CN105200048A - 小麦粒重主效QTL QTgw-4B.2的紧密连锁标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了小麦粒重主效QTL？QTgw-4B.2的紧密连锁标记及其应用。本发明提供了用于鉴定小麦千粒重的引物，由序列表中序列1所示的引物1和序列表中序列2所示的引物2组成。本发明筛选的与千粒重主效QTL紧密连锁的SSR标记Xcau4b1，可以在苗期有效筛选出不同粒重大小的小麦株系，节约实验成本，快速筛选出千粒重高的小麦株系，提高选择效率，加速小麦高产育种的进程。

Description

小麦粒重主效QTL QTgw-4B.2的紧密连锁标记及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种小麦粒重主效QTLQTgw-4B.2的紧密连锁标记及其应用。

背景技术

小麦是世界重要的粮食作物，据FAO预测，到2030年我国对小麦的需求量将达到1.7364×108吨，比2003年小麦的总产量0.9×108吨增加了92.3％(田纪春.超级小麦的概念、育种目标和任务[J].山东农业科学，2004，(5):18－21)。因此，高产仍是小麦育种最基本、最重要的目标。

小麦的单产由单位面积穗数、每穗粒数和千粒重三个因素构成。其中，千粒重在产量构成因素中对产量的直接贡献最大，王辉等(2002)认为在群体不变的条件下增加单穗粒重是提高品种群体产量潜力的关键。过去的育种实践也表明，千粒重的遗传改良是提高小麦产量潜力的有效途径之一。李月华等(1993)对我国上个世纪80年代以前的1400多个小麦育成品种的千粒重进行分析，结果表明千粒重从50年代以前的31g增加到了80年代的42g，平均增加了33.8％，其中45g以上的品种也占到了42％。赵倩等(2013)运用相关分析和通径分析的方法，对2006年_～2012年山东省审定的38个高产小麦品种的产量及其构成三因素进行分析，产量构成因素中千粒重与产量的相关系数最大且呈显著正相关。当前我国高产小麦品种的单位面积穗数一般相对较高，千粒重成为产量的主要制约因素，因此针对目前的单产水平，应主要通过增加千粒重获得小麦的高产。

前期研究中，逯腊虎(2012)和贾立加(2013)以农大3338和京冬6号及其衍生的DH群体为基本材料，通过复合区间作图方法对小麦千粒重性状进行的两年三点(分别于2007-2008年度和2008-2009年度在北京、山西临汾和河北石家庄进行种植)实验进行QTL分析发现，在4B染色体的两个SSR标记Xcau178a-Xcau506区间内检测到一个环境稳定的粒重QTLQTgw-4B.2，LOD值为13.23-20.50，加性遗传效应为2.04g-3.66g，在六个环境中解释的表型变异为17.35％-27.00％。

