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GEBIET DER
ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren, um genetisch
transformierte Pflanzenzellen, in die eine erwünschte Nukleotidsequenz eingeführt wurde,
zu selektieren, indem man die transformierten Zellen mit einem selektiven
Vorteil versieht, ohne die nicht transformierten Zellen zu schädigen, sowie
auf in dem Verfahren verwendbare neuartige Verbindungen.
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HINTERGRUND
DER ERFINDUNG
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Es
ist wohlbekannt, dass, wenn neues genetisches Material durch Transformation
in eine Zellpopulation eingeführt
werden soll, nur eine bestimmte Anzahl der Zellen erfolgreich transformiert
werden, d.h. das neue genetische Material erhalten. Es ist dann
notwendig, die genetisch transformierten Zellen zu identifizieren,
damit diese Zellen von den nicht transformierten Zellen in der Population
abgetrennt werden können.
Identifizierung und Abtrennung der transformierten Zellen wurden
herkömmlicherweise
erreicht, indem etwas verwendet wurde, was als "negative Selektion" bezeichnet werden kann, mit anderen
Worten, durch Verwendung eines Verfahrens, bei dem die transformierten
Zellen überleben
und wachsen können,
während
die nicht transformierten Zellen einer Wachstumshemmung unterliegen
oder vielleicht sogar durch eine Substanz abgetötet werden, die die transformierten
Zellen aushalten können.
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Wenn
zum Beispiel eine Population von Pflanzenzellen einer genetischen
Transformation unterzogen wird, findet die Selektion der transformierten
Zellen typischerweise statt, indem man ein Selektionsgen verwendet,
das Antibiotika- oder Herbizidresistenz codiert. Das Selektionsgen – das selbst
im allgemeinen keine nützliche
Funktion in der genetisch transformierten Pflanze hat, und eigentlich
in der Pflanze unerwünscht
sein kann – wird
mit dem Gen, das in die in Frage kommende Pflanze eingeführt werden
soll, gekoppelt oder miteingeführt,
so dass beide der zwei Gene in die Zellpopulation eingeführt werden,
oder eher in bestimmte Zellen in der Population, da es in der Praxis
nicht möglich
ist, alle oder sogar eine Mehrzahl der Zellen zu transformieren.
Die Zellen werden dann auf oder in einem Medium, das das Antibiotikum
oder Herbizid enthält,
gegen das die genetisch transformierten Zellen mittels des Selektionsgens
resistent sind, kultiviert, wodurch die transformierten Zellen identifiziert
werden können,
da die nicht transformierten Zellen – die das in Frage kommende Antibiotika-
oder Herbizidresistenzgen nicht enthalten – einer Wachstumshemmung unterliegen
oder abgetötet werden.
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Diese
negativen Selektionsverfahren haben jedoch bestimmte Nachteile.
Erstens können
die nicht transformierten Zellen wegen der Anwesenheit von beispielsweise
Antibiotika im Wachstumsmedium absterben. Wenn die Zellpopulation
ein zusammenhängendes
Gewebe ist, besteht infolgedessen ein klares Risiko, dass nicht
nur die nicht transformierten Zellen, sondern auch die transformierten
Zellen absterben können,
wegen der Tatsache, dass das Absterben der nicht transformierten
Zellen die Nährstoffversorgung
der transformierten Zellen unterbrechen kann, oder weil die geschädigten oder
absterbenden nicht transformierten Zellen giftige Verbindungen absondern
können.
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Ein
anderer bedeutender Nachteil der negativen Selektion ist der, dass
die Anwesenheit eines unnötigen
Gens für
beispielsweise Antibiotikaresistenz unerwünscht sein kann. Es gibt zum
Beispiel unter Umweltschutzgruppen und Regierungsstellen Bedenken,
ob es sicher ist, Gene, die eine Antibiotikaresistenz codieren,
in Pflanzen und Mikroorganismen einzuführen. Diese Bedenken sind von
besonderer Bedeutung für
Nahrungspflanzen und Mikroorganismen, die nicht dafür bestimmt
sind, in einer abgeschlossenen Umgebung verwendet zu werden (z.B.
Mikroorganismen für
die Verwendung in der Landwirtschaft), sowie für Mikroorganismen, die zur
Verwendung in einer abgeschlossenen Umgebung vorgesehen sind, die
aber versehentlich aus der abgeschlossenen Umgebung freigesetzt
werden können.
Während
sich diese Bedenken als unbegründet erweisen
können,
können
solche Bedenken dennoch zu Einschränkungen von Seiten der Regierung
für die Verwendung
von Genen für
Antibiotikaresistenz in beispielsweise Pflanzen führen, und
es ist desahlb wünschenswert,
neue Methoden zur Selektion genetisch transformierter Zellen, die
nicht von solchen Genen abhängig
sind, zu entwickeln.
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Ein
weiterer Nachteil der negativen Selektion ist, dass Pflanzengewebe
oder -zellen, die mit giftigen Substanzen behandelt werden, für bakterielle
Infektionen anfälliger
werden. Das ist ein Problem, wenn Agrobacterium als Transformationsvektor verwendet
wird, weil die behandelten Gewebe oder Zellen manchmal von dem Bakterium überwuchert
werden, obwohl Antibiotika verwendet werden, um Bakterienwachstum
zu verhindern.
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Außerdem erfordert
die Selektion von Zellen oder Geweben unter Verwendung negativer
Selektion sehr genaue Wahl des richtigen Zeitpunkts der Expression
der eingeführten
Gene in Bezug auf den Selektionsprozess. Wenn die transgenen Zellen
mit einer giftigen Substanz behandelt werden, bevor das entgiftende Gen
exprimiert wird, oder bevor genug Genprodukte hergestellt sind,
um die Wirkung der giftigen Verbindung zu antagonisieren, werden
die transgenen Zellen zusammen mit den nicht transgenen Zellen abgetötet. Wenn die
Selektion zu spät
erfolgt, kann die Selektion der transgenen Zellen oder Gewebe behindert
sein, besipielsweise durch Keimbildung aus nicht transgenen Zellen
oder Geweben.
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Die
obigen Nachteile werden durch das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung
(genannt "positive
Selektion") beseitigt,
das es zum ersten Mal ermöglicht,
genetisch transformierte Pflanzenzellen zu identifizieren und zu
isolieren, ohne die nicht transformierten Zellen in der Population
zu schädigen
oder abzutöten, und
ohne Coeinführung
von Antibiotika- oder Herbizidresistenzgenen. Zusätzlich zu
der Tatsache, dass die Notwendigkeit von Antibiotika- oder Herbizidresistenzgenen
beseitigt wird, wurde gezeigt, dass das Verfahren der positiven
Selektion gemäß der vorliegenden
Erfindung oft weitaus effizienter als die herkömmliche negative Selektion
ist. Wie unten in den Beispielen beschrieben, ist die Anzahl transgener
Keime, die von Tabakblattscheiben unter Verwendung der positiven
Selektion selektiert wurden, beispielsweise in der Größenordnung von
30mal höher
als die Anzahl an Keimen, die unter Verwendung eines herkömmlichen
Kanamycinbasierten negativen Selektionssystems selektiert wurden,
und eine Kombination aus positiver und negativer Selektion gab eine
Auslesehäufigkeit
an transgenen Keimen von etwa 10mal derjenigen, die unter Verwendung
von nur negativer Selektion erhalten wurde (siehe Beispiel 11).
Außerdem
liefert die Anwendung der positiven Selektion den Vorteil, dass
ein einziges Gen sowohl als Reportergen als auch als Selektionsgen
verwendet werden kann, was in einer Vereinfachung der Vektorkonstruktionen,
stabileren Konstruktionen und 100%igen Korrelation zwischen der
Expression von Reporter- und Selektionsgenen resultiert. Positive
Selektion beseitigt auch die oben genannten Probleme bezüglich Wahl
des Zeitpunkts, da die Verbindungen, die zur Selektion führen, immer
als Folge von Genexpression erzeugt werden. So reichert sich die
selektive Verbindung an, wenn das Selektionsgen exprimiert wird,
und der Selektionseffekt wird offensichtlich, wenn eine genügend große Menge der
selektiven Verbindung erzeugt worden ist.
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Methoden,
die Genaktivität
innerhalb transformierter Zellen zu überwachen, waren im Stand der
Technik bereits vorher bekannt.
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Jefferson
RA (1989) Nature Vol 342, 837-838 offenbaren die Verwendung von
GUS und des Glucuronidpermeasesystems als Überwachungssystem für transformierte
Pflanzenzellen. Jefferson bezieht sich insbesondere auf die Hydrolyse
des X-Gluc-Substrats
und die Detektion des blauen Indigofarbstoff-Produkts in transformierten
Pflanzenzellen, die die 35S Promoter-gus A Gen-Konstruktion enthalten.
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US-P
4,857,467 offenbart die Tranformation von Hefestämmen der Gattung Pichia mit
DNA-Fragmenten, die Genfunktionen codieren, die die Wirtspflanze
nicht hat oder nur unzulänglich
hat. Die transformierten Hefezellen können auf einer Kohlenstoff-
und Energiequelle wachsen, was die Expression der vom DNA-Fragment bereitgestellten
Genfunktion erforderlich macht.
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WO
89/03880 offenbart die Transfektion von Wirtszellen mit einem Gen,
das Glucuronid-Permease codiert. Das System kann zusammen mit GUS-Gen-Fusionen
verwendet werden.
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Keine
der zitierten Fachschriften offenbart ein Verfahren zur Selektion
transformierter Pflanzenzellen, das auf der Anwesenheit einer bestimmten
eingeführten
Nukleotidsequenz basiert, wie es im Rahmen der vorliegenden Erfindung
mitgeteilt wird.
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KURZE BESCHREIBUNG
DER ERFINDUNG
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Ein
Aspekt der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren
zur Selektion genetisch transformierter Pflanzenzellen aus einer
Zellpopulation, worin die genetisch transformierten Pflanzenzellen
mit einer erwünschten
exprimierbaren Nukleotidsequenz, die eine regulatorische Sequenz
enthält,
die ihre Expression in den transformierten Zellen ermöglicht,
und einer miteingeführten
exprimierbaren Nukleotidsequenz, die ebenfalls eine regulatorische
Sequenz enthält,
die ihre Expression in den transformierten Pflanzenzellen ermöglicht,
transformiert sind, welches Verfahren umfasst, besagte Population
mit einer Verbindung zu versehen, die durch das Expressionsprodukt
der miteingeführten
exprimierbaren Nukleotidsequenz, die mit der erwünschten exprimierbaren Nukleotidsequenz
in besagte transformierte Zellen eingeführt wurde, metabolisiert werden
kann, um so die transformierten Zellen verglichen mit den nicht
transformierten Zellen mit einem physiologischen Vorteil zu versehen,
wobei die Verbindung kein Antibiotikum oder Herbizid ist und keine
direkte nachteilige Wirkung auf die nicht transformierten Zellen
hat.
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In
einer Ausführung
wird das Verfahren durchgeführt,
indem man die Zellpopulation auf oder in einem Medium kultiviert,
das wenigstens eine/n inaktive Verbindung oder Nährstoff enthält, die/der
in Zellen, die die miteingeführte
Nukleotidsequenz und die gewünschte
Nukleotidsequenz enthalten, direkt oder indirekt aktiviert wird,
wobei die Verbindung oder der Nährstoff
in nicht transformierten Zellen inaktiv ist, oder in nicht transformierten
Zellen weniger aktiv als in transformierten Zellen ist, so dass
die transformierten Zellen mit einem selektiven Vorteil versehen
sind, der es erlaubt, sie von der Zellpopulation zu selektieren.
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In
einer anderen Ausführungsform
wird das Verfahren durchgeführt,
indem man die Zellpopulation auf oder in einem Medium kultiviert,
das wenigstens eine/n Verbindung oder Nährstoff enthält, die/der
für die
transformierten Zellen durch Expression oder Transkription der miteingeführten Nukleotidsequenz
verfügbar
gemacht wird, wobei die Verbindung oder der Nährstoff für nicht transformierte Zellen
nicht verfügbar
ist oder für nicht
transformierte Zellen weniger verfügbar ist als für transformierte
Zellen, so dass die transformierten Zellen mit einem selektiven
Vorteil ausgestattet sind, der es erlaubt, sie von der Zellpopulation
zu selektieren.
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In
einer weiteren Ausführungsform
führt die
Expression der miteingeführten
Nukleotidsequenz zu einer Zunahme der Aktivität eines Enzyms, das in der
Zellpopulation endogen vorhanden war, so dass die Aktivität des Enzyms
in transformierten Zellen größer ist
als die Aktivität
des Enzyms in nicht transformierten Zellen.
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Verbindungen,
die für
die Verwendung in dem obigen Verfahren geeignet sind, sind die der
allgemeinen Formel I
worin
R
2 H,
CH
3, S-CH
3, SO
2-CH
3, SCH
2-phenyl, SH, OH, Cl oder eine Gruppe -S-R
10, -NH-R
10 oder
-O-R
10 ist, worin R
10 eine β-D-Glucopyranuronosylgruppe
[deren Struktur aus den hier enthaltenen Arbeitsbeispielen offensichtlich
ist] oder ein Salz davon oder ein Ester- oder Amidderivat davon
an der Carbonsäurefunktion
ist,
R
6 Benzyl ist, das am Phenylring
substituiert sen kann mit OH, C
1-6-Alkoxy,
Halogen, C
1-4-Alkyl, NH
2 oder
CF
3, oder mit -O-R
10,
-S-R
10 oder -NH-R
10,
worin R
10 wie oben definiert ist; C
1-8-Alkyl oder C
2-8-Alkenyl,
das mit 1 bis 3 Hydroxy-, Glucosyloxy- oder C
1-6-Alkoxygruppen,
mit Phenyl, und/oder mit -O-R
10, -S-R
10 oder -NH-R
10,
worin R
10 wie oben definiert ist, substituiert
sein kann; verestertes C
1-6-Alkyl oder C
2-6-Alkenyl; Furfuryl; oder Clyclohexylureido,
Phenylureido oder Tolylureido;
entweder
i) R
7 und
Y halbe Bindungen sind, die zusammen eine Bindung bilden
ii)
eines von R
3 und R
9 H
oder eine Gruppe R
10 wie oben definiert
ist, und das andere eine halbe Bindung ist, die zusammen mit einer
halben Bindung X eine Bindung bildet, oder R
9 Ribosyl,
5'-Phosphoribosyl,
Glucosyl oder -CH
2CH(NH
2)COOH
ist und R
3 eine halbe Bindung ist, die zusammen
mit der halben Bindung X eine Bindung bildet, ist, und
iii)
R
8 H, CH
3, S-CH
3, SO
2-CH
3, SCH
2-phenyl, SH,
OH, Cl oder eine Gruppe -S-R
10, -NH-R
10 oder -O-R
10 ist, worin
R
10 wie oben definiert ist, oder
iv)
R
7 Ribosyl, 5'-Phosphoribosyl oder Glucosyl ist, R
8 H ist, R
9 und Y
halbe Bindungen sind, die zusammen eine Bindung bilden, und R
3 eine halbe Bindung ist, die zusammen mit
der halben Bindung X eine Bindung bildet; unter der Maßgabe, dass
eines von R
2, R
3,
R
6, R
8 und R
9 eine β-D-Glucopyranuronosylgruppe
oder ein Salz davon oder ein Ester- oder Amidderivat davon an der
Carbonsäurefunktion
ist oder enthält.
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Weitere
Verbindungen, die in dem oben genannten Verfahren verwendet werden
können,
sind die der allgemeinen Formel II
worin
R
1 cis-
-CH=CH-COOH, ein Salz davon oder ein Esterderivat davon an der Carbonsäurefunktion
oder das Amidderivat von cis- und/oder trans- -CH=CH-COOH ist und
R
10 wie oben definiert ist.
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Außerdem werden
hierin genetisch transformierte Zellen offenbart, die nach dem oben
genannten Verfahren selektiert wurden, insbesondere Pflanzenzellen,
sowie Pflanzen, Nachkommen und Samen, die sich von solchen genetisch
transformierten Pflanzenzellen ableiten.
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DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
DER ERFINDUNG
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Der
Begriff "Zellen" im Zusammenhang
mit der vorliegenden Erfindung soll sich auf jeglichen Typ Zellen
beziehen, aus denen unter Verwendung des Verfahrens der Erfindung
individuelle genetisch transformierte Zellen identifiziert und isoliert
werden können,
wobei Pflanzenzellen, tierische Zellen und Mikroorganismen wie Bakerien,
Pilze, Hefen etc. eingeschlossen sind. Außerdem soll der Begriff "Zelle" auch Protoplasten
umfassen, d.h. das Protoplasma einer Zelle, das in eine Membran
eingeschlossen ist, aber ohne Zellwand. Während man erwägt, dass
das allgemeine Prinzip der vorliegenden Erfindung auf jegliche Typen
von Zellen angewendet werden kann, hat es sich herausgestellt, dass
das Verfahren besonders geeignet ist für die Selektion genetisch transformierter
Pflanzenzellen.
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Der
Begriff "Zellpopulation" bezieht sich auf
jegliche Gruppe von Zellen, die einer genetischen Transformation
unterzogen worden ist, und von der jene Zellen, die genetisch transformiert
wurden, identifiziert werden sollen, und die genetisch transformierten
Zellen von den nicht genetisch transformierten Zellen isoliert werden
sollen. Die Population kann z.B. ein Gewebe sein, ein Organ oder
ein Teil davon, eine Population individueller Zellen in oder auf
einem Substrat, z.B. eine Zellpopulation in einer Lösung oder
Suspension, oder ein ganzer Organismus, z.B. eine ganze Pflanze.
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Der
Begriff "Selektieren" bezieht sich auf
den Prozess, die genetisch transformierten Zellen zu identifizieren
und/oder von den nicht genetisch transformierten Zellen zu isolieren,
wobei das hier offenbarte Verfahren verwendet wird.
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Die "gewünschte Nukleotidsequenz" kann jegliche Nukleotidsequenz
sein, die in die in Frage kommenden Zellen eingeführt werden
soll, um genetisch transformierte Zellen herzustellen. Einführung von
Nukleotidsequenzen in Pflanzen, Mikroorganismen und Tiere wird weithin
praktiziert, und es gibt keine Einschränkungen bezüglich der Nukleotidsequenzen,
deren Anwesenheit durch Anwendung der hier beschriebenen positiven
Selektionsmerkmale nachgewiesen werden kann. Durch Verwendung dieser
Methode kann die Anwesenheit der gewünschten Nukleotidsequenz in
die genetisch transformierten Zellen ohne die oben erwähnten Nachteile,
die mit herkömmlichen
negativen Selektionssystemen einhergehen, bestimmt werden.
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Die
Tatsache, dass eine Nukleotidsequenz "miteingeführt wird mit" der gewünschten
Nukleotidsequenz bezieht sich aud die Tatsache, dass die beiden
Nukleotidsequenzen aneinander gekoppelt sind oder anders zusammen
auf solche Weise eingeführt
werden, dass die Anwesenheit der miteingeführten Nukleotidsequenz in einer
Zelle anzeigt, dass die gewünschte
Nukleotidsequenz in die Zelle eingeführt wurde, d.h. wenn gezeigt
wird, dass eine der Nukleotidsequenzen eingeführt wurde, ist die Wahrscheinlichkeit,
dass die andere ebenso eingeführt
wurde, deutlich größer. Die
beiden Nukleotidsequenzen sind deshalb typischer-, aber nicht notwendigerweise
Teil derselben genetischen Konstruktion und werden z.B. durch denselben
Vektor eingeführt.
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Die
hierin beschriebenen Methoden können
ebenso verwendet werden, wenn die miteingeführte Nukleotidsequenz und die
gewünschte
Nukleotidsequenz unabhängig
voneinander eingeführt
werden. Das kann beispielsweise durchgeführt werden, indem man dieselben
Bakterien für
die Einführung
beider Gene verwendet und eine relativ große Anzahl Kopien der gewünschten
Nukleotidsequenz in die Zellen einführt, wodurch die Wahrscheinlichkeit
relativ hoch hist, dass Zellen, die nachweislich die miteingeführte Nukleotidsequenz
exprimieren, auch die gewünschte
Nukleotidsequenz enthalten und exprimieren. Es ist zu erwarten,
dass die unabhängige
Einführung
von zwei oder mehr Genen, die in einer Co-Expression der Gene in
der gleichen Zelle resultiert, allgemein eine geringere Wahrscheinlichkeit
hat, und es wird deshalb erwartet, dass die verbesserten Selektionshäufigkeiten,
die durch das positive Selektionsverfahren erzielt werden, in solchen
Systemen besonders vorteilhaft sind.
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Da
es notwendig ist, dass die eingeführten Nukleotidsequenzen in
den transformierten Zellen exprimiert werden, enthält ein genetisches
Gebilde, das die beiden Nukleotidsequenzen enthält, typischer- aber nicht notwendigerweise
Regulationssequenzen, die die Expression der Nukleotidsequenzen
ermöglichen,
z.B. bekannte Promotoren und Transkriptionsterminatoren. Somit ist
die miteingeführte
Nukleotidsequenz typischerweise mit einem Promotor verbunden, der
ein konstitutiver oder regulierbarer Promotor sein kann, und die
gewünschte
Nukleotidsequenz ist typischerweise auch mit einem konstitutiven
oder regulierbaren Promotor verbunden.
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Wie
oben erwähnt,
ist das Verfahren besonders geeignet für die Selektion genetisch transformierter Pflanzenzellen,
wodurch die Identifikation und Isolation solcher Zellen ohne die
Verwendung von Selektionsgenen, die Antibiotika- oder Herbizidresistenz
codieren, ermöglicht
wird. Wie bei herkömmlichen
negativen Selektionsverfahren kann das hier beschriebene positive
Selektionsverfahren für
die Selektion von Zellen in vitro verwendet werden. Jedoch kann
das positive Selektionsverfahren auch in vivo verwendet werden.
Die Verwendung des positiven Selektionsverfahrens in vivo ist von
besonderer Bedeutung, z.B. im Zusammenhang mit genetischer Transformation
an ganzen Pflanzen oder an Pflanzenteilen, in denen die Pflanzen
oder Pflanzenteile sowohl transformierte als auch nicht transformierte
Zellen enthalten, da die Selektion der transformierten Zellen erreicht
wird, ohne die benachbarten nicht transformierten Zellen direkt
zu schädigen.
Die transformierten Zellen haben so einen selektiven "Vorteil" verglichen mit den
nicht transformierten Zellen (z.B. die Fähigkeit, Keime zu bilden),
aber die nicht transformierten Zellen erleiden keinen ernsten Nachteil
in dem Sinne, dass die geschädigt
oder abgetötet
werden, wie in dem Falle der negativen Selektion unter Verwendung
von Antibiotika oder Herbiziden.
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Die/der "inaktive Verbindung
oder Nährstoff" kann jegliche/r
Verbindung oder Nährstoff
in inaktiver oder Vorläuferform
sein, d.h. die/der in Abwesenheit der Expression der miteingeführten Nukleotidsequenz
in einer Form vorliegt, die im wesentlichen bezüglich der in Frage kommenden
Zellen biologisch inaktiv ist, die/der aber, wenn die miteingeführte Nukleotidsequenz
exprimiert oder transkribiert wird, hydrolysiert oder anderswie
aktiviert oder metabolisiert wird, um so die genetisch transformierten
Zellen, die die gewünschte
Nukleotidsequenz enthalten, mit einem selektiven Vorteil zu versehen,
und sie dadurch identifiziert und isoliert werden können. Die/der
inaktive Verbindung oder Nährstoff
kann also z.B. ein inaktiver Pflanzenwachstumsregulator sein, beispielsweise
ein inaktiviertes Cytokinin, Auxin oder Gibberellin, ein Vitamin,
z.B. inaktiviertes Thiamin, ein Kohlenhydrat (z.B. Mannose, wenn
die miteingeführte
Nukleotidsequenz Mannose-6-phosphat-Isomerase codiert, oder Galaktose oder
eine Galaktose-enthaltende Verbindung, wenn die miteingeführte Nukleotidsequenz
UDP-Galaktose-4-Epimerase codiert), eine stickstoffhaltige Verbindung
(z.B. ein Opin, wenn die miteingeführte Nukleotidsequenz ein Opinmetabolismus-
oder -transportenzym codiert), Stärke, ein Protein, oder ein
anderer Nährstoff
in inaktiver Form, oder eine Verbindung, die eine wesentliche Funktion
während
der Differenzierung und Dedifferenzierung von Zellen und Geweben
hat. Die Behandlung von Zellen und Geweben mit Verbindungen, die
die Abhängigekti
von weiterer Zugabe wesentlicher Verbindungen bewirken, kann ebenso
zusammen mit den entsprechenden inaktiven Verbindungen angewendet
werden. Dieser Weg kann beispielsweise angewendet werden, wenn die
Sterol- oder Saponinsynthese gehemmt ist und inaktive Sterole oder
Saponine zugegeben werden. Die inaktive Verbindung kann darüberhinaus
z.B. ein Mineral sein, das chelatisiert ist und dadurch für die genetisch
transformierten Zellen verfügbar
gemacht wird.
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Im
Gegensatz zur herkömmlichen
negativen Selektion, bei der die nicht transformierten Zellen auf Grund
der Anwesenheit eines Antibiotikums, Herbizids oder Giftstoffes
im Substrat geschädigt
oder abgetötet werden,
haben inaktive Verbindungen oder Nährstoffe, die in dem positiven
Selektionsverfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden,
keinen direkten nachteiligen Effekt auf die nicht transformierten
Zellen. Stattdessen werden die transformierten Zellen mit einem
physiologischen Vorteil ausgestattet, der es ermöglicht, sie zu identifizieren
und zu isolieren, während
die nicht transformierten Zellen durch die Anwesenheit der/s inaktiven
Verbindung oder Nährstoffs,
der zu Selektionszwecken verwendet wird, als solche nicht oder weniger angegriffen
werden.
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Die
herkömmlichen
Verfahren der "negativen
Selektion" sind
also gekennzeichnet durch die Verwendung eines Selektionsgens, das
die negative Wirkung einer zugegebenen Verbindung auf die transformierten Zellen
reduziert. Im Gegensatz dazu bezieht sich der Begriff "positive Selektion", wie er im Zusammenhang
mit der vorliegenden Erfindung verwendet wird, auf die Verwendung
eines Selektionsgens, das eine positive Wirkung einer zugegebenen
Verbindung auf die transformierten Zellen erzeugt oder steigert.
