CN1452857B - 一种节瓜雌性基因的分子标记方法 - Google Patents
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Abstract
本发明是一种节瓜雌性基因的分子标记方法，它涉及节瓜全雄株系、全雌株系的选育与保持方法，以及利用节瓜全雄株系、全雌株系进行雌性基因分子标记的方法。该方法利用改良CTAB法从节瓜全雌株系与全雄株系杂交分离后代中快速提取全雌DNA和全雄DNA，采用BSA法对节瓜性型基因进行标记，扩增反应的热循环条件：94℃，1min；36℃，2min；72℃，1min；5个循环后改为94℃，0.5min；36℃，1min；72℃，1.5min；35个循环后于72℃延伸10min。
Description
(一)技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体是指一种节瓜雌性基因的分子标记方法。
(二)背景技术
节瓜(Benincasa hispida Cogn.var.chieh-qua How.)，冬瓜属的一个变种，是华南地区有优势的特色蔬菜，国外仅见少数华人地区零星种植，在我国广东省栽培已逾300余年。节瓜在蔬菜生产和供应上起着重要作用，除供应本地市场外，还是出口创汇的主要蔬菜之一，在东南亚、香港及澳门享有盛誉。近年来，华南地区节瓜生产发展很快，年种植面积超过50万亩，倍受市场欢迎。节瓜生产以采收嫩瓜供食为主，其肉质柔滑，味微甜清香、甘爽，富含蛋白质、维生素等营养成分，是华南地区出口的主要蔬菜品种之一。国内、外节瓜育种研究起步较晚，广东省农业科学院从20世纪80年代中期开始开展节瓜雌性系相关研究，并成功运用于育种实践，达到了提高雌性系选育效率和杂交种纯度的目的。目前，筛选雌性系主要方法是田间自然筛选鉴定，一方面由于自然环境条件不稳定对花性分离有影响；另一方面，所花费的时间长。
(三)发明内容
本发明的目的就是为了解决上述现有技术中存在的不足之处，提供一种节瓜雌性基因的分子标记方法，该方法在筛选节瓜种质资源的性型方面是一种全新、快捷、高效的鉴定、鉴别方法，也为常规育种与分子标记辅助选择的有机结合奠定基础。
本发明所述一种节瓜雌性基因的分子标记方法，其特征是，它包括如下步骤：
第一步 全雌株系的获得和保持：从节瓜强雌株中经多年自交，定向选择，选育出节瓜全雌株，全雌株在3～5片真叶期喷施AgNO3，诱导产生雄花，然后进行自交，从而获得节瓜全雌株系种子，进而使得节瓜全雌株系得到保持和延续；
第二步 全雄株系的获得和保持：从节瓜强雄株中经多年自交，定向选择，选育出节瓜全雄株，全雄株上的雄花与其同亲缘的强雄株上的雌花进行杂交，从而获得节瓜杂交种子，从F1中自交后可分离出全雄株，进而使得节瓜全雄株系得到保持和延续；
第三步 全雌株、全雄株的获得：利用纯合的节瓜全雌株系与全雄株系进行杂交，获得F1种子，种植F1种子，可获得分离世代的F2植株，从中可筛选出全雌株、全雄株；
第四步 全雌株DNA、全雄株DNA的获得：分别取7～10株全雌株、全雄株，混合取样，按CTAB法提取全雌株、全雄株DNA(要求在提取过程中动作要快，加样、加液准确，样品褐化程度减小到最小)；
第五步 分子标记反应体系：RAPD反应总体积25μl，含2.5mmol/L的MgCl2，模板DNA20～30ng，扩增反应的热循环条件：94℃，1min；36℃，2min；72℃，1min；5个循环后改为94℃，0.5min；36℃，1min；72℃，1.5min；35个循环后于72℃延伸10min；取8～10μl反应产物，与2μl溴酚蓝混匀，点入含0.5mg/L EB的1.0％琼脂糖凝胶中，在5V/cm电场强度下电泳2～3小时，取出凝胶，采用紫外凝胶分析系统进行分析。
为了更好地实现本发明，所述节瓜全雌株、全雄株DNA的纯度必须满足RAPD反应的要求；所述缓冲液含25mmol/L的MgCl2。
本发明与现有技术相比，具有如下优点和有益效果：
1.目前，国内、外尚无节瓜全雄株系、全雌株系的获得和保持方法的报道，本发明在这一方面属于开创性成果。
2.国内、外至今尚无成熟的标记节瓜性型基因的RAPD技术，本发明提出标记节瓜性型基因的RAPD扩增反应的热循环条件，成熟可靠。
3.通过本发明方法可获得节瓜雌性基因特异性分子标记性状OPQ-451150。
