CN116790613A - 调控水稻耐盐性的基因OsST2及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开的一种调控水稻耐盐性的基因OsST2的分离克隆、功能验证及其在水稻耐盐育种中的应用,属于植物基因工程领域,该基因OsST2的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示,氨基酸序列如SEQ IDNo.2所示。本发明还公开了敲除所述基因OsST2获得的突变体B6236,所述突变体显著提高了水稻对盐胁迫的耐受性,为研究OsST2调控水稻耐盐机制和水稻耐盐育种提供了重要的基因资源。本发明还提供了上述基因在水稻耐盐育种中的应用,为培育优良耐盐水稻品种奠定基础。
Description
技术领域
本发明涉及植物基因工程技术领域,更具体地,涉及一种调控水稻耐盐性的基因OsST2及其在水稻耐盐育种中的应用。
背景技术
目前全球20%以上的灌溉土地受到高盐度的威胁,随着全球气候变化和不良灌溉方式,盐渍土面积逐年增加。据有关数据统计,全球已有约6%的土地遭受盐害侵袭。我国的盐碱地高达0.2-0.26亿hm2,并以每年1%的速度增加,严重威胁生态可持续发展和粮食安全。与此同时,全球人口却在不断增加,利用盐渍土种植主要作物来满足粮食需求势在必行。因此,挖掘和利用更多优异耐盐基因并培育耐盐性品种是解决这一问题的有效途径。
水稻(Oryza sativa L.)属禾本科,最重要的粮食作物之一。水稻是盐敏感作物。盐胁迫对水稻的影响是多方面的,有研究表明水稻种子的发芽率、发芽势、发芽指数和活力指数均会随盐浓度的升高呈下降趋势。在盐胁迫条件下,叶子会卷曲、枯萎、变黄,并会抑制叶和根的生长,在严重时会导致幼苗死亡。在盐胁迫下水稻的有效穗数与每穗颖花数均会降低,水稻每穗粒数减少,进而导致水稻减产,且加工品质及外观品质也会受到影响,精米率降低,垩白粒率和垩白度升高。盐胁迫会使普通水稻的光合作用在一定程度上受到抑制,渗透胁迫会导致气孔快速闭合,从而降低植物吸收二氧化碳的能力并抑制光合作用。
水稻中目前已定位、克隆了多个耐盐相关的基因,有些基因已经明确了其基因功能。但水稻耐盐性是由多基因调控的数量性状,其耐盐调控网络非常复杂,目前对盐反应调控网络的理解仍然有限,限制了这些基因在育种中的应用。因此亟需在广泛的水稻种质资源中挖掘耐盐基因资源,鉴定和克隆更多新的耐盐基因,为进一步探索水稻盐胁迫响应的分子机制和培育耐盐水稻品种奠定基础。
发明内容
有鉴于此,本发明的主要目的在于提供一种调控水稻耐盐基因OsST2及其在水稻耐盐育种中的应用。通过定位和克隆水稻中OsST2基因,获得其核苷酸序列和蛋白质的氨基酸序列,获得了OsST2基因的敲除突变体,突变体提高了水稻对盐胁迫的抗性。
本发明提供了一种调控水稻耐盐性的基因OsST2,其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
优选的,所述基因以纯合形式存在于水稻基因组中。
本发明中所述OsST2基因序列通过如下方法获得:
从培育的日本晴水稻植株的叶片(以下简称野生型或WT)中提取DNA,用PCR引物即OsST2F引物和OsST2R引物,进行PCR扩增,经测序,获得OsST2基因核苷酸序列。
由OsST2基因编码的蛋白质包含有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。
其中,OsST2F引物序列为如SEQ ID NO:3所示,具体为:5’-TTTACAGTGGTCTAAAAGCGAAAT-3’;
所述OsST2R引物序列为如SEQ ID NO:4所示,具体为:5’-CCGACATCTTCATCGAGCAG-3’。
具体PCR反应体系采用50μL体系:DNA模板2μL,OsST2F引物(10μmol/L)2μL,OsST2R引物(10μmol/L)2μL,Taq Mix25μL,加ddH2O补足50μL。
PCR扩增程序如下:94℃预变形5min、94℃变性30s、54℃~60℃退火30s(温度因引物不同而不同)、72℃延伸1min(延伸时间因引物不同而不同),30~35个循环、72℃延伸10min。
