JP2015532124A5

JP2015532124A5 -

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Publication number: JP2015532124A5
Application number: JP2015538155A
Authority: JP
Filing date: 2013-10-23
Publication date: 2018-01-18

Description

様々なタイプの突然変異誘発を用いて、タンパク質分子をコードするバリアント核酸を生成及び／若しくは単離、並びに／又はデンプン合成遺伝子のタンパク質をさらに改変／変異させることができる。これらは、限定されないが、部位特異的、無作為点突然変異誘発、相同組換え（DNAシャフリング）、ウラシル含有鋳型を用いる突然変異誘発、オリゴヌクレオチド指定突然変異誘発、ホスホロチオエート改変ＤＮＡ突然変異誘発、ギャップ２重鎖ＤＮＡを用いる突然変異誘発などを含む。さらなる適切な方法は、点ミスマッチ修復、修復欠損宿主株を用いる突然変異誘発、制限−選択及び制限−精製、欠失突然変異誘発、トータル遺伝子合成による突然変異誘発、２本鎖切断修復などを含む。例えばキメラ構築物が関与する突然変異誘発も本発明に含まれる。一実施形態では、突然変異誘発は、自然に存在する分子又は改変若しくは変異された自然に存在する分子の既知の情報、例えば配列、配列比較、物理的特性、結晶構造などにより手引きできる。作用物質、プロトコールのような植物での突然変異誘発のさらなる情報について、Ａｃｑｕａａｈら（Principles of plant genetics and breeding、Wiley-Blackwell、2007、ISBN 1405136464、9781405136464、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている）を参照されたい。ＲＮＡ干渉を用いて植物遺伝子を阻害する方法は、本明細書に後で記載する。

本発明の変異体デンプン合成タンパク質は、参照対立遺伝子若しくは生物活性バリアント又はそれらの断片に１又は複数の改変を有することができる。特に適切な改変は、アミノ酸置換、挿入、欠失又は短縮を含む。いくつかの実施形態では、タンパク質中の少なくとも１つの非保存アミノ酸置換、挿入又は欠失を作製して、タンパク質活性を阻害又は改変する。置換は、分子中の１つのアミノ酸だけが置換される単一であってよい、又は２つ以上のアミノ酸が同じ分子中で置換される多重であってよい。挿入変異体は、参照タンパク質分子、生物活性バリアント又はそれらの断片中の特定の位置のアミノ酸のすぐ隣に挿入された１又は複数のアミノ酸を有するものである。挿入は、１又は複数のアミノ酸であり得る。挿入は、例えば１つ又は２つの保存アミノ酸からなることができる。挿入部位の隣のアミノ酸と電荷及び／又は構造が類似するアミノ酸は、保存的と定義される。代わりに、変異体デンプン合成タンパク質は、挿入部位の隣のアミノ酸と実質的に異なる電荷及び／又は構造を有するアミノ酸の挿入を含む。いくつかの他の実施形態では、変異体デンプン合成タンパク質は、参照タンパク質と比較して１又は複数のドメインを喪失した短縮タンパク質である。

標的遺伝子を阻害及び／又は変更する方法は、当業者に知られている。これらの方法は、限定されないが、突然変異誘発（例えば化学的突然変異誘発、放射線照射突然変異誘発、トランスポゾン突然変異誘発、挿入突然変異誘発、符号タグ化突然変異誘発、部位特異的突然変異誘発及び天然突然変異誘発）、ノックアウト／ノックイン、アンチセンス及びＲＮＡ干渉を含む。

植物形質転換
本発明は、１又は複数の改変デンプン合成遺伝子を有するトランスジェニックコムギ植物を提供する。改変は、阻害又は過剰発現のいずれかであることができる。

示差走査熱量分析
ＳＧＰ−１２重ヌル及び対照デンプンの糊化特性及びアミロース含量を、ＤＳＣを用いて調べた。組み合わせた熱走査サーモグラムは、６０℃付近にて観察される第１ピークで表される、ＳＧＰ−１２重ヌル系統におけるアミロペクチンの糊化の明確な変化があることを示す（図５）。ＳＧＰ−１２重ヌル系統は、野生型コムギ系統から変化した糊化特性を有した。ＳＧＰ−１２重ヌル系統は、ピーク高さに基づく著しくより低い糊化温度と、エンタルピーの劇的により小さい変化とを有した（図５、表５）。これらのデータは、アミロペクチン合成の阻害を示す。アミロース糊化と関連する１０５℃付近の第２ピークは、対照と比較してより低い糊化温度及びエンタルピーのより大きい変化を有するＳＧＰ−１２重ヌル系統と全ての試料にわたって形状及びサイズが類似していた（図５、表５）。ＳＧＰ−Ａ１ヌル系統におけるアミロース含量は、野生型対照と比較して変化しなかったが、ＳＧＰ−１２重ヌル系統は、著しくより高いアミロース含量を有した（表５）。系統ＤＨＡ１７５では、４１．１％のアミロースの増加があり、ＤＨＡ５５について２８．６％の増加があった。

