CN117264971B - 大豆硫氧还原蛋白基因GmTrx1及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及了一种大豆硫氧还原蛋白基因GmTrx1及其应用，其中，大豆硫氧还原蛋白基因GmTrx1，的序列含有：1)SEQ ID NO.1所示的基因编码区序列，或2）SEQ ID NO.2所示的基因启动子序列，或3)在SEQ ID NO.2所示的序列中经取代、缺失或添加一个或几个核苷酸且具有同等或差异活性的由2)衍生的核苷酸序列。本发明还提供了含上述基因GmTrx1的载体及含载体的宿主细胞或工程菌。该大豆硫氧还原蛋白基因GmTrx1在提升热区适应性大豆株高及大豆产量方面具有重要应用，可有效将大豆种质的株高进行高、低区分，该位点可进一步开发为功能分子标记，在今后对热区大豆株高性状筛选上具有重要的应用价值。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种大豆硫氧还原蛋白基因GmTrx1及其应用。
背景技术
大豆（Glycine max (Linn.) Merr.）是我国重要的油料、经济及饲料作物，在人们生活中占据重要角色。大豆株高是影响大豆产量的关键因素，它是一个受多基因控制的复杂数量性状。目前，针对我国大豆株高或株型功能基因挖掘与验证的研究报道较多，如Dt1、Dt2及GmCOL1b等，这些基因的挖掘主要源于我国北方及黄淮海大豆种质资源及主要产区。然而，目前我国低纬热区大豆种质相对匮乏，对于大豆株高等产量相关性状遗传背景的表型精准评测、关键QTL挖掘及优异基因鉴定等研究还较为薄弱。
发明内容
针对现有技术中存在的不足，本发明提供了一种大豆硫氧还原蛋白基因GmTrx1及其应用。
本发明广泛收集国内、外热区大豆种质并完成海南引种实验，基于大豆株高表型及基因组深度重测序，结合转录组测序、基因单倍型分析及异源转基因拟南芥实验，初步证明大豆硫氧还原蛋白基因GmTrx1可正向调节大豆株高，并最终提高单株产量。本发明基于海南等我国热区的环境适应性，探究热区大豆株高是提高热区大豆产量的关键因素，可为今后培育热区适应性高产大豆种质提供重要的功能基因/优异等位变异资源，以保障我国大豆的高产、稳产。
具体的，本发明提供了一种大豆硫氧还原蛋白基因GmTrx1，所述大豆硫氧还原蛋白基因GmTrx1的序列含有：
1) SEQ ID NO .1所示的基因编码区序列，或
2) SEQ ID NO .2所示的基因启动子序列，或
3) 在SEQ ID NO .2所示的序列中经取代、缺失或添加一个或几个核苷酸且具有同等或差异活性的由2)衍生的核苷酸序列。
本发明还提供了上述大豆硫氧还原蛋白基因GmTrx1的载体，其出发载体为pCAMBIA3301。
含有上述大豆硫氧还原蛋白基因GmTrx1或上述载体的宿主细胞或工程菌均属于本发明的保护范围。
本发明还提供了上述大豆硫氧还原蛋白基因GmTrx1在提升热区适应性大豆株高中的应用。
本发明还提供了上述大豆硫氧还原蛋白基因GmTrx1在提高热区适应性大豆产量中的应用。
本发明还提供了一种能够提升株高的转基因植物的制备方法，在植物基因组中引入或过表达上述的大豆硫氧还原蛋白基因GmTrx1。
进一步的，采用农杆菌介导法，将上述的大豆硫氧还原蛋白基因GmTrx1转入植物中，筛选转基因植株。
进一步的，所述植物为拟南芥。
与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
GmTrx1是本发明鉴定并发现的具有影响热区大豆株高能力的功能新基因。研究发现，GmTrx1基因在高株高表型热带大豆中的表达显著高于低株高大豆；对该基因进行优异变异及单倍型分析，发现在基因启动子区存在1个显著的SNP（C/T）变异，推测其影响基因的表达，基于这一变异位点可有效将大豆种质的株高进行高、低区分，该位点可进一步开发为功能分子标记，在今后对热区大豆株高性状筛选上具有重要的应用价值。
此外，本发明获得了转GmTrx1过表达拟南芥，通过对过表达株系和野生型拟南芥的株高、果荚长度及千粒重的比较，发现转基因株系各性状均显著高于野生型拟南芥，且植株千粒重提高了近2倍以上，结果表明GmTrx1的异源表达显著提高了拟南芥的株高表现，并且推测GmTrx1可同时通过增加有效果荚长度，进而增加单株粒数，最终提高单株产量。
附图说明
图1 为本发明株高性状GWAS结果的曼哈顿图和QQ散点图 。
图2为本发明高/低株高热带大豆中候选基因表达水平。
图3为本发明GmTrx1基因株高性状的单倍型分析。
图4为本发明 EHA105农杆菌菌液PCR鉴定。
