CN118126147A - BnaNF-YA2基因、蛋白及其在调控甘蓝型油菜水分胁迫抗性中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物领域，涉及BnaNF‑YA2基因、蛋白及其在调控甘蓝型油菜水分胁迫抗性中的应用，具体涉及一种调控甘蓝型油菜水分胁迫抗性基因BnaNF‑YA2的分离克隆和应用，本发明分离和应用一种包含BnaNF‑YA2基因的DNA片段BnaNF‑YA2，该片段赋予甘蓝型油菜水分胁迫抗性增强的能力。其中，含有BnaNF‑YA2基因编码区的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示，它编码蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。本发明从甘蓝型油菜中分离BnaNF‑YA2基因，通过基因工程技术控制BnaNF‑YA2基因的表达量能够调控甘蓝型油菜对水分胁迫的抗性，对于培育水分胁迫抗性提高的甘蓝型油菜新品种具有十分重要的意义。

Description

BnaNF-YA2基因、蛋白及其在调控甘蓝型油菜水分胁迫抗性中 的应用

技术领域

本发明涉及甘蓝型油菜基因工程领域。具体涉及分离、克隆和通过功能验证得到一种能够提高水分胁迫抗性的甘蓝型油菜BnaNF-YA2片段在甘蓝型油菜水分胁迫抗性遗传改良中的应用。本发明利用PCR的方法，分离到调控甘蓝型油菜水分胁迫应答的基因BnaNF-YA2，并利用基因工程技术获得BnaNF-YA2过表达载体，过表达该基因能够提高甘蓝型油菜对水分胁迫的抗性，证实了该基因的功能及其应用途径。

背景技术

油菜功能多样，不仅是我国食用油和高蛋白饲用饼粕的重要来源，也可以当做蔬菜食用或用于修复和改良土壤，在欧洲有超过一半的油菜籽用于生物柴油行业，具有广泛的利用价值。我国油菜的产量和种植面积均居于世界前列。油菜主要分为白菜型油菜、甘蓝型油菜和芥菜型油菜，甘蓝型油菜是中国目前栽培的主要油菜类型。然而，干旱胁迫严重影响甘蓝型生长发育，大大制约着油菜的产量和品质，威胁油菜行业的健康发展。我国油菜产区常常面临干旱气候和缺水条件，因此，挖掘油菜抗水分胁迫相关基因，培育具有优良水分胁迫抗性的油菜新种质对于拓展油菜种植范围，提高油菜产量具有重大意义。但目前关于油菜水分胁迫调控的报道较少。目前甘蓝型油菜水分胁迫抗性相关研究主要是围绕抗水分胁迫种质资源筛选鉴定、抗水分胁迫相关性状的QTL定位等，研究者们鉴定得到的抗水分胁迫基因数目不多，围绕油菜水分胁迫相关基因开展的功能研究工作相对来说也比较滞后。

发明内容

本发明提供一种BnaNF-YA2在增强甘蓝型油菜水分胁迫抗性中的应用。利用qPCR方法分析了甘蓝型油菜中BnaNF-YA2在水分胁迫条件下的表达变化情况，结果显示在聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)条件下，BnaNF-YA2的表达显著上升。本发明分离和应用一种包含BnaNF-YA2的DNA片段，该片段赋予甘蓝型油菜提高水分胁迫抗性的能力。

为了实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案为：

一种调控甘蓝型油菜水分胁迫抗性的蛋白，所述蛋白为如下(a)或(b)：

(a)包括SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的蛋白质；

(b)将SEQ ID NO:2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与甘蓝型油菜水分胁迫抗性调控相关的由SEQ ID NO:2衍生的蛋白质。

一种调控甘蓝型油菜水分胁迫抗性的基因，所述基因编码上述的蛋白。

一种调控甘蓝型油菜水分胁迫抗性基因，所述基因为BnaNF-YA2，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示。

所述的BnaNF-YA2的编码序列如序列表SEQ ID NO:1所示，基因序列长度为846bp，编码281个氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

