素−ヨウ化カリウムアッセイが関与する比色アッセイにより、ＤＳＣ、ＣｏｎＡにより測定できるか、又は加熱後に小麦粉若しくはデンプンの水吸収能力を測定することにより見積もることができる。
本明細書で用いる場合、「デンプン合成遺伝子」との用語は、植物でのデンプン合成に直接的又は間接的に貢献し、デンプン合成を調節し、又はデンプン合成に影響する任意の遺伝子のことをいう。このような遺伝子は、限定されないが、モチ様タンパク質（GBSSI、GBSSIIのような顆粒結合型デンプン合成酵素（GBSS）としても知られる）、ＡＤＰ−グルコースピロホスホリラーゼ（AGPアーゼ）、デンプン分枝酵素（SBE I及びSBE IIのようなSBEとしても知られる）、デンプン脱分枝酵素（SDBEとしても知られる）及びデンプン合成酵素Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ及びＩＶをコードする遺伝子を含む。
本明細書で用いる場合、「モチ様タンパク質」、「顆粒結合型デンプン合成酵素」、ＧＢＳＳ又は「ＡＤＰ−グルコース：（１→４）−アルファ−Ｄ−グルカン４−アルファ−Ｄ−グルコシルトランスフェラーゼ」との用語は、以下の反応：
ＡＤＰ−グルコース＋（１，４−アルファ−Ｄ−グルコシル）ｎ
＝ＡＤＰ＋（１，４−アルファ−Ｄ−グルコシル）ｎ＋１
を触媒できる、Ｅ．Ｃ．番号２．４．１．２１を有するタンパク質のことをいう。
本明細書で用いる場合、「ＡＤＰ−グルコースピロホスホリラーゼ」、ＡＧＰアーゼ、「アデノシン二リン酸グルコースピロホスホリラーゼ」又は「アデノシン−５’−ジホスホグルコースピロホスホリラーゼ」との用語は、以下の反応：
ＡＴＰ＋アルファ−Ｄ−グルコース１−リン酸
＝二リン酸＋ＡＤＰ−グルコース
を触媒できる、Ｅ．Ｃ．番号２．７．７．２７を有するタンパク質のことをいう。
本明細書で用いる場合、「デンプン分枝酵素」、ＳＢＥ、「分枝酵素」、ＢＥ、「グリコーゲン分枝酵素」、「１，４−アルファ−グルカン分枝酵素」、「アルファ−１，４−グルカン：アルファ−１，４−グルカン６−グリコシルトランスフェラーゼ」又は「（１→４）−アルファ−Ｄ−グルカン：（１→４）−アルファ−Ｄ−グルカン６−アルファ−Ｄ−［（１→４）−アルファ−Ｄ−グルカノ］−トランスフェラーゼ」との用語は、以下の反応：
２ １，４−アルファ−Ｄ−グルカン
＝アルファ−１，４−Ｄ−グルカン−アルファ−１，６−（アルファ−１，４−Ｄ−グルカン）
を触媒できる、Ｅ．Ｃ．番号２．４．１．１８を有するタンパク質のことをいう。
本明細書で用いる場合、「デンプン脱分枝酵素」、ＳＤＢＥ又はイソアミラーゼとの用語は、アルファ−１，４及びアルファ−１，６の両方の連結を含有するグルカン中のアルファ−１，６グルコシド結合を加水分解できる、Ｅ．Ｃ．番号２．４．１．１、２．４．１．２５、３．２．１．６８又は３．２．１．４１を有するタンパク質のことをいう。
本明細書で用いる場合、デンプン合成酵素Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ又はＩＶ（SSI又はSI、SSII又はSII、SSIII又はSOOO及びSSIV又はSIV）との用語はそれぞれデンプン合成酵素クラスＩ、クラスＩＩ、クラスＩＩＩ又はクラスＩＶのタンパク質のことをいう。例えば、アミロペクチン合成に関与するタンパク質である。
本明細書で用いる場合、デンプン粒タンパク質−１又はＳＧＰ−１との用語は、コムギデンプン粒に含有される、デンプン合成酵素クラスＩＩに属するタンパク質のことをいう（Yamamori及びEndo、1996）。
本明細書で用いる場合、コムギとの用語は、限定されないが、２倍体、４倍体及び６倍体のコムギ種を含む、Ｔｒｉｔｉｃｕｍの属又はＴｒｉｔｉｃｅａｅの連内の任意のコムギ種のことをいう。
本明細書で用いる場合、用語「製粉製品」は、穀粒（コムギ又はその他の穀粒生成植物から）の粉砕から製造される製品のことをいう。製粉製品の非限定的な例は、中でも小麦粉、中力粉、デンプン、パン用小麦粉、ケーキ用小麦粉、セルフライジング小麦粉、ペストリー用小麦粉、セモリナ、デュラム小麦粉、全粒小麦粉、石臼挽小麦粉、グルテン粉及びグラハム粉を含む。
本明細書で用いる場合、「小麦粉ベース製品」との用語は、中でもパスタ、麺類、パン製品、クッキー及びペストリーを含む、小麦粉から作られる製品のことをいう。
本明細書で用いる場合、「高アミロース穀粒」との用語は、高レベルのアミロースを有するデンプンを含むデュラムコムギ穀粒のことをいう。いくつかの実施形態では、高アミロースレベルは、同様の圃場条件で同じ時間栽培した野生型又はその他の適当なデュラムコムギ指標品種からのコムギ穀粒のアミロース含量と比較して、上昇している。他の実施形態では、アミロースレベルは、示差走査熱量分析により測定して、絶対的パーセントの点で高い。
本明細書で用いる場合、２倍体コムギとの用語は、ゲノムＡＡを有する一粒コムギ（T. monococcum）のような、各染色体の２つの相同コピーを有するコムギ種のことをいう。
本明細書で用いる場合、４倍体コムギとの用語は、野生エマー（T. dicoccoides）に由来するエマー及びデュラムコムギのような、各染色体の４つの相同コピーを有するコムギ種のことをいう。野生エマーは、それ自体で、２種の２倍体野生イネ科植物、すなわちＴ．ｕｒａｒｔｕとＡｅｇｉｌｏｐｓ ｓｅａｒｓｉｉ又はＡｅ．ｓｐｅｌｔｏｉｄｅｓのような野生のゴートグラスとの間の雑種形成の結果である。野生エマー（ゲノムAABBを有する）を形成した雑種形成は、栽培植物化よりずっと以前に野生で生じ、自然選択により駆動された。
本明細書で用いる場合、６倍体コムギとの用語は、パンコムギのような、各染色体の６つの相同コピーを有するコムギ種のことをいう。栽培植物化されたエマー又はデュラムコムギのいずれかを、別の野生２倍体イネ科植物（ゲノムDDを有するAegilops tauschii）と雑種形成させて、６倍体コムギ（ゲノムAABBDDを有する）を作製した。
本明細書で用いる場合、ＳＳＩＩａ−Ａａは、存在する両方の野生型「ａａ」対立遺伝子のことをいうが、ＳＳＩＩａ−Ａｂは、存在する両方の「ｂｂ」対立遺伝子のことをいう。ＳＳＩＩａ及びＳＳＩＩｂは、同じ酵素の２つの異なる形であり得る。
本明細書で用いる場合、「糊化温度」との用語は、加熱中にデンプンが水に溶解する温度のことをいう。糊化温度は、アミロース含量に関係し、アミロース含量の増加は、糊化温度の増加と関連する。
本明細書で用いる場合、「デンプン老化」との用語は、デンプン水ゲルの硬さのことをいい、アミロースの増加は、デンプン老化の増加及びより硬いデンプンベースゲルと関連する。
本明細書で用いる場合、「小麦粉膨潤度」又はＦＳＰとの用語は、過剰の水の存在下で加熱後の、元の試料の重量に対する小麦粉又はデンプンベースゲルの重量のことをいう。アミロースの増加は、ＦＳＰの減少と関連する。
本明細書で用いる場合、「穀粒固さ」との用語は、穀粒を破壊するために必要な圧力のことをいい、製粉後の粒子サイズ、製粉収率及びいくつかの最終生成物の品質形質に関係する。穀粒固さの増加は、小麦粉粒子サイズの増加、デンプン損傷の増加及び分割小麦粉収率の減少と関連する。
本明細書で用いる場合、「セモリナ」との用語は、デュラムコムギの粗い精製コムギミドリング粉のことをいう。
本明細書で用いる場合、「難消化性アミロース」との用語は、消化に対して耐性があり、よってグリセミック指数が低減した食品を製造する目的に応えるアミロースのことをいう。
本明細書で用いる場合、「難消化性デンプン」との用語は、消化に対して耐性があり、食物繊維のように挙動するデンプンのことをいう。アミロースの増加は、難消化性デンプンの増加と関連すると考えられている。
本明細書で用いる場合、「対立遺伝子」との用語は、ある遺伝子のいくつかの代替の形態のいずれかのことをいう。
本明細書で用いる場合、「デンプン」は、その自然若しくは天然の形態のデンプンのことをいい、物理的、化学的、酵素及び生物学的プロセスにより改変されたデンプンのこともいう。
本明細書で用いる場合、「アミロース」は、アルファ１，６−Ｄ−グルコシド結合により連結されたＤ−無水グルコース単位の本質的に直鎖状の集合物であるデンプンポリマーのことをいう。
本明細書で用いる場合、「アミロース含量」は、アミロペクチンのようなその他のデンプンポリマーとの関係でのアミロース型ポリマーのパーセンテージのことをいう。
本明細書で用いる場合、「穀粒」との用語は、その種を栽培又は繁殖させる以外の目的のために商業的な栽培者により生産される成熟コムギの仁のことをいう。
本明細書で用いる場合、「仁」との用語は、重複受精の生成物である、成熟胚及び胚乳を含むコムギ頴果のことをいう。
本明細書で用いる場合、「系統」との用語は、限定されないが、組織培養技術により単一の親植物から栄養繁殖された植物の群、又は共通の親からの子孫であるので遺伝子的に非常に類似する近交系植物の群を含むように広い意味で用いられる。植物は、その植物が（ａ）その系統の材料から再生された初代形質転換体（T0）植物であるか、（ｂ）その系統のＴ０植物で構成される血統を有するか、又は（ｃ）共通の先祖のために遺伝子的に非常に類似している（例えば近親交配又は自家受精により）ならば、特定の系統に「属する」という。この文脈において、「血統」との用語は、例えば、ヘテロ接合性（ヘミ接合性）又はホモ接合性の条件での遺伝子又は遺伝子の組み合わせが所望の形質を植物に与えるように行った有性交雑の観点での植物の系列のことをいう。
本明細書で用いる場合、「遺伝子座」との用語は、遺伝子的に定義された任意の部位のことをいう。遺伝子座は、遺伝子、又は遺伝子の一部、又はいくらかの調節の役割を有するＤＮＡ配列であってよく、同じ又は異なる配列が占めることができる。
本発明は、形質転換により植物又は植物細胞を得るための方法を提供する。本明細書で用いる場合、「形質転換」との用語は、細胞への核酸（すなわちヌクレオチドポリマー）の移入のことをいう。本明細書で用いる場合、「遺伝子形質転換」との用語は、細胞へのＤＮＡ、特に組換えＤＮＡの移入及び組み込みのことをいう。
本発明は、植物及び植物細胞形質転換体を提供する。本明細書で用いる場合、「形質転換体」との用語は、形質転換を経た細胞、組織又は生物のことをいう。元の形質転換体は、「Ｔ０」又は「Ｔ０」と称する。Ｔ０の自家受精は、「Ｔ１」又は「Ｔ１」と称する形質転換第１世代を生成する。
本発明は、植物導入遺伝子を提供する。本明細書で用いる場合、「導入遺伝子」との用語は、核酸の機能を確実にする様式で生物、宿主細胞又はベクターに挿入された核酸のことをいう。
本発明は、植物トランスジェニック植物、植物の部分及び植物細胞を提供する。本明細書で用いる場合、「トランスジェニック」との用語は、形質転換の様々な方法の１つにより外来又は改変遺伝子を受容した細胞、細胞培養物、生物（例えば植物）及び後代であって、外来又は改変遺伝子が、外来又は改変遺伝子を受容した生物と同じ又は異なる種からである細胞、細胞培養物、生物（例えば植物）及び後代のことをいう。
本発明は、植物転位事象を提供する。本明細書で用いる場合、「転位事象」との用語は、ドナー部位から標的部位へのトランスポゾンの移動のことをいう。
本発明は、植物品種を提供する。本明細書で用いる場合、「品種」との用語は、その他の類似の一連の個体から形又は機能が異なる、ある種の中の個体の群からなるその種の下位区分のことをいう。
本発明は、植物ベクター、プラスミド又は構築物を提供する。本明細書で用いる場合、「ベクター」、「プラスミド」又は「構築物」との用語は、外因性核酸をコードする任意のプラスミド又はウイルスのことを広くいう。この用語は、例えばポリリジン化合物などのようなビリオン又は細胞への核酸の移入を容易にする非プラスミド及び非ウイルス化合物も含むと解釈されるべきである。ベクターは核酸又はその変異体を細胞に送達するための送達媒体として適切なウイルスベクターであってよい、又はベクターは同じ目的のために適切な非ウイルスベクターであってよい。細胞及び組織へのＤＮＡの送達のためのウイルス及び非ウイルスベクターの例は、当該技術において公知であり、例えばＭａら（1997、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94: 12744-12746）に記載されている。
本発明は、単離された、キメラの、組換えの又は合成のポリヌクレオチド配列を提供する。本明細書で用いる場合、「ポリヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド配列」又は「核酸」との用語は、リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドである、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形又はそのアナログのことをいう。この用語は、分子の１次構造のことをいい、よって２本鎖及び１本鎖ＤＮＡ並びに２本鎖及び１本鎖ＲＮＡを含む。これは、メチル化及び／又はキャッピングされた核酸、改変塩基、主鎖改変などを含有する核酸のような改変核酸も含む。「核酸」及び「ヌクレオチド配列」との用語は、交換可能に用いる。ポリヌクレオチドは、合成、非自然又は変更されたヌクレオチド塩基を任意選択により含有する、１本鎖又は２本鎖であるＲＮＡ又はＤＮＡのポリマーであってよい。ＤＮＡのポリマーの形態のポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ又はそれらの混合物の１つ又は複数のセグメントで構成されることがある。ヌクレオチド（その5'-一リン酸形で通常見出される）は、以下のような１文字表記で示される：アデニル酸又はデオキシアデニル酸（それぞれRNA又はDNAについて）について「Ａ」、シチジル酸又はデオキシシチジル酸について「Ｃ」、グアニル酸又はデオキシグアニル酸について「Ｇ」、ウリジル酸について「Ｕ」、デオキシチミジル酸について「Ｔ」、プリン（A又はG）について「Ｒ」、ピリミジン（C又はT）について「Ｙ」、Ｇ又はＴについて「Ｋ」、Ａ又はＣ又はＴについて「Ｈ」、イノシンについて「Ｉ」並びに任意のヌクレオチドについて「Ｎ」。
本発明は、単離された、キメラの、組換えの又はポリペプチド配列を提供する。本明細書で用いる場合、「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」との用語は、本明細書において交換可能に用いて、任意の長さのアミノ酸のポリマーのことをいう。これらの用語は、糖鎖付加、アセチル化及びリン酸化を含む反応により翻訳後改変されたタンパク質も含む。
本発明は、相同及びオルソロガスなポリヌクレオチド及びポリペプチドを提供する。本明細書で用いる場合、「相同」又は「ホモログ」又は「オルソログ」との用語は、当該技術において知られており、共通の先祖又は家族の一員を共有し、配列同一性の程度に基づいて決定される関係する配列のことをいう。「相同性」、「相同」、「実質的に類似」及び「実質的に対応する」との用語は、本明細書において交換可能に用いられる。これらは、１つ又は複数のヌクレオチド塩基の変化が遺伝子発現を媒介するか又はある種の表現型を生み出す核酸断片の能力に影響しない、核酸断片のことをいう。これらの用語は、初期の未改変の断片に対して得られる核酸断片の機能的特性を実質的に変更しない１つ又は複数のヌクレオチドの欠失又は挿入のような本発明の核酸断片の改変のこともいう。よって、当業者が認識するように、本発明は、具体的に例示する配列以外も包含すると理解される。これらの用語は、１つの種、亜種、品種、栽培変種又は株において見出される遺伝子と、別の種、亜種、品種、栽培変種又は株における対応する又は等価な遺伝子との間の関係について記載する。本発明の目的のために、相同配列が比較される。「相同配列」又は「ホモログ」又は「オルソログ」は、機能的に関係すると考えられているか、信じられているか又は知られている。機能的関係は、限定されないが、（ａ）配列同一性の程度及び／又は（ｂ）同じ又は同様の生物学的機能を含むいくつかの方式のいずれか１つにより示すことができる。好ましくは、（ａ）及び（ｂ）の両方が示される。配列同一性の程度は変動できるが、一実施形態では、少なくとも５０％（当該技術において知られる標準的な配列アラインメントプログラムを用いる場合）、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも９８．５％、又は少なくとも約９９％、又は少なくとも９９．５％、又は少なくとも９９．８％、又は少なくとも９９．９％である。相同性は、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（F.M. Ausubelら編、1987）補遺３０、７．７１８章、表７．７１で論じられているもののような、当該技術において容易に利用可能なソフトウェアプログラムを用いて決定できる。アラインメントプログラムのいくつかは、ＭａｃＶｅｃｔｏｒ（Oxford Molecular Ltd、Oxford、U.K.）、ＡＬＩＧＮ Ｐｌｕｓ（Scientific and Educational Software、Pennsylvania）及びＡｌｉｇｎＸ（Vector NTI、Invitrogen、Carlsbad、CA）である。別のアラインメントプログラムは、デフォルトパラメータを用いるＳｅｑｕｅｎｃｈｅｒ（Gene Codes、Ann Arbor、Michigan）である。
本発明は、野生型参照配列と比較してヌクレオチド変化を有するポリヌクレオチドを提供する。本明細書で用いる場合、「ヌクレオチド変化」との用語は、当該技術においてよく理解されているように、例えばヌクレオチド置換、欠失及び／又は挿入のことをいう。例えば、変異は、サイレント置換、付加又は欠失を生じるが、コードされるタンパク質の特性若しくは活性又はタンパク質がどのように作製されるかを変更しない変更を含有する。
本発明は、野生型参照配列と比較してタンパク質改変を有するポリペプチドを提供する。本明細書で用いる場合、「タンパク質改変」との用語は、当該技術においてよく理解されているように、例えばアミノ酸置換、アミノ酸改変、欠失及び／又は挿入のことをいう。
本発明は、野生型参照配列に由来するポリヌクレオチド及びポリペプチドを提供する。本明細書で用いる場合、「に由来する」との用語は、起源又は供給源のことをいい、自然に存在するか、組換えであるか、未精製であるか又は精製された分子を含むことができ、起源が植物又は植物の部分である細胞を含むこともできる。ある起源又は供給源に由来する核酸又はアミノ酸は、本明細書の他の場所で定義する全ての種類のヌクレオチド変化又はタンパク質改変を有することができる。
本発明は、本発明の核酸配列及びポリペプチド配列の部分又は断片を提供する。本明細書で用いる場合、核酸又はポリペプチドの「少なくとも一部分」又は「断片」との用語は、そのような配列に特徴的な最小限のサイズを有する一部分、又は全長分子を含んで全長分子までの、全長分子の任意のより大きい断片を意味する。例えば、核酸の一部分は、１２ヌクレオチド、１３ヌクレオチド、１４ヌクレオチド、１５ヌクレオチド、１６ヌクレオチド、１７ヌクレオチド、１８ヌクレオチド、１９ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、２２ヌクレオチド、２４ヌクレオチド、２６ヌクレオチド、２８ヌクレオチド、３０ヌクレオチド、３２ヌクレオチド、３４ヌクレオチド、３６ヌクレオチド、３８ヌクレオチド、４０ヌクレオチド、４５ヌクレオチド、５０ヌクレオチド、５５ヌクレオチドなどの全長核酸までであってよい。同様に、ポリペプチドの一部分は、４アミノ酸、５アミノ酸、６アミノ酸、７アミノ酸などの全長ポリペプチドまでであってよい。用いられる部分の長さは、具体的な用途に依存する。ハイブリダイゼーションプローブとして有用な核酸の一部分は、１２ヌクレオチドほど短いことがある。一実施形態では、これは、２０ヌクレオチドである。エピトープとして有用なポリペプチドの一部分は、４アミノ酸ほど短いことがある。全長ポリペプチドの機能を実行するポリペプチドの一部分は、一般的に、４アミノ酸より長い。
本発明は、本発明の核酸配列及びポリペプチド配列に対して高い類似性又は同一性を有する配列を提供する。本明細書で用いる場合、２つの核酸又はポリペプチド配列の関係における「配列同一性」又は「同一性」は、具体的な比較ウィンドウにわたって最大限に対応するように整列させた場合に同じである２つの配列中の残基への言及を含む。タンパク質に関して配列同一性のパーセンテージを用いる場合、同一でない残基の位置は、頻繁に、アミノ酸残基が同様の化学的特性（例えば電荷又は疎水性）を有するその他のアミノ酸残基で置換されるので、分子の機能的特性を変化させない保存アミノ酸置換により異なると認識される。配列が保存置換により異なる場合、パーセント配列同一性は、置換の保存的性質について補正するために、上方に調整できる。このような保存置換により異なる配列は、「配列類似性」又は「類似性」を有するという。この調整を行うための手段は、当業者に公知である。典型的に、この手段には、保存置換を完全なミスマッチよりもむしろ部分的なミスマッチとして評点することが関与し、そのことによりパーセンテージ配列同一性が増える。よって、例えば、同一アミノ酸のスコアが１であり、非保存置換のスコアがゼロである場合、保存置換は、ゼロと１の間のスコアを与えられる。保存置換の評点は、例えばＭｅｙｅｒｓ及びＭｉｌｌｅｒ、Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｐｐｌｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｓｃｉ．、４：１１〜１７（１９８８）のアルゴリズムに従って算出される。
本発明は、本発明の核酸配列と実質的に相補的な配列を提供する。本明細書で用いる場合、「実質的に相補的な」との用語は、２つの核酸配列が、少なくとも約６５％、好ましくは７０％又は７５％、より好ましくは約８０％又は８５％、さらにより好ましくは９０％又は９５％、最も好ましくは約９８％又は９９％の配列相補性を互いに有することを意味する。このことは、プライマー及びプローブが、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするために、それぞれそれらの鋳型及び標的核酸に対して十分な相補性を示さなければならないことを意味する。よって、プライマー及びプローブ配列は、鋳型上の結合領域の厳密に相補的な配列を反映する必要はなく、縮重プライマーを用いることができる。例えば、非相補的ヌクレオチド断片をプライマーの５’末端に結合させ、残りのプライマー配列が鎖に相補的であってよい。代わりに、プライマーが増幅される鎖の１つの配列と十分な相補性を有してそれとハイブリダイズし、そのことにより重合手段により伸長され得る２重鎖構造を形成できるならば、非相補的塩基又はより長い配列がプライマー中に散在してよい。プライマーの非相補的ヌクレオチド配列は、制限酵素部位を含むことができる。標的配列の末端に制限酵素部位を添えることは、標的配列のクローニングのために特に有用である。実質的に相補的なプライマー配列は、プライマー結合及び第２鎖合成をもたらすように増幅鋳型に対して十分な配列相補性を有するものである。当業者は、増幅鋳型に対して十分な配列相補性を有するプライマーの要件について熟知している。
本発明は、本発明の核酸配列及びポリペプチド配列の生物活性バリアント又は機能的バリアントを提供する。本明細書で用いる場合、タンパク質に関する「生物活性バリアント」又は「機能的バリアント」との句は、参照配列に関して１つ又は複数のアミノ酸が変更されたが、参照配列の実質的な生物活性をまだ維持しているアミノ酸配列のことをいう。バリアントは、置換されるアミノ酸が類似の構造的又は化学的特性を有する「保存」変化、例えばロイシンのイソロイシンでの置き換えを有することができる。代わりに、バリアントは、「非保存」変化、例えばグリシンのトリプトファンでの置き換えを有することができる。似通っているわずかな変動は、アミノ酸欠失若しくは挿入又はその両方も含むことができる。生物活性又は免疫学的活性を削除することなくどのアミノ酸残基を置換、挿入又は欠失させることができるかを決定するための手引きは、当該技術において周知のコンピュータプログラム、例えばＤＮＡＳＴＡＲソフトウェアを用いて見出すことができる。ポリヌクレオチドについて、バリアントは、５’及び／又は３’末端に欠失（すなわち短縮）；参照ポリヌクレオチド中の１若しくは複数の内部部位における１つ若しくは複数のヌクレオチドの欠失及び／又は付加；並びに／或いは参照ポリヌクレオチド中の１若しくは複数の部位における１つ若しくは複数のヌクレオチドの置換を有するポリヌクレオチドを含む。本明細書で用いる場合、「参照」ポリヌクレオチドは、本明細書に開示する方法により生成されるヌクレオチド配列を含む。バリアントポリヌクレオチドは、例えば部位特異的突然変異誘発を用いることにより生じたが、遺伝子調節エレメント活性をまだ有するもののような合成により派生させたポリヌクレオチドも含む。一般的に、本発明の特定のポリヌクレオチド又は核酸分子のバリアントは、本明細書の他の場所に記載する配列アラインメントプログラム及びパラメータにより決定して、その特定のポリヌクレオチドに対して少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９１．５％、９２％、９２．５％、９３％、９３．５％、９４％、９４．５％、９５％、９５．５％、９６％、９６．５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％以上の配列同一性を有する。
バリアントポリヌクレオチドは、ＤＮＡシャフリングのような突然変異誘発性及び組換え誘発性の手順に由来する配列も含む。このようなＤＮＡシャフリングについての方策は、当該技術において知られている。例えばＳｔｅｍｍｅｒ（１９９４）ＰＮＡＳ ９１：１０７４７〜１０７５１；Ｓｔｅｍｍｅｒ（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ ３７０：３８９〜３９１；Ｃｒａｍｅｒｉら（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１５：４３６〜４３８；Ｍｏｏｒｅら（１９９７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７２：３３６〜３４７；Ｚｈａｎｇら（１９９７）ＰＮＡＳ ９４：４５０４〜４５０９；Ｃｒａｍｅｒｉら（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ ３９１：２８８〜２９１；並びに米国特許第５，６０５，７９３号及び第５，８３７，４５８号を参照されたい。本明細書に開示するポリヌクレオチドのＰＣＲ増幅のために、オリゴヌクレオチドプライマーを設計して、ＰＣＲ反応において用いて、ｃＤＮＡ又は対象の任意の植物から抽出されたゲノムＤＮＡから対応するＤＮＡ配列を増幅できる。ＰＣＲプライマーの設計及びＰＣＲクローニングについての方法は、全般的に当該技術において知られており、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Plainview、New York）に開示されている。Ｉｎｎｉｓら編（１９９０）ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Academic Press、New York）；Ｉｎｎｉｓ及びＧｅｌｆａｎｄ編（１９９５）ＰＣＲ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ（Academic Press、New York）；並びにＩｎｎｉｓ及びＧｅｌｆａｎｄ編（１９９９）ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍａｎｕａｌ（Academic Press、New York）も参照されたい。ＰＣＲの既知の方法は、限定されないが、プライマー対、ネステッドプライマー、単一特異的プライマー、縮重プライマー、遺伝子特異的プライマー、ベクター特異的プライマー、部分的ミスマッチプライマーなどを用いる方法を含む。
本発明は、本発明の核酸配列及びポリペプチド配列に由来するプライマーを提供する。「プライマー」との用語は、本明細書で用いる場合、増幅標的に対してアニールでき、ＤＮＡポリメラーゼが結合することを可能にし、そのことによりプライマー伸長生成物の合成が誘導される条件下、すなわちヌクレオチド及びＤＮＡポリメラーゼのような重合剤の存在下でかつ適切な温度及びｐＨにおかれた場合にＤＮＡ合成の開始点として作用するオリゴヌクレオチドのことをいう。（増幅）プライマーは、増幅における最大限の効率のために、好ましくは１本鎖である。好ましくは、プライマーは、オリゴデオキシリボヌクレオチドである。プライマーは、重合剤の存在下で伸長生成物の合成を開始するために十分に長くなければならない。プライマーの厳密な長さは、温度及びプライマーの組成（A/T対G/C含量）を含む多くの因子に依存する。２方向プライマーの対は、ＰＣＲ増幅のようなＤＮＡ増幅の当該技術において一般的に用いられるように、１つのフォワードプライマーと１つのリバースプライマーとからなる。
