CN114934063B

CN114934063B - 水稻dt1蛋白在调控水稻抗旱能力中的应用

Info

Publication number: CN114934063B
Application number: CN202210480984.2A
Authority: CN
Inventors: 刘喜; 曹鹏辉; 董丹; 陈文静; 冯亚婷; 杜坛潇; 郜素
Original assignee: Huaiyin Normal University
Current assignee: Huaiyin Normal University
Priority date: 2022-05-05
Filing date: 2022-05-05
Publication date: 2023-02-28
Anticipated expiration: 2042-05-05
Also published as: CN114934063A

Abstract

本发明涉及水稻抗性育种，具体涉及水稻DT1蛋白在调控水稻抗旱能力中的应用。本发明的技术方案是水稻DT1蛋白在调控水稻抗旱能力中的应用，所述水稻DT1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。在抗旱育种过程种，通过将上述水稻抗旱调控蛋白DT1的表达的物质导入水稻，可以显著提高水稻的抗旱性。水稻抗旱调控蛋白DT1的作用使得其发现和相关突变体的鉴定以及对水稻抗旱分子育种具有重要的应用价值。

Description

水稻DT1蛋白在调控水稻抗旱能力中的应用

技术领域

本发明涉及水稻抗性育种，具体涉及水稻DT1蛋白在调控水稻抗旱能力中的应用。

背景技术

水稻生产需要消耗大量的淡水资源，但我国天然降水呈现总量少、分布不均匀等特点，导致部分地区季节性干旱频发，严重制约着我国水稻生产。通过遗传改良增强水稻抗旱性是节约淡水资源、提高水稻产量的有效途径之一。

水稻抗旱性是一个由多基因控制的数量性状，遗传基础较为复杂。目前，已鉴定超过650个的水稻干旱胁迫相关数量性状基因位点。通过正向与反向遗传学手段鉴定出很多的水稻抗旱调控因子，如DRO1、 OsbZIP23、OsTPS1。DRO1编码一个生长素响应蛋白，受到生长素负向调控，调控水稻根系的不对称生长和对重力响应的向下弯曲，从而改变水稻避旱能力。过表达OsbZIP23的转基因水稻对ABA的敏感性和干旱胁迫的耐受性显著提高，调控OsPP2C49和9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶基因OsNCED4的表达。过表达OsTPS1提高了水稻幼苗对干旱处理的耐受性。然而，水稻抗旱调控的机理极其复杂，亟待挖掘新的抗旱调控基因。

生长素响应因子(auxin response factor,ARF)是一类特异性地结合到生长素响应元件(AuxREs)上的转录因子，参与调控生长素响应。在水稻基因组中有25个ARF基因。OsARF4与OsARF6负调控水稻籽粒大小，其突变体均表现为籽粒变大与千粒重增加；OsARF16参与磷酸盐饥饿应答；OsARF12突变导致水稻对多种真菌菌株表现出过敏反应。然而，在水稻抗旱性调控中，至今未见有相关报道。因此，鉴定参与水稻抗旱性调控的ARF基因，有助于揭示和完善水稻抗旱调控网络，为培育节水抗旱型水稻新品种提供基因资源。

发明内容

本发明要解决的技术问题是为培育抗旱性水稻品种提供一种新选择。

本发明的技术方案是水稻DT1蛋白在调控水稻抗旱能力中的应用，所述水稻DT1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

进一步的，所述水稻DT1蛋白的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

具体的，所述应用为下调水稻DT1蛋白的表达在提高水稻抗旱能力中的应用。

其中，所述下调水稻DT1蛋白的表达的方法是：构建针对DT1蛋白的sgRNA表达载体，进而转化根癌农杆菌，导入水稻细胞中。

优选的，所述sgRNA表达载体的靶序列为SEQ ID NO.1第471～490位和/或第572～591位所示的核苷酸序列。

本发明的有益效果：在抗旱育种过程种，通过将上述水稻抗旱调控蛋白DT1的表达的物质导入水稻，可以显著提高水稻的抗旱性。水稻抗旱调控蛋白DT1的作用使得其发现和相关突变体的鉴定以及对水稻抗旱分子育种具有重要的应用价值。通过设计不同的水稻抗旱调控蛋白DT1敲除靶标位点，利用 CRISPR/Cas9技术构建基因敲除载体，转化水稻细胞，获得DT1基因敲除纯合突变体。相比对照，不同突变体的抗旱性显著增强。因此，本发明提供的敲除水稻抗旱调控蛋白DT1以增加抗旱性的方法，具有重要的应用价值，对水稻抗旱遗传改良具有重要的意义。