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Selektion,
die diesen Ansatz verwendet, wird also erreicht, indem man eine
Verbindung für
die transformierten Zellen verfügbar
macht, während
die Verbindung für
die nicht transformierten Zellen nicht oder weniger verfügbar ist.
Die/der in Frage kommende Verbindung oder Nährstoff kann vom selben Typ
sein wie jeder der oben erwähnten,
wobei der Unterschied darin besteht, dass die Verbindung oder der
Nährstoff
in diesem Fall zusätzlich
zu einer Aktivierung in den transformierten Zellen in die transformierten
Zellen transportiert wird.
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Beispiele
von Verbindungen, die eine physiologische Wirkung ausüben können, wenn
sie in die Zelle eindringen, die aber nicht einfach in die Zelle
oder ein Zellkompartiment aufgenommen werden, sind stark hydrophile
oder hydrophobe Verbindungen, insbesondere geladene Verbindungen,
große
Moleküle,
wo wie Polymere, insbesondere Proteine, Peptide, Oligo- und Polysaccharide,
einschließlich
Pflanzenhormone, phosphorylierte Metabolite, wie phosphorylierte
Kohlenhydrate, phophorylierte Vitamine, phosphorylierte Nukleoside,
einschließlich
Cytokinine, und Verbindungen, die zu Carbonsäure-enthaltenden Kohlenhydraten
oder Aminosäuren
konjugiert sind, einschließlich
Pflanzenhormonkonjugate.
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Der "selektive Vorteil", den die transformierten
Zellen besitzen, kann jeglicher Unterschied oder Vorteil hinsichtlich
der nicht transformierten Zellen sein, der es ermöglicht,
dass die transformierten Zellen leicht identifiziert und von den
nicht transformierten Zellen isoliert werden. Dies ist typischerweise
ein Unterschied oder Vorteil, der es ermöglicht, dass die transformierten
Zellen durch einfache visuelle Mittel, d.h. ohne Anwendung eines
speziellen Assays zur Bestimmung der Gegenwart eines Markergens
identifiziert werden.
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Wenn
ein Polypeptid, das durch die miteingeführte Nukleotidsequenz codiert
ist, eine/n inaktive/n Verbindung oder Nährstoff in den transformierten
Zellen direkt aktiviert, können
die nicht transformierten Zellen in bestimmten Fällen eine bestimmte Menge des
in Frage kommenden Polypeptids enthalten oder produzieren. Wenn
beispielsweise das aktivierende Polypeptid ein Enzym ist, können die
nicht transformierten Zellen eine bestimmte ursprüngliche
Enzymaktivität
enthalten, wobei das native Enzym vom selben Typ wie das eingeführte aktivierende
Enzym ist. In solchen Fällen
muss die/der "inaktive
Verbindung oder Nährstoff" nicht notwendigerweise
vollkommen inaktiv in den nicht transformierten Zellen sein, da
es ausreichend sein kann, dass die Verbindung oder der Nährstoff
lediglich wesentlich weniger aktiv in nicht transformierten Zellen
als in transformierten Zellen ist. Mit anderen Worten, ein qualitativer
Unterschied zwischen den transformierten Zellen und den nicht transformierten
Zellen hinsichtlich der Aktivierung der/s anfänglich inaktiven Verbindung
oder Nährstoffs
kann in bestimmten Fällen
für Selektionszwecke
ausreichend sein. In solchen Fällen
können
Inhibitoren oder Substrate, die mit den nativen Enzymen konkurrieren,
zugegeben werden. Besonders geeignet sind Inhibitoren, die vom nativen
Enzym aktiviert werden, was zu einer selbstkatalysierten Produktion
des aktiven Inhibitors auf ein Niveau führt, bei dem das native Enzym
im wesentlichen vollständig
gehemmt ist.
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Das
aktivierende Polypeptid, das durch die miteingeführte Nukleotidsequenz codiert
wird, ist nicht auf irgendein besonderes Polypeptid beschränkt und
ist selbstverständlich
eines, das entweder direkt oder indirekt aktiv ist, bezüglich der/m
bestimmten Verbindung oder Nährstoff,
die/der in den genetisch transformierten Zellen aktiviert werden
soll. Das Polypeptid ist insbesondere oft ein Enzym.
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Ein
Enzym, das sich für
die Selektion genetisch transformierter Pflanzenzellen als geeignet
erwiesen hat, ist β-Glucuronidase
("GUS"), wobei die Selektion
ausgeführt
wird, indem man eine Glucuronidverbindung verwendet, die einen Pflanzenwachstumsregulator
enthält,
der durch β-Glucuronidase
gespalten wird, z.B. ein Cytokininglucuronid (dessen Bedeutung aus
den hier enthaltenen Beispielen klar wird). Es ist überraschend, dass
Selektion genetisch transformierter Pflanzenzellen durch Verwendung
eines GUS-Gens erreicht werden kann, da es sich im Zusammenhang
mit der vorliegenden Erfindung herausgestellt hat, dass höhere Pflanzen eine
ursprüngliche
GUS-Aktivität
besitzen. Diese Erkenntnis steht im Gegensatz zu dem, was früher berichtet wurde.
So stellt GB 2 197 653-A fest, dass höhere Pflanzen keine messbare β-Glucuronidaseaktivität enthalten,
und impliziert damit, dass, da GUS-Aktivität in höheren Pflanzen nicht gefunden
wird, es eine relativ klare Sache ist, die Expression einer interessierenden
Genkonstruktion unter Verwendung des GUS-Gens zu überwachen.
Wie unten erklärt
(siehe Beispiele) ist dies jedoch nicht der Fall, und die Verwendung
eines GUS-Gens für
die Überwachung
der Gegenwart eines interessierenden Gens ist in keinster Weise
einfach oder klar, wegen der Tatsache, dass höhere Pflanzen in Wirklichkeit
eine bedeutende intrinsische (Hintergrund-) β-Glucuronidaseaktivität enthalten.
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So
kann für
die Selektion genetisch transformierter Pflanzenzellen die Zellpopulation
auf oder in einem Medium kultiviert werden, das ein Cytokininglucuronid
enthält,
das in den transformierten Zellen durch die β-Glucuronidase gespalten wird,
wodurch freies Cytokinin freigesetzt und Keim- und/oder Kallusauslösung in den
transformierten Zellen veranlasst wird.
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Eine
Anzahl neuartiger Cytokininglucuronidverbindungen ist für die Zwecke
der vorliegenden Erfindung entwickelt worden. Die Herstellung dieser
Verbindungen sowie ihre Verwendung für positive Selektion von genetisch
transformierten Zellen ist unten ausführlich beschrieben.
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In
bestimmten Fällen
kann es wünschenswert
sein, die hier offenbarte grundlegende Methode zu modifizieren,
beispielsweise um eine effektivere Selektion zu liefern oder um
das Selektionsverfahren zu vereinfachen. Wenn die inaktive Verbindung,
die für
das positive Selektionsverfahren verwendet wird, eine ist, die durch β-Glucuronidase
gespalten wird, kann das grundlegende Verfahren durch verschiedene
Möglichkeiten modifiziert
werden, um ein besseres Ergebnis zu erzielen. Eine dieser Möglichkeiten
ist die Verwendung bestimmter Sterolglucuronidverbindungen, z.B.
Cholesteryl-β-D-glucuronid oder β-Sitosteryl-β-D-glucuronid,
zusammen mit einer die Sterolsynthese hemmenden Verbindung wie Tridemorph
(4-Tridecyl-2,6-dimethylmorpholin). Die Beispiele 5 und 6 unten
beschreiben die Verwendung solcher Verbindungen. Man glaubt, dass durch
Verwendung eines Sterolsyntheseinhibitors zusammen mit Sterolglucuroniden,
die der Wirkung des Sterolsyntheseinhibitors auf die Hydrolyse durch β-Glucuronidase
entgegenwirken, sogenanntes "cross
feeding" (d.h. Diffusion
der aktivierten Verbindung aus der Zelle, in der sie aktiviert wird,
in eine ander Zelle) während des
Selektionsverfahrens verhindert werden kann, da die Sterolverbindungen
nicht von Zelle zu Zelle diffundieren, wenn der hydrophile Glucuronidteil
abgespalten ist. So wird eine lokalisiertere Wirkung erreicht. Entsprechende
Ergebnisse können
mit einer großen
Anzahl anderer Glucuronide, die ein hydrophobes Aglycon enthalten,
erhalten werden.
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Wie
oben erklärt,
wurde im Gegensatz zu dem, was vorher berichtet worden war, gefunden,
dass höhere
Pflanzen wirklich ursprüngliche
GUS-Aktivität
bestitzen. Aus diesem Grund kann die bloße Einführung eines GUS-Gens in eine
Pflanze nicht zwangsläufig
ausreichend sein, um die gewünschte
Selektion der genetisch transformierten Zellen zu erhalten, und
es kann notwendig oder wünschenswert
sein, jegliche ursprüngliche β-Glucuronidaseaktivität in der
Zellpopulation zu vermindern. Da eine eingeführte β-Glucuronidase andere Eigenschaften
als eine native β-Glucuronidase
haben kann, kann eine Verminderung jeglicher urspünglicher β-Glucu ronidaseaktivität auf verschiedenen
Wegen erreicht werden, z.B. durch Zugabe einer β-Glucuronidase-hemmenden Verbindung
zum Kulturmedium, die eine stärker
hemmende Wirkung auf die ursprüngliche β-Glucuronidase
hat als auf die β-Glucuronidase,
die durch das Nukleotid oder eine Subsequenz davon codiert ist.
Ein solcher Typ von Verbindung ist ein Ammoniumsalz.
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Ursprüngliche β-Glucuronidasaktivität in der
Zellpopulation kann auch wesentlich reduziert werden durch Zugabe
einer Verbindung zu dem Kulturmedium, die bei Hydrolyse zu einem
Produkt führt,
das die Aktivität
der nativen β-Glucuronidase
hemmt, und das vorzugsweise die Aktivität der eingeführten β-Glucuronidase
mehr hemmt als die Aktivität
der eingeführten β-Glucuronidase
gehemmt wird. Dan kann in einer selbstregulierten oder lokalisierten
Weise erfolgen, beispielsweise lokalisiert auf bestimmte Kompartimente,
wo das eingeführte
GUS-Gen lokalisiert oder nicht lokalisiert ist. Ein Beispiel für ein Hydrolyseprodukt,
das native β-Glucuronidase
hemmt, ist Glucuronsäure,
die beispielsweise aus der Hydrolyse von Glycyrrhizinsäure oder Sterylglucuroniden
stammt.
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Ursprüngliche β-Glucuronidaseaktivität in der
Zellpopulation kann weiterhin vermindert werden durch Zugabe eines β-Glucuronidaseinhibitors
zum Kulturmedium, insbesondere β-Glucuronid,
das in Zellen ohne ein eingeführtes β-Glucuronidasegen
die β-Glucuronidaseaktivität mehr hemmt
als in Zellen mit einem eingeführten β-Glucuronidasegen.
Das kann z.B. ein schlecht oder wenig geeignetes Glucuronidasesubstrat
(ein Glucuronid) sein, das eine höhere Affinität für die native β-Glucuronidase
als für
die eingeführte β-Glucuronidase
hat.
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β-Glucuronidase,
die durch das eingeführte β-Glucuronidasegen
codiert ist, das für
die Zwecke der vorliegenden Erfindung verwendet wird, ist über einen
relativ breiten pH-Bereich aktiv, während die native β-Glucuronidase,
die in einer breiten Vielfalt von Pflanzenspezies gefunden wird,
nur in einem relativ engen Bereich von pH-Werten aktiv ist, typischerweise etwa
pH 4-5 (siehe Beispiel 3 unten). Ursprüngliche β-Glucuronidaseaktivität kann deshalb
in diesem Fall durch Zugabe eines Glucuronids, das durch die native β-Glucuronidase
hydrolisiert werden kann und das bei Hydrolyse zu einer pH-Zunahme
führt,
beispielsweise o-Cumarylglucuronid, zu dem Kulturmedium vermindert
werden.
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Da
herausgefunden wurde, das β-Glucuronidase,
die den Pflanzen ursprünglich
ist, im allgemeinen bei einem pH von etwa 4-5 aktiv ist, kann die
ursprüngliche β-Glucuronidaseaktivität auch durch
Zugabe einer pH-regulierenden Verbindung zum Kulturmedium vermindert
werden, die das Kulturmedium mit einem pH zwischen ungefähr 5,5 und
8,5, vorzugsweise zwischen ungefähr
6,0 und 8,0, beispielsweise zwischen ungefähr 6,5 und 7,5 versieht, oder
einer pH-regulierenden Verbindung, die den pH in den Zellen oder
in Kompartimenten der Zellen auf einen pH innerhalb dieser Bereiche
erhöht.
Bei diesen pH-Werten ist β-Glucuronidase,
die durch das eingeführte
GUS-Gen codiert ist, aktiv, aber ursprüngliche β-Glucuronidase ist im wesentlichen
inaktiv. Ein Beispiel einer pH-regulierenden Verbindung, die verwendet
werden kann, ist ein Ammoniumsalz oder eine Ammonium freisetzende
Verbindung, z.B. Ammoniumnitrat.
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Letztendlich
kann ursprüngliche β-Glucuronidaseaktivität vermindert
oder im wesentlichen beseitigt werden durch eine physikalische Behandlung,
wie eine Hitzebehandlung, beispielsweise unter Verwendung einer
Temperatur im Bereich von 50-65 °C
in Form einer Behandlung mit kurzen Pulsen über ungefähr 1-2 Tage vor dem Transfer
auf das Selektionssubstrat und/oder unter Verwendung einer Temperatur
im Bereich von 30-45 °C
während
der Selektion (siehe Beispiel 10).
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Genetische
Transformation von Pflanzenzellen wird oft unter Verwendung von
Agrobacterium-Stämmen,
insbesondere Stämmen
von Agrobacterium tumifaciens, durchgeführt. Es wurde gefunden, dass
bestimmte entwaffnete Agrobacterium-Stämme
Keimbildung durch die Produktion keimbildungsauslösender Substanzen
während
der Cokultivierung induzieren, und solche Stämme sollten normalerweise vermieden werden,
wenn GUS-Hydrolyse von Cytokininglucuroniden für die Zwecke der Selektion
genetisch transformierter Zellen verwendet werden soll. So wird
genetische Transformation der Zellen unter Verwendung eines Cytokininglucuronids
als inaktive Verbindung vorzugsweise durchgeführt unter Verwendung eines
Agrobacterium-Stammes, der keine Cytokinine oder andere keim- (wachstums-)
auslösenden
Verbindungen produziert, oder der nur eine unwesentliche Menge solcher
Verbindungen produziert, wodurch die Auslösung von Keimwachstum aufgrund
der Gegenwart lebender Bakterien auf oder in den Zellen beseitigt
oder wesentlich vermindert wird.
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In
besonderen Fällen,
wenn beispielsweise eine verbesserte Selektionshäufigkeit erwünscht ist,
kann es für
die gewünschte
Nukleotidsequenz vorteilhaft sein, mit wenigstens zwei verschiedenen
Selektionsgenen miteingeführt
zu werden. Das zusätzliche
Selektionsgen kann ein zusätzliches
Gen sein, das ein Enzym (oder anderes Protein oder Polypeptid) codiert,
das für
positive Selektion gemäß der vorliegenden
Erfindung geeignet ist, oder es kann ein Gen sein, das ein Enzym
(oder anderes Protein oder Polypeptid) codiert, das für herkömmliche
negative Selektion geeignet ist, d.h. das Resistenz gegen einen
Giftstoff, ein Antibiotikum oder ein Herbizid codiert. So können genetisch
transformierte Zellen selektiert werden, indem man eine Kombination von
positiver und negativer Selektion anwendet, wobei die gewünschte Nukleotidsequenz
in die genetisch transformierten Zellen weiterhin miteingeführt wird
mit einer Subsequenz, die Resistenz gegenüber wenigstens einem Giftstoff,
Antibiotikum oder Herbizid codiert, wobei das Medium wenigstens
einen Giftstoff, ein Antibiotikum oder ein Herbizid enthält, gegen
das die transformierten Zellen resistent sind.
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Wie
oben erwähnt,
sind in einem Aspekt der vorliegenden Erfindung genetisch transformierte
Zellen offenbart, die nach der oben genannten Methode selektiert
wurden, insbesondere Pflanzenzellen, sowie Pflanzen, Nachfahren
oder Samen, die von solchen genetisch transformierten Pflanzenzellen
abgeleitet sind. Insbesondere ist es oft ein Vorteil, dass diese
Zellen genetisch transformierte Pflanzenzellen sind, deren Genom als
Selektionsmarker keine eingeführte
(d.h. nicht-native) Nukleotidsequenz enthält, die Toxin-, Antibiotika- oder
Herbizidresistenz codiert. Wie oben erklärt, gibt es Bedenken darüber, ob
es sicher ist, Gene, die beispielsweise Antibiotikaresistenz in
beispielsweise Nahrungspflanzen codieren, einzuführen. Genetisch transformierte
Pflanzenzellen, die durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung
selektiert werden, die keine Selektionsgene für beispielsweise Antibiotikaresistenz
enthalten, sowie Pflanzen, Nachfahren und Samen, die von solchen
Zellen abgeleitet werden, sind unter diesem Gesichtspunkt klar von
Vorteil.
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Synthese von Verbindungen
der allgemeinen Formel I gemäß der Erfindung
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Verschiedene
Verfahren von mehr oder weniger großer Allgemeingültigkeit
sind für
die Synthese von Cytokininglucuroniden, die von der allgemeiner
Formel I umfasst werden, verfügbar,
und zwei davon, die als beste dieser Verfahren betrachtet werden,
sind im folgenden beschrieben:
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A) Oxidation des entsprechenden
Cytokinin-D-glucosids.
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In
diesem Ansatz wird die -CH2-OH-Gruppe am
Pyranosering des β-D-Glucosids,
das dem in Frage kommenden Glucuronid entspricht, unter geeigneten
Bedingungen zu einer Carboxylfunktion oxidiert. Das wahrscheinlich
beste Verfahren, diese Oxidationsreaktion in einer einfachen und
hochselektiven Art zu erreichen, ist katalytische; Oxidation durch
Sauerstoff, geeigneterweise unter Verwendung von Platinmohr oder Platin
auf Kohlenstoff als Katalysator und unter Verwendung eines schwach
basischen (pH 8-10) wässrigen oder
wässrig-alkoholischen
(so wie wässrig-ethanolischen)
Reaktionsmediums; die Reaktion kann geeigneterweise bei einer Temperatur
im Bereich von 60-100 °C
während
einer Zeitdauer von 2 bis 24 Stunden durchgeführt werden. Oxidation (im allgemeinen
nicht-katalytisch) durch herkömmliche
Oxidationsmittel, die von Sauerstoff verschieden sind, können auch
angewendet werden, aber voraussichtlich ergibt die sich ergebende
Oxidationsreaktion im allgemeinen kleinere Ausbeuten und ist weniger
spezifisch [d.h. führt
zu Gemischen an Oxidationsprodukten – insbesondere wenn nicht Maßnahmen
getroffen werden, um andere oxidierbare Funktionalitäten des
Glucosid-Ausgangsmaterials durch Einführung geeigneter Schutzgruppen
zu schützen
(siehe unten)].
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Ein
Beispiel für
den Ansatz der katalytischen Oxidation wird durch Verfahren 1 von
Beispiel 1C in der vorliegenden Anwendung gegeben, in dem N6-Benzyladenin-9-β-D-glucopyranosid (BA9G) zu N6-Benzyladenin-9-β-D-glucopyranuronsäure, (die
anschließend
als Natriumsalz isoliert wird) durch Oxidation mit Sauerstoff in
Gegenwart von Platinmohr oxidiert wird.
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Dieses
Verfahren scheint von ziemlich allgemeiner Anwendbarkeit für die Synthese
von Cytokinin-9-glucuroniden aus entsprechenden 9-Glucosiden zu
sein. Es hat sich auch als zufriedenstellend für die Synthese von beispielsweise
Zeatin-O-glucuronid (vgl. Beispiel 1G hierin) aus den entsprechenden
Zeatin-O-glucosiden erwiesen; Zeatin-O-glucuronid ist ein Beispiel
für eine
Verbindung der Formel I gemäß der Erfindung,
in der der Glucuronidteil ein Substituent an einem R6-Teil – wie hierin
definiert – des
C2-8-Alkenyl-Typs ist, und das in Frage
kommende Verfahren wird als von ziemlich großer Allgemeingültigkeit
für andere Cytokininglucuronide
gemäß der Erfindung
erachtet, in denen ein O-Glucuronid-Teil als Substituent an einer R6-Gruppe
sitzt, die einer der folgenden Typen ist, wie in Zusammenhang mit
der allgemeinen Formel I definiert: eine Benzylgruppe; ein C1-8-Alkyl oder substituiertes C1-8-Alkyl;
ein C2-8-Alkenyl oder substituiertes C2-8-Alkenyl.
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Dieser
Ansatz scheint jedoch nicht allgemein anwendbar zu sein, beispielsweise
für die
Synthese von Cytokinin-3-glucuroniden.
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Wie
bereits angedeutet, ist es klar, dass, wenn man einen Ansatz macht,
der die Oxidation eines Cytokininglucosides einschließt, jegliche
anderen oxidierbaren (unter den in Frage kommenden Oxidationsbedingungen)
funktionellen Gruppen, die im Ausgangs-Cytokininglucosid vorhanden
sein können
und die im endgültigen
Glucuronid der Formel I unverändert
bleiben sollen, durch die vorherige Einführung geeigneter Schutzgruppen
geschützt
werden müssen.
Beispiele möglicher
oxidierbarer Gruppen, die in Verbindungen innerhalb der Definition
der Formel I vorhanden sein können,
sind [bezüglich
ihrer Position wie in Zusammenhang mit der allgemeinen Formel I
(siehe oben) aufgeführt]:
eine SH-Gruppe, die als R2- und/oder R8-Gruppe vorliegen
kann; Hydroxy- oder Glucosyloxygruppen, die als Substituenten an
R6-Gruppen des substituierten C1-8-Alkyltyps
oder des substituierten C2-8-Alkenyl-Typs vorliegen können; und
Ribosyl-, 5'-Phosphoribosyl- oder
Glucosylgruppen, die als R9- oder R7-Gruppen vorliegen können. Wenn es beispielsweise
notwendig ist, aliphatische (alkoholische) Hydroxygruppen zu schützen, wie
Hydroxygruppen an sekundären
Kohlenstoffatomen in Ribosyl-, 5'-Phosphoribosyl-
oder Glucosylgruppen, sind geeignete Schutzgruppen oft beispielsweise Acetylgruppen,
die durch Verfahren eingeführt
werden können,
die einem Fachmann wohlbekannt sind, und die nach dem Oxidationsvorgang
durch alkalische Hydrolyse entfernt werden können.
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Verwendet
man jedoch den Ansatz der milden katalytischen Oxidations, der oben
beschrieben ist, sind Hydroxygruppen an primären aliphatischen Kohlenstoffatomen im
allgemeinen oxidationsempfindlich, während Hydroxygruppen an sekundären (und
tertiären)
Kohlenstoffatomen dies im allgemeinen nicht sind; so erfordern,
wenn man den -CH2-OH-Teil in der 5-Position
des Glucopyranoserings eines Cytokinin-β-D-glucosids auf diese Weise oxidiert,
die Hydroxygruppen an den 2-, 3- und 4-Positionen des Glucopyranoserings im
allgemeinen keinen Schutz. Eine -SH-Gruppe, die als eine Gruppe R2 oder R8 vorliegt,
erfordert jedoch im allgemeinen einen Schutz während dieser katalytischen
Oxidation, und eine solche SH-Gruppe kann geeigneterweise als Benzylderivat
(siehe hinten im Zusammenhang mit dem unten beschriebenen Verfahren
B) geschützt
werden.
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Zahlreiche
geeignete Cytokininglucoside zur Verwendung als Ausgangsmaterialien
in diesem Verfahren sind kommerziell erhältlich; beispielsweise ist
eine große
Vielfalt davon von Apex Organics Ltd., Leicester, England, erhältlich und
einige Cytokinin-9-glucoside
sind von Sigma Chemical Company, P.O. Box 14508, St. Louis, MO 63178,
USA, erhältlich.
Cytokininglucoside können
auch durch bekannte Verfahren hergestellt werden, die in der Literatur
beschrieben sind. Beispielsweise kann die Synthese einer Vielzahl
geeigneter Cytokinin-9-glucoside, die R6-Gruppen
tragen und von deren hier vorliegender Definition erfasst werden,
durch einfache Ausweitung des Verfahrens erreicht werden, das durch
Cowley et al. [Aust. J. Chem. 31 (1978) 1095] für die Synthese von 9-β-Glucopyranosiden
des Zeatins und N6-Benzyladenins beschrieben
ist.
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B) Synthesen des Koenigs-Knorr-Typs.
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Dieser
Ansatz, der auf dem Originalverfahren von W. Koenigs und E. Knorr
[Chem. Ber. 34 (1901) 957] beruht, beinhaltet die Reaktion von Methyl-(2,3,4-tri-O-acetyl-α-D-glucopyranosylbromid)uronat
[abgekürzt MBTG;
eine geeignete Methode für
dessen Herstellung ist durch Bollenback et al., J. Amer. Chem. Soc.
77 (1955) 3310, beschrieben] mit einer alkoholischen oder phenolischen
Hydroxygruppe, einer Mercapto-(-SH-)Gruppe oder einem Ring-Stickstoffatom
in einem aromatischen oder ungesättigten
heterocyclischen Teil.
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Dieser
Ansatz liefert wahrscheinlich das am allgemeinsten anwendbare Verfahren
für die
Synthese von Cytokininglucuroniden gemäß der Erfindung (oder von Glucuroniden
von Vorläuferverbindungen,
die anschließend
einfach zu den gewünschten
Cytokininglucuroniden umgewandelt werden können), indem man von geeigneten
Cytokininen [oder Cytokininvorläuferverbindungen
(siehe unten)] ausgeht, und man glaubt, dass dies von sehr großer Anwendbarkeit
bei der Herstellung von Verbindungen, die von der allgemeinen Formel
I umfasst werden, ist.