本発明は、本発明の核酸配列とハイブリダイズできるポリヌクレオチド配列を提供する。「ストリンジェンシー」又は「ストリンジェントハイブリダイゼーション条件」との用語は、ハイブリッドの安定性に影響するハイブリダイゼーション条件、例えば温度、塩濃度、ｐＨ、ホルムアミド濃度などのことをいう。これらの条件は、プライマー又はプローブとその標的核酸配列との特異的結合を最大限にし、非特異的結合を最小限にするように、経験的に最適化される。用いられるこれらの用語は、プローブ又はプライマーがその他の配列よりも検出可能に大きい程度（例えばバックグラウンドの少なくとも2倍）までその標的配列とハイブリダイズする条件への言及を含む。ストリンジェント条件は、配列依存性であり、異なる状況で異なる。より長い配列は、より高い温度にて特異的にハイブリダイズする。一般的に、ストリンジェント条件は、規定されたイオン強度及びｐＨにて特定の配列についての熱融点（Tm）より約５℃低くなるように選択される。Ｔｍは、相補的標的配列の５０％が、完全にマッチするプローブ又はプライマーと（規定のイオン強度及びpHの下で）ハイブリダイズする温度である。典型的に、ストリンジェント条件は、ｐＨ７．０〜８．３にて塩濃度が約１．０Ｍ Ｎａ＋イオン未満、典型的に約０．０１〜１．０Ｍ Ｎａ＋イオン濃度（又はその他の塩）であり、温度が短いプローブ又はプライマー（例えば10〜50ヌクレオチド）について少なくとも約３０℃、長いプローブ又はプライマー（例えば50ヌクレオチドを超える）について少なくとも約６０℃であるものである。ストリンジェント条件は、ホルムアミドのような不安定化剤の添加によっても達成できる。例示的な低ストリンジェント条件又は「低減ストリンジェンシー条件」は、３０％ホルムアミド、１Ｍ ＮａＣｌ、１％ＳＤＳの緩衝液を用いて３７℃でのハイブリダイゼーションと、２×ＳＳＣ中で４０℃での洗浄とを含む。例示的な高ストリンジェント条件は、５０％ホルムアミド、１Ｍ ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ中で３７℃でのハイブリダイゼーションと、０．１×ＳＳＣ中で６０℃での洗浄とを含む。ハイブリダイゼーション手順は、当該技術において周知であり、例えばＡｕｓｕｂｅｌら、１９９８及びＳａｍｂｒｏｏｋら、２００１により記載されている。
本発明は、コード配列を提供する。本明細書で用いる場合、「コード配列」は、具体的なアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列のことをいう。
本発明は、調節配列を提供する。「調節配列」は、コード配列の上流（5'非コード配列）、コード配列内又はコード配列の下流（3'非コード配列）にあり、転写、ＲＮＡプロセシング若しくは安定性、又は関連するコード配列の翻訳に影響するヌクレオチド配列のことをいう。
本発明は、プロモーター配列を提供する。本明細書で用いる場合、「プロモーター」は、コード配列又は機能的ＲＮＡの発現を制御できるＤＮＡ配列のことをいう。プロモーター配列は、近位及びより遠位の上流エレメントからなり、後者のエレメントは、頻繁に、エンハンサーとよばれる。したがって、「エンハンサー」は、プロモーター活性を刺激できるＤＮＡ配列であり、プロモーターの先天的なエレメント又はプロモーターのレベル若しくは組織特異性を増進するために挿入された異種エレメントであってよい。プロモーターは、その全体が自然の遺伝子に由来するか、又は自然で見出される異なるプロモーターに由来する異なるエレメントで構成されるか、又は合成ＤＮＡセグメントを含むことさえできる。異なるプロモーターが異なる組織若しくは細胞型において、又は発達の異なる段階にて、又は異なる環境条件に応答して遺伝子の発現を方向付けし得ることが当業者により理解される。ほとんどの場合、調節配列の厳密な境界は完全に定義されていないので、いくらかの変動のあるＤＮＡ断片は、同一のプロモーター活性を有し得ることがさらに認識される。
いくつかの実施形態では、本発明は、植物プロモーターを提供する。本明細書で用いる場合、「植物プロモーター」は、その起源が植物細胞であるか否かに関わらず、植物細胞での転写を開始できるプロモーターであり、例えば、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍプロモーターが植物細胞において機能的であることが周知である。よって、植物プロモーターは、植物、植物ウイルス並びにＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ及びＢｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ細菌のような細菌から得られるプロモーターＤＮＡを含む。植物プロモーターは、構成性プロモーター又は非構成性プロモーターであり得る。
本発明は、３’非コード配列又は３’非翻訳領域を含む組換え遺伝子を提供する。本明細書で用いる場合、「３’非コード配列」又は「３’非翻訳領域」は、コード配列の下流にあるＤＮＡ配列のことをいい、ポリアデニル化認識配列及びｍＲＮＡプロセシング又は遺伝子発現に影響し得る調節シグナルをコードするその他の配列を含む。ポリアデニル化シグナルは、通常、ｍＲＮＡ前駆体の３’末端に一連のポリアデニル酸を付加することに影響することを特徴とする。異なる３’非コード配列の使用は、Ｉｎｇｅｌｂｒｅｃｈｔ，Ｉ．Ｌ．ら（１９８９）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ：６７１〜６８０に例示されている。
本発明は、ＲＮＡ転写産物を提供する。本明細書で用いる場合、「ＲＮＡ転写産物」は、ＤＮＡ配列のＲＮＡポリメラーゼが触媒する転写に起因する生成物のことをいう。ＲＮＡ転写産物がＤＮＡ配列の完璧に相補的なコピーである場合、これは、１次転写産物とよばれる。ＲＮＡ転写産物は、１次転写産物の転写後プロセシングに由来するＲＮＡ配列である場合、成熟ＲＮＡとよばれる。「メッセンジャーＲＮＡ（mRNA）」は、イントロンを有さず、細胞がタンパク質に翻訳できるＲＮＡのことをいう。「ｃＤＮＡ」は、ｍＲＮＡ鋳型と相補的であり、酵素逆転写酵素を用いてｍＲＮＡ鋳型から合成されるＤＮＡのことをいう。ｃＤＮＡは、１本鎖であり得るか、又はＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー断片を用いて２本鎖の形に変換できる。「センス」ＲＮＡは、ｍＲＮＡを含み、細胞内又はｉｎ ｖｉｔｒｏでタンパク質に翻訳できるＲＮＡ転写産物のことをいう。「アンチセンスＲＮＡ」は、標的１次転写産物又はｍＲＮＡの全体又は一部と相補的であり、標的遺伝子の発現を遮断するＲＮＡ転写産物のことをいう（米国特許第５，１０７，０６５号）。アンチセンスＲＮＡの相補性は、特定の遺伝子転写産物の任意の部分に対して、すなわち５’非コード配列、３’非コード配列、イントロン又はコード配列にあってよい。「機能的ＲＮＡ」は、アンチセンスＲＮＡ、リボザイムＲＮＡ、又は翻訳されないことがあるが細胞プロセスに対してなお影響するその他のＲＮＡのことをいう。「相補体」及び「逆相補体」との用語は、ｍＲＮＡ転写産物に関して本明細書において交換可能に用いられ、メッセージのアンチセンスＲＮＡを定義することを意味する。
本発明は、対象の遺伝子がプロモーター配列に作動可能に連結した組換え遺伝子を提供する。本明細書で用いる場合、「作動可能に連結した」との用語は、単一核酸断片上の核酸配列同士が、一方の機能が他方により調節されるように関連することをいう。例えば、プロモーターは、コード配列の発現を調節できる（すなわちコード配列が、プロモーターの転写制御下にある）場合、コード配列に作動可能に連結している。コード配列は、センス又はアンチセンスの向きで調節配列に作動可能に連結できる。別の例では、本発明の相補的ＲＮＡ領域は、直接的又は間接的に、標的ｍＲＮＡに対して５’、又は標的ｍＲＮＡに対して３’、又は標的ｍＲＮＡ内に作動可能に連結できるか、或いは第１相補領域が標的ｍＲＮＡに対して５’であり、その相補体が標的ｍＲＮＡに対して３’である。
本発明は、組換え発現カセット及び組換え構築物を提供する。本明細書で用いる場合、「組換え」との用語は、例えば化学合成による又は遺伝子工学技術によって核酸の単離セグメントの操作により、配列のそうでなければ分かれている２つのセグメントを人工的に組み合わせることをいう。本明細書で用いる場合、「組換え構築物」、「発現構築物」、「キメラ構築物」、「構築物」及び「組換えＤＮＡ構築物」との句は、本明細書において交換可能に用いられる。組換え構築物は、核酸断片、例えば自然では一緒に見出されない調節及びコード配列の人工的な組み合わせを含む。例えば、キメラ構築物は、異なる供給源に由来する調節配列及びコード配列、又は同じ供給源に由来するが、自然で見出されるものとは異なる様式で配置されている調節配列及びコード配列を含むことがある。このような構築物は、それ自体で用いることができるか、又はベクターとともに用いることができる。ベクターを用いるならば、ベクターの選択は、当業者に周知のように、宿主細胞を形質転換するために用いる方法に依存する。例えば、プラスミドベクターを用いることができる。当業者は、本発明の任意の単離核酸断片を含む宿主細胞をうまく形質転換、選択及び増殖させるためにベクター上に存在しなければならない遺伝子エレメントをよく認識している。当業者は、異なる独立した形質転換事象が、異なるレベル及びパターンの発現をもたらし（Jonesら、（1985）EMBO J. 4:2411-2418; De Almeidaら、（1989）Mol. Gen. Genetics 218:78-86）、よって所望の発現レベル及びパターンを示す系統を得るために、複数の事象をスクリーニングしなければならないことも認識している。このようなスクリーニングは、中でもＤＮＡのサザン解析、ｍＲＮＡ発現のノーザン解析、タンパク質発現のイムノブロッティング解析、又は表現型解析により達成できる。ベクターは、自己複製するか又は宿主細胞の染色体に組み込まれ得るプラスミド、ウイルス、バクテリオファージ、プロウイルス、ファージミド、トランスポゾン、人工染色体などであり得る。ベクターは、自己複製しないネイキッドＲＮＡポリヌクレオチド、ネイキッドＤＮＡポリヌクレオチド、同じ鎖内でＤＮＡ及びＲＮＡの両方で構成されるポリヌクレオチド、ポリリジンコンジュゲートＤＮＡ又はＲＮＡ、ペプチドコンジュゲートＤＮＡ又はＲＮＡ、リポソームコンジュゲートＤＮＡなどであることもできる。
なお別の実施形態では、本発明は、本発明のデュラムコムギ系統から得られるデュラムコムギ植物の再生可能な細胞の組織培養物であって、組織が、本発明により提供されるデュラムコムギ植物の全て又は実質的に全ての形態学的及び生理的特徴を有する植物を再生する組織培養物を提供する。あるそのような実施形態では、組織培養物は、葉、根、根端、根毛、葯、雌蕊、雄蕊、花粉、胚珠、花、種子、胚、茎、芽、子葉、胚軸、細胞及びプロトプラストからなる群から選択される植物の部分に由来する。別のそのような実施形態では、本発明は、上記の組織培養物から再生されたコムギ植物を含む。
本発明は、「ＤＨＡ１７５」と称するか若しくは「ＤＨＡ−１７５」に由来するデュラムコムギ生殖質又はその任意の子の細胞、細胞培養物、組織、組織培養物、種子、全植物及び植物の部分を提供する。
本発明は、「ＤＨＡ５５」と称するか若しくはＤＨＡ−５５に由来するデュラムコムギ生殖質又はその任意の子の細胞、細胞培養物、組織、組織培養物、種子、全植物及び植物の部分を提供する。例えばコムギ組織培養の方法について、（Altpeterら、1996; Smidanskyら、2002）を参照されたい。
コムギ
コムギは、Ｔｒｉｔｉｃｕｍの属に属する植物種である。コムギ種の非限定的な例は、Ｔ．ａｅｓｔｉｖｕｍ（食用コムギ又はパンコムギとしても知られる、6倍体）、Ｔ．ａｅｔｈｉｏｐｉｃｕｍ、Ｔ．ａｒａｒａｔｉｃｕｍ、Ｔ．ｂｏｅｏｔｉｃｕｍ、Ｔ．ｃａｒｔｈｌｉｃｕｍ、Ｔ．ｃｏｍｐａｃｔｕｍ、Ｔ．ｄｉｃｏｃｃｏｉｄｅｓ、Ｔ．ｄｉｃｏｃｃｕｍ（エマーコムギとしても知られる、4倍体）、Ｔ．ｄｕｒｕｍ（デュラムコムギとしても知られる、4倍体）、Ｔ．ｉｓｐａｈａｎｉｃｕｍ、Ｔ．ｋａｒａｍｙｓｃｈｅｖｉｉ、Ｔ．ｍａｃｈａ、Ｔ．ｍｉｌｉｔｉｎａｅ、Ｔ．ｍｏｎｏｃｏｃｃｕｍ（一粒コムギ、2倍体）、Ｔ．ｐｏｌｏｎｉｃｕｍ、Ｔ．ｓｐｅｌｔａ（スペルトとしても知られる、6倍体）、Ｔ．ｓｐｈａｅｒｏｃｏｃｃｕｍ、Ｔ．ｔｉｍｏｐｈｅｅｖｉｉ、Ｔ．ｔｕｒａｎｉｃｕｍ、Ｔ．ｔｕｒｇｉｄｕｍ、Ｔ．ｕｒａｒｔｕ、Ｔ．ｖａｖｉｌｏｖｉｉ、Ｔ．ｚｈｕｋｏｖｓｋｙｉ及びそれらの任意の雑種を含む。
いくつかのコムギ種は、２組の染色体を有する２倍体であるが、多くのものは、４組（4倍体）又は６組（6倍体）の染色体を有する安定な倍数体である。
一粒コムギ（T. monococcum）は、２倍体（AA、2組の7つの染色体、2n=14）である。ほとんどの４倍体コムギ（例えばエマー及びデュラムコムギ）は、野生エマー、Ｔ．ｄｉｃｏｃｃｏｉｄｅｓに由来する。野生エマーは、それ自体で、２種の２倍体野生イネ科植物、すなわちＴ．ｕｒａｒｔｕとＡｅｇｉｌｏｐｓ ｓｅａｒｓｉｉ又はＡｅｇｉｌｏｐｓ ｓｐｅｌｔｏｉｄｅｓのような野生のゴートグラスとの間の雑種形成の結果である。野生エマー（AABB）を形成した雑種形成は、栽培植物化よりずっと以前に野生で生じ、自然選択により駆動された（Hancock、James F.（2004）Plant Evolution and the Origin of Crop Species. CABI Publishing. ISBN 0-85199-685-X）。６倍体コムギ（AABBDD）は、農場で進化した。栽培植物化されたエマー又はデュラムコムギのいずれかを、なお別の野生２倍体イネ科植物（Aegilops tauschii）と雑種形成させて、６倍体コムギ、スペルトコムギ及びパンコムギが得られた。これらは、３組の対になった染色体を有する。
よって、６倍体コムギでは、ほとんどの遺伝子は、各ゲノム（すなわちAゲノム、Bゲノム又はDゲノム）から１組ずつの同祖の３重組として存在し、４倍体コムギでは、ほとんどの遺伝子は、各ゲノム（すなわちAゲノム又はBゲノム）から１組ずつの相同の２重組として存在する。ゲノムに沿って生じる無作為変異のために、異なるゲノムから単離された対立遺伝子は、必ずしも同一でない。
コムギ遺伝子のある種の対立遺伝子の存在は、作物表現型にとって重要である。いくつかの対立遺伝子は、参照対立遺伝子と等しいか又は実質的に等しい活性を有する機能的ポリペプチドをコードする。いくつかの対立遺伝子は、参照対立遺伝子と比較して活性が増加したポリペプチドをコードする。いくつかの対立遺伝子は、機能的ポリペプチドをコードしない破壊されたバージョンであるか、又は参照対立遺伝子と比較して活性が低下したポリペプチドだけをコードする。異なる対立遺伝子のそれぞれは、育種プログラムの具体的な目標に応じて利用できる。
コムギデンプン合成遺伝子
デンプンは、植物中の主要な保留炭水化物である。デンプンは、実際上全ての型の組織：葉、果実、根、シュート、茎、花粉及び種子に存在する。穀物の穀粒では、デンプンは、貯蔵エネルギーの主要な供給源である。穀物の穀粒中に含有されるデンプンの量は、種及び発達段階に応じて変動する。
２種のデンプン粒が、コムギ胚乳において見出される。コムギの大きい（A型）デンプン粒は、円盤状又はレンズ状の形状であり、１０〜３５μｍの平均直径であるが、小さい（B型）デンプン粒は、ほぼ球状又は多角形の形状であり、１〜１０μｍの範囲の直径である。
パンコムギ（Triticum aestivum L.）デンプンは、通常、ほぼ２５％のアミロースと７５％のアミロペクチンとからなる（Hannah及びJames、2008において概説されている）。アミロースは、α−１，４結合により連結された直鎖のグルコース分子である。アミロペクチンは、α−１，６分枝点を有してα−１，４結合により連結されたグルコース残基からなる。
デンプン合成は、デンプン合成酵素により触媒される。アミロース及びアミロペクチンは、共通の基質ＡＤＰ−グルコースを有する２つの経路により合成される。ＡＧＰアーゼは、植物におけるデンプン合成の最初のステップを触媒する。モチ様タンパク質顆粒結合型デンプン合成酵素Ｉ（GBSSI）は、アミロース合成を担うＷｘ遺伝子によりコードされる。デンプン合成酵素Ｉ（SSI又はSI）、ＩＩ（SSII又はSII）及びＩＩＩ（SSIII又はSIII）のような可溶性デンプン合成酵素、デンプン分枝酵素（例えばSBEI、SBEIIa及びSBEIIb）並びにイソアミラーゼ型及び限界デキストリナーゼ型（ISA及びLD）のデンプン脱分枝酵素は、アミロペクチン合成において重要な役割を演じると考えられている。
コムギのＳＳＩは、顆粒と可溶性画分との間で区画化されている（Liら、1999、Pengら、2001）。コムギＳＳＩＩは、主に顆粒に結合し、少量だけが可溶性画分中に存在する（Gao及びChibbar、2000）。ＳＳＩＩＩは、コムギ胚乳の可溶性画分でのみ見出される（Liら、2000）。
ＳＢＥは、２つの主要な群に分けることができる。Ｉ型ＳＢＥ（又はクラスB）は、トウモロコシ（Babaら、1991）、コムギ（Morellら、1997、Repellinら、1997、Bagaら、1999b）、ジャガイモ（Kossmanら、1991）、コメ（Kawasakiら、1993）及びキャッサバ（Salehuzzamanら、1992）からのＳＢＥＩと、エンドウ（Burtonら、1995）からのＳＢＥＩＩとを含む。他方の群であるＩＩ型ＳＢＥ（又はクラスA）は、トウモロコシ（Gaoら、1997）、コムギ（Nairら、1997）、ジャガイモ（Larssonら、1996）及びＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ（Fisherら、1996）からのＳＢＥＩＩと、コメ（Mizunoら、1993）からのＳＢＥＩＩＩと、エンドウ（Bhattacharyyaら、1990）からのＳＢＥＩとを含む。ＳＢＥＩ及びＳＢＥＩＩは、全般的に、免疫学的に無関係であるが、異なる触媒活性を有する。ＳＢＥＩは、長いグルカン鎖を移行し、基質としてアミロースを好むが、ＳＢＥＩＩは、主にアミロペクチンに対して作用する（Guan及びPreiss、1993）。ＳＢＥＩＩは、ＳＢＥＩＩａ及びＳＢＥＩＩｂにさらに細分類でき、これらのそれぞれは、触媒特性がわずかに異なる。２つの形態のＳＢＥＩＩは、異なる遺伝子によりコードされ、組織特異的様式で発現される（Gaoら、1997、Fisherら、1996）。特定組織でのＳＢＥＩＩａ及びＳＢＥＩＩｂの発現パターンは、植物種に特異的である。例えば、コメでの胚乳特異的ＳＢＥＩＩは、ＳＢＥＩＩａであるが（Yamanouchi及びNakamura、1992）、オオムギでのものはＳＢＥＩＩｂである（Sunら、1998）。
ＳＤＢＥは、アミラーゼ、デンプンホスホリラーゼ（EC 2.4.1.1）、不均化酵素（EC 2.4.1.25）のようなアルファ−１，４−標的化酵素、又は直接的脱分枝酵素（例えば限界デキストリナーゼ、EC 3.2.1.41又はイソアミラーゼ、EC 3.2.2.68）、間接的脱分枝酵素（例えばアルファ-1,4-及びアルファ-4,6-標的化酵素）のようなアルファ−１，６−標的化酵素のいずれかであり得る。
いくつかのデンプン生合成タンパク質は、デンプン粒の内部に結合しているのを見出すことができる。これらのタンパク質の部分集合は、デンプン粒タンパク質（SGP）とよばれている。パンコムギデンプン粒タンパク質（SGP）は、分子質量が全て＞８０ｋｄであるＳＧＰ−１、ＳＧＰ−２及びＳＧＰ−３と、モチ様タンパク質（GBSS）とを少なくとも含む。パンコムギのＳＧＰ−１画分は、ＳＧＰ−Ａ１、ＳＧＰ−Ｂ１及びＳＧＰ−Ｄ１に分割され、これらのタンパク質をコードする遺伝子は、同祖の第７群染色体に局在した（Yamamori及びEndo、1996）。野生型と比較してＳＧＰ−１ヌル系統では約８％のアミロースの増加が観察され、ＳＧＰ−１がアミロペクチン合成に関与することが推測される（Yamamoriら（2000）。ＳＧＰ−１ヌル系統は、変形したデンプン粒、全体的なデンプン含量の低下、アミロペクチン含量の変更、並びにＳＧＰ−２及びＳＧＰ−３とデンプン粒との結合の低減も示す。ＳＧＰ−１タンパク質は、デンプン合成酵素クラスＩＩ酵素であり、これらの酵素をコードする遺伝子は、ＳＳＩＩ−Ａ１、ＳＳＩＩ−Ｂ１及びＳＳＩＩ−Ｄ１とよばれる（Liら、1999）。
４倍体であるデュラムコムギ（Triticum turgidum L. var. durum）は、パンコムギのＤゲノムを欠くが、ＳＧＰ−１タンパク質をコードする遺伝子についての同質対立遺伝子は、Ａ及びＢゲノム上に存在する（Lafiandraら、2010）。Ｙａｍａｍｏｒｉ及びＥｎｄｏ（１９９６）からの６倍体 ＳＧＰ−Ａ１及びＳＧＰ−Ｂ１変異体を、デュラム栽培変種Ｓｖｅｖｏと交配させた。ＳＧＰ−Ａ１／Ｂ１ヌル後代は、Ｓｖｅｖｏ野生型コムギよりも２０％高いアミロース含量を示し、ＳＧＰ−２及びＳＧＰ−３とデンプン粒との結合が低減した。しかし、６倍体パンコムギと４倍体デュラムとの間のこれらの交雑種は、商業的に実現可能な製品とはみなされない。
デュラム×６倍体交雑種の後代は、親の選択とともに様々なＡ及びＢゲノム遺伝子座が組み込まれるために高度に変動性であり、このことは交雑種の成功率に大きく影響する（Lanningら、2008; Martinら、2011）。さらに、４倍体×６倍体コムギ交雑種からの系統の農業経済学的収率は、適応された遺伝子複合体がバラバラになるので、適応された親よりも低いことが期待される。６倍体×デュラム交雑種のこの短所は、当該技術において周知であり、本発明者らが知る限り、デュラムと６倍体コムギ品種との間の交雑種から、一般的に栽培されるデュラム品種は得られていない。よって、デュラムデンプン合成酵素ＩＩ遺伝子中の変異を特異的に選択することによる高アミロースデュラムコムギの作出は、デュラムコムギとの交配により６倍体コムギデンプン合成酵素ＩＩ変異を組み込むために好ましい。
ＳＧＰ−１変異は、その他の顆粒結合型酵素の相互作用を、デンプン粒中でのそれらの捕捉を低減することにより変更すると考えられる。同様に、オオムギＳＳＩＩａ ｓｅｘ６遺伝子座変異は、デンプン含量が低減し、アミロース含量が増加し（＋４５％）（2つのSGP-1変異体について70.3%に対して野生型25.4%）、デンプン粒が変形され、他のＳＧＰとの結合が減少した種子を有する（Morellら、2003）。これらのオオムギｓｓｌｌａ変異体は、可溶性タンパク質画分のウェスタンブロット分析に基づいてＳＳＩ、ＳＢＥＩＩａ及びＳＢＥＩＩｂの通常の発現を示し、このことは、デンプン合成遺伝子の全体的な下方制御がなかったことを証明した。パンコムギでのＳＧＰ−１ ３重変異体では、ＳＳＩ、ＳＢＥＩＩａ及びＳＢＥＩＩｂタンパク質は、発達中の種子で安定に発現されたが、これらはデンプン粒画分中に存在しない（Kosar-Hashemiら、2007）。ＳＳＩＩの喪失及びアミロースの増加と関係する同様の結果が、トウモロコシ（Zhangら、2004）及びエンドウ（Craigら、1998）で観察されている。
ＲＮＡ干渉によりデュラムコムギにおいてアミロペクチン合成についての別の重要な遺伝子ＳｂｅＩＩａを削除することにより、＋８％〜＋５０％（24%野生型に対して31〜75% SbeIIa RNAi系統）の範囲のアミロース増加がもたらされたが、タンパク質含量は、野生型と同様であったか、又はいくつかの場合では野生型よりも低かった（Sestiliら、2010b）。ｑＲＴ−ＰＣＲにより、ＳｂｅＩＩａのサイレンシングが、モチ様遺伝子、ＳＳＩＩＩ、限界デキストリナーゼ（Ldl）及びイソアミラーゼ−１（Iso1）の発現の上昇をもたらしたことが決定された。Ｓｅｓｔｉｌｉら（2010b）により彼らのトランスジェニック系統のいくつかで観察された非常に高いアミロースの結果は、ＳｂｅＩＩａ発現の低減のみによるものではない可能性がある。なぜなら、ＳｂｅＩＩａ突然変異誘発は、ＳＳＩＩａ変異のものにより類似するアミロースレベルの増加をもたらしたからである（28% sbeIIa 2重変異体に対して23%野生型）（Hazardら、2012）。現在までに、ＳＧＰ−１ヌルバックグラウンドにおけるデンプン合成遺伝子の詳細な発現プロファイルは、報告されていない。ＲＮＡ−Ｓｅｑは、転写産物レベルで遺伝子発現解析を可能にする次世代配列決定技術を採用する、台頭しつつある方法である。ＲＮＡ−Ｓｅｑは、再現性が高い単ヌクレオチド分解能をもたらし（Marioniら、2008）、その他の方法と比較してより大きい配列決定感度、大きいダイナミックレンジ、及び発現される遺伝子の異なる対立遺伝子間又はアイソフォーム間を区別する能力を有する。ＲＮＡ−Ｓｅｑは、よって、ヌルＳＧＰ−１遺伝子型がその他のデンプン合成遺伝子の発現に対して有する効果を決定するために用いるための理想的な方法である。
高アミロース含量を有する穀類は、より多くの難消化性デンプンを有するので、望ましい。難消化性デンプンは、ヒト及び動物の腸管における分解に対して耐え、よって、より食物繊維のようであるが、微生物発酵を促進するデンプンである（Nugent 2005において検討されている）。高レベルの難消化性デンプンを有する製品は、全体的な結腸の健康を増進し、食物消化中の糖の放出を減らすので、健康的であるとみなされる。８０％のアミロース含量を有するＳｂｅＩＩａ ＲＮＡｉサイレンシングパンコムギからの全種子食を与えたラットは、腸健康指数の改善と、微生物発酵の最終生成物である短鎖脂肪酸（SCFA）の増加を示した（Reginaら、2006）。同様に、ヌルｓｓＩＩａオオムギをヒトに与えた場合に、いくつかの腸健康指数の著しい改善と、ＳＣＦＡの増加があった（Birdら、2008）。ｓｓＩＩａヌルオオムギから作られる押出シリアルも、ヒトに与えた場合に、より低いグリセミック指数と、より低い血漿インスリン応答とをもたらした（Kingら、2008）。Ｙａｍａｍｏｒｉら（２０００）のＳＧＰ−１単一変異体をイタリアの育種系統と交配させ、戻し交配させ、次いで異種交配させて、３重ヌル系統を生成し、ここから全穀粒パンを準備した。乳酸を加えた得られたパンは、難消化性デンプンが増加し、グリセミック指数が低減したが、インスリンレベルには影響しなかった（Hallstromら、2011）。最近、高アミローストウモロコシが、過体重の男性でのインスリン感受性を変化させ、糖尿病の病態生理学的特徴であるインスリン抵抗性を有しにくくすることが示された（Makiら、2012）。
グリセミック指数に対するアミロースの増加の肯定的な影響に加えて、より高いアミロースは、デュラム製品の質の増進をもたらすことがある。調理したときにより硬いパスタは、加熱過多に耐えるので好ましく、高アミロースが麺硬さの増加をもたらすことが期待される。加熱過多に対する耐性は、パスタの硬さと正に相関する。現在の高アミロースコムギベースの食物は、高アミローストウモロコシデンプンを加えた、標準的アミロース含量コムギの小麦粉を用いて調製される（Thompson、2000）。デュラムの質に対する高アミロースの影響を試験するために、Ｓｏｈら（2006）は、デュラム小麦粉アミロース含量を、高アミローストウモロコシデンプン及びコムギグルテンを加えたデュラム小麦粉を再構成することにより変動させた。アミロース増加小麦粉は、力がより弱く、伸びにくい生地であったが、より硬いパスタが得られた。パスタは、世界的に人気がある食品アイテムであり、多数のその他の文化的に重要な食品でも用いられるデュラムセモリナから主に作られている。いくつかの実施形態では、本発明は、ＳＳＩＩａ中の変異の作出により高アミロースデュラム系統を開発し、デンプン合成に関与するその他の遺伝子の発現に与えるＳＧＰ−１ヌル遺伝子型の影響を、ＲＮＡ−Ｓｅｑを用いて調べる。これらの系統を、それらの最終生成物の質及び可能性のある健康上の利益について試験する。
アミロペクチンに対するアミロースの比は、Ｗｘ遺伝子座又はその他のデンプン合成酵素遺伝子座の代替の形態を選択することにより変化できる。３つ全てのＷｘ遺伝子座においてヌル対立遺伝子を有するパンコムギ（Nakamuraら、1995）及び両方のＷｘ遺伝子座においてヌル対立遺伝子を有するデュラムコムギ（Lafiandraら、2010及びVignauxら、2004）は、アミロースをほとんど含まない。他方、３つのＳＧＰ−１遺伝子座においてヌルであるパンコムギ系統は、示差走査熱量分析により測定して、野生型遺伝子型の２４．９％のアミロースと比較して３７．５％のアミロースを有した（Moritaら、2005）。両方のＳＧＰ−１遺伝子座についてヌル対立遺伝子を有するデュラムコムギ系統は、野生型遺伝子型についての２３．０％と比較して、４３．６％のアミロースを有した（Lafiandraら、2010）。Ｗｘ遺伝子座の一方だけにヌル対立遺伝子を有する遺伝子型（部分的モチ様）は、アミロース含量のわずかに小さい低減を示す。例えば、Ｍａｒｔｉｎら（２００４）は、Ｗｘ−Ｂ１について分離型の組換え近交系個体群において野生型とヌル対立遺伝子との間で２．４％のアミロースの差を示した。Ｖｉｇｎａｕｘら（２００４）は、部分的モチ様デュラム遺伝子型がアミロースを１％低減したことを示したが、差は有意でなかった。
