DE69229556T3 - Verfahren zur selektion genetisch transformierter zellen und dafür verwendbare verbindungen - Google Patents

Verfahren zur selektion genetisch transformierter zellen und dafür verwendbare verbindungen Download PDF

Info

Publication number
DE69229556T3
DE69229556T3 DE69229556T DE69229556T DE69229556T3 DE 69229556 T3 DE69229556 T3 DE 69229556T3 DE 69229556 T DE69229556 T DE 69229556T DE 69229556 T DE69229556 T DE 69229556T DE 69229556 T3 DE69229556 T3 DE 69229556T3
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
cells
glucuronidase
selection
gus
glucuronide
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
DE69229556T
Other languages
English (en)
Other versions
DE69229556T2 (de
DE69229556D1 (de
Inventor
Finn T. Okkels
Robert J. Leicester LE9 WHENHAM
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Syngenta Participations AG
Original Assignee
Syngenta Participations AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=8105710&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=DE69229556(T3) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Syngenta Participations AG filed Critical Syngenta Participations AG
Application granted granted Critical
Publication of DE69229556D1 publication Critical patent/DE69229556D1/de
Publication of DE69229556T2 publication Critical patent/DE69229556T2/de
Publication of DE69229556T3 publication Critical patent/DE69229556T3/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H15/00—Compounds containing hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
    • C07H15/20—Carbocyclic rings
    • C07H15/203—Monocyclic carbocyclic rings other than cyclohexane rings; Bicyclic carbocyclic ring systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H15/00—Compounds containing hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
    • C07H15/26—Acyclic or carbocyclic radicals, substituted by hetero rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H17/00—Compounds containing heterocyclic radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
    • C07H17/02—Heterocyclic radicals containing only nitrogen as ring hetero atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C07H19/16—Purine radicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C07H19/16—Purine radicals
    • C07H19/20—Purine radicals with the saccharide radical esterified by phosphoric or polyphosphoric acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/65—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression using markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8209—Selection, visualisation of transformants, reporter constructs, e.g. antibiotic resistance markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C12N15/8245—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving modified carbohydrate or sugar alcohol metabolism, e.g. starch biosynthesis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0018—Culture media for cell or tissue culture
    • C12N5/0025—Culture media for plant cell or plant tissue culture
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2434—Glucanases acting on beta-1,4-glucosidic bonds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/90—Isomerases (5.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/90—Isomerases (5.)
    • C12N9/92—Glucose isomerase (5.3.1.5; 5.3.1.9; 5.3.1.18)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01031—Beta-glucuronidase (3.2.1.31)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Heterocyclic Carbon Compounds Containing A Hetero Ring Having Oxygen Or Sulfur (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Transition And Organic Metals Composition Catalysts For Addition Polymerization (AREA)

Description

  • GEBIET DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren, um genetisch transformierte Pflanzenzellen, in die eine erwünschte Nukleotidsequenz eingeführt wurde, zu selektieren, indem man die transformierten Zellen mit einem selektiven Vorteil versieht, ohne die nicht transformierten Zellen zu schädigen, sowie auf in dem Verfahren verwendbare neuartige Verbindungen.
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Es ist wohlbekannt, dass, wenn neues genetisches Material durch Transformation in eine Zellpopulation eingeführt werden soll, nur eine bestimmte Anzahl der Zellen erfolgreich transformiert werden, d.h. das neue genetische Material erhalten. Es ist dann notwendig, die genetisch transformierten Zellen zu identifizieren, damit diese Zellen von den nicht transformierten Zellen in der Population abgetrennt werden können. Identifizierung und Abtrennung der transformierten Zellen wurden herkömmlicherweise erreicht, indem etwas verwendet wurde, was als "negative Selektion" bezeichnet werden kann, mit anderen Worten, durch Verwendung eines Verfahrens, bei dem die transformierten Zellen überleben und wachsen können, während die nicht transformierten Zellen einer Wachstumshemmung unterliegen oder vielleicht sogar durch eine Substanz abgetötet werden, die die transformierten Zellen aushalten können.
  • Wenn zum Beispiel eine Population von Pflanzenzellen einer genetischen Transformation unterzogen wird, findet die Selektion der transformierten Zellen typischerweise statt, indem man ein Selektionsgen verwendet, das Antibiotika- oder Herbizidresistenz codiert. Das Selektionsgen – das selbst im allgemeinen keine nützliche Funktion in der genetisch transformierten Pflanze hat, und eigentlich in der Pflanze unerwünscht sein kann – wird mit dem Gen, das in die in Frage kommende Pflanze eingeführt werden soll, gekoppelt oder miteingeführt, so dass beide der zwei Gene in die Zellpopulation eingeführt werden, oder eher in bestimmte Zellen in der Population, da es in der Praxis nicht möglich ist, alle oder sogar eine Mehrzahl der Zellen zu transformieren. Die Zellen werden dann auf oder in einem Medium, das das Antibiotikum oder Herbizid enthält, gegen das die genetisch transformierten Zellen mittels des Selektionsgens resistent sind, kultiviert, wodurch die transformierten Zellen identifiziert werden können, da die nicht transformierten Zellen – die das in Frage kommende Antibiotika- oder Herbizidresistenzgen nicht enthalten – einer Wachstumshemmung unterliegen oder abgetötet werden.
  • Diese negativen Selektionsverfahren haben jedoch bestimmte Nachteile. Erstens können die nicht transformierten Zellen wegen der Anwesenheit von beispielsweise Antibiotika im Wachstumsmedium absterben. Wenn die Zellpopulation ein zusammenhängendes Gewebe ist, besteht infolgedessen ein klares Risiko, dass nicht nur die nicht transformierten Zellen, sondern auch die transformierten Zellen absterben können, wegen der Tatsache, dass das Absterben der nicht transformierten Zellen die Nährstoffversorgung der transformierten Zellen unterbrechen kann, oder weil die geschädigten oder absterbenden nicht transformierten Zellen giftige Verbindungen absondern können.
  • Ein anderer bedeutender Nachteil der negativen Selektion ist der, dass die Anwesenheit eines unnötigen Gens für beispielsweise Antibiotikaresistenz unerwünscht sein kann. Es gibt zum Beispiel unter Umweltschutzgruppen und Regierungsstellen Bedenken, ob es sicher ist, Gene, die eine Antibiotikaresistenz codieren, in Pflanzen und Mikroorganismen einzuführen. Diese Bedenken sind von besonderer Bedeutung für Nahrungspflanzen und Mikroorganismen, die nicht dafür bestimmt sind, in einer abgeschlossenen Umgebung verwendet zu werden (z.B. Mikroorganismen für die Verwendung in der Landwirtschaft), sowie für Mikroorganismen, die zur Verwendung in einer abgeschlossenen Umgebung vorgesehen sind, die aber versehentlich aus der abgeschlossenen Umgebung freigesetzt werden können. Während sich diese Bedenken als unbegründet erweisen können, können solche Bedenken dennoch zu Einschränkungen von Seiten der Regierung für die Verwendung von Genen für Antibiotikaresistenz in beispielsweise Pflanzen führen, und es ist desahlb wünschenswert, neue Methoden zur Selektion genetisch transformierter Zellen, die nicht von solchen Genen abhängig sind, zu entwickeln.
  • Ein weiterer Nachteil der negativen Selektion ist, dass Pflanzengewebe oder -zellen, die mit giftigen Substanzen behandelt werden, für bakterielle Infektionen anfälliger werden. Das ist ein Problem, wenn Agrobacterium als Transformationsvektor verwendet wird, weil die behandelten Gewebe oder Zellen manchmal von dem Bakterium überwuchert werden, obwohl Antibiotika verwendet werden, um Bakterienwachstum zu verhindern.
  • Außerdem erfordert die Selektion von Zellen oder Geweben unter Verwendung negativer Selektion sehr genaue Wahl des richtigen Zeitpunkts der Expression der eingeführten Gene in Bezug auf den Selektionsprozess. Wenn die transgenen Zellen mit einer giftigen Substanz behandelt werden, bevor das entgiftende Gen exprimiert wird, oder bevor genug Genprodukte hergestellt sind, um die Wirkung der giftigen Verbindung zu antagonisieren, werden die transgenen Zellen zusammen mit den nicht transgenen Zellen abgetötet. Wenn die Selektion zu spät erfolgt, kann die Selektion der transgenen Zellen oder Gewebe behindert sein, besipielsweise durch Keimbildung aus nicht transgenen Zellen oder Geweben.
  • Die obigen Nachteile werden durch das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung (genannt "positive Selektion") beseitigt, das es zum ersten Mal ermöglicht, genetisch transformierte Pflanzenzellen zu identifizieren und zu isolieren, ohne die nicht transformierten Zellen in der Population zu schädigen oder abzutöten, und ohne Coeinführung von Antibiotika- oder Herbizidresistenzgenen. Zusätzlich zu der Tatsache, dass die Notwendigkeit von Antibiotika- oder Herbizidresistenzgenen beseitigt wird, wurde gezeigt, dass das Verfahren der positiven Selektion gemäß der vorliegenden Erfindung oft weitaus effizienter als die herkömmliche negative Selektion ist. Wie unten in den Beispielen beschrieben, ist die Anzahl transgener Keime, die von Tabakblattscheiben unter Verwendung der positiven Selektion selektiert wurden, beispielsweise in der Größenordnung von 30mal höher als die Anzahl an Keimen, die unter Verwendung eines herkömmlichen Kanamycinbasierten negativen Selektionssystems selektiert wurden, und eine Kombination aus positiver und negativer Selektion gab eine Auslesehäufigkeit an transgenen Keimen von etwa 10mal derjenigen, die unter Verwendung von nur negativer Selektion erhalten wurde (siehe Beispiel 11). Außerdem liefert die Anwendung der positiven Selektion den Vorteil, dass ein einziges Gen sowohl als Reportergen als auch als Selektionsgen verwendet werden kann, was in einer Vereinfachung der Vektorkonstruktionen, stabileren Konstruktionen und 100%igen Korrelation zwischen der Expression von Reporter- und Selektionsgenen resultiert. Positive Selektion beseitigt auch die oben genannten Probleme bezüglich Wahl des Zeitpunkts, da die Verbindungen, die zur Selektion führen, immer als Folge von Genexpression erzeugt werden. So reichert sich die selektive Verbindung an, wenn das Selektionsgen exprimiert wird, und der Selektionseffekt wird offensichtlich, wenn eine genügend große Menge der selektiven Verbindung erzeugt worden ist.
  • Methoden, die Genaktivität innerhalb transformierter Zellen zu überwachen, waren im Stand der Technik bereits vorher bekannt.
  • Jefferson RA (1989) Nature Vol 342, 837-838 offenbaren die Verwendung von GUS und des Glucuronidpermeasesystems als Überwachungssystem für transformierte Pflanzenzellen. Jefferson bezieht sich insbesondere auf die Hydrolyse des X-Gluc-Substrats und die Detektion des blauen Indigofarbstoff-Produkts in transformierten Pflanzenzellen, die die 35S Promoter-gus A Gen-Konstruktion enthalten.
  • US-P 4,857,467 offenbart die Tranformation von Hefestämmen der Gattung Pichia mit DNA-Fragmenten, die Genfunktionen codieren, die die Wirtspflanze nicht hat oder nur unzulänglich hat. Die transformierten Hefezellen können auf einer Kohlenstoff- und Energiequelle wachsen, was die Expression der vom DNA-Fragment bereitgestellten Genfunktion erforderlich macht.
  • WO 89/03880 offenbart die Transfektion von Wirtszellen mit einem Gen, das Glucuronid-Permease codiert. Das System kann zusammen mit GUS-Gen-Fusionen verwendet werden.
  • Keine der zitierten Fachschriften offenbart ein Verfahren zur Selektion transformierter Pflanzenzellen, das auf der Anwesenheit einer bestimmten eingeführten Nukleotidsequenz basiert, wie es im Rahmen der vorliegenden Erfindung mitgeteilt wird.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Selektion genetisch transformierter Pflanzenzellen aus einer Zellpopulation, worin die genetisch transformierten Pflanzenzellen mit einer erwünschten exprimierbaren Nukleotidsequenz, die eine regulatorische Sequenz enthält, die ihre Expression in den transformierten Zellen ermöglicht, und einer miteingeführten exprimierbaren Nukleotidsequenz, die ebenfalls eine regulatorische Sequenz enthält, die ihre Expression in den transformierten Pflanzenzellen ermöglicht, transformiert sind, welches Verfahren umfasst, besagte Population mit einer Verbindung zu versehen, die durch das Expressionsprodukt der miteingeführten exprimierbaren Nukleotidsequenz, die mit der erwünschten exprimierbaren Nukleotidsequenz in besagte transformierte Zellen eingeführt wurde, metabolisiert werden kann, um so die transformierten Zellen verglichen mit den nicht transformierten Zellen mit einem physiologischen Vorteil zu versehen, wobei die Verbindung kein Antibiotikum oder Herbizid ist und keine direkte nachteilige Wirkung auf die nicht transformierten Zellen hat.
  • In einer Ausführung wird das Verfahren durchgeführt, indem man die Zellpopulation auf oder in einem Medium kultiviert, das wenigstens eine/n inaktive Verbindung oder Nährstoff enthält, die/der in Zellen, die die miteingeführte Nukleotidsequenz und die gewünschte Nukleotidsequenz enthalten, direkt oder indirekt aktiviert wird, wobei die Verbindung oder der Nährstoff in nicht transformierten Zellen inaktiv ist, oder in nicht transformierten Zellen weniger aktiv als in transformierten Zellen ist, so dass die transformierten Zellen mit einem selektiven Vorteil versehen sind, der es erlaubt, sie von der Zellpopulation zu selektieren.
  • In einer anderen Ausführungsform wird das Verfahren durchgeführt, indem man die Zellpopulation auf oder in einem Medium kultiviert, das wenigstens eine/n Verbindung oder Nährstoff enthält, die/der für die transformierten Zellen durch Expression oder Transkription der miteingeführten Nukleotidsequenz verfügbar gemacht wird, wobei die Verbindung oder der Nährstoff für nicht transformierte Zellen nicht verfügbar ist oder für nicht transformierte Zellen weniger verfügbar ist als für transformierte Zellen, so dass die transformierten Zellen mit einem selektiven Vorteil ausgestattet sind, der es erlaubt, sie von der Zellpopulation zu selektieren.
  • In einer weiteren Ausführungsform führt die Expression der miteingeführten Nukleotidsequenz zu einer Zunahme der Aktivität eines Enzyms, das in der Zellpopulation endogen vorhanden war, so dass die Aktivität des Enzyms in transformierten Zellen größer ist als die Aktivität des Enzyms in nicht transformierten Zellen.
  • Verbindungen, die für die Verwendung in dem obigen Verfahren geeignet sind, sind die der allgemeinen Formel I
    Figure 00060001
    worin
    R2 H, CH3, S-CH3, SO2-CH3, SCH2-phenyl, SH, OH, Cl oder eine Gruppe -S-R10, -NH-R10 oder -O-R10 ist, worin R10 eine β-D-Glucopyranuronosylgruppe [deren Struktur aus den hier enthaltenen Arbeitsbeispielen offensichtlich ist] oder ein Salz davon oder ein Ester- oder Amidderivat davon an der Carbonsäurefunktion ist,
    R6 Benzyl ist, das am Phenylring substituiert sen kann mit OH, C1-6-Alkoxy, Halogen, C1-4-Alkyl, NH2 oder CF3, oder mit -O-R10, -S-R10 oder -NH-R10, worin R10 wie oben definiert ist; C1-8-Alkyl oder C2-8-Alkenyl, das mit 1 bis 3 Hydroxy-, Glucosyloxy- oder C1-6-Alkoxygruppen, mit Phenyl, und/oder mit -O-R10, -S-R10 oder -NH-R10, worin R10 wie oben definiert ist, substituiert sein kann; verestertes C1-6-Alkyl oder C2-6-Alkenyl; Furfuryl; oder Clyclohexylureido, Phenylureido oder Tolylureido;
    entweder
    i) R7 und Y halbe Bindungen sind, die zusammen eine Bindung bilden
    ii) eines von R3 und R9 H oder eine Gruppe R10 wie oben definiert ist, und das andere eine halbe Bindung ist, die zusammen mit einer halben Bindung X eine Bindung bildet, oder R9 Ribosyl, 5'-Phosphoribosyl, Glucosyl oder -CH2CH(NH2)COOH ist und R3 eine halbe Bindung ist, die zusammen mit der halben Bindung X eine Bindung bildet, ist, und
    iii) R8 H, CH3, S-CH3, SO2-CH3, SCH2-phenyl, SH, OH, Cl oder eine Gruppe -S-R10, -NH-R10 oder -O-R10 ist, worin R10 wie oben definiert ist, oder
    iv) R7 Ribosyl, 5'-Phosphoribosyl oder Glucosyl ist, R8 H ist, R9 und Y halbe Bindungen sind, die zusammen eine Bindung bilden, und R3 eine halbe Bindung ist, die zusammen mit der halben Bindung X eine Bindung bildet; unter der Maßgabe, dass eines von R2, R3, R6, R8 und R9 eine β-D-Glucopyranuronosylgruppe oder ein Salz davon oder ein Ester- oder Amidderivat davon an der Carbonsäurefunktion ist oder enthält.
  • Weitere Verbindungen, die in dem oben genannten Verfahren verwendet werden können, sind die der allgemeinen Formel II
    Figure 00070001
    worin
    R1 cis- -CH=CH-COOH, ein Salz davon oder ein Esterderivat davon an der Carbonsäurefunktion oder das Amidderivat von cis- und/oder trans- -CH=CH-COOH ist und
    R10 wie oben definiert ist.