具体培育方法为:打破休眠并经过消毒发芽的水稻种子,在28℃、14小时光照,10小时黑暗的条件下蒸馏水正常培养7d,第8天换成1/2倍国际水稻所标准营养液培养至14d,第15d全营养液培养生长至21d,第22d用100mmol/L NaCl溶液进行盐胁迫,结合根长、株高和钾、钠离子含量等参数综合评价水稻耐盐性。
本发明还提供了一种含有上述基因的重组载体、含有上述基因的质粒,以及含有上述基因或载体的工程菌或宿主细胞。所述工程菌和宿主细胞可理解为本领域技术人员在转基因过程中所使用的的工程菌或宿主细胞。在优选的技术方案中,所述宿主细胞是含有所述基因的靶标序列的大肠杆菌细胞、农杆菌细胞或植物细胞。随着科技发展,所述工程菌和宿主细胞的选择也许会发生变化,或非转基因目的的应用领域,也同样涉及载体和工程菌的利用,但只要含有本发明所述基因或本发明所述的载体,均在本发明的保护范围内。
本发明还提供了上述基因的应用,所述应用包括以下中的一种或多种:
1)用于水稻的耐盐育种;
2)通过将水稻中上述OsST2基因敲除或沉默,提高水稻耐盐能力。
进一步地,本发明提供了利用荧光定量RT-PCR检测OsST2基因表达量的方法,包括以下步骤:
将水稻在28℃、14小时光照,10小时黑暗的条件下蒸馏水正常培养7d,第8天换成1/2倍国际水稻所标准营养液培养至14d,第15d全营养液培养至21d,第22d用200mmol/L的NaCl溶液进行盐胁迫处理后,取水稻叶片总RNA,反转录后,获得cDNA,以cDNA为模板,用RT-PCR引物即OsST2qF引物和OsST2qR引物扩增,检测OsST2基因表达量。
其中,OsST2qF引物序列为如SEQ ID NO:5所示,具体为:5’-ACGCCTACATCGACAAGACCGAC-3’;
OsST2qR引物序列为如SEQ ID NO:6所示,具体为:5’-GCAACCCCACCGGCCACCC-3’。
具体RT-PCR反应体系如下:2×SYBR GreenPro Taq HS Premix10μL;cDNA4μL;Primer F(10μM)0.8μL;Primer R(10μM)0.8μL;ROX Reference Dye(20μM)0.4μL;RNasefree water to 20μL。
表达量计算方法采用△CT=AVERAGE(样本CT值)-AVERAGE(内参CT值)算法,即:样本CT值的平均数-内参CT值的平均。
本发明还公开了包含引物OsST2qF、OsST2qR的试剂或试剂盒。本领域技术人员可借助常规技术手段获得包含上述引物的试剂或试剂盒。
本发明公开了一种调节水稻盐耐受性的方法,其将含有所述OsST2基因序列的核酸于水稻中敲除或沉默,从而提高水稻的耐盐能力。
本发明还提供了一种敲除所述OsST2基因的水稻突变体,该水稻突变体不具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列的基因。
其中,水稻突变体的具体制备方法为:
(1)在OsST2基因的外显子区域设计一对gRNA引物,连接至载体质粒中;
(2)将质粒转化至农杆菌中,挑取农杆菌单克隆菌落,制备浸染液;
(3)将水稻愈伤组织于浸染液中浸染,浸染后的愈伤组织培养分化成苗得到水稻突变体。
其中,步骤(1)中,所述gRNA引物,其正向引物OsSTgF核苷酸序列如SEQ ID No.7所示,具体为:5’-CCGTGGTGCTGAGCCACCAC-3’;
反向引物OsSTgR核苷酸序列如SEQ ID No.8所示,具体为:5’-GATGTGGTGGCTCAGCACCA-3’;
步骤(1)中,连接至载体质粒的连接体系包含:2μL酶切后的pRGEB32,2.5μL的gRNA,1μL的10×T4 Buffer,0.5μLT4Ligase,并使用ddH2O补足10μL;连接体系16℃反应4h。
步骤(2)中,质粒为经测序正确的质粒,农杆菌为农杆菌EHA105,浸染液的制备方法为挑取单克隆于5mL含卡纳霉素和利福平抗性YEB培养液中,在28℃条件下200rpm震荡培养24-36h,之后于4000rpm离心5min,加入含200μM乙酰丁香酮的AAM感菌液制成浸染液。
步骤(3)中所述浸染包括以下步骤:将水稻愈伤组织放入浸染液侵染5-10min,然后将愈伤组织取出,无菌滤纸上沥干30-40min,置于共培养培养基上,25℃黑暗条件下培养3天,将愈伤组织取出,分别放到含头孢霉素和潮霉素的选择培养基上进行3轮筛选得到浸染后的愈伤组织。
