CN108841863B

CN108841863B - 一种培育高结瘤固氮植物的方法

Info

Publication number: CN108841863B
Application number: CN201810816770.1A
Authority: CN
Inventors: 王幼宁; 朱林; 李霞
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2018-07-24
Filing date: 2018-07-24
Publication date: 2020-08-18
Anticipated expiration: 2038-07-24
Also published as: CN108841863A

Abstract

本发明公开了一种培育高结瘤固氮植物的方法，在植物体内过表达序列表中的SEQ ID NO：1所示核苷酸序列，获得与正常植物相比具有高结瘤固氮能力的转基因植物。经试验验证，利用本发明构建的过表达载体转化受体大豆植株获得转基因植物，能够显著提高大豆的结瘤固氮能力，对提高大豆产量具有重大的实际意义。

Description

一种培育高结瘤固氮植物的方法

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其是一种转基因植物的培育方法。

背景技术

大豆是重要的粮油经济作物，其通过根瘤可将空气中的氮气转化为可被植物吸收利用的氨态氮，从而为大豆生长发育提供了必需的氮素营养。由根瘤介导的共生固氮过程不仅影响着大豆的正常生长和产量，还有利于节约能源，减少环境化学污染。目前，提高共生固氮效率已成为提高大豆产量及保证农业可持续发展的重要途径之一。

在分子水平解析调控大豆根系结瘤及共生固氮发挥的机制为在生产上更合理高效地利用并发挥共生固氮过程的效能奠定了重要基础。尽管此前在大豆中克隆并证明了miR172c-NNC1、miR167c-GmARF8、miR393-GmTIR1/AFB2等模块参与调控大豆的根系结瘤及共生固氮（Wang et al., 2014, 2015; Cai et al., 2017），但仍然需要大力挖掘与大豆共生固氮有关的更多的元件或功能基因，从而可为在生产上更为充分地利用该“绿色”氮素营养供给方式提供数据支持。

在大豆的氮素营养供给过程中，其通过根系的氮吸收系统获取土壤中的硝态氮或铵态氮也发挥着非常重要的作用。硝酸盐作为植物生长发育过程中的主要无机氮源，不仅是植物的营养元素，也可作为信号分子调控植物的形态建成、生理响应和相关基因的表达，从而应对环境中硝酸盐浓度的变化和自身生理状态的需求。

植物中硝酸盐的吸收转运是通过硝酸盐转运体NRT（Nitrate transporter）家族成员参与的。在模式植物拟南芥中，AtNRT1.2（NRT1/AtNPF4.6）属于低亲和转运蛋白，不具有高亲和力特性，其在外界硝酸根水平较高的情况下发挥硝酸根转运的功能。拟南芥中的研究证明参与硝酸根吸收的AtNRT1.1 和AtNRT2.1 会受外界NO₃ ^-诱导表达，与此不同的是，AtNRT1.2 的表达为组成型，即其不受NO₃ ^-的诱导（Huang et al., 1999）。

目前尚未见到有关NRT1.2在大豆根及根系结瘤和共生固氮中是否具有调控作用的报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种培育高结瘤固氮植物的方法

为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案如下。

一种培育高结瘤固氮植物的方法，在植物体内过表达序列表中的SEQ ID NO：1所示核苷酸序列，获得与正常植物相比具有高结瘤固氮能力的转基因植物。

作为本发明的一种优选技术方案，首先构建含有SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的过表达载体，然后利用此过表达载体构建转化体，再利用所得转化体侵染受体植物根系，筛选阳性植株，获得与正常植物相比具有高结瘤固氮能力的转基因植物。

作为本发明的一种优选技术方案，所述过表达载体以pEGAD为骨架载体，通过SmaI和BamH I酶切后进行目的基因片段与骨架载体的连接，完成过表达载体的构建。

作为本发明的一种优选技术方案，在构建过表达载体之前对SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列进行PCR扩增，其正向扩增引物如序列表中的SEQ ID NO：4所示，其反向扩增引物如序列表中的SEQ ID NO：5所示。

作为本发明的一种优选技术方案，利用所述过表达载体转化农杆菌K599获得转化体，然后再利用农杆菌K599介导的毛状根转化法获得转基因植物，筛选阳性植株得到与正常植物相比具有高结瘤固氮能力的转基因植物。