一种调控甘蓝型油菜水分胁迫抗性的基因。所述基因包括如下(a1)-(a3)中任何一种的DNA分子：

(a1)包括如SEQ ID NO:1所示序列的DNA分子；

(a2)在严格条件下与(a1)限定的核苷酸序列杂交且编码甘蓝型油菜水分胁迫抗性调控相关蛋白的DNA分子；

(a3)与(a1)限定的核苷酸序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或者至少具有99％同源性的甘蓝型油菜水分胁迫抗性调控相关DNA分子。

本发明的另一个目的是提供含有前述基因的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系。

本发明还提供所述的调控甘蓝型油菜水分胁迫抗性基因在转基因甘蓝型油菜中的应用。

本发明的又一个目的是提供(b1)或(b2)或(b3)的应用：

(b1)所述基因或含有所述基因的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系在调控甘蓝型油菜水分胁迫抗性中的应用；

(b2)所述基因或含有所述基因的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系在培育甘蓝型油菜抗水分胁迫品种中的应用；

(b3)所述基因或含有所述基因的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系在调控植物水分胁迫抗性中的应用。所述的植物为甘蓝型油菜、水稻、烟草、大豆、番茄或小麦。

进一步的，所述应用包括提高甘蓝型油菜萌发期的下胚轴长和鲜重。

本发明还提供一种培育提高植物水分胁迫抗性的转基因植物的方法，提高目的植物中所述核苷酸片段的含量或活性，得到转基因植物；所述转基因植物的水分胁迫抗性增加。

一种培育提高植物水分胁迫抗性的转基因植物的方法，采用前述方法培育得到转基因植物；所述的转基因植物含有甘蓝型油菜水分胁迫抗性调控基因。

本发明还提供了一种调控甘蓝型油菜水分胁迫抗性基因重组载体的构建方法，所述基因为前述调控甘蓝型油菜水分胁迫抗性的基因，所述方法包括以下步骤：以甘蓝型油菜Darmor的cDNA为模板扩增得到BnaNF-YA2基因片段并连接到克隆载体上，利用添加pMDC83载体同源臂的引物进行PCR扩增后与相应酶切的pMDC83骨架载体进行同源重组，最终获得BnaNF-YA2基因的过表达载体。

本发明还提供一种抗水分胁迫转基因植物的培育方法，对上述构建方法构建的载体进行农杆菌转化，利用农杆菌介导法实现外源片段在甘蓝型油菜中的遗传转化，得到转基因植物。

进一步的，所述遗传转化方法包括：

种子灭菌：分别用75％乙醇和2％浓度次氯酸钠溶液浸洗甘蓝型油菜种子，期间晃动浸洗的容器使种子充分灭菌，然后用无菌蒸馏水冲洗种子5-6次；

接种：将灭菌后的种子均匀接种于M₀培养基上，25℃黑暗条件下培养5-6d；

侵染：提前2-3d活化保存于－80℃的农杆菌菌株并挑取单克隆进行阳性鉴定，在切苗前一天晚上将鉴定过的阳性单克隆菌落接种于含有卡那霉素(Kanamycin，Kan)和利福平(Rifampicin，Rif)抗性的LB液体培养基中，28℃250rpm培养12-16h；25℃6000rpm离心5min，弃去上清，用DM液重悬菌液后离心，弃去上清后利用DM液再次重悬农杆菌液。在无菌操作台上将培养好的油菜幼苗下胚轴切下并分割成0.8-1.5cm的小段，暂时置于DM侵染液中，向DM中加入AS母液(V_DM：V_菌液：V_AS＝1000：100：1)，用DM侵染液将外植体侵染10min后转移至无菌滤纸上晾干；随后将外植体转移至M₁培养基上，25℃黑暗条件下培养36～48h；

愈伤分化：将生长状态健康的外植体从M₁培养基转移到含有250mg/L Hyg的M₂培养基上，25℃光照条件下培养2～3周后，将分化出明显愈伤组织的外植体转移至含有250mg/LHyg的M₃培养基上，每隔2～3周继代一次，一般继代2～4次后会观察到愈伤组织处长出绿色幼苗；