上述gRNA引物还可以用于水稻OsST2基因编辑的引物在基因敲除、外援基因编辑插入中的应用,其正向引物核苷酸序列如SEQ IDNo.7所示,反向引物核苷酸序列如SEQ IDNo.8所示。
本发明进一步提供了一种耐盐性的检测方法,具体包括如下步骤:
统计野生型材料(日本晴)和水稻突变体(OsST2基因敲除突变体)在100mM NaCl盐处理7天后的叶数和死叶数,从而计算出野生型材料和OsST2基因敲除突变体的叶片存活率;
设置对照组,对照组7天时间中用营养液进行培育,统计对照组和实验组中,野生型材料和OsST2基因敲除突变体的根系变化情况;
结合根系变化和存活率得到野生型材料和水稻突变体的耐盐性能。
本发明还提供一种水稻耐盐关键基因OsST2的筛选和定位方法,包括以下步骤:
(1)水稻苗期耐盐表型鉴定
以盐胁迫下的死叶率作为评价指标评估水稻苗期耐盐性,并对8个耐盐相关性状进行统计分析:RNC(地下部Na+浓度)、SKC(地上部K+浓度)、SNC(地上部Na+浓度)、RN/K(地下部Na+/K+)、RTRSA(相对总根表面积)、RTRV(相对总根体积)、RTRL(相对总根长)和RSN/K(地下部相对Na+/K+);
(2)全基因组关联分析
结合基因型数据,对8个水稻苗期耐盐相关性状进行全基因组关联分析,全基因组关联分析采用Tassel5.0软件中的混合线性模型(Compressed MLM)程序;
(3)耐盐候选基因的检索
选择共定位QTLs中P值最小的SNPs位点,通过国家水稻数据中心(https://www.ricedata.cn/)检索SNPs±250kbp范围内所有候选基因,并结合基因注释初步预测OsST2为耐盐候选基因。
本发明还提供一种水稻耐盐关键基因OsST2的鉴定和功能分析方法,包括以下步骤:
1)单倍型分析
对共定位QTLs区间内lead SNPs±250kbp范围内所有基因进行单倍型分析,先从RAP-DB(Rice Annotation Project Database)网站(http://rapdb.dna.affrc.go.jp/)上检索候选区间内所有基因号及其注释信息,再从测序的数据中提取所有基因的非同义突变的SNPs及启动子区的所有SNP,并剔除低质量的SNPs,进行单倍型分析。首先利用非同义突变的SNPs对该区间内所有基因进行单倍型分析,然后对不同单倍型之间表型值没有显著差异的基因,再利用启动子区的SNPs进行单倍型分析。对至少3份水稻材料的单倍型进行表型比较分析,每个非同义SNP的等位基因之间的表型值差异通过t检验进行评估。使用与耐盐相关的非同义SNPs确定每个基因的序列比对,并且通过单向方差分析或t检验计算每个基因单倍型之间表型值的差异。如果单向方差分析的结果显著(P<0.01),则进行Duncan的多重范围检验以进行比较。OsST2基因的外显子区检测到的所有差异SNPs可将该基因划分为8种单倍型,其中Hap_8与Hap_1的表型值存在显著差异,具体如图2所示;
表1 8种单倍型对应数量
2)表达量分析
将将培养至三叶一心时期的幼苗用200mM NaCl进行短时间处理,在0、3、6和12小时分别对叶片取样提取总RNA、反转录,获得cDNA,以合成的cDNA为模板,用OsST2qF引物(序列见SEQ ID No.5所示)和OsST2qR引物(序列见SEQ ID No.6所示),检测OsST2基因表达量;
3)序列比对
利用CTAB法提取叶片DNA,设计引物OsST2F引物(序列见SEQ ID No.3所示)和OsST2R引物(序列见SEQ ID No.4所示)进行PCR扩增,产物测序,通过序列比对及表达谱分析验证候选基因OsST2基因。对耐盐材料(S125)和盐敏感材料(S87)的基因组DNA进行测序,具体如图1所示,基因组DNA序列测序比对分析,与日本晴序列相比,在耐盐材料(S125)和盐敏感材料(S87)中各存在2处碱基替换,均导致编码的氨基酸发生了改变。
本发明与现有技术相比,具有以下优点:
本发明利用全基因组关联分析定位,结合候选基因表达量分析、单倍型分析和测序比对的方法,成功预测水稻耐盐调控基因,并验证其参与水稻耐盐调控,可将其用于调控水稻耐盐性;通过CRISPR-Cas9基因编辑方法在日本晴背景下构建敲除水稻OsST2的突变体B6236,与野生型日本晴相比,突变体B6236在盐胁迫下的叶片存活率显著提高,根长也与野生型存在显著性差异。可见,本发明提供的水稻OsST2基因在调控植株耐盐性功能明确,为培育耐盐水稻品种提供了重要的基因资源。
