JPH02503623A - 外来性遺伝情報の受容システムとしての有用植物の胚 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 外来性遺伝情報の受容システムとしての有用植物の胚本発明は、有用な植物の非 被覆成熟胚をＤＮＡまたはＲＮＡの形態にある外来性遺伝情報の受容システムと して使用することに関する。さらに、本発明は、導入された外来性遺伝情報の内 容を有する露出成熟胚、該胚の製造方法、および遺伝子導入した有用植物を再生 し培養するための該胚の使用に関する。

アグロバクテリウム・ツメファシェンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍ ｅｆａｃｉｅｎｓ）は、主として双子葉植物のための十分に精査された取り扱い が容易である遺伝子転移システムであるが、これは単子葉植物にはほんの歩測し か適用されていない。したがって、遺伝子を直接植物に転移させること、すなわ ち細菌またはウィルスのベクターを使用しない遺伝子転移は代替の転移方法であ り、アグロバクテリウムの宿主となりにくい植物には非常に重要性を増しつつあ る。このような植物とはまさに、商業的に重要かつ有用な多くの植物、特に穀類 植物およびマメ科植物などであり、これらはＤ　Ｎ　Ａ工学で操作することが依 然として不可能に近い植物である。

直接的な遺伝子転移を目的としてプロトプラストを使用することが十分確立され ている。これは穀類植物のプロトプラストにも応用できる。しかし、穀類プロト プラストを再生させて成熟植物にすることが可能であるケースは稀にしかない。

これが、代替の方法を研究し続けなければならない理由である。

デ・う・ペネ（Ｄｅ　ｌａ　Ｐｅｎａ）らによって報告された文献、ネイチャ（ Ｎａｔｕｒｅ）　３２５　（１９８７）の２７４−２７６には、有用な植物に遺 伝子を直接転移させるための最初の成功経路が開示されている。減数分裂の前約 ２ｉ！ｉｉ目に、プラスミドＤＮＡを若いライ麦の穂に注入した。形質転換され た植物を第一代世代（’Ｆｌ　ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）で選択した。この方法に 加えてさらに、この著者は、共通の裸のＤＮＡを使用する種々の外植のインキュ ベートを包含する他の方法をも記載している。

高等植物の花粉、種子、胚芽、または多細胞構造体を外来性ＤＮＡで処置するこ とは知られているが、このことは、具体的な証拠がないために議論の的になって いる。

したがって、本発明の目的は、外来性遺伝情報を有用な植物、特に穀類およびマ メ科植物に挿入するための新規なシステムを提供することにある。

この目的は、本願の請求の範囲に記載された態様を行うことによって達成される 。

したがって、本発明の要旨は、Ｄ　Ｎ　ＡまたはＲＮＡの形態にある外来性遺伝 情報の受容システムとしての有用植物の非被覆成熟胚（ｕｎｃｏｖｅｒｅｄ、　 ｍａｔｕｒｅ　ｅｍｂｒｙｏｓ）に関する◎成熟種子の胚は、膨潤するとき、単 離された状態で、または種子（たとえば、機械的に露出された種子）内で外来性 遺伝情報を取り込むことができる。この「外来性遺伝情報」は、それ自身で複製 し、かつ感染性であるか、または安定にゲノムに組み込まれるＤＮＡまたはＲＮ Ａのいずれであってもよい。ウィロイド（ｖｉｒｏｉｄ）またはウィルスが、こ れと同じ態様の「外来性遺伝情報」なる用語に包含される。さらに、「外来性遺 伝情報」は、有用な植物に天然で存在しているが、表現型の変化を惹起させるた めにその有用な植物にコピーとして配置されている遺伝情報をも意味するもので ある。たとえば、これにより、有用な植物に天然で存在する遺伝子を増幅させる ことが可能である。しかし、成熟種子の胚の使用に加え、休眠様状態に入ってし まった体細胞胚または人工種子を使用することもできる。

本発明の要旨はさらに、ＤＮＡまたはＲＮ　Ａの形態にある導入された外来性遺 伝情報の内容を含有する有用な植物の露出成熟胚から形成される。

本明細書中、「露出」、「非被覆」、および「単離」なる用語を以下のように定 義する。

本発明では、露出胚は、その種子の少なくとも１部分の種皮が除去されてＤＮＡ またはＲＮＡの形態にある外来性遺伝情報が胚に侵入して行くことができるよう なものである。したがって、「露出胚（ｅｘｐｏｓｅｄ　ｅｍｂｒｙｏｓ）ヨな る用語は、一般的な名称と考えてよい。

単離胚および非被覆胚は外来性遺伝情報の内容を含有する本発明の露出狂の好ま しい態様である。

「単離胚（ｉｓｏｌａｔｅｄ　ｅｍｂｒｙｏｓ）Ｊなる用語は、種子の貯蔵組織 から分離されたものを意味する。単離小麦胚を製造する１つの方法は、ジョンス トン＆スターン（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ　＆　５ｔｅｒｎ）のＮａｔｕｒｅ　１７９ （１９５７）、１６０から１６１により既知である。しかし、ジジンストン＆ス ターンは、遺伝子導入した有用植物の再生および培養のためにこのような胚を使 用することは記載していない。