  • Außerdem werden hierin genetisch transformierte Zellen offenbart, die nach dem oben genannten Verfahren selektiert wurden, insbesondere Pflanzenzellen, sowie Pflanzen, Nachkommen und Samen, die sich von solchen genetisch transformierten Pflanzenzellen ableiten.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Der Begriff "Zellen" im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung soll sich auf jeglichen Typ Zellen beziehen, aus denen unter Verwendung des Verfahrens der Erfindung individuelle genetisch transformierte Zellen identifiziert und isoliert werden können, wobei Pflanzenzellen, tierische Zellen und Mikroorganismen wie Bakerien, Pilze, Hefen etc. eingeschlossen sind. Außerdem soll der Begriff "Zelle" auch Protoplasten umfassen, d.h. das Protoplasma einer Zelle, das in eine Membran eingeschlossen ist, aber ohne Zellwand. Während man erwägt, dass das allgemeine Prinzip der vorliegenden Erfindung auf jegliche Typen von Zellen angewendet werden kann, hat es sich herausgestellt, dass das Verfahren besonders geeignet ist für die Selektion genetisch transformierter Pflanzenzellen.
  • Der Begriff "Zellpopulation" bezieht sich auf jegliche Gruppe von Zellen, die einer genetischen Transformation unterzogen worden ist, und von der jene Zellen, die genetisch transformiert wurden, identifiziert werden sollen, und die genetisch transformierten Zellen von den nicht genetisch transformierten Zellen isoliert werden sollen. Die Population kann z.B. ein Gewebe sein, ein Organ oder ein Teil davon, eine Population individueller Zellen in oder auf einem Substrat, z.B. eine Zellpopulation in einer Lösung oder Suspension, oder ein ganzer Organismus, z.B. eine ganze Pflanze.
  • Der Begriff "Selektieren" bezieht sich auf den Prozess, die genetisch transformierten Zellen zu identifizieren und/oder von den nicht genetisch transformierten Zellen zu isolieren, wobei das hier offenbarte Verfahren verwendet wird.
  • Die "gewünschte Nukleotidsequenz" kann jegliche Nukleotidsequenz sein, die in die in Frage kommenden Zellen eingeführt werden soll, um genetisch transformierte Zellen herzustellen. Einführung von Nukleotidsequenzen in Pflanzen, Mikroorganismen und Tiere wird weithin praktiziert, und es gibt keine Einschränkungen bezüglich der Nukleotidsequenzen, deren Anwesenheit durch Anwendung der hier beschriebenen positiven Selektionsmerkmale nachgewiesen werden kann. Durch Verwendung dieser Methode kann die Anwesenheit der gewünschten Nukleotidsequenz in die genetisch transformierten Zellen ohne die oben erwähnten Nachteile, die mit herkömmlichen negativen Selektionssystemen einhergehen, bestimmt werden.
  • Die Tatsache, dass eine Nukleotidsequenz "miteingeführt wird mit" der gewünschten Nukleotidsequenz bezieht sich aud die Tatsache, dass die beiden Nukleotidsequenzen aneinander gekoppelt sind oder anders zusammen auf solche Weise eingeführt werden, dass die Anwesenheit der miteingeführten Nukleotidsequenz in einer Zelle anzeigt, dass die gewünschte Nukleotidsequenz in die Zelle eingeführt wurde, d.h. wenn gezeigt wird, dass eine der Nukleotidsequenzen eingeführt wurde, ist die Wahrscheinlichkeit, dass die andere ebenso eingeführt wurde, deutlich größer. Die beiden Nukleotidsequenzen sind deshalb typischer-, aber nicht notwendigerweise Teil derselben genetischen Konstruktion und werden z.B. durch denselben Vektor eingeführt.
  • Die hierin beschriebenen Methoden können ebenso verwendet werden, wenn die miteingeführte Nukleotidsequenz und die gewünschte Nukleotidsequenz unabhängig voneinander eingeführt werden. Das kann beispielsweise durchgeführt werden, indem man dieselben Bakterien für die Einführung beider Gene verwendet und eine relativ große Anzahl Kopien der gewünschten Nukleotidsequenz in die Zellen einführt, wodurch die Wahrscheinlichkeit relativ hoch hist, dass Zellen, die nachweislich die miteingeführte Nukleotidsequenz exprimieren, auch die gewünschte Nukleotidsequenz enthalten und exprimieren. Es ist zu erwarten, dass die unabhängige Einführung von zwei oder mehr Genen, die in einer Co-Expression der Gene in der gleichen Zelle resultiert, allgemein eine geringere Wahrscheinlichkeit hat, und es wird deshalb erwartet, dass die verbesserten Selektionshäufigkeiten, die durch das positive Selektionsverfahren erzielt werden, in solchen Systemen besonders vorteilhaft sind.
  • Da es notwendig ist, dass die eingeführten Nukleotidsequenzen in den transformierten Zellen exprimiert werden, enthält ein genetisches Gebilde, das die beiden Nukleotidsequenzen enthält, typischer- aber nicht notwendigerweise Regulationssequenzen, die die Expression der Nukleotidsequenzen ermöglichen, z.B. bekannte Promotoren und Transkriptionsterminatoren. Somit ist die miteingeführte Nukleotidsequenz typischerweise mit einem Promotor verbunden, der ein konstitutiver oder regulierbarer Promotor sein kann, und die gewünschte Nukleotidsequenz ist typischerweise auch mit einem konstitutiven oder regulierbaren Promotor verbunden.
  • Wie oben erwähnt, ist das Verfahren besonders geeignet für die Selektion genetisch transformierter Pflanzenzellen, wodurch die Identifikation und Isolation solcher Zellen ohne die Verwendung von Selektionsgenen, die Antibiotika- oder Herbizidresistenz codieren, ermöglicht wird. Wie bei herkömmlichen negativen Selektionsverfahren kann das hier beschriebene positive Selektionsverfahren für die Selektion von Zellen in vitro verwendet werden. Jedoch kann das positive Selektionsverfahren auch in vivo verwendet werden. Die Verwendung des positiven Selektionsverfahrens in vivo ist von besonderer Bedeutung, z.B. im Zusammenhang mit genetischer Transformation an ganzen Pflanzen oder an Pflanzenteilen, in denen die Pflanzen oder Pflanzenteile sowohl transformierte als auch nicht transformierte Zellen enthalten, da die Selektion der transformierten Zellen erreicht wird, ohne die benachbarten nicht transformierten Zellen direkt zu schädigen. Die transformierten Zellen haben so einen selektiven "Vorteil" verglichen mit den nicht transformierten Zellen (z.B. die Fähigkeit, Keime zu bilden), aber die nicht transformierten Zellen erleiden keinen ernsten Nachteil in dem Sinne, dass die geschädigt oder abgetötet werden, wie in dem Falle der negativen Selektion unter Verwendung von Antibiotika oder Herbiziden.
  • Die/der "inaktive Verbindung oder Nährstoff" kann jegliche/r Verbindung oder Nährstoff in inaktiver oder Vorläuferform sein, d.h. die/der in Abwesenheit der Expression der miteingeführten Nukleotidsequenz in einer Form vorliegt, die im wesentlichen bezüglich der in Frage kommenden Zellen biologisch inaktiv ist, die/der aber, wenn die miteingeführte Nukleotidsequenz exprimiert oder transkribiert wird, hydrolysiert oder anderswie aktiviert oder metabolisiert wird, um so die genetisch transformierten Zellen, die die gewünschte Nukleotidsequenz enthalten, mit einem selektiven Vorteil zu versehen, und sie dadurch identifiziert und isoliert werden können. Die/der inaktive Verbindung oder Nährstoff kann also z.B. ein inaktiver Pflanzenwachstumsregulator sein, beispielsweise ein inaktiviertes Cytokinin, Auxin oder Gibberellin, ein Vitamin, z.B. inaktiviertes Thiamin, ein Kohlenhydrat (z.B. Mannose, wenn die miteingeführte Nukleotidsequenz Mannose-6-phosphat-Isomerase codiert, oder Galaktose oder eine Galaktose-enthaltende Verbindung, wenn die miteingeführte Nukleotidsequenz UDP-Galaktose-4-Epimerase codiert), eine stickstoffhaltige Verbindung (z.B. ein Opin, wenn die miteingeführte Nukleotidsequenz ein Opinmetabolismus- oder -transportenzym codiert), Stärke, ein Protein, oder ein anderer Nährstoff in inaktiver Form, oder eine Verbindung, die eine wesentliche Funktion während der Differenzierung und Dedifferenzierung von Zellen und Geweben hat. Die Behandlung von Zellen und Geweben mit Verbindungen, die die Abhängigekti von weiterer Zugabe wesentlicher Verbindungen bewirken, kann ebenso zusammen mit den entsprechenden inaktiven Verbindungen angewendet werden. Dieser Weg kann beispielsweise angewendet werden, wenn die Sterol- oder Saponinsynthese gehemmt ist und inaktive Sterole oder Saponine zugegeben werden. Die inaktive Verbindung kann darüberhinaus z.B. ein Mineral sein, das chelatisiert ist und dadurch für die genetisch transformierten Zellen verfügbar gemacht wird.
  • Im Gegensatz zur herkömmlichen negativen Selektion, bei der die nicht transformierten Zellen auf Grund der Anwesenheit eines Antibiotikums, Herbizids oder Giftstoffes im Substrat geschädigt oder abgetötet werden, haben inaktive Verbindungen oder Nährstoffe, die in dem positiven Selektionsverfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden, keinen direkten nachteiligen Effekt auf die nicht transformierten Zellen. Stattdessen werden die transformierten Zellen mit einem physiologischen Vorteil ausgestattet, der es ermöglicht, sie zu identifizieren und zu isolieren, während die nicht transformierten Zellen durch die Anwesenheit der/s inaktiven Verbindung oder Nährstoffs, der zu Selektionszwecken verwendet wird, als solche nicht oder weniger angegriffen werden.
  • Die herkömmlichen Verfahren der "negativen Selektion" sind also gekennzeichnet durch die Verwendung eines Selektionsgens, das die negative Wirkung einer zugegebenen Verbindung auf die transformierten Zellen reduziert. Im Gegensatz dazu bezieht sich der Begriff "positive Selektion", wie er im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung verwendet wird, auf die Verwendung eines Selektionsgens, das eine positive Wirkung einer zugegebenen Verbindung auf die transformierten Zellen erzeugt oder steigert.
  • Selektion, die diesen Ansatz verwendet, wird also erreicht, indem man eine Verbindung für die transformierten Zellen verfügbar macht, während die Verbindung für die nicht transformierten Zellen nicht oder weniger verfügbar ist. Die/der in Frage kommende Verbindung oder Nährstoff kann vom selben Typ sein wie jeder der oben erwähnten, wobei der Unterschied darin besteht, dass die Verbindung oder der Nährstoff in diesem Fall zusätzlich zu einer Aktivierung in den transformierten Zellen in die transformierten Zellen transportiert wird.
  • Beispiele von Verbindungen, die eine physiologische Wirkung ausüben können, wenn sie in die Zelle eindringen, die aber nicht einfach in die Zelle oder ein Zellkompartiment aufgenommen werden, sind stark hydrophile oder hydrophobe Verbindungen, insbesondere geladene Verbindungen, große Moleküle, wo wie Polymere, insbesondere Proteine, Peptide, Oligo- und Polysaccharide, einschließlich Pflanzenhormone, phosphorylierte Metabolite, wie phosphorylierte Kohlenhydrate, phophorylierte Vitamine, phosphorylierte Nukleoside, einschließlich Cytokinine, und Verbindungen, die zu Carbonsäure-enthaltenden Kohlenhydraten oder Aminosäuren konjugiert sind, einschließlich Pflanzenhormonkonjugate.
  • Der "selektive Vorteil", den die transformierten Zellen besitzen, kann jeglicher Unterschied oder Vorteil hinsichtlich der nicht transformierten Zellen sein, der es ermöglicht, dass die transformierten Zellen leicht identifiziert und von den nicht transformierten Zellen isoliert werden. Dies ist typischerweise ein Unterschied oder Vorteil, der es ermöglicht, dass die transformierten Zellen durch einfache visuelle Mittel, d.h. ohne Anwendung eines speziellen Assays zur Bestimmung der Gegenwart eines Markergens identifiziert werden.
  • Wenn ein Polypeptid, das durch die miteingeführte Nukleotidsequenz codiert ist, eine/n inaktive/n Verbindung oder Nährstoff in den transformierten Zellen direkt aktiviert, können die nicht transformierten Zellen in bestimmten Fällen eine bestimmte Menge des in Frage kommenden Polypeptids enthalten oder produzieren. Wenn beispielsweise das aktivierende Polypeptid ein Enzym ist, können die nicht transformierten Zellen eine bestimmte ursprüngliche Enzymaktivität enthalten, wobei das native Enzym vom selben Typ wie das eingeführte aktivierende Enzym ist. In solchen Fällen muss die/der "inaktive Verbindung oder Nährstoff" nicht notwendigerweise vollkommen inaktiv in den nicht transformierten Zellen sein, da es ausreichend sein kann, dass die Verbindung oder der Nährstoff lediglich wesentlich weniger aktiv in nicht transformierten Zellen als in transformierten Zellen ist. Mit anderen Worten, ein qualitativer Unterschied zwischen den transformierten Zellen und den nicht transformierten Zellen hinsichtlich der Aktivierung der/s anfänglich inaktiven Verbindung oder Nährstoffs kann in bestimmten Fällen für Selektionszwecke ausreichend sein. In solchen Fällen können Inhibitoren oder Substrate, die mit den nativen Enzymen konkurrieren, zugegeben werden. Besonders geeignet sind Inhibitoren, die vom nativen Enzym aktiviert werden, was zu einer selbstkatalysierten Produktion des aktiven Inhibitors auf ein Niveau führt, bei dem das native Enzym im wesentlichen vollständig gehemmt ist.
  • Das aktivierende Polypeptid, das durch die miteingeführte Nukleotidsequenz codiert wird, ist nicht auf irgendein besonderes Polypeptid beschränkt und ist selbstverständlich eines, das entweder direkt oder indirekt aktiv ist, bezüglich der/m bestimmten Verbindung oder Nährstoff, die/der in den genetisch transformierten Zellen aktiviert werden soll. Das Polypeptid ist insbesondere oft ein Enzym.
  • Ein Enzym, das sich für die Selektion genetisch transformierter Pflanzenzellen als geeignet erwiesen hat, ist β-Glucuronidase ("GUS"), wobei die Selektion ausgeführt wird, indem man eine Glucuronidverbindung verwendet, die einen Pflanzenwachstumsregulator enthält, der durch β-Glucuronidase gespalten wird, z.B. ein Cytokininglucuronid (dessen Bedeutung aus den hier enthaltenen Beispielen klar wird). Es ist überraschend, dass Selektion genetisch transformierter Pflanzenzellen durch Verwendung eines GUS-Gens erreicht werden kann, da es sich im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung herausgestellt hat, dass höhere Pflanzen eine ursprüngliche GUS-Aktivität besitzen. Diese Erkenntnis steht im Gegensatz zu dem, was früher berichtet wurde. So stellt GB 2 197 653-A fest, dass höhere Pflanzen keine messbare β-Glucuronidaseaktivität enthalten, und impliziert damit, dass, da GUS-Aktivität in höheren Pflanzen nicht gefunden wird, es eine relativ klare Sache ist, die Expression einer interessierenden Genkonstruktion unter Verwendung des GUS-Gens zu überwachen. Wie unten erklärt (siehe Beispiele) ist dies jedoch nicht der Fall, und die Verwendung eines GUS-Gens für die Überwachung der Gegenwart eines interessierenden Gens ist in keinster Weise einfach oder klar, wegen der Tatsache, dass höhere Pflanzen in Wirklichkeit eine bedeutende intrinsische (Hintergrund-) β-Glucuronidaseaktivität enthalten.
  • So kann für die Selektion genetisch transformierter Pflanzenzellen die Zellpopulation auf oder in einem Medium kultiviert werden, das ein Cytokininglucuronid enthält, das in den transformierten Zellen durch die β-Glucuronidase gespalten wird, wodurch freies Cytokinin freigesetzt und Keim- und/oder Kallusauslösung in den transformierten Zellen veranlasst wird.
  • Eine Anzahl neuartiger Cytokininglucuronidverbindungen ist für die Zwecke der vorliegenden Erfindung entwickelt worden. Die Herstellung dieser Verbindungen sowie ihre Verwendung für positive Selektion von genetisch transformierten Zellen ist unten ausführlich beschrieben.
  • In bestimmten Fällen kann es wünschenswert sein, die hier offenbarte grundlegende Methode zu modifizieren, beispielsweise um eine effektivere Selektion zu liefern oder um das Selektionsverfahren zu vereinfachen. Wenn die inaktive Verbindung, die für das positive Selektionsverfahren verwendet wird, eine ist, die durch β-Glucuronidase gespalten wird, kann das grundlegende Verfahren durch verschiedene Möglichkeiten modifiziert werden, um ein besseres Ergebnis zu erzielen. Eine dieser Möglichkeiten ist die Verwendung bestimmter Sterolglucuronidverbindungen, z.B. Cholesteryl-β-D-glucuronid oder β-Sitosteryl-β-D-glucuronid, zusammen mit einer die Sterolsynthese hemmenden Verbindung wie Tridemorph (4-Tridecyl-2,6-dimethylmorpholin). Die Beispiele 5 und 6 unten beschreiben die Verwendung solcher Verbindungen. Man glaubt, dass durch Verwendung eines Sterolsyntheseinhibitors zusammen mit Sterolglucuroniden, die der Wirkung des Sterolsyntheseinhibitors auf die Hydrolyse durch β-Glucuronidase entgegenwirken, sogenanntes "cross feeding" (d.h. Diffusion der aktivierten Verbindung aus der Zelle, in der sie aktiviert wird, in eine ander Zelle) während des Selektionsverfahrens verhindert werden kann, da die Sterolverbindungen nicht von Zelle zu Zelle diffundieren, wenn der hydrophile Glucuronidteil abgespalten ist. So wird eine lokalisiertere Wirkung erreicht. Entsprechende Ergebnisse können mit einer großen Anzahl anderer Glucuronide, die ein hydrophobes Aglycon enthalten, erhalten werden.