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Das
allgemeine Verfahren ist wie folgt: Das geeignete Cytokinin oder
die Cytokininvorläuferverbindung (siehe
unten), gelöst
in einem Lösungsmittel
wie N,N-Dimethylformamid (DMF), Chinolin, Propylencarbonat, Methanol
oder Diethylether, lässt
man mit 1,25-2 molaren Äquivalenten
MBTG bei einer Temperatur im Bereich von 25-100 °C während einer Zeit von 3 bis
96 Stunden reagieren, vorzugsweise in Gegenwart eines zugegebenen
Halogenid(Bromid-)fängers
wie Silberoxid oder Silbercarbonat (verwendet man beispielsweise
DMF als Lösungsmittel,
wirkt das Lösungsmittel
selbst oft hinreichend als Halogenidfänger, wobei in dem Fall die
Zugabe eines zusätzlichen
Fängers
nicht wesentlich ist). Diese Reaktion ergibt einen Methylester des
Zwischenproduktes peracetyliertes Glucuronid, das im allgemeinen
isoliert und gereinigt wird; das kann geeigneterweise durchgeführt werden
durch beispielsweise (i) Verdampfen des Lösungsmittels, gefolgt von einer
Extraktion des Rückstands
mit einem Lösungsmittel
wie Chloroform, Entfernung des letzteren Lösungsmittels aus dem Extrakt
und Reinigung der sich ergebenden rohen Zwischenverbindung durch
Umkristallisieren und/oder herkömmliche
Säulenchromatographietechniken;
oder, beispielsweise, (ii) durch Abtrennung des Zwischenprodukts
aus dem Reaktionsgemisch durch herkömmliche Säulenchromatographie, die direkt
an dem Reaktionsgemisch ausgeführt
wird, gefolgt von einer Entfernung des Eluierungslösungsmittels
aus der/den interessierenden eluierten Fraktion/en und Umkristallisation
des Rohprodukts.
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In
Fällen,
in denen das gewünschte
Endprodukt der Formel I den Glucuronidteil in der Amidform (Glucuronamid)
haben soll, wird die Umwandlung der peracetylierten Methylesterform
des Glucuronidteils in die Amidform geeigneterweise in dieser Stufe
ausgeführt,
und das kann im allgemeinen erreicht werden, indem man den peracetylierten
Methylester (vorzugsweise gereinigt, z.B. in der oben ausgeführten Weise)
mit einer Lösung
von wasserfreiem Ammoniak in wasserfreiem Methanol bei geringer
Temperatur, beispielsweise einer Temperatur zwischen 0 °C und –10 °C, oder – als alternative
Möglichkeit – mit einer
konzentrierten (geeigneterweise gesättigten) wässrigen Lösung von Ammoniak bei ungefähr Raumtemperatur über eine
Zeitdauer von 0,5-4 Stunden behandelt. Das Glucuronamid kann dann
isoliert werden durch Verdampfen der Ammoniaklösung, beispielsweise unter
Vakuum, und Umkristallisieren aus einem geeigneten Lösungsmittel
oder Lösungsmittelgemisch,
wie 90%iges wässriges
Ethanol. Ein Beispiel dieser Umwandlung wird durch Beispiel 1B hierin gegeben,
in dem N6-Benzyladenin-3-glucuronamid (BA3Gnamid)
aus dem entsprechenden Methylester dargestellt wird.
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Weiterhin
kann, im Falle von Verfahren, die von bestimmten Typen an Cytokininvorläuferverbindungen ausgehen,
eine chemische Transformation, die notwendig ist, um den Cytokininvorläuferteil
zu dem geeigneten Cytokininteil umzuwandeln, oft am Methylester
vorgenommen werden, bevor man dazu übergeht, das freie Glucuronid
freizusetzen. Als Beispiel kann die Synthese von Cytokinin-9-glucuroniden
(deren Synthese durch den Ansatz der katalytischen Oxidation schon
oben beschrieben wurde) normalerweise zufriedenstellend erreicht
werden, indem man von einem substituierten oder unsubstituierten
Purin ausgeht, das in der 6-Position ein Chloratom trägt; letztere
6-Chlorverbindung kann im allgemeinen in den Methylester des entsprechenden peracetylierten
9-Glucuronids umgewandelt werden mittels des oben beschriebenen
allgemeinen Verfahrens unter Verwendung von MBTG, und die 6-Chlorgruppe
kann dann geeigneterweise zum gewünschten -NH-R6-Teil
umgewandelt werden, indem man das Produkt aus letzterer Reaktion
mit dem entsprechenden Amin (R6-NH2) reagieren lässt, das im allgemeinen geeigneterweise
in situ aus dem Aminhydrochlorid (R6-NH2·HCl)
und einem Überschuss
(geeigneterweise ein 2-4facher molarer Überschuss) einer geeigneten Base,
z.B. eines tertiären
aliphatischen Amins, wie Triethylamin, in einem geeigneten polaren
Lösungsmittel, wie
einem C1-4-aliphatischen Alkohol, bei einer
Temperatur im Bereich von 65-120 °C,
erzeugt wird. Dies wird durch Verfahren 2 des Beispiels 1C hierin
veranschaulicht, in dem die Synthese von N6-Benzyladenin-9-glucuronid
(BA9GN) (als sein Natriumsalz) durch dieses Verfahren beschrieben
ist.
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Die
Acetylgruppen am Glucuronidteil werden dann durch basische Hydrolyse
entfernt, indem man eine Base, wie wässriges Natriumhydroxid, wässriges
methanolisches oder ethanolisches Natriumhydroxid oder methanolischen
Ammoniak, bei einer Temperatur im Bereich 0-25 °C über eine Zeitdauer von 0,5
bis 6 Stunden, verwendet. Verwendet man eine Base wie eine der oben
erwähnten
wässrigen
oder alkoholischen Natriumhydroxidlösungen, ergibt dieses Verfahren – nach Neutralisation
der überschüssigen Base – die Salzform des
entsprechenden Cytokininglucuronids, während die Verwendung eines
Reagens wie methanolischem Ammoniak und anschließende Entfernung von überschüssigem Ammoniak
durch Verdampfen zu der Amidform des Glucuronids führt. Letzteres
wird geeigneterweise durch herkömmliche
Methoden gereinigt, wie Chromatographie, insbesondere Reversed-phase-Chromatographie,
und/oder Umkristallisation aus einem geeigneten Lösungsmittel,
wie einem wässrigen
organischen Lösungsmittel,
z.B. 80-90%iges wässriges
Ethanol.
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Wenn
das Ausgangs-Cytokinin oder die Cytokininvorläuferverbindung eine oder mehr
Funktionalitäten enthält, die
mit MBTG unter den in Frage kommenden Bedingungen reagieren können, und
die im End-Glucuronid der Formel I unverändert vorliegen müssen, dann
müssen
natürlich
solche Funktionalitäten
durch vorherigen Aufbau geeigneter Schutzgruppen geschützt werden;
Beispiele für
solche reaktive Funktionalitäten,
die in Ausgangs-Cytokininen vorkommen können, die zu Produkten innerhalb
der Definition von Formel I führen, sind
[unter Bezug auf ihre Position wie im Zusammenhang mit der allgemeinen
Formel I (siehe oben) spezifiziert]: -OH oder -SH, vorliegend als
eine R2-Gruppe; -OH oder -SH, vorliegend
als eine R8-Gruppe; -OH oder -NH2, vorliegend als ein Substituent am Phenylring
einer R6-Gruppe des substituierten Benzyl-Typs;
-OH- oder Glucosyloxygruppen, vorliegend als Substituent(en) an
einer R6-Gruppe des substituierten C1-8-Alkyl-Typs oder substituierten C2-8-Alkenyl-Typs; Ribosyl-, 5'Phosphoribosyl- oder
Glucosylgruppen, die als R9 oder R7-Gruppen vorliegen können; und NH2 in
einer -CH2CH(NH2)COOH-Gruppe,
die als R9-Gruppe vorliegt.
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In
Bezug auf Schutzgruppen, die für
den Schutz der oben genannten Beispiele an reaktiven Funktionalitäten, die
in Ausgangs-Cytokininen vorliegen können, geeignet sind, kann eine
-OH-Gruppe im allgemeinen geeigneterweise geschützt werden durch Einführung einer
Acetylgruppe (siehe unten im Zusammenhang mit dem oxidativen Verfahren
zur Darstellung von Verbindungen der Formel I), um die entsprechende
Acetoxygruppe (-OOCCH3) zu bilden. Eine
-SH-Gruppe kann im allgemeinen sehr geeignet als Benzylthioetherderivat
(-SCH2C6H5) durch die Einführung einer Benzylgruppe [beispielsweise
durch Reaktion mit Benzylchlorid in einer ähnlichen Weise wie die, die
unten im Zusammenhang mit Cytokininvorläuferverbindungen, die, zumindest
formal, Oxo- (=O) oder Thioxo- (=S) gruppen an der 2-Position und eine
Oxogruppe an der 6-Position enthalten (siehe unten), genauer beschrieben
ist] geschützt
werden. Eine NH2-Gruppe kann im allgemeinen
geeigneterweise durch Umwandlung zu einer Phthalimidogruppe wie
folgt geschützt
werden: Das Cytokinin oder die Cytokininvorläuferverbindung wird mit einem Überschuss
an Phthalsäureanhydrid
in einem relativ inerten Lösungsmittel,
wie Chloroform oder 1,2-Dimethoxyethan bei einer Temperatur im Bereich
von 70-100 °C über Stunden,
oft geeigneterweise ungefähr
4 Stunden, erhitzt. Die NH2-Gruppe kann, nach
Durchführung
der Koenigs-Knorr-Typ-Reaktion, nachfolgend durch Behandlung mit
einer wässrigen
alkoholischen (so wie einer wässrigen
ethanolischen) Lösung
von Hydrazin wiederhergestellt werden.
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Eine
Gruppe von Cytokininvorläuferverbindungen,
die besonders gut geeignet sind für die Verwendung in der Synthese
von Cytokininglucuroniden gemäß der Erfindung,
und die den Glucuronidteil (der R10 in der
allgemeinen Formel I entspricht) als -O-R10 oder
-S-R10 an der 2-Position des Purinringsystems
angelagert haben, sind Cytokininvorläuferverbindungen, die, wenigstens
formal, Oxo- (=O) oder Thioxo- (=S)
gruppen an der 2-Position und eine Oxogruppe an der 6-Position enthalten;
es sollte an dieser Stelle erwähnt
werden, dass Verbindungen der in Frage kommenden Typen, die 2-Oxo-
und 2-Thioxogruppen haben, zumindest in Lösung, im allgemeinen im tautomeren
Gleichgewicht mit den entsprechenden 2-Hydroxy- und 2-Mercaptoverbindungen
sind (wobei die 6-Oxogruppe dann als eine 6-Hydroxygruppe vorliegt),
und die letzteren tautomeren Formen liegen, im allgemeinen, in bedeutendem
Anteil vor.
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Die
zuletzt genannte Hydroxy- oder Mercaptogruppe an der 2-Position
wird in der letzten Phase des gesamten Syntheseverfahrens mittels
des Koenig-Knorr-Typ-Verfahrens
zu der entsprechenden -O-R10- beziehungsweise
-S-R10-Gruppe umgewandelt; bevor man die
Koenigs-Knorr-Typ-Reaktionsfolge durchführt, wird jedoch geeigneterweise
die 6-Hydroxygruppe umgewandelt, und zwar über ihre zwischenzeitliche
Umwandlung zu einer 6-Halogenid-(vorzugsweise 6-Chlor-)gruppe in
einen -NH-R6-Teil, der in Formel I gezeigt
ist, und das macht es im allgemeinen erforderlich, dass die Hydroxy-
oder Mercaptogruppe an der 2-Position durch eine geeignete Schutzgruppe
während
dieser Umwandlungsfolge geschützt
wird. Für
beide dieser Gruppen ist die Schutzgruppe der Wahl eine Benzylgruppe,
die normalerweise direkt eingeführt
werden kann durch eine Reaktion, die die allmähliche Zugabe eines leichten Überschusses
an Benzylchlorid zu einer gerührten
Lösung oder
Suspension der in Frage kommenden Cytokininvorläuferverbindung in wässriger
Base (pH typischerweise ungefähr
12-13), so wie wässriges
Natrium- oder Kaliumhydroxid, bei ungefähr Raumtemperatur, beinhaltet.
Nach weiterem Rühren
für, typischerweise,
1-2 Stunden, wird das Reaktionsgemisch durch Zugabe von beispielsweise
Eisessig neutralisiert und das unlösliche, benzylgeschützte Produkt
wird durch Filtration isoliert.
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Die
6-Hydroxygruppe des resultierenden 2-Benzyloxy- oder 2-Benzylthio-6-purinolderivates
wird dann in eine 6-Chlorgruppe umgewandelt, geeigneterweise unter
Verwendung eines Überschusses
an einem chlorierenden Reagens, so wie Phosphoroxychlorid (Phosphorylchlorid),
in Gegenwart einer organischen Base, so wie N,N-Diethylanilin; letztere
Reaktion wird normalerweise geeigneterweise unter Rückflussbedingungen über eine
Zeitdauer von ungefähr
10 Minuten bis ungefähr
3 Stunden durchgeführt.
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Die
6-Chlorgruppe kann dann geeigneterweise in den gewünschten
-NH-R6-Teil umgewandelt werden, indem man
das Produkt aus der letzten Reaktion mit dem entsprechenden Amin,
R6-NH2, reagieren
lässt,
das im allgemeinen geeigneterweise in situ aus dem Aminhydrochlorid
(R6-NH2·HCl) und
einem Überschuss
(geeigneterweise ein 2-4facher molarer Überschuss) einer geeigneten
Base, z.B. eines tertiären
aliphatischen Amins, wie Triethylamin, in einem geeigneten polaren
Lösungsmittel,
wie einem C1-4-aliphatischen Alkohol (z.B.
1-Butanol), bei einer Temperatur im Bereich von 65-120 °C, erzeugt
wird.
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Nach
der Isolierung des Produkts wird die Schutzgruppe entfernt, um die
freie 2-Hydroxy- oder 2-Mercaptogruppe wiederherzustellen; im Falle
einer Benzylschutzgruppe kann dies geeigneterweise durch, beispielsweise,
Behandlung des Produkts mit einem Überschuss von Natrium in flüssigem Ammoniak
durchgeführt
werden.
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Im
Falle von Produkten, die auf dieser Stufe eine 2-Mercaptogruppe
haben, glaubt man, dass es allgemein vorteilhaft ist, die 2-Mercaptogruppe
in die Salzform (-S-), beispielsweise die Kaliumsalzform umzuwandeln,
bevor man damit weitermacht, den Glucuronidteil mittels des oben
beschriebenen Koenigs-Knorr-Typ-Verfahrens einzuführen. Ein
Beispiel eines geeigneten Verfahrens für diesen Zweck ist in Schritt
4 des hier enthaltenen Arbeitsbeispiels 1E beschrieben, und die
dort beschriebenen Bedingungen werden als von ziemlich großer allgemeiner
Anwendbarkeit erachtet. Es kann jedoch in manchen Fällen möglich sein,
die Koenigs-Knorr-Typ-Reaktion mit MBTG (siehe unten) direkt ohne
vorherige Umwandlung der 2-Mercaptogruppe in die Salzform durchzuführen.
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Schließlich wird
der Glucuronidteil durch Reaktion mit MBTG eingeführt, wie
oben im Zusammenhang mit dem Koenigs-Knorr-Typ-Verfahren beschrieben.
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Ein
Beispiel, das die oben beschriebene Abfolge von Syntheseschritten
veranschaulicht, ist in Beispiel 1E für die Synthese des Natriumsalzes
von N6-(2'-isopentenyl)adenin-2-thioglucuronid
(IP2SGN), ausgehend von 2-Thioxanthin, beschrieben, und man glaubt,
dass viele der darin gegebenen weiteren Informationen hinsichtlich
der Wahl der Umkristallisations- und Extraktionslösungsmittel,
Wahl an Konzentrationen und Mengen an Reagentien, usw., von allgemeinerer
Anwendbarkeit sind bei der Durchführung der oben umrissenen Reaktionsabfolge,
in der man von einer Cytokininvorläuferverbindung, die eine "2-Thioxo"-Gruppe (d.h. eine 2-Mercaptogruppe)
und eine "6-Oxo"-Gruppe (d.h. eine
6-Hydroxygruppe) hat, ausgeht.
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Ähnlich sind
eine Gruppe von Cytokininvorläuferverbindungen,
die besonders gut geeignet sind für die Anwendung in der Synthese
von Cytokininglucuroniden gemäß der Erfindung,
die den Cytokininglucuronidteil (entsprechend R10 in
der allgemeinen Formel I) als -O-R10 oder
-S-R10 in der 8-Position des Purinringsystems gebunden
haben, Cytokininvorläuferverbindungen,
die, wenigstens formal (aus Gründen ähnlich den
oben im Zusammenhang mit Cytokininvorläufeverbindungen, die eine formale
2-Oxo- oder 2-Thioxogruppe und eine formale 6-Oxogruppe haben, umrissenen),
eine Oxo- (=O) oder Thioxo- (=S) gruppe an der 8-Position haben, und
die weiterhin eine Hydroxygruppe an der 6-Position haben. Diese
können
im allgemeinen in das gewünschte
Endprodukt der Formel I umgewandelt werden, indem man eine Abfolge
von Reaktionen (Schutz, Einführung
einer 6-Chlorgruppe, Einführung
des -N-R6-Teils, Entfernung der Schutzgruppen
und schließlich Reaktion
mit MBTG) verwendet, die analog zu der oben für Cytokininglucuronide, die
den Glucuronidteil als -O-R10 oder -S-R10 in der 2-Position des Purinringsystems
gebunden haben, umrissenen ist. Ein Beispiel dafür ist hierin in Beispiel 1F
für die
Synthese von N6-(2'-Isopentenyl)adenin-8-thioglucuronid
(als dessen Natriumsalz) gegeben.
-
Verbindungen
der Formel I, in denen der Glucuronidteil in der Carbonsäureform
vorliegt, können
im allgemeinen aus der entsprechenden Salzform, beispielsweise Natriumsalzform,
dargestellt werden (die auf eine bereits oben umrissene Art hergestellt
werden), indem man eine gerührte
Lösung
oder Lösung/Suspension
der Salzform in einem geeigneten Lösungsmittel (z.B. einem wässrigen
Alkohol, wie wässriges
Ethanol), vorzugsweise bei einer Temperatur unter 25 °C mit einer
Mineralsäure,
wie Salzsäure,
auf einen pH von ungefähr
2,5 ansäuert.
Nachdem man für
einige Minuten gerührt
hat, wird das Lösungsmittel
dann unter Vakuum entfernt. Der rohe Rückstand kann vorzugsweise einer
chromatographischen Behandlung unterzogen werden, um anorganische
Salze zu entfernen (siehe z.B. Beispiel 11 hierin für Details
eines typischen Verfahrens und ein geeignetes chromatographisches
Substrat für
diesen Zweck), nach der das Produkt aus einem geeigneten Lösungsmittel,
typischerweise einem polaren Lösungsmittel,
wie Methanol oder Ethanol, umkristallisiert werden kann.
-
Verbindungen
der Formel I, in denen der Glucuronidteil in der Methylester- oder
Ethylesterform vorliegt, können
im allgemeinen sehr geeignet, in hoher Ausbeute, durch Reaktion
der entsprechenden Carbonsäureform
des Cytokininglucuronids (das beispielsweise wie oben beschrieben
hergestellt wurde) mit Diazomethan beziehungsweise Diazoethan dargestellt
werden, indem man Reaktionsbedingungen anwendet, die für diesen
Reaktionstyp normal sind und die einem Fachmann gut bekannt sein
werden. Zahlreiche Cytokinine und Cytokininvorläuferverbindungen, die für eine Verwendung
als Ausgangsmaterialien im Zusammenhang mit Verfahren B), oben,
geeignet sind, sind kommerziell erhältlich, während andere nach herkömmlichen
Verfahren, die in der Literatur beschrieben sind, synthetisiert
werden können.
Beispielsweise kann eine Anzahl geeigneter N6-substituierter
Adenine, die R6-Gruppen haben, die von deren
vorliegender Definition umfasst werden, durch Literaturverfahren
erzielt werden, auf die Iwamura et al. [Phytochemistry 19 (1980)
1309] hinweisen, und zahlreiche 2-, 8- und 2,8-substituierte N6-(2'-Isopentenyl)adenine,
die R2- und/oder R8-Gruppen haben,
die durch deren vorliegende Definition umfasst werden, können wie
von Dammann et al. [Phytochemistry 13 (1974) 329] beschrieben, hergestellt
werden.
-
Gegenwärtig bevorzugte
Verbindungen der Formel I sind die folgenden:
eine Verbindung
der Formel I, worin R
2 H ist, R
3 eine β-D-Glucopyranuronosylgruppe
oder ein Salz davon an deren Carbonsäurefunktion ist, R
9 und
X halbe Bindungen sind, die zusammen eine Bindung bilden, R
6 Benzyl ist, R
7 und
Y halbe Bindungen sind, die zusammen eine Bindung bilden, und R
8 H ist;
eine Verbindung der Formel
I, worin R
2 H ist, R
3 das
Amidderivat von β-D-Glucopyranuronosyl
an dessen Carbonsäurefunktion
ist, R
9 und X halbe Bindungen sind, die
zusammen eine Bindung bilden, R
6 Benzyl
ist, R
7 und Y halbe Bindungen sind, die
zusammen eine Bindung bilden, und R
8 H ist;
eine
Verbindung der Formel I, worin R
2 H ist,
R
3 und X halbe Bindungen sind, die zusammen
eine Bindung bilden, R
9 eine β-D-Glucopyranuronosylgruppe
oder ein Salz davon an der Carbonsäurefunktion ist, R
6 Benzyl ist,
R
7 und Y halbe Bindungen sind, die zusammen
eine Bindung bilden, und R
8 H ist;
eine
Verbindung der Formel I, worin R
2 H ist,
R
3 eine β-D-Glucopyranuronosylgruppe
oder ein Salz davon an der Carbonsäurefunktion ist, R
9 und
X halbe Bindungen sind, die zusammen eine Bindung bilden, R
6 2-Isopentenyl ist, R
7 und
Y halbe Bindungen sind, die zusammen eine Bindung bilden, und R
8 H ist;
eine Verbindung der Formel
I, worin R
2 eine -S-β-D-Glucopyranuronosylgruppe
oder ein Salz davon an der Carbonsäurefunktion ist, R
9 H
ist, R
3 und X halbe Bindungen sind, die
zusammen eine Bindung bilden, R
6 2-Isopentenyl
ist, R
7 und Y halbe Bindungen sind, die
zusammen eine Bindung bilden, und R
8 H ist;
eine
Verbindung der Formel I, worin R
2 H ist,
R
9 H ist, R
3 und
X halbe Bindungen sind, die zusammen eine Bindung bilden, R
6 2-Isopentenyl ist, R
7 und
Y halbe Bindungen sind, die zusammen eine Bindung bilden, und R
8 eine -S-β-D-Glucopyranuronosylgruppe
oder ein Salz davon an der Carbonsäurefunktion ist; und
eine
Verbindung der Formel I, worin R
2 H ist,
R
3 und X halbe Bindungen sind, die zusammen
eine Bindung bilden, R
9 H ist, R
6 eine Gruppe der Formel
oder ein Salz davon ist,
R
7 und Y halbe Bindungen sind, die zusammen
eine Bindung bilden, und R
8 H ist.
-
Synthese von Verbindungen
der allgemeinen Formel II gemäß der Erfindung
-
Verbindungen
der Formel II können
einfach dargestellt werden, indem man den leicht darzustellenden Methylester
von o-Cumarsäure
(d.h. 3-(2-Hydroxyphenyl)-2-propensäure) als
Ausgangsmaterial verwendet. Der letztgenannte Ester kann durch Erhitzen
der freien Säure
(beispielsweise bezogen von Aldrich Chemical Company, Gillingham,
Dorset, England, unter Katalognummer H2,280-9) unter Rückfluss
in Methanol in Gegenwart von Schwefelsäure hergestellt werden. Es
sollte hier angemerkt werden, dass ein Gemisch der cis- und trans-Formen
(hinsichtlich der ethylenischen Doppelbindung) der Baueinheit erhalten
wird. Man glaubt, dass die trans-Form, unabhängig vom Darstellungsverfahren,
anfangs generell vorherrschend ist. Das macht jedoch nichts, da
man gefunden hat, dass sowohl die cis- (Cumarinyl) als auch die
trans- (Cumaryl-)glucuronide nach der GUS-Hydrolyse letztlich in
Cumarin umgewandelt werden, wegen der Tatsache, dass Cumarsäure über einen
Zeitraum einiger Tage (nichtenzymisch, vermutlich durch Lichtkatalyse)
langsam in Cumarin umgewandelt wird.
-
Wirksame
Verfahren für
die Synthese der Verbindungen der Formel II, in denen (a) R1 und R10 in der Carbonsäureform
und (b) R1 und R10 in
der Amidform vorliegen, sind im Detail in den hier enthaltenen Beispielen
1H beziehungsweise 1I beschrieben. Die Verbindungen) der Formel
II, in der(denen) sowohl R1 als auch R10 in der Natriumsalzform vorliegen, kann(können) geeigneterweise
durch basische Hydrolyse des Methylesters des peracetylierten Glucuronids
[hergestellt (aus Methylo-cumarat) und isoliert wie im ersten Teil
des in Beispiel 1I beschriebenen Darstellungsverfahrens] unter Verwendung
von methanolischen Natriumhydroxid auf die Weise, die am Anfang
des zweiten Teils des in Beispiel 1I beschriebenen Herstellungsverfahrens
beschrieben ist, erhalten werden; anstatt den pH des Hydrolysats
mit Salzsäure
auf 2,5 einzustellen, wie in Beispiel 1I beschrieben, wird das Gemisch
einfach mit Salzsäure
neutralisiert (auf einen pH ungefähr 7). Die Natriumsalzform
wird geeigneterweise aus dem Gemisch durch Chromatographie über, beispielsweise
nichtionisches Harz Amberlit XAD-2, isoliert, wobei die Säule mit
Wasser gewaschen wird, um anorganische Salze zu entfernen, und dann
typischerweise mit Methanol eluiert. Die rohe Glucuronid-Natriumsalzform,
die durch Entfernen des Methanols erhalten wird, kann dann geeigneterweise
aus beispielsweise absolutem Methanol umkristallisiert werden. Die
Kaliumsalzform ist natürlich
durch ein sehr analoges Verfahren darstellbar, indem man im Hydrolyseverfahren
beispielsweise methanolisches Kaliumhydroxid verwendet.