(四)具体实施方式
下面结合实施例，对本发明做进一步地详细说明。
第一步 从江竹节瓜选用强雌株经多代自交，定向选择，选育出全雌株A36，全雌株在3～5片真叶期喷施2％的AgNO3，诱导产生雄花，然后进行自交，从而获得节瓜全雌株系种子，进而使得节瓜全雌株系得到保持和延续。
第二步 从广东省农家种黑毛节选取强雄株，经多代自交，定向选择，选育出全雄株H，全雄株H与黑毛节中的强雄株进行杂交，从F1中自交后可分离出全雄株，进而使得节瓜全雄株系得到保持和延续。
第三步 纯雌材料A36与全雄株系黑毛节H进行杂交，经自交，从分离世代中挑选出全雄株、全雌株，分别取7～10株，混合取样，按CTAB法提取DNA。采用改良的CTAB法可以保证每离心管中的样品比较均匀，且减少了鲜样褐变时间，还可节省时间，提高工作效率，从而建立了雌性株DNA基因池和雄性株DNA基因池。经紫外分光光度计检测雌性DNA的A260/230＝2.130，A260/280＝1.8235；雄性DNA的A260/230＝2.015，A260/280＝1.7455。
第四步 琼脂糖凝胶电泳检测全雌株DNA的浓度为100ng/u l，全雄株DNA的浓度约为80ng/μl。带条清晰，达到RAPD实验所需要求。
第五步 RAPD反应总体积25μl，含2.5μl缓冲液(含25mmol/L，MgCl2)，10mmol/L的dNTP0.25μl，Taq DNA聚合酶0.5U，10碱基随机引物1μl，模板DNA20～30ng，加ddH2O至25μl。覆盖20～30μl石蜡油。扩增反应的热循环条件：94℃，1min；36℃，2min；72℃，1min；5个循环后改为94℃，0.5min；36℃，1min；72℃，1.5min；35个循环后于72℃延伸10min。PCR仪为美国PE公司生产的PE-480扩增仪。取10μl反应产物，与2μl溴酚蓝混匀，点入含0.5mg/L EB的1.0％琼脂糖凝胶中，在5V/cm电场强度下电泳2～3小时，取出凝胶，采用紫外凝胶分析系统进行分析。
以雌性DNA池和雄性DNA池为模板，平行地进行RAPD反应，结果每反应均可产生0～3条扩增带。从198个随机引物中筛选出1个引物：OPQ-45(TGAGCGGACA)能在全雌基因池中扩增出一条特异带，重复多次，结果一致。此扩增条带的大小为1150bp，命名为OPQ-451150。
Claims (1)
1.一种节瓜雌性基因的分子标记方法，其特征是，它包括如下步骤：
第一步全雌株系的获得和保持：从节瓜强雌株中经多年自交，定向选择，选育出节瓜全雌株，全雌株在3～5片真叶期喷施AgNO3，诱导产生雄花，然后进行自交，从而获得节瓜全雌株系种子，进而使得节瓜全雌株系得到保持和延续；
第二步全雄株系的获得和保持：从节瓜强雄株中经多年自交，定向选择，选育出节瓜全雄株，全雄株上的雄花与其同亲缘的强雄株上的雌花进行杂交，从而获得节瓜杂交种子，从F1中自交后可分离出全雄株，进而使得节瓜全雄株系得到保持和延续；
第三步全雌株、全雄株的获得：利用纯合的节瓜全雌株系与全雄株系进行杂交，获得F1种子，种植F1种子，可获得分离世代的F2植株，从中可筛选出全雌株、全雄株；
第四步全雌株DNA、全雄株DNA的获得：分别取7～10株全雌株、全雄株，混合取样，按CTAB法提取全雌株、全雄株DNA；
第五步分子标记反应体系：RAPD反应总体积25μl，含25mmol/L的MgCl2，10mmol/L的dNTP0.25μl，Taq DNA聚合酶0.5U，10碱基随机引物1μl，模板DNA20～30ng，扩增反应的热循环条件：94℃，1min；36℃，2min；72℃，1min；5个循环后改为94℃，0.5min；36℃，1min；72℃，1.5min；35个循环后于72℃延伸10min；取8～10μl反应产物，与2μl溴酚蓝混匀，点入含0.5mg/L EB的1.0％琼脂糖凝胶中，在5V/cm电场强度下电泳2～3小时，取出凝胶，采用紫外凝胶分析系统进行分析，从198个随机引物中筛选出1个引物：OPQ-45，其序列为TGAGCGGACA，能在全雌基因池中扩增出一条特异带，此扩增条带的大小为1150bp，命名为OPQ-451150。
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