作为本发明的一种优选技术方案，所述目的植物为蝶形花科植物。

作为本发明的一种优选技术方案，所述目的植物为大豆。

采用上述技术方案所产生的有益效果在于：经试验验证，利用本发明构建的过表达载体转化受体大豆植株获得转基因植物，能够显著提高大豆的结瘤固氮能力，对提高大豆产量具有重大的实际意义。

附图说明

图1为实施例1中，GmNRT1.2基因响应短期硝酸根处理的表达模式分析结果。在硝酸根处理的大豆根中，随着硝酸根处理后的时间的增加，GmNRT1.2基因的表达先受到显著诱导而后又被抑制，在硝酸根处理后1 h，GmNRT1.2基因的表达量最高。该结果说明GmNRT1.2基因并非如拟南芥中AtNRT1.2一致，是组成型表达，而是受硝酸根诱导的。

图2为实施例2中，GmNRT1.2基因响应长期根瘤菌侵染的表达模式分析结果。相对于不接种根瘤菌的处理的大豆根而言，在根瘤菌侵染后的大豆根中，GmNRT1.2基因的表达受到显著抑制，该结果说明GmNRT1.2基因参与了大豆根系结瘤固氮的过程。

图3为实施例3中，过表达GmNRT1.2后对大豆结瘤的表型分析结果。在完全相同的实验环境下，上调表达GmNRT1.2的转基因根同空载体转化的转基因根系（EV）相比，根瘤数量显著增多（图3A和3B），图3C为对转基因根系中GmNRT1.2的表达水平分析，结果显示在转基因根系中GmNRT1.2的表达是显著上调的。

具体实施方式

以下实施例详细说明了本发明。本发明所使用的各种原料及各项设备均为常规市售产品，均能够通过市场购买直接获得。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂公司购买得到的。下述实施例中的%，如无特殊说明，均为质量百分含量。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

实施例1、GmNRT1.2基因响应硝酸根处理的表达模式分析。

1、材料获取：实验所用材料为威廉姆斯82（简称W82）；材料按照以下流程进行：大豆种子用70%的洒精灭菌30 sec，播种于低氮营养液浸泡的蛭石基质中，于培养室中培养，16 h光/8 h 暗，光强7000 LUX，温度26 ℃，相对湿度为70%。播种后15天，倒出蛭石，把大豆苗侵泡在高浓度的硝酸营养液中，并分别在处理1 min、5 min、15 min、1 h、3 h、24 h和72h后取主根和侧根样品。其中，低氮：0.25 mM；高氮：15.75 mM。

2、mRNA的分离：采用Trizol法提取大豆总RNA，①先将组织放入研磨中用液氮研磨3次，将研磨好的组织0.1-0.2 g加入1 mL离心管中然后加入1 mL TRI pure试剂，充分震荡，裂解产物应呈澄清的透明粘稠液体，室温放置5 min；②加200 μL氯仿，振荡混匀，室温静置5 min，4 ℃，12000 r/min，离心15 min；③将上清移入另外一个离心管中，加入等体积异丙醇，振荡混匀，-20 ℃沉淀30 min，4 ℃，12000 r/min，离心10 min；④弃上清，用75%的乙醇（DEPC处理过的无菌水配制）洗，4 ℃，12000 r/min，离心10 min，重复两次，室温风干10 min左右，加20 μl左右 DEPC处理过的RNase Free水（DEPC水）溶解沉淀。

3、反转录为cDNA：将提取的mRNA用TaKaRa反转录试剂盒，反转录为cDNA。

4、实时荧光定量PCR分析：采用TIANGEN公司的 SuperReal PreMix Plus（SYBRGreen）试剂盒，具体实验方法如下：在10 μl体系中加入上步所得cDNA模板0.2 μl、正反向引物各0.2 μl、2 x SuperReal PreMix Plus 5 μl、ddH₂O 4.4 μl；扩增程序为：95 ℃，15min；95 ℃，10 sec；60 ℃，34 sec，40 cycles；65 ℃，5 sec，95 ℃，5 sec；其中，