附图说明

图1为实施例1中野生型Dongjin与突变体dt1的抗旱表型图；WT：野生型；Beforedrought：干旱处理前；drought：干旱处理中；After drought：干旱处理后；Survival rate：存活率。

图2为实施例1中野生型和突变体dt1的叶片气孔扫描电镜观察图；图中，A、B是野生型水稻正常生长的叶片气孔形态图；E、F是野生型水稻干旱胁迫下的叶片气孔形态图；C、D是dt1的水稻正常生长的叶片气孔形态图；G、H是dt1的水稻干旱胁迫的叶片气孔形态图。

图3为是实施例1中突变体dt1的T-DNA插入位点鉴定图；WT：野生型；OsARF19expression level： OsARF19表达水平。

图4为是实施例2中CRISPR/Cas9敲除蛋白DT1的抗旱表型图；NPB：水稻日本晴；Survival rate：存活率。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。

实施例1水稻抗旱突变体dt1的表型鉴定

从购自韩国庆熙大学的水稻品种Dongjin T-DNA插入突变体库(https://orygenesdb.cirad.fr/)中筛选获得抗旱突变体dt1(drought tolerance 1)。

与野生型相比，突变体dt1表现抗旱的表型(图1)。相比野生型，突变体植株在干旱处理后的存活率显著高于野生型(图1)。

取正常生长2周与干旱胁迫处理3天的野生型和突变体叶片，切成小块。用2.5％戊二醛固定液固定 24小时，再用1％锇酸固定6小时，利用扫描电子显微镜观察。扫描电镜结果表明，在正常生长的条件下野生型和突变体气孔开闭无差异，但在干旱胁迫下野生型和突变体气孔开闭存在显著差异(图2)。

综上所述，相比野生型，突变体dt1在干旱胁迫下叶片气孔关闭，进而增强植物抗旱性。

实施例2DT1的克隆与CRISPR-Cas9敲除验证

1、DT1的克隆

为了分离鉴定出控制突变体dt1的抗旱的基因，根据T-DNA插入的侧翼序列设计三条检测引物P1(如 SEQ ID No.3所示，ttgtaagcggcaagagg)、P2(如SEQ ID No.4所示，ccatttatggaaaagtgag)和P3(如SEQ ID No.5所示，atcaattccagttttcg)(图3A)。PCR扩增结果表明，引物P1+P2在野生型中能扩增出目的片段，而在dt1中则不能。同时，引物P2+P3在dt1中可以扩增出目的片段，而在野生型中则不能(图3B)，结合DNA测序，发现T-DNA插在基因OsARF19第八外显子上(图3A)，OsARF19翻译表达的蛋白为DT1，其氨基酸序列如SEQ IDNo.2所示。根据已公布的水稻日本晴基因组序列，结合基因测序，获得了如SEQ ID No.1所示的编码DT1蛋白的基因OsARF19全长cDNA序列。