「非被覆胚（ｕｎｃｏｖｅｒｅｄ　ｅｍｂｒｙｏｓ）Ｊなる用語は、依然として 種子中にあるが、その種皮が、外来性遺伝情報が胚に侵入していく程にオーブン であるものを意味する。この非被覆胚は本発明にとって特に好ましい。その理由 は、遺伝子導入した有用な植物の再生および培養において再生する植物の収率は 、単離胚の場合よりも非被覆胚の場合のほうが高いからである。

「露出」、「非被覆」および「単離」間の関係を説明すると以下のようになる・ 露出狂 （種皮の一部または全部が除去されている）単離胚　　　　　　　　　　　　　 　非被覆胚・（種皮および貯蔵組織が　　　　　（種皮が開いているだけである すべて除去されている：　　　　　　かまたはその一部が除去されジョンストン ＆スターン参照）　　　でいる；本発明で初めて開示）本発明によれば、外来性 遺伝情報は細胞中で結合せずに存在していてもよく、または細胞のゲノムに組み 込まれていてもよい。胚の細胞中で結合せずに存在する遺伝情報は、さらにｒ　 Ｄ　Ｎ　Ａ工学的植物保護物（ＤＮＡ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ　ｐｌａｎ ｔ　ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ）Ｊと呼ぶこともできるであろう。

本発明の目的は、胚から成長した植物全体に効力をおよぼすか、または感染させ ることであるので、露出狂も、それ自身で複製し、植物に広がる遺伝情報のため の入り口として使用することができる。

限定された期間で、胚は外来性遺伝情報の遺伝子産物を製造することができ、こ の産物は今日通常の測定法によって検出することができる。これは、操作するの が幾分困難であるプロトプラストにおいてキメラ遺伝子の一時的発現を測定する のに代わるものである。

組織特異的発現は、その問題の組織が完全なものである限り期待することができ る。この発現の特異性はさらに、特異的プロモーターを使用することによっても 制御することができる。

本発明によれば、有用な植物の露出成熟胚は、その種子に機械的処理を加えるこ とによって入手するのが好ましい。胚の周囲の種皮を剥脱するなどして除去する ことにより、胚を非被覆状態にすることができる。胚がＤＮＡまたはＲＮＡ形態 にある外来性遺伝情報を享受できるような方法で種皮を剥脱する。しかし、その 際、胚の発芽能を有意に傷付けてはならないことは重要である。本発明によれば 、種皮の剥脱は、穏やかな工程であり、迅速に行うことができる。

したがって、本発明により、外来性遺伝物質の内容を含有する多くの有用な植物 を、短期間で、処置胚をもとにして培養することができる。

本発明はさらに、ＤＮＡまたはＲＮＡの形態にある導入された外来性遺伝情報の 内容を有する露出成熟胚を、有用な植物から製造するだめの方法に関する。この 方法では、有用な植物の露出成熟胚を、ＤＮＡまたはＲＮＡの形態にある遺伝情 報の水溶液で処置する。

本発明の方法の好ましい態様では、胚の水分含量は２０重量％よりも多くない。

本発明の方法のさらに好ましい態様では、その水溶液のｐＨは３から約１１であ る。

本発明の有用な植物の露出成熟胚は、遺伝子導入した有用な植物の再生および培 養に非常に適している。これらは特に、穀類植物およびマメ科植物の再生に適し ている。遺伝子導入した有用な植物を、本発明の胚を基礎として再生および培養 することは、自体既知の方法によって実施することができる。

本発明に係る解決策を見いだすための第１の工程は、一時的発現に関連する実験 を行うことであった。これらの実験の背景にある主要な考えは、特定のキメラ遺 伝子の発現を数日間行う（すなわち、一時的発現）ということであった。キメラ 遺伝子は、インビトロで組み立てられたＤＮＡ創製創製ブランクる。これらの創 製プロノクは機能し得る合成遺伝子を形成し、プラスミド上に配置することがで きる。以下の第１表は、上記事項に基づくものであり、例として小麦を使用した 本発明の詳細な説明するものである。

星上茎 単離した小麦胚におけるキメラ遺伝子の一時的発現再現性 ↓　↓ ＤＮＡ組み込み様式←→ＤＮＡ発現の最適化↓　　　↓ 形質転換 下記事項は、まず始めに、キメラ遺伝子の偶然の発現の観察、次ぎに、再現性条 件についての研究、発現の最適化を目的としたＤＮＡ組み込みの様式の究明の試 み、最後に、前に行った観察に基づいた、一時的または安定に形質転換された植 物を得ることのできる実験を説明するためのものである。このことは、植物自身 、またはその子孫が形質転換された、すなわちそのゲノムに組み込まれているこ ともある外来性遺伝情報を含有する処置胚から、植物を再生することをも可能で あることを意味する。処置胚の再生は、普通の方法、たとえばカルス誘導（体細 胞胚形成の誘導）にしたがって通常の培地中で培養するか、または種子の自然栄 養供給源を利用することによって行なわれる。

以下に、第１表で使用した用語の説明をする。

再現性（ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｉｌｉｔｙ）小麦胚を使用する最初の実験では、 この再現性が主として困難の原因であった。始め、単離胚１５ｍｇで、時々ＮＰ ＴＩＩシグナルが生じた。胚の量を３００ｍｇにまで増加させて初めて強さは変 動するものの、再現性のあるＮ　Ｐ　Ｔ　ＩＩシグナルが生じた（第１ａ図）。