高繊維及びアミロース小麦粉並びに得られる製品
欧州及び北米では、パスタは、１００％デュラム小麦粉を用いて伝統的に調製されている（Fuad及びPrabhasanker 2010）。実際に、デュラムコムギの小麦粉に固有の特性により、この小麦粉は、パスタ製造に理想的に適するものになる。なぜなら、比較的高いレベルの黄色色素による優れた色と、天然のグルテニンタンパク質に固有の良好な混合特性を与えるからである（Dexter及びMatson 1979; Fuad及びPrabhasanker 2010）。最近、繊維及びアミロース含量の増加を含む栄養特性が改善された小麦粉製品、並びにタンパク質含量が増加した小麦粉製品に向かう動きがある。
食物繊維が増加した小麦粉は、胃腸管のよりよい健康と、糖尿病及び心臓病のリスクの低下と関連する。アミロース含量が高い小麦粉も、消化中に吸収されず、よって食物繊維と同様の健康上の利益を生じる難消化性デンプンの含量がより高いので、望ましい。小麦粉のアミロース含量の増加は、デンプンの糊化及び糊付け（pasting）特性にも影響する。ラピッドビスコアナライザ（RVA）により測定したピーク粘度、最終粘度、ブレークダウン、セットバック及びピーク時間は全て、デュラムコムギについてアミロース含量を増加するとともに下がった（Lafiandraら、2010）。デンプン特性の変更は、硬さの増加及び調理し過ぎに対する耐性のような最終生成物特性の変化となる。
小麦粉製品の食物繊維、アミロース及び／又はタンパク質含量の増加は、エンドウ粉、穀類可溶性又は不溶性繊維のような様々なタンパク質又は食物繊維富化画分を組み込むことにより達成できる。これらのタイプの混合富化小麦粉ブレンドは、しかし、消費者承認の問題を導き得る。例えば、デュラムコムギにオオムギ粉をブレンドしてパスタ中の食物繊維を増やすことにより、色が濃い製品が導かれた（Casiraghiら、2013）。エンドウ粉を用いてパスタの栄養強化をすることにより、生地取り扱い特性が低下し、パスタの調理による損失が増加し、加熱過多に対する抵抗性がより低くなった（Nielsenら、1980）。デュラムコムギを改変してアミロース、タンパク質及び食物繊維を増やすことは、デュラム小麦粉添加剤にとって好ましい。なぜなら、このことにより、栄養が改善されるとともにデュラム小麦粉の多くの望ましい特性も保持したパスタを得ることができるからである。最終製品は、こうして、１００％デュラムパスタについての北米及び欧州での嗜好性に調和できる。パスタの調製で用いるアミロース、タンパク質及び食物繊維が増加したデュラムコムギの小麦粉は、外見がより濃く、調理したときの硬さが低減するので、消費者承認の低減を導く標準的な全穀粒デュラムパスタよりも好ましい可能性がある（Manthey及びSchorno 2002）。
食品用のアミロースがより高い小麦粉に対して最近興味が持たれている。主な理由は、高アミロースのデンプンは、難消化性デンプンの率がより高いからである。難消化性デンプンは、消化中に小腸で吸収されない画分である（Nugent 2005で検討されている）。難消化性デンプンは、食物繊維と同様の健康上の利益をもたらすと考えられる。商業的な高アミロース食品は、高アミローストウモロコシデンプンを用いて伝統的に開発されている（Thompson、2000）。高アミロースパンコムギ遺伝子型の開発により、最終生成物の質に対する高アミロースコムギデンプンの影響を試験することが可能になった。高アミロースコムギの小麦粉は、より固いテクスチャの生地をもたらし、より粘度が高く、通常の小麦粉よりも小さいパンのローフをもたらした（Moritaら、2002）。５０％までの高アミロースコムギの小麦粉を置換し、残りは通常コムギの小麦粉を用いることにより、１００％通常コムギの小麦粉対照と著しく異ならないパンの質が得られた（Hungら、2005）。アミロース含量が変動したデュラムコムギの小麦粉は、高アミローストウモロコシデンプンを用いてそれらを再構成することにより作製できる（Sohら、2006）。高アミロースデュラムコムギの小麦粉は、力がより弱く、伸びにくい生地であった。これらの小麦粉から製造したパスタは、アミロース含量の増加とともにより硬く、調理による損失がより多い傾向にあった。
小さい少しずつのアミロースの増加でさえ、最終生成物の質に影響を与えることができる。消費者は、硬く、加熱過多に対して抵抗性があるパスタを好む。アミロースの低下は、テクスチャがより軟らかい麺類をもたらす（Odaら1980; Miura及びTanii 1994; Zhaoら1998）。デュラム製品の質に対するアミロース含量の小さい増加の影響は、わかっていない。例えば、部分的モチ様小麦粉からのアジアの麺の質が注目されている。Ｗｘ遺伝子座の１つでの変異による部分的モチ様軟コムギ栽培変種は、より軟らかいテクスチャを麺に与えるので、うどん麺類用に好まれる（Odaら1980; Miura及びTanii 1994; Zhaoら1998）。部分的モチ様遺伝子型は、硬質コムギ組換え近交系個体群において、白い加塩麺の硬さについて野生型とは異ならなかった（Martinら、2004）。しかし、部分的モチ様遺伝子型は、より大きいローフ容量を与え、パンは、野生型からのものよりも軟らかいテクスチャであった。
モチ様デュラム同質遺伝子系統からは、より軟らかく、調理による損失がより多く、通常の系統からのパスタよりも加熱過多に対して耐性がより小さいパスタが得られた。しかし、部分的モチ様同質遺伝子系統からは、野生型系統から実質的に異ならない特性を有するパスタが得られた（Vignauxら、2005）。
本発明者らは、世界のデュラムコムギ生殖質を検分し、ＳＧＰ−Ａ１タンパク質を欠く２つの遺伝子型を同定した。これらの遺伝子型を、適応されたデュラム遺伝子型と交配させて、ＳＳＩＩａ−Ａｂヌル対立遺伝子について分離型の個体群を作出した。セモリナ特性及び最終生成物の質に対するＳＳＩＩ−Ａ１遺伝子座での対立遺伝子変動の影響を、試験製品として麺類を用いて調査した。
デュラムでの変異デンプン合成遺伝子の同定及び作出
１又は複数のデンプン合成遺伝子の１又は複数の変異体対立遺伝子を有するデュラムコムギを作出して同定できる。いくつかの実施形態では、このような変異体対立遺伝子は、進化の間に自然に生じる。いくつかの実施形態では、このような変異体対立遺伝子は、突然変異誘発（例えば化学的突然変異誘発、放射線照射突然変異誘発、トランスポゾン突然変異誘発、挿入突然変異誘発、符号タグ化突然変異誘発、部位特異的突然変異誘発及び天然突然変異誘発）、アンチセンス、ノックアウト及び／又はＲＮＡ干渉のような人工的な方法により作出される。
様々なタイプの突然変異誘発を用いて、タンパク質分子をコードするバリアント核酸を生成及び／若しくは単離、並びに／又はデンプン合成遺伝子のタンパク質をさらに改変／変異させることができる。これらは、限定されないが、部位特異的、無作為点突然変異誘発、相同組換え（DNAシャフリング）、ウラシル含有鋳型を用いる突然変異誘発、オリゴヌクレオチド指定突然変異誘発、ホスホロチオエート改変ＤＮＡ突然変異誘発、ギャップ２重鎖ＤＮＡを用いる突然変異誘発などを含む。さらなる適切な方法は、点ミスマッチ修復、修復欠損宿主株を用いる突然変異誘発、制限−選択及び制限−精製、欠失突然変異誘発、トータル遺伝子合成による突然変異誘発、２本鎖切断修復などを含む。例えばキメラ構築物が関与する突然変異誘発も本発明に含まれる。一実施形態では、突然変異誘発は、自然に存在する分子又は改変若しくは変異された自然に存在する分子の既知の情報、例えば配列、配列比較、物理的特性、結晶構造などにより手引きできる。作用物質、プロトコールのような植物での突然変異誘発のさらなる情報について、Ａｃｑｕａａｈら（Principles of plant genetics and breeding、Wiley-Blackwell、2007、ISBN 1405136464、9781405136464、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている）を参照されたい。ＲＮＡ干渉を用いて植物遺伝子を破壊する方法は、本明細書に後で記載する。
遺伝子機能は、ＲＮＡ干渉（RNAi）によっても妨害及び／又は変更できる。ＲＮＡｉは、動物及び植物における配列特異的転写後遺伝子サイレンシング又は転写遺伝子サイレンシングのプロセスであり、サイレンシングされる遺伝子と配列が相同な２本鎖ＲＮＡ（dsRNA）により開始される。本発明において有用な好ましいＲＮＡエフェクター分子は、本発明の方法のいずれを行った後でも機能が乱されないことを意図するいずれの宿主ポリヌクレオチド配列とも配列が十分に異ならなければならない。コンピュータアルゴリズムを用いて、ＲＮＡ分子ポリヌクレオチド配列と宿主の必須な通常配列との間の相同性の本質的な欠如を規定できる。
「ｄｓＲＮＡ」又は「ｄｓＲＮＡ分子」又は「２本鎖ＲＮＡエフェクター分子」との用語は、２本鎖立体構造中にある少なくとも約１９以上のヌクレオチドの領域を含有する少なくとも部分的に２本鎖のリボ核酸分子のことをいう。２本鎖ＲＮＡエフェクター分子は、２つの別々のＲＮＡ鎖から形成される２重鎖で２本鎖のＲＮＡであってよい、又は少なくとも部分的に２本鎖のヘアピン立体構造（すなわちヘアピンdsRNA又はステム-ループdsRNA）をとり得る自己相補性の領域を有する１本鎖ＲＮＡであってよい。様々な実施形態では、ｄｓＲＮＡは、完全にリボヌクレオチドからなるか、又はＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドのようなリボヌクレオチドとデオキシヌクレオチドとの混合物からなる。ｄｓＲＮＡは、分子のあるセグメント中のヌクレオチドが、分子の別のセグメント中のヌクレオチドと塩基対形成するように自己相補性の領域を有する単一分子であってよい。一態様では、自己相補性の領域は、分子の別の部分との相補性を欠き、よって１本鎖のままである（すなわち「ループ領域」）少なくとも約３〜４ヌクレオチド、又は約５、６、７、９〜１５ヌクレオチド以上の領域と連結される。このような分子は、任意選択により短い１本鎖５’及び／又は３’末端を有する部分的に２本鎖のステム−ループ構造をとる。一態様では、ヘアピンｄｓＲＮＡの自己相補性の領域又は２重鎖ｄｓＲＮＡの２本鎖領域は、エフェクター配列とエフェクター補体（例えばヘアピンdsRNA中で1本鎖ループ領域により連結された）とを含む。エフェクター配列又はエフェクター鎖は、ＲＩＳＣに取り込まれるか又はＲＩＳＣと関連する２本鎖領域又は２重鎖の鎖である。一態様では、２本鎖ＲＮＡエフェクター分子は、デンプン合成遺伝子の逆相補体である少なくとも１９の隣接ヌクレオチドエフェクター配列、好ましくは１９〜２９、１９〜２７又は１９〜２１ヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡエフェクター分子は、「ヘアピンｄｓＲＮＡ」、「ｄｓＲＮＡヘアピン」、「短いヘアピンＲＮＡ」又は「ｓｈＲＮＡ」、すなわちおよそ４００〜５００ヌクレオチド（nt）未満、又は１００〜２００ｎｔ未満のＲＮＡ分子であって、少なくとも１５〜１００ヌクレオチド（例えば17〜50 nt、19〜29 nt）の少なくとも１つのひと続きが同じＲＮＡ分子（1本鎖RNA）上にある相補配列と塩基対形成し、当該配列と相補配列とが、塩基相補性の２つの領域により作出されるステム構造の上方に１本鎖ループを形成する少なくとも約４〜７ヌクレオチド（又は約9〜約15 nt、約15〜約100 nt、約100〜約1000 nt）の対形成していない領域で分けられているＲＮＡ分子である。ｓｈＲＮＡ分子は、阻害される標的配列と相同かつ相補的な約１７〜約５００ｂｐ、約１７〜約５０ｂｐ、約４０〜約１００ｂｐ、約１８〜約４０ｂｐ又は約１９〜約２９ｂｐの２本鎖ステム領域と、塩基相補性の２つの領域により作出されるステム構造の上方に１本鎖ループを形成する少なくとも約４〜７ヌクレオチド又は約９〜約１５ヌクレオチド、約１５〜約１００ｎｔ、約２５０〜５００ｂｐ、約１００〜約１０００ｎｔの対形成していないループ領域とを含む少なくとも１つのステム−ループ構造を含む。しかし、「ループ領域」又は「ループ配列」を含むことは厳密に必要ではないことが認識される。なぜなら、逆相補体が直後に続く配列を含むＲＮＡ分子は、無関係の「スタッファー」配列により分けられていなくてもステム−ループ構造をとる傾向にあるからである。
１又は複数の２本鎖ＲＮＡエフェクター分子に転写され得るＤＮＡ配列を含む本発明の発現構築物は、コムギ植物に形質転換でき、ここで、形質転換された植物は、非形質転換植物とは異なるデンプン組成をもたらす。ｄｓＲＮＡエフェクター分子により阻害される標的配列は、限定されないが、脂肪酸合成遺伝子のコード領域、５’ＵＴＲ領域、３’ＵＴＲ領域を含む。
ＲＮＡｉの効果は、植物全体において浸透移行性及び遺伝性の両方であり得る。ＲＮＡｉは、原形質連絡により細胞間でｓｉＲＮＡを移入することにより伝播すると考えられる。遺伝性は、ＲＮＡｉが標的にするプロモーターのメチル化によるものである。新しいメチル化パターンは、細胞のそれぞれの新しい世代にコピーされる。植物と動物との間の大きい全般的な違いは、内因的に生成されるｍｉＲＮＡの標的化にある。植物では、ｍｉＲＮＡは、通常、それらの標的遺伝子と完璧又はほぼ完璧に相補的であり、ＲＩＳＣによる直接的ｍＲＮＡ切断を誘導するが、動物のｍｉＲＮＡは、配列がより多様である傾向があり、翻訳抑制を誘導する。植物でのＲＮＡｉについての詳細な方法は、全て参照によりそれらの全体が全ての目的のために本明細書に組み込まれているＤａｖｉｄ Ａｌｌｉｓら（Epigenetics、CSHL Press、2007、ISBN 0879697245、9780879697242）、Ｓｏｈａｉｌら（Gene silencing by RNA interference: technology and application、CRC Press、2005、ISBN 0849321417、9780849321412）、Ｅｎｇｅｌｋｅら（RAN Interference、Academic Press、2005、ISBN 0121827976、9780121827977）及びＤｏｒａｎら（RNA Interference: Methods for Plants and Animals、CABI、2009、ISBN 1845934105、9781845934101）に記載されている。
いくつかの実施形態では、デュラムコムギ中の変異デンプン合成遺伝子は、デュラムコムギ個体群を１又は複数の表現型に基づいてスクリーニングすることにより同定できる。いくつかの実施形態では、表現型は、小麦粉膨潤度の変化である。
いくつかの実施形態では、デュラムコムギ中の変異デンプン合成遺伝子は、デュラムコムギ個体群をデュラムコムギ中の１又は複数のデンプン合成遺伝子のＰＣＴ増幅及び配列決定に基づいてスクリーニングすることにより同定できる。
いくつかの実施形態では、デュラムコムギ中の変異デンプン合成遺伝子は、ＴＩＬＬＩＮＧ（登録商標）により同定できる。ＴＩＬＬＩＮＧ（登録商標）での方法及び組成物についての詳細な記載は、それぞれが参照により全ての目的のために本明細書に組み込まれているＵＳ５９９４０７５、ＵＳ２００４／００５３２３６Ａ１、ＷＯ２００５／０５５７０４及びＷＯ２００５／０４８６９２で見出すことができる。
ＴＩＬＬＩＮＧ（登録商標）（標的化により誘導されるゲノム中の局所的損傷（Targeting Induced Local Lesions in Genomes））は、特定の遺伝子中の変異の指定された同定を可能にする分子生物学における方法である。ＴＩＬＬＩＮＧ（登録商標）は、モデル植物Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａを用いて２０００年に導入された。ＴＩＬＬＩＮＧ（登録商標）は、それ以来、ゼブラフィッシュ、トウモロコシ、コムギ、コメ、ダイズ、トマト及びレタスのようなその他の生物での逆遺伝学的方法として用いられている。この方法は、化学的変異原（例えばエチルメタンスルホン酸（EMS））を用いる標準的で効率的な突然変異誘発の技術と、標的遺伝子中の単一塩基変異（点変異ともよばれる）を同定する高感度のＤＮＡスクリーニング技術とを組み合わせたものである。ＥｃｏＴＩＬＬＩＮＧは、通常は集団遺伝学解析のために、個体の自然変異を探すためにＴＩＬＬＩＮＧ（登録商標）技術を用いる方法である。それぞれが参照により全ての目的のために本明細書に組み込まれているＣｏｍａｉら、２００３、Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ ｉｎ ｎａｔｕｒａｌ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｂｙ ＥｃｏＴＩＬＬＩＮＧ、Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ ３７、７７８〜７８６．Ｇｉｌｃｈｒｉｓｔら２００６．Ｕｓｅ ｏｆ ＥｃｏＴＩＬＬＩＮＧ ａｓ ａｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ＳＮＰ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｔｏｏｌ ｔｏ ｓｕｒｖｅｙ ｇｅｎｅｔｉｃ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｉｎ ｗｉｌｄ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｐｏｐｕｌｕｓ ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ．Ｍｏｌ．Ｅｃｏｌ．１５、１３６７〜１３７８．Ｍｅｊｌｈｅｄｅら２００６．ＥｃｏＴＩＬＬＩＮＧ ｆｏｒ ｔｈｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａｌｌｅｌｉｃ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｗｉｔｈｉｎ ｔｈｅ ｐｏｗｄｅｒｙ ｍｉｌｄｅｗ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｇｅｎｅｓ ｍｌｏ ａｎｄ Ｍｌａ ｏｆ ｂａｒｌｅｙ．Ｐｌａｎｔ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ １２５、４６１〜４６７．Ｎｉｅｔｏら２００７、ＥｃｏＴＩＬＬＩＮＧ ｆｏｒ ｔｈｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａｌｌｅｌｉｃ ｖａｒｉａｎｔｓ ｏｆ ｍｅｌｏｎ ｅＩＦ４Ｅ，ａ ｆａｃｔｏｒ ｔｈａｔ ｃｏｎｔｒｏｌｓ ｖｉｒｕｓ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ．ＢＭＣ Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ ７、３４〜４２を参照されたい。ＤＥｃｏＴＩＬＬＩＮＧは、安価な方法を用いて断片を同定するＴＩＬＬＩＮＧ（登録商標）及びＥｃｏＴＩＬＬＩＮＧの変形である（Garvinら、2007、DEco-TILLING: An inexpensive method for SNP discovery that reduces ascertainment bias. Molecular Ecology Notes 7、735-746）。
本発明は、デンプン合成遺伝子の変異体も包含する。いくつかの実施形態では、デンプン合成遺伝子は、ＧＢＳＳ、モチ様タンパク質、ＳＢＥＩ及びＩＩ、デンプン脱分枝酵素並びにＳＳＩ、ＳＳＩＩ，ＳＳＩＩＩ及びＳＳＩＶをコードする遺伝子からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、デンプン合成遺伝子は、ＳＳＩＩである。変異体は、構成タンパク質のアミノ酸配列中の変更を含んでよい。ポリペプチドに関しての「変異体」との用語は、参照配列に関して１又は複数のアミノ酸により変更されたアミノ酸配列のことをいう。変異体は、「保存」変化又は「非保存」変化を有することができ、例えば似通っているわずかな変動は、アミノ酸欠失若しくは挿入又はその両方も含むことができる。
デンプン合成遺伝子中の変異は、デンプン合成遺伝子のコード領域又は非コード領域中にあり得る。変異は、コードされるデンプン合成遺伝子中のアミノ酸の変化を導くことができるか又は導かなくてよい。いくつかの実施形態では、変異は、ミスセンス、重度のミスセンス、サイレント、ナンセンス変異であり得る。例えば、変異は、ヌクレオチド置換、挿入、欠失又はゲノム再構成であり得、これらは次いで、リーディングフレームシフト、アミノ酸置換、挿入、欠失及び／又はポリペプチド短縮を導いてよい。その結果、変異デンプン合成遺伝子は、参照対立遺伝子によりコードされるポリペプチドと比較して活性が改変されたデンプン合成ポリペプチドをコードする。
本明細書で用いる場合、ナンセンス変異は、転写されたｍＲＮＡ内で未熟な停止コドン又はナンセンスコドンと、短縮され、不完全で通常非機能的なタンパク質生成物をもたらすＤＮＡの配列中の点変異、例えば１ヌクレオチド多型（SNP）である。ミスセンス変異（非同義変異の1種）は、単一ヌクレオチドが変化して、異なるアミノ酸をコードするコドンをもたらす点変異である（アミノ酸を停止コドンに変化させる変異は、ミスセンス変異ではなくナンセンス変異とみなされる）。このことにより、得られるタンパク質は非機能的になり得る。サイレント変異は、タンパク質のアミノ酸配列の変化をもたらさないＤＮＡ変異である。これらは、非コード領域（遺伝子の外側又はイントロン内）中で生じることがあるか、又は最終的なアミノ酸配列を変更しない様式でエキソン内で生じることがある。重度のミスセンス変異はアミノ酸を変化させ、このことは、立体構造、電荷状態などの劇的な変化を導く。
変異は、デンプン合成遺伝子の任意の部分、例えばデンプン合成遺伝子の５’、中間、又は３’にあって、コードされるデンプン合成タンパク質の任意の一服の変異をもたらすことができる。
本発明の変異体デンプン合成タンパク質は、参照対立遺伝子若しくは生物活性バリアント又はそれらの断片に１又は複数の改変を有することができる。特に適切な改変は、アミノ酸置換、挿入、欠失又は短縮を含む。いくつかの実施形態では、タンパク質中の少なくとも１つの非保存アミノ酸置換、挿入又は欠失を作製して、タンパク質活性を破壊又は改変する。置換は、分子中の１つのアミノ酸だけが置換される単一であってよい、又は２つ以上のアミノ酸が同じ分子中で置換される多重であってよい。挿入変異体は、参照タンパク質分子、生物活性バリアント又はそれらの断片中の特定の位置のアミノ酸のすぐ隣に挿入された１又は複数のアミノ酸を有するものである。挿入は、１又は複数のアミノ酸であり得る。挿入は、例えば１つ又は２つの保存アミノ酸からなることができる。挿入部位の隣のアミノ酸と電荷及び／又は構造が類似するアミノ酸は、保存的と定義される。代わりに、変異体デンプン合成タンパク質は、挿入部位の隣のアミノ酸と実質的に異なる電荷及び／又は構造を有するアミノ酸の挿入を含む。いくつかの他の実施形態では、変異体デンプン合成タンパク質は、参照タンパク質と比較して１又は複数のドメインを喪失した短縮タンパク質である。
いくつかの例では、変異体は、少なくとも１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０又は１００アミノ酸の変化を有することができる。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸変化は、保存置換である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸変化は、非保存置換である。いくつかの実施形態では、変異体タンパク質は、野生型対立遺伝子と比較して酵素活性が改変している。いくつかの実施形態では、変異体タンパク質は、野生型対立遺伝子と比較して、酵素活性が減少又は増加している。いくつかの実施形態では、野生型対立遺伝子と比較して減少又は増加した酵素活性は、デュラムコムギでのアミロース含量の変化を導く。
保存アミノ酸置換は、作製した場合に、元のタンパク質の特性に対する干渉が最小である、すなわちタンパク質の構造と特に機能が、このような置換により保存され、著しく変化しない置換である。保存置換は、（ａ）置換の領域中のポリペプチド主鎖の例えばシート又はらせん立体構造としての構造、（ｂ）標的部位での分子の電荷又は疎水性、或いは（ｃ）側鎖の嵩高さを一般的に維持する。保存置換に関するさらなる情報は、例えばＢｅｎ Ｂａｓｓａｔら（J. Bacteriol.、169:751-757、1987）、Ｏ’Ｒｅｇａｎら（Gene、77:237-251、1989）、Ｓａｈｉｎ−Ｔｏｔｈら（Protein Sci.、3:240-247、1994）、Ｈｏｃｈｕｌｉら（Bio/Technology、6: 1321-1325、1988）並びに遺伝学及び分子生物学の広く用いられている参考書で見出すことができる。Ｂｌｏｓｕｍ行列は、ポリペプチド配列の関連度を決定するために一般的に用いられる。Ｂｌｏｓｕｍ行列は、信頼されるアラインメントの大きいデータベース（BLOCKSデータベース）を用いて作出され、ここでは、いくらかの閾値パーセンテージ同一性未満であることにより関連する対になった配列アラインメントが計数される（Henikoffら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、89: 10915-10919、1992）。９０％同一性の閾値を、ＢＬＯＳＵＭ９０行列の高度に保存された標的頻度について用いた。６５％同一性の閾値を、ＢＬＯＳＵＭ６５行列について用いた。Ｂｌｏｓｕｍ行列中のゼロ以上のスコアは、選択したパーセンテージ同一性にて「保存置換」とみなす。以下の表は、例示的な保存アミノ酸置換を示す。
Figure 2015532124
いくつかの実施形態では、変異体デュラムコムギは、デュラムコムギの「Ａ」型ゲノム又はデュラムコムギの「Ｂ」型ゲノムのような１つの共有先祖に追跡して戻ることができる同じゲノムのデンプン合成遺伝子と関連する変異を含む。例えば、変異ＳＳＩＩａ−Ａ又は変異ＳＳＩＩａ−Ｂを有する変異体デュラムコムギが含まれる。いくつかの実施形態では、所定の型のゲノム内のデンプン合成遺伝子の一方又は両方の対立遺伝子が変異される。
いくつかの実施形態では、変異体デュラムコムギは、デュラムコムギの「Ａ」型ゲノム及びデュラムコムギの「Ｂ」型ゲノムのような２つの共有先祖に追跡して戻ることができる異なるゲノムの同じデンプン合成遺伝子と関連する変異を含む。例えば、変異ＳＳＩＩａ−Ａ及び変異ＳＳＩＩａ−Ｂを有する変異体デュラムコムギが含まれる。いくつかの実施形態では、２つの型のゲノム内のデンプン合成遺伝子の一方又は両方の対立遺伝子が変異される。
デュラム表現型を改変する方法
本発明は、デュラム表現型を改変／変更／改善する方法をさらに提供する。本明細書で用いる場合、「改変する」又は「変更する」との用語は、参照品種と比較した表現型の任意の変化、例えばデンプン特性と関連する変化のことをいう。「改善する」との用語は、工業的又は栄養的な用途のために１又は複数の質がよりよいデュラムコムギを作製する任意の変化のことをいう。このような改善は、限定されないが、粗びき粉としての質の改善、広範囲の最終生成物を製造するための原材料としての質の改善を含む。
いくつかの実施形態では、改変／変更／改善された表現型は、デンプンに関係する。デンプンは、ヒトの食餌において最も一般的な炭水化物であり、多くの食物に含まれている。世界的なデンプン摂取の主な供給源は、穀類（コメ、コムギ及びトウモロコシ）及び根菜（ジャガイモ及びキャッサバ）である。デンプンを含む広く用いられている調理済み食品は、パン、パンケーキ、シリアル、麺類、パスタ、ポリッジ及びトルティーヤである。デンプン工業は、湿式粉砕、洗浄、ふるい分け及び乾燥により、種子、根及び塊茎からデンプンを抽出及び精製する。今日では、主な商業的な精製デンプンは、トウモロコシデンプン、タピオカ、コムギ及びジャガイモデンプンである。
デンプンは、酸、様々な酵素又はこれら２つの組み合わせにより、より単純な炭水化物に加水分解できる。得られる断片は、デキストリンとして知られる。変換の程度はブドウ糖等量（DE）により典型的に定量され、これは大まかに切断されたデンプン中のグリコシド結合の率である。