-
Verbindungen
der Formel II, in denen R1 und R10 beide in der Methylesterform vorliegen,
oder beide in der Ethylesterform vorliegen, können geeigneterweise durch
Reaktion zwischen Diazomethan beziehungsweise Diazoethan und der(den)
Verbindungen) der Formel II, in der(denen) sowohl R1 als
auch R10 in der Carbonsäureform vorliegt(vorliegen),
dargestellt werden. Die Reaktionsbedingungen hierfür sind geeigneterweise
wie oben für
die analoge Herstellung der Methyl- oder Ethylesterformen von Cytokininglucuroniden
beschrieben.
-
Gegenwärtig bevorzugte
Verbindungen der allgemeinen Formel II sind die folgenden:
eine
Verbindung der Formel II, worin R1 cis-
und/oder trans-2-Amidoethenyl [cis und/oder trans-CH=CHCONH2] ist, und R10 das
Amidderivat von (3-D-Gluco pyranuronosyl an deren Carbonsäurefunktion
ist (2-Hydroxycinnamyl-β-D-glucopyranuronamid).
eine
Verbindung der Formel II, worin R1 cis-2-Carboxyethenyl
[cis-CH=CHCOOH]
ist, und R10 eine β-D-Glucopyranuronosylgruppe
(2-Hydroxycinnamyl-β-D-glucopyranuronsäure) ist.
-
Die
Beispiele unter veranschaulichen die allgemeinen Prinzipien der
vorliegenden Erfindung in Pflanzen, insbesondere unter Verwendung
einer β-Glucuronidase
als ein Selektionsgen und unter Verwendung neuartiger Glucuronidsubstrate,
die durch dieses Gen hydrolisiert werden können. Auf der Basis dieser
Arbeit wird erwogen, dass Gene wie das β-Glucuronidasegen für eine Anzahl
verwandter Zwecke verwendet werden können. So kann das β-Glucuronidasegen
in einem Verfahren zum Erhalt eines lokalisierten oder gewebetypischen
Pflanzenwachstumsregulationseffekt in einem Pflanzenteil oder Pflanzengewebe,
das ein eingeführtes β-Glucuronidasegen
auf höherer
Stufe als andere Teile oder Gewebe in derselben Pflanze exprimiert,
angewendet werden, wobei das Verfahren umfasst, dass man die Pflanze
einer Verbindung aussetzt, die durch das eingeführte β-Glucuronidasegen hydrolisiert
werden kann, so dass die Verbindung in dem Teil oder Gewebe, das
das eingeführte β-Glucuronidasegen
enthält,
hydrolysiert wird, wodurch eine Wachstumsregulierungsverbindung
in dem Gewebe freigesetzt und nur in diesem Teil oder Gewebe eine
Wachstumsregulierungswirkung herbeigeführt wird oder in diesem Teil
oder Gewebe eine Wachstumsregulierungswirkung herbeigeführt wird, die
größer ist
als die Wirkung, die in anderen Teilen oder Geweben in der Pflanze
erhalten wird. Es wird ebenso erwogen, dass es vorteilhaft sein
kann, Pflanzenwachstumsregulatoren wie Cytokinine eher in Form von
Glucuroniden oder Glucuronidderivaten denn als freie Cytokinine
zu verwenden, beispielsweise um aus der Tatsache Vorteil zu ziehen,
dass sie, verglichen mit beispielsweise den entsprechenden freien
oder ribosylierten Cytokininen, in Pflanzen vermutlich anders transportiert
und verteilt würden.
-
Ähnlich schlagen
die Beispiele unten bestimmte andere Verwendungen für β-Glucuronidase
vor. Eine davon ist ein in vitro-Verfahren, um Cytokininglucuronidverbindungen
(oder Glucuronidverbindungen anderer Pflanzenwachstumsregula toren),
die in vivo durch ein eingeführtes β-Glucuronidasegen
hydrolisiert werden können,
zu screenen und zu identifizieren. β-Glucuronidase kann auch in
einem System zum Screenen von Verbindungen verwendet werden, die
für die
Verwendung als Selektionsreagentien in dem hier offenbarten positiven
Selektionsverfahren geeignet sind (siehe Beispiel 2). In den Beispielen
3 und 12 sind Systeme beschrieben, die für das Screenen von Verbindungen
verwendet werden können,
die selektiv ein natives β-Glucuronidaseenzym
in Pflanzenzellen hemmen, ohne die Aktivität eines Enzyms, das durch ein
eingeführtes β-Glucuronidasegen
codiert ist, zu beeinträchtigen.
-
BEISPIEL 1
-
SYNTHESE VON
GLUCURONIDVERBINDUNGEN
-
Die
Synthese einer Anzahl neuartiger Glucuronidverbindungen ist im folgenden
beschrieben. Zusätzlich
zu den Abkürzungen,
die für
jede der einzelnen synthetisierten Verbindungen angegeben sind,
werden die folgenden Abkürzungen
verwendet:
- BA
- N6-Benzyladenin
- AcOH
- Essigsäure
- DMF
- N,N-Dimethylformamid
- IP
- N6-(2-Isopentenyl)adenin
- MBTG
- Methyl-(2,3,4-tri-O-acetyl-α-D-glucopyranosylbromid)uronat
-
BEISPIEL 1A
-
3-β-Glucopyranuronosyl-6-benzylaminopurin-Natriumsalz
-
- Synonyme: N6-Benzyladenin-N3-β-D-glucopyranuronsäure-Natriumsalz,
N6-Benzyladenin-3-glucuronid-Natriumsalz
- Abkürzung:
BA3GN-Natriumsalz
-
-
Kondensation von N6-Benzyladenin (BA) und Methyl-(2,3,4-tri-O-acetyl-α-D-glucopyranosylbromid)uronat (MBTG)
-
BA
(12,6 mmol) und MBTG (15,1 mmol) (Bollenback et al., 1955, J. Amer.
Chem. Soc., Vol. 77, S. 3310-3315) wurden in wasserfreiem N,N-Dimethylformamid
(DMF) (50 ml) suspendiert und für
ungefähr
10 Std. auf 100 °C
erhitzt. Das meiste DMF wurde unter Vakuum entfernt, und das Rohprodukt
in Chloroform (300 ml) gelöst
und mit Wasser (3 × 300
ml) verteilt. Nach dem Trocknen über
wasserfreiem Magnesiumsulfat wurde der Chloroformextrakt unter Vakuum
abgedampft und eine dunkle sirupartige Flüssigkeit aus Ethanol umkristallisiert.
Das Rohprodukt (ein Gemisch aus BA, BA9GN und BA3GN als deren peracetylierte
Methylester) wurde gereinigt über
100 g Kieselgel, gepackt in Chloroform, eluiert mit einem Gradienten
von 0-4% Ethanol in Chloroform. Der rohe Peracetyl-BA3GN-methylester
wurde aus Ethanol umkristallisiert. Ausbeute: 280 mg eines farblosen,
amorphen Feststoffs.
-
Peracetyl-BA3GN-methylester
wurde durch Behandlung mit 5%igem Natriumhydroxid in 50%igem wässrigem
Ethanol bei Raumtemperatur hydrolisiert. Fünf Minuten, nachdem der Feststoff
sich gelöst
hatte, wurde das Reaktionsgemisch vorsichtig mit Salzsäure unter
Eiskühlung
neutralisiert. Nach dem Trocknen unter Vakuum wurde das rohe BA3GN-Natriumsalz
durch Reversed-phase-Chromatographie (über 100 g Octadecylkieselgel)
gereinigt, indem mit Wasser (1 l) und anschließend mit 20%igem wässrigem
Methanol eluiert wurde, anschließend aus Ethanol umkristallisiert
wurde. Reines BA3GN-Natriumsalz (150 mg) wurde als farbloser, mikrokristalliner
Feststoff erhalten, der bis zur Gewichtskonstanz über Calciumchlorid
unter Vakuum getrocknet wurde.
-
-
Diese
Werte sind mit den Literaturwerten für BA-3-β-D-glucuropyranosid und N3, N6-disubstituierte Adenine
identisch (N J Leonard, K L Carraway und J P Helgeson, J. Heterocyclic
Chem. 1965, 2, 291-297).
-
HPLC
-
HPLC
wurde durchgeführt
unter Verwendung einer 10 × 0,46
cm Säule
mit Octadecylkieselgel, isokratischer Eluierung mit 60%igem Methanol,
das 10% Essigsäure
enthielt, bei 1 ml/min. UV-Überwachung
bei 290 nm.
-
BA3GN-Natriumsalz
hatte eine Reinheit von 95+% und einen auf < 0,05% geschätzten Gehalt an freiem BA.
-
Hydrolyse durch β-Glucuronidase
(GUS)
-
Das
BA3GN-Natriumsalz (500 μg)
in 500 μl
eines 50 mM Natriumphosphatpuffers, pH 7,0, wurde mit β-Glucuronidase
(GUS, Sigma Typ G7896), 2500 Sigma "Fishman"-Einheiten 18 Stunden lang bei 37 °C inkubiert.
HPLC (Bedingungen wie oben) zeigte nahezu vollständiges Verschwinden des BA3GN-Peaks
bei gleichzeitigem Erscheinen eines Peaks, der in einem 1:1-Gemisch
mit authentischem BA cochromatographierte. Das bestätigt die
Identität
des Produkts als Konjugat aus BA und β-D-Glucuronsäure.
-
Die
folgende Analyse wurde für
einen anderen Anteil des BA3GN-Natriumsalzes erhalten, das wie oben
beschrieben hergestellt wurde:
-
HPLC
-
15 × 0,46 cm
Octadecylkieselgel, eluiert mit einem Gradienten von 20-60% Methanol/10%
Essigsäure über 30 min
bei 1 ml/min. HPLC-Reinheit 99,5%. Gehalt an freiem BA < 0,05%.
-
DC
-
Kieselgel,
entwickelt mit 1-Butanol/Essigsäure/Wasser
(12/3/5). DC-Reinheit 99,5%, Gehalt an freiem BA < 0,05%.
-
Hydrolyse durch β-Glucuronidase
(GUS)
-
BA3GN-Natriumsalz
(500 μg)
in 500 μl
eines 50 mM Natriumphosphatpuffers, pH 7,0, wurde mit β-Glucuronidase
(GUS, Sigma Typ G7896), 2500 Sigma "Fishman"-Einheiten
12 Stunden lang bei 37 °C
inkubiert. HPLC und DC zeigten nahezu vollständiges (> 99%) Verschwinden des BA3GN, wobei sich
eine Verbindung ergab, die in einem 1:1-Gemisch mit authentischem
BA cochromatographierte.
-
BEISPIEL 1B
-
3-β-D-Glucopyranuronamido-6-benzylaminopurin
-
- Synonyme: N6-Benzyladenin-N3-β-D-glucopyranuronamid
N6-Benzyladenin-3-glucuronamid
- Abkürzung:
BA3Gnamid
-
-
Synthese
-
Umkristallisierter
Peracetyl-BA3GN-methylester (1,5 g), der wie in Beispiel 1A hergestellt
wurde, wurde in wasserfreiem Methanol (200 ml) suspendiert und auf
0 °C abgekühlt. Weiteres
wasserfreies Methanol (400 ml), gesättigt mit wasserfreiem Ammoniak
bei –10 °C, wurde
zugegeben, und das Gemisch wurde auf Eis gerührt. Weiteres eiskaltes wasserfreies
Methanol wurde zugegeben, bis sich der Feststoff vollständig löste. Das
Reaktionsgemisch wurde weitere 3 h auf Eis gerührt. Überschüssiger Ammoniak und Methanol
wurden unter Vakuum entfernt und das Produkt wurde gründlich mit
heißem
Ethanol verrieben, wobei sich ein farbloser Feststoff ergab (1,3
g).
-
BA3GNamid
ist, genauso wie andere Adenin-3-glycoside, nur spärlich in
Wasser oder Alkohol löslich, aber
löst sich
zu 2,4 mg/ml in 50%igem wässrigem
Methanol, das 25% Essigsäure
enthält.
-
Analyse
-
DC (Kieselgel-Chloroform/Methanol/Eisessig,
50/50/5)
-
Einzelner
UV-Spot (Rf 0,36) ohne nachweisbare Verunreinigungen bei 50 μg Beladung.
Reinheit 98+%. Kein nachweisbarer (< 1 %) Peracetyl-BA3GN-methylester (Rf
0,89) oder BA3GN (Rf 0,02).
-
DC (Kieselgel-Chloroform/Methanol,
9/1)
-
Angewendet,
um auf BA-Gehalt zu testen. BA3GNamid bei 129 μg Beladung zeigte kein nachweisbares
6-Benzyladenin. BA-Gehalt deshalb < 0,2%.
-
BEISPIEL 1C
-
9-β-D-Glucopyranuronosyl-6-benzylaminopurin-Natriumsalz
-
- Synonyme: N6-Benzyladenin-N9-β-D-glucopyranuronsäure-Natriumsalz
N6-Benzyladenin-9-glucuronid-Natriumsalz
- Abkürzung:
BA9GN-Natriumsalz
-
-
Synthese
-
Verfahren 1
-
Katalytische Oxidation
von N6-Benzyladenin-9-β-D-glucopyranosid (BA9G)
-
BA9G
(50 mg) wurde in 50 mM Natriumbicarbonat (25 ml) mit Platinmohr
(200 mg) suspendiert. Die Mischung wurde auf einem Wasserbad auf
80 °C erhitzt,
während
ein kräftiger
Sauerstoffstrom durchgeleitet wurde. Nach 4 Stunden wurden weitere
100 mg Platinkatalysator zugegeben. Nach 20 Stunden Behandlung waren
ungefähr
95+% des BA9G in die entsprechende 9-β-D-Glucopyranonsäure und
etwas BA umgewandelt. Das Gemisch wurde neutralisiert, und das Produkt
BA9GN-Natriumsalz
durch Reversed-phase-Chromatographie gereinigt (über 20 g Octadecylkieselgel),
indem mit 200 ml Wasser und anschließend 20%igem MeOH eluiert wurde.
-
Reines
BA9GN-Natriumsalz, frei von Glucosid und BA, wurde über Calciumchlorid
unter Vakuum zu einem farblosen Feststoff getrocknet.
-
Verfahren 2
-
Kondensation von 6-Chlorpurin
und Methyl-(2,3,4-tri-O-acetyl-α-D-Glucopyranosylbromid)uronat
(MBTG)
-
6-Chlorpurin
(getrocknet über
Phosphorpentoxid, 1,13 g), MBTG (3,87 g) und frisch getrocknetes
Kaliumcarbonat (1,5 g) wurden in wasserfreiem Propylencarbonat 30
ml) bei Raumtemperatur 24 Stunden lang gerührt. Das dunkle Gemisch wurde filtriert
und durch Säulenchromatographie über Kieselgel
(100 g) gereinigt, indem mit einem 0-80% Gradienten von Ethylacetat
in Chloroform eluiert wurde. Die Hauptfraktion (von nicht umgesetztem
6-Chlorpurin verschieden) wurde getrocknet und aus kochendem Ethanol
umkristallisiert, wobei sich Methyl-6-chlorpurin-9-(2',3',4'-tri-O-acetyl-β-D-glucopyranuronat)
als schwachgelben Feststoff (450 mg) ergab, der über Phosphorpentoxid unter
Vakuum getrocknet wurde. HPLC ergab eine Reinheit von 95+%.
-
Methyl-6-chlorpurin-9-(2',3',4'-tri-O-acetyl-β-D-glucopyranuronat)
(312 mg) und Benzylamin (171 μl) wurden
zusammen in 1-Butanol (13,5 ml) bei 100 °C 1 Stunde lang erhitzt. Der
Feststoff löste
sich einfach, wobei sich eine klare gelbe Flüssigkeit ergab. Das meiste
Butanol wurde unter Vakuum entfernt, um einen weißlichen
Feststoff zu ergeben, der mit 5%igem Natriumhydroxid in 50%igem
wässrigem
Ethanol (25 ml) 1-2 Stunden lang bei Raumtemperatur geschüttelt wurde.
Nach Neutralisation wurde das Produkt unter Vakuum getrocknet, um
Spuren von Butanol zu entfernen, und das rohe BA9GN-Natriumsalz
wurde durch Reversed-phase-Chromatographie
wie in Verfahren 1 gereinigt.
-
Das
reine Produkt wurde unter Vakuum über Calciumchlorid und Phosphorpentoxid
getrocknet, um einen farblosen Feststoff zu ergeben (210 mg), der
mit BA9GN, das durch katalytische Oxidation dargestellt worden war,
cochromatographierte.
-
Analyse
von BA9GN-Natriumsalz, hergestellt durch Kondensationsreaktion von
Verfahren 2
-
Diese
Ergebnisse stimmen überein
mit der Struktur eines N6,N9-disubstituierten
Adenins. Die Extinktionskoeftizienten sind nahezu die gleichen wie
für reines
BA9G, was Abwesenheit nicht-UV-absorbierender Verunreinigungen anzeigt.
UV-Reinheit 95+%.
-
HPLC
-
10 × 0,46 cm
Octadecylkieselgelsäule,
UV-Monitor bei 270 nm. Isokratische (50% Methanol/0,2 M Essigsäure, 2 ml/min)
und Gradienten-HPLC (0-60% Methanol/0,2 M Essigsäure, 2 ml/min) zeigen einen
scharfen, symmetrischen Peak für
BA9GN, das genau vor dem entsprechenden Glucosid eluiert wird. BA9GN,
das durch Kondensationsreaktion hergestellt wurde, cochromatographiert
bei der HPLC (Gradienten- und isokratische) in einem 1:1-Gemisch
mit BA9GN, das durch katalytische Oxidation hergestellt wurde. Dies
bestätigt, dass
BA9GN, das durch die Kondensationsreaktion hergestellt wurde, das β-D-Glucopyranosylisomer
ist. BA9GN enthält
kein nachweisbares (< 2%) α-Anomer oder
andere Verunreinigungen, einschließlich BA. HPLC-Reinheit des
BA9GN 98+%.
-
DC (Kieselgel-Chloroform/Methanol,
9/1)
-
Wurde
angewendet, um BA-Verunreinigung des BA9GN-Produktes zu messen.
BA9GN bewegt sich in diesem System nicht vom Ausgangsfleck. Mindestnachweisgrenze
von BA = 200 ng. BA9GN bei 200 μg
Beladung zeigt kein nachweisbares BA oder andere Verunreinigungen.
DC-Reinheit 98+%. BA-Gehalt < 0,1%.
-
Saure Hydrolyse
-
Mineralsäure wandelt
Cytokininglucoside in die entsprechenden freie Cytokininbase um.
Behandlung von BA9GN-Natriumsalz (1 mg/ml) mit 1 M Salzsäure bei
100 °C über Nacht
ergab einen einzigen Spot bei der DC, der mit authentischem BA cochromatographierte.
Dieser Test bestätigte,
dass BA9GN ein säureempfindliches
Konjugat von BA ist.
-
Enzymatische
Hydrolyse
-
BA9GN-Natriumsalz
(500 μg)
in 500 μl
eines 50 mM Natriumphosphatpuffers, pH 7,0, wurde mit Sigma β-Glucuronidase
(GUS, Typ G7896), 2500 "Fishman"-Einheiten 18 Stunden
lang bei 37 °C
inkubiert. HPLC und DC zeigten keine nachweisbare Herstellung von
BA. Weitere Inkubierung bei Raumtemperatur für 3 Tage zeigte keine Hydrolyse.
BA9GN ist deshalb nicht empfänglich
für Hydrolyse
durch β-Glucuronidase.
-
BEISPIEL 1D
-
3-β-D-Glucopyranuronosyl-6-(3-methyl-but-2-enylamino)purin-Natriumsalz
-
- Synonyme: N6-(2'-Isopentenyl)adenin-N3-β-D-glucopyranuronsäure-Natriumsalz
N6-(2'-Isopentenyl)adenin-3-glucuronid-Natriumsalz
- Abkürzung:
IP3GN-Natriumsalz
-
-
Synthese
-
N6-(2-Isopentenyl)adenin (9,48 g) und MBTG
(22,1 g) wurden in wasserfreiem DMF (179 ml) 12 Stunden lang auf
100 °C erhitzt.
Das meiste DMF wurde auf einem siedenden Wasserbad unter Vakuum
entfernt, und die abgekühlte
sirupartige Flüssigkeit
wurde in Chloroform (500 ml) aufgenommen. Die Chloroformlösung wurde
mit Wasser extrahiert (3 × 500
ml) und der organische Extrakt über
wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Das meiste Chloroform wurde
unter Vakuum entfernt, und die sirupartige Flüssigkeit wurde chromatographisch über Kieselgel,
das mit einem Gradienten von 0 bis 3,75% Methanol in Chloroform
entwickelt wurde, gereinigt Der rohe Peracetyl-IP3GN-methylester
wurde aus Methanol mit Aktivkohleentfärbung umkristallisiert, um
reinen, farblosen Peracetyl-IP3GN-methylester (3,2 g) zu erhalten, der
unter Vakuum über
Calciumchlorid getrocknet wurde. Ein Teil des Peracetyl-IP3GN-methylesters
(1,2 g) wurde durch Auflösen
in ungefähr
1 l 75%igem wässrigem
Methanol, das 5% Natriumhydroxid enthielt, und Rühren des Gemisches für 10 min
bei Raumtemperatur hydrolysiert. Das Gemisch wurde auf Eis gekühlt, vorsichtig
mit Salzsäure
neutralisiert und unter Vakuum auf eine sirupartige Flüssigkeit
eingeengt. Das Rohprodukt wurde durch aufeinanderfolgende Chromatographie über XAD-2
Harz und Octadecylkieselgel gereinigt, um IP3GN-Natriumsalz als
farblosen, mikrokristallinen Feststoff zu ergeben, der über Calciumchlorid
(810 mg) getrocknet wurde.
-
IP3GN-Natriumsalz
ist in Wasser zu 2 mg/ml löslich.
-
Analyse
-
DC (Kieselgel-1-Butanol/Eisessig/Wasser,
12/3/5
-
IP3GN-Natriumsalz
gibt einen einzelnen, scharfen Spot (Rf = 0,32) bei 100 μg Beladung
ohne nachweisbares N6-(2-isopentenyl)adenin
(IP) (Rf = 0,66) oder andere Verunreinigungen. Reinheit 99,5+%.
-
Hydrolyse durch β-Glucuronidase
(GUS)
-
IP3GN-Natriumsalz
(500 μg)
in 500 μl
eines 50 mM Natriumphosphatpuffers, pH 7,0, wurde mit β-Glucuronidase
(GUS, Sigma Typ G7896), 2500 Sigma "Fishman"-Einheiten
12 Stunden lang bei 37 °C
inkubiert. DC zeigte das Verschwinden des UV-Spots von IP3GN bei gleichzeitigem Auftreten
eines neuen UV-Spots, der mit authentischem IP cochromatographierte.
-
BEISPIEL 1E
-
6-(3-Methyl-but-2-enylamino)purin-2-yl-1-thio-β-D-glucopyranuronsäure-Natriumsalz
-
- Synonyme: N6-(2'-Isopentenyl)adenin-2-thioglucopyranuronsäure-Natriumsalz
N6-(2'-Isopentenyl)adenin-2-thioglucuronid-Natriumsalz
- Abkürzung:
IP2SGN-Natriumsalz
-
-
Synthese
-
1. 2-Benzylthio-6-purinol
-
Benzylchlorid
(1,4 ml) wurde tropfenweise unter starkem Rühren zu einer Lösung von
2 g 2-Thioxanthin in 12 ml 1 M Natriumhydroxid, das mit Wasser auf
140 ml verdünnt
war, zugefügt.
Nachdem alles zugegeben war, bildete sich ein cremefarbener Niederschlag.
Das Reaktionsgemisch wurde eine weitere Stunde bei Raumtemperatur
gerührt
und filtriert. Der Feststoff wurde gründlich mit Wasser gewaschen
und über
Nacht unter Vakuum über
Calciumchlorid, und bis zur Gewichtskonstanz über Phosphorpentoxid getrocknet.
Das Rohprodukt (2 g) wurde im nächsten
Schritt direkt ohne Umkristallisieren verwendet.
-
2. 2-Benzylthio-6-chlorpurin
-
2-Benzylthio-6-purinol
(2 g) wurde mit einem Gemisch aus Phosphoroxychlorid (20 ml) und
Diethylanilin (2 ml) bedeckt. Das Gemisch wurde unter Rühren für 1 Stunde
am Rückfluss
gekocht, abgekühlt
und auf Eis (100 g) geschüttet.
Es bildete sich ein gelber Niederschlag, der filtriert, gründlich mit
Wasser gewaschen und unter Vakuum getrocknet wurde. Das Rohprodukt
wurde aus Methanol umkristallisiert, um einen leicht cremefarbigen
Feststoff zu ergeben (1,2 g), der auf Gewichtskonstanz über Phosphorpentoxid
getrocknet wurde.
-
3. 2-Benzylthio-N6-(2-isopentenyl)adenin
-
Eine
Mischung aus 2-Benzylthio-6-chlorpurin (1,2 g) und Isopentenylaminhydrochlorid
(1,04 g) in 1-Butanol (25 ml), das Triethylamin (2,2 ml) enthielt,
wurde in einem verschlossenen Rohr bei 110 °C 2 Stunden lang erhitzt. Das
Butanol wurde unter Vakuum entfernt und die Mischung mit Eiswasser
(100 ml) geschüttelt.
Das Produkt wurde filtriert, aus Ethanol mit Aktivkohleentfärbung umkristallisiert
und unter Vakuum mit Phosphorpentoxid getrocknet. Ausbeute 0,64
g. Ausbeute 1,3 g 2-Benzylthio-N6-(2-isopentenyl)adenin als farbloser Feststoff.
Das Rohprodukt wurde im nächsten
Schritt direkt weiterverwendet.
-
4. 2-Thio-N6-(2-isopentenyl)adenin
-
2-Benzylthio-N6-(2'-isopentenyl)adenin
(0,64 g) wurden in flüssigem
Ammoniak (62,5 ml) gelöst,
um eine klare gelbe Lösung
zu ergeben. Natrium (ungefähr
200 mg) wurde in kleinen Stücken
zugegeben, bis eine blaue Färbung
für 10
min bestehen blieb. Eine kleine Menge festes Ammoniumchlorid wurde
vorsichtig zugegeben, um überschüssiges Natrium
zu entfernen, und man ließ den
Ammoniak bis auf ein kleines Volumen verdampften. Diethylether (65,5
ml) wurde zugegeben, und der Etherextrakt wurde mit Wasser (62,5
ml) extrahiert. Der wässrige
Extrakt wurde mit Essigsäure
auf einen pH zwischen 4 und 5 eingestellt, wo sich ein cremiger
Feststoff abschied. Nach Kühlung
wurde das Produkt abfiltriert und unter Vakuum über Phosphorpentoxid getrocknet.