SEQ ID No.1基因OsARF19全长cDNA序列：

atgatgaagcaggcgcagcagcagccgccgccgccaccggcgagctctgcggcgacgacgaccaccgcgatggcagccgctgcggcggcggcggtg gtggggagcgggtgcgaaggggagaagacgaaggcgccggcgatcaactcggagctgtggcacgcctgcgcggggccgctggtgtcgctgccgccggcggg cagcctcgtcgtctacttcccccagggccacagcgagcaggcggacccagaaacagatgaagtgtatgcacaaatgactcttcagccagttacttcatatgggaagg aggccctgcagttatcagagcttgcactcaaacaagcgagaccacagacagaattcttttgcaagacactgactgcaagtgatacaagtactcatggaggcttctctgt gcctcgtcgagctgcagaaaagatatttcctccactggacttctcaatgcaaccacctgcacaagaactacaggccagggatttgcatgataatgtgtggacattccgtc acatatatcggggtcagccaaaaaggcatctgcttaccactggctggagtctatttgtaagcggcaagaggttatttgctggagattctgtcatttttgtcagggatgaaa agcagcaacttctattaggaatcaggcgtgctaaccgacagccaactaacatatcatcatctgtcctttcaagtgacagcatgcacatagggattcttgctgctgcagcc catgctgctgccaacaatagcccatttaccatcttttataaccctagggccagtcctactgaatttgttatcccatttgctaagtatcagaaggcagtctatggtaatcaaata tctttagggatgcgctttcgcatgatgtttgagactgaggaattaggaacacgaagatacatgggaacaataactggcataagtgatctagatccagtaagatggaaaa actcgcagtggcgcaacttacaggttggttgggatgaatccgcagccggtgaaaggcgaaatagggtttctatctgggagattgaaccggtcgctgctccatttttcata tgtcctccaccattttttggtgcgaagcggcccaggcaattagatgacgagtcctcggaaatggagaatctcttaaagagggctatgccttggcttggtgaggaaatatg cataaaggatcctcagactcagaacaccataatgcctgggctgagcttggttcagtggatgaacatgaacatgcaacagagctcctcatttgcgaatacagccatgca gtctgagtaccttcgatcattgagcaaccccaacatgcaaaatcttggtgccgccgatctctctaggcaattatgcctgcagaaccagcttcttcaacagaacaatataca gtttaatactcccaaactttctcagcaaatgcagccagtcaatgagttagcaaaggcaggcattccgttgaatcagcttggtgtgagcaccaaacctcaggaacagattc atgatgctagcaaccttcagaggcaacaaccttccatgaaccatatgcttcctttgagccaagctcaaaccaatcttggccaagctcaggtccttgtccaaaatcaaatg caacagcaacatgcatcttcaactcaaggtcaacaaccagctaccagccagcccttgcttctgccccagcagcagcaacagcagcagcagcagcagcaacaacaa caacaacagcaacaacaacaaaaattgctacaacagcagcagcaacagcttttgctccagcaacagcagcaattgagtaagatgcctgcacagttgtcaagtctggc gaatcagcagtttcagctaactgatcaacagcttcagctgcaactgttacaaaaactacagcaacaacagcagtcattgctttcacaacctgcagtcacccttgcacaatt acctctgatccaagaacagcagaagttacttctggatatgcaacagcagctgtcaaactcccaaacactttcccaacaacaaatgatgcctcaacaaagtaccaaggtt ccatcacagaacacaccattgccactgcctgtgcaacaagagccacaacagaagcttctacagaagcaagcgatgctagcagacacttcagaagctgccgttccgc cgaccacatcagtcaatgtcatttcaacaactggaagccctttgatgacaactggtgctactcattctgtacttacagaagaaatcccttcttgttcaacatcaccatccaca gctaatggcaatcaccttctacaaccaatacttggtaggaacaaacattgtagcatgatcaacacagaaaaggttcctcagtctgctgctcctatgtcagttccaagctcc cttgaagctgtcacagcaaccccgagaatgatgaaggattcaccaaagttgaaccataatgttaaacaaagtgtagtggcttcaaaattagcaaatgctgggactggtt ctcaaaattatgtgaacaatccacctccaacggactatctggaaactgcttcttccgcaacttcagtgtggctttcccagaatgatggacttctacatcaaaatttccctatg tccaacttcaaccagccacagatgttcaaagatgctcctcctgatgctgaaattcatgctgctaatacaagtaacaatgcattgtttggaatcaatggtgatggtccgctgg gcttccctataggactaggaacagatgatttcctgtcgaatggaattgatgctgccaagtacgagaaccatatctcaacagaaattgataatagctacagaattccgaag gatgcccagcaagaaatatcatcctcaatggtttcacagtcatttggtgcatcagatatggcatttaattcaattgattccacgatcaacgatggtggctttttgaaccggag ttcttggcctcctgccgctcccttaaagaggatgaggacattcaccaaggtatataagcgaggagctgtaggccggtccattgacatgagtcagttctctggatatgatg aattaaagcatgctctggcacggatgttcagtatagaggggcaacttgaggaacggcagagaattggttggaagctcgtttacaaggatcatgaagatgacatcctact tcttggcgacgacccatgggaggaatttgtcggttgcgtgaaatgcattaggatcctttcacctcaagaagttcagcagatgagcttggagggttgtgatctcgggaac aacattcccccgaatcaggcctgcagcagctcagacggagggaatgcatggagggctcgctgcgatcagaactccgaggccattcttaagatctccatgatgaaatc aaaagttgaagatgtcaggtattggaatactgcgtaa