生根培养：选择具有明显生长点的幼苗，用剪刀和解剖刀除去多余的老叶和愈伤组织，然后转移至M₄培养基上，25℃光照条件下培养2～4周至幼苗生根；

将幼苗从培养基中取出，小心清洗掉根上的培养基后转移到油菜培养土中炼苗2-4周，然后移栽至大田中继续生长。

本发明还提供一种鉴定甘蓝型油菜抗水分胁迫品种的方法，提取甘蓝型油菜基因组RNA，检测前述调控甘蓝型油菜水分胁迫抗性基因的表达量。

进一步的，引物序列如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示。

携带有本发明BnaNF-YA2的表达载体可通过使用Ti质粒、植物病毒载体，直接DNA转化、微注射、电击转化等常规生物技术方法导入植物细胞。

可使用包括本发明的BnaNF-YA2的表达载体转化宿主(包括甘蓝型油菜在内的多种植物)，培育水分胁迫抗性相对提高的植物品种。植物宿主还可以为水稻、烟草、大豆、番茄、小麦等。

利用DNA回收试剂盒回收包含BnaNF-YA2基因的DNA扩增片段，利用酶切连接的方法连入pMDC83骨架载体，构建该基因的过量表达载体，命名为pMDC83-BnaNF-YA2。

利用电击转化法将pMDC83-BnaNF-YA2载体导入GV3101农杆菌。借助农杆菌侵染介导的遗传转化方法将pMDC83-BnaNF-YA2转化甘蓝型油菜受体材料J9712，成功获得了BnaNF-YA2基因表达量相对于对照显著升高的转基因植株，观察发现，与对照植株相比，过表达pMDC83-BnaNF-YA2的转基因甘蓝型油菜在15％ PEG和120mM甘露醇模拟水分胁迫条件下，植株生长状况较好，说明BnaNF-YA2能够调控植物对水分胁迫的抗性。

有益效果

本发明以甘蓝型油菜为研究材料，通过分析甘蓝型油菜在正常条件下和水分胁迫条件下BnaNF-YA2的表达水平，发现BnaNF-YA2在正常条件下和干旱胁迫条件下显著差异表达，可能在提高植物水分胁迫抗性中起重要作用。

甘蓝型油菜是我国食用植物油的主要来源之一，提高甘蓝型油菜的抗逆性是目前油菜育种工作的重要目标之一。本发明从甘蓝型油菜中分离BnaNF-YA2基因，发现BnaNF-YA2对水分胁迫有明显应答，最终得到的过表达BnaNF-YA2的转基因材料对水分胁迫的抗性增强，对拓展油菜种植范围、培育抗逆性增强的甘蓝型油菜新品种具有重要的应用潜力。

本发明通过候选基因筛选和鉴定，验证了BnaNF-YA2基因受水分胁迫诱导表达，过表达BnaNF-YA2基因提高了转基因油菜对水分胁迫的抗性，表明BnaNF-YA2基因参与了油菜对水分胁迫的应答过程。因此，从油菜中分离BnaNF-YA2基因，并鉴定它在提高油菜水分胁迫抗性方面所发挥的功能，对于培育抗水分胁迫的油菜新品种将具有非常重要的意义。

附图说明

图1为BnaNF-YA2在PEG处理条件下的表达情况；

图2为BnaNF-YA2过表达载体(pMDC83-BnaNF-YA2)构建示意图；

图3为BnaNF-YA2在pMDC83-BnaNF-YA2阳性转基因植株中的表达情况，CK为转基因阴性植株(对照)；其余编号的植株为BnaNF-YA2阳性转基因油菜植株；

图4为BnaNF-YA2转基因油菜在PEG和甘露醇模拟水分胁迫下的表型，CK为对照植株；BnaNF-YA2-OE-6，BnaNF-YA2-OE-8，BnaNF-YA2-OE-16代表BnaNF-YA2表达量较高的转基因甘蓝型油菜株系；其中A为照片，B为数据柱形图。

具体实施方式

以下实施例定义了本发明，并描述了本发明克隆包含有BnaNF-YA2编码区段的DNA片段，以及验证BnaNF-YA2基因功能的方法。根据以下描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种改变和修改，以使其适用于不同的用途和条件。