正向引物为：CACCAGCATG TGACGCAT（SEQ ID NO：2）；

反向引物为：TGCCAAGAAC ACTGGGATAGAT（SEQ ID NO：3）。

5、结果：如图1所示，随着硝酸根处理后的时间的增加，GmNRT1.2基因的表达先受到显著诱导而后又被抑制，该结果说明GmNRT1.2基因是受硝酸根诱导的。

实施例2、GmNRT1.2基因响应根瘤菌侵染的表达模式分析。

1、材料获取：实验所用材料为威廉姆斯82（简称W82）；材料按照以下流程进行：大豆种子用70%的洒精灭菌30 sec，播种于低氮营养液浸泡的蛭石基质中，于培养室中培养，16 h光/8 h 暗，光强7000 LUX，温度26 ℃，相对湿度为70%。播种后15天，做接种根瘤菌处理，每株接种慢生型根瘤菌USDA110菌液（OD₆₀₀=0.08）30 mL，分别在接菌后0、1、3、5、10及28天取大豆的根。

正向引物为：CACCAGCATG TGACGCAT（SEQ ID NO：2）；

反向引物为：TGCCAAGAAC ACTGGGATAGAT（SEQ ID NO：3）。

5、结果：如图2所示，在根瘤菌侵染长期的大豆根中，GmNRT1.2基因的表达受到显著抑制，该结果说明GmNRT1.2基因参与了大豆根系结瘤固氮过程。

实施例3、具有高结瘤固氮能力转基因大豆的培育。

1、Wilimas82大豆根组织中总RNA的提取。

研钵经 180 ℃高温处理8 h或经燃烧处理以消除RNA酶污染；氯仿、异丙醇，乙醇等试剂使用新开封未被污染的；其它器材如枪头、离心管和试剂如超纯水、NaAc，均经1 ‰DEPC水处理过夜后121 ℃高温湿热灭菌30 min，枪头，离心管65 ℃烘干备用；采用Trizol法提取大豆总RNA：

（1）取100mg大豆根材料用液氮研磨材料，加入1mL TRI pure试剂，充分匀浆后，将匀浆液吸入1.5mL离心管，室温放置5 min；

（2）加入200μl氯仿，震荡混匀，静置5 min，4℃，12000 r/min，离心10 min；

（3）取上清于另一离心管，加等体积异丙醇，振荡混匀，-20℃沉淀30min，4℃，12000r/min，离心10min；

（4）弃上清，用1mL 75%的乙醇（DEPC处理过的无菌水配制）洗涤，4℃，12000r/min，离心10min，重复两次，室温风干10min左右，加20μl左右 DEPC处理过的RNase Free水（DEPC水）溶解沉淀。

2、反转录PCR。

（1）在用DEPC 处理过的的200μl PCR管中顺序加入5μL RNA和3μL oligo (dt)18；4 μL dNTPs，65℃温育5 min后迅速置于冰上冷却；

（3）按以下顺序加入以下溶液：5X M-MLV buffer（invitrogen公司出品）4μl，RNase inhibitor 1μl，M-MLV 1μl，0.1M DTT 2μl；

（4）将上述反应液混匀，37℃反应30min；

（5）反应结束后，70℃处理10min灭活逆转录酶活性；反应合成的cDNA第一条链可用作PCR反应模板。

3、构建重组表达载体。

（1）GmNRT1.2基因片段的克隆。

根据GmNRT1.2的编码序列（SEQ ID NO：1）设计引物对用于过表达载体构建，根据载体pEGAD上的多克隆位点，引物末端分别引入SmaI和BamH I酶切识别位点；以大豆测序品种W82的cDNA为模板进行PCR，扩增GmNRT1.2长为1758 bp的基因片段（SEQ ID NO：1）；引物序列为：

正向引物：TCCCCCGGG ATGGAATTAGAACAAAACCAGAG（SEQ ID NO: 4）；

反向引物：CGGGATCC TCAGTTGTTTGTAGTTCCTGTCC（SEQ ID NO: 5）；

扩增程序为：95℃ 5min；95℃ 30sec，56℃ 30sec，68℃ 2min，30个循环；72℃ 70sec；

PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，采用上海生工胶回收试剂盒回收纯化1758bp左右的条带；