  • Wie oben erklärt, wurde im Gegensatz zu dem, was vorher berichtet worden war, gefunden, dass höhere Pflanzen wirklich ursprüngliche GUS-Aktivität bestitzen. Aus diesem Grund kann die bloße Einführung eines GUS-Gens in eine Pflanze nicht zwangsläufig ausreichend sein, um die gewünschte Selektion der genetisch transformierten Zellen zu erhalten, und es kann notwendig oder wünschenswert sein, jegliche ursprüngliche β-Glucuronidaseaktivität in der Zellpopulation zu vermindern. Da eine eingeführte β-Glucuronidase andere Eigenschaften als eine native β-Glucuronidase haben kann, kann eine Verminderung jeglicher urspünglicher β-Glucu ronidaseaktivität auf verschiedenen Wegen erreicht werden, z.B. durch Zugabe einer β-Glucuronidase-hemmenden Verbindung zum Kulturmedium, die eine stärker hemmende Wirkung auf die ursprüngliche β-Glucuronidase hat als auf die β-Glucuronidase, die durch das Nukleotid oder eine Subsequenz davon codiert ist. Ein solcher Typ von Verbindung ist ein Ammoniumsalz.
  • Ursprüngliche β-Glucuronidasaktivität in der Zellpopulation kann auch wesentlich reduziert werden durch Zugabe einer Verbindung zu dem Kulturmedium, die bei Hydrolyse zu einem Produkt führt, das die Aktivität der nativen β-Glucuronidase hemmt, und das vorzugsweise die Aktivität der eingeführten β-Glucuronidase mehr hemmt als die Aktivität der eingeführten β-Glucuronidase gehemmt wird. Dan kann in einer selbstregulierten oder lokalisierten Weise erfolgen, beispielsweise lokalisiert auf bestimmte Kompartimente, wo das eingeführte GUS-Gen lokalisiert oder nicht lokalisiert ist. Ein Beispiel für ein Hydrolyseprodukt, das native β-Glucuronidase hemmt, ist Glucuronsäure, die beispielsweise aus der Hydrolyse von Glycyrrhizinsäure oder Sterylglucuroniden stammt.
  • Ursprüngliche β-Glucuronidaseaktivität in der Zellpopulation kann weiterhin vermindert werden durch Zugabe eines β-Glucuronidaseinhibitors zum Kulturmedium, insbesondere β-Glucuronid, das in Zellen ohne ein eingeführtes β-Glucuronidasegen die β-Glucuronidaseaktivität mehr hemmt als in Zellen mit einem eingeführten β-Glucuronidasegen. Das kann z.B. ein schlecht oder wenig geeignetes Glucuronidasesubstrat (ein Glucuronid) sein, das eine höhere Affinität für die native β-Glucuronidase als für die eingeführte β-Glucuronidase hat.
  • β-Glucuronidase, die durch das eingeführte β-Glucuronidasegen codiert ist, das für die Zwecke der vorliegenden Erfindung verwendet wird, ist über einen relativ breiten pH-Bereich aktiv, während die native β-Glucuronidase, die in einer breiten Vielfalt von Pflanzenspezies gefunden wird, nur in einem relativ engen Bereich von pH-Werten aktiv ist, typischerweise etwa pH 4-5 (siehe Beispiel 3 unten). Ursprüngliche β-Glucuronidaseaktivität kann deshalb in diesem Fall durch Zugabe eines Glucuronids, das durch die native β-Glucuronidase hydrolisiert werden kann und das bei Hydrolyse zu einer pH-Zunahme führt, beispielsweise o-Cumarylglucuronid, zu dem Kulturmedium vermindert werden.
  • Da herausgefunden wurde, das β-Glucuronidase, die den Pflanzen ursprünglich ist, im allgemeinen bei einem pH von etwa 4-5 aktiv ist, kann die ursprüngliche β-Glucuronidaseaktivität auch durch Zugabe einer pH-regulierenden Verbindung zum Kulturmedium vermindert werden, die das Kulturmedium mit einem pH zwischen ungefähr 5,5 und 8,5, vorzugsweise zwischen ungefähr 6,0 und 8,0, beispielsweise zwischen ungefähr 6,5 und 7,5 versieht, oder einer pH-regulierenden Verbindung, die den pH in den Zellen oder in Kompartimenten der Zellen auf einen pH innerhalb dieser Bereiche erhöht. Bei diesen pH-Werten ist β-Glucuronidase, die durch das eingeführte GUS-Gen codiert ist, aktiv, aber ursprüngliche β-Glucuronidase ist im wesentlichen inaktiv. Ein Beispiel einer pH-regulierenden Verbindung, die verwendet werden kann, ist ein Ammoniumsalz oder eine Ammonium freisetzende Verbindung, z.B. Ammoniumnitrat.
  • Letztendlich kann ursprüngliche β-Glucuronidaseaktivität vermindert oder im wesentlichen beseitigt werden durch eine physikalische Behandlung, wie eine Hitzebehandlung, beispielsweise unter Verwendung einer Temperatur im Bereich von 50-65 °C in Form einer Behandlung mit kurzen Pulsen über ungefähr 1-2 Tage vor dem Transfer auf das Selektionssubstrat und/oder unter Verwendung einer Temperatur im Bereich von 30-45 °C während der Selektion (siehe Beispiel 10).
  • Genetische Transformation von Pflanzenzellen wird oft unter Verwendung von Agrobacterium-Stämmen, insbesondere Stämmen von Agrobacterium tumifaciens, durchgeführt. Es wurde gefunden, dass bestimmte entwaffnete Agrobacterium-Stämme Keimbildung durch die Produktion keimbildungsauslösender Substanzen während der Cokultivierung induzieren, und solche Stämme sollten normalerweise vermieden werden, wenn GUS-Hydrolyse von Cytokininglucuroniden für die Zwecke der Selektion genetisch transformierter Zellen verwendet werden soll. So wird genetische Transformation der Zellen unter Verwendung eines Cytokininglucuronids als inaktive Verbindung vorzugsweise durchgeführt unter Verwendung eines Agrobacterium-Stammes, der keine Cytokinine oder andere keim- (wachstums-) auslösenden Verbindungen produziert, oder der nur eine unwesentliche Menge solcher Verbindungen produziert, wodurch die Auslösung von Keimwachstum aufgrund der Gegenwart lebender Bakterien auf oder in den Zellen beseitigt oder wesentlich vermindert wird.
  • In besonderen Fällen, wenn beispielsweise eine verbesserte Selektionshäufigkeit erwünscht ist, kann es für die gewünschte Nukleotidsequenz vorteilhaft sein, mit wenigstens zwei verschiedenen Selektionsgenen miteingeführt zu werden. Das zusätzliche Selektionsgen kann ein zusätzliches Gen sein, das ein Enzym (oder anderes Protein oder Polypeptid) codiert, das für positive Selektion gemäß der vorliegenden Erfindung geeignet ist, oder es kann ein Gen sein, das ein Enzym (oder anderes Protein oder Polypeptid) codiert, das für herkömmliche negative Selektion geeignet ist, d.h. das Resistenz gegen einen Giftstoff, ein Antibiotikum oder ein Herbizid codiert. So können genetisch transformierte Zellen selektiert werden, indem man eine Kombination von positiver und negativer Selektion anwendet, wobei die gewünschte Nukleotidsequenz in die genetisch transformierten Zellen weiterhin miteingeführt wird mit einer Subsequenz, die Resistenz gegenüber wenigstens einem Giftstoff, Antibiotikum oder Herbizid codiert, wobei das Medium wenigstens einen Giftstoff, ein Antibiotikum oder ein Herbizid enthält, gegen das die transformierten Zellen resistent sind.
  • Wie oben erwähnt, sind in einem Aspekt der vorliegenden Erfindung genetisch transformierte Zellen offenbart, die nach der oben genannten Methode selektiert wurden, insbesondere Pflanzenzellen, sowie Pflanzen, Nachfahren oder Samen, die von solchen genetisch transformierten Pflanzenzellen abgeleitet sind. Insbesondere ist es oft ein Vorteil, dass diese Zellen genetisch transformierte Pflanzenzellen sind, deren Genom als Selektionsmarker keine eingeführte (d.h. nicht-native) Nukleotidsequenz enthält, die Toxin-, Antibiotika- oder Herbizidresistenz codiert. Wie oben erklärt, gibt es Bedenken darüber, ob es sicher ist, Gene, die beispielsweise Antibiotikaresistenz in beispielsweise Nahrungspflanzen codieren, einzuführen. Genetisch transformierte Pflanzenzellen, die durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung selektiert werden, die keine Selektionsgene für beispielsweise Antibiotikaresistenz enthalten, sowie Pflanzen, Nachfahren und Samen, die von solchen Zellen abgeleitet werden, sind unter diesem Gesichtspunkt klar von Vorteil.
  • Synthese von Verbindungen der allgemeinen Formel I gemäß der Erfindung
  • Verschiedene Verfahren von mehr oder weniger großer Allgemeingültigkeit sind für die Synthese von Cytokininglucuroniden, die von der allgemeiner Formel I umfasst werden, verfügbar, und zwei davon, die als beste dieser Verfahren betrachtet werden, sind im folgenden beschrieben:
  • A) Oxidation des entsprechenden Cytokinin-D-glucosids.
  • In diesem Ansatz wird die -CH2-OH-Gruppe am Pyranosering des β-D-Glucosids, das dem in Frage kommenden Glucuronid entspricht, unter geeigneten Bedingungen zu einer Carboxylfunktion oxidiert. Das wahrscheinlich beste Verfahren, diese Oxidationsreaktion in einer einfachen und hochselektiven Art zu erreichen, ist katalytische; Oxidation durch Sauerstoff, geeigneterweise unter Verwendung von Platinmohr oder Platin auf Kohlenstoff als Katalysator und unter Verwendung eines schwach basischen (pH 8-10) wässrigen oder wässrig-alkoholischen (so wie wässrig-ethanolischen) Reaktionsmediums; die Reaktion kann geeigneterweise bei einer Temperatur im Bereich von 60-100 °C während einer Zeitdauer von 2 bis 24 Stunden durchgeführt werden. Oxidation (im allgemeinen nicht-katalytisch) durch herkömmliche Oxidationsmittel, die von Sauerstoff verschieden sind, können auch angewendet werden, aber voraussichtlich ergibt die sich ergebende Oxidationsreaktion im allgemeinen kleinere Ausbeuten und ist weniger spezifisch [d.h. führt zu Gemischen an Oxidationsprodukten – insbesondere wenn nicht Maßnahmen getroffen werden, um andere oxidierbare Funktionalitäten des Glucosid-Ausgangsmaterials durch Einführung geeigneter Schutzgruppen zu schützen (siehe unten)].
  • Ein Beispiel für den Ansatz der katalytischen Oxidation wird durch Verfahren 1 von Beispiel 1C in der vorliegenden Anwendung gegeben, in dem N6-Benzyladenin-9-β-D-glucopyranosid (BA9G) zu N6-Benzyladenin-9-β-D-glucopyranuronsäure, (die anschließend als Natriumsalz isoliert wird) durch Oxidation mit Sauerstoff in Gegenwart von Platinmohr oxidiert wird.
  • Dieses Verfahren scheint von ziemlich allgemeiner Anwendbarkeit für die Synthese von Cytokinin-9-glucuroniden aus entsprechenden 9-Glucosiden zu sein. Es hat sich auch als zufriedenstellend für die Synthese von beispielsweise Zeatin-O-glucuronid (vgl. Beispiel 1G hierin) aus den entsprechenden Zeatin-O-glucosiden erwiesen; Zeatin-O-glucuronid ist ein Beispiel für eine Verbindung der Formel I gemäß der Erfindung, in der der Glucuronidteil ein Substituent an einem R6-Teil – wie hierin definiert – des C2-8-Alkenyl-Typs ist, und das in Frage kommende Verfahren wird als von ziemlich großer Allgemeingültigkeit für andere Cytokininglucuronide gemäß der Erfindung erachtet, in denen ein O-Glucuronid-Teil als Substituent an einer R6-Gruppe sitzt, die einer der folgenden Typen ist, wie in Zusammenhang mit der allgemeinen Formel I definiert: eine Benzylgruppe; ein C1-8-Alkyl oder substituiertes C1-8-Alkyl; ein C2-8-Alkenyl oder substituiertes C2-8-Alkenyl.
  • Dieser Ansatz scheint jedoch nicht allgemein anwendbar zu sein, beispielsweise für die Synthese von Cytokinin-3-glucuroniden.
  • Wie bereits angedeutet, ist es klar, dass, wenn man einen Ansatz macht, der die Oxidation eines Cytokininglucosides einschließt, jegliche anderen oxidierbaren (unter den in Frage kommenden Oxidationsbedingungen) funktionellen Gruppen, die im Ausgangs-Cytokininglucosid vorhanden sein können und die im endgültigen Glucuronid der Formel I unverändert bleiben sollen, durch die vorherige Einführung geeigneter Schutzgruppen geschützt werden müssen. Beispiele möglicher oxidierbarer Gruppen, die in Verbindungen innerhalb der Definition der Formel I vorhanden sein können, sind [bezüglich ihrer Position wie in Zusammenhang mit der allgemeinen Formel I (siehe oben) aufgeführt]: eine SH-Gruppe, die als R2- und/oder R8-Gruppe vorliegen kann; Hydroxy- oder Glucosyloxygruppen, die als Substituenten an R6-Gruppen des substituierten C1-8-Alkyltyps oder des substituierten C2-8-Alkenyl-Typs vorliegen können; und Ribosyl-, 5'-Phosphoribosyl- oder Glucosylgruppen, die als R9- oder R7-Gruppen vorliegen können. Wenn es beispielsweise notwendig ist, aliphatische (alkoholische) Hydroxygruppen zu schützen, wie Hydroxygruppen an sekundären Kohlenstoffatomen in Ribosyl-, 5'-Phosphoribosyl- oder Glucosylgruppen, sind geeignete Schutzgruppen oft beispielsweise Acetylgruppen, die durch Verfahren eingeführt werden können, die einem Fachmann wohlbekannt sind, und die nach dem Oxidationsvorgang durch alkalische Hydrolyse entfernt werden können.
  • Verwendet man jedoch den Ansatz der milden katalytischen Oxidations, der oben beschrieben ist, sind Hydroxygruppen an primären aliphatischen Kohlenstoffatomen im allgemeinen oxidationsempfindlich, während Hydroxygruppen an sekundären (und tertiären) Kohlenstoffatomen dies im allgemeinen nicht sind; so erfordern, wenn man den -CH2-OH-Teil in der 5-Position des Glucopyranoserings eines Cytokinin-β-D-glucosids auf diese Weise oxidiert, die Hydroxygruppen an den 2-, 3- und 4-Positionen des Glucopyranoserings im allgemeinen keinen Schutz. Eine -SH-Gruppe, die als eine Gruppe R2 oder R8 vorliegt, erfordert jedoch im allgemeinen einen Schutz während dieser katalytischen Oxidation, und eine solche SH-Gruppe kann geeigneterweise als Benzylderivat (siehe hinten im Zusammenhang mit dem unten beschriebenen Verfahren B) geschützt werden.
  • Zahlreiche geeignete Cytokininglucoside zur Verwendung als Ausgangsmaterialien in diesem Verfahren sind kommerziell erhältlich; beispielsweise ist eine große Vielfalt davon von Apex Organics Ltd., Leicester, England, erhältlich und einige Cytokinin-9-glucoside sind von Sigma Chemical Company, P.O. Box 14508, St. Louis, MO 63178, USA, erhältlich. Cytokininglucoside können auch durch bekannte Verfahren hergestellt werden, die in der Literatur beschrieben sind. Beispielsweise kann die Synthese einer Vielzahl geeigneter Cytokinin-9-glucoside, die R6-Gruppen tragen und von deren hier vorliegender Definition erfasst werden, durch einfache Ausweitung des Verfahrens erreicht werden, das durch Cowley et al. [Aust. J. Chem. 31 (1978) 1095] für die Synthese von 9-β-Glucopyranosiden des Zeatins und N6-Benzyladenins beschrieben ist.
  • B) Synthesen des Koenigs-Knorr-Typs.
  • Dieser Ansatz, der auf dem Originalverfahren von W. Koenigs und E. Knorr [Chem. Ber. 34 (1901) 957] beruht, beinhaltet die Reaktion von Methyl-(2,3,4-tri-O-acetyl-α-D-glucopyranosylbromid)uronat [abgekürzt MBTG; eine geeignete Methode für dessen Herstellung ist durch Bollenback et al., J. Amer. Chem. Soc. 77 (1955) 3310, beschrieben] mit einer alkoholischen oder phenolischen Hydroxygruppe, einer Mercapto-(-SH-)Gruppe oder einem Ring-Stickstoffatom in einem aromatischen oder ungesättigten heterocyclischen Teil.