これらの変動は、実験の偏差として考えることができるが、個々の胚のそれぞれ 異なる強度のＤＮＡ組込みおよびＤＮＡ発現として考えることもできる。

別個に行った同じ３つの実験においてＮＰＴＩＩシグナルを検出したにも拘わら ず、これらのデータはクリティカルな評価に値する。

Ｄ　Ｎ　Ａ処置していない胚の抽出液ではＮＰＴｎ活性が何等認められなかった ので、内生シグナルは除外することができる。細菌または菌類の混入は、検出さ れるＮＰＴｎングナル原因として、殆ど完全に無視することができる。クラホラ ン”（Ｃ１ａｆｏｒａｎ″）を細菌に対して培地中に加えたし、また培養中に真 菌類は認められなかった。培養中に真菌類と接触した培地部分は除去した。長期 培地を設計するために胚を滅菌する実験、または抗真菌剤（ｆｕｎｇｉｃｉｄｅ ｓ）を使用する実験は、成功しなかった。代わって、剥脱した種子の培養物を使 用した。さらに、内胚乳の片（培養直後の同一重量に基づく）を使用する対照実 験を行ったが、ＮＰＴＩＩ活性は示さなかった。

旦Ｎ人里込立９拝式 再現性が認められた後、ＤＮＡ組込みの様式およびＮＰＴＩＩ発現の最適性につ いて密接に関連する問題が持ち上がった。Ｄ　Ｎ　Ａが細胞質に到達し得る前に 、通過しなければならない２つの障害、細胞壁および細胞膜がある。

乾燥胚がある特定の特殊な性質を示さないならば、細胞壁を通してＤＮＡ分子が 遊走することは不可能なようである。カーピタル（Ｃａｒｐｉｔａｌ）らは、ア セル・シニードブラタナス（Ａｃｅｒ　ｐｓｅｕｄｏｐｌａｔａｎｕｓ）浮遊培 養細胞の細胞壁の孔サイズは３．８から４Ｊｌ［ｌｌであると決定した［サイエ ンス２０５（１９７９）、　１１４４−１１４７１゜これは、分子量１３００か ら１６００のポリエチレングリコールの自由な透過性に相当するものであり、こ れは、適当な分子半径を有する１７０００ｄまでの球状タンパク質に匹敵するも のである。しかし、これはおそらく小さすぎて４．１５ｋｂ　（２，７Ｘ　１０ Ｉｌｄ）のプラスミドは通り抜けることができないであろう。それでも胚の一時 的な発現が観察できるのは何故であろうか。浮遊培養細胞と胚の「細胞質豊富な 、かつ脆い細胞壁の細胞」とを比較することはある種の制限を受ける。このよう な浮遊培養細胞は規則正しい細胞コンプレックスでなく、その細胞壁構造は胚の それとは異なっているようである。さらに、膨潤工程は巨大分子の透過能に影響 を与えることがあり、これは既述した乾燥胚における強調すべき性質の１つと考 えられる。

ＤＮＡが細胞壁を通コ０するためのもう１つの手段として、単離（第ｌｂ図）ま たは剥脱工程によって胚に負わせた傷を介するものが考えられる。

このことは、ＤＮＡ分子がプラスモデスム（原形質連絡）を介して細胞から細胞 へ遊走しないならば、外来性ＤＮＡを取り込むことができ、発現を指令し得る細 胞は障害部位に近接するものだけであることを意味する。

膨潤期にある、または傷を負った胚細胞における脆い細胞壁は、細胞壁という障 壁を通過するための考えられる通路である。しかし、これは、原形質膜を越えた ことを意味するものでない。ＤＮＡが細胞膜を通過できないことは、共通する認 、識である。化学物質、および電気的パルス、またはその両者を使用し、原形質 膜の制御機能を欺き、プロトプラストにおいて一時的発現を行うことが成功して いる。本発明によれば、一時的発現は、たとえ補助的なものが存在しなくても起 こるが、たとえばＤＭＳＯを用いればそれを増大させることができることが証明 された（第１ａ図および第２図）。このように、乾燥胚は特殊な性質を有してい るようである。膨潤の初期が極めて重要であることが、超微細構造の研究および 透過性の観察によって確認された。

ＮＰＴ■発現に関する測定によれば、２０重量％を越えない水を含有している乾 燥胚において、ＤＮＡ組込みが最適に行える。さらに膨潤が進めば、著しく発現 が低下する（第２図）。これは、原形質膜のあり得る再構成と調和している。Ｄ ＭＳＯの影響も、それが一般に膜再構成または膜透過性に影響を与え得るという 点で、この考えと一致する（第３図）。

ＮＰＴｎ発現の最適化 ＤＮＡ組込みの様式を分析し、安定な形質転換に関する実験を行うための確立さ れた改良法を使用できるようにするために、関心の的を主としてＮ　Ｐ　Ｔ　ｎ 発現の最適化に集中させた。

本発明では、ＤＭＳＯは、小麦胚のＮＰＴＩＩ発現に対して促進性の影響を与え ることが見いだされた（２０％が最適である）（第３図の中央）。

他の２つの実験により、一時的発現のための改良条件が得られた。

各実験において、乾燥胚３００１ｇを使用する（第１ａ図および第２図）代わり にＤＭＳＯを使用することにより、胚物質を１５０πｇしか使用しないで、少な くとも同等の結果を得ることができた（第３図、上８）。胚３０Ｊｌ＋ｇまでで 、再現性さえも、そのシグナルは非常に弱いけれども検出された。プラスミドＤ 　Ｎ　Ａ　］　Ｑ　Ｑμｇを添加してその状況が改善された（第３図、下段）。

