CN116855504A - 一种小麦红颖红秆基因RgM4G52及其KASP分子标记和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种小麦红颖红秆基因RgM4G52及其KASP分子标记和应用，涉及植物基因工程和生物技术领域，该基因RgM4G52位于小麦6A染色体长臂亚端部，在小麦RefSeqv1.0基因组版本的物理位置为556.97Mb‑557.09Mb，该基因的表达能导致小麦颖壳和茎秆颜色均为红色；该KASP分子标记为CLY‑7，其与该基因紧密连锁，该分子标记的SNP位点多态性为A/G，该分子标记能准确跟踪野生一粒小麦G52突变体红颖红秆基因RgM4G52。本发明还提供了鉴定小麦株系是否含有RgM4G52基因的引物组，对利用分子标记辅助选择选育红颖红秆小麦新品系具有重要应用价值。

Description

一种小麦红颖红秆基因RgM4G52及其KASP分子标记和应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程和生物技术领域，具体涉及一种小麦红颖红秆基因RgM4G52及其KASP分子标记和应用。

背景技术

花青素是一种水溶性色素，广泛存在于植物的花、果实、叶片等组织中。小麦、玉米等农作物的胚芽鞘、叶鞘、叶片、茎秆和籽粒糊粉层也都有花青素积累。对植物而言，花青素在不同的植物组织中的积累对植物生长具有重要的生理功能。植物的不同器官组织的色素沉着对植物适应某些生物及非生物胁迫十分重要。单核苷酸多态性(Single NucleotidePolymorphism，SNP)指的是基因组内DNA某一特定核苷酸位置上存在转换、颠换、插入、缺失等变化而引起的DNA序列多态性。其技术是利用己知序列信息来比对寻找SNP位点，再利用发掘的变异位点设计特异性的引物来对基因组DNA或cDNA进行PCR扩增，得到基于SNP位点的特定的多态性产物，最后利用电泳技术分析产物的多态性。SNP标记的优点是数量多，分布广泛；在单个基因和整个基因组中分布不均匀；SNP等位基因频率容易估计。

KASP(KompetitiveAllele Specific PCR，KASP)是一种竞争性等位基因特异性PCR技术，具有低成本、高通量特点的新型基因分型技术，通过引物末端碱基的特异匹配来对SNP以及In Del位点进行精准的双等位基因分型，在小麦、水稻、大豆等作物的分子标记辅助选择中得到广泛应用。

在小麦中，已报道的控制颖壳和茎秆颜色的基因有Rg和Pc。其中，Rg基因控制二倍体、四倍体、六倍体小麦的颖壳颜色，定位于1A、1B、1D和2A，其中，等位基因Rg-A1b和Rg-A1c分别控制二倍体、四倍体和六倍体小麦的颖壳呈现红色和黑色(深褐色)，而Rg-D1b和Rg-D1c分别控制六倍体小麦的颖壳呈现红色(棕色)和烟灰色，而Pc基因控制茎秆的紫色性状。野生一粒小麦(Triticum boeoticum，2n＝2x＝14，A^bA^b)是普通小麦应对各种生物和非生物胁迫的重要基因源。野生一粒小麦G52的颖壳和茎秆的颜色均为绿色，前期利用甲基磺酸乙酯(Ethyl Methyl Sulfonate，EMS)诱变获得了1个颖壳和茎秆均为红色且连锁遗传的突变体Z2921。虽然前人已对小麦中控制颖壳红色的基因进行了定位，但是对控制小麦茎秆红色的基因定位的研究未见报道，也未见小麦红色颖壳和红色茎秆连锁遗传的研究。因此，有必要对更多的控制颖壳和茎秆颜色的基因进行定位，解析更多的控制颖壳和茎秆颜色的基因的作用机制及其功能通路，对利用分子标记辅助选择选育红颖红秆小麦新品系具有重要作用。

发明内容

本发明的目的是提供一种小麦红颖红秆基因RgM4G52及其KASP分子标记和应用，为解决控制小麦茎秆红色的基因定位不明确，小麦红色颖壳和红色茎秆连锁遗传不明确等问题，对红颖红秆小麦新品系选育有重要的应用价值。

为了达到上述目的，本发明提供了一种小麦红颖红秆基因RgM4G52，该基因RgM4G52位于小麦6A染色体长臂的亚端部，在小麦RefSeqv1.0基因组版本的物理位置为556.97Mb-557.09Mb，该基因的表达导致小麦颖壳和茎秆颜色均为红色。

本发明还提供了一种与小麦红颖红秆基因RgM4G52紧密连锁的KASP分子标记，该分子标记为CLY-7，其SNP位点的多态性为A/G。

本发明还提供了一种鉴定该KASP分子标记的KASP引物，该KASP引物共包含3条引物，其核苷酸序列分别如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示。