实施例1：qPCR分析甘蓝型油菜内源BnaNF-YA2在PEG模拟水分胁迫条件下的表达情况

在甘蓝型油菜四叶一心时期对其进行15％ PEG模拟水分胁迫处理，在0d、3d、5d和7d对同一时刻的叶片样品进行取样，迅速置于液氮中保存。采用南京诺唯赞公司的RNAisolater Total RNA Extraction Reagent试剂提取总RNA，利用南京诺唯赞公司的RNAHiScript Q RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)反转录试剂盒进行反转录获得cDNA。

反转录体系：

移液器吸打混匀，42℃反应2min。

移液器吸打混匀，50℃反应15min后85℃处理5s，产物保存于－20℃冰箱备用。利用甘蓝型油菜的特异性内参引物BnaActin-QF(5'-TCTTCCTCACGCTATCCTCCG-3')(SEQ IDNO:3)和BnaActin-QR(5'-AGCCGTCTCCAGCTCTTGC-3')(SEQ ID NO:4)检测模板cDNA的质量和浓度。

利用qPCR技术检测BnaNF-YA2在PEG模拟水分胁迫不同时间点的相对表达量(BnaNF-YA2-QF引物：5'-CCCTCTGCTCCACAGATTTCTT-3'(SEQ ID NO:5)，BnaNF-YA2-QR引物：5'-CCTTAACTCCGGCCAATGAA-3')(SEQ ID NO:6)，如图1所示，BnaNF-YA2在水分胁迫处理后的甘蓝型油菜叶片中的表达水平显著升高。

实施例2：甘蓝型油菜BnaNF-YA2基因的分子克隆

对甘蓝型油菜“Darmor-bzh”三叶一心期幼苗叶片进行取样，置于液氮中速冻后将样品保存于－70℃冰箱中至提取总RNA。利用大连TaKaRa公司的RNAiso Plus试剂盒提取总RNA。利用南京诺唯赞生物科技有限公司的HiScriptⅢ1st Strand cDNA Synthesis Kit(+gDNA wiper)试剂盒合成甘蓝型油菜cDNA。

以上述试剂盒合成的cDNA第一链为模板，以基因特异性引物BnaNF-YA2-TF：5'-TCATCTCGGCAACGTCGAATCT-3'(SEQ ID NO:7)和BnaNF-YA2-TR：5'-CAGGTTTTGAAACTGCAGCAGC-3'(SEQ ID NO:8)为引物，利用RT-PCR进行PCR扩增，扩增条件为：94℃3min，94℃15s，59℃15s，72℃50s，35个循环；72℃7min。利用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，利用康为世纪生物科技有限公司的DNA回收试剂盒回收特异性目的片段。将目的片段连接与北京全式金生物技术有限公司的pEASY-Blunt T载体进行连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取单菌落进行菌落PCR进行阳性鉴定，委托扬州擎科生物科技有限公司对阳性克隆进行测序分析，将测序验证无误的质粒命名为BnaNF-YA2-T。

实施例3：BnaNF-YA2基因过表达载体(pMDC83-BnaNF-YA2)的构建

为了进一步分析BnaNF-YA2基因的功能，将其在甘蓝型油菜中过量表达，通过观察转基因植株在水分胁迫条件下的表型来研究该基因参与油菜水分胁迫应答的功能。

过表达载体构建方法如下：以BnaNF-YA2-T为模板，使用引物BnaNF-YA2-F(5'-GACCTCGACTCTAGAACTAGTCATCTCGGCAACGTCGAATCT-3')(SEQ ID NO:9)，序列特异引物外加pMDC83载体同源臂)和BnaNF-YA2-R(5'-CGGGCCCCCCCTCGAGGCGCGCCAGGTTTTGAAACTGCAGCAGC-3')(SEQ ID NO:10)，序列特异引物外加pMDC83载体同源臂)进行PCR扩增，扩增条件为：94℃3min，94℃30s，58℃30s，72℃1min，共35个循环；72℃5min。将目的片段利用DNA回收试剂盒回收后通过同源重组的方法连入pMDC83骨架载体，转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，挑取单克隆后进行菌液PCR以鉴定阳性克隆，获得的阳性质粒即为该基因的过量表达载体，命名为pMDC83-BnaNF-YA2(图2)。