SEQ ID No.2DT1蛋白的氨基酸序列：

MMKQAQQQPPPPPASSAATTTTAMAAAAAAAVVGSGCEGEKTKAPAINSELWHACAGPLVSLPPAG SLVVYFPQGHSEQADPETDEVYAQMTLQPVTSYGKEALQLSELALKQARPQTEFFCKTLTASDTSTHGGF SVPRRAAEKIFPPLDFSMQPPAQELQARDLHDNVWTFRHIYRGQPKRHLLTTGWSLFVSGKRLFAGDSVI FVRDEKQQLLLGIRRANRQPTNISSSVLSSDSMHIGILAAAAHAAANNSPFTIFYNPRASPTEFVIPFAKYQ KAVYGNQISLGMRFRMMFETEELGTRRYMGTITGISDLDPVRWKNSQWRNLQVGWDESAAGERRNRVS IWEIEPVAAPFFICPPPFFGAKRPRQLDDESSEMENLLKRAMPWLGEEICIKDPQTQNTIMPGLSLVQWMN MNMQQSSSFANTAMQSEYLRSLSNPNMQNLGAADLSRQLCLQNQLLQQNNIQFNTPKLSQQMQPVNEL AKAGIPLNQLGVSTKPQEQIHDASNLQRQQPSMNHMLPLSQAQTNLGQAQVLVQNQMQQQHASSTQGQ QPATSQPLLLPQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQKLLQQQQQQLLLQQQQQLSKMPAQLSSLANQQFQLTD QQLQLQLLQKLQQQQQSLLSQPAVTLAQLPLIQEQQKLLLDMQQQLSNSQTLSQQQMMPQQSTKVPSQN TPLPLPVQQEPQQKLLQKQAMLADTSEAAVPPTTSVNVISTTGSPLMTTGATHSVLTEEIPSCSTSPSTANG NHLLQPILGRNKHCSMINTEKVPQSAAPMSVPSSLEAVTATPRMMKDSPKLNHNVKQSVVASKLANAGT GSQNYVNNPPPTDYLETASSATSVWLSQNDGLLHQNFPMSNFNQPQMFKDAPPDAEIHAANTSNNALFG INGDGPLGFPIGLGTDDFLSNGIDAAKYENHISTEIDNSYRIPKDAQQEISSSMVSQSFGASDMAFNSIDSTI NDGGFLNRSSWPPAAPLKRMRTFTKVYKRGAVGRSIDMSQFSGYDELKHALARMFSIEGQLEERQRIGWKLVYKDHEDDILLLGDDPWEEFVGCVKCIRILSPQEVQQMSLEGCDLGNNIPPNQACSSSDGGNAWRARCDQNSEAILKISMMKSKVEDVRYWNTA

2、OsARF19的转录水平分析

T-DNA插入到基因OsARF19第八外显子上，可能抑制其转录翻译，因而对野生型和突变体中OsARF19 的转录水平进行分析。

使用天根生化植物RNA提取试剂盒提取野生型与突变体的总RNA。使用Nano Drop与琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的浓度和质量，进而反转录cDNA。选用SYBR premix Ex TaqTM(TaKaRa,Japan)试剂盒进行Real-time PCR，在伯乐荧光定量PCR仪CFX96上扩增，采用2^–ΔΔCT方法进行表达水平分析，以水稻看家基因UBQ为对照。结果表明，在突变体dt1中，OsARF19的表达受到显著抑制(图3C)。

3、CRISPR-Cas9敲除DT1验证

为了进一步验证dt1的突变表型是否是OsARF19的抑制表达所引起的，在DT1基因编码区设计两个 CRISPR/Cas9基因敲除靶点。合成基于CRISPR/Cas9系统的靶序列引物，序列如下：

DT1-Cas9-1F：5'-tgcacaagaactacaggcca-3'(SEQ ID No.8)，

DT1-Cas9-1R：5'-tggcctgtagttcttgtgca-3'(SEQ ID No.9),

DT1-Cas9-2F：5'-gtctatttgtaagcggcaag-3'(SEQ ID No.10)，

DT1-Cas9-2R：5'-cttgccgcttacaaatagac-3'(SEQ ID No.11)。

对DT1-Cas9-1F和DT1-Cas9-1R、DT1-Cas9-2F和DT1-Cas9-2R进行退火程序，形成双链DNA，插入CRISPR/Cas9基因敲除载体pCAMBIA1305.1，提取重组表达质粒测序验证正确后，转入根癌农杆菌菌株EHA105(G6040，上海昂羽生物技术有限公司)中，侵染水稻日本晴愈伤组织进行遗传转化。