图5为本发明转基因GmTrx1拟南芥的PPT筛选结果。
图6为本发明GmTrx1转基因拟南芥株系PCR部分鉴定结果，其中，1-4为不同转基因拟南芥株系，WT为野生型拟南芥。
图7为本发明GmTrx1转基因拟南芥不同株系中的相对表达量。
图8为本发明GmTrx1转基因拟南芥与野生型株高表型分析。
图9为本发明GmTrx1转基因拟南芥与野生型的荚果长度表型分析。
图10为本发明 GmTrx1转基因拟南芥与野生型的千粒重。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
为了挖掘并鉴定影响热区大豆株高的关键基因组区段及功能基因。本发明首先从国内、外收集了504份热区大豆种质，完成引种鉴定后对完熟期的大豆株高进行表型精准测定；此外，对大豆种质进行基因组深度重测序并获得了高通量的SNP标记，通过全基因组关联分析（GWAS）挖掘影响热区大豆的关键QTL；并进一步结合代表性高/低株高热带大豆种质的转录组测序、表达模式分析、基因单倍型分析及转基因拟南芥表型测定等，筛选、克隆并初步鉴定了大豆硫氧还原蛋白基因GmTrx1可正向调控大豆株高。本发明结果为培育热区理想株高及高产大豆新品种（系）奠定重要理论基础及应用价值。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规实验方法。下述实施例中所用的药品试剂，如无特殊说明，均从常规生化试剂公司购买。此外，所用大豆种质资源及拟南芥种子（Col-0），公众均可以从海南大学获得。基因组深度重测序数据，公众可以从海南大学获得。pCAMBIA3301植物表达载体、大肠杆菌DH5α及农杆菌EHA105，公众可以从海南大学获得。
下面结合具体的实施例进行说明：
实施例1 热带大豆自然群体株高性状表型分析
本研究从国内、外收集并引种热区大豆种质504份，进行株高的表型精准评测，通过Excel软件进行数据整理，并利用SPSS统计软件对自然群体大豆株高进行描述性统计及变异系数分析。结果显示，自然群体中大豆株高变化范围广泛，为12.67~117.00 cm，群体表型数据符合正态分布，统计结果见表1。
表1 热带大豆株高性状描述性统计及变异系数分析
| 最小值（cm） | 最大值（cm） | 平均值（cm） | 标准差 | 变异系数 |
| 12.67 | 117.00 | 31.72 | 16.16 | 0.51 |
实施例2 热带大豆株高性状全基因组关联分析
对504份大豆种质进行基因组深度重测序，测序数据经过滤、与大豆参考基因组比对等流程分析后，最终获得541，713个高质量SNP标记；采用TASSEL 5.0软件对大豆株高性状进行GWAS分析。研究发现在大豆3号、5号及15号染色体上检测到连续密集的SNP簇并绘制了曼哈顿图（图1），进一步通过QQ散点图说明株高性状GWAS关联性较好，基于15号染色体上显著性SNP最多且最为密集（表2），本发明选择该基因组区段进行热区大豆株高性状候选基因的挖掘。
表2 大豆15号染色体上株高性状显著性SNP簇
| 性状Trait | 染色体Chr. | 峰值SNP Peak SNPs | 阈值-Log10(P) |
| PH | Chr.15 | 50249890 | 6.40966 |
| PH | Chr.15 | 50270445 | 7.332875 |
| PH | Chr.15 | 50289866 | 9.100898 |
| PH | Chr.15 | 50323350 | 5.054776 |
| PH | Chr.15 | 50368059 | 10.03879 |
| PH | Chr.15 | 50385452 | 5.590254 |
| PH | Chr.15 | 50480630 | 5.108806 |
| PH | Chr.15 | 50503358 | 6.409938 |
| PH | Chr.15 | 50505040 | 5.215419 |
| PH | Chr.15 | 50504064 | 5.938968 |
| PH | Chr.15 | 50597575 | 7.241063 |
| PH | Chr.15 | 50841842 | 5.947111 |
| PH | Chr.15 | 50870062 | 7.655857 |
| PH | Chr.15 | 50887388 | 7.983632 |
| PH | Chr.15 | 50948418 | 6.738344 |
实施例3 株高性状候选基因的筛选