实施例4：pMDC83-BnaNF-YA2载体的甘蓝型油菜遗传转化

利用电击转化法，按照如下步骤对pMDC83-BnaNF-YA2载体进行农杆菌转化：准备电转仪、无菌电转杯和无菌液体LB培养基；取农杆菌GV3101感受态细胞放置冰上融化，加入1μL目的质粒混匀；吸取农杆菌感受态细胞和质粒的混合物加入电转杯底部，设置2000V电压进行瞬时电击，迅速向电转杯中加入500μL无菌LB液体培养，用移液器吸打混匀后吸取农杆菌液转入新离心管中，28℃200rpm复苏培养30min；取出菌液，室温6000rpm离心5min，弃上清后用无菌LB液体培养基重悬菌液；取适量菌液涂布于含有Kan和Rif的LA固体培养基上，倒置于28℃培养2d。

转化甘蓝型油菜的遗传转化方法为借鉴华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室的转化方法(Dai等,An efficient Agrobacterium-mediated transformationmethod using hypocotyl as explants for Brassica napus,Mol Breeding,2020,40:96)改进之后的方法，以甘蓝型油菜无菌幼苗的下胚轴作为外植体，利用农杆菌介导法进行油菜遗传转化。

涉及的培养基配方如下：

接种培养基(M₀)：4.43g/LMURASHIGE&SKOOG MEDIUM(简称MS)+30.0g/L蔗糖Sucrose+8g/L琼脂Agar(pH 5.8-pH 6.0)。

共培养培养基(M₁)：M₀+18.0g/L甘露醇Mannitol+1.0mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸2,4-D+0.3mg/L激动素Kinetin+100μM乙酰丁香酮AS(pH 5.8)。

愈伤分化培养基(M₂)：M₁+300.0mg/L特美汀Timentin+250mg/L潮霉素(HygromycinB，Hyg)。

生苗培养基(M₃)：4.43g/L MS+10.0g/L葡萄糖Glucose+0.25g/L吡喃木糖Xylose+0.6g/L吗啉乙磺酸MES+2.0mg/L玉米素Zeatin+0.1mg/L吲哚乙酸IAA+300.0mg/L特美汀Timentin+250mg/L Hyg。

壮苗生根培养基(M₄)：M₀+300.0mg/L特美汀Timentin+0.2mg/L吲哚乙酸IAA。

注意事项：培养基均需121℃高温灭菌18min。将激素和抗生素配制为1000倍浓度的母液，分装后保存于－20℃备用，2,4-D和Kinetin应在培养基灭菌前添加，其他激素和抗生素需待培养基灭菌后温度下降至50℃左右时添加。

甘蓝型油菜遗传转化具体操作步骤如下：

(1)种子灭菌：挑选籽粒饱满的甘蓝型油菜种子，在无菌操作台上先用75％的酒精浸洗1min，再用2％的次氯酸钠(NaClO)浸洗20～30min，最后用无菌蒸馏水冲洗种子4～6次。

(2)种子接种：将镊子置于酒精灯外焰上烧红彻底灭菌后冷却至室温，用镊子将上一步的无菌种子均匀接种于M₀培养基上，25℃黑暗条件下培养5～6d。

(3)农杆菌侵染及共培养(M₁阶段)：提前2-3d活化保存于－80℃的农杆菌菌株并取单克隆进行阳性鉴定，在切苗前一天晚上将鉴定过的阳性单克隆菌落接种于含有Kan和Rif抗性的LB液体培养基中，28℃250rpm培养12-16h；25℃6000rpm离心5min，弃去上清，用DM液重悬并离心，弃去上清后利用DM液再次重悬农杆菌菌液。在超净工作台上用镊子将无菌油菜幼苗从组培罐中取出，用无菌的锋利解剖刀片切去根和子叶，并将下胚轴切割为0.8～1.5cm长的小段，迅速将外植体转移到DM侵染液中暂存，向DM中加入AS母液和重悬的农杆菌菌液(V_DM：V_菌液：V_AS＝1000：100：1)，用DM侵染液将外植体侵染10min后转移至无菌滤纸上5～10min晾干，至外植体表面干燥无水渍即可。将外植体转移到M₁培养基上，25℃黑暗条件下培养36～48h。