附图说明
图1是OsST2基因在S87和S125中的变异位点。
图2是OsST2基因在RSN/K性状下的单倍型分析及其表型值。
图3是OsST2基因在耐盐水稻材料(S125)和盐敏感材料(S87)中的基因表达量。
图4是盐胁迫对野生型WT和敲除突变体B6236死叶率的影响。
图5是盐胁迫对野生型WT和敲除突变体B6236根长的影响。
具体实施方式
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施,本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进,因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。
除非另有定义,本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的,不是旨在于限制本发明。
下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明。实施例中所用到的试剂均由市售。
实施例1
1)OsST2基因在不同盐耐受性水稻中的基因表达量
水稻幼苗在盐胁迫下进行培养,结合根长、株高、钾钠离子含量等参数选取出两份极端材料分别是盐敏感材料S87,和耐盐材料S125;
将S87和S125的种子分别在28℃、14小时光照,10小时黑暗的条件下蒸馏水正常培养7d,第8天换成1/2倍国际水稻所标准营养液培养至14d,第15d全营养液培养至21d,处理组第22d在营养液中加入200mmol/L NaCl进行盐胁迫处理12h,对照组则在第22d继续用全营养液培养12h。
盐胁迫处理0、3、6和12h分别取叶片提取总RNA,用艾科瑞公司Evo-M-MLV反转录试剂预混液试剂盒(AG11706)将RNA反转录为cDNA。以cDNA为模板,用OsST2qF引物(5’-ACGCCTACATCGACAAGACCGAC-3’)和OsST2qR引物(5’-GCAACCCCACCGGCCACCC-3’),采用艾科瑞公司SYBR Green Pro Taq HS qPCR试剂盒(AG11701)检测OsST2基因表达量,具体结果如图3和下表2所示,可以看到,盐胁迫6h,盐敏感材料S87中OsST2基因的表达量显著升高,而在耐盐材料S125中的表达量则显著下降。
具体RT-PCR反应体系如下:2×SYBR GreenPro Taq HS Premix10μL;cDNA4μL;Primer F(10μM)0.8μL;Primer R(10μM)0.8μL;ROX Reference Dye(20μM)0.4μL;RNasefree water to 20μL。
表2 S125和S87中OsST2基因相对表达量
2)CRISPR-Cas9基因编辑方法敲除OsST2基因
在OsST2基因的外显子区域设计一对gRNA引物,OsSTgF引物(5’-CCGTGGTGCTGAGCCACCAC-3’)和OsSTgR引物(5’-GATGTGGTGGCTCAGCACCA-3’)连接至pRGEB32质粒中,得到CRISPR-Cas9敲除载体。连接体系如下:酶切后的pRGEB32 2μL,gRNA 2.5μL,10×T4 Buffer 1μL,T4 Ligase 0.5μL,ddH2O补足10μL。连接体系16℃反应4h。
将CRISPR-Cas9敲除载体导入水稻植株:
测序正确的质粒转化至农杆菌EHA105中,挑取单克隆于5mL含卡纳霉素和利福平抗性YEB培养液中,28℃200rpm震荡培养24-36h;4000rpm离心5min;用含200μM乙酰丁香酮的AAM感菌液制成浸染液。将长大一定大小的水稻愈伤组织放入AAM浸染液侵染5-10min,然后将愈伤组织取出,无菌滤纸上沥干30-40min,后,置于共培养培养基上,25℃暗培养3天。将愈伤组织取出,分别放到含头孢霉素和潮霉素的选择培养基上进行3轮筛选。挑取在选择培养基上存活较好颜色鲜黄的抗性愈伤移入分化培养基中,培养至分化成苗,得到OsST2基因敲除突变体,本发明中称之为B6236。
3)水稻植株的培育