  • Dieser Ansatz liefert wahrscheinlich das am allgemeinsten anwendbare Verfahren für die Synthese von Cytokininglucuroniden gemäß der Erfindung (oder von Glucuroniden von Vorläuferverbindungen, die anschließend einfach zu den gewünschten Cytokininglucuroniden umgewandelt werden können), indem man von geeigneten Cytokininen [oder Cytokininvorläuferverbindungen (siehe unten)] ausgeht, und man glaubt, dass dies von sehr großer Anwendbarkeit bei der Herstellung von Verbindungen, die von der allgemeinen Formel I umfasst werden, ist.
  • Das allgemeine Verfahren ist wie folgt: Das geeignete Cytokinin oder die Cytokininvorläuferverbindung (siehe unten), gelöst in einem Lösungsmittel wie N,N-Dimethylformamid (DMF), Chinolin, Propylencarbonat, Methanol oder Diethylether, lässt man mit 1,25-2 molaren Äquivalenten MBTG bei einer Temperatur im Bereich von 25-100 °C während einer Zeit von 3 bis 96 Stunden reagieren, vorzugsweise in Gegenwart eines zugegebenen Halogenid(Bromid-)fängers wie Silberoxid oder Silbercarbonat (verwendet man beispielsweise DMF als Lösungsmittel, wirkt das Lösungsmittel selbst oft hinreichend als Halogenidfänger, wobei in dem Fall die Zugabe eines zusätzlichen Fängers nicht wesentlich ist). Diese Reaktion ergibt einen Methylester des Zwischenproduktes peracetyliertes Glucuronid, das im allgemeinen isoliert und gereinigt wird; das kann geeigneterweise durchgeführt werden durch beispielsweise (i) Verdampfen des Lösungsmittels, gefolgt von einer Extraktion des Rückstands mit einem Lösungsmittel wie Chloroform, Entfernung des letzteren Lösungsmittels aus dem Extrakt und Reinigung der sich ergebenden rohen Zwischenverbindung durch Umkristallisieren und/oder herkömmliche Säulenchromatographietechniken; oder, beispielsweise, (ii) durch Abtrennung des Zwischenprodukts aus dem Reaktionsgemisch durch herkömmliche Säulenchromatographie, die direkt an dem Reaktionsgemisch ausgeführt wird, gefolgt von einer Entfernung des Eluierungslösungsmittels aus der/den interessierenden eluierten Fraktion/en und Umkristallisation des Rohprodukts.
  • In Fällen, in denen das gewünschte Endprodukt der Formel I den Glucuronidteil in der Amidform (Glucuronamid) haben soll, wird die Umwandlung der peracetylierten Methylesterform des Glucuronidteils in die Amidform geeigneterweise in dieser Stufe ausgeführt, und das kann im allgemeinen erreicht werden, indem man den peracetylierten Methylester (vorzugsweise gereinigt, z.B. in der oben ausgeführten Weise) mit einer Lösung von wasserfreiem Ammoniak in wasserfreiem Methanol bei geringer Temperatur, beispielsweise einer Temperatur zwischen 0 °C und –10 °C, oder – als alternative Möglichkeit – mit einer konzentrierten (geeigneterweise gesättigten) wässrigen Lösung von Ammoniak bei ungefähr Raumtemperatur über eine Zeitdauer von 0,5-4 Stunden behandelt. Das Glucuronamid kann dann isoliert werden durch Verdampfen der Ammoniaklösung, beispielsweise unter Vakuum, und Umkristallisieren aus einem geeigneten Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemisch, wie 90%iges wässriges Ethanol. Ein Beispiel dieser Umwandlung wird durch Beispiel 1B hierin gegeben, in dem N6-Benzyladenin-3-glucuronamid (BA3Gnamid) aus dem entsprechenden Methylester dargestellt wird.
  • Weiterhin kann, im Falle von Verfahren, die von bestimmten Typen an Cytokininvorläuferverbindungen ausgehen, eine chemische Transformation, die notwendig ist, um den Cytokininvorläuferteil zu dem geeigneten Cytokininteil umzuwandeln, oft am Methylester vorgenommen werden, bevor man dazu übergeht, das freie Glucuronid freizusetzen. Als Beispiel kann die Synthese von Cytokinin-9-glucuroniden (deren Synthese durch den Ansatz der katalytischen Oxidation schon oben beschrieben wurde) normalerweise zufriedenstellend erreicht werden, indem man von einem substituierten oder unsubstituierten Purin ausgeht, das in der 6-Position ein Chloratom trägt; letztere 6-Chlorverbindung kann im allgemeinen in den Methylester des entsprechenden peracetylierten 9-Glucuronids umgewandelt werden mittels des oben beschriebenen allgemeinen Verfahrens unter Verwendung von MBTG, und die 6-Chlorgruppe kann dann geeigneterweise zum gewünschten -NH-R6-Teil umgewandelt werden, indem man das Produkt aus letzterer Reaktion mit dem entsprechenden Amin (R6-NH2) reagieren lässt, das im allgemeinen geeigneterweise in situ aus dem Aminhydrochlorid (R6-NH2·HCl) und einem Überschuss (geeigneterweise ein 2-4facher molarer Überschuss) einer geeigneten Base, z.B. eines tertiären aliphatischen Amins, wie Triethylamin, in einem geeigneten polaren Lösungsmittel, wie einem C1-4-aliphatischen Alkohol, bei einer Temperatur im Bereich von 65-120 °C, erzeugt wird. Dies wird durch Verfahren 2 des Beispiels 1C hierin veranschaulicht, in dem die Synthese von N6-Benzyladenin-9-glucuronid (BA9GN) (als sein Natriumsalz) durch dieses Verfahren beschrieben ist.
  • Die Acetylgruppen am Glucuronidteil werden dann durch basische Hydrolyse entfernt, indem man eine Base, wie wässriges Natriumhydroxid, wässriges methanolisches oder ethanolisches Natriumhydroxid oder methanolischen Ammoniak, bei einer Temperatur im Bereich 0-25 °C über eine Zeitdauer von 0,5 bis 6 Stunden, verwendet. Verwendet man eine Base wie eine der oben erwähnten wässrigen oder alkoholischen Natriumhydroxidlösungen, ergibt dieses Verfahren – nach Neutralisation der überschüssigen Base – die Salzform des entsprechenden Cytokininglucuronids, während die Verwendung eines Reagens wie methanolischem Ammoniak und anschließende Entfernung von überschüssigem Ammoniak durch Verdampfen zu der Amidform des Glucuronids führt. Letzteres wird geeigneterweise durch herkömmliche Methoden gereinigt, wie Chromatographie, insbesondere Reversed-phase-Chromatographie, und/oder Umkristallisation aus einem geeigneten Lösungsmittel, wie einem wässrigen organischen Lösungsmittel, z.B. 80-90%iges wässriges Ethanol.
  • Wenn das Ausgangs-Cytokinin oder die Cytokininvorläuferverbindung eine oder mehr Funktionalitäten enthält, die mit MBTG unter den in Frage kommenden Bedingungen reagieren können, und die im End-Glucuronid der Formel I unverändert vorliegen müssen, dann müssen natürlich solche Funktionalitäten durch vorherigen Aufbau geeigneter Schutzgruppen geschützt werden; Beispiele für solche reaktive Funktionalitäten, die in Ausgangs-Cytokininen vorkommen können, die zu Produkten innerhalb der Definition von Formel I führen, sind [unter Bezug auf ihre Position wie im Zusammenhang mit der allgemeinen Formel I (siehe oben) spezifiziert]: -OH oder -SH, vorliegend als eine R2-Gruppe; -OH oder -SH, vorliegend als eine R8-Gruppe; -OH oder -NH2, vorliegend als ein Substituent am Phenylring einer R6-Gruppe des substituierten Benzyl-Typs; -OH- oder Glucosyloxygruppen, vorliegend als Substituent(en) an einer R6-Gruppe des substituierten C1-8-Alkyl-Typs oder substituierten C2-8-Alkenyl-Typs; Ribosyl-, 5'Phosphoribosyl- oder Glucosylgruppen, die als R9 oder R7-Gruppen vorliegen können; und NH2 in einer -CH2CH(NH2)COOH-Gruppe, die als R9-Gruppe vorliegt.
  • In Bezug auf Schutzgruppen, die für den Schutz der oben genannten Beispiele an reaktiven Funktionalitäten, die in Ausgangs-Cytokininen vorliegen können, geeignet sind, kann eine -OH-Gruppe im allgemeinen geeigneterweise geschützt werden durch Einführung einer Acetylgruppe (siehe unten im Zusammenhang mit dem oxidativen Verfahren zur Darstellung von Verbindungen der Formel I), um die entsprechende Acetoxygruppe (-OOCCH3) zu bilden. Eine -SH-Gruppe kann im allgemeinen sehr geeignet als Benzylthioetherderivat (-SCH2C6H5) durch die Einführung einer Benzylgruppe [beispielsweise durch Reaktion mit Benzylchlorid in einer ähnlichen Weise wie die, die unten im Zusammenhang mit Cytokininvorläuferverbindungen, die, zumindest formal, Oxo- (=O) oder Thioxo- (=S) gruppen an der 2-Position und eine Oxogruppe an der 6-Position enthalten (siehe unten), genauer beschrieben ist] geschützt werden. Eine NH2-Gruppe kann im allgemeinen geeigneterweise durch Umwandlung zu einer Phthalimidogruppe wie folgt geschützt werden: Das Cytokinin oder die Cytokininvorläuferverbindung wird mit einem Überschuss an Phthalsäureanhydrid in einem relativ inerten Lösungsmittel, wie Chloroform oder 1,2-Dimethoxyethan bei einer Temperatur im Bereich von 70-100 °C über Stunden, oft geeigneterweise ungefähr 4 Stunden, erhitzt. Die NH2-Gruppe kann, nach Durchführung der Koenigs-Knorr-Typ-Reaktion, nachfolgend durch Behandlung mit einer wässrigen alkoholischen (so wie einer wässrigen ethanolischen) Lösung von Hydrazin wiederhergestellt werden.
  • Eine Gruppe von Cytokininvorläuferverbindungen, die besonders gut geeignet sind für die Verwendung in der Synthese von Cytokininglucuroniden gemäß der Erfindung, und die den Glucuronidteil (der R10 in der allgemeinen Formel I entspricht) als -O-R10 oder -S-R10 an der 2-Position des Purinringsystems angelagert haben, sind Cytokininvorläuferverbindungen, die, wenigstens formal, Oxo- (=O) oder Thioxo- (=S) gruppen an der 2-Position und eine Oxogruppe an der 6-Position enthalten; es sollte an dieser Stelle erwähnt werden, dass Verbindungen der in Frage kommenden Typen, die 2-Oxo- und 2-Thioxogruppen haben, zumindest in Lösung, im allgemeinen im tautomeren Gleichgewicht mit den entsprechenden 2-Hydroxy- und 2-Mercaptoverbindungen sind (wobei die 6-Oxogruppe dann als eine 6-Hydroxygruppe vorliegt), und die letzteren tautomeren Formen liegen, im allgemeinen, in bedeutendem Anteil vor.
  • Die zuletzt genannte Hydroxy- oder Mercaptogruppe an der 2-Position wird in der letzten Phase des gesamten Syntheseverfahrens mittels des Koenig-Knorr-Typ-Verfahrens zu der entsprechenden -O-R10- beziehungsweise -S-R10-Gruppe umgewandelt; bevor man die Koenigs-Knorr-Typ-Reaktionsfolge durchführt, wird jedoch geeigneterweise die 6-Hydroxygruppe umgewandelt, und zwar über ihre zwischenzeitliche Umwandlung zu einer 6-Halogenid-(vorzugsweise 6-Chlor-)gruppe in einen -NH-R6-Teil, der in Formel I gezeigt ist, und das macht es im allgemeinen erforderlich, dass die Hydroxy- oder Mercaptogruppe an der 2-Position durch eine geeignete Schutzgruppe während dieser Umwandlungsfolge geschützt wird. Für beide dieser Gruppen ist die Schutzgruppe der Wahl eine Benzylgruppe, die normalerweise direkt eingeführt werden kann durch eine Reaktion, die die allmähliche Zugabe eines leichten Überschusses an Benzylchlorid zu einer gerührten Lösung oder Suspension der in Frage kommenden Cytokininvorläuferverbindung in wässriger Base (pH typischerweise ungefähr 12-13), so wie wässriges Natrium- oder Kaliumhydroxid, bei ungefähr Raumtemperatur, beinhaltet. Nach weiterem Rühren für, typischerweise, 1-2 Stunden, wird das Reaktionsgemisch durch Zugabe von beispielsweise Eisessig neutralisiert und das unlösliche, benzylgeschützte Produkt wird durch Filtration isoliert.
  • Die 6-Hydroxygruppe des resultierenden 2-Benzyloxy- oder 2-Benzylthio-6-purinolderivates wird dann in eine 6-Chlorgruppe umgewandelt, geeigneterweise unter Verwendung eines Überschusses an einem chlorierenden Reagens, so wie Phosphoroxychlorid (Phosphorylchlorid), in Gegenwart einer organischen Base, so wie N,N-Diethylanilin; letztere Reaktion wird normalerweise geeigneterweise unter Rückflussbedingungen über eine Zeitdauer von ungefähr 10 Minuten bis ungefähr 3 Stunden durchgeführt.
  • Die 6-Chlorgruppe kann dann geeigneterweise in den gewünschten -NH-R6-Teil umgewandelt werden, indem man das Produkt aus der letzten Reaktion mit dem entsprechenden Amin, R6-NH2, reagieren lässt, das im allgemeinen geeigneterweise in situ aus dem Aminhydrochlorid (R6-NH2·HCl) und einem Überschuss (geeigneterweise ein 2-4facher molarer Überschuss) einer geeigneten Base, z.B. eines tertiären aliphatischen Amins, wie Triethylamin, in einem geeigneten polaren Lösungsmittel, wie einem C1-4-aliphatischen Alkohol (z.B. 1-Butanol), bei einer Temperatur im Bereich von 65-120 °C, erzeugt wird.
  • Nach der Isolierung des Produkts wird die Schutzgruppe entfernt, um die freie 2-Hydroxy- oder 2-Mercaptogruppe wiederherzustellen; im Falle einer Benzylschutzgruppe kann dies geeigneterweise durch, beispielsweise, Behandlung des Produkts mit einem Überschuss von Natrium in flüssigem Ammoniak durchgeführt werden.
  • Im Falle von Produkten, die auf dieser Stufe eine 2-Mercaptogruppe haben, glaubt man, dass es allgemein vorteilhaft ist, die 2-Mercaptogruppe in die Salzform (-S-), beispielsweise die Kaliumsalzform umzuwandeln, bevor man damit weitermacht, den Glucuronidteil mittels des oben beschriebenen Koenigs-Knorr-Typ-Verfahrens einzuführen. Ein Beispiel eines geeigneten Verfahrens für diesen Zweck ist in Schritt 4 des hier enthaltenen Arbeitsbeispiels 1E beschrieben, und die dort beschriebenen Bedingungen werden als von ziemlich großer allgemeiner Anwendbarkeit erachtet. Es kann jedoch in manchen Fällen möglich sein, die Koenigs-Knorr-Typ-Reaktion mit MBTG (siehe unten) direkt ohne vorherige Umwandlung der 2-Mercaptogruppe in die Salzform durchzuführen.
  • Schließlich wird der Glucuronidteil durch Reaktion mit MBTG eingeführt, wie oben im Zusammenhang mit dem Koenigs-Knorr-Typ-Verfahren beschrieben.
  • Ein Beispiel, das die oben beschriebene Abfolge von Syntheseschritten veranschaulicht, ist in Beispiel 1E für die Synthese des Natriumsalzes von N6-(2'-isopentenyl)adenin-2-thioglucuronid (IP2SGN), ausgehend von 2-Thioxanthin, beschrieben, und man glaubt, dass viele der darin gegebenen weiteren Informationen hinsichtlich der Wahl der Umkristallisations- und Extraktionslösungsmittel, Wahl an Konzentrationen und Mengen an Reagentien, usw., von allgemeinerer Anwendbarkeit sind bei der Durchführung der oben umrissenen Reaktionsabfolge, in der man von einer Cytokininvorläuferverbindung, die eine "2-Thioxo"-Gruppe (d.h. eine 2-Mercaptogruppe) und eine "6-Oxo"-Gruppe (d.h. eine 6-Hydroxygruppe) hat, ausgeht.
  • Ähnlich sind eine Gruppe von Cytokininvorläuferverbindungen, die besonders gut geeignet sind für die Anwendung in der Synthese von Cytokininglucuroniden gemäß der Erfindung, die den Cytokininglucuronidteil (entsprechend R10 in der allgemeinen Formel I) als -O-R10 oder -S-R10 in der 8-Position des Purinringsystems gebunden haben, Cytokininvorläuferverbindungen, die, wenigstens formal (aus Gründen ähnlich den oben im Zusammenhang mit Cytokininvorläufeverbindungen, die eine formale 2-Oxo- oder 2-Thioxogruppe und eine formale 6-Oxogruppe haben, umrissenen), eine Oxo- (=O) oder Thioxo- (=S) gruppe an der 8-Position haben, und die weiterhin eine Hydroxygruppe an der 6-Position haben. Diese können im allgemeinen in das gewünschte Endprodukt der Formel I umgewandelt werden, indem man eine Abfolge von Reaktionen (Schutz, Einführung einer 6-Chlorgruppe, Einführung des -N-R6-Teils, Entfernung der Schutzgruppen und schließlich Reaktion mit MBTG) verwendet, die analog zu der oben für Cytokininglucuronide, die den Glucuronidteil als -O-R10 oder -S-R10 in der 2-Position des Purinringsystems gebunden haben, umrissenen ist. Ein Beispiel dafür ist hierin in Beispiel 1F für die Synthese von N6-(2'-Isopentenyl)adenin-8-thioglucuronid (als dessen Natriumsalz) gegeben.