Ausbeute 340 mg.
-
Rohes
2-Thio-N6-(2-isopentenyl)adenin wurde in
das Kaliumsalz umgewandelt durch Suspension in Wasser und Zugabe
einer äquimolaren
Menge von Kaliumhydroxid zusammen mit ausreichend Alkohol, um Auflösung zu
bewirken. Die Lösung
wurde unter Vakuum und über
Phosphorpentoxid getrocknet.
-
5. N6-(2-isopentenyl)adenin-2-thioglucopyranuronid
-
Das
Kaliumsalz von 2-Thio-N6-(2-isopentenyl)adenin
(2,89 mmol) wurde in wasserfreiem Methanol gelöst, und MBTG (5 mM) wurde zugegeben.
Das Gemisch wurde 24 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt, währenddessen
sich ein cremiger weißer
Feststoff niederschlug. Das Reaktionsgemisch wurde unter Vakuum getrocknet
und bei Raumtemperatur durch Behandlung mit 5%igem wässrigen
Natriumhydroxid (50 ml) hydrolysiert, um das freie Glucopyranuronid
als Natriumsalz zu ergeben. Das Gemisch wurde durch die vorsichtige Zugabe
von konzentrierter Salzsäure
mit Kühlung
von außen
neutralisiert, um einen farblosen Niederschlag des rohen IP2SGN-Natriumsalzes
zu ergeben.
-
Das
Rohprodukt wurde durch Reversed-phase-Chromatographie gereinigt,
aus Ethanol umkristallisiert und unter Vakuum über Calciumchlorid getrocknet,
um einen farblosen, amorphen Feststoff (150 mg) zu ergeben. Das
Produkt war spärlich
in 50%igem wässrigen
Alkohol löslich.
-
-
IP2SGN-Natriumsalz
zeigte das charakteristische UV-Spektrum von 2-thiosubstituierten
Cytokininen, und das Spektrum war sehr ähnlich dem von authentischem
2-Methylthio-N6-(2-isopentenyl)adenin. UV-Analyse
bestätigte
das Produkt als ein 2-N6-disubstituiertes
Adenin.
-
HPLC
-
Für HPLC wurde
eine 15 × 0,46
Octadecylkieselgelsäule
verwendet, die mit einem Gradienten von 0-60% Methanol, das 0,2
M Essigsäure
enthielt, über
30 min bei 1 ml/min. eluiert wurde. UV-Überwachung bei 270 nm.
-
IP2SGN-Natriumsalz
hatte eine Reinheit von 98+% und enthielt kein nachweisbares freies 2-Thio-N6-(2-isopentenyl)adenin (< 0,1 %).
-
Hydrolyse durch β-Glucuronidase
(GUS)
-
IP2SGN-Natriumsalz
(500 μg)
in 500 μl
eines 50 mM Natriumphosphatpuffers, pH 7,0, wurde mit β-Glucuronidase
(GUS, Sigma Typ G7896), 2500 Sigma "Fishman"-Einheiten
48 Stunden lang bei 37 °C
inkubiert. HPLC (Bedingungen wie oben) zeigte teilweises Verschwinden
(65%) von IP2SGN, wobei ein Peak entstand, der in einem 1:1-Gemisch
mit 2-Thio-N6-(2-pentenyl)adenin cochromatographierte.
Dieser Test bestätigt die
Identität
von IP2SGN-Natriumsalz als Konjugat von 2-Thio-N6-(2-isopentenyl)-adenin
und β-D-Glucuronsäure, teilweise
empfänglich
für GUS-Hydrolyse.
-
BEISPIEL 1F
-
6-(3-Methyl-but-2-enylamino)purin-8-yl-1-thio-β-D-glucopyranuronsäure-Natriumsalz
-
- Synonyme: N6-(2'-Isopentenyl)adenin-8-thioglucopyranuronsäure-Natriumsalz
N6-(2'-Isopentenyl)adenin-8-thioglucuronid-Natriumsalz
- Abkürzung:
IP8SGN-Natriumsalz
-
-
Reaktion 1
-
6-Hydroxy-8-thiopurin
-
4,5-Diamino-6-hydroxypyrimidinsulfat
(25 g) und Thioharnstoff (100 g) wurden zusammen gemahlen und auf
einem Ölbad
30 min lang bei 200 °C
erhitzt. Das abgekühlte,
verfestigte Produkt wurde in heißer 1 m NaOH (500 ml) gelöst, mit
Aktivkohle aufgekocht und filtriert. Das heiße Filtrat wurde mit cHCl angesäuert, und die
heiße
Lösung
wurde abfiltriert, um einen roten Feststoff zu ergeben, der aus
einer heißen
basischen Lösung
nochmals ausgefällt,
gut mit Wasser gewaschen und unter Vakuum bei 80 °C getrocknet
wurde. Ausbeute 5,28 g.
-
-
Reaktion 2
-
6-Hydroxy-8-benzylthiopurin
-
5,28
g 6-Hydroxy-8-thiopurin wurden in 78,5 ml 1 M NaOH suspendiert und
auf 400 ml mit Wasser verdünnt.
3,7 ml Benzylchlorid wurden zugegeben, und das Reaktionsgemisch
wurde 3 Stunden bei Raumtemperatur kräftig gerührt, mit Eisessig auf pH 5
eingestellt und filtriert. Das Produkt wurde gründlich mit Wasser gewaschen
und über
Nacht unter Vakuum bei 80 °C
getrocknet, um 7,33 g eines lachsrosa Feststoffs zu ergeben, der
ohne weitere Reinigung weiterverwendet wurde.
-
Reaktion 3
-
6-Chlor-8-benzylthiopurin
-
6-Hydroxy-8-benzylthiopurin
(7,33 g) wurde zu einer Mischung von Phosphoroxychlorid (70 ml)
und N,N-Diethylanilin (7,5 ml) zugegeben, und das Gemisch wurde
2 Stunden am Rückfluss
gekocht, um ein dunkelrotes Produkt zu ergeben. Das Gemisch wurde
unter Vakuum aufkonzentriert, und die sich ergebende sirupartige
Flüssigkeit
wurde langsam unter Rühren
auf Eis (400 g) geschüttet.
Das Gemisch wurde 15 min stehen gelassen, dann mit kalter konzentrierter
KOH stark alkalisch gemacht. Die Mischung wurde gründlich verrieben,
um das meiste der sirupartigen Flüssigkeit zu lösen, und
auf pH 1 durch langsame Zugabe kalter konzentrierter HCl gesäuert, wobei
immer noch überschüssiges Eis
vorhanden war.
-
Nach
Stehen für
1 Stunde bei Raumtemperatur wurde das Produkt abfiltriert, gründlich mit
Wasser gewaschen und unter Vakuum bei 80 °C für 2 Stunden getrocknet, um
7,8 g Produkt zu ergeben.
-
Reaktion 4
-
8-Benzylthio-N6-(2'-isopentenyl)adenin
-
Ein
Gemisch aus 6-Chlor-8-benzylthiopurin (3,9 g) und Isopentenylaminhydrochlorid
(3,42 g) in 1-Butanol (100 ml), das Triethylamin enthielt (7,5 ml),
wurde 2 Stunden lang am Rückfluss
gekocht. Das meiste Butanol wurde unter Vakuum entfernt, und das
Reaktionsgemisch wurde auf Eis gekühlt und mit Wasser (400 ml) geschüttelt. Nach
Kühlung über Nacht
wurde das Gemisch filtriert, um ein Rohprodukt zu ergeben, das durch Chromatographie über 100
g Kieselgel, das mit einem Gradienten von 0-2,5% MeOH in Chloroform
eluiert wurde, gereinigt wurde. Das chromatographisch reine Produkt
wurde aus Methanol umkristallisiert, um 1,18 g eines farblosen,
amorphen Feststoffs zu ergeben.
-
Analyse
-
DC (Kieselgel-2,5% Methanol/Chloroform)
-
- Reinheit 98+%. Keine nachweisbaren Verunreinigungen.
-
-
Reaktion 5
-
8-Thio-N6-(2'isopentenyl)adenin
-
8-Benzylthio-N6-(2'isopentenyl)adenin
(1,18 g) wurde in flüssigem
Ammoniak (125 ml) gelöst,
um eine klare gelbe Lösung
zu ergeben. Natrium wurde in kleinen Stücken zugegeben, bis eine blaue
Färbung
für 15 min
bestehen blieb. Eine kleine Menge festes Ammoniumchlorid wurde vorsichtig
zugegeben, um überschüssiges Natrium
zu entfernen. Der Ammoniak wurde auf einer heißen Platte auf ein kleines
Volumen abgedampft, und Ether (125 ml) zugegeben.
-
Nachdem
das meiste des verbliebenen Ammoniaks sich verflüchtigt hatte, wurde der Etherextrakt
mit Wasser (2 × 65
ml) extrahiert. Der wässrige
Extrakt (bei pH 12-13) wurde auf Eis gekühlt und mit Eisessig auf pH
5 eingestellt. Ein cremiger weißer
Feststoff schied sich ab, der filtriert, gründlich mit Wasser gewaschen
und über
Nacht über
Calciumchlorid getrocknet wurde, um ein nahezu weißes, sehr
leichtes Pulver zu ergeben. Ausbeute 760 mg.
-
Anmerkung:
8-Thio-N6-(2'isopentenyl)adenin wird in alkalischer
Lösung
leicht oxidiert.
-
Analyse
-
HPLC
-
- (15 cm Oktadecylkieselgel, 0-80% Methanol/0,2 M Eisessig,
30 min., 1 ml/min., UV-Überwachung
bei 300 nm)
- Scharfer, symmetrischer Peak ohne nachweisbare Verunreinigungen.
Reinheit 98+%.
-
-
Reaktion 6
-
IP8SGN-Natriumsalz
-
8-Thio-N6-(2'isopentenyl)adenin
(600 mg) wurden in 50 mM Kaliumhydroxid (102 ml), das 1 % 2-Mercaptoethanol
als Oxidationsmittel enthielt, suspendiert. Ausreichend Alkohol
wurde zugegeben, um den Feststoff zu lösen. Die Lösung wurde unter Vakuum über Calciumchlorid,
gefolgt von Phosphorpentoxid getrocknet. Das trockene Produkt wurde
in wasserfreiem Methanol (100 ml), das 2-Mercaptoethanol (50 μl) enthielt, gelöst, und
MBTG (2 g) wurde zugegeben. Das Gemisch wurde 24 Stunden bei Raumtemperatur
gerührt
und unter Vakuum über
Calciumchlorid und Phosphorpentoxid getrocknet. Der geschützte Ester
wurde 1 Stunde lang bei Raumtemperatur in 50 ml 5%igem Natriumhydroxid
hydrolisiert.
-
Nach
Neutralisation mit konzentrierter Salzsäure wurde das Rohprodukt durch
Reversed-phase- und Normal-phase-Chromatographie gereinigt, um einen
farblosen Feststoff zu ergeben, der auf Gewichtskonstanz über Calciumchlorid
getrocknet wurde. Ausbeute 190 mg.
-
Analyse
von IP8SGN-Natriumsalz
-
DC (Kieselgel-Chloroform/Methanol,
1/1)
-
Das
IP8SGN-Natriumsalz zeigte bei Beladungen von 34, 68, 102 und 134 μg einen einzelnen
scharfen Spot ohne nachweisbare Verunreinigungen. Reinheit 99,5+%.
Gehalt an freier Cytokininbase, 8-Thio-N6-(2'isopentenyl)adenin < 0,1 %.
-
HPLC
-
- (15 cm Oktadecylkieselgel, 0-80% Methanol/0,2 M Eisessig,
30 min., 1 ml, 300 nm)
- Einzelner, breiter Peak, tR 18,2 min. Keine Verunreinigungen
nachweisbar. Reinheit 99,5+%.
-
GUS Hydrolyse
-
IP8SGN-Natriumsalz
zu 1 mg/ml wurde mit 2500 Einheiten GUS (Sigma) in 50 mM Phosphatpuffer, pH
7, bei 37 °C
24 Stunden lang inkubiert. DC (1/1, Methanol/Chloroform) zeigte
vollständige
(> 95%) Umwandlung
des IP8SGN-Natriumsalzes in eine Verbindung, die mit 8-Thio-(2'isopentenyl)adenin
cochromatographierte. IP8SGN-Natriumsalz ist deshalb empfänglich für GUS-Hydrolyse.
-
BEISPIEL 1G
-
O-β-D-Glucopyranuronosylzeatin-Natriumsalz
-
- Synonyme: Zeatin-O-β-D-Glucopyranuronsäure-Natriumsalz
Zeatin-O-Glucuronid-Natriumsalz
- Abkürzung:
ZOGN-Natriumsalz
-
-
Synthese
-
Trans-2-Methyl-4-phthalimidobut-2-enyl-(2',3',4'-tri-O-acetyl-β-D-glucopyranuronsäuremethylester
-
Trans-1-Hydroxy-2-methyl-4-phthalimido-but-2-en
(1,87 g, Corse & Kuhnle,
1972, Synthesis, S. 618-619) und frisch aktiviertes Silbercarbonat
(9 g) wurden in wasserfreiem Ether (300 ml), der Molekularsieb enthielt
(9 g), suspendiert. Nach Rühren
für 30
min bei Raumtemperatur wurde MBTG (3,24 g) zugegeben, und das Gemisch
wurde im Dunkeln 2 Tage bei Raumtemperatur gerührt. Weiteres MBTG (1,62 g)
wurde zugegeben, und das Gemisch wurde für weitere 2 Tage gerührt. Das
Reaktionsgemisch wurde filtriert, unter Vakuum zu einer farblosen
sirupartigen Flüssigkeit
getrocknet, die weiter unter Vakuum über Calciumchlorid getrocknet wurde,
um einen farblosen, pulverisierbaren Schaum zu ergeben. Das Rohprodukt
wurde durch Chromatographie über
Kieselgel (200 g), das mit Chloroform eluiert wurde, von Zuckerverunreinigungen
befreit. Ausbeute an reinem Produkt war 2,45 g (55,4%).
-
Trans-2-Methyl-4-amino-but-2-enyl-β-D-glucopyranosyluronamid
-
Methyl-trans-2-methyl-4-phthalimidobut-2-enyl-(2',3',4'-tri-O-acetyl-β-D-glucopyranuronat
(2,45 g) wurde in wasserfreiem Methanol (150 ml) gelöst, auf
Eis gekühlt,
und Ammoniak wurde 6 Stunden lang durch das eisgekühlte Gemisch
durchgeleitet. Nach Entfernen des Methanols unter Vakuum wurde das
Rohprodukt durch Chromatographie über Zellulose (200 g) gereinigt
und mit Butanol-Ethanol-Essigsäure-Wasser
(8:2:1:3 v/v) entwickelt. Das Eluat wurde unter Vakuum getrocknet,
um eine braune sirupartige Flüssigkeit
zu ergeben, die im Kondensationsschritt ohne weitere Reinigung eingesetzt
wurde.
-
Zeatin-O-β-glucuronsäure-Natriumsalz
-
Die
sirupartige Flüssigkeit
aus dem vorherigen Schritt wurde in einem abgeschlossenen Rohr mit 6-Chlorpurin
(0,8 g) und Triethylamin (1,5 ml) in Methanol (25 ml) bei 90 °C 4 Stunden
lang erhitzt, um das Amid zu ergeben. Um das Amid in die Säure umzuwandeln,
wurde das Methanol unter Vakuum entfernt, und 5%iges wässriges
Natriumhydroxid (25 ml) wurde zugegeben. Nach Rühren bei Raumtemperatur für 6 Stunden
wurde das Gemisch vorsichtig mit 2 M Salzsäure neutralisiert und durch
Reversed-phase-Chromatographie über
Oktadecylkieselgel (100 g) und Elution mit Wasser gereinigt. Rohes
ZOGN-Natriumsalz, das nicht umgesetztes 6-Chlorpurin enthielt, wurde
unter Vakuum getrocknet und durch Chromatographie über Kieselgel (50
g) und Elution mit einem 0-100%-Gradienten von Methanol in Chloroform
gereinigt. Nach Entfernen des Lösungsmittels
am Vakuum wurde das Produkt als amorpher Feststoff unter Vakuum über Calciumchlorid
getrocknet. Ausbeute 158 g.
-
-
DC (Kieselgel-1-Butanol/Eisessig/Wasser,
12/3/5)
-
ZOGN-Natriumsalz
zeigte bei einer Beladung von 50 μg
einen einzelnen Spot (Rf 0,16) ohne nachweisbare Verunreinigungen.
Zeatin (0,66) oder 6-Chlorpurin (Rf 0,70) waren nicht nachweisbar.
Reinheit insgesamt 98+%.
-
HPLC
-
- (15 × 0,46
cm Oktadecylkieselgelsäule,
UV-Überwachung
bei 270 nm)
-
Gradientenelution
-
- (0-100% Methanol über
30 min bei 1 ml/min)
-
ZOGN-Natriumsalz
eluiert als recht breiter Peak (tR 10,0 min.) mit einer kleinen
Menge einer anorganischen Verunreinigung, die mit dem Lösungsmittelpeak
zusammen vorkommt. Reinheit insgesamt 97+%.
-
Isokratische Elution
-
- (50%iges wässriges
Methanol, 1 ml/min)
-
Isokratische
Elution wurde angewendet, um den Zeatingehalt zu bestimmen. ZOGN-Natriumsalz hatte eine
Retentionszeit (tR) von 1,1 min, verglichen mit tR von authentischem
trans-Zeatin von 2,2 min. HPLC von bis zu 96 μg ZOGN-Natriumsalz zeigte kein
nachweisbares Zeatin. Der Zeatingehalt war deshalb < 0,1%. Dies wurde
durch DC auf Kieselgel in Chloroform/Methanol 9/1 bestätigt. ZOGN-Natriumsalz
bewegte sich in diesem System nicht vom Ausgangspunkt, aber jegliche
Zeatinverunreinigung wurde bei Rf 0,39 klar abgetrennt. Es wurde
kein Zeatin nachgewiesen, wenn 200 μg ZOGN-Natriumsalz laufen gelassen
wurden. Die Nachweisgrenze für
trans-Zeatin in der DC war 200 ng; deshalb bestätigte sich die Verunreinigung
mit trans-Zeatin auf < 0,1%.
-
Enzymatische
Hydrolyse
-
Eine
Probe ZOGN-Natriumsalz wurde mit β-Glucuronidase
(Sigma G9387) in 50 mM Natriumphosphatpuffer bei pH 7,0 bei 37 °C inkubiert.
HPLC (50% isokratisches Methanol) zeigte nahezu vollständige Umwandlung
zu trans-Zeatin. Die Identität
von trans-Zeatin in dem Enzymhydrolysat wurde durch Cochromatographie
eines 1:1-Gemischs
des Hydrolysats und authentischem trans-Zeatin in 3 verschiedenen
chromatographischen Systemen nachgewiesen.
-
BEISPIEL 1H
-
2-Hydroxycinnamyl-β-D-glucopyranuronamid
-
- Synonyme: o-Cumaryl-β-D-Glucopyranuronamid
o-Cumarylglucuronamid
- Abkürzung:
CouGNamid
-
-
Synthese
-
Methyl-o-cumarat
(15 g) und MBTG (16,8 g) wurden zusammen mit Chinolin (25 ml) gemahlen,
um eine homogene Paste zu ergeben. Silber(I)oxid (10,7 g) wurde
in mehreren Portionen mit gründlichem
Mischen zugegeben, während
das Gemisch auf Eis gekühlt
wurde. Nach vollendeter Zugabe wurde das Reaktionsgemisch 3 h auf
Raumtemperatur gehalten. Das Gemisch wurde mit Ether (1 l) extrahiert
und der Etherextrakt mit Wasser (1 l) gewaschen. Der Etherextrakt
wurde über
wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und zu einer roten sirupartigen
Flüssigkeit
unter Vakuum getrocknet. Die rohe sirupartige Flüssigkeit wurde mit Petrolether (300
ml) extrahiert, um nicht umgesetztes Methyl-o-cumarat zu entfernen,
dann unter Vakuum getrocknet, um Spuren von Petrolether zu entfernen.
Das Rohprodukt wurde aus Ethanol mit Aktivkohleentfärbung umkristallisiert,
um reines peracetyliertes Methyl-2-hydroxycinnamyl-O-β-glucupyranuronat (3,5 g) zu
ergeben.
-
Der
Peracetylmethylester (3,5 g) wurde in wasserfreiem Methanol (250
ml) gelöst
und durch Rühren bei
0 °C über 3 h
mit weiterem wasserfreiem Methanol (250 ml), das mit trockenem Ammoniak
bei –10 °C gesättigt worden
war, hydrolisiert. Ammoniak und Methanol wurden unter Vakuum entfernt
und das Rohprodukt aus Ethanol umkristallisiert und unter Vakuum über Calciumchlorid
getrocknet, um reines CouGNamid als farblosen, federigen Feststoff
zu ergeben (1,7 g).
-
Analyse
-
DC (Kieselgel-Chloroform/Methanol,
1/1)
-
Einzelner,
scharfer Spot bei Rf 0,63. Keine Verunreinigungen wurden bei einer
Beladung von bis zu 50 μg
nachgewiesen, Reinheit 98+%. Verunreinigungen, weniger als 0,5%
Methyl-o-cumarat; oder Cumarin.
-
DC (Kieselgel-Chloroform/Methanol/Eisessig,
50/50/5)
-
- Einzelner, scharfer Spot bei Rf 0,68. Reinheit 98+%. Keine
nachweisbare (< 0,5%)
o-Cumarsäure
(Rf 0,80).
-
BEISPIEL 1I
-
2-Hydroxycinnamyl-β-D-glucopyranuronsäure
-
- Synonyme: o-Cumaryl-β-D-glucopyranuronsäure
o-Cumarylglucuronid
- Abkürzung:
CouGN
-
-
Synthese
-
Methyl-o-cumarat
(17,8 g) und MBTG (20 g) wurden zusammen mit Chinolin (20 ml) zu
einer einheitlichen Paste gemahlen. Silber(I)oxid (13 g) wurde unter
gründlichem
Mischen in Teilen zugegeben, während das
Gemisch auf Eis gekühlt
wurde. Nach vollendeter Zugabe wurde das Reaktionsgemisch bei Raumtemperatur
3 h lang stehengelassen. Das Gemisch wurde mit Ether (1 l) extrahiert,
und der Etherextrakt wurde mit Wasser (1 l) gewaschen. Der Etherextrakt
wurde über
wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und unter Vakuum zu einer
roten sirupartigen Flüssigkeit
getrocknet. Die rohe sirupartige Flüssigkeit wurde mit Petrolether (300
ml) extrahiert, um nicht umgesetztes Methyl-o-cumarat zu entfernen,
dann unter Vakuum getrocknet, um Spuren von Petrolether zu entfernen.
Das Rohprodukt wurde aus Ethanol mit Aktivkohleentfärbung umkristallisiert,
um reines peracetyliertes Methyl-CouGN
(2,9 g) zu ergeben.
-
Der
Peracetylmethylester (2,9 g) wurde in Methanol (250 ml) suspendiert,
und 2 M Natriumhydroxid (250 ml) wurde unter Rühren zugegeben, während das
Reaktionsgemisch auf Eis gekühlt
wurde. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur für 1,5 h lang gerührt und
mit Salzsäure
auf pH 2,5 eingestellt. Das Methanol wurde unter Vakuum entfernt
und das Rohprodukt durch XAD-2 Chromatographie gereinigt. Das chromatographische Harz
wurde zuerst mit Wasser gewaschen, um anorganische Salze zu entfernen,
und das Produkt wurde mit Methanol eluiert. Nach Trocknung unter
Vakuum wurde das Produkt aus Ethanol umkristallisiert und unter
Vakuum über
Calciumchlorid getrocknet, um reines CouGN als farblosen, amorphen
Feststoff (1,5 g) zu ergeben.
-
CouGN
ist zu 5 mg/ml in wässrigem
Puffer, pH 7, löslich
und in 50%igem wässrigem
Alkohol als klare, farblose Lösung.
-
Analyse
-
DC (Kieselgel-Chloroform/Methanol/Eisessig,
50/50/1)
-
Hauptspot
Rf 0,12 mit einer winzigen Verunreinigung bei Rf 0,24. Reinheit
90+%. Kein nachweisbares (< 1
%) Cumarin (Rf 0,90), Methyl-o-cumarat (Rf 0,91) oder o-Cumarsäure (Rf
0,80). Das Hauptprodukt cochromatographierte mit authentischer CouGN,
die durch die katalytische Oxidation von 2-Hydroxycinnamyl-O-β-D-glucopyranosid
hergestellt worden war.
-
GUS-Hydrolyse
-
CouGN
(5 mg) wurde in 50 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,0 (1 ml) gelöst und mit
GUS (1000 Einheiten Sigma Typ G5897) 12 Stunden lang bei 37 °C inkubiert.
DC zeigte 93,4% Umwandlung zu einer Verbindung, die mit o-Cumarsäure cochromatographierte.
o-Cumarsäure
wird über
einen Zeitraum von einigen Tagen langsam (nichtenzymatisch) in Cumarin
umgewandelt.
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BEISPIEL 2
-
CYTOKININGLUCURONIDE
WERDEN DURCH β-GLUCURONIDASE
HYDROLISIERT UND SETZEN DABEI UNVERÄNDERTE CYTOKININE FREI
-
Ein
Assay wurde entwickelt, um jene Cytokininglucuronide zu identifizieren,
die durch β-Glucuronidase von
E. coli hydrolisiert werden können.
(Verschiedene Merkmale des β-Glucuronidaseenzyms
und -gens sind beispielsweise im folgenden beschrieben: Blanco & Nemoz, Biochimie
69, S. 157-161, 1987; Jefferson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
Vol. 83, S. 8447-8451, 1986; Levvy & Marsh, Advan. Carbohydrate Chem.
14, S. 381-428;
US 4,721,671 ).