上述重组载体遗传转化获得了15株T₀代转基因水稻植株。利用基因组引物对含靶标位点的DNA片段进行扩增测序鉴定。所述引物序列为：

DT1-F：5'-ctcaaacaagcgagaccaagac-3'(SEQ ID No.6)，

DT1-R：5'-gcacgcctgattcctaatag-3'(SEQ ID No.7)。

如图4所示，2株纯合突变体(osarf19a、osarf19b)，全部表现抗旱性增强的表型。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 淮阴师范学院

<120> 水稻DT1蛋白在调控水稻抗旱能力中的应用

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 3417

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgatgaagc aggcgcagca gcagccgccg ccgccaccgg cgagctctgc ggcgacgacg 60

accaccgcga tggcagccgc tgcggcggcg gcggtggtgg ggagcgggtg cgaaggggag 120

aagacgaagg cgccggcgat caactcggag ctgtggcacg cctgcgcggg gccgctggtg 180

tcgctgccgc cggcgggcag cctcgtcgtc tacttccccc agggccacag cgagcaggcg 240

gacccagaaa cagatgaagt gtatgcacaa atgactcttc agccagttac ttcatatggg 300

aaggaggccc tgcagttatc agagcttgca ctcaaacaag cgagaccaca gacagaattc 360

ttttgcaaga cactgactgc aagtgataca agtactcatg gaggcttctc tgtgcctcgt 420

cgagctgcag aaaagatatt tcctccactg gacttctcaa tgcaaccacc tgcacaagaa 480

ctacaggcca gggatttgca tgataatgtg tggacattcc gtcacatata tcggggtcag 540

ccaaaaaggc atctgcttac cactggctgg agtctatttg taagcggcaa gaggttattt 600

gctggagatt ctgtcatttt tgtcagggat gaaaagcagc aacttctatt aggaatcagg 660

cgtgctaacc gacagccaac taacatatca tcatctgtcc tttcaagtga cagcatgcac 720

atagggattc ttgctgctgc agcccatgct gctgccaaca atagcccatt taccatcttt 780

tataacccta gggccagtcc tactgaattt gttatcccat ttgctaagta tcagaaggca 840

gtctatggta atcaaatatc tttagggatg cgctttcgca tgatgtttga gactgaggaa 900

ttaggaacac gaagatacat gggaacaata actggcataa gtgatctaga tccagtaaga 960

tggaaaaact cgcagtggcg caacttacag gttggttggg atgaatccgc agccggtgaa 1020

aggcgaaata gggtttctat ctgggagatt gaaccggtcg ctgctccatt tttcatatgt 1080

cctccaccat tttttggtgc gaagcggccc aggcaattag atgacgagtc ctcggaaatg 1140

gagaatctct taaagagggc tatgccttgg cttggtgagg aaatatgcat aaaggatcct 1200

cagactcaga acaccataat gcctgggctg agcttggttc agtggatgaa catgaacatg 1260

caacagagct cctcatttgc gaatacagcc atgcagtctg agtaccttcg atcattgagc 1320

aaccccaaca tgcaaaatct tggtgccgcc gatctctcta ggcaattatg cctgcagaac 1380

cagcttcttc aacagaacaa tatacagttt aatactccca aactttctca gcaaatgcag 1440

ccagtcaatg agttagcaaa ggcaggcatt ccgttgaatc agcttggtgt gagcaccaaa 1500

cctcaggaac agattcatga tgctagcaac cttcagaggc aacaaccttc catgaaccat 1560

atgcttcctt tgagccaagc tcaaaccaat cttggccaag ctcaggtcct tgtccaaaat 1620