本发明还提供了一种小麦颖壳和茎秆性状的鉴定方法，包括以下步骤：

步骤1：提取待测小麦植株的基因组DNA；

步骤2：以步骤1中提取的基因组DNA为模板，利用核苷酸序列分别如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示的KASP引物进行PCR扩增；

步骤3：检测PCR扩增产物的荧光，当检测到产物带有HEX标签的黄色荧光，表明待测植株具有红颖红秆基因RgM4G52时，该小麦为红颖红秆；当未检测到时，表明待测植株为不具有红颖红秆基因RgM4G52时，该小麦为绿颖绿杆。

进一步地，上述的鉴定方法中，其PCR扩增条件如下：

PCR扩增体系为：2×KASP Master Mix 5μL，KASP引物的引物混合物1.4μL，模板DNA 100ng，双蒸水加至总量为10μL，其中，该引物混合物是以核苷酸序列如SEQ ID No.1、2和3所示的引物，其浓度均为10ng/μL，分别按体积比加入12％、12％和30％，并添加46％的ddH₂O进行混合所得；

PCR扩增程序为：94℃15min；94℃20s，61℃60s，共10个循环，每个循环减少0.6℃；94℃20s、55℃60s，共32个循环。

本发明还提供了一种小麦红颖红秆基因RgM4G52的基因分型试剂盒，该试剂盒包含核苷酸序列分别如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示的KASP引物。

本发明提供的基因分型试剂盒可用于小麦育种中，尤其可用于包含红颖红秆小麦新品系的选育。

本发明提供的小麦红颖红秆基因RgM4G52及其KASP分子标记和应用，具有以下优点：

本发明通过利用甲基磺酸乙酯(EMS)对野生一粒小麦G52(Triticum boeoticum，2n＝2x＝14，A^bA^b)进行诱变，在诱变二代(M2)筛选到红颖红秆的突变体Z2921，连续两年表型观察，于诱变四代(M4)红颖红秆性状已表现稳定。利用突变体Z2921和野生型G52进行杂交得到杂种F₁，F₁代单株自交获得F₂，F₂自交获得F_2:3家系，F₂群体大小为64个株系，以此来构成遗传作图群体。对F₂、F_2:3家系群体颖壳和茎秆性状表型进行鉴定，通过提取F₂中极端表型的‘突变型植株红颖红秆’10株与‘野生型植株绿颖绿秆’10株单株DNA构建混池，使用基于混池的外显子捕获测序(BSE-seq)定位到了野生一粒小麦G52突变体Z2921的红颖红秆基因RgM4G52。

本发明公开了位于小麦6A染色体上的与野生一粒小麦G52突变体红颖红秆基因RgM4G52连锁的分子标记CLY-7，该分子标记是小麦6A染色体长臂上红颖红秆基因RgM4G52的侧翼标记，连锁紧密，且为共显性标记，检测准确高效、扩增方便稳定。该分子标记对应的KASP引物可用来检测来自于野生一粒小麦突变体6A染色体长臂上的红颖红秆基因，快速筛选具有该性状的植株，进而方便进行红颖红秆小麦的分子标记辅助育种，增加红颖红秆基因来源，达到选育红颖红秆小麦新品系或新品种的目的。

附图说明

图1为本发明中通过结合外显子捕获测序结果和混池表型，利用R-studio构建的SNP位点密度图。

图2为本发明中野生一粒小麦突变体Z2921的红颖红秆基因RgM4G52在6A染色体上的定位示意图。

图3为本发明中以分子标记CLY-7所对应的KASP引物对野生一粒小麦突变体Z2921×野生一粒小麦G52的F₂群体植株的KASP分型验证结果。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

说明：本发明实施例中所用的野生一粒小麦G52及其突变体Z2921均来自四川农业大学张连全教授种质资源库。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实验例1红颖红秆基因RgM4G52及其分子标记的获取和应用

突变体Z2921是通过利用甲基磺酸乙酯(EMS)对野生一粒小麦G52(Triticumboeoticum,2n＝2x＝14,A^bA^b)进行诱变所得，该突变体Z2921在M2代筛选到其性状为红颖红秆，再进行连续两年的表型观察，该红颖红秆性状于M4代时已表现为稳定遗传。将突变体Z2921和野生一粒小麦G52进行杂交得到杂种F₁，F₁代单株自交获得F₂，F₂群体大小为64个植株，以此来构成遗传作图群体。对F₂群体颖壳和茎秆性状表型进行鉴定，通过提取F₂中极端表型的‘突变型植株红颖红秆’10株与‘野生型植株绿颖绿秆’10株单株DNA构建混池，通过外显子捕获测序(BSE-seq)对构建的混池进行测序和定位。外显子捕获测序(BSE-Seq)是一种利用序列捕获技术将全基因组外显子区域DNA捕捉并富集后进行高通量测序的基因组分析方法，是一种性价比较高的定位方法，用于识别表现出明显不同表型的数量性状。