发明内容

本发明的一个目的是提供用于鉴定小麦千粒重的引物。

本发明提供的引物，为如下1)或2)：

1)由序列表中序列1所示的引物1和序列表中序列2所示的引物2组成；

2)将1)所示引物对中的一个或几个剪辑进行缺失、增加或替换得到具有相同功能的引物对。

本发明另一个目的是提供用于鉴定小麦千粒重的试剂。

本发明提供的试剂，包括上述的引物。

上述试剂中，所述引物中的各条引物的浓度均为10umol/L。

本发明第三个目的是提供用于鉴定小麦千粒重的试剂盒。

本发明提供的试剂盒，包括上述的引物或上述的试剂。

上述的引物或上述的试剂或上述的试剂盒在鉴定待测小麦是否为高千粒重小麦中的应用也是本发明保护的范围；

或上述的引物或上述的试剂或上述的试剂盒在鉴定待测小麦是否为高耐热性小麦中的应用也是本发明保护的范围；

或上述的引物或上述的试剂或上述的试剂盒在鉴定小麦千粒重性状中的应用也是本发明保护的范围；

或上述的引物或上述的试剂或上述的试剂盒在鉴定小麦耐热性性状中的应用也是本发明保护的范围；

上述的引物或上述的试剂或上述的试剂盒在鉴定小麦是否为高千粒重小麦中的应用也是本发明保护的范围；

或上述的引物或上述的试剂或上述的试剂盒在筛选高千粒重小麦中的应用也是本发明保护的范围；

或上述的引物或上述的试剂或上述的试剂盒在筛选耐热小麦中的应用也是本发明保护的范围。

本发明第四个目的是提供一种鉴定小麦千粒重的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：

1)用上述的引物或上述的试剂扩增待测小麦，得到SSR扩增产物；

2)检测所述SSR扩增产物目标条带的带型是A带型还是B带型带型，若待测小麦的SSR扩增产物带型为B带型，则待测小麦候选为高千粒重小麦；

若待测小麦的SSR扩增产物带型为A带型，则待测小麦候选为低千粒重小麦；

所述A带型的大小为160-165bp；

所述B带型的大小为180-185bp。

本发明第五个目的是提供一种鉴定小麦千粒重性状的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：

1)用上述的引物或上述的试剂扩增待测小麦，得到SSR扩增产物；

2)检测所述SSR扩增产物目标条带的带型是A带型还是B带型带型，B带型的待测小麦的千粒重高于A带型的待测小麦的千粒重；

所述A带型的大小为160-165bp；

所述B带型的大小为180-185bp。

本发明第六个目的是提供一种鉴定小麦耐热性状的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：

1)用上述的引物或上述的试剂扩增待测小麦，得到SSR扩增产物；

2)检测所述SSR扩增产物目标条带的带型是A带型还是B带型带型，B带型的待测小麦的耐热性高于A带型的待测小麦的耐热性；

所述A带型的大小为160-165bp；

所述B带型的大小为180-185bp。

上述方法中，所述扩增的模板为待测小麦的基因组DNA。

上述的方法在筛选高千粒重小麦中的应用也是本发明保护的范围；

或上述的方法在筛选耐热小麦中的应用也是本发明保护的范围。

不同地点判断高低千粒重标准不一，在山西地区，千粒重大于40.94g的为高千粒重植株，千粒重小于等于40.94g的为低千粒重植株。

在宁夏地区，千粒重大于46.20g的为高千粒重植株，千粒重小于等于46.20g的为低千粒重植株。

上述待测小麦为农大3338和京冬6号的DH群体，且其灌浆期为6-7月份。

本发明提供了一种与小麦千粒重主效QTL紧密连锁的SSR分子标记Xcau4b1及其应用。利用本发明中的分子标记进行辅助选择育种，可以在苗期有效筛选出不同千粒重大小的小麦品系，提高选择效率，节约实验成本，加快小麦高产品种的选育进程。

附图说明

图1为小麦粒重主效QTLQTgw-4B.2区间与粗山羊草、水稻的共线性关系比对示意图。

图2为小麦粒重主效QTLQTgw-4B.2区间的分子标记遗传连锁图谱。

图3为利用Xcau4b1标记对农大3338、京冬6号及其衍生的部分DH系的PCR扩增结果。

图4为2014年山西种植的农大3338/京冬6号衍生的DH群体千粒重分布图。

图5为2014年宁夏种植的农大3338/京冬6号衍生的DH群体千粒重分布图。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

10×PCRbuffer、dNTPs可从北京天一辉远生物科技有限公司购买。

农大3338和京冬6号记载在如下文献中：[1].逯腊虎等,普通小麦农大3338×京冬6号DH系群体株高及节间长度的QTL分析.中国农业大学学报,2014(01):第1-8页。