回收的DNA片段与Blant3-T载体 (Takara 公司)连接，10μl体系中加入T vector1 μl，回收片段4 μl，混匀混合液，16℃连接过夜，热击法转入E.coli大肠杆菌感受态细胞，过夜培养，挑阳性克隆，送交上海生工测序。

(2)重组表达载体的构建。

a.提取含有正确测序的GmNRT1.2 1758 bp基因序列的T载体质粒，用SmaI和BamHI酶切获得核苷酸序列；

b.用SmaI和BamH I酶切pEGAD质粒，获得线状的pEGAD核苷酸序列；

c. 将GmNRT1.2a核苷酸序列片段先克隆到pEGAD载体中；

d.将步骤3的连接产物热激转化感受态大肠杆菌DH5α菌株，37℃过夜培养，挑取阳性克隆进行测序；测序结果表明，得到了重组质粒GmNRT1.2-pEGAD。

4、农杆菌K599介导的毛状根转化。

（1）农杆菌的转化，采用液氮冻溶法转化农杆菌，具体操作如下。

a.取出冻存的200μl感受态细胞，融化后加入5-10μl质粒DNA，轻弹管壁混匀，冰上放20-30min；

b.放入液氮中5min后取出，将管转入37℃（5min）融化后，加入800μl LB（无抗性）液体培养基，28℃低速振荡(150r/min) 4-5 h；

c.4000 r/min，30 sec,去上清，加100 μl LB 液体培养基，悬浮菌体后涂板含50mg/ml卡那霉素）；

d.置28℃培养至白色转化子长出，用于毛状根的转化。

（2）农杆菌K599介导的毛状根转化。

以大豆品种W82为材料，取种子材料用氯气消毒10h后，在B₅培养基（培养基配方：2％蔗糖，0.8g琼脂粉（sigma），1×GAMBORG B-5 BASAL（Phyto Technology Laboratories，货号：G398），pH调至5.7）上萌发5天，待子叶刚要张开时切下子叶，在子叶下端十字交叉切割，浸在活化的农杆菌K599中侵染30 min（OD₆₀₀=0.6）后，将外植体转至1/2 MS培养基（培养基配方：2％蔗糖，0.8 琼脂粉（sigma），0.5×MURA SHIGE & SKOOG BASAL MEDIOM w/VITAMINS （Phyto Technology Laboratories，货号：G519），pH调至5.7；上共培生长3天后，再转至1/2 MS培养基上诱导毛状根，7天后，毛状根长出，待大豆真叶长出，毛状根达到7-8cm后，选择发育阶段接近的毛状根复合苗移入蛭石中，培养1周后接种根瘤菌USDA110（OD₆₀₀=0.08）30 mL/株，培养28天后统计根瘤数量。

5、结果观察。结果如图3所示，表明在完全相同的实验环境下，上调表达GmNRT1.2的转基因根同空载体转化的转基因根系（EV）相比，根瘤数量显著增多（图3A和3B），图3C为对转基因根系中GmNRT1.2的表达水平分析，结果显示在转基因根系中GmNRT1.2的表达是显著上调的。

综上，本发明构建的过表达载体能够特异的过表达大豆中的GmNRT1.2基因。此基因定位在大豆18号染色体上，实时荧光定量PCR检测结果表明，GmNRT1.2基因在大豆根中的表达受到硝酸根的诱导；GmNRT1.2基因在大豆根中的表达受到根瘤菌侵染的抑制；通过毛状根转化嵌合苗的结瘤分析显示，上调表达GmNRT1.2可以显著促进大豆根系结瘤数目的增加，表明GmNRT1.2基因在大豆根瘤发育中具有重要的实际应用价值。

上述描述仅作为本发明可实施的技术方案提出，不作为对其技术方案本身的单一限制条件。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 一种培育高结瘤固氮植物的方法

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1758

<212> DNA

<213> 大豆属大豆(Glycine max)