  • Verbindungen der Formel I, in denen der Glucuronidteil in der Carbonsäureform vorliegt, können im allgemeinen aus der entsprechenden Salzform, beispielsweise Natriumsalzform, dargestellt werden (die auf eine bereits oben umrissene Art hergestellt werden), indem man eine gerührte Lösung oder Lösung/Suspension der Salzform in einem geeigneten Lösungsmittel (z.B. einem wässrigen Alkohol, wie wässriges Ethanol), vorzugsweise bei einer Temperatur unter 25 °C mit einer Mineralsäure, wie Salzsäure, auf einen pH von ungefähr 2,5 ansäuert. Nachdem man für einige Minuten gerührt hat, wird das Lösungsmittel dann unter Vakuum entfernt. Der rohe Rückstand kann vorzugsweise einer chromatographischen Behandlung unterzogen werden, um anorganische Salze zu entfernen (siehe z.B. Beispiel 11 hierin für Details eines typischen Verfahrens und ein geeignetes chromatographisches Substrat für diesen Zweck), nach der das Produkt aus einem geeigneten Lösungsmittel, typischerweise einem polaren Lösungsmittel, wie Methanol oder Ethanol, umkristallisiert werden kann.
  • Verbindungen der Formel I, in denen der Glucuronidteil in der Methylester- oder Ethylesterform vorliegt, können im allgemeinen sehr geeignet, in hoher Ausbeute, durch Reaktion der entsprechenden Carbonsäureform des Cytokininglucuronids (das beispielsweise wie oben beschrieben hergestellt wurde) mit Diazomethan beziehungsweise Diazoethan dargestellt werden, indem man Reaktionsbedingungen anwendet, die für diesen Reaktionstyp normal sind und die einem Fachmann gut bekannt sein werden. Zahlreiche Cytokinine und Cytokininvorläuferverbindungen, die für eine Verwendung als Ausgangsmaterialien im Zusammenhang mit Verfahren B), oben, geeignet sind, sind kommerziell erhältlich, während andere nach herkömmlichen Verfahren, die in der Literatur beschrieben sind, synthetisiert werden können. Beispielsweise kann eine Anzahl geeigneter N6-substituierter Adenine, die R6-Gruppen haben, die von deren vorliegender Definition umfasst werden, durch Literaturverfahren erzielt werden, auf die Iwamura et al. [Phytochemistry 19 (1980) 1309] hinweisen, und zahlreiche 2-, 8- und 2,8-substituierte N6-(2'-Isopentenyl)adenine, die R2- und/oder R8-Gruppen haben, die durch deren vorliegende Definition umfasst werden, können wie von Dammann et al. [Phytochemistry 13 (1974) 329] beschrieben, hergestellt werden.
  • Gegenwärtig bevorzugte Verbindungen der Formel I sind die folgenden:
    eine Verbindung der Formel I, worin R2 H ist, R3 eine β-D-Glucopyranuronosylgruppe oder ein Salz davon an deren Carbonsäurefunktion ist, R9 und X halbe Bindungen sind, die zusammen eine Bindung bilden, R6 Benzyl ist, R7 und Y halbe Bindungen sind, die zusammen eine Bindung bilden, und R8 H ist;
    eine Verbindung der Formel I, worin R2 H ist, R3 das Amidderivat von β-D-Glucopyranuronosyl an dessen Carbonsäurefunktion ist, R9 und X halbe Bindungen sind, die zusammen eine Bindung bilden, R6 Benzyl ist, R7 und Y halbe Bindungen sind, die zusammen eine Bindung bilden, und R8 H ist;
    eine Verbindung der Formel I, worin R2 H ist, R3 und X halbe Bindungen sind, die zusammen eine Bindung bilden, R9 eine β-D-Glucopyranuronosylgruppe oder ein Salz davon an der Carbonsäurefunktion ist, R6 Benzyl ist, R7 und Y halbe Bindungen sind, die zusammen eine Bindung bilden, und R8 H ist;
    eine Verbindung der Formel I, worin R2 H ist, R3 eine β-D-Glucopyranuronosylgruppe oder ein Salz davon an der Carbonsäurefunktion ist, R9 und X halbe Bindungen sind, die zusammen eine Bindung bilden, R6 2-Isopentenyl ist, R7 und Y halbe Bindungen sind, die zusammen eine Bindung bilden, und R8 H ist;
    eine Verbindung der Formel I, worin R2 eine -S-β-D-Glucopyranuronosylgruppe oder ein Salz davon an der Carbonsäurefunktion ist, R9 H ist, R3 und X halbe Bindungen sind, die zusammen eine Bindung bilden, R6 2-Isopentenyl ist, R7 und Y halbe Bindungen sind, die zusammen eine Bindung bilden, und R8 H ist;
    eine Verbindung der Formel I, worin R2 H ist, R9 H ist, R3 und X halbe Bindungen sind, die zusammen eine Bindung bilden, R6 2-Isopentenyl ist, R7 und Y halbe Bindungen sind, die zusammen eine Bindung bilden, und R8 eine -S-β-D-Glucopyranuronosylgruppe oder ein Salz davon an der Carbonsäurefunktion ist; und
    eine Verbindung der Formel I, worin R2 H ist, R3 und X halbe Bindungen sind, die zusammen eine Bindung bilden, R9 H ist, R6 eine Gruppe der Formel
    Figure 00290001
    oder ein Salz davon ist, R7 und Y halbe Bindungen sind, die zusammen eine Bindung bilden, und R8 H ist.
  • Synthese von Verbindungen der allgemeinen Formel II gemäß der Erfindung
  • Verbindungen der Formel II können einfach dargestellt werden, indem man den leicht darzustellenden Methylester von o-Cumarsäure (d.h. 3-(2-Hydroxyphenyl)-2-propensäure) als Ausgangsmaterial verwendet. Der letztgenannte Ester kann durch Erhitzen der freien Säure (beispielsweise bezogen von Aldrich Chemical Company, Gillingham, Dorset, England, unter Katalognummer H2,280-9) unter Rückfluss in Methanol in Gegenwart von Schwefelsäure hergestellt werden. Es sollte hier angemerkt werden, dass ein Gemisch der cis- und trans-Formen (hinsichtlich der ethylenischen Doppelbindung) der Baueinheit erhalten wird. Man glaubt, dass die trans-Form, unabhängig vom Darstellungsverfahren, anfangs generell vorherrschend ist. Das macht jedoch nichts, da man gefunden hat, dass sowohl die cis- (Cumarinyl) als auch die trans- (Cumaryl-)glucuronide nach der GUS-Hydrolyse letztlich in Cumarin umgewandelt werden, wegen der Tatsache, dass Cumarsäure über einen Zeitraum einiger Tage (nichtenzymisch, vermutlich durch Lichtkatalyse) langsam in Cumarin umgewandelt wird.
  • Wirksame Verfahren für die Synthese der Verbindungen der Formel II, in denen (a) R1 und R10 in der Carbonsäureform und (b) R1 und R10 in der Amidform vorliegen, sind im Detail in den hier enthaltenen Beispielen 1H beziehungsweise 1I beschrieben. Die Verbindungen) der Formel II, in der(denen) sowohl R1 als auch R10 in der Natriumsalzform vorliegen, kann(können) geeigneterweise durch basische Hydrolyse des Methylesters des peracetylierten Glucuronids [hergestellt (aus Methylo-cumarat) und isoliert wie im ersten Teil des in Beispiel 1I beschriebenen Darstellungsverfahrens] unter Verwendung von methanolischen Natriumhydroxid auf die Weise, die am Anfang des zweiten Teils des in Beispiel 1I beschriebenen Herstellungsverfahrens beschrieben ist, erhalten werden; anstatt den pH des Hydrolysats mit Salzsäure auf 2,5 einzustellen, wie in Beispiel 1I beschrieben, wird das Gemisch einfach mit Salzsäure neutralisiert (auf einen pH ungefähr 7). Die Natriumsalzform wird geeigneterweise aus dem Gemisch durch Chromatographie über, beispielsweise nichtionisches Harz Amberlit XAD-2, isoliert, wobei die Säule mit Wasser gewaschen wird, um anorganische Salze zu entfernen, und dann typischerweise mit Methanol eluiert. Die rohe Glucuronid-Natriumsalzform, die durch Entfernen des Methanols erhalten wird, kann dann geeigneterweise aus beispielsweise absolutem Methanol umkristallisiert werden. Die Kaliumsalzform ist natürlich durch ein sehr analoges Verfahren darstellbar, indem man im Hydrolyseverfahren beispielsweise methanolisches Kaliumhydroxid verwendet.
  • Verbindungen der Formel II, in denen R1 und R10 beide in der Methylesterform vorliegen, oder beide in der Ethylesterform vorliegen, können geeigneterweise durch Reaktion zwischen Diazomethan beziehungsweise Diazoethan und der(den) Verbindungen) der Formel II, in der(denen) sowohl R1 als auch R10 in der Carbonsäureform vorliegt(vorliegen), dargestellt werden. Die Reaktionsbedingungen hierfür sind geeigneterweise wie oben für die analoge Herstellung der Methyl- oder Ethylesterformen von Cytokininglucuroniden beschrieben.
  • Gegenwärtig bevorzugte Verbindungen der allgemeinen Formel II sind die folgenden:
    eine Verbindung der Formel II, worin R1 cis- und/oder trans-2-Amidoethenyl [cis und/oder trans-CH=CHCONH2] ist, und R10 das Amidderivat von (3-D-Gluco pyranuronosyl an deren Carbonsäurefunktion ist (2-Hydroxycinnamyl-β-D-glucopyranuronamid).
    eine Verbindung der Formel II, worin R1 cis-2-Carboxyethenyl [cis-CH=CHCOOH] ist, und R10 eine β-D-Glucopyranuronosylgruppe (2-Hydroxycinnamyl-β-D-glucopyranuronsäure) ist.
  • Die Beispiele unter veranschaulichen die allgemeinen Prinzipien der vorliegenden Erfindung in Pflanzen, insbesondere unter Verwendung einer β-Glucuronidase als ein Selektionsgen und unter Verwendung neuartiger Glucuronidsubstrate, die durch dieses Gen hydrolisiert werden können. Auf der Basis dieser Arbeit wird erwogen, dass Gene wie das β-Glucuronidasegen für eine Anzahl verwandter Zwecke verwendet werden können. So kann das β-Glucuronidasegen in einem Verfahren zum Erhalt eines lokalisierten oder gewebetypischen Pflanzenwachstumsregulationseffekt in einem Pflanzenteil oder Pflanzengewebe, das ein eingeführtes β-Glucuronidasegen auf höherer Stufe als andere Teile oder Gewebe in derselben Pflanze exprimiert, angewendet werden, wobei das Verfahren umfasst, dass man die Pflanze einer Verbindung aussetzt, die durch das eingeführte β-Glucuronidasegen hydrolisiert werden kann, so dass die Verbindung in dem Teil oder Gewebe, das das eingeführte β-Glucuronidasegen enthält, hydrolysiert wird, wodurch eine Wachstumsregulierungsverbindung in dem Gewebe freigesetzt und nur in diesem Teil oder Gewebe eine Wachstumsregulierungswirkung herbeigeführt wird oder in diesem Teil oder Gewebe eine Wachstumsregulierungswirkung herbeigeführt wird, die größer ist als die Wirkung, die in anderen Teilen oder Geweben in der Pflanze erhalten wird. Es wird ebenso erwogen, dass es vorteilhaft sein kann, Pflanzenwachstumsregulatoren wie Cytokinine eher in Form von Glucuroniden oder Glucuronidderivaten denn als freie Cytokinine zu verwenden, beispielsweise um aus der Tatsache Vorteil zu ziehen, dass sie, verglichen mit beispielsweise den entsprechenden freien oder ribosylierten Cytokininen, in Pflanzen vermutlich anders transportiert und verteilt würden.
  • Ähnlich schlagen die Beispiele unten bestimmte andere Verwendungen für β-Glucuronidase vor. Eine davon ist ein in vitro-Verfahren, um Cytokininglucuronidverbindungen (oder Glucuronidverbindungen anderer Pflanzenwachstumsregula toren), die in vivo durch ein eingeführtes β-Glucuronidasegen hydrolisiert werden können, zu screenen und zu identifizieren. β-Glucuronidase kann auch in einem System zum Screenen von Verbindungen verwendet werden, die für die Verwendung als Selektionsreagentien in dem hier offenbarten positiven Selektionsverfahren geeignet sind (siehe Beispiel 2). In den Beispielen 3 und 12 sind Systeme beschrieben, die für das Screenen von Verbindungen verwendet werden können, die selektiv ein natives β-Glucuronidaseenzym in Pflanzenzellen hemmen, ohne die Aktivität eines Enzyms, das durch ein eingeführtes β-Glucuronidasegen codiert ist, zu beeinträchtigen.
  • BEISPIEL 1
  • SYNTHESE VON GLUCURONIDVERBINDUNGEN
  • Die Synthese einer Anzahl neuartiger Glucuronidverbindungen ist im folgenden beschrieben. Zusätzlich zu den Abkürzungen, die für jede der einzelnen synthetisierten Verbindungen angegeben sind, werden die folgenden Abkürzungen verwendet:
    • BA
    N6-Benzyladenin
    AcOH
    Essigsäure
    DMF
    N,N-Dimethylformamid
    IP
    N6-(2-Isopentenyl)adenin
    MBTG
    Methyl-(2,3,4-tri-O-acetyl-α-D-glucopyranosylbromid)uronat
  • BEISPIEL 1A
  • 3-β-Glucopyranuronosyl-6-benzylaminopurin-Natriumsalz
    • Synonyme: N6-Benzyladenin-N3-β-D-glucopyranuronsäure-Natriumsalz, N6-Benzyladenin-3-glucuronid-Natriumsalz
    • Abkürzung: BA3GN-Natriumsalz
  • Figure 00330001
  • Kondensation von N6-Benzyladenin (BA) und Methyl-(2,3,4-tri-O-acetyl-α-D-glucopyranosylbromid)uronat (MBTG)
  • BA (12,6 mmol) und MBTG (15,1 mmol) (Bollenback et al., 1955, J. Amer. Chem. Soc., Vol. 77, S. 3310-3315) wurden in wasserfreiem N,N-Dimethylformamid (DMF) (50 ml) suspendiert und für ungefähr 10 Std. auf 100 °C erhitzt. Das meiste DMF wurde unter Vakuum entfernt, und das Rohprodukt in Chloroform (300 ml) gelöst und mit Wasser (3 × 300 ml) verteilt. Nach dem Trocknen über wasserfreiem Magnesiumsulfat wurde der Chloroformextrakt unter Vakuum abgedampft und eine dunkle sirupartige Flüssigkeit aus Ethanol umkristallisiert. Das Rohprodukt (ein Gemisch aus BA, BA9GN und BA3GN als deren peracetylierte Methylester) wurde gereinigt über 100 g Kieselgel, gepackt in Chloroform, eluiert mit einem Gradienten von 0-4% Ethanol in Chloroform. Der rohe Peracetyl-BA3GN-methylester wurde aus Ethanol umkristallisiert. Ausbeute: 280 mg eines farblosen, amorphen Feststoffs.
  • Peracetyl-BA3GN-methylester wurde durch Behandlung mit 5%igem Natriumhydroxid in 50%igem wässrigem Ethanol bei Raumtemperatur hydrolisiert. Fünf Minuten, nachdem der Feststoff sich gelöst hatte, wurde das Reaktionsgemisch vorsichtig mit Salzsäure unter Eiskühlung neutralisiert. Nach dem Trocknen unter Vakuum wurde das rohe BA3GN-Natriumsalz durch Reversed-phase-Chromatographie (über 100 g Octadecylkieselgel) gereinigt, indem mit Wasser (1 l) und anschließend mit 20%igem wässrigem Methanol eluiert wurde, anschließend aus Ethanol umkristallisiert wurde. Reines BA3GN-Natriumsalz (150 mg) wurde als farbloser, mikrokristalliner Feststoff erhalten, der bis zur Gewichtskonstanz über Calciumchlorid unter Vakuum getrocknet wurde.
  • Analyse
    Figure 00340001
  • Diese Werte sind mit den Literaturwerten für BA-3-β-D-glucuropyranosid und N3, N6-disubstituierte Adenine identisch (N J Leonard, K L Carraway und J P Helgeson, J. Heterocyclic Chem. 1965, 2, 291-297).
  • HPLC
  • HPLC wurde durchgeführt unter Verwendung einer 10 × 0,46 cm Säule mit Octadecylkieselgel, isokratischer Eluierung mit 60%igem Methanol, das 10% Essigsäure enthielt, bei 1 ml/min. UV-Überwachung bei 290 nm.
  • BA3GN-Natriumsalz hatte eine Reinheit von 95+% und einen auf < 0,05% geschätzten Gehalt an freiem BA.
  • Hydrolyse durch β-Glucuronidase (GUS)
  • Das BA3GN-Natriumsalz (500 μg) in 500 μl eines 50 mM Natriumphosphatpuffers, pH 7,0, wurde mit β-Glucuronidase (GUS, Sigma Typ G7896), 2500 Sigma "Fishman"-Einheiten 18 Stunden lang bei 37 °C inkubiert. HPLC (Bedingungen wie oben) zeigte nahezu vollständiges Verschwinden des BA3GN-Peaks bei gleichzeitigem Erscheinen eines Peaks, der in einem 1:1-Gemisch mit authentischem BA cochromatographierte. Das bestätigt die Identität des Produkts als Konjugat aus BA und β-D-Glucuronsäure.