我々の以前の研究で示したように、いくつかの多面的効果がＳＳＩＩ又はＳＧＰ−１の喪失の結果として観察された。ここで、我々は、ＳＧＰ−１２重ヌル系統のアミロース含量が３８％から５０％まで（＋１２％）著しく増加したことを証明する。２つのＳＧＰ−１２重ヌル系統は、エンタルピーの減少と糊化温度の低減とを特徴とするＳＧＰ−Ａ１ヌル及び野生型とは非常に異なるアミロペクチン糊化ピークを有した（図５、表５）。系統ＤＨＡ５５では、アミロペクチン糊化についてのピークは、小さすぎてほぼ区別できなかった。したがって、ＳＧＰ−１２重ヌル系統は、より低い小麦粉膨潤度も有した（表４）。これらの結果は、アミロペクチン合成の阻害の証拠である。ＳＧＰ−１２重ヌルからの両方の型のデンプン粒は変形し、ざらざら又は割れた表面を有した。統計的に決定していないが、我々は、デュラムＳＧＰ−１２重ヌル系統においてＢ型デンプン粒の量の全体的な減少を観察した。デンプン粒の内部からの他のデンプン生合成酵素、すなわちＳＢＥＩＩ（SGP-2）及びＳＳＩ（SGP-3）のほぼ完全な喪失もあったが、ＧＢＳＳＩは手をつけられないままであった。デンプン粒中に存在するこれらのタンパク質の喪失は、しかし、これらのタンパク質が生成されなかったことを意味しなかった。胚乳の可溶性画分中で、ＳＢＥＩＩ、ＳＳＩ及びＧＢＳＳＩが通常レベルで蓄積されることが示されている（Kosar-Hashemiら、2007、Morellら、2003）。他のデンプン生合成酵素とともにＳＳ、ＳＢＥがコムギアミロプラスト中で複合体で作用し、これらの酵素の一方が阻害された場合に、他の酵素に対して著しい影響を有すると仮定されている（Tetlowら、2004a）。ＳＧＰ−１２重ヌル系統では、このことは、デンプン粒マトリクス中のＳＳＩ及びＳＢＥＩＩの捕捉の欠如として現れる。Ｔｅｔｌｏｗら（2008）は、パンコムギにおいて、リン酸化により制御されるデンプン沈着中にＳＢＥＩＩ、ＳＳＩ及びＳＳＩＩａが相互作用して複合体を形成することを証明した。ＳＳＩＩの喪失は、この複合体の形成、次いで、長鎖アミロペクチン形成とＳＢＥＩＩ及びＳＳＩの捕捉とを制限する可能性がある。