实施例1、目标QTLQTgw-4B.2紧密连锁标记Xcau4b1的获得

1、实验材料

1)农大3338和京冬6号的幼嫩叶片提取DNA后用于差异引物的筛选。

2)农大3338×京冬6号的DH群体，共203个单株，用于目标区间的遗传图谱构建。

3)农大3338/京冬6号的DH群体，用于多年多点千粒重QTL的定位。

2、遗传图谱的构建

利用目标区间上的所有标记，以DH系为模板，进行基因型分析，其中带型与亲本农大3338相同的记为A，与亲本京冬6号相同的记为B，缺失记为“-”。在此基础上，借助JoinMap4.0进行遗传图谱构建，从而计算出各标记在目标区间内的遗传位置。

3、千粒重QTL定位

参照AjayKumar(2013)的方法，使用QTLCartographerV2.5软件(WangS.2012)通过复合区间作图方法进行小麦粒重QTL的定位。

4、4B染色体上特异SSR标记的开发

下载国际小麦基因组测序协会(http://www.wheatgenome.org/)发布的4B染色体上所有的contig序列，利用BatchPrimer3v1.0(http://probes.pw.usda.gov/batchprimer3/)搜索两个碱基重复次数大于30，三个碱基重复大于21次所在的序列并设计引物，经亲本间PCR扩增和8％的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测及小群体验证，最终获得多态性明显且带型清晰的SSR标记。

5、QTL区间特异SSR标记的开发

根据国际小麦基因组测序协会(http://www.wheatgenome.org/)发布的genomezipper及PNAS发表的A4-gigabasephysicalmapunlocksthestructureandevolutionofthecomplexgenomeofAegilopstauschii,thewheatD-genomeprogenitor文章里的genomezipper，进行千粒重主效QTL区间内小麦与粗山羊草、水稻和短柄草的染色体共线性关系比对。根据共线性关系比对结果，利用该区间内所包含的粗山羊探针延伸序列、水稻基因序列和短柄草基因序列，从小麦基因组测序协会数据库中提取获得小麦千粒重主效QTL区间内的基因组序列。在此基础上，借助BatchPrimer3v1.0进行目标区间内的引物设计。同样地，经亲本间PCR扩增和8％的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测及小群体验证，最终获得QTL区间内多态性明显且带型清晰的SSR标记。

6、QTgw-4B.2区间内SSR标记的筛选

依据国际小麦基因组测序协会(http://www.wheatgenome.org/)发布的genomezipper及粗山羊草的genomezipper和90K小麦SNP基因芯片数据结果，进行千粒重主效QTL区间内小麦与粗山羊草、小麦和短柄草的染色体共线性关系比对(图1)，找到粗山羊草genomezipper对应的位置，利用该区间内所包含的粗山羊草探针延伸序列、水稻基因序列和短柄草基因序列，从小麦基因组测序协会数据库中提取获得小麦千粒重主效QTL区间内的基因组序列。在此基础上，借助BatchPrimer3v1.0进行目标区间内的引物设计。同样地，经亲本间PCR扩增和8％的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测及小群体验证，最终获得QTL区间内多态性明显且带型清晰的5对SSR标记。

7、QTgw-4B.2区间内的连锁图谱构建

以203个DH系为模板，利用区间内的分子标记，包括目标区间两端的SSR标记Xcau178a和Xcau506，区间内已有的SSR标记Xbarc1133和Xbarc340，2个SNP标记Excalibur_c29141_864、Excalibur_rep_c66596_988及新开发的5个多态性SSR标记共11个标记进行基因型检测，其中带型与亲本农大3338相同的记为A，与亲本京冬6号相同的记为B，缺失记为“-”。借助JoinMap4.0进行遗传图谱构建，获得11个分子标记在目标区段上的最优顺序及标记间新的遗传距离(图2，左侧数字表示各分子标记间的相对遗传距离，单位为cM.)。