いくつかのデンプン糖は、圧倒的に最も一般的なデンプンベースの食品材料であり、多くの飲料及び食品中で甘味剤として用いられている。これらは、限定されないが、マルトデキストリン、様々なグルコースシロップ、ブドウ糖、高果糖シロップ及び糖アルコールを含む。
加工デンプンは、高熱、高せん断力、低ｐＨ、凍結／融解及び冷却のような加工又は貯蔵中に頻繁に遭遇する条件下でデンプンが正しく機能することを可能にするように化学的に改変されたデンプンである。技術的用途のための典型的な加工デンプンは、カチオンデンプン、ヒドロキシエチルデンプン及びカルボキシメチル化デンプンである。
食品加工のための添加剤として、食品用デンプンは、プリン、カスタード、スープ、ソース、グレイビー、パイの中味及びサラダドレッシングのような食品中の増粘剤及び安定化剤として、そして麺類及びパスタを作製するために典型的に用いられる。
製薬業界では、デンプンは、補形剤として、錠剤崩壊剤として又は結合剤としても用いられる。
デンプンは、製紙、段ボール接着剤、衣類の糊、建設業界、製本のための様々な接着剤又は糊の製造、壁紙接着剤、紙袋製造、チューブ巻取り、粘着紙、封筒接着剤、木工用ボンド及び瓶のラベル付けのような工業的用途のためにも用いることができる。黄色デキストリンのようなデンプン誘導体は、いくらかの化学物質の添加により改変して、紙の作業のための固い糊を形成できる。これらの形態のいくつかは、ホウ砂又はソーダ灰を用い、これらをデンプン溶液と５０〜７０℃にて混合して、非常に良好な接着剤を作出する。
デンプンは、いくつかのピーナツ状梱包材及びいくつかのつり天井タイルを作るためにも用いられる。デンプンからの織物用化学物質は、織りの最中の紡ぎ糸の切れを低減するためにも用いられる。縦糸に糊付けする。デンプンは、主に、綿ベースの紡ぎ糸に糊付けするために用いられる。加工デンプンも、織物用捺染糊剤として用いられる。印刷業界では、食品グレードデンプンが、湿ったインクが裏移りすることを回避するために印刷済みの紙を分けるための裏移り防止スプレー粉末の製造において用いられる。デンプンは、様々なバイオプラスチック、生分解性である合成ポリマーを製造するために用いられる。ある例は、ポリ乳酸である。ボディーパウダーのために、粉末状デンプンを、タルク粉末のための基材として用い、その他の健康及び美容の製品においても同様に用いる。石油探査において、デンプンは、ドリルの頭部を潤滑にし、石油抽出物中に粉砕残渣を懸濁するために用いる掘削流体の粘度を調整するために用いられる。デンプンからのグルコースは、いわゆる湿式粉砕プロセスを用いてバイオ燃料トウモロコシエタノールまでさらに発酵させることができる。今日では、ほとんどのバイオエタノール製造工場は、乾式粉砕プロセスを用いて、トウモロコシ又はその他の供給原料を直接エタノールに発酵させる。水素製造は、酵素を用いて、原材料としてデンプンを用いることができる。
難消化性デンプンは、健常個体の小腸における消化を逃れるデンプンである。トウモロコシからの高アミロースデンプンは、他のタイプのデンプンよりも高い糊化温度を有し、ベーキング、穏やかな押し出し及びその他の食品加工技術中に難消化性デンプン含量を保持する。これは、パン、パスタ、クッキー、クラッカー、プレッツェル及びその他の低含水食品のような加工食品中の不溶性食物繊維として用いられる。これは、その健康上の利益のために、食品サプリメントとしても利用される。発表された研究は、２型耐性トウモロコシが、インスリン感受性の改善を助け、満腹感を増し、結腸機能のマーカーを改善することを示している。難消化性デンプンが、手をつけていない全穀粒の健康上の利益に貢献することが示唆されている。
難消化性デンプンは、本発明のデュラムコムギ植物から生成できる。難消化性デンプンは、以下の特徴の１又は複数を有することができる。
・繊維強化：難消化性デンプンは、良好又は優れた繊維供給源である。米国農務省及びその他の国での健康機関は、食物繊維の良好又は優れた供給源を何が構成するかについての基準を設定している。
・低カロリーへの貢献：このデンプンは、約１０ｋｃａｌ／ｇ、５ｋｃａｌ／ｇ、１ｋｃａｌ／ｇ又は０．５ｋｃａｌ／ｇ未満を有することができ、これは、典型的なデンプンと比べて約９０％のカロリー低減をもたらす。
・低い血糖／インスリン応答
・良好な小麦粉代替物、なぜならこれは、（１）最小限の処方の変化を必要として又は変化を必要とせずに処方中に容易に組み込まれ、（２）コムギベースの製品に自然に適合し、（３）老化及び劣化を低減する能力があるからである。劣化は、パン及びその他の食品においておいしさを低減する化学的及び物理的プロセスである。
・低水結合能：このデンプンは、その他のタイプの難消化性デンプンを含むほとんどのその他の繊維供給源よりも低い水保持能を有する。これは、サクサクした感触を目標とするために理想的である、処方中の水を低減し、微生物活性及び老化に関して有効期限を改善する。
・加工抵抗性：このデンプンは、押し出し、圧力調理などのようなエネルギー集約型手順に対して安定性がある。
・官能特性：例えばスムーズでざらつきがないテクスチャ、白色、「見えない」繊維源、そして自然な風味。
よって、本発明のデュラムコムギから製造される小麦粉又はデンプンは、パンコムギの小麦粉又はデンプンを置き換えて、コムギパン、マフィン、バン、パスタ、麺類、トルティーヤ、ピザ生地、朝食用シリアル、クッキー、ワッフル、ベーグル、ビスケット、スナック食品、ブラウニー、プレッツェル、ロール、ケーキ及びクラッカーを製造するために用いることができ、これらの食品は、１又は複数の所望の特徴を有することができる。
いくつかの実施形態では、変異体デュラムコムギは、同じ種の野生型デュラムコムギと比較して、限定されないが、糊化温度の改変（例えばアミロペクチン糊化ピークの改変及び/又はエンタルピーの改変）、アミロース含量の改変、難消化性アミロース含量の改変、デンプンの質の改変、小麦粉膨潤度の改変、タンパク質含量の改変（例えばより高いタンパク質含量）、仁重量の改変、仁固さの改変及びセモリナ収率の改変を含む、１又は複数の表現型を有する。
いくつかの実施形態では、これらの方法は、アミロペクチン糊化ピークの改変及び／又はエンタルピーの改変のようなデュラムコムギの糊化温度の改変に関係する。糊化温度の改変は、デンプンベースの製品を調理するために必要な温度の変更をもたらす。異なる程度のデンプン糊化は、難消化性デンプンのレベルに影響する。例えば、図５の吸熱ピークＩ及びＩＩは、それぞれ脂肪／アミロース複合体の分解された糊化及び融解による。いくつかの実施形態では、本発明のデュラムコムギのアミロペクチン糊化プロファイルは、野生型デュラムコムギのような参照デュラムコムギと比較して変化する。いくつかの実施形態では、本発明のデュラムコムギのアミロペクチン糊化温度は、野生型対照のものより著しく低い。例えば、本発明のデュラムコムギのアミロペクチン糊化温度は、同じ加熱速度の下で、示差走査熱量分析（DSC）サーモグラム上のピーク高さに基づいて、約１℃、２℃、３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃、１０℃、１５℃、２０℃、２５℃以上、野生型対照よりも低い。糊化が低減したデンプンは、アミロースが増加し、グリセミック指数が低減したデンプンと関連する。これらは、調理して冷めたパスタにおけるような老化の際のより硬いデンプンベースゲルとも関連する。
いくつかの実施形態では、本発明のデュラムコムギデンプンのエンタルピーの変化は、野生型対照のものと比較して劇的により小さい。例えば、ＤＳＣサーモグラムにより測定して、本発明のデュラムコムギデンプンにおける熱流量移行は、野生型対照の約１／２、１／３又は１／４だけである。
デンプン糊化は、水及び熱の存在下でのデンプン分子の分子間結合を切るプロセスであり、水素結合部位（ヒドロキシ水素及び酸素）がより多くの水と会合することを可能にする。この不可逆性は、デンプン粒を溶解する。水の浸透は、全般的なデンプン粒構造における無作為さを増加させ、結晶領域の数及びサイズを減少させる。結晶領域は、水を浸入させない。熱によりこのような領域は拡散するようになり、鎖が非晶質形に分かれ始める。偏光顕微鏡の下で、デンプンは、その複屈折及びその減衰断面を失う。このプロセスは、ルーソースを作る調理において用いられる。デンプンの糊化温度は、植物のタイプ及び存在する水、ｐＨ、配合表中の塩、糖、脂質及びタンパク質のタイプ及び濃度、並びに用いる誘導体化技術に依存する。糊化温度は、アミロペクチンの架橋の程度に依存し、デンプン合成酵素遺伝子の遺伝子操作により改変できる。
一実施形態では、方法は、難消化性アミロース含量のようなデュラムコムギのアミロース含量を改変することに関する。難消化性アミロース含量が増加した小麦粉は、加熱過多に対する耐性がより大きく、グリセミック指数が低減され、食物繊維及び難消化性デンプンが増加したより硬いパスタを作るために用いることができる。いくつかの実施形態では、本発明のデュラムコムギ及び当該コムギから製造される製品のアミロース含量及び／又は難消化性アミロース含量は、野生型デュラムコムギのものと比較して約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７９％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、１０００％以上改変（例えば増加）されている。
いくつかの実施形態では、本発明のデュラムコムギ及び当該コムギから製造される製品のアミロース含量及び／又は難消化性アミロース含量は、約２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７９％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％である。よって、本明細書に記載する例示的方法により分析される野生型デュラムコムギは、例えば約５３％アミロースを含んで、３８％のアミロース含量より著しく多いことが見出された本発明の高アミロースデュラムコムギと比較して、約３８％のアミロース含量を有することが見出された。
いくつかの実施形態では、方法は、デュラムコムギのデンプンの質を改変することに関する。
いくつかの実施形態では、方法は、デュラムコムギの小麦粉膨潤度（FSP）を改変することに関する。ＦＳＰの低減は、麺類の重量を低減し、硬さを増加させるはずである。いくつかの実施形態では、Ｍｕｋａｓａら（Comparison of flour swelling power and water-soluble protein content between self-pollinating and cross-pollinating buckwheat, Fagopyrum 22:45-50（2005）に記載される方法に基づいて、本発明のデュラムコムギのＦＳＰは、野生型デュラムコムギのものと比較して約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７９％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、１０００％以上改変（例えば減少）される。小麦粉膨潤度は、麺硬さと負に相関することがあるが、調理重量と正に相関して、ＦＳＰが下がった麺類は、より硬いが重くないことを意味し得る。
いくつかの実施形態では、本発明のデュラムコムギ及び当該コムギから製造される製品のＦＳＰは、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２，７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．８、７．９、８．０、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、９．０、９．１、９．２、９．３、９．４、９．５、９．６、９．７、９．８、９．９又は１０．０（g/g）である。よって、本明細書に記載する例示的方法により分析される野生型デュラムコムギは、例えば約５．８ＦＳＰを含んで、８．４ＦＳＰより著しく少ないことが見出された本発明の高アミロースデュラムコムギと比較して、約８．４のＦＳＰを有することが見出された。
いくつかの実施形態では、方法は、デュラムコムギのアミロペクチン含量を改変することに関する。アミロース及びアミロペクチンは相互に関係するので、アミロペクチンの減少は、アミロースの増加と同じ利益である。アミロースの減少（及び/又はアミロペクチンの増加）は、ＦＳＰの増加、老化の低減並びにより軟らかいベーキングされた製品及び麺類と関連する。アミロペクチンの増加は、劣化速度の低減とも関連する。いくつかの実施形態では、本発明のデュラムコムギのアミロペクチン含量は、野生型デュラムコムギのものと比較して、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７９％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、１０００％以上改変（例えば減少）される。
いくつかの実施形態では、本発明のデュラムコムギ及び当該コムギから製造される製品のアミロペクチン含量は、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７９％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％である。
いくつかの実施形態では、方法は、デュラムコムギのタンパク質含量を改変することに関する。いくつかの実施形態では、本発明のデュラムコムギ及び当該デュラムコムギから製造される製品のタンパク質含量は、野生型デュラムコムギのものと比較して、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７９％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、１０００％以上改変（例えば増加）される。
いくつかの実施形態では、本発明のデュラムコムギ及び当該コムギから製造される製品のタンパク質含量は、約１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７９％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％である。
よって、本明細書に記載する例示的方法により分析される野生型デュラムコムギ製品は、例えば約２２．８％のタンパク質を含んで、１６．８％のタンパク質含量より著しく多いことが見出された本発明の高アミロースデュラムコムギ製品と比較して、約１６．８％のタンパク質含量を有することが見出された。タンパク質含量の増加は、より大きい栄養価（グリセミック指数の低減）と、より大きい機能性とを意味する。パスタの質に関して、タンパク質含量の増加は、ＦＳＰの低減とパスタ硬さの増加とに関連する。
いくつかの実施形態では、方法は、デュラムコムギ穀粒中の食物繊維含量を改変することに関する。いくつかの実施形態では、本発明のデュラムコムギ穀粒及び当該デュラムコムギから製造される製品中の食物繊維含量は、野生型デュラムコムギのものと比較して約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７９％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、１０００％以上改変（例えば増加）される。
いくつかの実施形態では、本発明のデュラムコムギ及び当該コムギから製造される製品の食物含量は、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７９％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％である。
よって、本明細書に記載する例示的方法により分析される野生型デュラムコムギ製品は、約８．６％の食物繊維を含んで、３％の食物繊維より著しく多いことが見出された本発明の高アミロースデュラムコムギ製品と比較して、約３％の食物繊維含量を有することが見出された。
食物繊維が増加した穀粒から作られた製品を消費することの利点は、限定されないが、繊維の発酵中に健康によい成分、及びより嵩高く軟らかい便が生じることと、消化管の中の移行時間が短くなることを含む。
いくつかの実施形態では、方法は、デュラムコムギ穀粒中の脂質含量を改変することに関する。いくつかの実施形態では、本発明のデュラムコムギ穀粒中の脂質含量は、野生型デュラムコムギのものと比較して、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７９％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、１０００％以上改変（例えば増加）される。
いくつかの実施形態では、本発明のデュラムコムギ及び当該コムギから製造される製品の脂質含量は、約０％、．１％、．２％、．３％、．４％、．５％、．６％、．７％、．８％、．９％、１％、１．２％、１．３％、１．４％、１．５％、１．６％、１．７％、１．８％、１．９％、２％、２．２％、２．３％、２．４％、２．５％、２．６％、２．７％、２．８％、２．９％、３％、３．１％、３．２％、３．３％、３．４％、３．５％、３．６％、３．７％、３．８％、３．９％、４％、４．１％、４．２％、４．３％、４．４％、４．５％、４．６％、４．７％、４．８％、４．９％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、又は４０％である。
よって、本明細書に記載する例示的方法により分析される野生型デュラムコムギ製品は、例えば約３．５％の脂質を含んで、１．９％の脂質含量より著しく多いことが見出された本発明の高アミロースデュラムコムギ製品と比較して、約１．９％の脂質含量を有することが見出された。
いくつかの実施形態では、方法は、デュラムコムギ穀粒中の難消化性デンプン含量を改変することに関する。いくつかの実施形態では、本発明のデュラムコムギ穀粒中の難消化性デンプン含量は、野生型デュラムコムギのものと比較して約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７９％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、１０００％以上改変（例えば増加）される。
いくつかの実施形態では、本発明のデュラムコムギ及び当該コムギから製造される製品の難消化性デンプン含量は、約．１％、．２％、．３％、．４％、．５％、．６％、．７％、．８％、．９％、１％、１．２％、１．３％、１．４％、１．５％、１．６％、１．７％、１．８％、１．９％、２％、２．２％、２．３％、２．４％、２．５％、２．６％、２．７％、２．８％、２．９％、３％、３．１％、３．２％、３．３％、３．４％、３．５％、３．６％、３．７％、３．８％、３．９％、４％、４．１％、４．２％、４．３％、４．４％、４．５％、４．６％、４．７％、４．８％、４．９％、５％、５．１％、５．２％、５．３％、５．４％、５．５％、５．６％、５．７％、５．８％、５．９％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７９％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％である。
よって、本明細書に記載する例示的方法により分析される野生型デュラムコムギ製品は、例えば約３．８％の難消化性デンプンを含んで、＜２％の難消化性デンプンより著しく多いことが見出された本発明の高アミロースデュラムコムギ製品と比較して、約＜２％の難消化性デンプン含量を有することが見出された。
いくつかの実施形態では、方法は、デュラムコムギ穀粒中の灰分含量を改変することに関する。いくつかの実施形態では、本発明のデュラムコムギ穀粒の灰分含量は、野生型デュラムコムギのものと比較して約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７９％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、１０００％以上改変（例えば増加）される。
いくつかの実施形態では、本発明のデュラムコムギ及び当該コムギから製造される製品の灰分含量は、約．１％、．２％、．３％、．４％、．５％、．６％、．７％、．８％、．９％、１％、１．２％、１．３％、１．４％、１．５％、１．６％、１．７％、１．８％、１．９％、２％、２．２％、２．３％、２．４％、２．５％、２．６％、２．７％、２．８％、２．９％、３％、３．１％、３．２％、３．３％、３．４％、３．５％、３．６％、３．７％、３．８％、３．９％、４％、４．１％、４，２％、４．３％、４．４％、４．５％、４．６％、４．７％、４．８％、４．９％、５％、５．１％、５．２％、５．３％、５．４％、５．５％、５．６％、５．７％、５．８％、５．９％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、又は４０％である。
よって、本明細書に記載する例示的方法により分析される野生型デュラムコムギ製品は、例えば約１．２％の灰分を含んで、０．７％の灰分含量より著しく多いことが見出された本発明の高アミロースデュラムコムギ製品と比較して、約０．７％の灰分含量を有することが見出された。
いくつかの実施形態では、方法は、デュラムコムギの仁重量を改変することに関する。いくつかの実施形態では、本発明のデュラムコムギの仁重量は、野生型デュラムコムギのものと比較して約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７９％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、１０００％以上改変（例えば減少）される。例えば、本発明のＳＧＰ１ヌルは、仁重量が低減していることがある。仁重量の低減は、タンパク質含量の増加及び上記のそれと関連する利益と頻繁に関連する。種子の数に影響することなく種子重量を増加することは、収率の増加及びデンプン含量の全般的な増加を導く。
いくつかの実施形態では、本発明のデュラムコムギ穀粒の仁重量は、約１５ｍｇ、１６ｍｇ、１７ｍｇ、１８ｍｇ、１９ｍｇ、２０ｍｇ、２１ｍｇ、２２ｍｇ、２３ｍｇ、２４ｍｇ、２５ｍｇ、２６ｍｇ、２７ｍｇ、２８ｍｇ、２９ｍｇ、３０ｍｇ、３１ｍｇ、３２ｍｇ、３３ｍｇ、３４ｍｇ、３５ｍｇ、３６ｍｇ、３７ｍｇ、３８ｍｇ、３９ｍｇ、４０ｍｇ、４１ｍｇ、４２ｍｇ、４３ｍｇ、４４ｍｇ、４５ｍｇ、４６ｍｇ、４７ｍｇ、４８ｍｇ、４９ｍｇ、又は５０ｍｇである。
よって、本明細書に記載する例示的方法により分析される野生型デュラムコムギは、例えば約３４．８ｍｇを含んで、４０．３ｍｇの仁重量より著しく少ないことが見出された本発明の高アミロースデュラムコムギ製品と比較して、約４０．３ｍｇの仁重量を有することが見出された。
いくつかの実施形態では、方法は、デュラムコムギの仁固さを改変することに関する。いくつかの実施形態では、本発明のデュラムコムギの仁固さは、野生型デュラムコムギのものと比較して約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７９％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、１０００％以上改変（例えば増加又は減少）される。
いくつかの実施形態では、本発明のデュラムコムギ穀粒の仁固さは、約５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７９、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、又は１００である。
よって、本明細書に記載する例示的方法により分析される野生型デュラムコムギは、例えば約８９．８を含んで、７９の仁固さより著しく高いことが見出された本発明の高アミロースデュラムコムギ製品と比較して、約７９の仁固さを有することが見出された。
いくつかの実施形態では、仁固さは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれているＯｓｂｏｒｎｅ，Ｂ．Ｇ．、Ｚ，Ｋｏｔｗａｌら（１９９７）、「Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｉｎｇｌｅ−Ｋｅｒｎｅｌ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ ｔｏ Ｗｈｅａｔ Ｒｅｃｅｉｖｉｎｇ Ｔｅｓｔｉｎｇ ａｎｄ Ｑｕａｌｉｔｙ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ．」Ｃｅｒｅａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｊｏｕｒｎａｌ ７４（４）：４６７〜４７０に記載される方法により測定される。仁固さは、コムギの製粉特性に影響を与える。例えば、本発明のＳＧＰ１ヌルは、仁固さが低減していることがある。仁固さの低減は、分割小麦粉収率の増加並びに小麦粉灰分及びデンプン損傷の低減と関連する。製粉エネルギーも低減される。仁固さの増加は、製粉エネルギーの増加、製粉後のデンプン損傷の増加及び小麦粉粒子サイズの増加と関連する。
いくつかの実施形態では、方法は、デュラムコムギのセモリナ収率を改変することに関する。いくつかの実施形態では、本発明のデュラムコムギのセモリナ収率は、野生型デュラムコムギのものと比較して約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７９％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、１０００％以上改変（例えば増加又は減少）される。
いくつかの実施形態では、本発明のデュラムコムギ及び当該コムギから製造される製品のセモリナ収率は、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７９％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％である。
よって、本明細書に記載する例示的方法により分析される野生型デュラムコムギは、約５６．７％のセモリナ収率を含んで、著しく少ないセモリナ収率を有することが見出された本発明の高アミロースデュラムコムギ製品と比較して、約５７．９％のセモリナ収率を有することが見出された。
いくつかの実施形態では、１又は複数のデンプン合成遺伝子の１又は複数のコピー中の変異は、一緒に組み込まれて、２重、３重、４重などの変異を有する変異体植物を作出する。このような変異体は、伝統的な育種法により作出できる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載する変異は、マーカー促進性遺伝子移入法を用いて又は用いずに伝統的な育種法により、Ｔ．ａｅｓｔｉｖｕｍ、Ｔ．ａｅｔｈｉｏｐｉｃｕｍ、Ｔ．ａｒａｒａｔｉｃｕｍ、Ｔ．ｂｏｅｏｔｉｃｕｍ、Ｔ．ｃａｒｔｈｌｉｃｕｍ、Ｔ．ｃｏｍｐａｃｔｕｍ、Ｔ．ｄｉｃｏｃｃｏｉｄｅｓ、Ｔ．ｄｉｃｏｃｃｕｍ、Ｔ．ｉｓｐａｈａｎｉｃｕｍ、Ｔ．ｋａｒａｍｙｓｃｈｅｖｉｉ、Ｔ．ｍａｃｈａ、Ｔ．ｍｉｌｉｔｉｎａｅ、Ｔ．ｍｏｎｏｃｏｃｃｕｍ、Ｔ．ｐｏｌｏｎｉｃｕｍ、Ｔ．ｓｐｅｌｔａ、Ｔ．ｓｐｈａｅｒｏｃｏｃｃｕｍ、Ｔ．ｔｉｍｏｐｈｅｅｖｉｉ、Ｔ．ｔｕｒａｎｉｃｕｍ、Ｔ．ｔｕｒｇｉｄｕｍ、Ｔ．ｕｒａｒｔｕ、Ｔ．ｖａｖｉｌｏｖｉｉ及びＴ．ｚｈｕｋｏｖｓｋｙｉのような、デュラムコムギ以外のコムギ種に組み込むことができる。
一実施形態では、進化的に保存された領域又は部位に変異を有するデンプン合成遺伝子の変異体を用いて、表現型が改善又は変更されたデュラムコムギ植物を生成できる。一実施形態では、ナンセンス変異（未熟な停止コドン）による変異体を用いて、表現型が改善又は変更されたデュラムコムギ植物を生成できる。一実施形態では、進化的に保存された領域又は部位にない変異体を用いても、表現型が改善又は変更されたデュラムコムギ植物を生成できる。
いくつかの他の実施形態では、変異デンプン合成遺伝子を、その他の変異遺伝子及び／又は導入遺伝子とともに組み込むことができる。本発明の教示に基づいて、当業者は、好ましい標的遺伝子を取り上げ、最終的な好ましい脂肪酸生成が増加した、植物の健康、植物の生物体量、生物及び非生物因子に対する植物の耐性、植物収率を全般的に改善できる変異体及び／又は導入遺伝子のようなある種の目標を達成するために、破壊又は過剰発現がいつ必要かを決定することができる。このような変異体及び／又は導入遺伝子は、限定されないが、病原体耐性遺伝子及び種子収率に関係する植物形質を制御する遺伝子を含む。
デンプン合成に最終的に影響を与えることができるポリペプチドをコードする遺伝子を調節して、所望のデンプン生成を達成できる。このようなポリペプチドは、限定されないが、可溶性デンプン合成酵素（SSS）、ＧＢＳＳＩ、ＧＢＳＳＩＩのような顆粒結合型デンプン合成酵素（GBSS）、ＡＤＰ−グルコースピロホスホリラーゼ（AGPアーゼ）、デンプン分枝酵素（SBE I及びSBE IIのようなSBEとしても知られる）、デンプン脱分枝酵素（SDBEとしても知られる）、並びにデンプン合成酵素Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ及びＩＶを含む。