図面は以下の事項を示す。

第１図：（ａ）ＮＰＴＩＩ試験の結果：　Ｃ＝ｐＲＴ１００ｎｅｏで安定に形質 転換されたタバコのカルスを用いた対照；トラック］＝ｐＲ′ｒ１００ｎｅｏを 発現する一時的タバコプロトプラスト；トラック２から５＝膨潤した乾燥胚３０ ０ｚｇから得ろれた材料である発芽している小麦胚について、ＤＮＡ処置してい ないもの（トランク２）、および１５ｍｍｏｌＮａ（Ｊｊおよびｌ　、　５　ｍ ｍｏｌクエン酸三ナトリウム中、ｐＲＴ１００ｎｅｏ５０μｇと共にそれぞれイ ンキュベートしたちのくトラック３から５）である；＊＝非特異的植物活性；　 Ｋｍ−リン酸カナマイシン（リン酸ネオマイシントランスフェラーゼｒＮＰＴＬ 」の反応産物）。

（ｂ）０．７１■分画から単離した乾燥小麦胚。この材料を一時的発現に使用し たが、それは多少の完全胚、胚性、および少数の内胚乳片から構成されている。

矢印は胚の障害部位を示している。

（ｃ）小麦胚を使用した種々のインキュベート時間（時間単位）後のプラスミド ＤＮＡの分解（左）、および胚の不存在下におけるＤＮＡの安定性（右）。

第２図二発芽している小麦胚を使用したＮＰＴＩＩ試験の結果である（２つの試 料）。トランク１および２＝ＤＮＡ溶液（１５＋ｕ＋ｏｌＮａＣＱおよびｌ　、 　５ｍｍｏｌクエン酸三ナトリウム１ミリリットル当たりプラスミドＤ　Ｎ　Ａ 　Ｉ　Ｑ　Ｑμｇ）で３０分間処置し、次いで１５ｍｍｏｌＮｇＣρおよび１　 、５　ｍｍｏｌクエン酸三ナトリウム（ＤＮＡなし）で３０分間処置した胚；ト ラック３および４＝順序を逆にして、すなわちまずＤ　Ｎ　Ａのない溶液と、次 いでＤ　Ｎ　Ａ溶液と共にインキュベートした胚。Ｃ＝ポジティブ対照：＊＝非 特異的植物活性；に＠−’Ｊン酸カナマイシン。

第３図：発芽している小麦胚を使用したＮＰＴｎ試験の結果である： （上段）インキ二ベート時に２０％ＤＭＳＯおよびＤＮＡ５０μｇを使用した、 胚量の関数としてのＮＰＴＩＩシグナルである；（中段）種々の濃度のＤＭＳＯ を加えてＤＮＡ５０μｇで処理した胚１５０ｘｇ；（下段）胚１５０１ｇおよび ２０％ＤＭＳＯ添加時の、プラスミド濃度に基づ＜ＮＰＴｎ発現。Ｃ−ポジティ ブ対照；　Ｎ　Ｐ　Ｔ　Ｉｌシグナルのみを示す。

第４図：（ａ）カセｙ）ｐＲＴｌｏｏの構築経路である。矢印と並んで、クロー ニングに使用した制限部位を示す（個々の図式では、最も顕著なものしか示して いない）。５°突出末端の充填反応および３°突出末端の除去はクレノーポリメ ラーゼを使用して行った。

ポルカー・マツツアイト（Ｖｏｌｋｅｒ　Ｍａｔｚｅｉｔ）［１９８２；ケルン 大学の卒業論文〕によって、ＣａＭＶの単離体Ｃａｂｂ　Ｂ−Ｄの遺伝子閉領域 をｆｄｌｌ−６のＥｅｏＲＩサブクローン体として入手した。このクローンに基 づき、ポリＡシグナル（斜線部）をＨｐｈｌ−ＲｓａｌフラグメントとしてｐＵ ｃ１８［ヤニソン二−ペロン（Ｙａｎｉｓｈ−Ｐｅｒｒｏｎ）らのジーン（Ｇｅ ｎｅ）３３（１９８５）、　１０３−１１９Ｉの）］１ｎｃＩ［ｌ開裂部位に連 結した：プロモーター（点線部）をｐＵｃ　１９のＨｉｎｃｌｌ開裂部位に）（ ｐｈｌ　−Ｈ４ｎｃＩＩフラグメントとしてクローンした。逆の方向では、Ｓ　 ｍｘ　ＩおよびＫｐｎｌ開裂部位がＸｈｉｌおよびＮｃｏｌ開裂部位に置換され たｐＬｌｃ　１９誘導体の充填Ｘｈｏｌ開裂部位に、開裂したＰｓｔｌ開裂部位 を再度クローンした。Ｘｂａｌ開裂部位を削除し、次いでＳ　ｃａ　ｌおよびＳ ｓｔ■部位を介して最終的にその部分にプロモーターおよびポリＡシグナルを結 合し、ｐＲＴｌｏｏを得た。