以上述SNP位点的上、下游100 kb范围视为候选基因区间，并对区间内候选基因进行初步筛选，主要筛选原则如下：（1）阅读相关文献，参考有关已发表或报道的大豆株高QTL或QTN；（2）在基因区上有SNP存在；（3）基因功能注释与作物生长发育相关。综上，本研究在大豆15号染色体基因组区段内初步锁定7个基因作为候选基因（表3）。
表3 GWAS关联的株高候选基因
| 染色体Chr. | 峰值SNPPeak SNP | 候选基因Candidate gene | 拟南芥同源基因Homologsin Arabidopsis | 功能注释Functional annotation |
| Chr.15 | 50406016 | Glyma.15G267700 | AT2G44280.1 | Major facilitator superfamily protein |
| Chr.15 | 50448268 | Glyma.15G268100 | AT3G60080.1 | RING/U-box superfamily protein |
| Chr.15 | 50492385 | Glyma.15G268400 | AT2G31955.1 | Cofactor of nitrate reductase and xanthinedehydrogenase 2 |
| Chr.15 | 50503431 | Glyma.15G268600 | AT1G03510.1 | Tetratricopeptide repeat (TPR)-likesuperfamily protein |
| Chr.15 | 50878174 | Glyma.15G271500 | AT5G48030.1 | gametophytic factor 2 |
| Chr.15 | 50890193 | Glyma.15G271700 | AT3G16140.2 | Thioredoxin superfamily protein |
| Chr.15 | 50910117 | Glyma.15G271800 | AT3G52140.2 | tetratricopeptide repeat (TPR)-containingprotein |
实施例4 基于转录组测序的热带大豆株高性状基因差异表达分析及变异分析
本研究选取代表性高株高（SD160）/低株高（SD317）大豆进行转录组测序分析，以筛选并检测差异表达基因及其表达丰度。A1、A2和A3及B1、B2和B3分别代表高株高和低株高大豆品种的3次重复。在上述GWAS结果中的7个株高候选功能基因的表达中，研究发现Glyma.15G267700、Glyma.15G268600、Glyma.15G271700和Glyma.15G271800这4个基因在高/低大豆材料中存在差异表达，其中Glyma.15G271700表达丰度最高（表4）。进一步地，通过qRT-PCR分析4个基因的表达情况，结果显示Glyma.15G271700的表达量最高（图2），这一结果与转录组测序结果相一致。此外，对该基因进行单倍型分析，发现在基因启动子区有1个显著的SNP（C/T）变异，即具有单倍型1（Hap1）的大豆群体株高显著高于具有单倍型2（Hap2）的大豆种质（图3），进一步说明该基因能够调节热带大豆株高性状。基于功能注释发现该基因编码硫氧还原蛋白，故本研究将其命名为GmTrx1，并将此基因作为候选功能基因。
表4 转录组测序株高候选基因表达量结果
| 候选基因Candidate genes | A1 FPKM | A2 FPKM | A3 FPKM | B1 FPKM | B2 FPKM | B3 FPKM |
| Glyma.15G267700 | 8.14 | 5.25 | 4.99 | 3.70 | 4.92 | 2.35 |
| Glyma.15G268600 | 7.56 | 4.82 | 6.66 | 2.56 | 3.01 | 0 |
| Glyma.15G271700 | 160.90 | 130.46 | 133.32 | 93.90 | 118.03 | 109.67 |
| Glyma.15G271800 | 18.47 | 11.28 | 20.83 | 8.78 | 12.86 | 12.92 |
实施例5 GmTrx1基因的克隆与表达载体的构建
选取大豆品种SD160为基因克隆材料，待植株长出第一组三出复叶时，取样，提取叶片总RNA并反转录成cDNA第一链。根据Phytozome数据库上GmTrx1基因序列，使用Primer5软件设计基因克隆引物（引物1），以cDNA为模板，利用TOYOBO品牌的KOD - Plus -Neo高保真PCR酶进行目的基因扩增，PCR反应体系及程序如下：