(5)筛选和愈伤分化(M₂及M₃阶段)：将外植体从M₁培养基上转移至M₂培养基上，25℃光照培养2～3周后挑选生长状态较好、分化出愈伤组织的外植体转移至M₃培养基上，每隔2～3周继代一次，直至长出绿色幼苗(若出现玻璃化现象，应及时将外植体转移到新的培养基上继续培养)。

(6)壮苗生根培养(M₄阶段)：选择具有明显生长点的幼苗，用剪刀和解剖刀除去多余的老叶和愈伤组织，然后转移至M₄培养基上，25℃光照培养2～4周至幼苗生根，其间每隔2～3周视具体情况更换一次培养基。

(7)炼苗和移栽：对培养瓶中的无菌苗剪去较老的叶片，将根上的培养基洗净后移栽至油菜培养土中，前期通过覆膜保湿，使苗在培养土中适应有菌环境2～3周、生长比较健壮后放到室外适应2d左右，然后移栽至大田中。

实施例5：转基因甘蓝型油菜阳性植株的鉴定

按照如下步骤快速提取甘蓝型油菜基因组DNA：对每株转基因植株取适量幼嫩叶片(约0.2g)置于2mL离心管中，向管中加入500μL DNA buffer和一颗直径4.5mm的钢珠，打样机45Hz，2min打碎样品；将装有样品的离心管置于95℃水浴10min；将样品取出冷却至室温，12000rpm离心10min；吸取50μL上清液转移至新离心管中，适当稀释后备用(一般稀释10倍)。

DNA buffer配方如下：

500mM Tris-HCl(pH＝7.5)，300mM NaCl，300mM蔗糖，加ddH₂O至1L，121℃高温灭菌18min后储存至4℃备用。

转基因甘蓝型油菜叶片的DNA样品稀释液各取1μL作为模板，分别用引物35S-F(5'-CAAGACCCTTCCTCTAT-3')(SEQ ID NO:11)和BnaNF-YA2-TR(5'-CAGGTTTTGAAACTGCAGCAGC-3')(SEQ ID NO:8)搭配、BnaNF-YA2-TF(5'-TCATCTCGGCAACGTCGAATCT 3')(SEQ ID NO:7)和GFP-R(5'-CATCACCTTCACCCTC-3')(SEQ IDNO:12)搭配进行PCR扩增，扩增条件为：94℃5min；94℃30s，58℃30s，72℃1min，共35个循环；72℃5min。若能扩增出特异性目的片段，则证明BnaNF-YA2外源片段成功整合到甘蓝型油菜基因组中。

实施例6：过表达BnaNF-YA2转基因甘蓝型油菜对水分胁迫的抗性增强

本发明采用实时荧光定量PCR方法对部分pMDC83-BnaNF-YA2转基因甘蓝型油菜植株中BnaNF-YA2基因的表达量进行分析，按照实施例1中描述的方法进行RNA样品的提取和反转录。利用ABI公司的StepOneplusT100定量PCR仪，以pMDC83-BnaNF-YA2转基因甘蓝型油菜植株的cDNA作为模板，以BnaNF-YA2特异性定量引物BnaNF-YA2-QF(5'-CTTCAGGTGCACCATAAT-3')(SEQ ID NO:5)和BnaNF-YA2-QR(5'-CCTTAACTCCGGCCAATGAA-3')(SEQ ID NO:6)搭配进行实时荧光定量PCR，内参基因引物为BnaActin-QF(5'-TCTTCCTCACGCTATCCTCCG-3')(SEQ ID NO:3)和BnaActin-QR(5'-AGCCGTCTCCAGCTCTTGC-3')(SEQ ID NO:4)。反应条件如下：