（ｂ）ｐＲＴｌｏｏにおけるカセットのＤＮＡ配列である。ポリリンカー配列を 小文字で示し、ＣａＭ　Ｖ配列を大文字で示している。

ＴＡＴＡボックス（下線部）、想定される転写開始（”）　、Ｎｃｏ！開裂部位 のＡＴＧ、ポリアデニル化指令（コマンド）（下線部）、および想定される転写 終止（＠）をすべて示している。

第５図：Ｉ）ＲＴｌｏｏｎｅｏの構築の模式図である。ＮＰＴＩＩ遺伝子をｐＵ ｃ１８ｋａｎ＃４から５ａｉｌフラグメントとして切除し、ｐｔＪＲ２５０ｃル ーサー（Ｒｕｔｈｅｒ）、　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　　１０（１９ ８２）、　５７６５−５７７２］にサブクローンした。次いで、この中間体から Ｎ　Ｐ　Ｔ　ＩＩ遺伝子の５′末端を有する約１８０ｂｐＰｓｔｌフラグメント を取り出し、Ｈｉｎｄｍ開裂部位のないｐＵＣ１８誘導体にクローンした。Ｈｉ ｎｄＩＩｌ開裂し、充填反応し、８ｂｐリンカ−を使用して連結した後、Ｎｃｏ ｌ開裂部位を、すなわちＡＴＧコドンをこのクローン体に挿入できるようになっ た。最後に、ＮＰＴＩ＋遺伝子の５′末端をこの後者のクローンからＮｃｏｌ　 −Ｐｓｔ　Ｉフラグメントとして切り出し、それを、Ｐｓｔｌ−Ｘｂａｌフラグ メントであるＮＰＴＩＩ遺伝子の３”末端と共に、ＮｃｏｌおよびＸｂａｌで切 断しておいたｐＲＴｌｏｏにクローンした。

材料および方法 マニアチス（Ｍａｎｉａｔ　ｉｓ）らのモレ牛ニラ−・クローニング、ア・ラボ ラトリ−１マニニアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　ａ　Ｌａｂｏ ｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａ］）、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ −・プレス、二ニーヨーク（１９８２）にしたがって分子生物学的分析を行った 。

キメラ遺伝子 本発明において、キメラマーカー遺伝子として使用したモデルは、キメラマーカ ー遺伝子としてカリフラワー・モザイク・ウィルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモー ターによって制御されているネオマイシンホスホトランスフェラーゼ■遺伝子（ ＮＰＴｎ）を有するプラスミドｐＲＴ１００ｎｅｏである。この構築物の詳細な 説明を第４図および第５図に示す。第４ａ図は、ＣａＭＶ由来の３５５プロモー ター（単離体Ｃａｂｂ　Ｂ−Ｄ）および対応するＣａＭＶポリアデニル化シグナ ルを有する発現ベクターｐＲＴ　１００の構築を説明するものである。第４ｂ図 は、ＰＲ７１００ｎｅｏに至るクローニング工程を示すものである。一時的試験 のために使用したプラスミド（外来性遺伝情報）はそれらのフンホメーションと は無関係に種々の環状および線状の両形態で使用することができることが示され た。外来性遺伝情報とは、自己複製しかつ感染するか、またはゲノムに安定に組 み込まれるＤＮＡまたはＲＮＡである。

上記の問題に関して同一の結果が得られる他のプラスミドの例として、ｐＣＡＰ ２１２［ベルテンら（Ｖｅｌｔｅｎ　ａｎｄ　５ｅｈｅｌｌ）、Ｎｕｃｌ、Ａｃ １ｄｓ　Ｒｅｓ、１３（１９８５）、６９８１−６９９７１　、またはｐＥＰ９ のようなｐＤＨ５１の誘導体［ビートルザック（Ｐｉｅｔｒｚａｋ）らのＮｕｅ ｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１４（１９８６）、　５８５７−５８６８］が挙げら れる。

組織培養および形質転換法 概して実験は、枝分かれしていない夏小麦の種子を使用して行った。しかし、冬 小麦、夏大麦、冬大麦、夏ライ麦、冬ライ麦、ライコムギ、エンバク、メイズ、 米、および穀実用モロコシ（ｓｏｒｇｈｕｍ）、またはエントウ、豆（インゲン ）、大豆、ブソフォカルパス（ｐｓｏｐｈｏｃａｒｐｕｓ）など、他の有用な植 物などの他の穀類の種子を使用することもできる。

「成熟種子」またはただの「種子」なる用語は、高等植物の種を伝播し、保存す るための器官を意味するものである。この器官は、ソードリング（ｓｅｅｄｌｉ ｎｇ）　（胚）、栄養物を与える組織（内胚乳）、および多少硬い種皮（テスタ ）から形成されている。

機械的手段によって胚を単離することは、ドライアイスを使用すること以外は、 ジ目ンストンら（Ｊｏｂｎｓｔｏｎ　ａｎｄ　５ｔｅｒｎ）ＥＮａｔｕｒｅ　１ ７９（１９５７）、　１６０−１６１１によって設定された調節法にしたがって 行った：小麦の種子６５０ｇのうち１３０ｇを、ワーリング・ブレンダー１（１ ａｒｉｎｇ　Ｂｌｅｎｄｏｒジの１リツトル容器中で最も低速で１０秒間粉砕し た。