調節は、所望の対立遺伝子を単一コムギ植物に組み込む育種法により達成できる。所望の対立遺伝子は、自然に存在するものであるか又は突然変異誘発により作出できる。いくつかの実施形態では、所望の対立遺伝子は、参照対立遺伝子と比較して、植物細胞中のコードされるポリペプチドの活性の増加をもたらす。例えば、所望の対立遺伝子は、参照対立遺伝子と比較して植物細胞中のポリペプチド濃度の増加並びに／又は酵素活性が増加した及び／若しくは安定性が増加したポリペプチドを導くことができる。いくつかの実施形態では、所望の対立遺伝子は、参照対立遺伝子と比較して、植物細胞中のコードされるポリペプチドの活性の減少をもたらす。例えば、所望の対立遺伝子は、ヌル変異であるか、又は参照対立遺伝子と比較して、活性が減少した、安定性が減少した、及び／又は植物細胞中で不当に標的にされるポリペプチドをコードすることができる。
調節は、導入遺伝子をコムギ品種に導入することによっても達成でき、ここで、導入遺伝子は、対象の遺伝子を過剰発現するか、又は対象の遺伝子を負に調節できる。
いくつかの実施形態では、改変された可溶性デンプン合成酵素活性又は改変された顆粒結合型デンプン合成酵素活性をもたらす対立遺伝子のようなアミロース合成の増加をもたらす１又は複数の対立遺伝子を、コムギ植物に導入する。いくつかの実施形態では、対立遺伝子は、デュラムコムギのＡゲノム及び／又はＢゲノムにある。
いくつかの実施形態では、改変された可溶性デンプン合成酵素活性又は改変された顆粒結合型デンプン合成酵素活性をもたらす対立遺伝子のようなアミロース合成の減少をもたらす１又は複数の対立遺伝子を、コムギ植物に導入する。いくつかの実施形態では、対立遺伝子は、デュラムコムギのＡゲノム及び／又はＢゲノムにある。
いくつかの実施形態では、改変されたＳＳＩ、ＳＳＩＩ及び／若しくはＳＳＩＩＩ活性、改変されたデンプン分枝酵素（例えばSBEI、SBEIIa及びSBEIIb）活性又は改変されたデンプン脱分枝酵素活性をもたらす対立遺伝子のようなアミロペクチン合成の増加をもたらす１又は複数の対立遺伝子を、コムギ植物に導入する。いくつかの実施形態では、対立遺伝子は、デュラムコムギのＡゲノム及び／又はＢゲノムにある。
いくつかの実施形態では、改変されたＳＳＩ、ＳＳＩＩ及び／若しくはＳＳＩＩＩ活性、改変されたデンプン分枝酵素（例えばSBEI、SBEIIa及びSBEIIb）活性、又は改変されたデンプン脱分枝酵素活性をもたらす対立遺伝子のようなアミロペクチン合成の減少をもたらす１又は複数の対立遺伝子を、コムギ植物に導入する。いくつかの実施形態では、対立遺伝子は、デュラムコムギのＡゲノム及び／又はＢゲノムにある。
標的遺伝子を破壊及び／又は変更する方法は、当業者に知られている。これらの方法は、限定されないが、突然変異誘発（例えば化学的突然変異誘発、放射線照射突然変異誘発、トランスポゾン突然変異誘発、挿入突然変異誘発、符号タグ化突然変異誘発、部位特異的突然変異誘発及び天然突然変異誘発）、ノックアウト／ノックイン、アンチセンス及びＲＮＡ干渉を含む。
本発明は、種子油及び／又は粗びき粉中の脂肪酸のレベルが変更されたコムギ種を育種する方法も提供する。一実施形態では、このような方法は、
ｉ）本発明の変異体デュラムコムギと第２のコムギ種との間の交雑種を作製して、Ｆ１植物を作製することと、
ｉｉ）Ｆ１植物を第２のコムギ種に戻し交配することと、
ｉｉｉ）変異が第２のコムギ種のゲノムに組み込まれるまで、戻し交配工程を反復することとを含む。任意選択により、このような方法は、分子マーカーにより促進できる。
本発明は、デュラムコムギに近い種を育種する方法であって、当該種が、変更／改善されたデンプンを生成する方法を提供する。一実施形態では、このような方法は、
ｉ）本発明のコムギ変異体とデュラムコムギに近い種との間の交雑種を作製して、Ｆ１植物を作製することと、
ｉｉ）Ｆ１植物をデュラムコムギに近い種に戻し交配することと、
ｉｉｉ）変異がデュラムコムギに近い種のゲノムに組み込まれるまで、戻し交配工程を反復することとを含む。デュラムコムギからの遺伝子を別の種及び／又は属にうまく移入するために、特別の技術（例えば体細胞雑種形成）が必要になることがある。任意選択により、このような方法は、分子マーカーにより促進できる。
本発明は、独特のデンプン組成物も提供する。
いくつかの実施形態では、野生型デュラムコムギ種のような参照デュラムコムギ種に由来するデンプン組成物と比較して、改変されたデンプンの質を有するデュラムコムギデンプン組成物が提供される。
いくつかの実施形態では、野生型デュラムコムギ種のような参照デュラムコムギ種に由来するデンプン組成物と比較して、改変された糊化温度を有するデュラムコムギデンプン組成物が提供される。いくつかの実施形態では、本発明のデュラムコムギデンプン組成物は、改変されたアミロペクチン糊化ピーク及び／又は改変されたエンタルピーを有する。いくつかの実施形態では、本発明のデュラムコムギデンプンのアミロペクチン糊化温度は、同じ加熱速度の下で、示差走査熱量分析（DSC）サーモグラム上のピーク高さに基づいて、又はラピッドビスコアナライザ試験に基づいて、約１℃、２℃、３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃、１０℃、１１℃、１２℃、１３℃、１４℃、１５℃、１６℃、１７℃、１８℃、１９℃、２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、２５℃以上、野生型対照よりも高いか又は低い。アミロースの増加は、アミロペクチン糊化の温度である糊化温度の増加をもたらす。
本出願の方法を用いて、有利な特徴を有するデュラムコムギ穀粒を生成できる。このような特徴は、限定されないが、食物繊維含量の改変、タンパク質含量の改変、脂質含量の改変、難消化性デンプン含量の改変、灰分含量の改変及びアミロース含量の改変を含む。いくつかの実施形態では、対照のデュラムコムギ植物から作られる穀粒と比較して、以下の特徴の１又は複数のを有するデュラムコムギ穀粒が作出される：（１）食物繊維含量の増加、（２）タンパク質含量の増加、（３）脂質含量の増加、（４）難消化性デンプン含量の増加、（５）灰分含量の増加及び（６）アミロース含量の増加。上記の有利な特徴を有するデュラムコムギ穀粒を用いて、麺及びパスタのような食品を製造できる。
植物形質転換
本発明は、１又は複数の改変デンプン合成遺伝子を有するトランスジェニックコムギ植物を提供する。改変は、破壊又は過剰発現のいずれかであることができる。
コムギ形質転換のために適切なバイナリーベクターは、限定されないが、Ｚｈａｎｇら、２０００（An efficient wheat transformation procedure: transformed calli with long-term morphogenic potential for plant regeneration、Plant Cell Reports（2000）19: 241-250）、Ｃｈｅｎｇら、１９９７（Genetic Transformation of Wheat Mediated by Agrobacterium tumefaciens、Plant Physiol.（1997）115: 971-980）、Ａｂｄｕｌら（Genetic Transformation of Wheat（Triticum aestivum L）: A Review、TGG 2010、第1巻、第2号、1-7頁）、Ｐａｓｔｏｒｉら、２０００（Age dependent transformation frequency in elite wheat varieties、J. Exp. Bot.（2001）52（357）: 857-863）、Ｊｏｎｅｓ２００５（Wheat transformation: current technology and applications to grain development and composition、Journal of Cereal Science 第41巻、第2号、2005年3月、137-147頁）、Ｇａｌｏｖｉｃら、２０１０（MATURE EMBRYO-DERIVED WHEAT TRANSFORMATION WITH MAJOR STRESS MODULATED ANTIOXIDANT TARGET GENE、Arch. Biol Sci.、Belgrade、62（3）、539-546）などに記載されるベクターを含む。コムギ植物は、上記の参考文献に記載される任意の方法を用いて形質転換できる。
形質転換ベクターを構築するために、主鎖ベクターの左及び右のＴ−ＤＮＡ境界の間の領域を、構成的に発現される選択マーカー遺伝子（例えばNptIIカナマイシン耐性遺伝子）と、その後に続く、レポーター遺伝子（例えばGUS又はGFP）に作動可能に連結した表８に列挙する発現エレメントの１又は複数とからなる発現カセットで置き換える。最終構築物を、Ｚｈａｎｇら、２０００、Ｃｈｅｎｇら、１９９７、Ａｂｄｕｌら、Ｐａｓｔｏｒｉら、２０００、Ｊｏｎｅｓ２００５、Ｇａｌｏｖｉｃら、２０１０、米国特許第７，１９７，９９６４号などに記載される方法のいずれかによりコムギ植物中への形質転換のためにＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍに移入して、トランスジェニック植物におけるポリヌクレオチド：：ＧＦＰ融合体を作製する。
効率的な植物形質転換のために、植物全体が単一形質転換細胞から再生され、形質転換植物の全ての細胞が対象のＤＮＡを有するように選択法を用いなければならない。これらの方法は、正の選択を用いることができ、それにより、マンノース又はキシロースのようなそうでなければ用いることができない、培地中に存在する基質を利用することができるように外来遺伝子が植物細胞に供給される（例えばUS 5767378; US 5994629を参照されたい）。より典型的には、しかし、負の選択が用いられる。なぜなら、これはより効率的であり、形質転換されなかった植物細胞を死滅させるか又はその成長を阻害する除草剤又は抗生物質のような選択剤を利用し、キメラの可能性を低減するからである。負の選択剤に対して効果的な耐性遺伝子は、植物形質転換のために用いる導入外来ＤＮＡ上に提供される。例えば、最もよく用いられる選択剤の１つは、カナマイシン及び関連抗生物質に対する耐性を与える耐性遺伝子ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（nptII）と一緒の抗生物質カナマイシンである（例えばMessing及びVierra、Gene 19: 259-268（1982）; Bevaら、Nature 304: 184-187（1983）を参照されたい）。しかし、多くの異なる抗生物質及び抗生物質耐性遺伝子を、形質転換の目的のために用いることができる（US 5034322、US 6174724及びUS 6255560を参照されたい）。さらに、除草剤ホスフィノトリシンに対する耐性を与えるｂａｒ遺伝子を含むいくつかの除草剤及び除草剤耐性遺伝子が、形質転換の目的のために用いられている（Whiteら、Nucl Acids Res 18: 1062（1990）、Spencerら、Theor Appl Genet 79: 625-631（1990）、US 4795855、US 5378824及びUS 6107549）。さらに、抗癌剤メトトレキセートに対する耐性を与えるｄｈｆｒ遺伝子が、選択のために用いられている（Bourouisら、EMBO J. 2（7）: 1099-1104（1983）。
所定のタンパク質の発現を調節するために用いる発現制御エレメントは、コード配列と関連して通常見出される発現制御エレメントであり得るか（相同発現エレメント）、又は異種発現制御エレメントであり得る。様々な相同及び異種発現制御エレメントが当該技術において知られており、本発明で用いるための発現ユニットを作製するために容易に用いることができる。例えば転写開始領域は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのＴｉプラスミド中で見出されるオクトピン、マンノピン、ノパリンなどのような様々なオピン開始領域のいずれかを含むことができる。代わりに、カリフラワーモザイクウイルス１９Ｓ及び３５Ｓプロモーター（それぞれCaMV 19S及びCaMV 35Sプロモーター）のようなな植物ウイルスプロモーターを用いて、植物での遺伝子発現を制御することもできる（例えば米国特許第5,352,605号、第5,530,196号及び第5,858,742号）。ＣａＭＶに由来するエンハンサー配列も利用できる（例えば米国特許第5,164,316号、第5,196,525号、第5,322,938号、第5,530,196号、第5,352,605号、第5,359,142号及び第5,858,742号）。最後に、ｐｒｏｌｉｆｅｒａプロモーター、果実特異的プロモーター、Ａｐ３プロモーター、熱ショックプロモーター、種子特異的プロモーターなどのような植物プロモーターも用いることができる。
トランスジェニック植物を生成する方法は、当業者に公知である。トランスジェニック植物は、現在、限定されないが、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、粒子加速又は遺伝子銃としても知られる微粒子銃、ウイルス媒介形質転換及びＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換を含む様々な異なる形質転換法により生成できる。例えば、それぞれが明示的に本明細書に参照によりその全体が組み込まれている米国特許第５，４０５，７６５号、第５，４７２，８６９号、第５，５３８，８７７号、第５，５３８，８８０号、第５，５５０，３１８号、第５，６４１，６６４号、第５，７３６，３６９及び第５，７３６３６９号、国際特許出願公開ＷＯ２００２／０３８７７９及びＷＯ／２００９／１１７５５５；Ｌｕら（Plant Cell Reports、2008、27: 273-278）；Ｗａｔｓｏｎら、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｏｏｋｓ（１９９２）；Ｈｉｎｃｈｅｅら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈ．６：９１５〜９２２（１９８８）；ＭｃＣａｂｅら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈ、６：９２３〜９２６（１９８８）；Ｔｏｒｉｙａｍａら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈ、６：１０７２〜１０７４（１９８８）；Ｆｒｏｍｍら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈ．８：８３３〜８３９（１９９０）；Ｍｕｌｌｉｎｓら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈ．８：８３３〜８３９（１９９０）；Ｈｉｅｉら、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３５：２０５〜２１８（１９９７）；Ｉｓｈｉｄａら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１４：７４５〜７５０（１９９６）；Ｚｈａｎｇら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ８：２２３〜２３１（１９９７）；Ｋｕら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１７：７６〜８０（１９９９）；並びにＲａｉｎｅｒｉら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈ．８：３３〜３８（１９９０））を参照されたい。
育種法
本発明の１又は複数の変異体を、本発明のトランスジェニック植物との交配に適合性である他の植物品種又は他の近縁種に導入するために、伝統的な育種法を本発明に含めることができる。
放任受粉した個体群。ライ麦、多くのトウモロコシ及びテンサイのような作物、草本類、アルファルファ及びクローバのようなマメ科植物、並びにカカオ、ココナツ、アブラヤシ及びいくつかのゴムのような熱帯性樹木作物の放任受粉した個体群の改善は、高い程度（しかし最大限からは遠い）のヘテロ接合性を維持しながら好ましい対立遺伝子の固定に向かう遺伝子頻度を変更することに本質的に依存する。このような個体群における均一性は不可能であり、放任受粉した品種におけるタイプに対する純粋度（trueness-to-type）は、個別の植物の特徴ではなく、全体としての個体群の統計的特徴である。よって、放任受粉した個体群の不均質性は、近交系、クローン及び雑種の均質性（又は本質的に均質性）と対照をなす。
個体群改善法は、集団選択と通常よばれる純粋に表現型選択に基づくものと、後代検定を用いる選択を用いるものとの２つの群に必然的に分かれる。個体群間改善は、開放育種個体群の概念を利用し、遺伝子がある個体群から別の個体群へと流れることを許容する。ある個体群中の植物（栽培変種、株、生態型又は任意の生殖質供給源）を、自然に（例えば風により）又は手で若しくはミツバチ（一般的にApis mellifera L.又はMegachile rotundata F.）により、他の個体群からの植物と交配させる。選択を用いて、両方の供給源からの所望の形質を有する植物を単離することにより、一方（又は時折両方）の個体群を改善する。
放任受粉した個体群の改善の方法は、基本的に主に２つである。第１に、選択した選択手順により個体群がまとめて変化する状況がある。その成果物は改善された個体群であり、この個体群は単離においてそれ自体のうちでの無作為配偶により無限に繁殖可能なものである。第２に、合成品種は、個体群改善と同じ最終結果を達成するが、それ自体で繁殖可能でない。これは、親の系統又はクローンから再構成しなければならない。放任受粉した個体群を改善するためのこれらの植物育種手順は、当業者に公知であり、他家受粉させた植物を改善するために日常的に用いられる育種手順についての包括的な概説は、Ａｌｌａｒｄ、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９６０）；Ｓｉｍｍｏｎｄｓ、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｃｒｏｐ Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ、Ｌｏｎｇｍａｎ Ｇｒｏｕｐ Ｌｉｍｉｔｅｄ（１９７９）；Ｈａｌｌａｕｅｒ及びＭｉｒａｎｄａ、Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｉｎ Ｍａｉｚｅ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ、Ｉｏｗａ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８１）；並びにＪｅｎｓｅｎ、Ｐｌａｎｔ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９８８）を含む多数の参考書及び文献において示されている。
集団選択。集団選択では、所望の個別の植物を選択し、収穫し、後代検定なしで種子を複合させて、次の世代を作り出す。選択は母性の親のみに基づき、受粉の間に制御はないので、集団選択は、選択ありの無作為配偶の形になる。本明細書で述べるように、集団選択の目的は、個体群中の優れた遺伝子型の割合を増やすことである。
合成。合成品種は、全ての可能な雑種組み合わせにおいて良好な組み合わせ能力について選択されたいくつかの遺伝子型を同一育種間で交配させ、続いて放任受粉により品種を維持することにより生成される。親がいくつかのテンサイ及びインゲンマメ（Vicia）でのように（多かれ少なかれ近交系の）種子により繁殖させた系統であるか又は草本類、クローバ及びアルファルファでのようにクローンであるかは、原則として違いがない。親は、全般的に組み合わせ能力について、時折検定交雑又は品種系統間交雑、より一般的に多系統交雑により選択される。親の種子系統は、故意に近親交配させてよい（例えば自家受精又は兄妹交配）。しかし、親が故意に近親交配されていなくても、系統維持中の系統内の選択により、いくらかの近親交配が確実に生じる。クローン性の親は、もちろん、変化しないままであり、高度にヘテロ接合性である。
合成種が親の種子生成計画から栽培者まですぐに到達できるか、又はまず１若しくは２回の増殖サイクルを経なければらないかは、種子生産及び種子に対する要求の規模に依存する。実際上、草本類及びクローバは、１又は２回増殖され、よって、元の合成種からかなり除去される。
集団選択が時折用いられるが、後代検定は、操作が単純であり、目的、すなわち合成種における全般的な組み合わせ能力の活用に対して明らかに適切であるので、多系統交雑のために一般的に好まれる。
合成種に入る親の系統又はクローンの数は、広く変動する。実際上、親の系統の数は、１０〜数百の範囲であり、１００〜２００が平均である。１００以上のクローンから形成される広い範囲に基づく合成種は、種子増殖中に、狭い範囲に基づく合成種よりも安定であることが期待される。
血統が明らかな品種。血統が明らかな品種は、分離個体群から個別の植物を選択し、その後に自家受粉した子の繁殖及び種子増加並びに数世代にわたって遺伝子型を注意深く試験することから発展した優れた遺伝子型である。これは、自然に自家受粉する種でよく働く放任受粉の方法である。この方法は、品種開発において集団選択と組み合わせて用いることができる。組み合わせでの血統及び集団選択の変動は、自家受粉する作物において品種を作製するために最も一般的な方法である。
雑種。雑種は、異なる遺伝子型の親の間の交雑種に起因する個別の植物である。商業的な雑種は、現在、トウモロコシ（corn/maize）、モロコシ、テンサイ、ヒマワリ及びブロッコリーを含む多くの作物に広く用いられている。雑種は、２つの親を直接交配することにより（単交雑雑種）、単交雑雑種を別の親と交配することにより（3系又は3重交雑雑種）、又は２つの異なる雑種を交配することによる（4系又は2重交雑雑種）ことを含む、いくつかの異なる方法で形成できる。
厳密にいうと、異系交配（すなわち放任受粉した）個体群中のほとんどの個体は雑種であるが、この用語は、親が異なる種又は亜種として認識できるほど十分に異なるゲノムを有する個体である場合に通常とっておかれる。雑種は、２つの親のゲノム中の質的及び／又は量的な差に依存して稔性又は不稔性であり得る。雑種強勢（heterosis又はhybrid vigor）は、雑種を形成するために用いた親の系統と比較して、雑種の成長の活力、生存及び稔性の増加をもたらすヘテロ接合性の増加と通常関連する。最大限の雑種強勢は、２つの遺伝子的に異なる高度の近交系統を交配することにより、通常、達成される。
雑種の生成は、親の系統とこれらの系統の交配に起因する雑種との両方の別々の生成が関与する、十分に開発された産業である。雑種生成プロセスについての詳細な議論について、例えばＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｒｏｐ Ｐｌａｎｔｓ中のＷｒｉｇｈｔ、Ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ Ｈｙｂｒｉｄ Ｓｅｅｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ８：１６１〜１７６を参照されたい。
示差走査熱量分析
示差走査熱量分析又はＤＳＣは、試料及び参照の温度を増加させるために必要な熱の量の差を温度の関数として測定する熱分析技術である。試料及び参照はともに、実験中、同じ温度付近に維持される。一般的に、ＤＳＣ分析についての温度プログラムは、試料ホルダ温度が時間の関数として直線的に増加するように設計される。参照試料は、走査する範囲の温度にわたって明確に規定された熱容量を有するべきである。ＤＳＣは、熱相変化、熱ガラス転移温度（Tg）、結晶融解温度、吸熱効果、発熱効果、熱安定性、熱組成安定性、酸化安定性研究、遷移現象、固体状態構造及び様々な範囲の材料を分析するために用いることができる。ＤＳＣサーモグラムは、Ｔｇガラス転移温度、Ｔｍ融点、ΔＨｍ吸収エネルギー（ジュール/グラム）、Ｔｃ結晶点、及びΔＨｃ放出エネルギー（ジュール/グラム）を決定するために用いることができる。
ＤＳＣは、デンプンの糊化を測定するために用いることができる。Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｂｒｉｅｆ、ＴＡ第６号、ＳＩＩ Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．、「Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ ｏｆ ｇｅｌａｔｉｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｔａｒｃｈ ｂｙ ＤＳＣ」、１９８０；Ｄｏｎｏｖａｎ １９７９ Ｐｈａｓｅ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ ｓｔａｒｃｈ−ｗａｔｅｒ ｓｙｔｅｍ．Ｂｉｏ−ｐｏｌｙｍｅｒｓ、１８、２６３〜２７５．；Ｄｏｎｏｖａｎ，Ｊ．Ｗ．及びＭａｐｅｓ，Ｃ．Ｊ．（１９８０）．Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｐｈａｓｅ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎｓ ｏｆ ｓｔａｒｃｈｅｓ ａｎｄ Ｎａｇｅｌｉ ａｒｎｙｌｏｄｅｘｔｒｉｎｓ．Ｓｔａｒｃｈ、３２、１９０〜１９３．Ｅｌｉａｓｓｏｎ，Ａ．−Ｃ．（１９８０）．Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｗａｔｅｒ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｎ ｔｈｅ ｇｅｌａｔｉｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｗｈｅａｔ ｓｔａｒｃｈ．Ｓｔａｒｃｈ、３２、２７０〜２７２．Ｌｕｎｄ，Ｄ．Ｂ．（１９８４）．Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｉｍｅ，ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ，ｍｏｉｓｔｕｒｅ，ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓ ａｎｄ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｏｎ ｓｔａｒｃｈ ｇｅｌａｔｉｎｉｚａｔｉｏｎ．ＣＲＣ Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ、２０（４）、２４９〜２５７．Ｓｈｏｇｒｅｎ，Ｒ．Ｌ．（１９９２）．Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｍｏｉｓｔｕｒｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｎ ｔｈｅ ｍｅｌｔｉｎｇ ａｎｄ ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔ ｐｈｙｓｉｃａｌ ａｇｉｎｇ ｏｆ ｃｏｒｎｓｔａｒｃｈ．Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ、１９、８３〜９０．Ｓｔｅｖｅｎｓ，Ｄ．Ｊ．及びＥｌｔｏｎ，Ｇ．Ａ．Ｈ．（１９７１）．Ｔｈｅｒｍａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｓｔａｒｃｈ ｗａｔｅｒ ｓｙｓｔｅｍ．Ｓｔａｅｒｋｅ、２３、８〜１１．Ｗｏｏｔｔｏｎ，Ｍ．及びＢａｍｕｎｕａｒａｃｈｃｈｉ，Ａ．（１９８０）．Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｓｃａｎｎｉｎｇ ｃａｌｏｒｉｍｅｔｒｙ ｔｏ ｓｔａｒｃｈ ｇｅｌａｔｉｎｉｚａｔｉｏｎ．Ｓｔａｒｃｈ、３２、１２６−１２９．Ｚｏｂｅｌ，Ｈ．Ｆ．及びＧｅｌａｔｉｏｎ，Ｘ．（１９８４）．Ｇｅｌａｔｉｏｎ．Ｇｅｌａｔｉｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｔａｒｃｈ ａｎｄ ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｓｔａｒｃｈ ｐａｓｔｅｓ．Ｒ．Ｗｈｉｓｔｌｅｒ，Ｊ．Ｎ．Ｂｅｍｉｌｌｅｒ及びＥ．Ｆ．Ｐａｓｃｈａｌｌ、Ｓｔａｒｃｈ：ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（pp. 285-309）．Ｏｒｌａｎｄｏ，ＦＬ：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓを参照されたい。糊化プロファイルは、加熱速度及び水分含量に依存する。別段の定義のない限り、本出願のデュラムコムギからのデンプンと野生型参照デュラムコムギからのデンプンとの間のＤＳＣの比較は、同じ加熱速度及び／又は同じ水分含量の条件下である。いくつかの実施形態では、本出願は、ＤＳＣにより測定して、糊化温度が改変されたデンプン組成物を提供する。