<400> 1

atggaattag aacaaaacca gagatgggaa ggctatgtga actggaggaa caagcctgct 60

ctcagtggct gcaatggtgg catgcttgct gcctcctttg ttttagtggt tgagatattg 120

gagaatctgg catttctagc caatgcaagc aatttggtgc tgtatctgag gcagtacatg 180

cacatgtccc cttcaaaatc tgccaacaat gtcacaaatt tcatgggaac ggccttcctc 240

cttgcccttc ttggaggttt cttatctgat gcttttttca ccacttatca aatctacctg 300

ataagtgcag tcattgaatt cctgggattg attgttctca ctgtgcaagc tcgtgtgcca 360

tcactgaagc caccagcatg tgacgcatcc actccatgca atgaagttag tggtggaaaa 420

gcagcaatgc tgtttgctgg gctctatttg gtggcacttg gagttggagg aattaagggg 480

tcattgcctt cacatggtgc tgagcaattt gatgacaaca ccccatctgg aaggaagaaa 540

agatcaacct tcttcaacta ctttgtcttc tgcttgtcat ttggtgccct tattgcagtc 600

acatttgtgg tgtgggttga agacaacaaa gggtgggaat ggggctttgg aatctctact 660

ataaccatat ttgtatctat cccagtgttc ttggcaggct caactactta taggagcaag 720

atcccttcta gaagtccact tacaaccatt ttgaaggtac tagttgctgc ttcacttaac 780

agctgcttca acagtagaaa ttctagcagt gcagtggtga acatgacttc aagcccttcc 840

aatctaaact caggcagaaa acaagtaggg aaagaagctt ccaatattgc aaacaaggaa 900

ccagaagccc caataacaaa cacactcaaa ttcctcaata aagcagttga gaacaaccct 960

atctattcat caataaaatg cacagtggag caagtagaag atgtgaagat agtgctgaaa 1020

gtgctcccca tattcgcatg caccatcatg ctgaactgtt gcctggctca gctctccact 1080

ttctcagtcg agcaagccgc aacaatggac accaaacttg gtaccctaaa ggtgccacca 1140

gcctctttgc caatcttccc agtgctcttc atcatggtcc tggcaccaat ctacgaccac 1200

atcatcaccc catttgcaag aagagttacc aagacagaaa tgggaatcac acacctccaa 1260

aggattggaa ttggactagt cctctctgta gtagcgatgg cagtggcggc ggttgttgaa 1320

gtgaaaagaa aacgtgtggc aataatggca acacactcaa atagccttct agatgatgca 1380

accaagccac tccccatcac attcttttgg attgcttttc agtacttgtt ccttggttct 1440

gctgatcttt tcaccctagc ggggttattg gagtttttct tcacagaagc accttctagc 1500

atgaggtctt tggccacatc actctcttgg gcctctttgg ctgtagggta ttaccttagt 1560

tcagcaattg tgtcaattgt aaatagtgtc actggcaaca cctcacatag accatggctc 1620

tctgggacaa accttaacca ctaccaccta gagaggtttt actggctcat gtgtgtgctg 1680

agtgcgttga atttcttgca ttacttgttt tgggctatca gatacaagta tagagggaca 1740

ggaactacaa acaactga 1758

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 2

caccagcatg tgacgcat 18

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 3

tgccaagaac actgggatag at 22

<210> 4

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 4

tcccccggga tggaattaga acaaaaccag ag 32

<210> 5

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 5

cgggatcctc agttgtttgt agttcctgtc c 31

Claims

1.一种培育高结瘤固氮植物的方法，其特征在于：首先构建含有SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的过表达载体，然后利用此过表达载体构建转化体，再利用所得转化体侵染受体植物根系，筛选阳性植株，获得与正常植物相比具有高结瘤固氮能力的转基因植物；所述植物为大豆。

2.根据权利要求1所述的一种培育高结瘤固氮植物的方法，其特征在于：所述过表达载体以pEGAD为骨架载体，通过Sma I和BamH I酶切后进行目的基因片段与骨架载体的连接，完成过表达载体的构建。

3.根据权利要求1所述的一种培育高结瘤固氮植物的方法，其特征在于：在构建过表达载体之前对SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列进行PCR扩增，其正向扩增引物如序列表中的SEQ ID NO：4所示，其反向扩增引物如序列表中的SEQ ID NO：5所示。

4.根据权利要求1所述的一种培育高结瘤固氮植物的方法，其特征在于：利用所述过表达载体转化农杆菌K599获得转化体，然后再利用农杆菌K599介导的毛状根转化法获得转基因植物，筛选阳性植株得到与正常植物相比具有高结瘤固氮能力的转基因植物。