根据外显子捕获测序结果，结合混池表型，利用R-studio构建SNP位点密度图，结果如图1所示，共获得607个高质量的SNP位点(|AFD|>0.8)。筛选亲本及混池间差异的纯合SNP位点，利用R计算SNP位点富集区域，发现SNP位点主要富集在6A染色体长臂上的107Mb、135Mb和556Mb附近处。对该区域标记进行物理定位，并对获得的多态性位点进行分子标记开发，开发了5个KASP分子标记，并设计了对应的五组KASP引物，在每个分子标记所对应的上游引物5’端分别添加不同的荧光修饰基团(包括FAM标签序列和HEX标签序列)，其分子标记名称和具体引物序列见下表1所示。

表1KASP分子标记及KASP引物序列

通过上述表1中的五组KASP引物对F₂群体进行KASP分型，结合KASP标记分析结果和F₂群体中不同单株的颖壳和茎秆颜色的表型数据，利用QTL IciMapping构建连锁图谱，成功定位到一个突变体Z2921的红颖红秆基因，位于6A染色体上，命名为RgM4G52，该红颖红秆基因RgM4G52在6A染色体上的定位示意图如图2所示，可知，该基因位于小麦6A染色体亚端部，在小麦RefSeqv1.0基因组版本的物理位置为556.97Mb-557.09Mb处。同时发现，无个分子标记(CLY-7、CLY-26、CLY-27、CLY-28、CLY-33)中，只有分子标记CLY-7所对应的的KASP引物和小麦红颖红秆相连锁，当检测到该小麦植株带有分子标记CLY-7时，该小麦的表型为红颖红秆。其中，分子标记CLY-7对F₂群体的具体分型鉴定见实验例2，以分子标记CLY-7所对应的KASP引物对F₂群体植株及亲本的KASP分型验证结果如图3所示。同时可知，分子标记CLY-7的SNP位点多态性为A/G；结合植株茎秆与颖壳的表型可知，分子标记CLY-7与红颖红秆基因RgM4G52紧密连锁，含有该基因的小麦植株茎秆与颖壳同时呈现红色，表现为连锁遗传。

该红颖红秆基因与前人已定位相关基因及位点的比较：已公开报道的控制红色颖壳和红色茎秆的基因较少，仅Rg-A1b控制二倍体小麦的颖壳呈现红色，Rg-D1b控制六倍体小麦的颖壳呈现红色，未发现红颖红秆两个性状由一对隐性等位基因控制的报道，也未有报道在6A染色体长臂上发现红颖红秆基因。而本发明中的红颖红秆性状经杂交后，在F1代未出现该性状，在F2代发生了性状分离，才出现了该红颖红秆性状，且性状比例接近1:3，符合孟德尔隐形遗传定律，可知该性状由一对隐性基因控制。根据性状分析和染色体上的位置分析判断，突变体Z2921的红颖红秆基因RgM4G52与已报道的小麦染色体上的其他颖壳和茎秆颜色基因表现和染色体位置均不同，表明RgM4G52是一个新基因。

实验例2分型鉴定

由于自然条件的影响，在F2群体的64株小麦植株中只成功收集到了46株小麦植物可观察记录表型，并收获了对应植株的麦种。对收集到的46个F₂单株进行编号并进行CLY-7标记检测，编号分别为Z2956-1、Z2956-2......Z2956-46。具体方法为：单独提取46个单株的DNA，将其作为模板，以分子标记CLY-7的特异性引物对为引物通过PCR扩增进行KASP分型，并进行荧光读值，其中，分子标记CLY-7的特异性引物的核苷酸序列如SEQ IDNo.1(FAM标签F端引物)、SEQ ID No.2(HEX标签F端引物)和SEQ IDNo.3(通用下游引物R)所示。

上述的PCR扩增体系为：2×KASP MasterMix 5μL，上述的三条引物的引物混合物1.4μL，模板DNA 100ng，双蒸水加至总量为10μL，至少3个独立的以双蒸水代替DNA模板的作为空白对照；其中，引物混合物是以核苷酸序列如SEQ ID No.1、2和3所示的引物，其浓度均为10ng/μL，分别按体积比加入12％、12％和30％，并添加46％的ddH₂O进行混合所得。

上述的PCR扩增程序为：94℃预变性15min；94℃变性20s、61℃复性/延伸60s，共10个循环(每个循环减少0.6℃)；94℃变性20s、55℃复性/延伸60s，共32个循环；完成后进行荧光读值。