  • Die folgende Analyse wurde für einen anderen Anteil des BA3GN-Natriumsalzes erhalten, das wie oben beschrieben hergestellt wurde:
    Figure 00340002
  • HPLC
  • 15 × 0,46 cm Octadecylkieselgel, eluiert mit einem Gradienten von 20-60% Methanol/10% Essigsäure über 30 min bei 1 ml/min. HPLC-Reinheit 99,5%. Gehalt an freiem BA < 0,05%.
  • DC
  • Kieselgel, entwickelt mit 1-Butanol/Essigsäure/Wasser (12/3/5). DC-Reinheit 99,5%, Gehalt an freiem BA < 0,05%.
  • Hydrolyse durch β-Glucuronidase (GUS)
  • BA3GN-Natriumsalz (500 μg) in 500 μl eines 50 mM Natriumphosphatpuffers, pH 7,0, wurde mit β-Glucuronidase (GUS, Sigma Typ G7896), 2500 Sigma "Fishman"-Einheiten 12 Stunden lang bei 37 °C inkubiert. HPLC und DC zeigten nahezu vollständiges (> 99%) Verschwinden des BA3GN, wobei sich eine Verbindung ergab, die in einem 1:1-Gemisch mit authentischem BA cochromatographierte.
  • BEISPIEL 1B
  • 3-β-D-Glucopyranuronamido-6-benzylaminopurin
    • Synonyme: N6-Benzyladenin-N3-β-D-glucopyranuronamid N6-Benzyladenin-3-glucuronamid
    • Abkürzung: BA3Gnamid
  • Figure 00360001
  • Synthese
  • Umkristallisierter Peracetyl-BA3GN-methylester (1,5 g), der wie in Beispiel 1A hergestellt wurde, wurde in wasserfreiem Methanol (200 ml) suspendiert und auf 0 °C abgekühlt. Weiteres wasserfreies Methanol (400 ml), gesättigt mit wasserfreiem Ammoniak bei –10 °C, wurde zugegeben, und das Gemisch wurde auf Eis gerührt. Weiteres eiskaltes wasserfreies Methanol wurde zugegeben, bis sich der Feststoff vollständig löste. Das Reaktionsgemisch wurde weitere 3 h auf Eis gerührt. Überschüssiger Ammoniak und Methanol wurden unter Vakuum entfernt und das Produkt wurde gründlich mit heißem Ethanol verrieben, wobei sich ein farbloser Feststoff ergab (1,3 g).
  • BA3GNamid ist, genauso wie andere Adenin-3-glycoside, nur spärlich in Wasser oder Alkohol löslich, aber löst sich zu 2,4 mg/ml in 50%igem wässrigem Methanol, das 25% Essigsäure enthält.
  • Analyse
  • DC (Kieselgel-Chloroform/Methanol/Eisessig, 50/50/5)
  • Einzelner UV-Spot (Rf 0,36) ohne nachweisbare Verunreinigungen bei 50 μg Beladung. Reinheit 98+%. Kein nachweisbarer (< 1 %) Peracetyl-BA3GN-methylester (Rf 0,89) oder BA3GN (Rf 0,02).
  • DC (Kieselgel-Chloroform/Methanol, 9/1)
  • Angewendet, um auf BA-Gehalt zu testen. BA3GNamid bei 129 μg Beladung zeigte kein nachweisbares 6-Benzyladenin. BA-Gehalt deshalb < 0,2%.
  • BEISPIEL 1C
  • 9-β-D-Glucopyranuronosyl-6-benzylaminopurin-Natriumsalz
    • Synonyme: N6-Benzyladenin-N9-β-D-glucopyranuronsäure-Natriumsalz N6-Benzyladenin-9-glucuronid-Natriumsalz
    • Abkürzung: BA9GN-Natriumsalz
  • Figure 00370001
  • Synthese
  • Verfahren 1
  • Katalytische Oxidation von N6-Benzyladenin-9-β-D-glucopyranosid (BA9G)
  • BA9G (50 mg) wurde in 50 mM Natriumbicarbonat (25 ml) mit Platinmohr (200 mg) suspendiert. Die Mischung wurde auf einem Wasserbad auf 80 °C erhitzt, während ein kräftiger Sauerstoffstrom durchgeleitet wurde. Nach 4 Stunden wurden weitere 100 mg Platinkatalysator zugegeben. Nach 20 Stunden Behandlung waren ungefähr 95+% des BA9G in die entsprechende 9-β-D-Glucopyranonsäure und etwas BA umgewandelt. Das Gemisch wurde neutralisiert, und das Produkt BA9GN-Natriumsalz durch Reversed-phase-Chromatographie gereinigt (über 20 g Octadecylkieselgel), indem mit 200 ml Wasser und anschließend 20%igem MeOH eluiert wurde.
  • Reines BA9GN-Natriumsalz, frei von Glucosid und BA, wurde über Calciumchlorid unter Vakuum zu einem farblosen Feststoff getrocknet.
  • Verfahren 2
  • Kondensation von 6-Chlorpurin und Methyl-(2,3,4-tri-O-acetyl-α-D-Glucopyranosylbromid)uronat (MBTG)
  • 6-Chlorpurin (getrocknet über Phosphorpentoxid, 1,13 g), MBTG (3,87 g) und frisch getrocknetes Kaliumcarbonat (1,5 g) wurden in wasserfreiem Propylencarbonat 30 ml) bei Raumtemperatur 24 Stunden lang gerührt. Das dunkle Gemisch wurde filtriert und durch Säulenchromatographie über Kieselgel (100 g) gereinigt, indem mit einem 0-80% Gradienten von Ethylacetat in Chloroform eluiert wurde. Die Hauptfraktion (von nicht umgesetztem 6-Chlorpurin verschieden) wurde getrocknet und aus kochendem Ethanol umkristallisiert, wobei sich Methyl-6-chlorpurin-9-(2',3',4'-tri-O-acetyl-β-D-glucopyranuronat) als schwachgelben Feststoff (450 mg) ergab, der über Phosphorpentoxid unter Vakuum getrocknet wurde. HPLC ergab eine Reinheit von 95+%.
  • Methyl-6-chlorpurin-9-(2',3',4'-tri-O-acetyl-β-D-glucopyranuronat) (312 mg) und Benzylamin (171 μl) wurden zusammen in 1-Butanol (13,5 ml) bei 100 °C 1 Stunde lang erhitzt. Der Feststoff löste sich einfach, wobei sich eine klare gelbe Flüssigkeit ergab. Das meiste Butanol wurde unter Vakuum entfernt, um einen weißlichen Feststoff zu ergeben, der mit 5%igem Natriumhydroxid in 50%igem wässrigem Ethanol (25 ml) 1-2 Stunden lang bei Raumtemperatur geschüttelt wurde. Nach Neutralisation wurde das Produkt unter Vakuum getrocknet, um Spuren von Butanol zu entfernen, und das rohe BA9GN-Natriumsalz wurde durch Reversed-phase-Chromatographie wie in Verfahren 1 gereinigt.
  • Das reine Produkt wurde unter Vakuum über Calciumchlorid und Phosphorpentoxid getrocknet, um einen farblosen Feststoff zu ergeben (210 mg), der mit BA9GN, das durch katalytische Oxidation dargestellt worden war, cochromatographierte.
  • Analyse von BA9GN-Natriumsalz, hergestellt durch Kondensationsreaktion von Verfahren 2
    Figure 00380001
  • Diese Ergebnisse stimmen überein mit der Struktur eines N6,N9-disubstituierten Adenins. Die Extinktionskoeftizienten sind nahezu die gleichen wie für reines BA9G, was Abwesenheit nicht-UV-absorbierender Verunreinigungen anzeigt. UV-Reinheit 95+%.
  • HPLC
  • 10 × 0,46 cm Octadecylkieselgelsäule, UV-Monitor bei 270 nm. Isokratische (50% Methanol/0,2 M Essigsäure, 2 ml/min) und Gradienten-HPLC (0-60% Methanol/0,2 M Essigsäure, 2 ml/min) zeigen einen scharfen, symmetrischen Peak für BA9GN, das genau vor dem entsprechenden Glucosid eluiert wird. BA9GN, das durch Kondensationsreaktion hergestellt wurde, cochromatographiert bei der HPLC (Gradienten- und isokratische) in einem 1:1-Gemisch mit BA9GN, das durch katalytische Oxidation hergestellt wurde. Dies bestätigt, dass BA9GN, das durch die Kondensationsreaktion hergestellt wurde, das β-D-Glucopyranosylisomer ist. BA9GN enthält kein nachweisbares (< 2%) α-Anomer oder andere Verunreinigungen, einschließlich BA. HPLC-Reinheit des BA9GN 98+%.
  • DC (Kieselgel-Chloroform/Methanol, 9/1)
  • Wurde angewendet, um BA-Verunreinigung des BA9GN-Produktes zu messen. BA9GN bewegt sich in diesem System nicht vom Ausgangsfleck. Mindestnachweisgrenze von BA = 200 ng. BA9GN bei 200 μg Beladung zeigt kein nachweisbares BA oder andere Verunreinigungen. DC-Reinheit 98+%. BA-Gehalt < 0,1%.
  • Saure Hydrolyse
  • Mineralsäure wandelt Cytokininglucoside in die entsprechenden freie Cytokininbase um. Behandlung von BA9GN-Natriumsalz (1 mg/ml) mit 1 M Salzsäure bei 100 °C über Nacht ergab einen einzigen Spot bei der DC, der mit authentischem BA cochromatographierte. Dieser Test bestätigte, dass BA9GN ein säureempfindliches Konjugat von BA ist.
  • Enzymatische Hydrolyse
  • BA9GN-Natriumsalz (500 μg) in 500 μl eines 50 mM Natriumphosphatpuffers, pH 7,0, wurde mit Sigma β-Glucuronidase (GUS, Typ G7896), 2500 "Fishman"-Einheiten 18 Stunden lang bei 37 °C inkubiert. HPLC und DC zeigten keine nachweisbare Herstellung von BA. Weitere Inkubierung bei Raumtemperatur für 3 Tage zeigte keine Hydrolyse. BA9GN ist deshalb nicht empfänglich für Hydrolyse durch β-Glucuronidase.
  • BEISPIEL 1D
  • 3-β-D-Glucopyranuronosyl-6-(3-methyl-but-2-enylamino)purin-Natriumsalz
    • Synonyme: N6-(2'-Isopentenyl)adenin-N3-β-D-glucopyranuronsäure-Natriumsalz N6-(2'-Isopentenyl)adenin-3-glucuronid-Natriumsalz
    • Abkürzung: IP3GN-Natriumsalz
  • Figure 00400001
  • Synthese
  • N6-(2-Isopentenyl)adenin (9,48 g) und MBTG (22,1 g) wurden in wasserfreiem DMF (179 ml) 12 Stunden lang auf 100 °C erhitzt. Das meiste DMF wurde auf einem siedenden Wasserbad unter Vakuum entfernt, und die abgekühlte sirupartige Flüssigkeit wurde in Chloroform (500 ml) aufgenommen. Die Chloroformlösung wurde mit Wasser extrahiert (3 × 500 ml) und der organische Extrakt über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Das meiste Chloroform wurde unter Vakuum entfernt, und die sirupartige Flüssigkeit wurde chromatographisch über Kieselgel, das mit einem Gradienten von 0 bis 3,75% Methanol in Chloroform entwickelt wurde, gereinigt Der rohe Peracetyl-IP3GN-methylester wurde aus Methanol mit Aktivkohleentfärbung umkristallisiert, um reinen, farblosen Peracetyl-IP3GN-methylester (3,2 g) zu erhalten, der unter Vakuum über Calciumchlorid getrocknet wurde. Ein Teil des Peracetyl-IP3GN-methylesters (1,2 g) wurde durch Auflösen in ungefähr 1 l 75%igem wässrigem Methanol, das 5% Natriumhydroxid enthielt, und Rühren des Gemisches für 10 min bei Raumtemperatur hydrolysiert. Das Gemisch wurde auf Eis gekühlt, vorsichtig mit Salzsäure neutralisiert und unter Vakuum auf eine sirupartige Flüssigkeit eingeengt. Das Rohprodukt wurde durch aufeinanderfolgende Chromatographie über XAD-2 Harz und Octadecylkieselgel gereinigt, um IP3GN-Natriumsalz als farblosen, mikrokristallinen Feststoff zu ergeben, der über Calciumchlorid (810 mg) getrocknet wurde.
  • IP3GN-Natriumsalz ist in Wasser zu 2 mg/ml löslich.
  • Analyse
  • DC (Kieselgel-1-Butanol/Eisessig/Wasser, 12/3/5
  • IP3GN-Natriumsalz gibt einen einzelnen, scharfen Spot (Rf = 0,32) bei 100 μg Beladung ohne nachweisbares N6-(2-isopentenyl)adenin (IP) (Rf = 0,66) oder andere Verunreinigungen. Reinheit 99,5+%.
  • Hydrolyse durch β-Glucuronidase (GUS)
  • IP3GN-Natriumsalz (500 μg) in 500 μl eines 50 mM Natriumphosphatpuffers, pH 7,0, wurde mit β-Glucuronidase (GUS, Sigma Typ G7896), 2500 Sigma "Fishman"-Einheiten 12 Stunden lang bei 37 °C inkubiert. DC zeigte das Verschwinden des UV-Spots von IP3GN bei gleichzeitigem Auftreten eines neuen UV-Spots, der mit authentischem IP cochromatographierte.
  • BEISPIEL 1E
  • 6-(3-Methyl-but-2-enylamino)purin-2-yl-1-thio-β-D-glucopyranuronsäure-Natriumsalz
    • Synonyme: N6-(2'-Isopentenyl)adenin-2-thioglucopyranuronsäure-Natriumsalz N6-(2'-Isopentenyl)adenin-2-thioglucuronid-Natriumsalz
    • Abkürzung: IP2SGN-Natriumsalz
  • Figure 00420001
  • Synthese
  • 1. 2-Benzylthio-6-purinol
  • Benzylchlorid (1,4 ml) wurde tropfenweise unter starkem Rühren zu einer Lösung von 2 g 2-Thioxanthin in 12 ml 1 M Natriumhydroxid, das mit Wasser auf 140 ml verdünnt war, zugefügt. Nachdem alles zugegeben war, bildete sich ein cremefarbener Niederschlag. Das Reaktionsgemisch wurde eine weitere Stunde bei Raumtemperatur gerührt und filtriert. Der Feststoff wurde gründlich mit Wasser gewaschen und über Nacht unter Vakuum über Calciumchlorid, und bis zur Gewichtskonstanz über Phosphorpentoxid getrocknet. Das Rohprodukt (2 g) wurde im nächsten Schritt direkt ohne Umkristallisieren verwendet.
  • 2. 2-Benzylthio-6-chlorpurin
  • 2-Benzylthio-6-purinol (2 g) wurde mit einem Gemisch aus Phosphoroxychlorid (20 ml) und Diethylanilin (2 ml) bedeckt. Das Gemisch wurde unter Rühren für 1 Stunde am Rückfluss gekocht, abgekühlt und auf Eis (100 g) geschüttet. Es bildete sich ein gelber Niederschlag, der filtriert, gründlich mit Wasser gewaschen und unter Vakuum getrocknet wurde. Das Rohprodukt wurde aus Methanol umkristallisiert, um einen leicht cremefarbigen Feststoff zu ergeben (1,2 g), der auf Gewichtskonstanz über Phosphorpentoxid getrocknet wurde.
  • 3. 2-Benzylthio-N6-(2-isopentenyl)adenin
  • Eine Mischung aus 2-Benzylthio-6-chlorpurin (1,2 g) und Isopentenylaminhydrochlorid (1,04 g) in 1-Butanol (25 ml), das Triethylamin (2,2 ml) enthielt, wurde in einem verschlossenen Rohr bei 110 °C 2 Stunden lang erhitzt. Das Butanol wurde unter Vakuum entfernt und die Mischung mit Eiswasser (100 ml) geschüttelt. Das Produkt wurde filtriert, aus Ethanol mit Aktivkohleentfärbung umkristallisiert und unter Vakuum mit Phosphorpentoxid getrocknet. Ausbeute 0,64 g. Ausbeute 1,3 g 2-Benzylthio-N6-(2-isopentenyl)adenin als farbloser Feststoff. Das Rohprodukt wurde im nächsten Schritt direkt weiterverwendet.
  • 4. 2-Thio-N6-(2-isopentenyl)adenin
  • 2-Benzylthio-N6-(2'-isopentenyl)adenin (0,64 g) wurden in flüssigem Ammoniak (62,5 ml) gelöst, um eine klare gelbe Lösung zu ergeben. Natrium (ungefähr 200 mg) wurde in kleinen Stücken zugegeben, bis eine blaue Färbung für 10 min bestehen blieb. Eine kleine Menge festes Ammoniumchlorid wurde vorsichtig zugegeben, um überschüssiges Natrium zu entfernen, und man ließ den Ammoniak bis auf ein kleines Volumen verdampften. Diethylether (65,5 ml) wurde zugegeben, und der Etherextrakt wurde mit Wasser (62,5 ml) extrahiert. Der wässrige Extrakt wurde mit Essigsäure auf einen pH zwischen 4 und 5 eingestellt, wo sich ein cremiger Feststoff abschied. Nach Kühlung wurde das Produkt abfiltriert und unter Vakuum über Phosphorpentoxid getrocknet. Ausbeute 340 mg.
  • Rohes 2-Thio-N6-(2-isopentenyl)adenin wurde in das Kaliumsalz umgewandelt durch Suspension in Wasser und Zugabe einer äquimolaren Menge von Kaliumhydroxid zusammen mit ausreichend Alkohol, um Auflösung zu bewirken. Die Lösung wurde unter Vakuum und über Phosphorpentoxid getrocknet.