得られた粉砕種子を試験ふるい（１、６ｘｗ、　　１　、０　ｘｍ、０．５ｍｇ メソシ二幅）にかけて分画した。１．６１ｊＩ分画を同一処置に３回供した。

ふすま、および穀皮粒子を扇風機によって除去し、シクロへ牛サン／四塩化炭素 を使用した浮選によって内胚乳から胚を分離した。第１表は、個々の穀類につい て胚−内胚乳を分離するための経験的に決定されたシクロへ牛サンと四塩化炭素 との混合比を示すものである。最後に、多少とも完全な胚をふるい法（０，７１ １１メツシユ）を使用して胚フラグメントから分離した。この０．７１１１分画 を第１ｂ図に示す。胚の収率は、夏小麦については約４０％である。

１２遣 各種穀類の胚と内胚乳とを分離するためのシクロへ牛サン／四塩化炭素の混合比 ｔｔｉ　　　シクロへ牛サンの置　　四塩化炭素のｔ、＋−夏生小麦　　　　１ ００　　　　　　　２５０冬小麦　　　　　１００　　　　　　　２５０夏大麦 　　　　　１００　　　　　　　２５０冬大麦　　　　　１００　　　　　　　 ２５０冬ライ麦　　　　１ｏ○　　　　　　　　３００ライコムギ　　　１００ 　　　　　　　３３０エンバク　　　　　１００２５０ メイズ　　　　　１００　　　　　　　２００　　　　分離不良米　　　　　　 　　　１００　　　　　　　　　２５０穀実用モロコシ　１００　　　　　　　 ２００最適な形態にある小麦胚のＤＮＡ処置は下記のように行った：単離した胚 １５０ｍｇを以下の組成からなるインキュベート緩＃液５００μρ中で３０分間 室温にてインキュベートしたニブラスミドＤＮＡ　２００μｇ　　（＝７３ｐＭ ）ＮａＣρ１５ｍｍｏｌ クエン酸三ナトリウム３　、５　ｍｍｏ１２０％ＤＭＳ○ 水で満たし１ミリリツトルにした。

胚の培養は、２４℃において１２時間光周期で６００ルクス（ｌｕｘ）下に行っ た。それらを、ホルモンを加えていない固＋ＵＭＳ培地のフィルター上に置いた ［ムラシゲら（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ　ａｎｄ　Ｓｋｏｏｇ）、　Ｐｌａｎｔ　Ｐ ｈｙｓｉｏｌ、　１５（１９６２）、　４７３−４９７コ。培養の約３日後に、 得られた胚を遺伝子発現に関して調査した。

種子中の胚に関する実験 単離胚とは別個に、小麦種子の胚もＤＮＡで処理した。これに関し、まず果皮を 注意深く剥脱して胚を非被覆化し、次いで上記のインキ二ベート緩衝液２−３μ ｇで湿らせた。その直後か、または乾燥させた後、このようにして処置した種子 を、湿らせた濾紙上で培養して一時的発現を試験するか、または土壌上に散布し て安定な形質転換を試験した。後者は多重ポットラック（ｍｕｌＨｐｏｔ　ｒａ ｅｋｓ）［９６ポツト］中に入れ、ホイルで被覆し、温室で２４°Ｃに４日間保 持した。その際、ふるいにかけた土壌をかぶせた。

酵素試験方法 ＮＰＴ試験［レイス（Ｒｅｉｓｓ）ら、Ｇｅｎｅ　３０（１９８４）、　２１１ −２１８　：シュレイアー（Ｓｃｈｒｅｉｅｒ）ら、ＥＭＢＯＪ、　４（１９８ ５）、　２５−３２　；これらの変法］試験毎に１００μＣｉ［”Ｐγ−ｐｒｐ ３を使用し、試験操作法に若干の変化を加えてＮ　Ｐ　Ｔ試験を行った。発芽し た胚を、水上、抽出緩衝液（６２，５ｍ＋ＩＩｏｌのトリス−ＨＣＱ　ｐＨ６， ８および５％β−メルカプトエタノール）２ＩＲ中において、モーターで粉砕し た。

次いで、得られたホモジネートを１００，０ＯＯＸｙで６０分間遠心し、５０％ （ＮＨ，）、Ｓｏ、でＮＰＴｎを上清から沈澱させた（９０００　Ｘ９．４°Ｃ １１５分間）。硫酸アンモニウムを使用すれば、３０％以上でＮＰＴＩＩを沈澱 させることができる。約４５％では、上清中にはＮＰＴｎはもはや見いだせなく なる。タンパク質沈澱物を抽出緩衝液２５０μＱで注意して洗浄し、次いで緩衝 液（６２，５ｍ１Ｉｌｏｌ　）リス−ＨＣＱ　ｐＨ６，８，５％β−メルカプト エタノール、１０％グリセリン、および０．０２５％ブロモフェノールブルー） ５０μａに溶解した。

実施例は本発明を説明するものである。

夫奥廻ユ 単離小麦胚の一時的発現 １５ｍｍｏｌＮａＣ４および１　、５　ｍｍｏ＋クエン酸三ナトリウム１ミリリ ットル当たり乾燥小麦胚１５１ｇ、およびＤＮＡ１００μｇ（すべて、前もって ３日間培養しておいた）をインキュベートした後、まず、時々にしか起こらない ＮＰＴｎシグナルを得た。実験の目的は、それが人工産物でないことを示すこと にあった。