PCR反应体系20 uL：
| KOD One TM PCR Master Mix | 10 uL |
| 10 μM 引物（F/R） | 1.6 uL |
| DNA样品（50 ng/uL） | 1 uL |
| ddH2O | 7.4 uL |
PCR反应程序（30个循环）：
| 预变性 98 °C | 3 min |
| 变性 98 °C | 10 s |
| 退火 56 °C | 5 s |
| 延伸 68 °C | 10 s |
| 终延伸 68 °C | 10 min |
提取表达载体pCAMBIA3301的质粒，并用Spe I和 Bgl II进行质粒双酶切。利用同源重组法将酶切后的产物与成功扩增的目的片段相连接，并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取单克隆并进行菌液PCR及测序验证，完成pCAMBIA3301-GmTrx1重组质粒的构建。进一步地，将重组质粒转化农杆菌EHA105感受态，并进行农杆菌菌液PCR鉴定（图4），反应体系及程序同上，保留PCR正确的菌液，待进行农杆菌介导的拟南芥浸花转化法。
实施例6 GmTrx1在拟南芥中的过表达及表型分析
以拟南芥Col-0为受体，采用传统的浸花侵染法转化拟南芥，对不同株系的T1代拟南芥种子进行草铵膦（PPT）筛选（8mg/L），得到GmTrx1阳性过表达拟南芥T1代（图5），将生长状态良好的幼苗移栽至土中培养，待莲座叶完全展开，设计转基因特异性鉴定引物（引物2）进行PCR检测，成功扩增出目的条带的植株进行单株收种。随后继续进行PPT逐代筛选及特异性PCR鉴定，部分株系鉴定结果如图6所示，结果表明GmTrx1基因已成功转入野生型拟南芥中。为进一步筛选T3代稳定高表达的转基因拟南芥，设计基因定量引物（引物3）进行qRT-PCR分析，比较不同转基因拟南芥株系的GmTrx1基因表达水平。结果显示经逐代鉴定的超表达拟南芥表达量均显著高于野生型WT，表明GmTrx1已转入到野生型拟南芥并成功超表达，其中，OE-4和OE-7转基因株系的GmTrx1基因表达量最高（图7），待用于后续的株高表型鉴定。
对获得的转GmTrx1过表达株系与野生型拟南芥进行表型株高测定，结果显示过表达拟南芥株系OE-4和OE-7的株高、果荚长度及千粒重均显著高于野生型拟南芥（图8-图10），研究结果表明GmTrx1的异源表达显著提高了拟南芥的株高表现，并推测GmTrx1可同时通过增加有效果荚长度，进而增加单株粒数，最终提高单株产量。
综上所述，本研究初步证实GmTrx1基因可正向调节大豆株高，研究结果为通过分子技术手段培育具有热区适应性大豆株高及高产大豆新品种（系）奠定基础。
上述实施例中：
引物1：
正向：5-‘ACACGGGGGACTCTTGACCATGGTAATGCCGTTGAAGGTGTTAGAGG- 3’
反向：5-‘GTCATCCTTGTAATCACTAG+TCACTTGTCAGCAACAAGAGCT- 3’
引物2：
正向：5-‘GCCCAGCTATCTGTCACTTT - 3’
反向：5-‘AAGCCTCCAGCTTCTTGTAT - 3’
引物3：
正向：5-‘GGTTGGTCTTACATTGTGCTTT- 3’
正向：5-‘CATACACAGCAAGCTGAACATT- 3’
需要说明的是，在本文中，诸如术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (4)
1.大豆硫氧还原蛋白基因GmTrx1在提升热区适应性大豆株高中的应用，其特征在于，过表达所述大豆硫氧还原蛋白基因GmTrx1，所述大豆硫氧还原蛋白基因GmTrx1的序列为SEQ ID NO .1所示的基因编码区序列。
2. 大豆硫氧还原蛋白基因GmTrx1在提高热区适应性大豆产量中的应用，其特征在于，过表达所述大豆硫氧还原蛋白基因GmTrx1，所述大豆硫氧还原蛋白基因GmTrx1的序列为SEQ ID NO .1所示的基因编码区序列。
3.一种能够提升株高的转基因植物的制备方法，其特征在于，在植物中过表达大豆硫氧还原蛋白基因GmTrx1，所述植物为拟南芥；
所述大豆硫氧还原蛋白基因GmTrx1的序列为SEQ ID NO .1所示的基因编码区序列。
4.如权利要求3所述的能够提升株高的转基因植物的制备方法，其特征在于，采用农杆菌介导法，将所述大豆硫氧还原蛋白基因GmTrx1转入植物中，筛选转基因植株。
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