  • 5. N6-(2-isopentenyl)adenin-2-thioglucopyranuronid
  • Das Kaliumsalz von 2-Thio-N6-(2-isopentenyl)adenin (2,89 mmol) wurde in wasserfreiem Methanol gelöst, und MBTG (5 mM) wurde zugegeben. Das Gemisch wurde 24 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt, währenddessen sich ein cremiger weißer Feststoff niederschlug. Das Reaktionsgemisch wurde unter Vakuum getrocknet und bei Raumtemperatur durch Behandlung mit 5%igem wässrigen Natriumhydroxid (50 ml) hydrolysiert, um das freie Glucopyranuronid als Natriumsalz zu ergeben. Das Gemisch wurde durch die vorsichtige Zugabe von konzentrierter Salzsäure mit Kühlung von außen neutralisiert, um einen farblosen Niederschlag des rohen IP2SGN-Natriumsalzes zu ergeben.
  • Das Rohprodukt wurde durch Reversed-phase-Chromatographie gereinigt, aus Ethanol umkristallisiert und unter Vakuum über Calciumchlorid getrocknet, um einen farblosen, amorphen Feststoff (150 mg) zu ergeben. Das Produkt war spärlich in 50%igem wässrigen Alkohol löslich.
  • Analyse
    Figure 00440001
  • IP2SGN-Natriumsalz zeigte das charakteristische UV-Spektrum von 2-thiosubstituierten Cytokininen, und das Spektrum war sehr ähnlich dem von authentischem 2-Methylthio-N6-(2-isopentenyl)adenin. UV-Analyse bestätigte das Produkt als ein 2-N6-disubstituiertes Adenin.
  • HPLC
  • Für HPLC wurde eine 15 × 0,46 Octadecylkieselgelsäule verwendet, die mit einem Gradienten von 0-60% Methanol, das 0,2 M Essigsäure enthielt, über 30 min bei 1 ml/min. eluiert wurde. UV-Überwachung bei 270 nm.
  • IP2SGN-Natriumsalz hatte eine Reinheit von 98+% und enthielt kein nachweisbares freies 2-Thio-N6-(2-isopentenyl)adenin (< 0,1 %).
  • Hydrolyse durch β-Glucuronidase (GUS)
  • IP2SGN-Natriumsalz (500 μg) in 500 μl eines 50 mM Natriumphosphatpuffers, pH 7,0, wurde mit β-Glucuronidase (GUS, Sigma Typ G7896), 2500 Sigma "Fishman"-Einheiten 48 Stunden lang bei 37 °C inkubiert. HPLC (Bedingungen wie oben) zeigte teilweises Verschwinden (65%) von IP2SGN, wobei ein Peak entstand, der in einem 1:1-Gemisch mit 2-Thio-N6-(2-pentenyl)adenin cochromatographierte. Dieser Test bestätigt die Identität von IP2SGN-Natriumsalz als Konjugat von 2-Thio-N6-(2-isopentenyl)-adenin und β-D-Glucuronsäure, teilweise empfänglich für GUS-Hydrolyse.
  • BEISPIEL 1F
  • 6-(3-Methyl-but-2-enylamino)purin-8-yl-1-thio-β-D-glucopyranuronsäure-Natriumsalz
    • Synonyme: N6-(2'-Isopentenyl)adenin-8-thioglucopyranuronsäure-Natriumsalz N6-(2'-Isopentenyl)adenin-8-thioglucuronid-Natriumsalz
    • Abkürzung: IP8SGN-Natriumsalz
  • Figure 00450001
  • Reaktion 1
  • 6-Hydroxy-8-thiopurin
  • 4,5-Diamino-6-hydroxypyrimidinsulfat (25 g) und Thioharnstoff (100 g) wurden zusammen gemahlen und auf einem Ölbad 30 min lang bei 200 °C erhitzt. Das abgekühlte, verfestigte Produkt wurde in heißer 1 m NaOH (500 ml) gelöst, mit Aktivkohle aufgekocht und filtriert. Das heiße Filtrat wurde mit cHCl angesäuert, und die heiße Lösung wurde abfiltriert, um einen roten Feststoff zu ergeben, der aus einer heißen basischen Lösung nochmals ausgefällt, gut mit Wasser gewaschen und unter Vakuum bei 80 °C getrocknet wurde. Ausbeute 5,28 g.
  • Analyse
    Figure 00460001
  • Reaktion 2
  • 6-Hydroxy-8-benzylthiopurin
  • 5,28 g 6-Hydroxy-8-thiopurin wurden in 78,5 ml 1 M NaOH suspendiert und auf 400 ml mit Wasser verdünnt. 3,7 ml Benzylchlorid wurden zugegeben, und das Reaktionsgemisch wurde 3 Stunden bei Raumtemperatur kräftig gerührt, mit Eisessig auf pH 5 eingestellt und filtriert. Das Produkt wurde gründlich mit Wasser gewaschen und über Nacht unter Vakuum bei 80 °C getrocknet, um 7,33 g eines lachsrosa Feststoffs zu ergeben, der ohne weitere Reinigung weiterverwendet wurde.
  • Reaktion 3
  • 6-Chlor-8-benzylthiopurin
  • 6-Hydroxy-8-benzylthiopurin (7,33 g) wurde zu einer Mischung von Phosphoroxychlorid (70 ml) und N,N-Diethylanilin (7,5 ml) zugegeben, und das Gemisch wurde 2 Stunden am Rückfluss gekocht, um ein dunkelrotes Produkt zu ergeben. Das Gemisch wurde unter Vakuum aufkonzentriert, und die sich ergebende sirupartige Flüssigkeit wurde langsam unter Rühren auf Eis (400 g) geschüttet. Das Gemisch wurde 15 min stehen gelassen, dann mit kalter konzentrierter KOH stark alkalisch gemacht. Die Mischung wurde gründlich verrieben, um das meiste der sirupartigen Flüssigkeit zu lösen, und auf pH 1 durch langsame Zugabe kalter konzentrierter HCl gesäuert, wobei immer noch überschüssiges Eis vorhanden war.
  • Nach Stehen für 1 Stunde bei Raumtemperatur wurde das Produkt abfiltriert, gründlich mit Wasser gewaschen und unter Vakuum bei 80 °C für 2 Stunden getrocknet, um 7,8 g Produkt zu ergeben.
  • Reaktion 4
  • 8-Benzylthio-N6-(2'-isopentenyl)adenin
  • Ein Gemisch aus 6-Chlor-8-benzylthiopurin (3,9 g) und Isopentenylaminhydrochlorid (3,42 g) in 1-Butanol (100 ml), das Triethylamin enthielt (7,5 ml), wurde 2 Stunden lang am Rückfluss gekocht. Das meiste Butanol wurde unter Vakuum entfernt, und das Reaktionsgemisch wurde auf Eis gekühlt und mit Wasser (400 ml) geschüttelt. Nach Kühlung über Nacht wurde das Gemisch filtriert, um ein Rohprodukt zu ergeben, das durch Chromatographie über 100 g Kieselgel, das mit einem Gradienten von 0-2,5% MeOH in Chloroform eluiert wurde, gereinigt wurde. Das chromatographisch reine Produkt wurde aus Methanol umkristallisiert, um 1,18 g eines farblosen, amorphen Feststoffs zu ergeben.
  • Analyse
  • DC (Kieselgel-2,5% Methanol/Chloroform)
    • Reinheit 98+%. Keine nachweisbaren Verunreinigungen.
  • Figure 00470001
  • Reaktion 5
  • 8-Thio-N6-(2'isopentenyl)adenin
  • 8-Benzylthio-N6-(2'isopentenyl)adenin (1,18 g) wurde in flüssigem Ammoniak (125 ml) gelöst, um eine klare gelbe Lösung zu ergeben. Natrium wurde in kleinen Stücken zugegeben, bis eine blaue Färbung für 15 min bestehen blieb. Eine kleine Menge festes Ammoniumchlorid wurde vorsichtig zugegeben, um überschüssiges Natrium zu entfernen. Der Ammoniak wurde auf einer heißen Platte auf ein kleines Volumen abgedampft, und Ether (125 ml) zugegeben.
  • Nachdem das meiste des verbliebenen Ammoniaks sich verflüchtigt hatte, wurde der Etherextrakt mit Wasser (2 × 65 ml) extrahiert. Der wässrige Extrakt (bei pH 12-13) wurde auf Eis gekühlt und mit Eisessig auf pH 5 eingestellt. Ein cremiger weißer Feststoff schied sich ab, der filtriert, gründlich mit Wasser gewaschen und über Nacht über Calciumchlorid getrocknet wurde, um ein nahezu weißes, sehr leichtes Pulver zu ergeben. Ausbeute 760 mg.
  • Anmerkung: 8-Thio-N6-(2'isopentenyl)adenin wird in alkalischer Lösung leicht oxidiert.
  • Analyse
  • HPLC
    • (15 cm Oktadecylkieselgel, 0-80% Methanol/0,2 M Eisessig, 30 min., 1 ml/min., UV-Überwachung bei 300 nm)
    • Scharfer, symmetrischer Peak ohne nachweisbare Verunreinigungen. Reinheit 98+%.
  • Figure 00480001
  • Reaktion 6
  • IP8SGN-Natriumsalz
  • 8-Thio-N6-(2'isopentenyl)adenin (600 mg) wurden in 50 mM Kaliumhydroxid (102 ml), das 1 % 2-Mercaptoethanol als Oxidationsmittel enthielt, suspendiert. Ausreichend Alkohol wurde zugegeben, um den Feststoff zu lösen. Die Lösung wurde unter Vakuum über Calciumchlorid, gefolgt von Phosphorpentoxid getrocknet. Das trockene Produkt wurde in wasserfreiem Methanol (100 ml), das 2-Mercaptoethanol (50 μl) enthielt, gelöst, und MBTG (2 g) wurde zugegeben. Das Gemisch wurde 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und unter Vakuum über Calciumchlorid und Phosphorpentoxid getrocknet. Der geschützte Ester wurde 1 Stunde lang bei Raumtemperatur in 50 ml 5%igem Natriumhydroxid hydrolisiert.
  • Nach Neutralisation mit konzentrierter Salzsäure wurde das Rohprodukt durch Reversed-phase- und Normal-phase-Chromatographie gereinigt, um einen farblosen Feststoff zu ergeben, der auf Gewichtskonstanz über Calciumchlorid getrocknet wurde. Ausbeute 190 mg.
  • Analyse von IP8SGN-Natriumsalz
    Figure 00490001
  • DC (Kieselgel-Chloroform/Methanol, 1/1)
  • Das IP8SGN-Natriumsalz zeigte bei Beladungen von 34, 68, 102 und 134 μg einen einzelnen scharfen Spot ohne nachweisbare Verunreinigungen. Reinheit 99,5+%. Gehalt an freier Cytokininbase, 8-Thio-N6-(2'isopentenyl)adenin < 0,1 %.
  • HPLC
    • (15 cm Oktadecylkieselgel, 0-80% Methanol/0,2 M Eisessig, 30 min., 1 ml, 300 nm)
    • Einzelner, breiter Peak, tR 18,2 min. Keine Verunreinigungen nachweisbar. Reinheit 99,5+%.
  • GUS Hydrolyse
  • IP8SGN-Natriumsalz zu 1 mg/ml wurde mit 2500 Einheiten GUS (Sigma) in 50 mM Phosphatpuffer, pH 7, bei 37 °C 24 Stunden lang inkubiert. DC (1/1, Methanol/Chloroform) zeigte vollständige (> 95%) Umwandlung des IP8SGN-Natriumsalzes in eine Verbindung, die mit 8-Thio-(2'isopentenyl)adenin cochromatographierte. IP8SGN-Natriumsalz ist deshalb empfänglich für GUS-Hydrolyse.
  • BEISPIEL 1G
  • O-β-D-Glucopyranuronosylzeatin-Natriumsalz
    • Synonyme: Zeatin-O-β-D-Glucopyranuronsäure-Natriumsalz Zeatin-O-Glucuronid-Natriumsalz
    • Abkürzung: ZOGN-Natriumsalz
  • Figure 00500001
  • Synthese
  • Trans-2-Methyl-4-phthalimidobut-2-enyl-(2',3',4'-tri-O-acetyl-β-D-glucopyranuronsäuremethylester
  • Trans-1-Hydroxy-2-methyl-4-phthalimido-but-2-en (1,87 g, Corse & Kuhnle, 1972, Synthesis, S. 618-619) und frisch aktiviertes Silbercarbonat (9 g) wurden in wasserfreiem Ether (300 ml), der Molekularsieb enthielt (9 g), suspendiert. Nach Rühren für 30 min bei Raumtemperatur wurde MBTG (3,24 g) zugegeben, und das Gemisch wurde im Dunkeln 2 Tage bei Raumtemperatur gerührt. Weiteres MBTG (1,62 g) wurde zugegeben, und das Gemisch wurde für weitere 2 Tage gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde filtriert, unter Vakuum zu einer farblosen sirupartigen Flüssigkeit getrocknet, die weiter unter Vakuum über Calciumchlorid getrocknet wurde, um einen farblosen, pulverisierbaren Schaum zu ergeben. Das Rohprodukt wurde durch Chromatographie über Kieselgel (200 g), das mit Chloroform eluiert wurde, von Zuckerverunreinigungen befreit. Ausbeute an reinem Produkt war 2,45 g (55,4%).
  • Trans-2-Methyl-4-amino-but-2-enyl-β-D-glucopyranosyluronamid
  • Methyl-trans-2-methyl-4-phthalimidobut-2-enyl-(2',3',4'-tri-O-acetyl-β-D-glucopyranuronat (2,45 g) wurde in wasserfreiem Methanol (150 ml) gelöst, auf Eis gekühlt, und Ammoniak wurde 6 Stunden lang durch das eisgekühlte Gemisch durchgeleitet. Nach Entfernen des Methanols unter Vakuum wurde das Rohprodukt durch Chromatographie über Zellulose (200 g) gereinigt und mit Butanol-Ethanol-Essigsäure-Wasser (8:2:1:3 v/v) entwickelt. Das Eluat wurde unter Vakuum getrocknet, um eine braune sirupartige Flüssigkeit zu ergeben, die im Kondensationsschritt ohne weitere Reinigung eingesetzt wurde.
  • Zeatin-O-β-glucuronsäure-Natriumsalz
  • Die sirupartige Flüssigkeit aus dem vorherigen Schritt wurde in einem abgeschlossenen Rohr mit 6-Chlorpurin (0,8 g) und Triethylamin (1,5 ml) in Methanol (25 ml) bei 90 °C 4 Stunden lang erhitzt, um das Amid zu ergeben. Um das Amid in die Säure umzuwandeln, wurde das Methanol unter Vakuum entfernt, und 5%iges wässriges Natriumhydroxid (25 ml) wurde zugegeben. Nach Rühren bei Raumtemperatur für 6 Stunden wurde das Gemisch vorsichtig mit 2 M Salzsäure neutralisiert und durch Reversed-phase-Chromatographie über Oktadecylkieselgel (100 g) und Elution mit Wasser gereinigt. Rohes ZOGN-Natriumsalz, das nicht umgesetztes 6-Chlorpurin enthielt, wurde unter Vakuum getrocknet und durch Chromatographie über Kieselgel (50 g) und Elution mit einem 0-100%-Gradienten von Methanol in Chloroform gereinigt. Nach Entfernen des Lösungsmittels am Vakuum wurde das Produkt als amorpher Feststoff unter Vakuum über Calciumchlorid getrocknet. Ausbeute 158 g.
  • Analyse
    Figure 00510001
  • DC (Kieselgel-1-Butanol/Eisessig/Wasser, 12/3/5)
  • ZOGN-Natriumsalz zeigte bei einer Beladung von 50 μg einen einzelnen Spot (Rf 0,16) ohne nachweisbare Verunreinigungen. Zeatin (0,66) oder 6-Chlorpurin (Rf 0,70) waren nicht nachweisbar. Reinheit insgesamt 98+%.
  • HPLC
    • (15 × 0,46 cm Oktadecylkieselgelsäule, UV-Überwachung bei 270 nm)
  • Gradientenelution
    • (0-100% Methanol über 30 min bei 1 ml/min)
  • ZOGN-Natriumsalz eluiert als recht breiter Peak (tR 10,0 min.) mit einer kleinen Menge einer anorganischen Verunreinigung, die mit dem Lösungsmittelpeak zusammen vorkommt. Reinheit insgesamt 97+%.
  • Isokratische Elution
    • (50%iges wässriges Methanol, 1 ml/min)
  • Isokratische Elution wurde angewendet, um den Zeatingehalt zu bestimmen. ZOGN-Natriumsalz hatte eine Retentionszeit (tR) von 1,1 min, verglichen mit tR von authentischem trans-Zeatin von 2,2 min. HPLC von bis zu 96 μg ZOGN-Natriumsalz zeigte kein nachweisbares Zeatin. Der Zeatingehalt war deshalb < 0,1%. Dies wurde durch DC auf Kieselgel in Chloroform/Methanol 9/1 bestätigt. ZOGN-Natriumsalz bewegte sich in diesem System nicht vom Ausgangspunkt, aber jegliche Zeatinverunreinigung wurde bei Rf 0,39 klar abgetrennt. Es wurde kein Zeatin nachgewiesen, wenn 200 μg ZOGN-Natriumsalz laufen gelassen wurden. Die Nachweisgrenze für trans-Zeatin in der DC war 200 ng; deshalb bestätigte sich die Verunreinigung mit trans-Zeatin auf < 0,1%.