caaatgcaac agcaacatgc atcttcaact caaggtcaac aaccagctac cagccagccc 1680

ttgcttctgc cccagcagca gcaacagcag cagcagcagc agcaacaaca acaacaacag 1740

caacaacaac aaaaattgct acaacagcag cagcaacagc ttttgctcca gcaacagcag 1800

caattgagta agatgcctgc acagttgtca agtctggcga atcagcagtt tcagctaact 1860

gatcaacagc ttcagctgca actgttacaa aaactacagc aacaacagca gtcattgctt 1920

tcacaacctg cagtcaccct tgcacaatta cctctgatcc aagaacagca gaagttactt 1980

ctggatatgc aacagcagct gtcaaactcc caaacacttt cccaacaaca aatgatgcct 2040

caacaaagta ccaaggttcc atcacagaac acaccattgc cactgcctgt gcaacaagag 2100

ccacaacaga agcttctaca gaagcaagcg atgctagcag acacttcaga agctgccgtt 2160

ccgccgacca catcagtcaa tgtcatttca acaactggaa gccctttgat gacaactggt 2220

gctactcatt ctgtacttac agaagaaatc ccttcttgtt caacatcacc atccacagct 2280

aatggcaatc accttctaca accaatactt ggtaggaaca aacattgtag catgatcaac 2340

acagaaaagg ttcctcagtc tgctgctcct atgtcagttc caagctccct tgaagctgtc 2400

acagcaaccc cgagaatgat gaaggattca ccaaagttga accataatgt taaacaaagt 2460

gtagtggctt caaaattagc aaatgctggg actggttctc aaaattatgt gaacaatcca 2520

cctccaacgg actatctgga aactgcttct tccgcaactt cagtgtggct ttcccagaat 2580

gatggacttc tacatcaaaa tttccctatg tccaacttca accagccaca gatgttcaaa 2640

gatgctcctc ctgatgctga aattcatgct gctaatacaa gtaacaatgc attgtttgga 2700

atcaatggtg atggtccgct gggcttccct ataggactag gaacagatga tttcctgtcg 2760

aatggaattg atgctgccaa gtacgagaac catatctcaa cagaaattga taatagctac 2820

agaattccga aggatgccca gcaagaaata tcatcctcaa tggtttcaca gtcatttggt 2880

gcatcagata tggcatttaa ttcaattgat tccacgatca acgatggtgg ctttttgaac 2940

cggagttctt ggcctcctgc cgctccctta aagaggatga ggacattcac caaggtatat 3000

aagcgaggag ctgtaggccg gtccattgac atgagtcagt tctctggata tgatgaatta 3060

aagcatgctc tggcacggat gttcagtata gaggggcaac ttgaggaacg gcagagaatt 3120

ggttggaagc tcgtttacaa ggatcatgaa gatgacatcc tacttcttgg cgacgaccca 3180

tgggaggaat ttgtcggttg cgtgaaatgc attaggatcc tttcacctca agaagttcag 3240

cagatgagct tggagggttg tgatctcggg aacaacattc ccccgaatca ggcctgcagc 3300

agctcagacg gagggaatgc atggagggct cgctgcgatc agaactccga ggccattctt 3360

aagatctcca tgatgaaatc aaaagttgaa gatgtcaggt attggaatac tgcgtaa 3417

<210> 2

<211> 1138

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Met Lys Gln Ala Gln Gln Gln Pro Pro Pro Pro Pro Ala Ser Ser

1 5 10 15

Ala Ala Thr Thr Thr Thr Ala Met Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Val