利用ABI7500 StepOneplusT100自带的软件(StepOne^TMSoftware v2.3)对结果进行分析，利用2^-△△Ct法分析转基因植株中BnaNF-YA2的表达水平，利用GraphPad Prism7.0软件对结果进行可视化。如图3所示，与对照植株相比，大部分转基因阳性植株中BnaNF-YA2的表达量均有不同程度上升，说明本发明成功获得过表达BnaNF-YA2的油菜植株。

对过表达BnaNF-YA2的转基因阳性植株和J9712(对照)植株进行水分胁迫表型分析。以BnaNF-YA2表达水平较高的3个转基因阳性株系(命名为BnaNF-YA2-OE-6、BnaNF-YA2-OE-8和BnaNF-YA2-OE-16)的T₂代种子作为实验对象，J9712为对照(CK)，分析它们在萌发后期对水分胁迫的抗性。选用大小一致的BnaNF-YA2-OE和CK种子，灭菌后接种于1/2MS培养基上22℃培养24h；挑选萌发状态一致的幼苗转移到1/2MS培养基和分别含有15％ PEG、120mM甘露醇的1/2MS培养基上，在22℃16h光照/8h黑暗条件下培养7d后，测量和记录在正常和逆境胁迫条件下甘蓝型油菜的下胚轴长、根长和鲜重。结果显示，正常培养条件下，BnaNF-YA2过表达植株和CK植株的生长状态没有明显差异；在15％ PEG处理条件下生长7d后，BnaNF-YA2过表达植株的根长与CK植株无明显差异，而其下胚轴长显著长于CK植株，平均值从2.035cm分别增长到2.88cm、2.256cm和2.343cm，分别增长了41.52％、10.86％和15.14％；鲜重显著重于CK植株，平均值从0.0479g分别增长到0.0726g、0.0593g、0.0586g，分别增长了51.57％、23.80％和22.34％；在120mM甘露醇处理条件下生长7d后，BnaNF-YA2过表达植株的根长与CK植株无明显差异，而其下胚轴长显著长于CK植株，平均值从0.92cm分别增长到1.22cm、1.285cm和1.3cm，分别增长了32.61％、39.67％和41.30％；鲜重显著重于CK植株，平均值从0.0272g分别增长到0.0317g、0.0335g、0.0306g，分别增长了16.54％、23.16％和12.5％；说明过表达BnaNF-YA2使甘蓝型油菜在萌发后期对PEG和甘露醇模拟的水分胁迫的抗性显著增强(图4)。

本发明分离得到与水分胁迫应答相关的甘蓝型油菜基因BnaNF-YA2，对于研究植物水分胁迫应答相关基因具有一定的理论指导意义。本发明分离得到的干旱应答相关基因来自于植物本身，对环境影响较小。利用分离的基因进行油菜水分胁迫抗性遗传改良分子育种，对于培育水分胁迫抗性相对提高的甘蓝型油菜新品种具有十分重要的意义。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征以及本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

SEQ ID NO:1

ATGGCTATGCAAACTATGAGAGAAGGTCTTCCCTCTGCTCCACAGATTTCTTGGTGGAACGCTTTTGGATCTCAGCCGTTAACTCCAGAGAGTCTCTCCGGAGATAATGATTCATTGGCCGGAGTTAAGGTCAGATCTGCTGGAGGGATAGAACAAGGTGTGAATAAACAAAGCAACTCTGTATCTCACTTTGCTTTCTCACTTGGTGATGTAAAGAGTCCAAGAGTTGTGCCAAAGCCTCATGGATCTGCTTTCTCGATGCAACCACCTTACTTGGAACTTGGATTTTCTCAGCCACAGATGTACAAAAAGTATCCATGTGTGGAACAACAATACTATGGAGTTCTTTCACCCTATGGATCTCATAGCAGTGTAATGCTTCCTCTAAACATGGAAACAGAAGATGGAACAATCTTTGTGAACTCAAAGCAATACCATGCCATCATCAGGCGACGCCAATCACGTGCAAAGGCTGCTGCTGTTCTTGATCAGAACAAACCGAGTAGCAAATTCCGTAAGCCATATATGCATCATTCACGCCATCTCCATGCATTGCGCCGTCCTAGAGGATCTGGTGGGAGGTTCTTGAACACTAAGAGTCAGAACAATGCAAAGAAAGCTGATGGAACTAAGCAGACTCAGCCTCAGCAAAGTAACTCTCAGGATTCAGACGTTCTTCATCCTGAAAACGTGACCATGAACTTATCAAACCGACTAGGATCAGAAGTTACAAGCATGAACTACTTTTTAAGCTCTTCGGTTCATCCCCTTGGTGGCATGGTAATGCCTAGCAAGTGGATCACAGCAGCAGCAATGGATAATGGCTGCTGCAGTTTCAAAACCTGA