8、目标QTLQTgw-4B.2紧密连锁标记Xcau4b1的获得

针对203个DH群体，利用加密后的图谱信息，结合2009年北京、山西临汾和河北石家庄的千粒重数据，利用WinQTLCart2.5软件，通过复合区间作图法，LOD阈值为2.5，对千粒重进行再次定位发现，均能在标记Xcau4b1附近检测到控制千粒重的主效QTL，其加性效应为1.53g-4.09g，可解释的表型变异为3.94％-43.82％，其增效位点均来自高千粒重亲本京冬6号(表1)。

表1为利用农大3338/京冬6号的DH群体再次检测到的QTgw-4B.2的信息

用于PCR扩增的SSR分子标记Xcau4b1的引物序列如表2所示：

表2为Xcau4b1标记的引物序列、退火温度(Tm)

实施例2、Xcau4b1标记SSR引物在鉴定小麦千粒重中的应用

1、基因组DNA的提取

选取在2014年春播环境下山西和宁夏种植的农大3338和京冬6号的DH群体，使其灌浆期在6-7月份，提取群体中各单株的基因组DNA。

分别提取农大3338基因组DNA和京冬6号基因组DNA。

2、PCR反应

以上述1获得的DH群体各单株基因组DNA、农大3338基因组DNA和京冬6号基因组DNA为模板，用Xcau4b1的SSR引物进行PCR扩增，得到SSR扩增产物。

上述PCR扩增的PCR反应体系(10μl体系)如下表3：

表3为PCR反应体系

PCR扩增的反应程序：94℃预变性5min；94℃变性30s、57℃复性30s、72℃延伸30s，共36个循环；最后72℃延伸10min；12℃保存。

8％的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测SSR扩增产物，目标条带带型结果如图3所示，SSR扩增产物的目标条带有2种带型：A带型(160-165bp)和B带型(180-185bp)；农大3338的SSR扩增产物为A带型，京冬6号的SSR扩增产物为B带型；二者的部分DH群体中部分为A带型，部分为B带型。

将农大3338(A带型)、京冬6号(B带型)、A带型的DH群体和B带型的DH群体分别在山西和宁夏生长成熟后，测定并统计其千粒重大小。

统计不同地区千粒重，结果如图4、图5和表4所示，

表4为山西、宁夏两点DH群体的千粒重统计结果

根据上述结果确定：

在山西地区，千粒重大于40.94g的为高千粒重植株，千粒重小于等于40.94g的为低千粒重植株。

在宁夏地区，千粒重大于46.20g的为高千粒重植株，千粒重小于等于46.20g的为低千粒重植株。

分析农大3338(A带型)、京冬6号(B带型)、A带型的DH群体和B带型的DH群体的结果如下：

山西地点的DH群体203个株系中有84株为A带型、119株为B带型，

84株为A带型山西DH群体中小于等于40.94g的有61株，占72.62％；

119株为B带型山西DH群体中大于40.94g的有78株，占65.55％。

宁夏地点的DH群体203个株系中有84株为A带型、119株为B带型，

84株为A带型山西DH群体中小于等于46.20g的有61株，占72.62％；

119株为B带型山西DH群体中大于46.20g的有86株，占72.27％。

因此，可以通过Xcau4b1的SSR引物扩增待测小麦的基因组DNA，检测SSR扩增产物带型，根据带型辅助鉴定待测小麦是否为高千粒重植物；

上述根据带型辅助鉴定待测小麦是否为高千粒重植物为如下：

若待测小麦的SSR扩增产物目标条带带型为B带型，则待测小麦候选为高千粒重小麦；

若待测小麦的SSR扩增产物目标条带带型为A带型，则待测小麦候选为低千粒重小麦。

也可以根据带型辅助鉴定待测小麦的千粒重性状：B带型的待测小麦的千粒重高于A带型的待测小麦。

待测小麦为农大3338和京冬6号的DH群体，且其灌浆期在6-7月份。

6-7月份宁夏平均温度为高温环境，从上述结果可以看出，在高温下千粒重仍然是B带型待测小麦大于A带型待测小麦，因此，也可以根据带型辅助鉴定待测小麦的耐热性性状：B带型的待测小麦的耐热性高于A带型的待测小麦。