ＤＳＣは、デンプンのガラス転移温度を測定するために用いることができる。Ｃｈｉｎａｃｈｏｔｉ，Ｐ．（１９９６）．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅｒｍｏｍｅｃｈａｎｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｉｎ ｓｔａｒｃｈ ａｎｄ ｃｅｒｅａｌ ｐｒｏｄｕｃｔｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｔｈｅｒｍａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ、４７、１９５〜２１３．Ｍａｕｒｉｃｅら１９８５ Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ−ｗａｔｅｒ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ−ｔｈｅｒｍａｌ ｂｅｈａｖｉｏｒ ｏｆ ｒｉｃｅ ｓｔａｒｃｈ．Ｄ．Ｓｉｍａｔｏｓ及びＳ．Ｌ．Ｍｕｌｔｏｎ，Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｗａｔｅｒ ｉｎ ｆｏｏｄｓ（pp. 211-227）中．Ｄｏｒｄｒｅｃｈｔ：Ｎｉｌｈｏｆｆ；Ｓｌａｄｅ，Ｌ．及びＬｅｖｉｎｅ，Ｈ．（１９８７）．Ｒｅｃｅｎｔ ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｓｔａｒｃｈ ｒｅｔｒｏｇｒａｄａｔｉｏｎ．Ｓ．Ｓ．Ｓｔｉｖａｌａ、Ｖ．Ｃｒｅｓｃｅｎｚｉ及びＩ．Ｃ．Ｍ．Ｄｅａ、Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ（pp. 387-430）中．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｇｏｒｄｏｎ及びＢｒｅａｃｈ．Ｓｔｅｐｔｏ，Ｒ．Ｆ．Ｔ．及びＴｏｍｋａ，Ｉ．（１９８７）．Ｃｈｉｍｉａ、４１（３）、７６〜８１．Ｚｅｌｅｚｎａｋ，Ｋ．Ｌ．及びＨｏｓｅｎｅｙ，Ｒ．Ｃ．（１９９７）、Ｔｈｅ ｇｌａｓｓ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ ｉｎ ｓｔａｒｃｈ．Ｃｅｒｅａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、６４（２）、１２１〜１２４を参照されたい。いくつかの実施形態では、本出願は、ＤＳＣにより測定して、ガラス転移温度が改変されたデンプン組成物を提供する。
ＤＳＣは、デンプンの結晶化を測定するために用いることができる。Ｂｉｌｉａｄｅｒｉｓ，Ｃ．Ｇ．、Ｐａｇｅ，Ｃ．Ｍ．、Ｓｌａｄｅ，Ｌ．及びＳｉｒｅｔｔ，Ｒ．Ｒ．（１９８５）．Ｔｈｅｒｍａｌ ｂｅｈａｖｉｏｒ ｏｆ ａｍｙｌｏｓｅ−ｌｉｐｉｄ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ．Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ、５、３６７〜３８９．Ｒｉｎｇ，Ｓ．Ｇ．、Ｃｏｌｉｎｎａ，Ｐ．、Ｉ’Ａｎｓｏｎ，Ｋ．Ｊ．、Ｋａｌｉｃｈｅｖｓｋｙ，Ｍ．Ｔ．、Ｍｉｌｅｓ，Ｍ．Ｊ．、Ｍｏｒｒｉｓ，Ｖ．Ｊ．及びＯｒｆｏｒｄ，Ｐ．Ｄ．（１９８７）．Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１６２、２７７〜２９３を参照されたい。いくつかの実施形態では、本出願は、ＤＳＣにより測定して、結晶化温度が改変されたデンプン組成物を提供する。
ＤＳＣは、本出願のデュラムコムギ植物と野生型デュラムコムギ植物とから作られたデンプンの間の熱容量変化を算出するためにも用いることができる。試料の熱容量は、開始時遷移でのベースラインのシフト：
Ｃｐ＝ｄＨ／ｄｔ×ｄｔ／ｄＴ
（式中、dH/dtは、サーモグラムのベースラインのシフトであり、dt/dTは、加熱速度の逆数である）から算出される。熱流量の単位は、ｍＷ又はｍｃａｌ／秒であり、加熱速度の単位は、℃／分又は℃／秒である。いくつかの実施形態では、１０℃／分の加熱速度にて、ＤＳＣにより測定して、本出願のデュラムコムギから作られるデンプンの熱容量は、野生型デュラムコムギから作られるデンプンのものと比較して約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７９％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、１０００％以上改変（例えば増加又は減少）される。
本発明を、限定すると解釈されるべきでない以下の実施例によりさらに説明する。本出願を通して引用する全ての参考文献、特許及び特許出願公開の内容、並びに図面及び配列表は、本明細書に参照により組み込まれている。
実施例１
デュラムコムギの麺の質に対するＳＳＩＩ−Ａヌル対立遺伝子の影響
材料及び方法
２００のデュラムコムギ受託物の標本を、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｍａｌｌ Ｇｒａｉｎｓ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ａｂｅｒｄｅｅｎ、ＩＤから、及び５５のデュラムコムギ受託物を、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｉｎ ｔｈｅ Ｄｒｙ Ａｒｅａｓ（ICARDA）から得た。これらの受託物をスクリーニングして、ＳＧＰ−Ａ１及び／又はＳＧＰ−Ｂ１についてヌル表現型を示す受託物を、デンプン粒結合タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて同定した。
デンプン抽出
単一遺伝子型からの種子を、Ｂｒａｕｎコーヒーミル（Proctor Gamble、Cincinnati、OH）中で１０秒間粉砕し、次いで、２ｍｌの微量遠心管に、６．５ｍｍのイットリア安定化ジルコニアセラミックボール２つ（Stanford Materials、Irvine、CA）とともに入れ、これらを次いで３０秒間、ミニ−ビーズビーター−９６（Biospec Products、Bartlesville、OK）中で、振動距離３．２ｃｍ及び振とう速度３６回の振動／秒で撹拌した。ジルコニアボールを遠心管から取り除き、０．１Ｍ ＮａＣｌ １．０ｍｌを全穀粒小麦粉に加え、これを次いで放置して室温にて３０分間浸した。３０分後に、プラスチックのＫｏｎｔｅｓペレットペッスル（Kimble Chase、Vineland、NJ）を用いて湿潤小麦粉を混合することにより生地のボールを作り、デンプンを圧搾した後にこのグルテンボールを試料から取り除いた。液体デンプン懸濁物を、次いで、予め秤量した新しい２．０ｍｌチューブに移し、ｄｄＨ２Ｏ ０．５ｍｌを最初のチューブ中の残存デンプンペレットに加えた。最初のチューブをボルテックスし、１分間放置して落ち着かせ、液体デンプン懸濁物を第２のチューブに移した。デンプン懸濁物含有チューブを５，０００ｇにて遠心分離し、液体を吸引して除いた。デンプンペレットに、ＳＤＳ抽出緩衝液（55 mM Tris-Cl pH 6.8、2.3% SDS、5% BME、10%グリセロール）０．５ｍｌを加え、懸濁されるまで試料をボルテックスし、次いで５，０００ｇで遠心分離した。ＳＤＳ緩衝液を吸引して除き、ＳＤＳ緩衝液抽出をもう１度繰り返した。次に、８０％ＣｓＣｌ ０．５ｍｌをデンプンペレットに加え、懸濁されるまで試料をボルテックスし、次いで７，５００ｇで遠心分離した。ＣｓＣｌを吸引して除き、１０，０００ｇの遠心分離速度を用いてｄｄＨ２Ｏ ０．５ｍｌで２回及びアセトンで１回デンプンペレットを洗浄した。アセトンを吸引して除いた後に、ペレットを１晩、ドラフト中で放置して乾燥させた。
デンプン粒タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ
デンプンを精製するために、ＳＤＳローディング緩衝液（SDS抽出緩衝液とブロモフェノールブルー）７．５μｌをデンプン１ミリグラムあたり加えた。試料を１５分間、７０℃にて加熱し、１０，０００ｇにて１分間遠心分離し、次いで、３０％アクリルアミド／０．８％ピペラジンジアクリルアミドｗ／ｖストック溶液を用いて調製した１０％（w/v）アクリルアミドゲルに試料４０μｌをロードした。ゲルは、３０％アクリルアミド／０．８％ピペラジンジアクリルアミドｗ／ｖストック溶液を用いて調製した標準的な４％ｗ／ｖアクリルアミドスタッキングゲルを有した。ゲル（mAが適切になるように、ゲルの長さ幅及び高さが必要であり、アンディの論文にもそれが欠落していた）を泳動し（25mA/ゲルで45分、次いで35mA/ゲルで3時間）、標準的な手順に従って銀染色し、デジタルカメラを用いてライトボックス上で写真撮影した。ＳＧＰ−Ａ１及び／又はＳＧＰ−Ｂ１タンパク質の存在又は非存在について、各系統の遺伝子型を決定した。
分離型個体群の評価
２つの受託物、すなわちＮＳＧＣからのＰＩ３３０５４６及びＩＣＡＲＤＡからのＩＧ８６３０４は、ＳＧＰ−Ａ１タンパク質を欠いていた。これらをともに、適応されたデュラムコムギ栽培変種「Ｍｏｕｎｔｒａｉｌ」（PVP 990266）（Elias及びMiller、2000）と交配させた。個体群を、単粒系統法によりＦ５世代に進めた。全ての系統は、上記のＳＤＳ−ＰＡＧＥ法を用いてＳＧＰ−Ａ１タンパク質の存在又は非存在について遺伝子型を決定した（図１）。種子増加が生じた後に、系統と親を、２つの反復を用いる乱塊分割区画法において評価した。個体群は主区画であり、各個体群内の系統は副区画であった。各区画は、３０ｃｍの間隔の４本の３ｍ列であった。区画は、区画コンバインを用いて収穫した。試験は、Ｂｏｚｅｍａｎ、ＭＴの近くのＡｒｔｈｕｒ Ｈ．Ｐｏｓｔ Ｆｉｅｌｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙにて、２００９年及び２０１０年に、別々の隣接した天水及び灌漑実験で成長させた。
穀粒、小麦粉及び麺の特徴の測定
小麦粉膨潤度（FSP）は、２００９年の４つの反復（2つは天水環境から、2つは灌漑環境から）及び２０１０年の１つの反復からの圃場成長区画からの種子を用いて測定した。種子を、Ｂｒａｕｎコーヒーミル（Proctor Gamble、Cincinnati、OH）中で１０秒間粉砕し、次いで、２ｍｌのチューブに、６．５ｍｍのジルコニアボール２つとともに入れ、次いで３０秒間、ミニ−ビーズビーター−９６（Biospec Products、Bartlesville、OK）中で、振動距離３．２ｃｍ及び振とう速度３６回の振動／秒で撹拌した。次いで、全粒小麦粉３０ｍｇを２ｍｌのチューブ中に秤量し、ｄｄＨ２Ｏ １．５ｍｌを加えた。試料をＴｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ（登録商標）（Eppendorf、Hamburg、Germany）で、８００ｒｐｍで連続的に混合しながら３０分間、９２℃にて加熱した。試料を次いでベンチで２分間冷却した後に、４℃、１，０００ｇにて１０分間の遠心分離を行い、その後、水を吸引して除いた。チューブを次いで再秤量し、小麦粉膨潤度を、最終小麦粉重量を初期小麦粉重量で除すことにより算出した。
穀粒、セモリナ及び麺の品質特性を、Ｄｕｒｕｍ Ｗｈｅａｔ Ｑｕａｌｉｔｙ ａｎｄ Ｐａｓｔａ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｆａｒｇｏ、ＮＤにて決定した。仁固さ及び重量は、単一仁特徴決定システム（SKCS）を用いて決定した。仁タンパク質含量及び水分含量は、Ｆｏｓｓ Ｉｎｆｒａｔｅｃ １２４１穀粒分析器（Foss North America、Eden Prairie、MN）を用いて決定した。仁重量、穀粒固さ及び穀粒タンパク質は、２００９年及び２０１０年の両方からの全ての圃場成長反復について測定した。
セモリナ及び麺の品質形質について、４つの圃場反復全てを２０１０年試験について測定し、２つの天水反復及び２つの灌漑反復からの穀粒は、一緒にして、２００９年の試験についての２つの反復を形成した。穀粒試料は、１５．５％に２４時間調節し、デュラムをセモリナに製粉するように設定されたＢｒａｂｅｎｄｅｒ Ｑｕａｄｒｕｍａｔ Ｊｒ．ミルでセモリナに製粉した。セモリナ試料をガラスのジャーに４℃にて使用時まで貯蔵した。セモリナのタンパク質含量及び水分含量は、Ｆｏｓｓ Ｉｎｆｒａｔｅｃ １２４１穀粒分析器を用いて決定した。セモリナの色は、石英ガラス窓を有する黒色の保持セルにセモリナを入れることにより決定し、Ｍｉｎｏｌｔａ ＣＲ３１０色彩色差計を用いてＣＩＥ Ｌ、ａ、ｂ色尺度で色を測定した。Ｌ値は、白に対する黒の尺度であり（０〜１００）、ａ値は正である場合に赤の度合い、負である場合に緑の度合いの尺度であり、ｂ値は正である場合に黄色の度合いの尺度である。
セモリナ（７５ｇ）を、４０℃に加熱した蒸留水を用いて水分３８％まで水和させた。水和は３ステップで行った。第１に、セモリナを３０秒間、低速にてキッチンエイドミキサ（モデル、製造業者、都市、州）を用いて混合しながら蒸留水を加えた。第２に、ミキサを消し、水和したセモリナをスパチュラで３０秒間撹拌して混合ボウルの側面をこそげた。第３に、水和したセモリナを、キッチンエイドミキサを用いて３０秒間、高速にて混合した。このことにより、脆い生地が得られ、これをボールに丸めてプラスチックの袋に入れ、室温にて２０分間休ませた。休ませた生地をキッチンエイドミキサのシート形成付属物を用いてシート状にした。シート形成の３ステップを用い、生地シートは常に同じ方向で機械に通した。シートは、最も広いロール間隔を３回、中程度のロール間隔を２回及び狭いロール間隔を２回通過させた。次いで、シートをフェツッチーニカッターに通し、乾燥のためにトレイに置いた。麺を、低温（４０℃）乾燥サイクルを用いて乾燥させた。乾燥期間中に、乾燥機の相対湿度は、９５％から５０％まで低下させた。温度は最初の１２時間は４０℃に保持し、次いでサイクルの最後の６時間は２５℃に低下させた。
乾燥麺は、平均幅６ｍｍ及び厚さ１．７ｍｍであった。乾燥麺の色は、Ｍｉｎｏｌｔａ ＣＲ３１０色彩色差計を用いて測定した。麺を一緒に集め、黒色のプラスチック背景を用いて測定した。色の読み取りは、Ｌ、ａ及びｂについてのＨｕｎｔｅｒ値により表した。Ｌ値は、白に対する黒の尺度であり（０〜１００）、ａ値は正である場合に赤の度合い、負である場合に緑の度合いの尺度であり、ｂ値は正である場合に黄色の度合いの尺度である。
麺（１０ｇ、長さ５ｃｍ）を沸騰した蒸留水（３００ｍＬ）中で１８分間調理した。麺をブフナー漏斗を用いて水切りし、蒸留水（５０ｍＬ）ですすぎ、麺を秤量した。調理損失（%全固形重量）は、強制空気オーブン中で１１０℃にて調理水を蒸発させて乾燥させることにより測定した。調理後硬さは、４本の調理後の麺をせん断するために必要な仕事量（g.cm）を、パスタ用の刃を備えるＴＸ−ＸＴ２テクスチャ分析器（Texture Technologies Corp.、Scarsdale、NY）を用いて測定することにより決定した。硬さの結果は、それぞれの調理後試料について行った４回の測定の平均である。
データ分析
どちらの年も十分に雨が降ったので、天水試験及び灌漑試験は非常に類似していた。よって、環境（天水及び灌漑）×ブロックの組み合わせを、各年についてのブロックとして処理した。両年にわたって組み合わせた分散分析を、全ての測定した形質について、個体群が主区画であり個体群内の系統が副区画である、年をまたいで組み合わせた乱塊分割区画についてのモデルを用いて行った。各系統についての最小二乗平均を得た。副区画及び副区画×個体群のソースを、ＳＳＩＩａ−Ａクラス、ＳＳＩＩａ−Ａクラス内の系統及びこれらのソースと年との全ての可能な相互作用に分割した。ブロック及びＳＳＩＩａ−Ａクラス内の系統は、無作為とみなし、全てのその他の因子は固定された効果とみなした。分析は、ＳＡＳ Ｓｙｔｅｍ ｆｏｒ Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）（SAS Institute Inc.、Cary、NC）のＳＡＳ／ＳＴＡＴソフトウェアバージョン９．３でＰＲＯＣ ＭＩＸＥＤプロシージャを用いて行った。各個体群についてのＳＳＩＩ−Ａクラス平均間の差は、ＥＳＴＩＭＡＴＥステートメントを用いて見積もった。唯一の例外は、小麦粉膨潤度であり、ここでは、年効果をモデルに含めなかった。ＳＡＳ／ＳＴＡＴソフトウェアでＰＲＯＣ ＣＯＲＲプロシージャを用いて、選択した形質の間で線形の相関が系統平均を用いて得られた。変数の特定の対についてＳＳＩＩａ−Ａ対立遺伝子クラス間の関係（傾き）の不均質性は、Ｌｉｔｔｅｌｌら２４０頁（２００２）に概説される方法を用いて試験した。
結果
ＳＧＰ−Ａ１タンパク質を欠く２つの遺伝子型を同定した。これらのヌル遺伝子型は、ＳＳＩＩａ−Ａｂと称し、野生型はＳＳＩＩａ−Ａａと称した。ヌル遺伝子型をＭｏｕｎｔｒａｉｌと交配させて、分離型個体群を作出した。これらの分離型個体群を、２年にわたる反復試験において評価した。平均穀粒タンパク質は、１年目及び２年目について１４．１％及び１５．０％であった。年との相互作用は、一般的に重要でなく、データは、２年にわたる平均として示す。ＳＳＩＩａ−Ａｂクラスは、ＳＳＩＩａ−Ａ１ａクラスよりも低いＦＳＰを有した（表Ｉ）。この差は、ＩＧ８６３０４交雑種よりもＰＩ３３０５４６交雑種について大きかった。ＳＳＩＩａ−Ａｂクラスは、両方の交雑種について、より固い仁（P<0.05）を有した。仁重量は、ＩＧ８６３０４交雑種について、ＳＳＩＩａ−Ａａクラスと比較してＳＳＩＩａ−Ａｂクラスについて、より低かった。しかし、仁重量のこの差は、ＰＩ３３０５４６交雑種について観察されなかった。
ＳＳＩＩａ−Ａｂクラスは、ＩＧ８６３０４交雑種について、ＳＳＩＩａ−Ａａクラスよりも著しく低いセモリナ収率を有した（表１）。２０１０年にのみ測定したセモリナの色は、ＳＳＩＩａ−Ａ対立遺伝子クラスの差により著しく影響されなかった。ＩＧ８６３０４及びＰＩ３３０５４６の親は、Ｍｏｕｎｔｒａｉｌの親よりも低いＦＳＰ、高いタンパク質、低い仁重量、固い仁及び低いセモリナ収率を有した（表１）。
麺の色についてのＳＳＩＩａ−Ａ対立遺伝子クラス間の相対的な差は、Ｈｕｎｔｅｒ及びＣＩＥ色尺度について類似していた（表２）。ＳＳＩＩａ−Ａ対立遺伝子の差は、麺の色の形質に対してほとんど影響しなかった。残存又は調理重量についてＳＳＩＩａ−Ａ対立遺伝子クラス間に差はなかった。ＳＳＩＩａ−Ａｂクラスは、ＰＩ３３０５４６交雑種について、ＳＳＩＩａ−Ａａクラスよりも固い麺を生成したが、ＩＧ８６３０４交雑種についてそうでなかった。結果は、両年で一貫していた（データは示さず）。ＩＧ８６３０４及びＰＩ３３０５４６の親は、適応されたＭｏｕｎｔｒａｉｌの親よりも、より色が濃く（より低いL）及び黄色がより少ない（より低いb）麺を生成したが、これらはともに消費者により望まれない特徴であるとみなされた。ＳＳＩＩ−Ａｂヌル対立遺伝子を有するこれらの２つの適応していない親は、Ｍｏｕｎｔｒａｉｌよりも硬さが低い麺を生成した。
仁重量は、両方の交雑種において穀粒固さと反比例し、ＩＧ８６３０４交雑種についてセモリナ収率及び麺硬さと正比例した（表３）。穀粒タンパク質は、両方の交雑種においてセモリナ収率及びＦＳＰと負に相関した。小麦粉膨潤度は、ＩＧ８６３０４交雑種についていずれの麺品質形質（損失、調理重量又は硬さ）とも統計的に関係しなかったが、ＰＩ３３０５４６交雑種において、ＦＳＰは麺硬さと負に相関したが、調理重量と正に相関し、このことは、ＦＳＰが下がるにつれて、麺は、より硬く、より重かったことを意味した。３つの麺品質形質、すなわち麺硬さ、損失及び調理重量は、高度に相互関係し（表３）、損失及び調理重量は、硬さ及び調理重量と負に相関し、調理重量と損失は正に相関した。これらの関係は、２つの交雑種間で一貫していた。
Figure 2015532124
Figure 2015532124
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ＦＳＰと麺硬さとの間の関係も調べて、この関係がＳＳＩＩａ−Ａ対立遺伝子クラス間で異なるかを決定した（図２）。ＦＳＰ 対 麺硬さの関係は、ＰＩ３３０５４６交雑種について均質である（傾きが異ならない）（P=0.82）。２つのＳＳＩＩａ−Ａクラスについての応答も、ＩＧ８６３０４交雑種について異ならなかった（P=0.28）。両方のＳＳＩＩａ−ＡクラスについてのＦＳＰ 対 麺硬さについての応答方程式は、ＰＩ３３０５４６交雑種についてｙ＝１０．９１６−０．０８７ｘ±０．０２１（r2=0.28）及びＩＧ８６３０４交雑種についてｙ＝１０．０１０−０．０３９ｘ±０．０２８（r2=0.06）であった。
小麦粉膨潤度は、分離型個体群におけるアミロース含量の間接的な尺度として測定する。小麦粉膨潤試験は、デンプン糊化中の水の取り込みを測定する。アミロースと比較してアミロペクチンの水吸収が増加するので（Tester及びMorrison、1990）、小麦粉膨潤とアミロース含量とは、反比例の関係である（Crosbieら、1992）。例えばＭａｒｔｉｎら（２００４）は、アミロース含量と小麦粉膨潤度との間に、パンコムギ組換え近交系個体群においてｒ＝−０．５７、及びパンコムギ栽培変種の調査においてｒ＝−０．８５の負の相関を見出した。結果は、ＳＳＩＩａ−Ａｂクラスが、両方の交雑種においてＳＳＩＩａ−Ａａクラスよりも低い膨潤度を有したことを示した（表Ｉ）。アミロースは、この研究において決定しなかった。Ｈｏｇｇら（２０１２）は、Ｍｏｕｎｔｒａｉｌ／ＰＩ３３０５４６交雑種からの無作為ＳＳＩＩａ−Ａａ及びＳＳＩＩａ−Ａｂヌル系統から、示差走査熱量分析を用いてアミロースを決定した。彼らは、アミロース含量が、ＳＳＩＩａ−Ａｂヌルについて３９．２２％であるのに対してＳＳＩＩａ−Ａａ野生型について３８．０２％であるが、この差は統計学的に異ならないことを見出した（P<0.05）。彼らは、ピークアミロペクチン糊化温度が、ＳＳＩＩａ−Ａｂヌル遺伝子型について著しく低減されたことを見出した。
ＳＳＩＩａ−Ａｂ対立遺伝子は、ＩＧ８６３０４交雑種においてＳＳＩＩａ−Ａａ対立遺伝子と比較してより低い仁重量と、より固い仁とをもたらした（表Ｉ）。仁重量は、両方の交雑種において穀粒固さと負に相関し、このことは、より小さい仁がより固い傾向にあることを意味した（表ＩＩＩ）。２つの交雑種間で仁重量及び穀粒固さについての結果が異なる理由は明らかでない。ＩＧ８６３０４及びＰＩ３３０５４６の親は、同様の仁重量を有し、これらはともにＭｏｕｎｔｒａｉｌの親よりも著しく少なかった。ＰＩ３３０５４６交雑種は、ＳＳＩＩａ−Ａｂ１クラスの麺が、ＳＳＩＩ−Ａａの対応物よりも硬かったことを示した（表ＩＩ）。しかし、ＩＧ８６３０４交雑種について対立遺伝子クラス間に麺の硬さの差はなかったが、これらの交雑種はともに、対立遺伝子クラス間で小麦粉膨潤が著しく異なった。ＦＳＰ対麺硬さの関係がＳＳＩＩａ−Ａクラス間で異なることは検出できなかったが、ＩＧ８６３０４交雑種についてのＳＳＩＩａ−Ａｂクラスは、ＳＳＩＩａ−Ａａクラス及びＰＩ３３０５４６交雑種からの２つの対立遺伝子クラスとは異なって応答すると見られる（図２）。ある可能性のある説明は、ＩＧ８６３０４交雑種についてＳＳＩＩａ−Ａｂヌルクラスにおける系統の数が少ない（１０）ことに起因するサンプリング変動であり得る。デンプン特徴の他に、小麦粉タンパク質は、麺テクスチャに影響し得る。パンコムギにおいて、小麦粉タンパク質の増加は、より硬い麺類を導く（Martinら、2010）。タンパク質含量は、２つの交雑種間の応答の差の因子であるようには見られない。なぜなら、タンパク質含量は、両方の交雑種について対立遺伝子クラス間でほぼ同じであったからである。
ＳＳＩＩａ−Ａ対立遺伝子の差は、麺の質のその他の変化と関連しなかった。このことは、適応された栽培変種へのＳＳＩＩａ−Ａｂヌル対立遺伝子の組み込みが、麺の質に対して有害な影響を有さないことを示す。ＳＳＩＩａ−Ａｂヌル対立遺伝子の１つの可能性のある利点は、ＰＩ３３０５４６において観察されたＳＳＩＩａ−Ａｂ対立遺伝子からの麺硬さの増加が、加熱過多に対する抵抗性の増加を与え得ることである。消費者は、より硬く、加熱過多に対してより抵抗性が高い製品（麺類又はパスタ）を好むと考えられる。
実施例２
デンプン合成酵素ＩＩの突然変異誘発による高アミロースデュラムコムギの作出
穀類種子におけるデンプンの型は、様々なデンプン合成酵素により制御される。顆粒結合型デンプン合成酵素Ｉ「モチ様」は、アミロース生合成を制御し、多数の可溶性デンプン合成酵素は、アミロペクチン生合成に関与する。１又は複数の顆粒非結合型又は「可溶性」デンプン合成酵素における変異は、アミロペクチンの減少及びアミロース含量の増加を導く。アミロースの増加は、次いで、重要である。なぜなら、これは、グリセミック指数を低くし、デュラム（Triticum durum）パスタの質を、硬さを増加することにより増加できるからである。ここで、我々は、デュラムデンプンに対するデンプン合成酵素ＩＩａ（SSIIa又はSGP-1）変異の影響を決定することを計画した。実施例１に記載したように、デュラム受託物のスクリーニングにより、ＳＧＰ−１のＡゲノムコピーであるＳＧＰ−Ａ１を欠く２つの系統が同定された。これら２つの系統は、同じＳＧＰ−Ａ１変異、すなわち２９ｂｐの欠失を第１エキソン中に保有すると決定された。ＳＧＰ−Ａ１ヌルをそれぞれ、デュラム品種「Ｍｏｕｎｔｒａｉｌ」と交配させ、Ｆ５由来ＳＧＰ−Ａ１ヌル後代系統をＥＭＳで処理した。各ＥＭＳ個体群から、ミスセンス変異をそれぞれ有する１つのＳＧＰ−Ｂ１ヌル変異を回収した。ＳＧＰ−１ ２重ヌルのそれぞれは、アミロース含量が大きく増加し、ＳＧＰ−２及びＳＧＰ−３とデンプン粒内部との結合が低減することが見出された。ＲＮＡ−Ｓｅｑを用いて、ＳＧＰ−１の喪失が他のデンプン生合成遺伝子に与える影響を調べた。いくつかのデンプン生合成遺伝子の転写産物レベルの著しい増加が、Ｍｏｕｎｔｒａｉｌと比較してＳＧＰ−１ ２重ヌルにおいて観察された。結果として得られた高アミロースデュラムは、硬さが増加しグリセミック指数が低減するという付加価値のあるパスタの作出において有用であると見出される可能性がある。
材料及び方法
突然変異デュラムコムギ個体群の作出及びスクリーニング
ＵＳＤＡ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｍａｌｌ Ｇｒａｉｎｓ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（NSGC、Aberdeen、ID）及びＩＣＡＲＤＡから得たデュラムコムギ受託物を、ＳＧＰ−Ａ１及び／又はＳＧＰ−Ｂ１についてヌルのものについて、デンプン粒結合タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（以下を参照されたい）を用いてスクリーニングした。スクリーニングした２００のＮＳＧＣ Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ｄｕｒｕｍコア収集受託物からは、１つの系統、すなわちＰＩ−３３０５４６がＳＧＰ−Ａ１を欠き、ＳＧＰ−Ｂ１を欠くものはなかった。スクリーニングした５５のＩＣＡＲＤＡ Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ｄｕｒｕｍ受託物からは、１つの系統、すなわちＩＧ−８６３０４がＳＧＰ−Ａ１を欠き、ＳＧＰ−Ｂ１を欠くものはなかった。これら２つの系統を、栽培変種「Ｍｏｕｎｔｒａｉｌ」（PVP 9900266）と独立して交配させ（Elias及びMiller、2000）、単粒系統法によりＦ５世代に進めた。各交雑種からのＭｏｕｎｔｒａｉｌと同様の種子及び植物の特徴を有するＳＧＰ−Ａ１ヌル形質についてホモ接合性の系統を、次いで、ＥＭＳ ０．５％を用い、植物をＭ１：Ｍ２世代まで温室中で２世代進めた以外はＦｅｉｚら（２００９）に記載されるようにしてエチルメタンスルホン酸（EMS）で処理した。２９４のＭｏｕｎｔｒａｉｌ／ＰＩ−３３０５４６ Ｍ１系統及び１９６のＭｏｕｎｔｒａｉｌ／ＩＧ−８６３０４ Ｍ１系統からの種子を、可能性のあるＳＳＩＩａ−Ｂ変異について、小麦粉膨潤度試験を用いて予備スクリーニングした。各系統について、単一の穂先からの４つの種子を、Ｂｒａｕｎコーヒーミル（Proctor Gamble、Cincinnati、OH）中で１０秒間粉砕し、次いで、２ｍｌの微量遠心管に、６．５ｍｍのイットリア安定化ジルコニアセラミックボール２つ（Stanford Materials、Irvine、CA）とともに入れ、３０秒間、ミニ−ビーズビーター−９６（Biospec Products、Bartlesville、OK）中で、振動距離３．２ｃｍ及び振とう速度３６回の振動／秒で撹拌した。次に、全粒小麦粉３０ｍｇを２ｍｌチューブに秤量し、ｄｄＨ２Ｏ １．５ｍｌを加えた。試料をＴｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ（登録商標）（Eppendorf、Hamburg、Germany）で、８００ｒｐｍで連続的に混合しながら３０分間、９２℃にて加熱した。試料を次いで室温にて２分間冷却した後に、４℃／１，０００ｇにて１０分間遠心分離を行い、その後、水を吸引して除いた。チューブを再秤量し、小麦粉膨潤度を、最終小麦粉重量を初期小麦粉重量で除すことにより算出した。