一連の実験では、ＤＮＡ？８液（１５ｍｍｏｌＮａＣＩ２．１．５ｍｍｏｌクエ ン酸三ナトリウム、１ミリリツトル当たりプラスミドＤＮＡ１００μｇ）中で、 種々の１１（１５，５０，１００，２００，３００，４００ｍｇ）の胚を膨潤さ せ、次いで培養した。２つの試料について、その胚量から規則的かつ再現性よく 起こるであろう以後のＮＰＴＩＩシグナルが起こることを示すことを目的とした 。胚２００．３００および４００ｘｇにおいて２つのシグナルが検出された。し かし、２００ｍｇのシグナルはむしろ非常に弱かったので、以後の実験の初期胚 量は３００ｘｇに増加させた。

第１ａ図は、ＤＮＡで処置していない抽出胚（トラック２）と比較した、ＤＮＡ −処置胚（３つの試料ニドランク３から５）を用いた実験の結果を示すものであ る。

次いで、乾燥胚がＤＮＡの組込みに必須であるか否かを調査した。

ＤＮＡ組込みの工程を説明する為に、簡単な実験が計画された。前述のように、 最初の３０分間に胚３００＋ｇをＤＮＡで処置したが、以後の３０分間はＤＮＡ 不含溶液で処置した。別の胚３００ｍｇを反対の方法で処置した。まず、ＤＮＡ 不含溶液と共に、次いでＤＮＡ含有溶液と共にインキユベートした。得られた結 果（２つの試料）を第２図に示す。乾燥した胚のみが、ＤＮＡを取り込むことが でき、培養後にそれを発現することができる。さらに、ＤＮＡの組込みは、膨潤 の最初３０分以内で起こる。次の実験により、最初の３分以内で起こるＤＮＡ組 込みが最も顕著であり、次いで徐々に減少し、１５分後には実質的に完了するこ とが示された。

次に実施した実験は、どれ程発現が増強されるかを観察するものである。その当 時、選択した開始条件が最適かどうかは、まだ不明であった。以下の実験によっ て、この問題を解決し、発現システムを一般に改良した；最初、ＤＭＳ○を試験 した。ＤＭＳＯ濃度が高（なればなる程（２０％まで）、発現の増大が高くなっ た（第３図）。ＤＭＳＯ濃度を３０％またはそれ以上にした場合、生型１１Ｏｒ ｅｓｈｗｅｉｇｈｔ）は減少する。したがって、ＮＰＴＨの発現は減少する。こ の結果に基づき、上述のＤ　Ｎ　、Ａ溶液（１５ｍｍｏｌＮａＣｆｆ、１　、５ 　＋ｎｍｏｌクエン酸三ナトリウム、１ミリリツトル当たりプラスミドＤＮＡ１ ００μｇ）を以下のように改変した：　１５＋ｎｍｏｌＮａＣ１２，１、５ｍｍ ｏｌクエン酸三ナトリウム、２０％ＤＭＳ○、１ミリリツトル当たりプラスミド ＤＮＡ１００μｇ０種々の量の胚を用いた新しい系列の実験により、使用した胚 ３０ｘｇまでで、ＮＰＴＩＩシグナルの再現性が認められ、１５０および３００ ｍｇでは比較的強いシグナルが認められた（第３図、上段）。したがって、胚の 量を１５０ｘｇにまで減少させた。

これらの改変パラメーターを使用し、最大のＮ　Ｐ　Ｔ　ｎ発現が得られるであ ろうＤＮＡ濃度についての研究を続行した。インキュベート調製物（胚１５０ｚ ｇ、プラスミドＤＮＡ％　　１５ｍＩＩ＋ｏｌＮａＣＩ２ｓ　　１　。

５ｆｆ１ｍｏ＋クエン酸三ナトリウム、２０％ＤＭＳＯ）０．５ｍρ当たりプラ スミド２５．５０．１００、および２００μｇ間の比較により、０．５蛙当たり ＤＮＡ　１００および２００μｇで最大発現が起こることを確認した（第３図） 。したがって、０．５ＲＱ当たり１００μｇのプラスミドＤＮＡ　（または１祿 当たり２００μｇ）を使用することが、このパラメーターでは最適である。

したがって、最適なインキュベート調製は、乾燥小麦胚１５０ｘｇ プラスミドＤＮＡ１００μｇ　　（３６，５ｍｍｏｌ）ＮａＣＣ１５μｇ クエン酸三ナトリウム１　、５　ｍｍｏ１２０％ＤＭＳＯ 水を充填して０．５ミリリツトルとすることを特徴とするものである。

胚をこのインキュベート緩衝液と共にインキュベートする場合、ＮＰＴｎは培養 後２４時間足らずで確実に検出することができる。

２４．４８、および７２時間の時点の培養により、ＮＰＴＩＩ活性の連続した増 加が認められた。

実施例２ 種子中の小麦胚における一時的発現 本実験では、剥脱によって胚を非被覆化した小麦胚を使用した。

小麦の種子をＤＮＡで処置しく既述のように、最適条件下で）、３日間発芽させ た。次いで、ソードリンゲスを単離し、ＮＰＴｎ活性について検査した。単離処 置胚と同様に、ここでもＮＰＴＩＩ活性が検出された。これにより、片方の処置 を行った胚でさえもＤＮＡを取り込み、発現することができることが判明した。