Claims

デュラムデンプン粒タンパク質−Ｂ１（ＳＧＰ−Ｂ１）遺伝子の１つ又は複数の変異と、デュラムデンプン粒タンパク質−Ａ１（ＳＧＰ−Ａ１）遺伝子の１つ又は複数の変異と、を備えるデュラムコムギ植物から生成された高アミロース穀粒であって、
前記ＳＧＰ−Ｂ１変異及び前記ＳＧＰ−Ａ１変異の少なくとも一つが、前記遺伝子の活性を阻害又は改変し、
当該高アミロース穀粒が、同様の圃場条件で栽培した野生型デュラムコムギ植物から生成された対照穀粒のアミロース含量と比較して、高いアミロース含量を有する、
高アミロース穀粒。
当該穀粒のデンプン中のアミロースの割合が、示差走査熱量分析で測定して、少なくとも４０％である、請求項１に記載の高アミロース穀粒。
当該穀粒のデンプン中のアミロースの割合が、示差走査熱量分析で測定して、少なくとも５０％である、請求項１に記載の高アミロース穀粒。
前記デュラムＳＧＰ−Ａ１遺伝子の変異が、前記ＳＧＰ−Ａ１遺伝子の第１エキソン中の欠失を含む、請求項１から３のいずれか１項に記載の高アミロース穀粒。
前記ＳＧＰ−Ａ１遺伝子の第１エキソン中の欠失が、２９ｂｐの欠失である、請求項４に記載の高アミロース穀粒。
前記デュラムＳＧＰ−Ｂ１遺伝子の変異が、ＳＧＰ−Ｂ１遺伝子のヌクレオチド９７９位及び／又は１８６４位におけるヌクレオチド置換を含むか、
前記変異が、配列番号５のタンパク質をコードする部分のヌクレオチド９７９位及び／又は１８６４位に対応するヌクレオチド置換を含む
請求項１から５のいずれか１項に記載の高アミロース穀粒。
デュラムＳＧＰ−Ｂ１遺伝子の変異が、
ＳＧＰ−Ｂ１のアミノ酸３２７位におけるアスパラギン酸からアスパラギンへのアミノ酸置換、又は配列番号６のアミノ酸３２７位に対応するアミノ酸位におけるアスパラギン酸からアスパラギンへのアミノ酸置換、及び／又は
ＳＧＰ−Ｂ１のアミノ酸６２２位におけるアスパラギン酸からアスパラギンへのアミノ酸置換、又は配列番号６のアミノ酸６２２位に対応するアミノ酸位におけるアスパラギン酸からアスパラギンへのアミノ酸置換
を導く、
請求項１から５のいずれか１項に記載の高アミロース穀粒。
約７．５ｇ／ｇ未満の小麦粉膨潤度（ＦＳＰ）を有する、請求項１から７のいずれか１項に記載の高アミロース穀粒。
請求項１から８のいずれか１項に記載の高アミロース穀粒から製造された小麦粉。
請求項１から８のいずれか１項に記載の高アミロース穀粒から製造されたデンプン。
請求項１から８のいずれか１項に記載の高アミロース穀粒を備える小麦粉ベース製品。
乾燥パスタである、請求項１１に記載の小麦粉ベース製品。
少なくとも１７％のタンパク質含量を有し、当該少なくとも１７％のタンパク質含量が、前記高アミロース穀粒によりもたらされる、請求項１１又は１２に記載の小麦粉ベース製品。
１つ又は複数の変異デュラムデンプン粒タンパク質−Ｂ１（ＳＧＰ−Ｂ１）対立遺伝子、及び１つ又は複数の変異デュラムデンプン粒タンパク質−Ａ１（ＳＧＰ−Ａ１）対立遺伝子を備えるデュラムコムギ植物を生成する方法であって、
ａ．デュラムコムギ穀粒に突然変異を誘発して、突然変異誘発穀粒の個体群を生成することであって、突然変異の誘発の前に、前記デュラムコムギ穀粒が、以前から存在している変異デュラムＳＧＰ−Ｂ１対立遺伝子又は以前から存在している変異デュラムＳＧＰ−Ａ１対立遺伝子を備え、前記以前から存在している変異デュラムＳＧＰ−Ｂ１対立遺伝子及び前記以前から存在している変異デュラムＳＧＰ−Ａ１対立遺伝子が６倍体のコムギ由来ではなく；
ｂ．前記突然変異誘発デュラムコムギ穀粒から、１つ又は複数のデュラムコムギ植物を栽培すること；
ｃ．ステップ（ａ）の前記以前から存在している変異デュラムＳＧＰ−Ｂ１対立遺伝子又は前記以前から存在している変異デュラムＳＧＰ−Ａ１対立遺伝子に対して、異なるゲノム上に位置する、新たに生成された変異デュラムＳＧＰ−Ｂ１対立遺伝子又は新たに生成された変異デュラムＳＧＰ−Ａ１対立遺伝子について、ステップ（ｂ）で得られた植物をスクリーニングすること；及び