SEQ ID NO:2

MAMQTMREGLPSAPQISWWNAFGSQPLTPESLSGDNDSLAGVKVRSAGGIEQGVNKQSNSVSHFAFSLGDVKSPRVVPKPHGSAFSMQPPYLELGFSQPQMYKKYPCVEQQYYGVLSPYGSHSSVMLPLNMETEDGTIFVNSKQYHAIIRRRQSRAKAAAVLDQNKPSSKFRKPYMHHSRHLHALRRPRGSGGRFLNTKSQNNAKKADGTKQTQPQQSNSQDSDVLHPENVTMNLSNRLGSEVTSMNYFLSSSVHPLGGMVMPSKWITAAAMDNGCCSFKT

SEQ ID NO:3

TCTTCCTCACGCTATCCTCCG

SEQ ID NO:4

AGCCGTCTCCAGCTCTTGC

SEQ ID NO:5

CCCTCTGCTCCACAGATTTCTT

SEQ ID NO:6

CCTTAACTCCGGCCAATGAA

SEQ ID NO:7

TCATCTCGGCAACGTCGAATCT

SEQ ID NO:8

CAGGTTTTGAAACTGCAGCAGC

SEQ ID NO:9

GACCTCGACTCTAGAACTAGTCATCTCGGCAACGTCGAATCT

SEQ ID NO:10

CGGGCCCCCCCTCGAGGCGCGCCAGGTTTTGAAACTGCAGCAGC

SEQ ID NO:11

CAAGACCCTTCCTCTATSEQ ID NO:12CATCACCTTCACCCTC。

Claims (10)

1.一种调控甘蓝型油菜水分胁迫抗性的蛋白，其特征在于，所述蛋白为如下(a)或(b)：

(a)包括SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的蛋白质；

(b)将SEQ ID NO:2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与甘蓝型油菜水分胁迫抗性调控相关的由SEQ ID NO:2衍生的蛋白质。

2.一种调控甘蓝型油菜水分胁迫抗性的基因，其特征在于，所述基因编码权利要求1所述的蛋白。

3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于：所述基因包括如下(a1)-(a3)中任何一种的DNA分子；

(a1)包括如SEQ ID NO:1所示序列的DNA分子；

(a2)在严格条件下与(a1)限定的DNA序列杂交且编码甘蓝型油菜水分胁迫抗性调控相关蛋白的DNA分子；

(a3)与(a1)限定的DNA序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或者至少具有99％同源性且编码甘蓝型油菜水分胁迫抗性调控相关蛋白的DNA分子。

4.含有权利要求2或3所述基因的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系。

5.权利要求1所述蛋白或权利要求2或3所述基因或含有权利要求2或3所述基因的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系在调控甘蓝型油菜水分胁迫抗性中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述应用包括提高甘蓝型油菜萌发期的下胚轴长和鲜重。

7.权利要求1所述蛋白或权利要求2或3所述基因或含有权利要求2或3所述基因的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系在培育甘蓝型油菜抗水分胁迫品种中的应用。

8.一种抗水分胁迫转基因植物的培育方法，其特征在于，提高目的植物中权利要求1所述蛋白的含量或活性，得到转基因植物；所述转基因植物的植物水分胁迫抗性强于所述目的植物。

9.一种鉴定甘蓝型油菜抗水分胁迫品种的方法，其特征在于，提取甘蓝型油菜基因组RNA，检测权利要求2所述调控甘蓝型油菜抗水分胁迫基因的表达量。

10.根据权利要求9所述的鉴定甘蓝型油菜抗水分胁迫品种的方法，其特征在于，引物序列如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示。