2014年3月，在山西、宁夏两点通过春播的方式种植农大3338和京冬6号及其衍生的DH群体，将小麦的成熟期推迟，实现了DH群体在灌浆期的高温处理，说明该粒重主效QTL还可能与小麦的耐热性相关，是一个环境稳定且与小麦耐热性相关的粒重主效QTL。利用该紧密连锁标记Xcau4b1可快速有效地筛选出具有京冬6号基因型的高千粒重小麦，节约实验成本，提高选择效率，加速小麦高产育种的进程。

Claims (10)

1.用于鉴定小麦千粒重的引物，为如下1)或2)：

1)由序列表中序列1所示的引物1和序列表中序列2所示的引物2组成；

2)将1)所示引物对中的一个或几个剪辑进行缺失、增加或替换得到具有相同功能的引物对。

2.用于鉴定小麦千粒重的试剂，包括权利要求1所述的引物。

3.根据权利要求2所述的试剂，其特征在于：所述试剂中，所述引物中的各条引物的浓度均为10umol/L。

4.用于鉴定小麦千粒重的试剂盒，包括权利要求1所述的引物或权利要求2或3所述的试剂。

5.权利要求1所述的引物或权利要求2或3所述的试剂或权利要求4所述的试剂盒在鉴定待测小麦是否为高千粒重小麦中的应用；

或权利要求1所述的引物或权利要求2或3所述的试剂或权利要求4所述的试剂盒在鉴定待测小麦是否为高耐热性小麦中的应用；

权利要求1所述的引物或权利要求2或3所述的试剂或权利要求4所述的试剂盒在鉴定小麦千粒重性状中的应用；

或权利要求1所述的引物或权利要求2或3所述的试剂或权利要求4所述的试剂盒在鉴定小麦耐热性性状中的应用；

或权利要求1所述的引物或权利要求2或3所述的试剂或权利要求4所述的试剂盒在筛选高千粒重小麦中的应用；

或权利要求1所述的引物或权利要求2或3所述的试剂或权利要求4所述的试剂盒在筛选耐热小麦中的应用。

6.一种鉴定小麦千粒重的方法，包括如下步骤：

1)用权利要求1所述的引物或权利要求2或3所述的试剂扩增待测小麦，得到SSR扩增产物；

2)检测所述SSR扩增产物目标条带的带型是A带型还是B带型带型，若待测小麦的SSR扩增产物带型为B带型，则待测小麦候选为高千粒重小麦；

若待测小麦的SSR扩增产物带型为A带型，则待测小麦候选为低千粒重小麦；

所述A带型的大小为160-165bp；

所述B带型的大小为180-185bp。

7.一种鉴定小麦千粒重性状的方法，包括如下步骤：

1)用权利要求1所述的引物或权利要求2或3所述的试剂扩增待测小麦，得到SSR扩增产物；

2)检测所述SSR扩增产物目标条带的带型是A带型还是B带型带型，B带型的待测小麦的千粒重高于A带型的待测小麦；

所述A带型的大小为160-165bp；

所述B带型的大小为180-185bp。

8.一种鉴定小麦耐热性状的方法，包括如下步骤：

1)用权利要求1所述的引物或权利要求2或3所述的试剂扩增待测小麦，得到SSR扩增产物；

2)检测所述SSR扩增产物目标条带的带型是A带型还是B带型带型，B带型的待测小麦的耐热性高于A带型的待测小麦；

所述A带型的大小为160-165bp；

所述B带型的大小为180-185bp。

9.根据权利要求6-8中任一所述的方法，其特征在于：所述扩增的模板为待测小麦的基因组DNA。

10.权利要求6或7所述的方法在筛选高千粒重小麦中的应用；

或权利要求8所述的方法在筛选耐热小麦中的应用。