-
Die
Verbindung, die getested werden soll, wird in 50 mM Natriumphosphatpuffer,
pH 7,0, (im allgemeinen 500 μg
der Verbindung in 500 μl
Puffer) mit β-Glucuronidase
(im allgemeinen Sigma Typ G7896, 2500 "Fishman"-Einheiten) 12-24 h lang bei 37 °C inkubiert.
Die Gegenwart von Hydrolyseprodukten wird dann unter Verwendung
von HPLC und DC bestimmt.
-
Die
Tabelle unten zeigt die Ergebnisse des oben beschriebenen Assays
an einer Anzahl von Cytokinin-β-glucuroniden
und einem Cytokinin-β-D-glucuronamid.
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-
Weil
die einzigen Substrate, die verwendet wurden, um das GUS-Enzym von
E. coli in transgenen Organismen zu testen, O-Glucuronide waren,
und weil früher
berichtet worden war (Jefferson, "The GUS reporter gene system", Nature, Vol. 342,
S. 837-838, 1989),
dass die Substrate von β-Glucuronidase
aus D-Glucuronsäure
bestehen, die durch eine β-O-glykosidische
Verknüpfung
an ein Aglykon gebunden ist, war es überraschend, dass gefunden
wurde, dass auch bestimmte N-Glucuronide und S-Glucuronide gute Substrate für dieses
Enzym sind. Es wird deshalb auch erwogen, dass solche N- und S-Glucuronidverbindungen
in Assays für das β-Glucuronidaseenzym
von E. coli und Pflanzen, beispielsweise ähnlich dem X-gluc-Assay, auf
den man sich unten bezieht, verwendet werden können.
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In
GB 2 197 653 A wird
festgestellt, dass durch Verwendung des β-Glucuronidasesystems und neuartiger
Substanzen positive und negative Selektion unter Verwendung der
GUS-Aktivität
möglich
sein kann. Diese Annahme ist jedoch nie überprüft worden, und enzymatische
Hydrolyse solcher Verbindungen hat sich nie als wahrscheinlich gezeigt,
selbst auf der Grundlage theoretischer Überlegungen, die die chemischen
Eigenschaften von Substraten für β-Glucuronidase
von E-coli berücksichtigen.
Wie hier gezeigt, sind nicht alle Glucuronide Substrate für das β-Glucuronidaseenzym
von E. coli, und es wird nicht erwartet, dass die meisten Glucuronide
Substrate für
das GUS-Enzym sind.
-
Reaktionen
im Pflanzengewebe, die das β-Glucuronidasegen
von E. coli exprimieren, wurden bereits als Verfahren zur Bewertung,
ob bestimmte Glucuronide (einschließlich Pflanzenhormonvorläuferverbindungen)
durch das Enzym in vivo hydrolisiert werden können (Jefferson, "The GUS gene fusion
system as a versatile tool for agricultural molecular biology", Abstract aus International
Congress on Genetic Manipulation in Plant Breeding, gehalten in
Elsinore, Dänemark,
11.-16. September 1988), verwendet. Unglücklicherweise ist dieser Ansatz
nicht möglich
wegen des Auftretens von starker endogener β-Glucuronidaseaktivität in Pflanzengewebe
(siehe z.B. Beispiel 3 unten, ebenso wie Hodal et al., "Detection, expression
and specific elimination of endogenous β-glucuronidase activity in transgenic
and non-transgenic plants",
im Druck in Plant Science). Das Auftreten dieser endogenen β-Glucuronidaseaktivität bedeutet
auch, dass es durch Anwendung des von Jefferson beschriebenen Verfahrens
unmöglich
ist zu bestimmen, ob die durch das Glucuronid verursachten Wirkungen
auf Hydrolyse der Verbindung beruhen, oder ob sie durch die Tatsache
erklärt
werden können,
dass das Glucuronid selbst aktiv ist. Um eine geeignete Verbindung
für Selektionszwecke
zu sein, muss eine Verbindung durch das GUS-Enzym aktiviert werden
und auch ohne jegliche bedeutende Aktivität in der Glucuronidform sein.
-
Der
oben beschriebene Assay kann verwendet werden, um auf Cytokininglucuronide
zu durchsuchen, die durch ein gegebenes β-Glucuronidaseenzym hydrolisiert
werden können,
hier am Beispiel des β-Glucuronidaseenzyms
von E. coli.
-
Es
war ferner unter Verwendung von HPLC und DC festgestellt worden,
dass unmodifizierte aktive Cytokinine das Produkt der GUS-Hydrolyse
sind (siehe die Beispiele oben, die sich auf die Herstellung und
Analyse neuartiger Cytokininglucuronidverbindungen beziehen). So
wurde beispielsweise gefunden, dass die Hydrolyse von BA3GN-Natriumsalz
durch β-Glucuronidase
von E. coli zu nahezu vollständigem
(> 99%) Verschwinden
des BA3GN-Natriumsalzes führte,
wobei sich eine Verbindung ergab, die in einem 1:1-Gemisch mit authentischem
BA cochromatographierte. Ähnlich
konnte durch HPLC (50%iges isokratisches Methanol) gezeigt werden,
dass Inkubation von ZOGN-Natriumsalz mit β-Glucuronidase von E. coli eine
nahezu vollständige
Umwandlung zu trans-Zeatin ergibt; und es konnte durch DC (1:1,
MeOH/Chloroform) gezeigt werden, dass Inkubation von IP8SGN-Natriumsalz
mit β-Glucuronidase
für 24
Stunden fast vollständige
(> 95%) Umwandlung
von IP8SGN in eine Verbindung ergibt, die mit 8-Thio-(2-isopentenyl)adenin
cochromatographiert.
-
Ähnlich können andere
Arten von Glucuroniden auf ihre Fähigkeit, durch eine gegebene β-Glucuronidase
hydrolisiert zu werden, abgesucht werden. Beispielsweise konnte
durch DC gezeigt werden, dass Inkubation von o-Cumaryl-β-D-glucuronid (5 mg
in 1 ml Puffer) für
12 Stunden mit β-Glucuronidase
(Sigma Typ G5897, 1000 Einheiten) eine 93,4%ige Umwandlung zu einer
Verbindung ergibt, die mit o-Cumarsäure cochromatographierte. Inkubation
der anderen in Tabelle 1 aufgelisteten Verbindungen (mit Ausnahme
der zwei Verbindungen, die nicht als Substrate für β-Glucuronidase von E-coli wirkten)
ergab ähnliche
Ergebnisse, d.h. ergab Hydrolyseprodukte, die denen entsprachen,
die nach der Hydrolyse durch β-Glucuronidase
zu erwarten waren (siehe die Beispiele oben, die sich auf die Herstellung
verschiedener Glucuronidverbindungen beziehen). Auf der anderen
Seite bewirkt BA9GN, das, wie in Tabelle 1 gezeigt, kein Substrat
für β-Glucuronidase von
E-coli ist und keine nachweisbare (< 1%) Produktion von BA nach Inkubation
für 18
h bei 37 °C
mit β-Glucuronidase
zeigte, keine Keimbildung in Tabakblattscheiben (Tabelle 2 unten).
-
BEISPIEL 3
-
INDUKTION
VON KEIMBILDUNG AUS PFLANZENGEWEBE MIT UND OHNE EIN EINGEFÜHRTES β-GLUCURONIDASEGEN
DURCH CYTOKININGLUCURONIDE
-
Es
wurden Experimente durchgeführt,
um zu bestimmen, ob Cytokininglucuronide (sowie Cytokininglucuronamid)
Keimbildung in vivo in Pflanzenmaterial mit beziehungsweise ohne
ein eingeführtes β-Glucuronidasegen
bewirken können.
-
Samen
von einer GUS-negativen und einer GUS-positiven Tabakpflanze (Nicotiana
tabacum 'Wisconsin
38') wurden auf
MSO-Substrat (Murashige & Skoog
Substrat ohne Hormone, beschrieben in Murashige & Skoog, Physiol. Plant. 15: 473-497,
1962, erhältlich
von Sigma, USA) gekeimt. Das GUS-positive Pflanzenmaterial enthielt
ein eingeführtes β-Glucuronidasegen
von E. coli (uidA), das durch den 35S Promoter von Blumenkohlmosaikvirus
gesteuert wird, wie beispielweise von Jefferson et al., The EMBO
Journal, Vol. 6, Nr. 13, S. 3901-3907, 1987 beschrieben. Die originalen,
transgenen GUS-positiven Pflanzen wurden hergestellt unter Verwendung
des herkömmlichen
kanamycinbasierten negativen Selektionssystems, wie beispielweise
durch Burow et al., Plant Molecular Biology Reporter, Vol. 8(2),
S. 124-139, 1990 beschrieben. GUS-positive Sämlinge wurde mittels des X-gluc-Assays wie unten
in diesem Beispiel beschrieben, identifiziert.
-
Nach
4-5 Wochen wurden die oberen Teile der Pflanzen oder Keime auf ein
neues MSO-Substrat übertragen,
und dieses Vorgehen wurde bei Bedarf wiederholt. Auf diese Weise
wurde das Pflanzenmaterial (sowohl das GUS-positive als auch das
GUS-negative) als sterile Keimkultur aufrechterhalten (siehe Burow
et al., Plant Molecular Biology Reporter, Vol 8(2), S. 124-139,
1990). Aus den größten Blättern (3-5
Wochen alt) wurden Scheiben ausgestanzt und auf die unten angegebenen
Substrate (Tabelle 2) übertragen.
Das grundlegende verwendete Substrat war MSO, die verschiedenen
Testverbindungen wurden bei verschiedenen Konzentration bis hin
zu 250 μM
zugegeben. Kleine Petrischalen (⌀ = 5 cm), die 6 ml Substrat
enthielten, wurden verwendet, auf jede Petrischale wurden 3 Blattscheiben
gelegt. Jede Behandlung wurde mindestens 4mal wiederholt.
-
Es
wurde gefunden, dass mehrere Cytokininglucuronide Keimbildung in
Pflanzengewebe, das das β-Glucuronidaseenzym
enthält,
induzieren. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle gezeigt:
-
-
Aus
der obigen Tabelle kann ersehen werden, dass alle Cytokininglucuronide,
die Keimbildung bei einer Konzentration unter 250 mM in Blattscheiben
von Tabak, der ein eingeführtes β-Glucuronidasegen
enthielt, induzieren, auch Keimbildung bei Verwendung einer ähnlichen
Konzentration in entsprechenden Blattscheiben, die kein eingeführtes β-Glucuronidasegen
enthielten, induzieren konnten. Auf der anderen Seite führte das
Cytokininglucuronid BA9GN, von dem gezeigt wurde, dass es nicht
als Substrat für β-Glucuronidase
von E. coli (siehe Beispiel 2) wirkt, nicht zu einer Keimbildung
in Blattscheiben, weder mit oder ohne ein eingeführtes β-Glucuronidasegen. Jedoch wurde
gefunden, dass das Cytokininglucuronamid BA3GNamid, das, wie in Beispiel
2 gezeigt, nicht als Substrat für β-Glucuronidase
von E. coli wirkte, Keimbildung sowohl in GUS-positiven als auch
in GUS-negativen Blattscheiben induzierte, was zeigt, dass Cytokininglucuronamide
in Pflanzengewebe in die entsprechenden Cytokininglucuronsäuren umgewandelt
werden. So scheint es, dass Vorläuferverbindungen
für Cytokininglucuronide
in vivo auf die gleiche Weise wirken können wie die Cytokininglucuronide
selbst.
-
Diese
Ergebnisse zeigen, dass höhere
Pflanzen, in diesem Fall Tabak, endogene β-Glucuronidaseaktivität besitzen.
Dieser Befund ist mit dem kürzlich
durch Hu et al. (Plant Cell Reports 9, S. 1-5, 1990) berichteten,
der das Auftreten GUS-ähnlicher
Aktivität
in 52 Arten von Samenpflanzen untersuchte, und mit den Befunden
von Hodal et al. (im Druck in Plant Science) in Einklang. Hu et
al. fanden heraus, dass Arten, die positive GUS-ähnliche Aktivitäten exprimieren,
in jeder Schlüsselgruppe
von Angiospermen, sowie in einigen der Gymnospermen verteilt sind.
(Während
Hu et al. keine GUS-Aktivität
in Tabak feststellten, kann dieses Ergebnis durch die Tatsache erklärt werden,
dass ihr Assay in vitro bei pH 7 durchgeführt wurde. Wie unten gezeigt, scheint
das Enzym, das für
die ursprüngliche
GUS-Aktivität
in Tabak verantwortlich ist, bei pH 7 nicht aktiv zu sein, aber
es wurde gefunden, dass es bei pH 4-5 aktiv ist.).
-
Diese
Befunde stehen im Gegensatz zu dem, der in
GB 2 197 653 A offenbart
ist, der feststellt, dass höhere
Pflanzen, einschließlich
Tabak, keine nachweisbare β-Glucuronidaseaktivität enthalten.
GB 2 197 653 A ,
das sich unter anderem auf ein Verfahren bezieht, um Expression
eines interessierenden Gens unter Verwendung des GUS-Gens zu überwachen,
erklärt,
dass das Vorkommen von GUS-Aktivität die Expression eines interessierenden
Gens anzeigt, und impliziert damit, dass, da GUS-Aktivität in höheren Pflanzen
nicht gefunden wird, es eine relativ einfache Sache ist, die Expression
eines interessierenden Gens unter Verwendung des GUS-Gens zu überwachen.
Jedoch zeigen die obigen Ergebnisse, dass dies nicht der Fall ist,
und dass die Verwendung eines GUS-Gens zur Überwachung der Anwesenheit
eines interessierenden Gens überhaupt nicht
einfach oder klar ist, wegen der Tatsache, dass höhere Pflanzen
tatsächlich
eine bedeutende intrinsische (Hintergrund-) β-Glucuronidaseaktivität enthalten.
-
Um
die Natur der beobachteten GUS-Aktivität in Pflanzenmaterial mit und
ohne ein eingeführtes β-Glucuronidasegen
zu untersuchen, wurde die pH-Abhängigkeit
der GUS-Aktivität
bestimmt, indem man einen standardisierten histochemischen GUS-Assay mit "X-gluc" (5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-glucuronid)
verwendete.
-
Der
X-gluc-Assay kann durchgeführt
werden, indem man zuerst ein Assaymedium herstellt, indem man 50
mg X-gluc in einer Lösung,
die 25 ml 0,2 M NaPO4-Puffer, typischerweise
pH 7,0, 24 ml destilliertes Wasser, 0,25 ml 0,1 M K3(Fe(CN)6), 0,25 ml 0,1 M K4(Fe(CN)6) und 0,5 ml 1,0 M Na2EDTA
enthält,
löst und anschließend bis
zur Auflösung
rührt (ungefähr 30 min).
Frischgeschnittene oder formaldehydfixierte Gewebeabschnitte (Dicke
kleiner 0,5 mm) oder Gewebe bei 37 °C werden dann in dem X-gluc-Medium
für einige
Minuten bis 24 Stunden inkubiert. Nach der Inkubation werden die
Abschnitte in Natriumphosphatpuffer oder Wasser gespült und mikroskopisch
untersucht. GUS-Aktivität
zeigt sich als blaue Einfärbung
des behandelten Pflanzenmaterials an der Stelle der Enzymaktivität (Jefferson,
Plant Molecular Biology Reporter, Vol. 5, Nr. 4, S. 387-405, 1987).
Für die
Zwecke der vorliegenden Erfindung wurden typischerweise Assayzeiten
von 20 Stunden angewendet. Nach der Inkubation wurden die Scheiben
mit 96%igem Ethanol behandelt, um Chlorophyll zu entfernen.
-
Die
Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle gezeigt:
-
-
Man
kann sehen, dass das Enzym, das für die Hintergrund-β-Glucuronidaseaktivität in Tabakblattscheiben
ohne ein eingeführtes β-Glucuronidasegen
verantwortlich ist, nur innerhalb eines engen pH-Bereichs, der dem
inneren pH der Pflanzen entspricht (ungefähr pH 5), aktiv ist, während die β-Glucuronidase, die
durch das eingeführte
Gen exprimiert wird, über
einen großen
pH-Bereich von 4 bis 8 aktiv ist. Diese pH-Abhängigkeit
kann erklären,
warum frühere
Versuche, GUS-Aktivität
in Pflanzen festzustellen, zum größten Teil nicht erfolgreich
waren und zu der fälschlichen Annahme
(z.B. in
GB 2 197 653
A ) führten,
dass Pflanzen keine intrinsische GUS-Aktivität besitzen.
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Die
Tatsache, dass die oben für
das Pflanzenmaterial ohne ein eingeführtes GUS-Gen gezeigte β-Glucuronidaseaktivität wirklich
das Ergebnis der Hydrolyse des Cytokininglucuronidsubstrats durch β-Glucuronidase
ist, und nicht das Ergebnis einer nichtspezifischen Reaktion, die
das Substrat spaltet, z.B. eine nichtenzymatische saure Hydrolyse
von Glucuroniden (die bekanntermaßen bei niedrigen pH-Werten
gespalten werden), wurde gezeigt, indem die Wirkung von Inhibitoren
verschiedener Enzyme bei pH 5 in nicht genetisch transformiertem
Pflanzenmaterial (d.h. in Pflanzenmaterial, das nur ursprüngliche
GUS-Aktivität
besaß)
getestet wurde. Der Test wurde unter Verwendung des oben beschriebenen
X-gluc-Assays bei pH 5,0 für
20 Stunden durchgeführt.
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Die
sechs getesteten Inhibitoren haben die folgenden Wirkungen:
Saccharo-1,4-lacton
ist ein Inhibitor, der spezifisch für β-Glucuronidaseenzyme ist (mit
anderen Worten, er hemmt nur β-Glucuronidasen,
und er hemmt alle β-Glucuronidasen).
Es ist allgemein anerkannt, dass GUS-Aktivität, die durch diese Verbindung
gehemmt werden kann, aus der Wirkung eines β-Glucuronidaseenzyms herrührt.
-
Gluconolacton
ist ein Inhibitor von β-Glucuronidasen.
Er entspricht Saccharo-1,4-lacton
mit der Ausnahme, dass er spezifisch für β-Glucosidasen ist.
-
UDP-Glucuronid
ist ein Substrat für
UDP-Glucuronidtransferasen.
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Glucuronsäure ist
das Produkt jeder β-Glucuronidasereaktion
und deshalb ein Produktinhibitor von β-Glucuronidasen und anderen
glucuronsäurebildenden
Enzymen.
-
Galaktose
ist ein Inhibitor von UDP-glucuronidtransferase-abhängigen Reaktionen.
-
Methylumbellipherylglucuronid
ist ein Substrat für
alle β-Glucuronidasen,
die bis jetzt untersucht sind, und ist so ein konkurrierender Inhibitor
von GUS-Enzymen.
-
Da
auch gefunden wurde, dass EDTA (das UDP-Glucuronidtransferasen inhibiert)
keine Wirkung hat, ist es unwahrscheinlich, dass solche Transferasen
in die beobachtete GUS-Aktivität
einbezogen sind. Die obige Tabelle zeigt, dass jene Verbindungen,
die ein Transferaseenzym inhibieren sollten, keine Wirkung, selbst bei
sehr hohen Konzentrationen, haben. Es kann weiterhin gesehen werden,
dass Gluconolacton keine hemmende Wirkung hat, und es ist deshalb
unwahrscheinlich, dass die GUS-Aktivität mit einer β-Glucosidaseaktivität zusammenhängt.
-
Weiterhin
ist zu sehen, dass der GUS-spezifische Inhibitor Saccharo-1,4-lacton
ein starker Inhibitor ist, dass Glucuronsäure (Produktinhibierung von β-Glucuronidase)
ein mittelstarker Inhibitor ist, und dass Methylumbellipherylglucuronid
(ein GUS-Substrat
und deshalb ein konkurrierendes Substrat zu X-gluc, wenn ein β-Glucuronidaseenzym
für die
Hydrolyse von X-gluc verantwortlich ist) ein schwacher Inhibitor
ist. Die GUS-Aktivität
in Tabak erfüllt
deshalb alle nötigen
Kriterien, um als Folge eines β-Glucuronidaseenzyms
eingestuft zu werden. Es kann deshalb die Schlussfolgerung gezogen
werden, dass die Pflanzen ein β-Glucuronidaseenzym
enthalten.
-
Eine
entsprechende Reihe von Versuchen wurde durchgeführt, um sicherzustellen, dass
die Wirkung der Inhibitoren ausreichend schnell war, um alle Enzyme
hemmen zu können.
In dieser Reihe wurde das Pflanzenmaterial in den Testverbindungen
(Inhibitoren) 24 Stunden lang vorinkubiert, bevor der X-gluc-Assay
mit denselben Testverbindungen durchgeführt wurde. Die erhaltenen Ergebnisse
waren identisch mit denen, die ohne Vorinkubation erhalten worden
waren, was darauf hinweist, dass die Inhibitoren schnell genug in
das Pflanzengewebe eindringen, um den X-gluc-Assay zu hemmen, bevor die blaue Einfärbung erscheinen
kann.
-
Ergebnisse ähnlich den
oben beschriebenen wurden in einer anderen Untersuchung des Auftretens von
GUS-Aktivität
in Pflanzen erhalten. In diesem Fall wurde die pH-Abhängigkeit
der histologischen GUS-Reaktion in einer Anzahl von Pflanzenspezies
bei pH-Werten zwischen 3 und 8 sowohl mit als auch ohne den GUS-spezifischen
Inhibitor Saccharo-1,4-lacton getestet.
-
Der
angewendete Assay war der oben beschriebene X-gluc-Assay. Der Assay
wurde bei 37 °C
20 Stunden lang durchgeführt.
Blätter
wurden zerlegt (mit sterilen Rasierklingen), so dass jedes Blatt
bei einer Anzahl verschiedener pH-Werte getestet wurde.
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Wie
in der Tabelle unten gezeigt, bestätigte diese Untersuchung, dass
Pflanzen in der Tat eine ursprüngliche
GUS-Aktivität
besitzen, dass diese Aktivität
das Ergebnis einer enzymatischen Reaktion ist (keine Reaktion in
Gegenwart des GUS-spezifischen
Inhibitors) und dass das Enzym in erster Linie bei pH-Werten von
ungefähr
4-5 aktiv ist.
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-
Die
Tatsache, dass Pflanzen eine allgemeine intrinsische GUS-Aktivität haben,
macht es möglich,
ein Gen, das Glucuronidpermease codiert, als positives Selektionsgen
zu verwenden, ohne irgendein anderes Selektionsgen zu verwenden,
indem man einen Vorteil aus der gesteigerten Aufnahme einer Glucuronidverbindung
durch transformierte Zellen zieht. Es wurde beispielsweise gefunden,
dass Glucuronide nicht einfach durch Plasmamembranen hindurch in
Pflanzenzellen aufgenommen werden. Wenn ein Glucuronidpermeasegen
in eine Zelle eingeführt wird,
werden die Glucuronide jedoch einfacher die Plasmamembran durchdringen und
in die Zelle eindringen können.
Die Glucuronide sind dann für
Spaltung durch das intrinsische GUS-Enzym in den transformierten
Zellen verfügbar.
Im Gegensatz dazu ist das fragliche Glucuronid nicht für nichttransformierte
Zellen verfügbar,
wodurch eine positive Selektionswirkung erzielt wird. Ähnlich kann
positive Selektion auch durchgeführt
werden, indem man andere Permeasen und andere Verbindungstypen verwendet,
die entweder in den transformierten Zellen durch ein intrinsisches
Enzym aktiviert werden, oder die anders eine biologische Wirkung
in den transformierten Zellen, in die sie transportiert werden,
ausüben.
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BEISPIEL 4
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CYTOKININGLUCURONIDE
SIND STABIL UND INAKTIV
-
Die
Wirkung des Natriumsalzes des Cytokininglucuronids BA3GN ist blockiert,
wenn die GUS-Aktivität in
dem Pflanzengewebe, das dieses Cytokininglucuronid enthält, gehemmt
ist. In anderen Worten, das Cytokininglucuronid selbst ist inaktiv.
Weiterhin wurde gezeigt, dass das Cytokininglucuronid sowohl in
dem Wachstumsmedium als auch in Pflanzengewebe stabil ist, wenn β-Glucuronidase
nicht anwesend ist, wie durch die Tatsache gezeigt wird, dass der
spezifische GUS-Inhibitor, Saccharo-1,4-lacton (SL), Keimbildung, die durch das
Cytokininglucuronid BA3GN-Natriumsalz hervorgerufen wird, stark
hemmt, aber durch das freie Cytokinin BA hervorgerufene Keimbildung
nur schwach hemmt (unter Verwendung der grundlegenden Methode, die oben
in Beispiel 3 beschrieben ist):
-
-
Durch
Vergleich der Ergebnisse der obigen Tabelle mit den oben in Tabelle
2 angegebenen kann man sehen, dass das BA3GN-Natriumsalz, das Keimbildung
sowohl in GUS-positiven als auch GUS-negativen Tabakblattscheiben
induziert, keine Keimbildung in entsprechenden Blattscheiben in
Gegenwart des β-Glucuronidase-spezifischen
Inhibitors Saccharo-1,4-lacton induziert.
-
Saccharo-1,4-lacton
(SL) ist bei dem in diesem Beispiel verwendeten pH keine stabile
Verbindung. Es besteht ein Gleichgewicht zwischen SL und Zuckersäure (SA).
Dieses Gleichgewicht wird nur langsam erreicht, und der Umwandlung
von SL zu SA folgt ein Abfall im pH. Der pH muß deshalb vor der Verwendung von
SL mehrmals während
der Dauer einer Woche eingestellt werden, bis sich der pH in dem
SL-enthaltenden Substrat stabilisiert hat.
-
Die
Tatsache, dass Cytokininglucuronide stabil und inaktiv sind, wenn
keine β-Glucuronidase zugegen ist,
wird weiterhin durch die Tatsache gezeigt, dass BA9GN, das nicht
durch β-Glucuronidase
hydrolisiert werden kann, keine Keimbildung in Pflanzenmaterial
induzieren kann, das β-Glucuronidaseaktivität enthält (siehe Beispiele
2 und 3).
-
Es
ist wichtig, dass die Cytokininglucuronidverbindungen in Substraten,
die kein β-Glucuronidaseenzym
enthalten, inaktiv und stabil sind, da diese Stabilität eine Voraussetzung
für das
richtige Funktionieren des positiven Selektionssystems ist, das
sie benutzt.