以分子标记CLY-7所对应的KASP引物对F₂群体植株及亲本的KASP分型验证结果如图3所示，其中，黑色菱形荧光为空白对照；将检测到与‘G52’一致的FAM(蓝色)荧光的植株基因型记为B，为正常颜色植株；同‘Z2921’一样表现为HEX(黄色)荧光的植株基因型记为A，为红颖红秆植株；绿色三角形荧光为杂合株系，记为H，为正常颜色植株。各个单株基因型与野生型表型和突变体表型如下表2所示。实际结果与预期结果基本一致，说明本发明的红颖红秆基因RgM4G52确实有能控制红颖红秆性状表达的作用，分子标记CLY-7及其特异性KASP分型引物可以用与跟踪鉴定红颖红秆基因RgM4G52，该基因RgM4G52的表达能导致小麦性状为红颖红秆，将促进新型红颖红秆小麦新品系的培育，景观小麦新品种选育中有应用价值。

表2‘Z2921’בG52’F₂群体不同单株CLY-7基因型与表型对应结果

可知，本发明提供的核苷酸序列分别如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示的KASP引物可用于小麦育种，包括红颖红秆基因RgM4G52的鉴定和小麦的基因分型，还可用于红颖红秆小麦新品系的选育。利用该三条引物可以开发一种基因分型试剂盒，同时也可用于小麦育种，包括红颖红秆基因RgM4G52的鉴定和小麦的基因分型，还可用于红颖红秆小麦新品系的选育。

彩色小麦非常具有观赏价值，适合用作田园景观打造等，其也是根据市场需求开发出多元化产品。同时，对彩色小麦的相关研究，也是我国种质资源保护的重要内容。彩色的秸秆还可以用在编织工艺品等方面，也能产生一定的观赏和经济价值。

综上可知，本发明提供的小麦红颖红秆基因RgM4G52位于小麦6A染色体上，该基因的表达能导致小麦颖壳和茎秆颜色均为红色；本发明提供的分子标记CLY-7与该基因紧密连锁，该分子标记的SNP位点多态性为A/G，该分子标记能准确跟踪野生一粒小麦G52突变体红颖红秆基因RgM4G52；本发明还提供了鉴定小麦株系是否含有RgM4G52基因的引物组，对利用分子标记辅助选择选育红颖红秆小麦新品系具有重要应用价值，对筛选和制备彩色小麦中具有参考意义，能够产生一定的经济效益。

尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。

/>

Claims (8)

1.一种小麦红颖红秆基因RgM4G52，其特征在于，该基因RgM4G52位于小麦6A染色体长臂的亚端部，在小麦RefSeqv1.0基因组版本的物理位置为556.97Mb-557.09Mb，该基因的表达导致小麦颖壳和茎秆颜色均为红色。

2.一种与权利要求1所述小麦红颖红秆基因RgM4G52紧密连锁的KASP分子标记，其特征在于，该分子标记为CLY-7，其SNP位点多态性为A/G。

3.鉴定如权利要求2所述KASP分子标记的KASP引物，其特征在于，所述KASP引物共包含3条引物，其核苷酸序列分别如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示。

4.一种小麦颖壳和茎秆性状的鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1：提取待测小麦植株的基因组DNA；

步骤2：以步骤1中提取的基因组DNA为模板，利用核苷酸序列分别如SEQ ID No.1、SEQID No.2和SEQ ID No.3所示的KASP引物进行PCR扩增；

步骤3：检测PCR扩增产物的荧光，当检测到产物带有HEX标签的黄色荧光，表明待测植株具有红颖红秆基因RgM4G52，该小麦为红颖红秆；当未检测到时，表明待测植株为不具有红颖红秆基因RgM4G52，该小麦为绿颖绿杆。

5.根据权利要求4所述的鉴定方法，其特征在于，所述的PCR扩增条件如下：PCR扩增体系为：2×KASP Master Mix 5μL，所述KASP引物的引物混合物1.4μL，模板DNA 100ng，双蒸水加至总量为10μL，其中，所述的引物混合物是以核苷酸序列如SEQ ID No.1、2和3所示的引物，其浓度均为10ng/μL，分别按体积比加入12％、12％和30％，并添加46％的ddH₂O进行混合所得；

PCR扩增程序为：94℃15min；94℃20s，61℃60s，共10个循环，每个循环减少0.6℃；94℃20s、55℃60s，共32个循环。

6.一种如权利要求1所述小麦红颖红秆基因RgM4G52的基因分型试剂盒，其特征在于，该试剂盒包含核苷酸序列分别如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示的KASP引物。

7.如权利要求6所述的试剂盒在小麦育种中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，该应用包含红颖红秆小麦新品系的选育。