寒旌ガ洛 穀類胚の一時的発現 夏小麦胚について確立された方法によって、冬小麦、夏大麦、冬大麦、ライ麦、 エンバク、メイズ、および穀実用モロコンの胚についても一時的発現を検出した 。

実施例４ マメ科植物の胚の一時的発現 エンドウ、インゲンマメ、およびンラマメ由来の胚３００ｘｇを、小麦胚の場合 と同じ方法によってＤＮＡと共にインキュベートした。

培養３日後に、ＮＰＴｎ活性を検出した。

寒黴豊五 星憲２ｐ旦掃 土壌中における剥脱種子の培養 １０個の小麦種子を、「材料および方法」で記載したように剥脱し、その剥脱部 位に水２μρを適用した。次いで、これらを標準の土壌／砂（１０／１）（以下 、「土壌」と呼ぶ）上に置き、発芽させた。試験試料は非処置の種子であった。

剥脱した材料は試験試料よりも早く発芽した。しかし、３日後には、後者はより 速く成長した。

さらに観察すると、剥脱した胚の幾つかは子葉鞘、根鞘および組織下にまで障害 を受けていることが分かった。さらに、発芽していないことが観察され、これは おそらくごの障害が原因である。しかし、剥脱した種子からは、強い胚盤葉を有 する全部で８個のソードリンゲスが得られた。

次の実験は、ＤＮＡ−処置した剥脱種子９６個、および９６個の非処置試験種子 をそれぞれ含有する多重ポットラックを使用して行った。２４℃の温室中、石英 砂をかけた土壌でそれらの種子を培養し、３週間経過時点で、発芽したのは、Ｄ 　Ｎ　Ａ処置植物がたったの２１個であったのに対し、対照種子は８３個であっ た。これは、約２３％の成功率を意味する（第３表）。

さらに実験を行い、２８８個の剥脱し、ＤＮＡ処置した種子を、それぞれ土壌巾 約１から２ｃｍの深さに挿入するか、土壌上に置き、ふるいにかけた土壌をかけ るか、または土壌上に散布した。次いで、それらをプラスチ、りのホイルで覆い 、再びふるいにかけた土壌で覆った。３週間後に得られた結果も第３表に示す。

最も高い発芽率である６３％が、ホイルで覆った種子で観察された。この結果に 鑑み、その後の実験では、剥脱し、処置した種子を土壌上に散布し、最初の４日 間、ホイルで被覆した。次いで、これらをふるいにかけた土壌で覆った。

散布した種子　　発芽した種子　発芽率　　変化パラメーターの数　　　　　　 の数 ９６　　　　　　２２　　　　２３％　　　石英被覆試験、９６　　　　　　８ ３　　　　８６％　　　石英被覆２８１１１　　　　　　４９　　　　１７％　 　　土壌上土壌中１−２ｃｘ。

２８８　　　　　　７１　　　　２５％　　　ふるいにかけた土壌で覆う。

２８８　　　　　　１８１　　　　６３％　　　土壌上、４日間ホイルで被覆し 、次いでふる いにかけた土壌で覆う。

１１０００個の散布した、剥脱しかつＤＮＡ処置した種子のうち、約４３００の 植物が成長し、種子成熟した。収穫した種子を、マーカー遺伝子（たとえば、Ｎ ＰＴＩ［を介したカナマインン耐性）にしたがった選択条件下で発芽させ、生存 している植物を、マーカー遺伝子の遺伝子産物および付加したＤＮＡの存在の両 方に関して調査した。

Ｆｉｇ、　　２ Ｆ工ＧｔＪＲ３ Ｆ工９．４Ａ 平成　１年１１月２２日

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. １．ＤＮＡまたはＲＮＡの形態にある外来性遺伝情報の受容システムとしての有 用植物の非被覆成熟胚。
2. ２．ＤＮＡまたはＲＮＡの形態にある導入された外来性遺伝情報の内容を含有す る有用植物の非被覆成熟胚。
3. ３．単離されている請求項２に記載の胚。
4. ４．非被覆化されている請求項２に記載の胚。
5. ５．外来性遺伝情報がＤＮＡの形態にあり、それがゲノムに組み込まれるもので ある請求項２から請求項４までのいずれかに記載の胚。
6. ６．外来性遺伝情報が植物に広がるが、ゲノムには組み込まれないＤＮＡまたは ＲＮＡの形態にあるものである請求項２から請求項５までのいずれかに記載の胚 。
7. ７．胚がＤＮＡまたはＲＮＡの形態にある外来性遺伝情報を受け入れるが、その 発芽能を実質的に傷付けないような態様によって、胚を含有する種子の胚領域に おける種皮を除去することを特徴とする請求項１に記載の胚の製造方法。
8. ８．有用な植物の露出成熟胚を、ＤＮＡまたはＲＮＡの形態にある遺伝情報の水 溶液で処置することを特徴とする請求項２から請求項６までのいずれかに記載の 胚の製造方法。
9. ９．胚の水分含量が２０重量％を越えない請求項８に記載の方法。
10. １０．水溶液のｐＨ値が３から約１１である請求項８または請求項９に記載の方 法。
11. １１．遺伝子導入した有用植物を再生し、培養するための請求項２から請求項６ までのいずれかに記載の胚の使用。