-
Man
kann jedoch nicht von allen Glucuronsäurederivaten erwarten, dass
sie stabil sind. Beispielsweise werden Esterglucuronide in Pflanzengewebe,
das nichtspezifische Esterasen enthält, nicht stabil sein. Das heißt, dass
die Cytokininglucuronidverbindungen, die gemäß der vorliegenden Erfindung
dargestellt und angewendet werden, (β-D-Glucuronide, gekoppelt an
das Aglykon über
glycosidische O-, S- und N-Atome) die Voraussetzung für Stabilität erfüllen. Auf
der anderen Seite kann man von Verbindungen, die andere Typen von
Glucuronidbindungen haben, z.B. Amid- oder Ester-β-D-glucuroniden,
wegen des Auftretens nichtspezifischer Esterasen und Amidasen in
Pflanzen nicht erwarten, dass sie selektiv durch β-Glucuronidasen
hydrolisiert werden.
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Unter
Bezug auf Beispiel 3 oben wurde so gezeigt, dass die getesteten
Cytokininglucuronide, die, wie in diesem Beispiel gezeigt, selbst
keine Cytokininaktivität
besitzen, in vivo durch das Wirken von β-Glucuronidase – entweder
in Form von endogener Hintergrund-β-Glucuronidase oder als Ergebnis
eines eingeführten β-Glucuronidasegens – gespalten
werden, wodurch freies Cytokinin freigesetzt wird.
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BEISPIEL 5
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INDUKTION VON KEIMBILDUNG
AUS PFLANZENGEWEBE, DAS EIN EINGEFÜHRTES β-GLUCURONIDASEGEN ENTHÄLT, UNTER
VERWENDUNG VON STEROLGLUCURONIDEN
-
Es
wurde gezeigt, dass andere Glucuronide, einschließlich Glucuronide
von Sterolen, Glycyrrhizinsäure
und Hydroxychinolin, durch β-Glucuronidase
hydrolisiert werden und zu einer Keimbildung auf modifizierten Substraten,
in denen die Hydrolyseprodukte für
Keimbildung wesentlich sind, führen.
Das ist in den Beispielen 5 und 6 gezeigt.
-
Es
wurden Versuche durchgeführt,
um die keimauslösende
Wirkung zweier Sterolglucuronide, β-Sitosteryl-β-D-glucuronid (SG) und Cholesteryl-β-D-glucuronid
(CG) zu bestimmen, wenn die Sterolsynthese in den Geweben gehemmt
ist. Die angewandten grundlegenden Verfahren entsprechen im Wesentlichen
denen, die für
Beispiel 3 oben beschrieben sind. Zusätzlich zu einem oder beiden
der oben erwähnten
Sterolglucuronide enthielt das Substrat jedoch 0,1 mM Tridemorph
und 5 mg/l BA3GN-Natriumsalz. Die Anzahl der Keime wurde nach 30
Tagen erfasst.
-
Tridemorph
(4-Tridecyl-2,6-dimethylmorpholin) ist ein Fungizid, das die Synthese
von Sterolen und ähnlichen
Verbindungen hemmt. Tridemorph hat eine hemmende Wirkung auf die
Neubildung von Keimen (obwohl es keine tödliche Wirkung auf die Explantate
hat), wenn das Pflanzengewebe nicht mit Sterolen versorgt wird.
So sollte Keimbildung, in Abwesenheit freier Sterole, wirkungsvoll
verhindert werden.
-
CG
wurde von Sigma, USA, bezogen, und SG wurde nach dem Verfahren,
das durch Ando et al. in J. Antibiotics 73, S. 408, 1970, beschrieben
ist, dargestellt.
-
Die
erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle gezeigt:
-
-
Die
obige Tabelle zeigt, dass Sitosteryl-β-D-glucuronid der keimhemmenden
Wirkung von Tridemorph entgegenwirken kann und dass die Kombination
von Sitosteryl-β-D-glucuronid
und Cholsteryl-β-D-glucuronid die
stärkste
Keimbildung ergibt. So ist positive Selektion gemäß Erfindung
unter Verwendung eines eingeführten β-Glucuronidasegens
möglich,
wenn man beispielsweise eine oder beide der obigen Sterolglucuronidverbindungen
zusammen mit einer keimhemmenden Verbindung wie Tridemorph verwendet.
Dies Ergebnisse zeigen, dass auch andere Sterole und sterolähnliche
Verbindungen für
die positive Selektion aus Gewebe, das ein eingeführtes β-Glucuronidasegen
enthält,
verwendet werden können.
-
Ein
Vorteil der Verwendung dieser sehr schwach löslichen Verbindungen für positive
Selektion ist, dass ihre Wirkung vermutlich sehr lokal sein wird,
da die Verbindungen nicht von Zelle zu Zelle diffundieren, wenn
die hydrophile Glucuronideinheit durch ein β-Glucuronidaseenzym abgespalten
wird. In anderen Worten, diese Verbindungen können verwendet werden, um "cross feeding" während des
Selektionsprozesses zu verhindern.
-
Dieser
Versuch zeigt weiterhin, dass dem keimhemmenden Effekt von Tridemorph,
und so auch anderer Verbindungen, die die Sterolsynthese hemmen,
durch Zugabe von Sterolen und Sterolderivaten zum Substrat entgegengewirkt
werden kann, wodurch ein Selektionssystem, das darauf basiert, dass
transgene Zellen mit Sterolen und sterolähnlichen Verbindungen versorgt
werden, mit den oben erwähnten
Vorteilen hergestellt werden kann.
-
BEISPIEL 6
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INDUKTION VON KEIMBILDUNG
AUS PFLANZENGEWEBE MIT UND OHNE EIN EINGEFÜHRTES β-GLUCURONIDASEGEN UNTER VERWENDUNG
VON SITOSTERYL-β-D-GLUCURONID
-
Ein
Versuch, ähnlich
dem in Beispiel 5 beschriebenen, wurde sowohl an transformierten
als auch an nichttransformierten Tabakblattscheiben unter Verwendung
von Sitosteryl-β-D-glucuronid
und entweder BA oder BA3GN-Natriumsalz
durchgeführt.
-
Die
verwendeten Verfahren waren im Wesentlichen die oben in Beispiel
5 beschriebenen. In diesem Versuch wurde dem Substrat Tridemorph
in einer Konzentration von 0,1 mM zugegeben, und Sitosteryl-β-D-glucuronid
wurde in einer Konzentration von 121 mg/l zugegeben. Das Substrat
enthielt zusätzlich
entweder 1,88 mg/l BA3GN-Natriumsalz oder 0,1 mg/l BA. Die Anzahl
der Keime wurde nach 40 Tagen festgestellt.
-
Die
Anzahl der erhaltenen Keime war wie folgt:
-
Man
kann sehen, dass, wie es auch in Beispiel 5 oben der Fall war, die
Gegenwart von Sitosteryl-β-D-glucuronid
der keimhemmenden Wirkung von Tridemorph entgegenwirken konnte.
Weiterhin wurde, wenn Sitosteryl-β-D-glucuronid
und Tridemorph zusammen mit dem BA3GN-Natriumsalz verwendet wurden, eine
selektive Keimbildung in den GUS-positiven Blattscheiben erreicht,
während
die GUS-negativen Blattscheiben auf dem Substrat, das BA3GN-Natriumsalz
enthielt, nahezu keine Keimbildung hatten.
-
Diese
Ergebnisse zeigen auch, dass die Verwendung einer Kombination verschiedener
Glucuronide (hier BA3GN und SG anstelle von BA und SG) die selektive
Reaktion von den transgenen Geweben verbessern kann.
-
Da
Sterole und Steroide auch wichtige Wachstumsregulatoren in tierischen
Zellen sind, können
entsprechende Selektionsverfahren auch für die Selektion von tierischen
Zellen, die β-Glucuronide
exprimieren, verwendet werden.
-
BEISPIEL 7
-
ENTWAFFNETE
AGROBACTERIUMSTÄMME
PRODUZIEREN CYTOKININE
-
Es
wurde gefunden, dass bestimmte Agrobacterium-Stämme Keimbildung durch die Produktion
keimbildender Substanzen während
der Cokultivierung induzieren können.
Solche Stämme
sollten normalerweise vermieden werden, wenn GUS-Hydrolyse von Cytokininglucuroniden
für die
Zwecke der Selektion genetisch transformierter Zellen verwendet
werden soll, da diese Stämme
allein Keimbildung hervorrufen können
und deshalb den Selektionsprozeß stören.
-
Als
Beispiel zeigt die Tabelle unten die Ergebnisse eines Versuchs mit
zwei verschiedenen Agrobacterium-Stämmen, von denen einer Keimbildung
auf Tabakblattscheiben nach Cokultivierung induziert.
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Die
verwendeten Methoden entsprechen im Wesentlichen den in Beispiel
13 beschriebenen, aber nach Cokultivierung wurden die Blattscheiben
auf MSO-Substrat
ohne Hormone übertragen,
das 300 mg/l Cefotaxim und 300 mg/l Carbenicillin enthielt.
-
Die
Anzahl neugebildeter Keime wurde 4 Wochen nach Cokultivierung festgestellt.
-
-
Man
kann sehen, dass die keimauslösenden
Eigenschaften einiger der Agrobacterium-Stämme nicht abhängig von
den Genen sind, die in der T-DNA enthalten sind. Das heißt, dass
Gene außerhalb
der T-DNA-Region für
die Keimauslösung
verantwortlich sind.
-
Ein
Gen außerhalb
der T-DNA-Region, das für
die Cytokininproduktion verantwortlich ist, wurde tzs genannt (Morris,
R.O. Ann. Rev. Plant Physiol. 37, pp 509-538, 1986). Stamm C58 enthält das tzs-Gen,
ein nichttransferierbares Gen, das für die Synthese von Zeatin während Cokultivierung
codiert. Stamm LBA4404 enthält
das tzs-Gen nicht. Die Tatsache, dass die keimauslösenden Stämme ein
Plasmid enthalten, das das tzs-Gen enthält, zeigt, dass dieses Gen
für die
keiminduzierenden Eigenschaften verantwortlich sein kann, die in
diesen Untersuchungen beobachtet wurden, und dass Stämme von
Agrobacterium, die das tzs-Gen enthalten, in Cytokininbasierten
Selektionssystemen vermieden werden sollten. Jegliche andere Agrobacterium-Stämme, die
Keimbildung hervorrufen, sollten normalerweise auch vermieden werden.
-
BEISPIEL 8
-
POSITIVE SELEKTION TRANSGENER
KEIME UNTER VERWENDUNG DES CYTOKININGLUCURONIDS BA3GN-NATRIUMSALZES
-
Genetisch
transformierte Keime können
unter Verwendung von Cytokininglucuroniden selektiert werden.
-
Eine
Reihe von Versuchen wurde durchgeführt, um die Wirksamkeit des
positiven Selektionssystems unter Verwendung des Cytokininglucuronids
BA3GN-Natriumsalz in Konzentrationen von 7,5 und 15 mg/l zu testen.
Die Versuche wurden an Wildtyp-Tabakblattscheiben
durchgeführt
unter Verwendung zweier verschiedener Agrobacterium-Stämme und
auch verschiedener Cokultivierungssubstrate. Die verwendete Transformationsmethode
war die, die unten in Beispiel 13 beschrieben ist, mit der Ausnahme,
dass Gamborg B5 Substrat (Gamborg et al., Exp. Cell Res. 50: 151-158,
1968; erhältlich
von Sigma, USA) anstelle von MSO verwendet wurde. Die unten angegebenen
Ergebnisse sind Durchschnittswerte, die auf zwei unabhängigen Versuchen basieren,
von denen jeder an 27 Blattscheiben pro Behandlung durchgeführt wurde.
-
-
Stamm
BS10 führt
ein GUS-Gen ein, das von einem modifizierten 35S-Promoter gesteuert
wird, der in Agrobacterium nicht aktiv ist, wie von Janssen & Gardner in Plant
Molecular Biology, 14, pp. 61-72, 1989, beschrieben. Stamm LDH1
führt ein
GUS-Gen ein, das von dem nichtmodifizierten 35S-Promoter gesteuert wird.
-
Die
Ergebnisse in Tabelle 9 zeigen, dass positive Selektion transgener
Keime, die ein eingeführtes β-Glucuronidasegen
exprimieren, unter Verwendung von BA3GN-Natriumsalz möglich ist. Diese Ergebnisse sind
sehr bedeutend und waren unerwartet, da, wie in Beispiel 3 beschrieben,
gefunden wurde, dass Cytokininglucuronide Keimbildung in Blattscheiben,
die kein eingeführtes β-Glucuronidasegen
enthalten, induzieren konnten. Die verschiedenen Behandlungen während der
Cokultivierung scheinen keinen bedeutende Wirkung auf die Selektion
zu haben.
-
Die
oben gezeigten Ergebnisse zeigen auch, dass die Verwendung eines
Agrobacterium-Stamms mit einem aktiven β-Glucuronidasegen (Stamm LDH1
exprimiert GUS-Aktivität
in Bakterien) das Transformationssystem nicht beeinträchtigt verglichen
mit einem Stamm, der kein aktives β-Glucuronidasegen hat (Stamm BS10
exprimiert keine GUS-Aktivität
in Bakterien).
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BEISPIEL 9
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SELEKTION GENETISCH TRANSFORMIERTER
KEIME UNTER VERWENDUNG DES CYTOKININGLUCURONIDS ZEATIN-O-β-GLUCURONSÄURE
-
Unter
Anwendung des im wesentlichen gleichen Verfahrens wie in Beispiel
13 beschrieben, wurden transgene Tabakkeime präpariert und unter Verwendung
des Cytokininglucuronids Zeatin-O-β-glucuronsäure (ZOGN) als positives Selektionsreagens
selektiert.
-
Cokultivierung
wurde 3 Tage lang durchgeführt,
wobei die Impfkulturdichte einer OD von 1,5 bei 660 nm entsprach.
Das nach der Cokultivierung verwendete Substrat war MSO, das 300
mg/l Carbenicillin, 300 mg/l Cefotaxim und 0,1 mg/l Indolessigsäure (IAA)
enthielt. Die Subkultivierung nach 3 Wochen erfolgte auf das gleiche
Substrat, aber ohne IAA. Der pH in allen Substraten in diesem Beispiel
war 8,0. 18 Blattscheiben wurden für jede Behandlung verwendet.
-
Fünf Wochen
nach der Cokultivierung wurden die Keime auf ein MSO-Substrat übertragen,
das 200 mg/l Kanamycinsulfat, 32 mM Zuckersäure, 300 mg/l Cefotaxim und
300 mg/l Carbenicillin enthielt, pH 8,0. Zuckersäure, ein Inhibitor von β-Glucuronidaseenzymen,
wurde zugegeben, um weitere Umwandlung von Zeatinglucuronid in Zeatin
zu stoppen. Zusammen mit dem β-Glucuronidasegen
wurde ein NPT-Gen mitübertragen,
das Resistenz auf Kanamycin verleiht. Nichttransformierte Keime
(negative Kontrollen) überlebten,
aber das Wachstum dieser Keime war auf diesem Substrat verzögert, während alle
transformierten Keime (positive Kontrollen), die ein aktives NPT-Gen
enthielten, ohne jede Wachstumsverzögerung überlebten.
-
Die
Anzahl an Keimen wurde festgestellt und die Anzahl GUS-positiver
Keime unter der Gesamtzahl von Keimen wurde durch den X-gluc-Assay
(Beispiel 3) 3 Wochen nach der letzen Subkultivierung (8 Wochen nach
Cokultivierung) bestimmt. Die Ergebnisse sind unten gezeigt: TABELLE
10
- * SL: 2 mM Saccharo-1,4-lacton
-
Die
in der obigen Tabelle angegebenen Ergebnisse zeigen, dass eine erfolgreiche
positive Selektion genetisch transformierter Keime unter Verwendung
von ZOGN erreicht wurde. Die Induktion transgener Keime wurde gehemmt,
wenn der β-glucuronidasespezifische
Inhibitor Saccharo-1,4-lacton dem Substrat zugegeben wurde, was
zeigt, dass das Wachstum transgener Keime und damit der Erfolg der
positiven Selektion von der β-glucuronidasekatalysierten
Umwandlung von ZOGN in Zeatin abhängig war.
-
BEISPIEL 10
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SELEKTION GENETISCH TRANSFORMIERTER
KEIME UNTER VERWENDUNG VON ZEATIN-O-β-GLUCURONSÄURE BEI VERSCHIEDENEN TEMPERATUREN
-
Die
Temperaturabhängigkeit
des positiven Selektionssystems unter Verwendung von Cytokininglucuroniden
wurde unter Verwendung von Zeatin-O-β-glucuronsäure (ZOGN) als positivem Selektionsreagenz
bei 25 °C,
30 °C und
35 °C untersucht.
-
Transgene
Tabakkeime wurden unter Verwendung des im wesentlichen gleichen
Verfahrens wie unten in Beispiel 13 beschrieben, präpariert.
Cokultivierung wurde drei Tage lang ausgeführt, wobei die Impfkulturdichte
einer OD von 1,5 bei 660 nm entsprach. Das Substrat, das nach Cokultivierung
verwendet wurde, war MSO, das 10 mg/l 2-(2-Hydroxyethylamino)-6-benzylamino-9-methylpurin
(9-met), 350 mg/l Carbenicillin, 350 mg/l Cefotaxim und 0,1 mg/l
Indolessigsäure
(IAA) und ZOGN-Natriumsalz
wie angegeben enthielt. 9-met (bezogen von Apex Organics Ltd., UK)
wurde zugegeben, um Glycosylierung von Zeatin und Zeatinderivaten
zu hemmen. 18 Blattscheiben wurden für jede Behandlung verwendet.
-
Sieben
Wochen nach der Cokultivierung wurden die Keime auf ein MSO-Substrat übertragen,
das 300 mg/l Kanamycinsulfat, 350 mg/l Cefotaxim, 350 mg/l Carbenicillin,
0,1 mg/l IAA und 10 mg/l 6-(m-Hydroxybenzylamino)purin (OH-BA) enthielt
und bei einer Temperatur von 25 °C
stehengelassen. OH-BA kann wie von Kaminek et al. (Plant Growth
Reg. 6, pp 113-120, 1987) beschrieben, dargestellt werden.
-
Nach
sechs Wochen auf dem kanamycinhaltigen Substrat wurde die Anzahl
grüner
Keime festgestellt. Resistenz gegen Kanamycin zeigt an, dass der
Keim transgen ist, weil zusammen mit dem β-Glucuronidasegen ein NPT-Gen,
das Kanamycinresistenz verleiht, mitübertragen wurde. Keine nichttransformierten
Keime (negative Kontrollen) überlebten
auf diesem Substrat, während
alle transformierten Keime (positive Kontrollen), die ein aktives
NPT-Gen enthielten, überlebten.
-
Der
Prozentanteil kanamycinresistenter Keime unter der Gesamtzahl neugebildeter
Keime wurde berechnet als Anzahl grüner Keime, die auf dem kanamycinhaltigen
Substrat überlebten,
dividiert durch die Anzahl an Keimen, die auf das kanamycinhaltige
Substrat übertragen
worden waren. Die Ergebnisse sind in der Tabelle unten gezeigt:
-
-
Der
Bioassay, der in diesem Beispiel beschrieben ist, wurde an einem
verknüpften,
mitübertragenen Gen
durchgeführt.
Das heißt,
dass das β-Glucuronidasegen
für die
Selektion verwendet wird, während
die Resistenz, die das Ergebnis des eingeführten, mitübertragenen NPT-Gens (Kanamycinresistenzgen)
ist, geprüft wird.
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Die
Ergebnisse oben zeigen, dass zusätzlich
zu dem β-Glucuronidasegen
ein mitübertragenes
Gen auch exprimiert wird, wenn die Selektion unter Verwendung des β-Glucuronidasegens
durchgeführt
wird. Zusätzlich
kann man sehen, dass Selektion bei erhöhten Temperaturen (d. h. ungefähr 30-35 °C) die Selektion von
transgenen Keimen pro Blattscheibe und auch den Anteil transgener
Keime pro Blattscheibe unter der Gesamtzahl neugebildeter Keime
verbessert.
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Durch
Durchführung
des X-gluc-Assays bei verschiedenen Temperaturen wurde in Zusammenhang mit
der vorliegenden Erfindung beobachtet, dass die intrinsische β-Glucuronidaseaktivität, die in
Pflanzen auftritt, bei hohen Temperaturen gehemmt ist, während die
eingeführte β-Glucuronidaseaktivität nicht
betroffen ist. Es wurde so herausgefunden, dass die intrinsische β-Glucuronidaseaktivität mit zunehmender
Temperatur bis zu etwa 60 °C
allmählich
abnahm, wobei es bei dieser Temperatur im wesentlichen keine intrinsische β-Glucuronidaseaktivität (wie mittels
X-gluc-Assay bestimmt) gab. Dies kann die Verbesserung des Selektionsverfahrens
bei erhöhten
Temperaturen erklären.
-
BEISPIEL 11
-
POSITIVE SELEKTION VERGLICHEN
UND KOMBINIERT MIT NEGATIVER SELEKTION
-
Es
konnte gezeigt werden, das das hierin beschriebene positive Selektionssystem
sehr leistungsfähig und
vorteilhaft ist verglichen mit herkömmlicher Kanamycinbasierter
negativer Selektion. Es werden jedoch auch gute Ergebnisse erzielt,
wenn das positive Selektionssystem zusammen mit herkömmlicher
negativer Selektion angewandt wird.
-
So
zeigt die Tabelle unten die Ergebnisse, ausgedrückt als Anzahl GUS-positiver
Tabakkeime pro Blattscheibe und des Prozentanteils GUS-positiver
Keime unter der Gesamtzahl von Keimen, für positive Selektion unter
Verwendung des BA3GN-Natriumsalzes,
herkömmliche
negative Selektion unter Verwendung von Kanamycin und BA, sowie
positive Selektion und negative Selektion in Kombination. Zusätzlich umfasste der
Versuch Selektion unter Verwendung des BA3GN-Natriumsalzes zusammen
mit Saccharo-1,4-lacton (SL) (ein stark spezifischer Inhibitor der
eingeführten β-Glucuronidase).
-
Die
verwendeten Verfahren waren im wesentlichen die gleichen wie unten
in Beispiel 13 beschrieben, aber es wurde Gamborg B5 Substrat anstelle
von MSO-Substrat verwendet. TABELLE
12
- * Natriumsalz
- ** Konzentrationen in mg/l
-
Der
Versuch mit BA zusammen mit Kanamycin, welches das herkömmliche
negative Selektionssystem ist, wurde als zwei unabhängige Versuche
mit 54 Blattscheiben pro Versuch wiederholt. Ein einziger GUS-positiver
Keim wurde unter einer Gesamtzahl von 23 selektierten Keimen gefunden.
Die Ergebnisse für das
BA3GN-Natriumsalz
wurden unter Verwendung von 324 Blattscheiben erhalten. Der Versuch
mit SL (Saccharo-1,4-lacton) wurde einmal mit insgesamt 162 Blattscheiben
durchgeführt.
-
Die
obige Tabelle zeigt, dass positive Selektion unter Verwendung von
15 mg/l BA3GN-Natriumsalz (ohne Kanamycin) 30mal mehr GUS-positive
Keime pro Blattscheibe ergab als das herkömmliche negative Selektionssystem
unter Verwendung von 1 mg/l BA und 300 mg/l Kanamycinsulfat. Weiterhin
war ein größerer Prozentanteil
der Gesamtzahl an Keimen GUS-positiv, wenn positive Selektion angewendet
wurde (7,4%), als wenn negative Selektion angewendet wurde (4,3%).
-
Vorteilhafte
Ergebnisse wurden auch erhalten, wenn eine Kombination von positiver
und negativer Selektion angewendet wurde, d.h. indem ein Cytokinin
in dem herkömmlichen
kanamycinbasierten negativen Selektionssystem durch ein Cytokininglucuronid
(BA3GN-Natriumsalz) ersetzt wurde. So war, wenn 15 mg/l BA3GN-Natriumsalz
mit 300 mg/l Kanamycinsulfat kombiniert wurden, der Prozentanteil
GUS-positiver Keime 11 mal so groß wie der, der unter Verwendung
von BA und Kanamycin erhalten wurde, und wenn 15 mg/l BA3GN-Natriumsalz
mit 33 mg/l Kanamycinsulfat kombiniert wurden, war die Anzahl GUS-positiver
Keime pro Blattscheibe 40mal so groß wie die, die unter Verwendung
von BA und Kanamycin erhalten wurde.
-
Wenn
15 mg/l BA3GN-Natriumsalz mit 10 mM des GUS-Inhibitors SL kombiniert
wurden, waren sowohl die Anzahl GUS-positiver Keime pro Blattscheibe
als auch der Prozantanteil GUS-positiver Keime drastisch vermindert,
verglichen damit, wenn nur 15 mg/l BA3GN-Natriumsalz verwendet wurden.
Das zeigt, dass das eingeführte
GUS-Gen für
die vorteilhaften Ergebnisse verantwortlich ist, die unter Verwendung
des positiven Selektionssystems erhalten wurden, da die Zugabe von
SL zum Wachstumsmedium die β-glucuronidasekatalysierte
Umwandlung von inaktivem Cytokininglucuronid (BA3GN-Natriumsalz)
zu aktivem Cytokinin in Zellen, die auf diesem Substrat gewachsen
sind, stark hemmt und dadurch zu dem beobachteten Rückgang in
der Anzahl induzierter Keime führt.
Das positive Selektionssystem funktioniert also wie beabsichtigt,
d.h. unter Verwendung einer eingeführten β-Glucuronidase, um ein Cytokininglukuronid
in genetisch transformierten Zellen zu spalten und dabei freies
Cytokinin in diesen Zellen freizusetzen und zu Keimbildung zu führen.
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BEISPIEL 12
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MODIFIZIERUNG
DES POSITIVEN SELEKTIONSSYSTEMS ZUR VERBESSERUNG DER SELEKTIVEN WIRKUNG
DER CYTOKININGLUCURONIDE
-
Es
ist bereits gezeigt worden (siehe Tabelle 3, Beispiel 3), dass die
natürlich
auftretende β-Glucuronidase
in Pflanzen bei relativ hohen pH-Werten inaktiv ist, d.h. bei pH-Werten
von ungefähr
6 oder mehr, während
die eingeführte β-Glucuronidase
bis zu pH 8 aktiv ist. Durch Zugabe einer Verbindung zum Wachstumsmedium,
die die den inneren pH der Zellen erhöhen kann, beispielsweise Ammoniumnitrat,
kann die selektive Keimbildung von GUS-positiven Zellen weiter verbessert
werden, da es dadurch möglich
wird, jegliche Hintergrund-β-Glucuronidaseaktivität, die die
Folge natürlich
auftretender β-Glucuronidase
in den nichttransformierten Zellen ist, zu blockieren.