デンプン抽出
それぞれの選択した低ＦＳＰ遺伝子型と、親対照とについて、４つの種子を、Ｂｒａｕｎコーヒーミル（Proctor Gamble、Cincinnati、OH）中で１０秒間粉砕し、次いで、２ｍｌの微量遠心管に、６．５ｍｍのジルコニアボール２つとともに入れ、３０秒間、ミニ−ビーズビーター−９６中で撹拌した。ジルコニアボールを微量遠心管から取り除き、０．１Ｍ ＮａＣｌ １．０ｍｌを全穀粒小麦粉に加え、これを次いで放置して室温にて３０分間浸した。３０分後に、プラスチックのＫｏｎｔｅｓペレットペッスル（Kimble Chase、Vineland、NJ）を用いて湿潤小麦粉を混合することにより生地のボールを作り、デンプンを圧搾した後にこのグルテンボールを試料から取り除いた。液体デンプン懸濁物を、次いで、予め秤量した新しい２．０ｍｌチューブに入れ、ｄｄＨ２Ｏ ０．５ｍｌを最初のチューブ中の残存デンプンペレットに加えた。最初のチューブをボルテックスし、１分間放置して落ち着かせ、液体デンプン懸濁物を第２のチューブに移した。デンプン懸濁物含有チューブを５，０００ｇにて遠心分離し、液体を吸引して除いた。次に、ＳＤＳ抽出緩衝液（55 mM Tris-Cl pH 6.8、2.3% SDS、5% BME、10%グリセロール）０．５ｍｌを加え、懸濁されるまで試料をボルテックスし、次いで５，０００ｇで遠心分離した。ＳＤＳ緩衝液を吸引して除き、ＳＤＳ緩衝液抽出をもう１度繰り返した。次に、８０％ＣｓＣｌ ０．５ｍｌをデンプンペレットに加え、懸濁されるまで試料をボルテックスし、７，５００ｇで遠心分離した。ＣｓＣｌを吸引して除き、１０，０００ｇの遠心分離速度を用いてｄｄＨ２Ｏ ０．５ｍｌで２回及びアセトンで１回デンプンペレットを洗浄した。上清の吸引の後に、デンプンペレットを１晩、ドラフト中で放置して乾燥させた。
デンプン粒タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ
デンプンを精製するために、ＳＤＳローディング緩衝液（SDS抽出緩衝液とブロモフェノールブルー）７．５μｌをデンプン１ミリグラムあたり加えた。試料を１５分間、７０℃にて加熱し、１０，０００ｇにて１分間遠心分離し、次いで、３０％アクリルアミド／０．８％ピペラジンジアクリルアミドｗ／ｖストック溶液を用いて調製した１０％（w/v）アクリルアミドゲルに試料４０μｌをロードした。ゲルは、３０％アクリルアミド／０．８％ピペラジンジアクリルアミドｗ／ｖストック溶液を用いて調製した標準的な４％ｗ／ｖアクリルアミドスタッキングゲルを有した。ゲルを泳動し（25 mA/ゲルで45分間、次いで35 mA/ゲルで3時間）、標準的な手順に従って銀染色し、デジタルカメラを用いてライトボックス上で写真撮影した。
ＳＳＩＩａ−Ａ及びＳＳＩＩａ−Ｂ中の変異についてのＰＣＲスクリーニング。
ｓｓＩＩａ−Ｂ変異を有することが疑われるＭ２植物及び親系統からの葉組織を、Ｆｅｅｋｅｓ成長段階１．３にて回収し、−８０℃にて貯蔵し、ＤＮＡを、Ｒｉｅｄｅ及びＡｎｄｅｒｓｏｎ（１９９６）に従って抽出した。以前に記載されたプライマー及びＰＣＲ条件（Chibbarら、2005、Shimbataら、2005、Sestiliら、2010a）を用いて、２重のＤＮＡ試料からのＳＳＩＩａ−Ａ及びＳＳＩＩａ−Ｂのコード領域を増幅した。アンプリコンを、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ Ｂｅｒｋｅｌｅｙ配列決定施設にて配列決定し、得られたＤＮＡ配列を、１ヌクレオチド多型について、Ｌａｓｅｒｇｅｎｅ １０．１ Ｓｕｉｔｅ（DNASTAR、Madison、WI）中のＳｅｑｍａｎ Ｐｒｏを用いて分析した。見出された２つのデュラム高アミロース（DHA）ＳＧＰ−１ ２重変異体は、Ｍｏｕｎｔｒａｉｌ／ＰＩ−３３０５４６交雑種からのＤＨＡ１７５と、Ｍｏｕｎｔｒａｉｌ／ＩＧ−８６３０４交雑種からのＤＨＡ５５であった。
示差走査熱量分析
Ｍｏｕｎｔｒａｉｌについて、Ｈａｎｓｅｎら（２０１０）に記載される方法に従って、Ｐｙｒｉｓ ７ Ｄｉａｍｏｎｄ ＤＳＣ（Perkin Elmer、Norwalk CT、USA）を用いてＭｏｕｎｔｒａｉｌ／ＰＩ３３０５４６（SGP-A1ヌル）、ＤＨＡ１７５及びＤＨＡ５５の示差走査熱量分析（DSC）を行った。各遺伝子型について、３つの生物学的反復を３重で実験した。試料あたりデンプンおよそ１０ｍｇ（実際の重量を記録した）を、ｄｄＨ２Ｏ ５５μＬとともに高圧ステンレス鋼のパンに入れた。パンをＯリングで密閉して覆い、デンプンを放置して室温にて１晩水和させた。試料を次の日に再秤量し、次いで２５℃に２分間置いて平衡化した後に、１２０℃まで１０℃／分にて加熱した。試料中の熱伝導を、参照としての空のステンレス鋼のパンと比較した。Ｐｙｒｉｓソフトウェアを用いてサーモグラムを作製し、遷移温度及び物理的遷移熱を算出した。アミロースは、Ｐｏｌａｓｋｅら（２００５）に記載される方法を用いてＤＳＣにより決定した。アミロース含量についての統計解析は、ＳＡＳ９．０（SAS Institute、Cary、NC）での０．０５のアルファを用いるＰＲＯＣ ＧＬＭ及びｔ検定を用いて行った。
デンプン粒の顕微鏡分析。
Ｍｏｕｎｔｒａｉｌ、Ｍｏｕｎｔｒａｉｌ／ＰＩ３３０５４６（SGP-A1ヌル）、ＤＨＡ１７５及びＤＨＡ５５からの精製デンプン粒を、試料あたり３つの生物学的反復から、上記の方法を用いて得た。個別のデンプン試料をカーボンテープ上に置き、これを次いでイリジウムでスパッタリングした（20 mAで30秒間）。デンプン粒を次いで観察し、Ｚｅｉｓｓ Ｓｕｐｒａ ５５ＶＰ電界放射電子銃−ＳＥＭ（Carl Zeiss Microscopy、Peabody、MA）を用いて写真撮影した。
ＲＮＡ−Ｓｅｑによるデンプン合成遺伝子発現解析
デンプン合成遺伝子の発現レベルを解析するために、開花１４日後の発達中の種子を、Ｍｏｕｎｔｒａｉｌ、ＤＨＡ５５及びＤＨＡ１７５から回収し、−８０℃にて貯蔵した。各遺伝子型について、発達中の種子を３つの別々の植物から回収し、各植物試料は、３つの異なる下穂の中間部からの４つの種子（合計12の種子）で構成された。種子を、次いで、予め冷却した乳鉢と乳棒で、液体Ｎ２中で微細粉末に粉砕した。過剰のデンプンを除去するために各試料をまず予備抽出した後に、トータルＲＮＡを未熟仁からＲＮｅａｓｙ植物ミニキット（Qiagen、Valencia、CA）を用いて抽出した。このことを達成するために、種子粉末１００ｍｇを、予め冷却した１．５ｍＬチューブに移し、ＲＮＡ抽出緩衝液（100 mM Tris pH 8.0、150mM LiCl、50 mM EDTA、1.5%（w/v）SDS、0.15%（v/v）BME）０．５ｍＬを加え、均質になるまでボルテックスした。次に、１：１（v/v）フェノール−クロロホルム（pH 4.7）０．２５ｍＬを加え、試料を逆さまにして混合した後に、１３，０００×ｇにて１５分間、室温にて遠心分離した。上清をＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒスピンカラムに移し、トータルＲＮＡを製造者の使用説明に従って抽出した。トータルＲＮＡを定量し、その質をＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Agilent Technologies、Santa Clara、CA）を用いて評価した。ＲＮＡ−Ｓｅｑ分析のために、トータルＲＮＡ １μｇを、製造者の使用説明に従ってＴｒｕＳｅｑ ＲＮＡ−Ｓｅｑライブラリーキット（Illumina、San Diego、CA）を用いてｃＤＮＡライブラリーを作出するために用いた。ｃＤＮＡライブラリーからのアンプリコンを、ＬｉｆｅＴｅｃｈ ＳＯＬｉＤ ５５００ｘｌ（Life Technologies、Carlsbad、CA）を用いて単一５０ｂｐ読み取りとして配列決定した。ＲＮＡ−Ｓｅｑデータを、ＡｒｒａｙＳｔａｒ ｖ５．０（DNASTAR、Madison、WI）中のＱ−Ｓｅｑを用いて分析した。対象の遺伝子は、マー最小化をオフにして少なくとも４０ｂｐについて１００％に設定したＱＳｅｑでのマッチ設定を用いる分析のために、ＮＣＢＩデータベースから選択した。全てのその他の設定はデフォルトのままにし、配列は、１百万のマッピングされた読み取りあたりのエキソンモデル１キロベースあたりの読み取り（Reads Per Kilobase of exon model per Million mapped reads）（RPKM）法を用いて標準化した。得られた線形計数を、次いで、ハウスキーピング遺伝子グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（Ga3pd）の発現レベルに対してさらに標準化した。スチューデントのｔ検定を用いて、Ｍｏｕｎｔｒａｉｌと、２つのｓｓＩＩａヌル遺伝子型ＤＨＡ５５及びＤＨＡ１７５との間の発現レベルを比較した。
結果
ＥＭＳ変異誘発デュラム系統のスクリーニング
Ｍｏｕｎｔｒａｉｌ／ＰＩ−３３０５４６及びＭｏｕｎｔｒａｉｌ／ＩＧ−８６３０４ Ｍ１系統からの種子を、ＳＳＩＩａ−Ｂ中の変異について、小麦粉膨潤度試験を用いて間接的にスクリーニングした（表４）。小麦粉膨潤度が６．５未満の系統を、ＳＧＰのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析のために選択した。Ｍｏｕｎｔｒａｉｌ／ＰＩ−３３０５４６交雑種からの１つの系統ＤＨＡ１７５は、ＳＧＰ−Ａ１／Ｂ１、ＳＧＰ−２及びＳＧＰ−３を欠き、Ｍｏｕｎｔｒａｉｌ／ＩＧ−８６３０４交雑種からの系統ＤＨＡ５５は、Ｍｏｕｎｔｒａｉｌ／ＩＧ−８６３０４（野生型）対照の強度のほぼ半分のＳＧＰ−Ｂ１バンドを有し（データは示さず）、このことは、ヘテロ接合体の可能性を示した。この系統をさらに１世代（M2:M3）成長させた後に、これは、個別の植物からのＳＧＰのヘテロ接合体であることがＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて確認された。Ｍｏｕｎｔｒａｉｌ／ＰＩ−３３０５４６（野生型）、Ｍｏｕｎｔｒａｉｌ／ＰＩ−３３０５４６（SGP-A1ヌル）、ＤＨＡ１７５及びホモ接合性ＳＧＰ−１ ２重ヌルＤＨＡ５５からのデンプン粒タンパク質を、次いで、系列希釈を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析して、他のＳＧＰの結合に対するＳＧＰ−１ ２重ヌルの影響を調べた（図３）。ＤＨＡ１７５及びＤＨＡ５５ではともに、ＳＧＰ−Ａ１及びＳＧＰ−Ｂ１バンドは完全になくし、ＳＧＰ−２及びＳＧＰ−３バンドは、野生型対照のロードの０．０６２５×未満の強度を有した。ＷＸバンドは、両方のＳＧＰ−１ ２重ヌル系統において通常であると見られた。ＳＧＰ−Ａ１ヌル対照では、ＳＧＰバンドはいずれも、野生型対照と比較して変化しているように見られなかった。
Figure 2015532124
ＳＳＩＩａ−Ａ及びＳＳＩＩａ−Ｂ中の変異についてのＰＣＲスクリーニング。
親のＳＧＰ−Ａ１ヌル系統ＰＩ−３３０５４６及びＩＧ−８６３０４において、２９ｂｐの欠失が、プライマーセットＳｇｐ−Ａ１Ｆ３／Ｓｇｐ−Ａ１Ｒ３（Shimbataら、2005）を用いて第１エキソン中に１４５〜１７４位において見出された。系統ＤＨＡ１７５では、ＳＳＩＩａ−Ｂ中の点変異が第３エキソン中で９７９位において見出され、ここでは、プライマーセットＳｇｐ−Ｂ１Ｆ１／Ｓｇｐ−Ｂ１Ｒ１（Sestiliら、2010a）を用いて、Ｇ／ＣからＡ／Ｔへの移行が生じていた。これは、３２７番目のアミノ酸をアスパラギン酸（GAT）からアスパラギン（AAT）に変化させた。系統ＤＨＡ５５では、点変異が、プライマーセットＳｇｐ−Ｂ１Ｆ２／Ｓｇｐ−Ｂ１Ｒ２（Shimbataら、2005）を用いて、ＳＳＩＩａ−Ｂにおいて第８エキソン中で１，８６４位に見出された。これも、アミノ酸６２２においてアスパラギン酸（GAC）からアスパラギン（AAC）への変化をもたらすＧ／ＣからＡ／Ｔへの移行であった。
顕微鏡分析
代表的で偏りのないデンプン粒画像を試みて得るために、各デンプン試料のいくつかの画像を様々な拡大レベルで得た。Ｍｏｕｎｔｒａｉｌ／ＰＩ−３３０５４６（野生型）系統では、より大きいＡ型顆粒は、平滑でレンズ形であり、より小さいＢ型顆粒は、球状で平滑であった（図４）。Ｍｏｕｎｔｒａｉｌ／ＰＩ−３３０５４６（SGP-A1ヌル）系統では、Ａ型デンプン粒は、広い範囲の小さい変形を有したが、平滑さとサイズを維持していると見られた。ＳＧＰ−Ａ１ヌル系統におけるＢ型顆粒は、野生型試料で観察されたものと同様であった（図４）。ＳＧＰ−１ ２重ヌル系統であるＤＨＡ１７５及びＤＨＡ５５では、Ａ型顆粒は変形し、野生型及びＳＧＰ−Ａ１ヌル試料よりもほっそりし、ざらざら又は割れた表面を有した（図４）。デンプン粒計数は行わなかったが、ＳＧＰ−１ ２重ヌル系統は、Ｂ型顆粒の数が少なかったと見られ、Ｂ型顆粒も変形し、へこんだ外観を有した。
示差走査熱量分析
ＳＧＰ−１ ２重ヌル及び対照デンプンの糊化特性及びアミロース含量を、ＤＳＣを用いて調べた。組み合わせた熱走査サーモグラムは、６０℃付近にて観察される第１ピークで表される、ＳＧＰ−１ ２重ヌル系統におけるアミロペクチンの糊化の明確な変化があることを示す（図５）。ＳＧＰ−１ ２重ヌル系統は、野生型コムギ系統から変化した糊化特性を有した。ＳＧＰ−１ ２重ヌル系統は、ピーク高さに基づく著しくより低い糊化温度と、エンタルピーの劇的により小さい変化とを有した（図５、表５）。これらのデータは、アミロペクチン合成の破壊を示す。アミロース糊化と関連する１０５℃付近の第２ピークは、対照と比較してより低い糊化温度及びエンタルピーのより大きい変化を有するＳＧＰ−１ ２重ヌル系統と全ての試料にわたって形状及びサイズが類似していた（図５、表５）。ＳＧＰ−Ａ１ヌル系統におけるアミロース含量は、野生型対照と比較して変化しなかったが、ＳＧＰ−１ ２重ヌル系統は、著しくより高いアミロース含量を有した（表５）。系統ＤＨＡ１７５では、４１．１％のアミロースの増加があり、ＤＨＡ５５について２８．６％の増加があった。
Figure 2015532124
ＲＮＡ−Ｓｅｑを用いるデンプン合成遺伝子発現解析
ＳＧＰ−１ ２重ヌル系統におけるデンプン合成に関与する遺伝子のＲＮＡ発現レベルを見るために、ＲＮＡ−Ｓｅｑを採用した。２つのＳＧＰ−１ ２重ヌル系統からのデータを組み合わせ、Ｍｏｕｎｔｒａｉｌ（SGP-1野生型）と比較した場合に、転写産物レベルが著しく変化したデンプン合成遺伝子がいくつかあった（表６）。ＤＨＡ１７５及びＤＨＡ５５の両方においてＳＳＩＩａ−Ａに存在する欠失は、ＳＳＩＩａ−Ａ転写産物の劇的な低減を引き起こした（表６）。ＳＳＩＩａ−Ａ及びＳｓＩＩａ−Ｂ遺伝子の高い相同性のために、ＳＳＩＩａ−Ａについて検出された少数のヒットは、２つの遺伝子が１００％同一である領域から生じたと考えられる。この可能性を評価するために、ＳＳＩＩａ−ＡヒットをＳＳＩＩａ−Ａ遺伝子（Genbank:AJ269503）と、Ｓｅｑｍａｎ ＮＧＥＮ（DNASTAR、Madison、WI）を用いて整列させた。実質的に全ての４０〜５０ｂｐヒットが、２つのアイソフォーム間に塩基対の差が存在する遺伝子のセグメントと整列され、このことは、これらがＳＳＩＩａ−Ａ転写産物からの断片であり、ＳＳＩＩａ−Ｂ転写産物の断片ではないことを示した（データは示さず）。ＳＳＩＩａ−Ｂ中の２つの独立した点変異は、ＳＳＩＩａ−Ａ中の欠失と同じ効果を生じなかったが、対照的に、ＳＳＩＩａ−Ｂの著しい上方制御があった（表６）。転写産物の著しい上方制御は、デンプン合成遺伝子Ｗｘ−Ａ１、ＳｓＩ−１、Ｓｂｅｌ−Ａ、ＳｂｅＩＩａ−Ａ、ＳｂｅＩＩａ−Ｂ、ＳＳＩＩＩ、ＡＧＰアーゼの大サブユニット及びＰｈｏ１についても示された。試料はいずれも、選択したグルテニン遺伝子、又はＣｙｐ３を除くいずれのハウスキーピング遺伝子についても転写産物レベルの著しい差を示さなかった（表６）。
Figure 2015532124
考察
我々の目標は、ＳＳＩＩａ（SGP-1）の突然変異誘発により高アミロースデュラム系統を開発することであった。これは重要なデンプン生合成酵素であるので、この遺伝子座には自然の変動はほとんどなく、２５５のＴｒｉｔｉｃｕｍ ｄｕｒｕｍ受託物のスクリーニング後に、我々は、ＳＧＰ−Ａ１ヌルであった系統を２つだけ発見し、ＳＧＰ−Ｂ１ヌルであったものはなかった。興味深いことに、ＳＧＰ−Ａ１ヌルであった２つの系統ＰＩ−３３０５４６及びＩＧ−８６３０４は、第１エキソン中に同じ２９ｂｐの欠失を有した。２つのＳＧＰ−１ ２重ヌル系統においてその転写産物レベルの著しい低減があったので、この欠失は、不安定なｍＲＮＡを生じると見られる。これは、Ｓｈｉｍｂａｔａら（２００５）により報告されたパンコムギにおけるＳＧＰ−Ａ１変異体についてと同じ欠失でない（Yamamori及びEndo 1996）。ＥＭＳ突然変異誘発によりＳＳＩＩａ−Ｂにおいて作出された２つの別々の点変異は、同じ効果を生じなかった。実際に、ＳＳＩＩａ−Ｂの発現は、栽培変種Ｍｏｕｎｔｒａｉｌと比較してＳＧＰ−１ ２重ヌル系統において著しくより高かった。ＳＳＩＩａ−Ｂにおける点変異のいずれも停止コドンを導入しなかったが、アスパラギン酸からアスパラギンへのもたらされたアミノ酸の変化（DHA175において327及びDHA55において622）は、酵素の安定性に明らかに影響した。これらのアミノ酸が、酵素活性のために重要であるのか、又はタンパク質の折り畳みに影響するのかはわからない。
我々の以前の研究で示したように、いくつかの多面的効果がＳＳＩＩ又はＳＧＰ−１の喪失の結果として観察された。ここで、我々は、ＳＧＰ−１ ２重ヌル系統のアミロース含量が３８％から５０％まで（＋１２％）著しく増加したことを証明する。２つのＳＧＰ−１ ２重ヌル系統は、エンタルピーの減少と糊化温度の低減とを特徴とするＳＧＰ−Ａ１ヌル及び野生型とは非常に異なるアミロペクチン糊化ピークを有した（図５、表５）。系統ＤＨＡ５５では、アミロペクチン糊化についてのピークは、小さすぎてほぼ区別できなかった。したがって、ＳＧＰ−１ ２重ヌル系統は、より低い小麦粉膨潤度も有した（表４）。これらの結果は、アミロペクチン合成の破壊の証拠である。ＳＧＰ−１ ２重ヌルからの両方の型のデンプン粒は変形し、ざらざら又は割れた表面を有した。統計的に決定していないが、我々は、デュラムＳＧＰ−１ ２重ヌル系統においてＢ型デンプン粒の量の全体的な減少を観察した。デンプン粒の内部からの他のデンプン生合成酵素、すなわちＳＢＥＩＩ（SGP-2）及びＳＳＩ（SGP-3）のほぼ完全な喪失もあったが、ＧＢＳＳＩは手をつけられないままであった。デンプン粒中に存在するこれらのタンパク質の喪失は、しかし、これらのタンパク質が生成されなかったことを意味しなかった。胚乳の可溶性画分中で、ＳＢＥＩＩ、ＳＳＩ及びＧＢＳＳＩが通常レベルで蓄積されることが示されている（Kosar-Hashemiら、2007、Morellら、2003）。他のデンプン生合成酵素とともにＳＳ、ＳＢＥがコムギアミロプラスト中で複合体で作用し、これらの酵素の一方が破壊された場合に、他の酵素に対して著しい影響を有すると仮定されている（Tetlowら、2004a）。ＳＧＰ−１ ２重ヌル系統では、このことは、デンプン粒マトリクス中のＳＳＩ及びＳＢＥＩＩの捕捉の欠如として現れる。Ｔｅｔｌｏｗら（2008）は、パンコムギにおいて、リン酸化により制御されるデンプン沈着中にＳＢＥＩＩ、ＳＳＩ及びＳＳＩＩａが相互作用して複合体を形成することを証明した。ＳＳＩＩの喪失は、この複合体の形成、次いで、長鎖アミロペクチン形成とＳＢＥＩＩ及びＳＳＩの捕捉とを制限する可能性がある。
ＲＮＡ−Ｓｅｑを用いてＳＧＰ−１ ２重ヌル系統におけるデンプン合成に関与する遺伝子の転写産物レベルを分析して、デンプン合成遺伝子発現に実際に負の影響はなかったが、いくらかの場合では上方制御があった。Ｗｘ−Ａ１、ＳｓＩ−１、ＳｂｅＩ−Ａ、ＳｂｅＩＩａ−Ａ、ＳｂｅＩＩａ−Ｂ、ＳＳＩＩＩ、ＡｇｐＬ（AGPアーゼの大サブユニット）及びＰｈｏ１（アルファ-1,4-グルカンホスホリラーゼ）について、ＳＧＰ−１ ２重ヌル系統においてこれらの遺伝子の転写産物レベルは著しく増加した。一般的に、デンプン生合成遺伝子は、ＳＧＰ−１ ２重ヌル系統での発現が上向きの傾向があった。重要な酵素の削除の後のデンプン生合成遺伝子の上方制御も、ＳｂｅＩＩａがＲＮＡｉを用いてサイレンシングされたパンコムギで観察された（Sestiliら、2010b）。ｑＲＴ−ＰＣＴを用いて、Ｓｅｓｔｉｌｉら（2010b）は、Ｗｘ−１、ＳＳＩＩＩ、Ｉｓｏ１及びＬｄ１転写産物の増加を見たが、ＳｓＩ、ＳＳＩＩａ、ＳｂｅＩＩｂ又はＳｂｅＩについて増加を見なかった。デュラムＳＧＰ−１ ２重ヌル系統における転写産物に関係するデンプン合成の増加は、Ｓｅｓｔｉｌｉら（2010b）により観察されるものよりもかなり穏やかであり、用いた方法が異なることによる可能性がある。定量ＲＴ−ＰＣＲ発現データは、倍数変化による相対的な違いを表すが、ＲＮＡ−ｓｅｑは、転写産物数のより精密な評価をもたらす。重要な遺伝子の１つが変異又はその他の手段によりスイッチオフされる場合にデンプン生合成遺伝子が上方制御されるこの現象は、まだ完全に説明されていない。デンプン合成遺伝子の発現を制御する負のフィードバックがあり、ＳＳＩＩの欠如がこれらの遺伝子が上方制御されることを引き起こすということである可能性がある。パンコムギ（Yamamoriら、2000）及びオオムギ（Morellら、2003）におけるＳＧＰ−１変異体では、ほとんどのデンプン合成遺伝子のこの上方制御に鑑みて奇妙に見えるデンプン含量の著しい減少があったことが注目された。しかし、これらの酵素が調和して作用することがわかっているので、これらの複合体が正しく形成されない場合に最大デンプン含量が達成できないと仮定することが妥当である。
本明細書で示す２つのデュラムＳＧＰ−１ ２重変異体系統の高アミロース含量、糊化特性の変更及び小麦粉膨潤度の減少に鑑みて、それらの最終使用の質に対する著しい影響があると仮定することが妥当である。Ｍｏｕｎｔｒａｉｌ ＰＩ−３３０３８ Ｆ５及びＭｏｕｎｔｒａｉｌ／ＩＧ−８８９０５ Ｆ５個体群から麺を作製した実験では、ＳＧＰ−Ａ１ヌル形質と関連して麺硬さが増加した。ＳＰＧ−１ ２重ヌル系統は、ＳＧＰ−Ａ１ヌル系統のアミロース含量が野生型と同様であるので、より重大な影響を生じるはずである。麺硬さの増加とともに、これらの系統が健康上の利益も有する可能性がある。ヒト及び動物の両方の試験では、難消化性デンプンが増加した高アミロースパンコムギ及びオオムギは、全体的な結腸の健康を増加し（Birdら、2008; Reginaら、2006）、より低いグリセミック指数を生じる（Halstromら、2011: Kingら、2008）ことが示された。
実施例３
デンプンが改変されたデュラムコムギ植物を用いるコムギ育種プログラム
コムギ育種についての非限定的な方法及び農業上重要な形質（例えばコムギ収率、生物ストレス抵抗性及び無生物ストレス抵抗性の改善など）は、Ｓｌａｆｅｒ及びＡｒａｕｓ、２００７（「Physiological traits for improving wheat yield under a wide range of conditions」、Scale and Complexity in Plant Systems Research: Gene-Plant-Crop Relations、147-156）；Ｒｅｙｎｏｌｄｓ（「Physiological approaches to wheat breeding」、Agriculture and Consumer Protection. Food and Agriculture Organization of the United Nations）；Ｒｉｃｈａｒｄら（「Physiological Traits to Improve the Yield of Rainfed Wheat: Can Molecular Genetics Help」、International Maize and Wheat Improvement Center出版）；Ｒｅｙｎｏｌｄｓら（「Evaluating Potential Genetic Gains in Wheat Associated with Stress-Adaptive Trait Expression in Elite Genetic Resources under Drought and Heat Stress Crop science」、Crop Science 2007 47:補遺3: S-172-S-189）；Ｓｅｔｔｅｒら（Review of wheat improvement for waterlogging tolerance in Australia and India: the importance of anaerobiosis and element toxicities associated with different soils. Annals of Botany、103巻（2）: 221-235）；Ｆｏｕｌｋｅｓら（Major Genetic Chan
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改変されたデンプン又は本発明のデンプン合成遺伝子のある種の対立遺伝子を含むデュラムコムギ植物は、自家交配させて、同じ表現型を含む子を得ることができる。
改変されたデンプン又は本発明のデンプン合成遺伝子のある種の対立遺伝子を含むデュラムコムギ植物（「ドナー植物」）は、別の植物（「レシピエント植物」）と交配させて、Ｆ１雑種植物を得ることもできる。いくつかのＦ１雑種植物は、レシピエント植物と１、２、３、４、５、６、７回以上戻し交配させることができる。各戻し交配の後に、種子を収穫し、植え付けて、改変されたデンプン及びレシピエント植物から受け継いだ好ましい形質を含む植物を選択する。このような選択された植物は、レシピエント植物と戻し交配させるための雄性又は雌性のいずれかとして用いることができる。
実施例４
さらなる特徴決定
デンプン含量
ＳＧＰ−１ ２重ヌル系統及び野生型対照デュラムコムギ系統のデンプン含量は、本明細書に記載する１若しくは複数の方法、又はそれぞれが参照によりその全体が組み込まれているＭｏｒｅｅｌｓら（Measurement of Starch Content of Commercial Starches、Starch 39（12）:414-416、1987）若しくはＣｈｉａｎｇら（Measurement of Total and Gelatinized Starch by Glucoamylase and o-toluidine reagent、Cereal Chem. 54（3）:429-435）に記載される方法により測定される。ＳＧＰ−１ ２重ヌル系統におけるデンプン含量は、野生型対照デュラムコムギ系統のものと比較してわずかに低減されることが期待される。
グリセミック指数
ＳＧＰ−１ ２重ヌル系統及び野生型対照デュラムコムギ系統のグリセミック指数は、本明細書に記載する１若しくは複数の方法、又はそれぞれが参照によりその全体が組み込まれているＢｒｏｕｎｓら（Glycemic index methodology、Nutrition Research Reviews、18（1）: 145-171、2005）、Ｗｏｌｅｖｅｒら（The glycemic index: methodology and clinical implications. Am. J. Clin. Nutr. 54（5）: 846-54、1991）又はＧｏｎｉら（A Starch hydrolysis procedure to estimate glycemic index、Human Study、17（3）:427-437、1997）に記載される方法により測定される。