先根据上述步骤2)中获得B6236的种子,选取野生型(日本晴)和B6236正常发芽的水稻种子,同时在28℃、14小时光照,10小时黑暗的条件下蒸馏水正常培养7d,第8天换成1/2倍国际水稻所标准营养液培养第14d,第15d全营养液培养生长到第21d,第22d用100mmol/L的NaCl溶液进行盐胁迫,培育得到野生型(日本晴)和OsST2基因敲除突变体(B6236)的水稻植株;
4)测序
利用CTAB法分别提取日本晴水稻植株叶片和B6236水稻叶片中的DNA,用OsST2F引物(5’-TTTACAGTGGTCTAAAAGCGAAAT-3’)和OsST2R引物(5’-CCGACATCTTCATCGAGCAG-3’),PCR扩增。
其中,PCR反应体系采用50μL体系:DNA模板2μL,正反向引物(10μmol/L)各2μL,TaqMix25μL,加ddH2O补足50μL。
PCR扩增程序如下:94℃预变形5min、94℃变性30s、54℃~60℃退火30s(温度因引物不同而不同)、72℃延伸1min(延伸时间因引物不同而不同),30~35个循环、72℃延伸10min。
经测序获得日本晴中OsST2基因核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。确定B6236中OsST2基因以纯合形式存在的突变体以进行后续的耐盐能力测定实验。
5)OsST2基因敲除突变体B6236耐盐能力测定
选取野生型材料WT(日本晴)和B6236中OsST2基因以纯合形式存在的突变体种子进行培育,按照步骤3)中的培育方法培育至21d,处理组第22d开始在营养液中加入100mmol/L的NaCl溶液进行盐胁迫,对照组继续以营养液进行培养;7天后统计各参数变化情况,具体如图4和下表3所示;同时统计根系变化情况,具体如图5和下表4所示。结果表明,盐处理下敲除突变体B6236的叶片存活率显著高于野生型WT的,且敲除突变体B6236的根长显著大于野生型WT的。表明敲除OsST2基因的B6236具有更好的耐盐性能,证明OsST2基因参与水稻耐盐性的调控,在水稻耐盐育种中具有重要的应用价值。
表3盐胁迫对日本晴(WT)和突变体(B6236)的影响
表4盐胁迫对日本晴(WT)和突变体(B6236)根长影响
其中,CK为对照组,NaCl为处理组,WT为野生型材料,B6236为OsST2基因敲除突变体。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合,为使描述简洁,未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述,然而,只要这些技术特征的组合不存在矛盾,都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范围。因此,本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (8)
1.一种调控水稻耐盐性的基因OsST2,其特征在于,所述基因的核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示。
2.如权利要1所述基因编码的蛋白质,其特征在于,所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ IDNO:2所示。
3.含有如权利要求1所述基因的重组载体、工程菌或宿主细胞。
4.如权利要求1所述基因的应用,其特征在于,所述应用包括以下中的一种或多种:
1)提高水稻对盐胁迫的抗性;
2)培育抗盐胁迫或培育具有高盐耐受性的水稻品种。
5.一种用于检测权利要求1中所述基因的RT-PCR引物,其特征在于,所述RT-PCR引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示的反向引物。
6.一种培育耐盐水稻的方法,其特征在于:将含有权利要求1所述基因于水稻中敲除,获得耐盐性增强的转基因水稻。
7.一种水稻OsST2基因敲除突变体,其特征在于,所述水稻突变体为敲除包含有SEQ IDNO:1所示的核苷酸序列的突变体。
8.用于敲除或插入权利要求1所述基因的gRNA引物,其特征在于,所述gRNA引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示的反向引物。
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