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Die
Tabelle unten zeigt die Anzahl an Keimen, die von GUS-positiven
und GUS-negativen
Tabakblattscheiben unter Verwendung verschiedener Konzentrationen
von BA3GN-Natriumsalz und Ammoniumnitrat erhalten wurden. Die angewendeten
Verfahren waren die gleichen wie die in Beispiel 3 beschriebenen,
mit der Ausnahme, dass Gamborg B5-Substrat anstelle von MSO-Substrat
verwendet wurde. TABELLE
13
- * der Selektivitätsfaktor ist die Anzahl GUS-positiver
Keime dividiert durch die Anzahl GUS-negativer Keime und gibt so
einen Hinweis auf die Selektivität
einer gegebenen Behandlung
- ** Natriumsalz
-
Man
kann sehen, dass die Verwendung von sowohl BA3GN-Natriumsalz als
auch Ammoniumnitrat in angemessenen Konzentrationen zu selektiver
Keimbildung in den GUS-positiven Blattscheiben führt. Zum Beispiel ergab eine
Kombination von 15 mg/l BA3GN-Natriumsalz und 55 mM Ammoniumnitrat
34 Keime von den GUS-positiven
Blattscheiben, während
an entsprechenden GUS-negativen Blattscheiben, die derselben Behandlung
ausgesetzt waren, keine Keime gebildet wurden.
-
Eine
andere Möglichkeit,
die Selektivität
des positiven Selektionssystems unter Verwendung von Cytokininglukuroniden
zu verbessern, ist, zu dem Wachs tumsmedium ein Substrat zuzugeben,
das nach Spaltung durch β-Glucuronidase
zu einem pH-Anstieg führt
und dadurch die Hydrolyse von Cytokininglucuroniden in den nichttransformierten
Zellen hemmt, ohne die Wirkung von freiem Cytokinin zu hemmen.
-
Dieses
Prinzip wurde in einem Versuch zur Wirkung verschiedener Konzentrationen
von o-Cumaryl-β-D-glucopyranuronsäure (CouGN)
auf die durch BA3GN-Natriumsalz
oder BA induzierte Keimbildung von GUS-negativen Tabakblattscheiben
veranschaulicht. Wenn o-Cumaryl-β-D-glucopyranuronsäure durch
die Wirkung von β-Glucuronidase
gespalten wird, wird o-Cumarsäure
freigesetzt. Wie oben erwähnt
(siehe Beispiel 1I), wird o-Cumarsäure spontan in Cumarin umgewandelt.
Dies beinhaltet die Eliminierung einer Säuregruppe (siehe unten) und
damit einen Anstieg des pH auf eine Höhe, bei der die Aktivität der nativen β-Glucuronidase
der Pflanze vermutlich vermindert ist.
-
-
Der
Versuch wurde unter Verwendung einer BA-Konzentration von 0,5 mg/l
und einer Konzentration an BA3GN-Natriumsalz von 10,0 mg/l durchgeführt. Es
gab pro Behandlung 12 Scheiben und die Anzahl an Keimen wurde nach
19 Tagen festgestellt. Die Ergebnisse sind unten gezeigt. TABELLE
14
-
Die
obige Tabelle zeigt, dass die Gegenwart von o-Cumaryl-β-D-glucopyranuronsäure im Wachstumsmedium
Keimneubildung hemmt, die durch BA3GN-Natriumsalz, nicht aber von
BA induziert wird. Beste Ergebnisse wurden in diesem Versuch unter
Verwendung einer o-Cumaryl-β-D-glucopyranuronsäurekonzentration
von ungefähr
3-4 mM erhalten. Verschiedene Mechanismen könnten an der Verminderung der
durch BA3GN induzierten Keimneubildung beteiligt sein, einschließlich der
folgenden: 1) ein erhöhter
pH infolge der Freisetzung von o-Cumarsäure, wie oben erklärt, 2) Substratkonkurrenz
zwischen CouGN und BA3GN, die zu einer geringeren Hydrolyserate
von BA3GN führt,
und 3) ein verminderter Transport von BA3GN in die Zellen. Während die
genauen Mechanismen, die an der beobachteten Verminderung der Keimbildung
in Gegenwart von CouGN beteiligt sind, nicht bestimmt wurden, glaubt
man, dass ein erhöhter
pH wahrscheinlich zumindest teilweise verantwortlich war. In jedem
Fall weist dieses Experiment darauf hin, dass die Selektivität des positiven Selektionssystems
durch Verwendung des eingeführten β-Glucuronidasegens
verbessert werden kann, um einen selbstregulierenden Mechanismus
aufzubauen, der die Wirkung jedes Hintergrundenzyms bedeutend vermindern
kann.
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BEISPIEL 13
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HERSTELLUNG
GENETISCH TRANSFORMIERTER PFLANZEN
-
Das
Folgende gibt eine allgemeine Methode an, die für die Herstellung genetisch
transformierter Pflanzen angewendet werden kann.
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Pflanzenmaterial
-
Blätter (Nicotiana
tabacum 'Wisconsin
38') werden von
Pflanzen erhalten, die in vitro oder in vivo gezogen wurden. Im
letzteren Fall werden die Blätter
vor der Transformation sterilisiert. Die Sterilisation kann durchgeführt werden,
indem man die Blätter
für 20
min. in eine Lösung
aus 5%igem Calciumhypochlorit, die 0,1 ml Tween 80 pro Liter enthält, legt,
gefolgt von 5maligem Waschen in sterilem Wasser. In vitro-Pflanzen werden
in Gefäßen auf
1/2 MSO gezüchtet.
(1/2 MSO ist dasselbe Substrat wie MSO in einer 50% Konzentration
mit Ausnahme von Agar, Zucker und Vitaminen.)
-
Die
Blätter
werden einzeln in eine 14 cm Petrischale gelegt. Sie werden dann
gestanzt oder in Stücke von
ungefähr
1 cm2 geschnitten ohne eine Hauptblattrippe,
wobei die Kanten der Stücke
aus Gewebe bestehen, das geschnitten wurde. Jegliches geschnittenes
Gewebe, das durch die Hypochloritsterilisation gebleicht wurde,
wird entfernt.
-
Kultivierung
von Bakterien
-
Einen
Tag vor der Transformation wird eine Bakterienkultur gestartet,
indem man 2-3 ml Bakterien zu 200 ml LB-Medium in einem Erlenmeyerkolben
gibt. Die Bakterien werden bei 28 °C unter Bewegung (300 rpm) gezüchtet.
-
Transformation
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Die
Bakterienkultur wird mit 1/2 MSO 50x oder auf OD 0,1 (bei 660 nm)
unmittelbar vor der Transformation verdünnt. Ungefähr 10 ml der verdünnten Bakteriensuspension
wird in eine 9 cm Petrischale geschüttet, und die Blattstücke werden
für 15
min. in diese Suspension getaucht. Die Blattstücke werden dann entfernt und überschüssige Bakteriensuspension
wird mit sterilem Filterpapier entfernt.
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Cokultivierung
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Am
Tag vor der Transformation wird ein Stück steriles Filterpapier auf
Cokultivierungsschalen gelegt (die typischerweise MSO-Substrat enthalten)
und die Blattstücke,
die in die Bakteriensuspension getaucht worden waren, werden mit
der Oberseite nach unten auf das Filterpapier gelegt. Die Blattstücke werden
in einer Wachstumskammer mit einem Zyklus von 12 Stunden Licht und
12 Stunden Dunkelheit 2 Tage lang inkubiert.
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Selektion/Neubildung
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Die
Blattstücke
werden in Petrischalen übertragen,
die Cytokininglucuronide wie angegeben und entweder 350 mg/l Carbenicillin
+ 350 mg/l Cefotoxim oder nur 800 mg/l Carbenicillin, in bestimmten
Fällen
in Kombination mit Kanamycinsulfat, enthalten. Die Blattstücke werden
nach 3 Wochen auf das gleiche Medium subkultiviert, aber ohne Cytokininglucuronide.
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Assay
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Neugebildete
Keime werden in Gefäße mit 1/2
MSO übertragen.
Nach ungefähr
2 Wochen wird der X-gluc-Assay an den grünen Keimen durchgeführt. Die
Keime werden nach Bedarf subkultiviert.
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Auspflanzen
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Genetisch
transformierte Keime, die Wurzeln gebildet haben (und die GUS-positiv
sind) werden in einer Wachstumskammer ausgepflanzt. Die Keime werden
in ein geeignetes Wachstumsmedium gepflanzt, z.B. Sphagnum. Sie
werden dann mit Plastiktüten
bedeckt und ungefähr
eine Woche wachsen gelassen, wonach die zwei Ecken der Plastiktüten abgeschnitten
werden. Nach einer weiteren Woche werden die Plastiktüten entfernt.
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BEISPIEL 14
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INDUKTION VON KEIMBILDUNG
VON PFLANZENGEWEBE MIT UND OHNE EIN EINGEFÜHRTES β-GLUCURONIDASEGEN UNTER VERWENDUNG
VON STEROLEN UND EINES DI-β-D-GLUCURONIDS
-
Tests ähnlich den
in Beispielen 5 und 6 beschriebenen wurden an GUS-positiven und
GUS-negativen Tabakblattscheiben durchgeführt, unter Verwendung von Substraten,
die 100 mg/l β-Sitosterol,
100 mg/l Cholesterol, 10 mg/l Campesterol, 1,88 mg/l BA3GN-Natriumsalz
und verschiedene Konzentrationen der Di-β-D-glucuronidglycyrrhizinsäure in der
Form eines Diammoniumsalzes enthielten. Zusätzlich enthielt die Hälfte der
Substrate 0,1 mM Tridemorph. Die Anzahl an Keimen wurde nach 17
Tagen festgestellt.
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Die
Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle gezeigt. TABELLE
15
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Man
kann sehen, dass die Kombination von Sterolen und des Diammoniumsalzes
von Glycyrrhizinsäure
zu selektiver Keimbildung in Blattscheiben führt, die ein eingeführtes β-Glucuronidasegen
enthalten. (Wie oben erwähnt
(siehe Beispiel 5), hemmt Tridemorph die Synthese von Sterolen und
hat so eine hemmende Wirkung auf Keimneubildung, wenn das Pflanzengewebe
nicht mit Sterolen versorgt wird). Während die selektive Keimauslösungswirkung
zu sehen ist, wenn man Substrate mit und ohne Tridemorph verwendet,
wird die größte Anzahl
an Keimen in den Substraten erhalten, die Tridemorph enthalten,
und insbesondere mit einer Glycyrrhizinsäurediammoniumsalzkonzentration
von 0,125 mM.
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BEISPIEL 15
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SELEKTIVE INHIBITION VON
BA3GN-INDUZIERTER KEIMBILDUNG VON WILDTYP-(GUS-)TABAKBLATTSCHEIBEN
-
Es
wurden Versuche durchgeführt
wie in Beispiel 3 beschrieben unter Verwendung der Tabakvarietät 'Burley' anstelle von 'Wisconsin 38'. Methyl-β-D-glucuronid
(MG), welches durch GUS zu Methanol und Glucuronsäure hydrolysiert
wird, wurde dem Substrat in verschiedenen Konzentrationen zugegeben,
zusammen mit entweder 1 mg/l BA oder 15 mg/l BA3GN-Natriumsalz.
Es wurde gezeigt, dass Methanol das native GUS-Enzym hemmt, ohne
das eingeführte
E. coli-Enzym sehr stark zu beeinträchtigen (Kosugi et al., 1990,
Plant Sci., 133-120), während
Glucuronsäure,
die aus Methyl-β-D-glucuronid
freigesetzt wird, ein Produktinhibitor von GUS-Enzymen ist. Durch Zugabe von MG anstelle
der unabhängigen
Zugabe der beiden Verbindungen werden die Hydrolyseprodukte lokal
produziert und in dem Kompartiment konzentriert, in dem das Enzym
lokalisiert ist. Die erhaltenen Ergebnisse sind unten in Tabelle
16 gezeigt.
-
-
Die
obigen Ergebnisse zeigen, dass die Zugabe von entweder MG oder Glucuronsäure zu einer
Verminderung der Anzahl an Keimen, die auf dem BA3GN-Substrat erhalten
wurden, führt,
verglichen mit der Anzahl an Keimen, die auf dem BA-Substrat erhalten
wurden. Durch Behandlung des Gewebes mit MG vor der Expression des
eingeführten
GUS-Enzyms kann es deshalb möglich
sein, die Aktivität
oder Wirkung des nativen GUS-Enzyms während des Selektionsprozesses
selektiv zu eliminieren oder zu vermindern. Unterschiede zwischen
den eingeführten
und den nativen GUS-Enzymen hinsichtlich Inhibition aufgrund von
Substratkonkurrenz, Empfindlichkeit auf Substratinhibition, Menge
an Enzym (Aktivität)
und Empfindlichkeit auf Produktinhibition können auch die Wirkungen von
MG und anderen Komponenten, die eine ähnliche Wirkung auf Wildtyp-Gewebe,
die mit Glucuroniden behandelt wurden, haben, erklären.
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Es
ist auch möglich,
dass MG dadurch wirkt, dass es mit der Aufnahme anderer Glucuronide
wie BA3GN konkurriert. Wenn das der Fall ist, könnte MG verwendet werden, um
die Aufnahme anderer Glucuronide in Wildtyp-Zellen zu vermindern
oder zu eliminieren. Einführung
eines Gens, das ein GUS-Gen codiert, das abgesondert wird, oder
eines Gens, das eine Glucuronidpermease codiert, könnte verwendet werden,
um transgene Zellen zu selektieren, wenn die Aufnahme durch beispielsweise
Zugabe von MG zum Substrat gehemmt wird. Im Falle von Glucuronidpermease
würden
nur transgene Zellen das Glucuronid (z.B. BA3GN) aufnehmen und wegen
des allgemeinen Vorkommens des nativen Enzyms in Pflanzen (siehe
z.B. Beispiel 3) würde
die Verbindung innerhalb der Zellen aktiviert werden und die Permease
(oder ein anderes Protein, das die Aufnahme von Glucuroniden erleichtert)
exprimieren.
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Es
ist auch interessant, dass Glucuronsäure selbst selektiv die Wirkung
von BA3GN hemmen kann, vermutlich indem es die Wirkung von BA, das
durch Spaltung von BA3GN durch GUS freigesetzt wurde, blockiert.
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BEISPIEL 16
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VERWENDUNG POSITIVER SELEKTION
UND EINER KOMBINATION VON POSITIVER UND NEGATIVER SELEKTION ZUR
VERBESSERUNG DER WIRKSAMKEIT DER SELEKTION VON TRANSGENEN ZELLEN, GEWEBEN
ODER KEIMEN VON WIDERSPENSTIGEN ARTEN
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Zuckerrübe ist eine
sehr widerspenstige Art hinsichtlich der Produktion transgener Pflanzen.
Viele untransformierte Keime werden „selektiert" unter Bedingungen,
die in gewöhnlichen
Transformationssystemen transgene Keime ergeben. Es wurde gefunden,
dass das auch der Fall ist, wenn positive Selektionsversuche (ohne
Zugabe von Kanamycin) unter Verwendung von 5-15 mg/l BA3GN-Natriumsalz
unter den im folgenden beschriebenen Bedingungen durchgeführt wurden.
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In
Beispiel 11 (siehe Tabelle 12) wurde gefunden, dass die Kombination
von positiver und negativer Selektion die Anzahl „selektierter" nichttransformierter
Keime vermindert. Deshalb wurde die Kombination von positiver und
negativer Selektion an Zuckerrüben
getestet, und es wurde gefunden, dass dies vorteilhafte Ergebnisse
ergibt.
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Transformation
wurde durchgeführt
unter Verwendung von Kotyledonen-Explantaten wie unten beschrieben.
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Samen
wurden 4 Tage lang in Dunkelheit auf einem Substrat, das 0,7 g/l
Agarose und 2 g/l Saccharose enthielt, gekeimt. Die Sämlinge wurden
dann in einen Nunc- Behälter übertragen,
der 1/2 × MSO
Substrat enthielt, und drei Tage lang im Licht kultiviert. Die Kotyledonen
wurden von den Sämlingen
entfernt, und die Kotyledonen-Explantate
am Petiolus mit einer kleinen Bürste
gebürstet,
die eine Agrobacterium-Suspension
enthielt, wobei das Agrobacterium 35S-NPTII und 35S-GUS (OD 660
= 0,1) enthielt. Die Kotyledonen wurden dann 4 Tage lang auf einem
Substrat, das 1/10 MSO-Substrat und 200 μM Acetosyringon enthielt, cokultiviert. Die
transformierten Explantate wurden auf ein MSO-Substrat übertragen,
das mit 0,25 mg/l BA oder 15 mg/l BA3GN-Natriumsalz (anstelle von
BAP), 0,025 mg/l Naphthylessigsäure,
400 mg/l Kanamycin, 800 mg/l Carbenicillin und 25 mg/l Vancomycin
ausgestattet war, und die Explantate wurden 21 Tage lang auf diesem
Substrat inkubiert. Die neugebildeten Keime wurden dann in Gefäße übertragen,
die dasselbe Substrat enthielten. Nach 52 Tagen auf diesem Substrat
wurden alle Keime auf MSO-Substrat übertragen, das mit 800 mg/l
Carbenicillin, 25 mg/l Vancomycin und 0,1 mg/l BA ausgestattet war.
Nach 14 Tagen wurden GUS-Assays wie in Beispiel 3 beschrieben an
dem selektierten Pflanzenmaterial durchgeführt.
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Die
Ergebnisse sind in der Tabelle unten gezeigt
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Man
kann sehen, dass mit der Kombination von positiver und negativer
Selektion transgene Keime unter Bedingungen produziert werden, in
denen unter Verwendung des herkömmlichen
negativen Selektionssystems keine transgenen Keime produziert werden.
Das zeigt, dass bei Zuckerrüben
die Verwendung des positiven Selektionssystems sehr vorteilhaft
ist verglichen zur Verwendung des reinen negativen Selektionssystems.
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Das
wiederum zeigt, dass es die Anwendung der positiven Selektion (allein
in Kombination mit negativer Selektion) möglich machen kann, transgene
Pflanzen in anderen widerspenstigen Arten zu produzieren, in denen
nur niedrige Transformations/Selektionsraten erreicht werden, oder
in denen unter Verwendung negativer Selektionssysteme überhaupt
keine transgenen Pflanzen selektiert werden können.
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BEISPIEL 17
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POSITIVE SELEKTIONSSYSTEME
AUF DER BASIS DER VERWENDUNG INAKTIVER N-QUELLEN, ERHÄLTLICH DURCH
DIE EINFÜHRUNG
METABOLISIERENDER GENE
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Es
wurden Versuche wie in Beispiel 3 beschrieben durchgeführt, aber
der normale Stickstoffgehalt des MSO-Substrates wurde auf 0 erniedrigt.
Stattdessen wurden die in Tabelle 18 angegebenen Stickstoffverbindungen
zugegeben. Das Substrat enthielt 1 mg/l BA. Substrate, die Ammoniumnitrat
enthielten, wurden als positive Kontrolle verwendet.
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Diese
Versuche wurden durchgeführt,
um zu untersuchen, ob Opine inaktiv sind, oder ob sie von Pflanzenzellen
als Stickstoffquellen in Substraten, die keine andere Stickstoffquelle
enthalten, genutzt werden können.
Weil Gene, die Enzyme codieren, die Opine metabolisieren, wohlbekannt
sind, ist die Hauptvoraussetzung für die Verwendung von Opinen
in einem positiven Selektionssystem die Identifizierung von Opinen,
die nicht als Stickstoffquelle für
Pflanzengewebe und Zellen verwendet werden können, die keine eingeführten Gene
enthalten, die die Pflanzenzellen befähigen, die fraglichen Opine
zu nutzen. Die Ergebnisse sind unten angegeben.
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In
getesteten Substraten, die keinen Stickstoff enthielten, wurden
ein paar Keime gebildet. Das kann möglich gewesen sein, weil Stickstoff
aus dem Gewebe in dem Explantat mobilisiert werden kann. Um jegliche Keimbildung
in den Behandlungen ohne jeden Stickstoff zu vermeiden, können die
Explantate an Stickstoff ausgehungert werden, indem man die Vorläuferkulturen
vor der Verwendung auf stickstofffreien Substraten züchtet oder
indem man die Explantate auf einem stickstofffreien Substrat, beispielsweise
ohne keimauslösende
Hormone, vorbehandelt.
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Es
wurde überraschenderweise
gefunden, dass Octopin und Nopalin Keimbildung nicht unterstützen können, während Mannopin
als gute Stickstoffquelle wirken und Keimbildung aus den Blattscheiben
unterstützen
kann.
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Es
ist wahrscheinlich, dass der Grund, warum Nopalin und Oktopin nicht
als Stickstoffquelle wirken können,
der ist, dass diese Verbindungen nicht aufgenommen, metabolisiert
oder hydrolisiert werden zu nutzbaren Verbindungen.
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Es
ist wohl bekannt, dass Organismen, die Gene enthalten, die am Transport
und Metabolismus von Opinen beteiligt sind, beispielsweise Agrobacterium,
Opine als Stickstoffquelle nutzen können, während Agrobacterium oder andere
Bakterienstämme,
die keine Gene enthalten, die Opinmetabolismus codieren, auf Substraten,
die nur Opine als Stickstoffquelle enthalten, nicht wachsen können.
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Basierend
auf diesen Ergebnissen können
positive Selektionssysteme durch Einführung von einem oder mehreren
Opinmetabolismus- oder -transportgenen in transgene Pflanzenzellen
unter Verwendung von Selektionssubstraten, die keine oder nur in
geringem Maße
Stickstoffquellen enthalten, die von beispielsweise Nopalin oder
Octopin verschieden sind, aufgebaut werden. Die Identifizierung
und Isolierung von Genen und genetischen Material, das dem Empfänger die
Fähigkeit
verleiht, Octopin und Nopalin zu nutzen, wurde in der Literatur
beschrieben: siehe z.B. C. Beaulieu et al., 1988, Can. J. Microbiol.,
38: 843-49; P. M. Klapwijk et al. 1976, J. Gen. Microbiol., 96:
155-163; C. L. Schardl und C. I. Kado, 1983, Mol. Gen. Genet., 191:
10-16 oder H. Wabiko et al., 1990, J. Gen. Microbiol. 136: 97-103.
Bei Isolierung von genetischem Material, das Opinmetabolismus codiert,
können
eukaryontische Organismen gemäß den Standardverfahren,
die in der Literatur beschrieben sind, mit entsprechenden Sequenzen,
die für
das Funktionieren der Gene für
Opinmetabolismus nötig
sind, transformiert werden.
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Basierend
auf den obigen Ergebnissen ist es wahrscheinlich, dass andere Opine
und entsprechende katabolisierende Gene in ähnlicher Weise verwendet werden
können,
und es erscheint weiterhin wahrscheinlich, dass andere inaktive
N-Quellen, die durch ähnliche
Mittel identifiziert werden, und ihre entsprechenden Gene ähnlich verwendet
werden können,
z.B. Amide in Kombination mit Amidasen, Peptide in Kombination mit spezifischen
Peptidasen, usw.
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BEISPIEL 18
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PRODUKTION
VON TRANSGENEM KALLUS AUS WIDERSPENSTIGEN ARTEN UNTER VERWENDUNG VON
POSITIVER SELEKTION IN KOMBINATION MIT NEGATIVER SELEKTION
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Es
wurden Versuche durchgeführt
wie in Beispiel 11 beschrieben, aber mit gewissen Veränderungen. Die
verwendeten Pflanzenarten waren die sehr widerspenstigen Zuchtlinien „V486" von Winterölraps und „S487" von Sommerölraps. Samen
wurden sterilisiert und gekeimt wie in Beispiel 16 beschrieben.
Hypokotyle wurden als Explantate verwendet und geimpft und cokultiviert
wie in Beispiel 11 beschrieben. Nach Cokultivierung wurden die Explantate
auf MSO-Substrat übertragen,
das 0,1 mg/l Naphthylessigsäure,
0,01 mg/l Gibberellinsäure
(GA3), 500 mg/l Carbenicillin, 50 mg/l Kanamycinsulfat und 6,0 mg/l
Agarose enthielt. Das Substrat enthielt zusätzlich entweder 1 mg/l BA oder
3,75, 7,5, oder 15,0 mg/l BA3GN-Natriumsalz.
Der pH wurde auf 5,8 eingestellt. Das verwendete Agrobacterium enthielt
in seiner T-DNA ein GUS-Gen und ein Neomycinphosphotransferase-II-Gen,
das von 35S-Promotoren gesteuert wurde. GUS-Assays wurden nach 8
Wochen durchgeführt
und Kalli, die eine intensive blaue Einfärbung in den meisten Kalluszellen
zeigten, wurden als GUS+ aufgezeichnet.
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Diese
Versuche zeigen, dass bei diesen sehr widerspenstigen Typen von Ölraps nur
positive Selektion in Kombination mit negativer Selektion die Selektion
transgener Kalli erlaubte, während
kein GUS-positiver Kallus mit herkömmlicher negativer Selektion
(Substrat mit BA anstelle von BA3GN-Natriumsalz) erhalten wurde.
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Das
zeigt, dass die Einführung
der positiven Selektionssysteme sehr vorteilhaft ist, verglichen
mit den reinen negativen Selektionssystemen, auch in Kallussystemen.
Es zeigt auch, dass die Verwendung positiver Selektion (allein oder
in Kombination mit negativer Selektion) es möglich machen kann, transgene
Pflanzen in anderen widerspenstigen Arten, in denen nur niedrige
Transformations/Selektionsraten erzielt werden, oder in denen überhaupt
keine transgenen Pflanzen unter Verwendung negativer Selektionssysteme
erhalten werden, hergestellt werden können.
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Nachdem
transgener Kallus selektiert wurde, kann er in transgene Keime neugebildet
werden, beispielsweise auf einem Substrat, das ein Cytokinin in
Kombination mit einer niedrigen Konzentration an Auxinen enthält. Bei
diesem Prozess ist keine Selektion erforderlich.