グリセミック指数（glycemic index、glycaemic index）又はＧＩは、炭水化物消費からのグルコース（血糖）レベル増加の尺度である。グルコースは、定義により１００のグリセミック指数を有し、他の食品は、より低いグリセミック指数を有する。デュラムコムギパスタのグリセミック指数は、１２時間の絶食及びＤＨＡ１７５又は野生型パスタの有効炭水化物５０ｇの摂取後の、２時間血糖応答曲線下面積（AUC）の増加を算出することにより測定した。試験食品のＡＵＣを、標準物質のＡＵＣ（グルコース又は白パン、2つの異なる定義を与える）で除し、１００を乗じる。平均ＧＩ値を、５名のヒト対象で回収したデータから算出する。標準及び試験食品は、等量の有効炭水化物を含有しなければならない。
ＤＨＡ１７５ ２重ヌル系統のグリセミック指数は、野生型対照デュラムコムギ系統と比較してより低いことが見出された（図６）。ＤＨＡ１７５パスタを与えられた対照は、野生時間対照デュラムと比較した場合に９０及び１２０分にてより低いグルコースピークとより高い持続グルコースレベルとを示す血漿グルコース曲線も示した（図７）。これらの結果は、ＤＨＡ１７５パスタが、上昇したグルコースレベルをより長い期間維持する、より大きい満腹感をもたらす可能性を有することを示す。この結果は、ＤＨＡ１７５パスタが、消費の後にインスリングルコーススパイクを低減することにより対照デュラムコムギパスタよりも大きい健康上の利益も有し得ることも示唆する。いずれの特定の理論と結び付けられることも望まないが、ＤＨＡ１７５グルコースの持続レベルがより高いことは、ＤＨＡ１７５麺のタンパク質含量がより高いことによる可能性がある。ＤＨＡ１７５パスタを供給された対象におけるグルコースレベルの増加のタイミング（90〜120分）は、アミノ酸から作られるグルコースの増加と一貫している。
パスタの質
ＳＧＰ−１ ２重ヌル系統及び野生型対照デュラムコムギ系統の小麦粉から作られたパスタの質は、本明細書に記載する１若しくは複数の方法、又はそれぞれが参照によりその全体が組み込まれているＬａｎｄｉ（Durum wheat, semolina and pasta quality characteristics for an Italian food company、Cheam-Options Mediterraneennes、33-42頁）又はＣｏｌｅ（Prediction and measurement of pasta quality、International Journal of Food Science and Technology、26（2）: 133-151、1991）に記載される方法により試験される。
パスタ硬さ（固さ、表７）及び加熱過多に対する耐性を測定する。ＳＧＰ−１ ２重ヌル系統において、野生型対照デュラムコムギ系統のものと比較して、パスタ硬さが劇的に増加し、加熱過多が低減することが期待される。
限定されないが以下のもの：（１）小麦粉が製造されるデュラムコムギの原産地のタイプ、（２）小麦粉の特徴、（３）こね、引き延ばし及び乾燥の製造プロセス、（４）可能性のある添加成分並びに（５）保存の衛生状態を含むパスタのその他の品質因子も、パスタの質を評価する場合に考慮できる。
ラピッドビスコアナライザ（RVA）
ＳＧＰ−１ ２重ヌル系統及び野生型対照デュラムコムギ系統のデンプンは、ラピッドビスコアナライザ（RVA）において、本明細書に記載する１若しくは複数の方法、又はそれぞれが参照によりその全体が組み込まれているＮｅｗｐｏｒｔ科学法ＳＴ−００改訂３（General Method for Testing Starch in Rapid Visco Analyzer、1998）、Ｒｏｓｓ（Amylose, amylopectin, and amylase: Wheat in the RVA、Oregon State University、第55回発表、2008）、Ｂａｏら（Starch RVA profile parameters of rice are mainly controlled by Wx gene、Chinese Science Bulletin、44（22）:2047-2051、1999）、Ｒａｖｉら（Use of Rapid Visco Analyzer（RVA）for measuring the pasting characteristics of wheat flour as influenced by additives、Journal of the Science of Food and Agriculture、79（12）: 1571-1576、1999）又はＧａｍｅｌら（Application of the Rapid Visco Analyzer（RVA）as an Effective Rheological Tool for Measurement of β-Glucan Viscosity、89（1）:52-58、2012）に記載される方法により試験される。
ＳＧＰ−１ ２重ヌル系統は、野生型対照デュラムコムギ系統のものと比較してピーク粘度が減少することが期待される。
難消化性デンプン
ＳＧＰ−１ ２重ヌル系統及び野生型対照デュラムコムギ系統の難消化性デンプン含量は、本明細書に記載する１若しくは複数の方法、又はそれぞれが参照によりその全体が組み込まれているＭｃＣｌｅａｒｙら（Measurement of resistant starch、J. AOAC Int. 2002、85（3）:665-675）、Ｍｕｉｒ及びＯ’Ｄｅａ（Measurement of resistant starch: factors affecting the amount of starch escaping digestion in vitro、Am. J. Clin. Nutr. 56: 123-127、1992）、Ｂｅｒｒｙ（Resistant starch: Formation and measurement of starch that survives exhaustive digestion with amylolytic enzymes during the determination of dietary fibre、Journal of Cereal Science、4（4）:301-314、1986）、Ｅｎｇｌｙｓｔら（Measurement of resistant starch in vitro and in vivo、British Journal of Nutrition、75（5）:749-755、1996）に記載される方法により試験される。
ＳＧＰ−１ ２重ヌル系統は、野生型対照デュラムコムギ系統と比較して、乾燥及び調理後パスタ試験の両方において難消化性デンプンが増加する（表８及び表９）。
実施例５
麺硬さ
ＤＨＡ１７５及び野生型姉妹系統を圃場で栽培した。穀粒を浄化し、製粉し、得られたセモリナを用いてパスタを調製した。製粉及びパスタ加工手順は、以前に記載されたとおりであった（Carreraら、2007）。簡単に述べると、２つのＭｉａｇ実験室スケール清浄機を取り付けたＢｕｈｌｅｒ実験ミル（Buhler-Miag、Minneapolis、MN、USA）を用いてデュラムをセモリナに製粉した。水和したセモリナを、ＤｅＭａＣｏ半商業的実験室押出機（DeFrancisci Machine Corp、Melbourne、FL、USA）を用いて減圧下でスパゲッティとして押し出した。スパゲッティを、実験室パスタ乾燥機（Standard Industries、Fargo、ND、USA）中で低温（40℃）乾燥サイクルを用いて乾燥させた。
パスタのテクスチャ特性を、各遺伝子型の２重の試料を、仕上がるまで沸騰蒸留水中で調理することにより決定した。調理時間は、パスタ１本１本の中央まで完全に調理されるまでと決定した。ＤＨＡ１７５系統は、野生型パスタと比較して調理時間がかなり低減された。水の吸収は、調理後重量を元の乾燥重量で除したものであり、ＤＨＡ１７５は、水の吸収が低減されていた。調理損失は、調理水を乾燥させ、喪失したパーセント固形分を記録することにより決定し、ＤＨＡ１７５は、調理損失がより大きかった。パスタの水を切り、５分間冷ました後にテクスチャ分析を行った。テクスチャ分析のために、６本の調理されたパスタ片に切断するために用いる１／４インチ幅平プローブとともにＴＡ．ＸＴ２テクスチャ分析器（Texture Technologies、Scarsdale、NY）を用いた。パスタ硬さ（固さ）は、プローブでスパゲッティに最初に圧力を加える時の力のピークである。このパラメータは、噛む感覚に関係する。ＤＨＡ１７５スパゲッティは、野生型スパゲッティよりも実質的に硬かった。麺付着性は、第１ピークと第２ピークとの間の負の力（スパゲッティの表面とプローブの表面との間の引力に打ち勝つために必要な働き）であり、理論的に、噛んだときのパスタの歯にくっつきやすさに関係する。ＤＨＡ１７５パスタは、野生型パスタよりも付着性が低かった。パスタの凝集性及びかみごたえは、（Epsteinら、2002）に記載されるようにして測定した。ＤＨＡ１７５パスタはまた、わずかにより低い凝集性と著しくより高いかみごたえのスコアを示した（表７）。
Figure 2015532124
実施例６
食品の分析
ＳＧＰ−１ ２重ヌル遺伝子型ＤＨＡ１７５及びその野生型姉妹系統デュラムコムギ（「野生型」）の穀粒から作製したパスタをさらに分析して、それらの栄養組成を決定した。ＤＨＡ１７５及び野生型はともに、Ｍｏｕｎｔｒａｉｌ×ＰＩ３３０５４６の間の交雑種からのＦ５由来系統からであった。突然変異していない根源的な種子を野生型と称し、次いでこの種子を突然変異させ、得られたＳＧＰ−１ ２重ヌルＤＨＡ１７５を回収した。乾燥パスタ及び調理後パスタの両方を分析した。
表８は、ＤＨＡ１７５及び野生型から作られる乾燥パスタの栄養組成を示す。結果は、ＳＧＰ−１ ２重ヌル遺伝子型ＤＨＡ１７５デュラムコムギから作られる乾燥パスタが、野生型から作られる乾燥パスタよりも実質的に多くの全食物繊維（「TD繊維」）（例えば消化可能でない炭水化物）を有することを示す。よって、ＤＨＡ１７５から作られる製品は、対照デュラムコムギから作られるものよりも多くの食物繊維を有すると考えられる。さらに、ＤＨＡ１７５から作られる乾燥パスタはまた、対照デュラムコムギ品種と比較して、脂質カロリーが増加し、灰分含量が増加し、タンパク質含量が増加し、脂質含量が増加し、難消化性デンプン含量が増加する。
同様の結果が、ＤＨＡ１７５及び野生型から作られる調理後パスタを比較した場合に観察され、この結果を表９に示す。調理後試料は、試験のために実験室に提出する前に液体窒素で急速冷凍させた。急速冷凍は、老化を妨げたはずである。
いずれの理論と結び付けられることも望まないが、ＤＨＡ１７５での食物繊維の増加、タンパク質の増加及び／又は難消化性デンプンの増加は、アミロース含量の増加による。代わりに、タンパク質の増加は、単に、デンプン含量の低減による。灰分も、ＤＨＡ１７５デュラムコムギから作られる高アミロースパスタにおいてより高い。ＤＨＡ１７５系統における種子のふっくら感の低減は、製粉プロセスにおいてふすま（より高い灰分及び繊維を有する）から胚乳（より低い灰分及び繊維を有する）を分離することをより困難にする。よって、いずれの特定の理論と結び付けられることも望まないが、ＤＨＡ１７５系統での繊維含量の増加は、ふすまに対する胚乳の比の減少（縮んだ種子）及び製粉収率の減少による可能性があり、これらのことは、繊維含量の増加とさらにアミロース含量の増加とに貢献する。
ＤＨＡ１７５デュラムコムギ及び野生型対照デュラムコムギから作られるパスタについての調理時間も決定した。表１０に示すように、パスタをＤＨＡ１７５デュラムコムギから作った場合に、調理時間は著しく低減される。
Figure 2015532124
Figure 2015532124
Figure 2015532124
実施例７
ＳＧＰ−Ａ１及びＳＧＰ−Ｂ１変異体の分離
ＳＧＰ−１ ２重ヌル遺伝子型ＤＨＡ１７５及びＤＨＡ５５をそれぞれ、野生型品種「Ｍｏｕｎｔｒａｉｌ」及び「Ｄｉｖｉｄｅ」と、各交配において雌性として野生型品種の親を用いて交配させた。４つの個体群のそれぞれからのおよそ１５０のＦ２植物の遺伝子型を、ＳＧＰ−Ａ１又はＳＧＰ−Ｂ１変異のいずれかに特異的なマーカーを用いて決定した。分離型変異の存在又は非存在についてホモ接合性の遺伝子型は、ホモ接合性クラスのそれぞれについて、ほぼ期待されたメンデル比１／１６にて見出された（表１０）。遺伝子型決定により、単一（個体）ＳＧＰ−Ａ１及び単一ＳＧＰ−Ｂ１コムギ植物が回収されるＳＧＰ−１変異の分離が明らかになった。
Figure 2015532124
別段の定義のない限り、本明細書における全ての術語及び科学用語は、本発明が属する分野の当業者が通常理解するものと同じ意味を有する。本明細書に記載するものと同様又は等価ないずれの方法及び材料も本発明の実施又は試験において用いることができるが、非限定的な例示の方法及び材料を本明細書に記載する。
明細書で言及する全ての公開及び特許出願は、本発明が関する当業者の水準を示す。全ての公開及び特許出願は、それぞれ個別の公開は特許出願が参照により組み込まれると具体的かつ個別に示されているのと同じ程度で参照により本明細書に組み込まれている。本明細書に記載する事項は、本発明が、先行発明によりそのような出版物に先行して権利を有さないことを認めると解釈されない。
上記の記載及び関連する図面に示す教示の利益を受けた発明が属する分野の当業者は、本明細書に示す発明の多くの改変及び他の実施形態を想到する。よって、本発明は、開示する具体的な実施形態に限定されず、改変及び他の実施形態を、添付の特許請求の範囲内に含むことを意図すると理解される。本明細書において特定の用語を用いるが、これらは包括的及び説明のための意味でのみ用いられ、限定する目的のためではない。
本発明をその具体的な実施形態との関連で記載したが、さらなる改変が可能であり、本出願は、本発明の原理に全般的に従う本発明の任意の変形、使用又は適応を包含することを意図しており、本発明が関する分野内での既知の又は慣例的な実施に付属する、本明細書において上で述べた必須の特徴に適用し得る、添付の特許請求の範囲に従う、本開示からの逸脱を含むと理解される。
参考文献
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Claims (55)

  1. デュラムデンプン粒タンパク質−Ｂ１（SGP-B1）遺伝子の１つ又は複数の変異と、デュラムデンプン粒タンパク質−Ａ１（SGP-A1）遺伝子の１つ又は複数の変異とを含むデュラムコムギ植物から生成される高アミロース穀粒。
  2. 前記穀粒のデンプン中のアミロースの割合が、示差走査熱量分析により測定して、少なくとも４０％である、請求項１に記載の高アミロース穀粒。
  3. 前記穀粒のデンプン中のアミロースの割合が、示差走査熱量分析により測定して、少なくとも５０％である、請求項１に記載の高アミロース穀粒。
  4. 前記変異が、ＳＧＰ−Ａ１遺伝子の第１エキソン中の欠失を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の高アミロース穀粒。
  5. 前記欠失が、ＳＧＰ−Ａ１遺伝子のヌクレオチド１４５〜１７４位にある、請求項４に記載の高アミロース穀粒。
  6. 前記変異が、ＳＧＰ−Ｂ１遺伝子のヌクレオチド９７９位及び／又は１８６４位におけるヌクレオチド置換を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の高アミロース穀粒。
  7. 前記変異が、ＳＧＰ−Ｂ１のアミノ酸３２７位におけるアスパラギン酸からアスパラギンへのアミノ酸置換、及び／又はＳＧＰ−Ｂ１のアミノ酸６２２位におけるアスパラギン酸からアスパラギンへのアミノ酸置換を導く、請求項６に記載の高アミロース穀粒。
  8. 約７．５未満の小麦粉膨潤度（FSP）を有する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の高アミロース穀粒。
  9. 請求項１〜８のいずれか一項に記載の高アミロース穀粒から製造される小麦粉。
  10. 請求項１〜８のいずれか一項に記載の高アミロース穀粒から製造されるデンプン。
  11. 請求項１〜８のいずれか一項に記載の高アミロース穀粒を含む小麦粉ベース製品。
  12. 乾燥パスタである、請求項１１に記載の小麦粉ベース製品。
  13. 当該小麦粉ベース製品が、少なくとも１７％のタンパク質含量を有し、前記少なくとも１７％のタンパク質含量が、高アミロース穀粒によりもたらされる、請求項１１又は１２に記載の小麦粉ベース製品。
  14. 当該小麦粉ベース製品が、少なくとも２０％のタンパク質含量を有し、前記少なくとも２０％のタンパク質含量が、高アミロース穀粒によりもたらされる、請求項１１又は１２に記載の小麦粉ベース製品。
  15. 当該小麦粉ベース製品が、少なくとも３％の食物繊維含量を有し、前記少なくとも３％の食物繊維含量が、高アミロース穀粒によりもたらされる、請求項１１又は１２に記載の小麦粉ベース製品。
  16. 当該小麦粉ベース製品が、少なくとも７％の食物繊維含量を有し、前記少なくとも７％の食物繊維含量が、高アミロース穀粒によりもたらされる、請求項１１又は１２に記載の小麦粉ベース製品。
  17. 当該小麦粉ベース製品が、少なくとも２％の難消化性デンプン含量を有し、前記少なくとも２％の難消化性デンプン含量が、高アミロース穀粒によりもたらされる、請求項１１又は１２に記載の小麦粉ベース製品。
  18. 当該小麦粉ベース製品が、少なくとも３％の難消化性デンプン含量を有し、前記少なくとも３％の難消化性デンプン含量が、高アミロース穀粒によりもたらされる、請求項１１又は１２に記載の小麦粉ベース製品。
  19. 前記高アミロース穀粒のデンプン中のアミロース含量が、同様の圃場条件で栽培した適当なデュラムコムギ指標品種の穀粒のデンプンと比較して増加している、請求項１に記載の高アミロース穀粒。
  20. 前記変異が、ＳＧＰ−Ａ１遺伝子の第１エキソン中の欠失を含む、請求項１９に記載の高アミロース穀粒。
  21. 前記欠失が、ＳＧＰ−Ａ１遺伝子のヌクレオチド１４５〜１７４位にある、請求項２０に記載の高アミロース穀粒。
  22. 前記変異が、ＳＧＰ−Ｂ１遺伝子のヌクレオチド９７９位及び／又は１８６４位におけるヌクレオチド置換を含む、請求項１９〜２１のいずれか一項に記載の高アミロース穀粒。
  23. 前記変異が、ＳＧＰ−Ｂ１のアミノ酸３２７位におけるアスパラギン酸からアスパラギンへのアミノ酸置換、及び／又はＳＧＰ−Ｂ１のアミノ酸６２２位におけるアスパラギン酸からアスパラギンへのアミノ酸置換を導く、請求項２２に記載の高アミロース穀粒。
  24. 前記高アミロース穀粒の食物繊維、難消化性デンプン及びタンパク質含量の割合が、同様の圃場条件で栽培した適当なデュラムコムギ指標品種の穀粒と比較して増加している、請求項１９〜２３のいずれか一項に記載の高アミロース穀粒。
  25. 前記高アミロース穀粒から作られるデンプンのアミロース含量が、同様の圃場条件で栽培した適当なデュラムコムギ指標品種の穀粒から作られるデンプンのアミロース含量より少なくとも１２％高い、請求項１９〜２３のいずれか一項に記載の高アミロース穀粒。
  26. 前記高アミロース穀粒から作られるデンプンのアミロース含量が、同様の圃場条件で栽培した適当なデュラムコムギ指標品種の穀粒から作られるデンプンのアミロース含量より少なくとも２５％高い、請求項１９〜２３のいずれか一項に記載の高アミロース穀粒。
  27. 前記高アミロース穀粒から作られるデンプンのアミロース含量が、同様の圃場条件で栽培した適当なデュラムコムギ指標品種の穀粒から作られるデンプンのアミロース含量より少なくとも４０％高い、請求項１９〜２３のいずれか一項に記載の高アミロース穀粒。
  28. 前記高アミロース穀粒からのデンプンが、同様の圃場条件で栽培した適当なデュラムコムギ指標品種の穀粒からのデンプンと比較して、Ｂ型デンプン粒の量において全体として減少している、請求項１９〜２７のいずれか一項に記載の高アミロース穀粒。
  29. 前記高アミロース穀粒からのデンプンが、同様の圃場条件で栽培した適当なデュラムコムギ指標品種の穀粒からのデンプンと比較して、糊化特性が変化している、請求項１９〜２８のいずれか一項に記載の高アミロース穀粒。
  30. 前記高アミロース穀粒から作られるパスタ又は麺類が、同様の圃場条件で栽培した適当なデュラムコムギ指標品種の穀粒から作られるパスタ又は麺類と比較して、硬さが増加している、請求項１９〜２９のいずれか一項に記載の高アミロース穀粒。
  31. 前記高アミロース穀粒から作られるパスタ又は麺類が、同様の圃場条件で栽培した適当なデュラムコムギ指標品種の穀粒から製造されるパスタ又は麺類と比較して、グリセミック指数が低減している、請求項１９〜３０のいずれか一項に記載の高アミロース穀粒。
  32. 前記高アミロース穀粒から作られるパスタ又は麺類が、同様の圃場条件で栽培した適当なデュラムコムギ指標品種の穀粒から製造されるパスタ又は麺類と比較して、加熱過多に対する抵抗性が増加している、請求項１９〜３１のいずれか一項に記載の高アミロース穀粒。
  33. 前記高アミロース穀粒から作られるパスタ又は麺類が、同様の圃場条件で栽培した適当なデュラムコムギ指標品種の穀粒から製造されるパスタ又は麺類と比較して、タンパク質含量が増加している、請求項１９〜３２のいずれか一項に記載の高アミロース穀粒。
  34. 請求項１９〜３３のいずれか一項に記載の高アミロース穀粒から製造される小麦粉。
  35. 請求項１９〜３３のいずれか一項に記載の高アミロース穀粒から製造されるデンプン。
  36. 請求項１９〜３３のいずれか一項に記載の高アミロース穀粒を含む小麦粉ベース製品。
  37. 乾燥パスタである、請求項３６に記載の小麦粉ベース製品。
  38. 同様の圃場条件で栽培した適当なデュラムコムギ指標品種の穀粒から製造される小麦粉ベース製品より少なくとも１０％高い、増加したタンパク質含量を有し、タンパク質含量の増加が、高アミロース穀粒によりもたらされる、請求項３６又は３７に記載の小麦粉ベース製品。
  39. 前記小麦粉ベース製品が、同様の圃場条件で栽培した適当なデュラムコムギ指標品種の穀粒から製造される小麦粉ベース製品より少なくとも２０％高い、増加したタンパク質含量を有し、前記タンパク質含量の増加が、高アミロース穀粒によりもたらされる、請求項３６又は３７に記載の小麦粉ベース製品。
  40. 前記小麦粉ベース製品が、同様の圃場条件で栽培した適当なデュラムコムギ指標品種の穀粒から製造される小麦粉ベース製品より少なくとも３０％高い、増加したタンパク質含量を有し、前記タンパク質含量の増加が、高アミロース穀粒によりもたらされる、請求項３６又は３７に記載の小麦粉ベース製品。
  41. 前記小麦粉ベース製品が、同様の圃場条件で栽培した適当なデュラムコムギ指標品種の穀粒から製造される小麦粉ベース製品より少なくとも５０％高い、増加した食物繊維含量を有し、前記食物繊維含量の増加が、高アミロース穀粒によりもたらされる、請求項３６又は３７に記載の小麦粉ベース製品。
  42. 前記小麦粉ベース製品が、同様の圃場条件で栽培した適当なデュラムコムギ指標品種の穀粒から製造される小麦粉ベース製品より少なくとも１００％高い、増加した食物繊維含量を有し、前記食物繊維含量の増加が、高アミロース穀粒によりもたらされる、請求項３６又は３７に記載の小麦粉ベース製品。
  43. 前記小麦粉ベース製品が、同様の圃場条件で栽培した適当なデュラムコムギ指標品種の穀粒から製造される小麦粉ベース製品より少なくとも２００％高い、増加した食物繊維含量を有し、前記食物繊維含量の増加が、高アミロース穀粒によりもたらされる、請求項３６又は３７に記載の小麦粉ベース製品。
  44. 前記小麦粉ベース製品が、同様の圃場条件で栽培した適当なデュラムコムギ指標品種の穀粒から製造される小麦粉ベース製品より少なくとも５０％高い、増加した難消化性デンプン含量を有し、前記難消化性デンプン含量の増加が、高アミロース穀粒によりもたらされる、請求項３６又は３７に記載の小麦粉ベース製品。
  45. 前記小麦粉ベース製品が、同様の圃場条件で栽培した適当なデュラムコムギ指標品種の穀粒から製造される小麦粉ベース製品より少なくとも１００％高い、増加した難消化性デンプン含量を有し、前記難消化性デンプン含量の増加が、高アミロース穀粒によりもたらされる、請求項３６又は３７に記載の小麦粉ベース製品。
  46. 前記小麦粉ベース製品が、同様の圃場条件で栽培した適当なデュラムコムギ指標品種の穀粒から製造される小麦粉ベース製品より少なくとも２００％高い、増加した難消化性デンプン含量を有し、前記難消化性デンプン含量の増加が、高アミロース穀粒によりもたらされる、請求項３６又は３７に記載の小麦粉ベース製品。
  47. デュラムデンプン粒タンパク質（SGP-B1）の１つ又は複数の変異と、デュラムデンプン粒タンパク質−Ａ１（SGP-A1）遺伝子の１つ又は複数の変異とを有するデュラムコムギ植物を生成する方法であって、
    ａ．デュラムデンプン粒タンパク質−Ａ１（SGP-A1）遺伝子の１つ又は複数の変異を含有するデュラムコムギ穀粒に突然変異を誘発して、突然変異誘発穀粒の個体群を形成することと、
    ｂ．前記突然変異誘発デュラムコムギ穀粒から１種又は複数のデュラムコムギ植物を栽培することと、
    ｃ．得られた植物をスクリーニングして、デュラムＳＧＰ−Ｂ１変異遺伝子を有するデュラムコムギ植物を同定することと、
    ｄ．デュラムＳＧＰ−Ｂ１変異遺伝子を含有する１種又は複数のデュラムコムギ植物を選択することと
    を含み、
    前記デュラムコムギ植物が、デュラムデンプン粒タンパク質−Ｂ１（SGP-B1）遺伝子の１つ又は複数の変異と、デュラムデンプン粒タンパク質−Ａ１（SGP-A1）遺伝子の１つ又は複数の変異とを含み、前記植物が、高アミロース穀粒を生成する、方法。
  48. デュラムデンプン粒タンパク質（SGP-B1）の１つ又は複数の変異と、デュラムデンプン粒タンパク質−Ａ１（SGP-A1）遺伝子の１つ又は複数の変異とを有するデュラムコムギ植物を生成する方法であって、
    ａ．デュラムＳＧＰ−Ａ１遺伝子上に１つ又は複数の変異を含有するデュラムコムギ植物と、デュラムＳＧＰ−Ｂ１遺伝子上に１つ又は複数の変異を含有する第２のデュラムコムギ植物とを交配させることと、
    ｂ．得られる穀粒を収穫することと、
    ｃ．収穫した穀粒を植物まで栽培することと
    を含み、
    得られるデュラムコムギ植物が、デュラムデンプン粒タンパク質−Ｂ１（SGP-B1）遺伝子の１つ又は複数の変異と、デュラムデンプン粒タンパク質−Ａ１（SGP-A1）遺伝子の１つ又は複数の変異とを含み、前記植物が、高アミロース穀粒を生成する、方法。
  49. 前記変異が、ＳＧＰ−Ａ１遺伝子の第１エキソン中の欠失を含む、請求項４７又は４８に記載の方法。
  50. 前記欠失が、ＳＧＰ−Ａ１遺伝子のヌクレオチド１４５〜１７４位にある、請求項４９に記載の方法。
  51. 前記変異が、ＳＧＰ−Ｂ１遺伝子のヌクレオチド９７９位及び／又は１８６４位におけるヌクレオチド置換を含む、請求項４７〜５０のいずれか一項に記載の方法。
  52. 前記変異が、ＳＧＰ−Ｂ１のアミノ酸３２７位におけるアスパラギン酸からアスパラギンへのアミノ酸置換、及び／又はＳＧＰ−Ｂ１のアミノ酸６２２位におけるアスパラギン酸からアスパラギンへのアミノ酸置換を導く、請求項５１に記載の方法。
  53. 植物組織を培養及び再生する方法であって、請求項４７〜５２のいずれか一項に記載の方法により生成されるコムギ植物の少なくとも一部分を培養することを含み、前記植物の一部分が、植物再生を促す条件下で培養され、そのことにより前記植物が再生される、方法。
  54. 雑種種子を生成する方法であって、請求項４７〜５３のいずれか一項に記載の方法により生成されるコムギ植物を別の植物と交配させることと、得られる種子を収穫することとを含む方法。
  55. 高アミロースデュラム穀粒を有するデュラムコムギ植物を育種する方法であって、
    ｉ）請求項４７〜５４のいずれか一項に記載の方法により生成される第１植物と、第２植物との間の交雑種を作製して、Ｆ１植物を生成することと、
    ｉｉ）Ｆ１植物を第２植物に戻し交配することと、
    ｉｉｉ）戻し交配工程を１又は複数回反復して、近同質遺伝子又は同質遺伝子系統を得ることと
    を含み、
    請求項４９〜５２のいずれか一項に記載のＳＧＰ−Ａ１及びＳＧＰ−Ｂ１変異が、第２植物、並びにＳＧＰ−Ａ１及び／又はＳＢＰ−Ｂ１変異を有する第２植物に由来する近同質遺伝子又は同質遺伝子系統のゲノム中に組み込まれている、方法。
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