ｄ．前記新たに生成された変異デュラムＳＧＰ−Ｂ１対立遺伝子又は前記新たに生成された変異デュラムＳＧＰ−Ａ１対立遺伝子を備えるデュラムコムギ植物を選択すること；
を含む方法であって、
前記得られた植物が、１つ又は複数の変異デュラムＳＧＰ−Ｂ１対立遺伝子及び１つ又は複数の変異デュラムＳＧＰ−Ａ１対立遺伝子を備える、
方法。
前記デュラムコムギ穀粒が、前記以前から存在している変異デュラムＳＧＰ−Ａ１対立遺伝子を備え、ステップ（ａ）の前記以前から存在している変異デュラムＳＧＰ−Ａｌ対立遺伝子が、ＰＩ−３３０５４６及びＩＧ−８６３０４コムギ系統にみられるような２９ｂｐ欠失を有する、請求項１４に記載の方法。
前記デュラムコムギ穀粒が、前記以前から存在している変異デュラムＳＧＰ−Ｂ１対立遺伝子を備え、ステップ（ａ）の前記以前から存在している変異デュラムＳＧＰ−Ｂ１対立遺伝子が、配列番号６のアミノ酸３２７位に対応するアミノ酸位におけるアスパラギン酸からアスパラギンへのアミノ酸置換をコードする、請求項１４に記載の方法。
前記デュラムコムギ穀粒が、前記以前から存在している変異デュラムＳＧＰ−Ｂ１対立遺伝子を備え、ステップ（ａ）の前記以前から存在している変異デュラムＳＧＰ−Ｂ１対立遺伝子が、配列番号６のアミノ酸６２２位に対応するアミノ酸位におけるアスパラギン酸からアスパラギンへのアミノ酸置換をコードする、請求項１４に記載の方法。
１又は複数の世代の間、ステップ（ｄ）で得られた植物を、自身と、又は第２の植物と交配させ、前記ＳＧＰ−Ａ１及びＳＧＰ−Ｂ１変異対立遺伝子についてホモ接合性であるデュラムコムギ植物を生成するステップをさらに備える、請求項１４に記載の方法。
前記ＳＧＰ−Ａ１及びＳＧＰ−Ｂ１変異対立遺伝子についてホモ接合性であるデュラムコムギ植物が、高アミロース穀粒を生成し、前記高アミロース穀粒のデンプンにおけるアミロースの割合が、示差走査熱量分析で測定して、約３８％以上であり、
前記高アミロース穀粒が、同様の圃場条件で栽培した野生型デュラムコムギ植物から生成された対照穀粒のアミロース含量と比較して、高いアミロース含量を有する、請求項１８に記載の方法。
前記ＳＧＰ−Ａ１及びＳＧＰ−Ｂ１変異対立遺伝子についてホモ接合性であるデュラムコムギ植物が、高アミロース穀粒を生成し、前記高アミロース穀粒のデンプンにおけるアミロースの割合が、同様の圃場条件で栽培した野生型デュラムコムギ植物から生成された対照穀粒のデンプンにおけるアミロースの割合より少なくとも２５％高い、請求項１８に記載の方法。
前記ＳＧＰ−Ａ１及びＳＧＰ−Ｂ１変異対立遺伝子についてホモ接合性であるデュラムコムギ植物が、高アミロース穀粒を生成し、前記高アミロース穀粒のデンプンにおけるアミロースの割合が、同様の圃場条件で栽培した野生型デュラムコムギ植物から生成された対照穀粒のデンプンにおけるアミロースの割合より少なくとも３５％高い、請求項１８に記載の方法。
１つ又は複数のデュラムデンプン粒タンパク質−Ｂ１ヌル（ＳＧＰ−Ｂ１ヌル）対立遺伝子、及び１つ又は複数のデュラムデンプン粒タンパク質−Ａ１ヌル（ＳＧＰ−Ａ１ヌル）対立遺伝子を備えるデュラムコムギ植物を生成する方法であって、
ａ．１つ又は複数のＳＧＰ−Ａ１ヌル対立遺伝子を備えるデュラムコムギ植物を、１つ又は複数のＳＧＰ−Ｂ１ヌル対立遺伝子を備える第２のデュラムコムギ植物と交配させ、Ｆ１後代植物を生成すること；及び
ｂ．前記ＳＧＰ−Ａ１ヌル及びＳＧＰ−Ｂ１ヌル対立遺伝子のそれぞれのコピーを少なくとも一つ備えるＦ１後代植物を選択すること；
を含み、
前記ＳＧＰ−Ａ１ヌル及びＳＧＰ−Ｂ１ヌル対立遺伝子のいずれもが、６倍体コムギ由来ではない、
方法。