20 25 30

Val Gly Ser Gly Cys Glu Gly Glu Lys Thr Lys Ala Pro Ala Ile Asn

35 40 45

Ser Glu Leu Trp His Ala Cys Ala Gly Pro Leu Val Ser Leu Pro Pro

50 55 60

Ala Gly Ser Leu Val Val Tyr Phe Pro Gln Gly His Ser Glu Gln Ala

65 70 75 80

Asp Pro Glu Thr Asp Glu Val Tyr Ala Gln Met Thr Leu Gln Pro Val

85 90 95

Thr Ser Tyr Gly Lys Glu Ala Leu Gln Leu Ser Glu Leu Ala Leu Lys

100 105 110

Gln Ala Arg Pro Gln Thr Glu Phe Phe Cys Lys Thr Leu Thr Ala Ser

115 120 125

Asp Thr Ser Thr His Gly Gly Phe Ser Val Pro Arg Arg Ala Ala Glu

130 135 140

Lys Ile Phe Pro Pro Leu Asp Phe Ser Met Gln Pro Pro Ala Gln Glu

145 150 155 160

Leu Gln Ala Arg Asp Leu His Asp Asn Val Trp Thr Phe Arg His Ile

165 170 175

Tyr Arg Gly Gln Pro Lys Arg His Leu Leu Thr Thr Gly Trp Ser Leu

180 185 190

Phe Val Ser Gly Lys Arg Leu Phe Ala Gly Asp Ser Val Ile Phe Val

195 200 205

Arg Asp Glu Lys Gln Gln Leu Leu Leu Gly Ile Arg Arg Ala Asn Arg

210 215 220

Gln Pro Thr Asn Ile Ser Ser Ser Val Leu Ser Ser Asp Ser Met His

225 230 235 240

Ile Gly Ile Leu Ala Ala Ala Ala His Ala Ala Ala Asn Asn Ser Pro

245 250 255

Phe Thr Ile Phe Tyr Asn Pro Arg Ala Ser Pro Thr Glu Phe Val Ile

260 265 270

Pro Phe Ala Lys Tyr Gln Lys Ala Val Tyr Gly Asn Gln Ile Ser Leu

275 280 285

Gly Met Arg Phe Arg Met Met Phe Glu Thr Glu Glu Leu Gly Thr Arg

290 295 300

Arg Tyr Met Gly Thr Ile Thr Gly Ile Ser Asp Leu Asp Pro Val Arg

305 310 315 320

Trp Lys Asn Ser Gln Trp Arg Asn Leu Gln Val Gly Trp Asp Glu Ser

325 330 335

Ala Ala Gly Glu Arg Arg Asn Arg Val Ser Ile Trp Glu Ile Glu Pro

340 345 350

Val Ala Ala Pro Phe Phe Ile Cys Pro Pro Pro Phe Phe Gly Ala Lys

355 360 365

Arg Pro Arg Gln Leu Asp Asp Glu Ser Ser Glu Met Glu Asn Leu Leu

370 375 380

Lys Arg Ala Met Pro Trp Leu Gly Glu Glu Ile Cys Ile Lys Asp Pro

385 390 395 400

Gln Thr Gln Asn Thr Ile Met Pro Gly Leu Ser Leu Val Gln Trp Met

405 410 415

Asn Met Asn Met Gln Gln Ser Ser Ser Phe Ala Asn Thr Ala Met Gln

420 425 430

Ser Glu Tyr Leu Arg Ser Leu Ser Asn Pro Asn Met Gln Asn Leu Gly

435 440 445

Ala Ala Asp Leu Ser Arg Gln Leu Cys Leu Gln Asn Gln Leu Leu Gln

450 455 460

Gln Asn Asn Ile Gln Phe Asn Thr Pro Lys Leu Ser Gln Gln Met Gln

465 470 475 480

Pro Val Asn Glu Leu Ala Lys Ala Gly Ile Pro Leu Asn Gln Leu Gly

485 490 495

Val Ser Thr Lys Pro Gln Glu Gln Ile His Asp Ala Ser Asn Leu Gln

500 505 510

Arg Gln Gln Pro Ser Met Asn His Met Leu Pro Leu Ser Gln Ala Gln

515 520 525

Thr Asn Leu Gly Gln Ala Gln Val Leu Val Gln Asn Gln Met Gln Gln

530 535 540

Gln His Ala Ser Ser Thr Gln Gly Gln Gln Pro Ala Thr Ser Gln Pro

545 550 555 560

Leu Leu Leu Pro Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln

565 570 575

Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Lys Leu Leu Gln Gln Gln Gln Gln

580 585 590

Gln Leu Leu Leu Gln Gln Gln Gln Gln Leu Ser Lys Met Pro Ala Gln

595 600 605

Leu Ser Ser Leu Ala Asn Gln Gln Phe Gln Leu Thr Asp Gln Gln Leu

610 615 620

Gln Leu Gln Leu Leu Gln Lys Leu Gln Gln Gln Gln Gln Ser Leu Leu

625 630 635 640

Ser Gln Pro Ala Val Thr Leu Ala Gln Leu Pro Leu Ile Gln Glu Gln

645 650 655

Gln Lys Leu Leu Leu Asp Met Gln Gln Gln Leu Ser Asn Ser Gln Thr

660 665 670

Leu Ser Gln Gln Gln Met Met Pro Gln Gln Ser Thr Lys Val Pro Ser

675 680 685

Gln Asn Thr Pro Leu Pro Leu Pro Val Gln Gln Glu Pro Gln Gln Lys

690 695 700

Leu Leu Gln Lys Gln Ala Met Leu Ala Asp Thr Ser Glu Ala Ala Val

705 710 715 720

Pro Pro Thr Thr Ser Val Asn Val Ile Ser Thr Thr Gly Ser Pro Leu

725 730 735

Met Thr Thr Gly Ala Thr His Ser Val Leu Thr Glu Glu Ile Pro Ser

740 745 750

Cys Ser Thr Ser Pro Ser Thr Ala Asn Gly Asn His Leu Leu Gln Pro

755 760 765

Ile Leu Gly Arg Asn Lys His Cys Ser Met Ile Asn Thr Glu Lys Val

770 775 780

Pro Gln Ser Ala Ala Pro Met Ser Val Pro Ser Ser Leu Glu Ala Val

785 790 795 800

Thr Ala Thr Pro Arg Met Met Lys Asp Ser Pro Lys Leu Asn His Asn

805 810 815

Val Lys Gln Ser Val Val Ala Ser Lys Leu Ala Asn Ala Gly Thr Gly

820 825 830

Ser Gln Asn Tyr Val Asn Asn Pro Pro Pro Thr Asp Tyr Leu Glu Thr

835 840 845

Ala Ser Ser Ala Thr Ser Val Trp Leu Ser Gln Asn Asp Gly Leu Leu

850 855 860

His Gln Asn Phe Pro Met Ser Asn Phe Asn Gln Pro Gln Met Phe Lys

865 870 875 880

Asp Ala Pro Pro Asp Ala Glu Ile His Ala Ala Asn Thr Ser Asn Asn

885 890 895

Ala Leu Phe Gly Ile Asn Gly Asp Gly Pro Leu Gly Phe Pro Ile Gly

900 905 910

Leu Gly Thr Asp Asp Phe Leu Ser Asn Gly Ile Asp Ala Ala Lys Tyr

915 920 925

Glu Asn His Ile Ser Thr Glu Ile Asp Asn Ser Tyr Arg Ile Pro Lys

930 935 940

Asp Ala Gln Gln Glu Ile Ser Ser Ser Met Val Ser Gln Ser Phe Gly

945 950 955 960

Ala Ser Asp Met Ala Phe Asn Ser Ile Asp Ser Thr Ile Asn Asp Gly

965 970 975

Gly Phe Leu Asn Arg Ser Ser Trp Pro Pro Ala Ala Pro Leu Lys Arg

980 985 990

Met Arg Thr Phe Thr Lys Val Tyr Lys Arg Gly Ala Val Gly Arg Ser

995 1000 1005

Ile Asp Met Ser Gln Phe Ser Gly Tyr Asp Glu Leu Lys His Ala Leu

1010 1015 1020

Ala Arg Met Phe Ser Ile Glu Gly Gln Leu Glu Glu Arg Gln Arg Ile

1025 1030 1035 1040

Gly Trp Lys Leu Val Tyr Lys Asp His Glu Asp Asp Ile Leu Leu Leu

1045 1050 1055

Gly Asp Asp Pro Trp Glu Glu Phe Val Gly Cys Val Lys Cys Ile Arg

1060 1065 1070

Ile Leu Ser Pro Gln Glu Val Gln Gln Met Ser Leu Glu Gly Cys Asp

1075 1080 1085

Leu Gly Asn Asn Ile Pro Pro Asn Gln Ala Cys Ser Ser Ser Asp Gly

1090 1095 1100

Gly Asn Ala Trp Arg Ala Arg Cys Asp Gln Asn Ser Glu Ala Ile Leu

1105 1110 1115 1120

Lys Ile Ser Met Met Lys Ser Lys Val Glu Asp Val Arg Tyr Trp Asn

1125 1130 1135

Thr Ala

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<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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ttgtaagcgg caagagg 17

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ccatttatgg aaaagtgag 19

<210> 5

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atcaattcca gttttcg 17

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<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ctcaaacaag cgagaccaag ac 22

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gcacgcctga ttcctaatag 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tgcacaagaa ctacaggcca 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tggcctgtag ttcttgtgca 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gtctatttgt aagcggcaag 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

cttgccgctt acaaatagac 20

Claims

1.敲除水稻DT1蛋白在提高水稻抗旱能力中的应用，其特征在于，所述水稻DT1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

2.如权利要求1的应用，其特征在于，所述水稻DT1蛋白的编码基因的核苷酸序列如SEQID No.1所示。

3.如权利要求1的应用，其特征在于，所述敲除水稻DT1蛋白方法是：构建针对DT1蛋白的sgRNA表达载体，进而转化根癌农杆菌，导入水稻细胞中。

4.如权利要求3的应用，其特征在于，所述sgRNA表达载体的靶序列为SEQ ID NO.1第471～490位和/或第572～591位所示的核苷酸序列。