前記ＳＧＰ−Ｂ１ヌル対立遺伝子が、配列番号６のアミノ酸３２７位に対応するアミノ酸位におけるアスパラギン酸からアスパラギンへのアミノ酸置換をコードする、請求項２２に記載の方法。
前記ＳＧＰ−Ｂ１ヌル対立遺伝子が、配列番号６のアミノ酸６２２位に対応するアミノ酸位におけるアスパラギン酸からアスパラギンへのアミノ酸置換をコードする、請求項２２に記載の方法。
前記ＳＧＰ−Ａｌヌル対立遺伝子が、ＰＩ−３３０５４６及びＩＧ−８６３０４コムギ系統にみられるような２９ｂｐ欠失を有する、請求項２２に記載の方法。
１又は複数の世代の間、ステップ（ｂ）で得られた植物を、自身と、又は第２の植物と交配させ、前記ＳＧＰ−Ａ１ヌル及びＳＧＰ−Ｂ１ヌル対立遺伝子についてホモ接合性であるデュラムコムギ植物を生成するステップをさらに備える、請求項２２に記載の方法。
前記ＳＧＰ−Ａ１ヌル及びＳＧＰ−Ｂ１ヌル対立遺伝子についてホモ接合性であるデュラムコムギ植物が、高アミロース穀粒を生成し、前記高アミロース穀粒のデンプンにおけるアミロースの割合が、示差走査熱量分析で測定して、約３８％以上であり、
前記高アミロース穀粒が、同様の圃場条件で栽培した野生型デュラムコムギ植物から生成された対照穀粒のアミロース含量と比較して、高いアミロース含量を有する、請求項２６に記載の方法。
前記ＳＧＰ−Ａ１ヌル及びＳＧＰ−Ｂ１ヌル対立遺伝子についてホモ接合性であるデュラムコムギ植物が、高アミロース穀粒を生成し、前記高アミロース穀粒のデンプンにおけるアミロースの割合が、同様の圃場条件で栽培した野生型デュラムコムギ植物から生成された対照穀粒のデンプンにおけるアミロースの割合より少なくとも２５％高い、請求項２６に記載の方法。
前記ＳＧＰ−Ａ１ヌル及びＳＧＰ−Ｂ１ヌル対立遺伝子についてホモ接合性であるデュラムコムギ植物が、高アミロース穀粒を生成し、前記高アミロース穀粒のデンプンにおけるアミロースの割合が、同様の圃場条件で栽培した野生型デュラムコムギ植物から生成された対照穀粒のデンプンにおけるアミロースの割合より少なくとも３５％高い、請求項２６に記載の方法。
１つ又は複数の変異デュラムデンプン粒タンパク質−Ｂ１（ＳＧＰ−Ｂ１）対立遺伝子、及び１つ又は複数の変異デュラムデンプン粒タンパク質−Ａ１（ＳＧＰ−Ａ１）対立遺伝子を備えるデュラムコムギ植物を生成する方法であって、
ａ．デュラムコムギ穀粒の突然変異を誘発して、突然変異誘発穀粒の個体群を生成すること；
ｂ．前記突然変異誘発デュラムコムギ穀粒から１つ又は複数のデュラムコムギ植物を栽培すること；
ｃ．変異デュラムＳＧＰ−Ｂ１対立遺伝子及び変異デュラムＳＧＰ−Ａ１対立遺伝子について、ステップ（ｂ）で得られた植物をスクリーニングすること；及び
ｄ．１つ又は複数のデュラムコムギ植物を選択すること
を含む方法であって、
選択された植物のそれぞれが、変異デュラムＳＧＰ−Ｂ１対立遺伝子及び変異デュラムＳＧＰ−Ａ１対立遺伝子を備える、
方法。
デュラムデンプン粒タンパク質−Ｂ１（ＳＧＰ−Ｂ１）遺伝子の１つ又は複数の変異、及びデュラムデンプン粒タンパク質−Ａ１（ＳＧＰ−Ａ１）遺伝子の１つ又は複数の変異を備えるデュラムコムギ植物から生成される高アミロース穀粒であって、
前記ＳＧＰ−Ａ１遺伝子が、ＰＩ−３３０５４６及びＩＧ−８６３０４コムギ系統にみられるような２９ｂｐ欠失を有し、
前記デュラムＳＧＰ−Ｂ１遺伝子の変異が、配列番号６のアミノ酸３２７位に対応するアミノ酸位におけるアスパラギン酸からアスパラギンへのアミノ酸置換、及び／又は配列番号６のアミノ酸６２２位に対応するアミノ酸位におけるアスパラギン酸からアスパラギンへのアミノ酸置換を導く、
高アミロース穀粒であって、
当該高アミロース穀粒が、同様の圃場条件で栽培した野生型デュラムコムギ植物から生成された対照穀粒のアミロース含量と比較して、高いアミロース含量を有する、
高アミロース穀粒。