  • Enzymatische Hydrolyse
  • Eine Probe ZOGN-Natriumsalz wurde mit β-Glucuronidase (Sigma G9387) in 50 mM Natriumphosphatpuffer bei pH 7,0 bei 37 °C inkubiert. HPLC (50% isokratisches Methanol) zeigte nahezu vollständige Umwandlung zu trans-Zeatin. Die Identität von trans-Zeatin in dem Enzymhydrolysat wurde durch Cochromatographie eines 1:1-Gemischs des Hydrolysats und authentischem trans-Zeatin in 3 verschiedenen chromatographischen Systemen nachgewiesen.
  • BEISPIEL 1H
  • 2-Hydroxycinnamyl-β-D-glucopyranuronamid
    • Synonyme: o-Cumaryl-β-D-Glucopyranuronamid o-Cumarylglucuronamid
    • Abkürzung: CouGNamid
  • Figure 00530001
  • Synthese
  • Methyl-o-cumarat (15 g) und MBTG (16,8 g) wurden zusammen mit Chinolin (25 ml) gemahlen, um eine homogene Paste zu ergeben. Silber(I)oxid (10,7 g) wurde in mehreren Portionen mit gründlichem Mischen zugegeben, während das Gemisch auf Eis gekühlt wurde. Nach vollendeter Zugabe wurde das Reaktionsgemisch 3 h auf Raumtemperatur gehalten. Das Gemisch wurde mit Ether (1 l) extrahiert und der Etherextrakt mit Wasser (1 l) gewaschen. Der Etherextrakt wurde über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und zu einer roten sirupartigen Flüssigkeit unter Vakuum getrocknet. Die rohe sirupartige Flüssigkeit wurde mit Petrolether (300 ml) extrahiert, um nicht umgesetztes Methyl-o-cumarat zu entfernen, dann unter Vakuum getrocknet, um Spuren von Petrolether zu entfernen. Das Rohprodukt wurde aus Ethanol mit Aktivkohleentfärbung umkristallisiert, um reines peracetyliertes Methyl-2-hydroxycinnamyl-O-β-glucupyranuronat (3,5 g) zu ergeben.
  • Der Peracetylmethylester (3,5 g) wurde in wasserfreiem Methanol (250 ml) gelöst und durch Rühren bei 0 °C über 3 h mit weiterem wasserfreiem Methanol (250 ml), das mit trockenem Ammoniak bei –10 °C gesättigt worden war, hydrolisiert. Ammoniak und Methanol wurden unter Vakuum entfernt und das Rohprodukt aus Ethanol umkristallisiert und unter Vakuum über Calciumchlorid getrocknet, um reines CouGNamid als farblosen, federigen Feststoff zu ergeben (1,7 g).
  • Analyse
  • DC (Kieselgel-Chloroform/Methanol, 1/1)
  • Einzelner, scharfer Spot bei Rf 0,63. Keine Verunreinigungen wurden bei einer Beladung von bis zu 50 μg nachgewiesen, Reinheit 98+%. Verunreinigungen, weniger als 0,5% Methyl-o-cumarat; oder Cumarin.
  • DC (Kieselgel-Chloroform/Methanol/Eisessig, 50/50/5)
    • Einzelner, scharfer Spot bei Rf 0,68. Reinheit 98+%. Keine nachweisbare (< 0,5%) o-Cumarsäure (Rf 0,80).
  • BEISPIEL 1I
  • 2-Hydroxycinnamyl-β-D-glucopyranuronsäure
    • Synonyme: o-Cumaryl-β-D-glucopyranuronsäure o-Cumarylglucuronid
    • Abkürzung: CouGN
  • Figure 00540001
  • Synthese
  • Methyl-o-cumarat (17,8 g) und MBTG (20 g) wurden zusammen mit Chinolin (20 ml) zu einer einheitlichen Paste gemahlen. Silber(I)oxid (13 g) wurde unter gründlichem Mischen in Teilen zugegeben, während das Gemisch auf Eis gekühlt wurde. Nach vollendeter Zugabe wurde das Reaktionsgemisch bei Raumtemperatur 3 h lang stehengelassen. Das Gemisch wurde mit Ether (1 l) extrahiert, und der Etherextrakt wurde mit Wasser (1 l) gewaschen. Der Etherextrakt wurde über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und unter Vakuum zu einer roten sirupartigen Flüssigkeit getrocknet. Die rohe sirupartige Flüssigkeit wurde mit Petrolether (300 ml) extrahiert, um nicht umgesetztes Methyl-o-cumarat zu entfernen, dann unter Vakuum getrocknet, um Spuren von Petrolether zu entfernen. Das Rohprodukt wurde aus Ethanol mit Aktivkohleentfärbung umkristallisiert, um reines peracetyliertes Methyl-CouGN (2,9 g) zu ergeben.
  • Der Peracetylmethylester (2,9 g) wurde in Methanol (250 ml) suspendiert, und 2 M Natriumhydroxid (250 ml) wurde unter Rühren zugegeben, während das Reaktionsgemisch auf Eis gekühlt wurde. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur für 1,5 h lang gerührt und mit Salzsäure auf pH 2,5 eingestellt. Das Methanol wurde unter Vakuum entfernt und das Rohprodukt durch XAD-2 Chromatographie gereinigt. Das chromatographische Harz wurde zuerst mit Wasser gewaschen, um anorganische Salze zu entfernen, und das Produkt wurde mit Methanol eluiert. Nach Trocknung unter Vakuum wurde das Produkt aus Ethanol umkristallisiert und unter Vakuum über Calciumchlorid getrocknet, um reines CouGN als farblosen, amorphen Feststoff (1,5 g) zu ergeben.
  • CouGN ist zu 5 mg/ml in wässrigem Puffer, pH 7, löslich und in 50%igem wässrigem Alkohol als klare, farblose Lösung.
  • Analyse
  • DC (Kieselgel-Chloroform/Methanol/Eisessig, 50/50/1)
  • Hauptspot Rf 0,12 mit einer winzigen Verunreinigung bei Rf 0,24. Reinheit 90+%. Kein nachweisbares (< 1 %) Cumarin (Rf 0,90), Methyl-o-cumarat (Rf 0,91) oder o-Cumarsäure (Rf 0,80). Das Hauptprodukt cochromatographierte mit authentischer CouGN, die durch die katalytische Oxidation von 2-Hydroxycinnamyl-O-β-D-glucopyranosid hergestellt worden war.
  • GUS-Hydrolyse
  • CouGN (5 mg) wurde in 50 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,0 (1 ml) gelöst und mit GUS (1000 Einheiten Sigma Typ G5897) 12 Stunden lang bei 37 °C inkubiert. DC zeigte 93,4% Umwandlung zu einer Verbindung, die mit o-Cumarsäure cochromatographierte. o-Cumarsäure wird über einen Zeitraum von einigen Tagen langsam (nichtenzymatisch) in Cumarin umgewandelt.
  • BEISPIEL 2
  • CYTOKININGLUCURONIDE WERDEN DURCH β-GLUCURONIDASE HYDROLISIERT UND SETZEN DABEI UNVERÄNDERTE CYTOKININE FREI
  • Ein Assay wurde entwickelt, um jene Cytokininglucuronide zu identifizieren, die durch β-Glucuronidase von E. coli hydrolisiert werden können. (Verschiedene Merkmale des β-Glucuronidaseenzyms und -gens sind beispielsweise im folgenden beschrieben: Blanco & Nemoz, Biochimie 69, S. 157-161, 1987; Jefferson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 83, S. 8447-8451, 1986; Levvy & Marsh, Advan. Carbohydrate Chem. 14, S. 381-428; US 4,721,671 ).
  • Die Verbindung, die getested werden soll, wird in 50 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,0, (im allgemeinen 500 μg der Verbindung in 500 μl Puffer) mit β-Glucuronidase (im allgemeinen Sigma Typ G7896, 2500 "Fishman"-Einheiten) 12-24 h lang bei 37 °C inkubiert. Die Gegenwart von Hydrolyseprodukten wird dann unter Verwendung von HPLC und DC bestimmt.
  • Die Tabelle unten zeigt die Ergebnisse des oben beschriebenen Assays an einer Anzahl von Cytokinin-β-glucuroniden und einem Cytokinin-β-D-glucuronamid.
  • TABELLE 1
    Figure 00570001
  • Weil die einzigen Substrate, die verwendet wurden, um das GUS-Enzym von E. coli in transgenen Organismen zu testen, O-Glucuronide waren, und weil früher berichtet worden war (Jefferson, "The GUS reporter gene system", Nature, Vol. 342, S. 837-838, 1989), dass die Substrate von β-Glucuronidase aus D-Glucuronsäure bestehen, die durch eine β-O-glykosidische Verknüpfung an ein Aglykon gebunden ist, war es überraschend, dass gefunden wurde, dass auch bestimmte N-Glucuronide und S-Glucuronide gute Substrate für dieses Enzym sind. Es wird deshalb auch erwogen, dass solche N- und S-Glucuronidverbindungen in Assays für das β-Glucuronidaseenzym von E. coli und Pflanzen, beispielsweise ähnlich dem X-gluc-Assay, auf den man sich unten bezieht, verwendet werden können.
  • In GB 2 197 653 A wird festgestellt, dass durch Verwendung des β-Glucuronidasesystems und neuartiger Substanzen positive und negative Selektion unter Verwendung der GUS-Aktivität möglich sein kann. Diese Annahme ist jedoch nie überprüft worden, und enzymatische Hydrolyse solcher Verbindungen hat sich nie als wahrscheinlich gezeigt, selbst auf der Grundlage theoretischer Überlegungen, die die chemischen Eigenschaften von Substraten für β-Glucuronidase von E-coli berücksichtigen. Wie hier gezeigt, sind nicht alle Glucuronide Substrate für das β-Glucuronidaseenzym von E. coli, und es wird nicht erwartet, dass die meisten Glucuronide Substrate für das GUS-Enzym sind.
  • Reaktionen im Pflanzengewebe, die das β-Glucuronidasegen von E. coli exprimieren, wurden bereits als Verfahren zur Bewertung, ob bestimmte Glucuronide (einschließlich Pflanzenhormonvorläuferverbindungen) durch das Enzym in vivo hydrolisiert werden können (Jefferson, "The GUS gene fusion system as a versatile tool for agricultural molecular biology", Abstract aus International Congress on Genetic Manipulation in Plant Breeding, gehalten in Elsinore, Dänemark, 11.-16. September 1988), verwendet. Unglücklicherweise ist dieser Ansatz nicht möglich wegen des Auftretens von starker endogener β-Glucuronidaseaktivität in Pflanzengewebe (siehe z.B. Beispiel 3 unten, ebenso wie Hodal et al., "Detection, expression and specific elimination of endogenous β-glucuronidase activity in transgenic and non-transgenic plants", im Druck in Plant Science). Das Auftreten dieser endogenen β-Glucuronidaseaktivität bedeutet auch, dass es durch Anwendung des von Jefferson beschriebenen Verfahrens unmöglich ist zu bestimmen, ob die durch das Glucuronid verursachten Wirkungen auf Hydrolyse der Verbindung beruhen, oder ob sie durch die Tatsache erklärt werden können, dass das Glucuronid selbst aktiv ist. Um eine geeignete Verbindung für Selektionszwecke zu sein, muss eine Verbindung durch das GUS-Enzym aktiviert werden und auch ohne jegliche bedeutende Aktivität in der Glucuronidform sein.
  • Der oben beschriebene Assay kann verwendet werden, um auf Cytokininglucuronide zu durchsuchen, die durch ein gegebenes β-Glucuronidaseenzym hydrolisiert werden können, hier am Beispiel des β-Glucuronidaseenzyms von E. coli.
  • Es war ferner unter Verwendung von HPLC und DC festgestellt worden, dass unmodifizierte aktive Cytokinine das Produkt der GUS-Hydrolyse sind (siehe die Beispiele oben, die sich auf die Herstellung und Analyse neuartiger Cytokininglucuronidverbindungen beziehen). So wurde beispielsweise gefunden, dass die Hydrolyse von BA3GN-Natriumsalz durch β-Glucuronidase von E. coli zu nahezu vollständigem (> 99%) Verschwinden des BA3GN-Natriumsalzes führte, wobei sich eine Verbindung ergab, die in einem 1:1-Gemisch mit authentischem BA cochromatographierte. Ähnlich konnte durch HPLC (50%iges isokratisches Methanol) gezeigt werden, dass Inkubation von ZOGN-Natriumsalz mit β-Glucuronidase von E. coli eine nahezu vollständige Umwandlung zu trans-Zeatin ergibt; und es konnte durch DC (1:1, MeOH/Chloroform) gezeigt werden, dass Inkubation von IP8SGN-Natriumsalz mit β-Glucuronidase für 24 Stunden fast vollständige (> 95%) Umwandlung von IP8SGN in eine Verbindung ergibt, die mit 8-Thio-(2-isopentenyl)adenin cochromatographiert.
  • Ähnlich können andere Arten von Glucuroniden auf ihre Fähigkeit, durch eine gegebene β-Glucuronidase hydrolisiert zu werden, abgesucht werden. Beispielsweise konnte durch DC gezeigt werden, dass Inkubation von o-Cumaryl-β-D-glucuronid (5 mg in 1 ml Puffer) für 12 Stunden mit β-Glucuronidase (Sigma Typ G5897, 1000 Einheiten) eine 93,4%ige Umwandlung zu einer Verbindung ergibt, die mit o-Cumarsäure cochromatographierte. Inkubation der anderen in Tabelle 1 aufgelisteten Verbindungen (mit Ausnahme der zwei Verbindungen, die nicht als Substrate für β-Glucuronidase von E-coli wirkten) ergab ähnliche Ergebnisse, d.h. ergab Hydrolyseprodukte, die denen entsprachen, die nach der Hydrolyse durch β-Glucuronidase zu erwarten waren (siehe die Beispiele oben, die sich auf die Herstellung verschiedener Glucuronidverbindungen beziehen). Auf der anderen Seite bewirkt BA9GN, das, wie in Tabelle 1 gezeigt, kein Substrat für β-Glucuronidase von E-coli ist und keine nachweisbare (< 1%) Produktion von BA nach Inkubation für 18 h bei 37 °C mit β-Glucuronidase zeigte, keine Keimbildung in Tabakblattscheiben (Tabelle 2 unten).
  • BEISPIEL 3
  • INDUKTION VON KEIMBILDUNG AUS PFLANZENGEWEBE MIT UND OHNE EIN EINGEFÜHRTES β-GLUCURONIDASEGEN DURCH CYTOKININGLUCURONIDE
  • Es wurden Experimente durchgeführt, um zu bestimmen, ob Cytokininglucuronide (sowie Cytokininglucuronamid) Keimbildung in vivo in Pflanzenmaterial mit beziehungsweise ohne ein eingeführtes β-Glucuronidasegen bewirken können.
  • Samen von einer GUS-negativen und einer GUS-positiven Tabakpflanze (Nicotiana tabacum 'Wisconsin 38') wurden auf MSO-Substrat (Murashige & Skoog Substrat ohne Hormone, beschrieben in Murashige & Skoog, Physiol. Plant. 15: 473-497, 1962, erhältlich von Sigma, USA) gekeimt. Das GUS-positive Pflanzenmaterial enthielt ein eingeführtes β-Glucuronidasegen von E. coli (uidA), das durch den 35S Promoter von Blumenkohlmosaikvirus gesteuert wird, wie beispielweise von Jefferson et al., The EMBO Journal, Vol. 6, Nr. 13, S. 3901-3907, 1987 beschrieben. Die originalen, transgenen GUS-positiven Pflanzen wurden hergestellt unter Verwendung des herkömmlichen kanamycinbasierten negativen Selektionssystems, wie beispielweise durch Burow et al., Plant Molecular Biology Reporter, Vol. 8(2), S. 124-139, 1990 beschrieben. GUS-positive Sämlinge wurde mittels des X-gluc-Assays wie unten in diesem Beispiel beschrieben, identifiziert.
  • Nach 4-5 Wochen wurden die oberen Teile der Pflanzen oder Keime auf ein neues MSO-Substrat übertragen, und dieses Vorgehen wurde bei Bedarf wiederholt. Auf diese Weise wurde das Pflanzenmaterial (sowohl das GUS-positive als auch das GUS-negative) als sterile Keimkultur aufrechterhalten (siehe Burow et al., Plant Molecular Biology Reporter, Vol 8(2), S. 124-139, 1990). Aus den größten Blättern (3-5 Wochen alt) wurden Scheiben ausgestanzt und auf die unten angegebenen Substrate (Tabelle 2) übertragen. Das grundlegende verwendete Substrat war MSO, die verschiedenen Testverbindungen wurden bei verschiedenen Konzentration bis hin zu 250 μM zugegeben. Kleine Petrischalen (⌀ = 5 cm), die 6 ml Substrat enthielten, wurden verwendet, auf jede Petrischale wurden 3 Blattscheiben gelegt. Jede Behandlung wurde mindestens 4mal wiederholt.
  • Es wurde gefunden, dass mehrere Cytokininglucuronide Keimbildung in Pflanzengewebe, das das β-Glucuronidaseenzym enthält, induzieren. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle gezeigt:
  • TABELLE 2
    Figure 00610001
  • Aus der obigen Tabelle kann ersehen werden, dass alle Cytokininglucuronide, die Keimbildung bei einer Konzentration unter 250 mM in Blattscheiben von Tabak, der ein eingeführtes β-Glucuronidasegen enthielt, induzieren, auch Keimbildung bei Verwendung einer ähnlichen Konzentration in entsprechenden Blattscheiben, die kein eingeführtes β-Glucuronidasegen enthielten, induzieren konnten. Auf der anderen Seite führte das Cytokininglucuronid BA9GN, von dem gezeigt wurde, dass es nicht als Substrat für β-Glucuronidase von E. coli (siehe Beispiel 2) wirkt, nicht zu einer Keimbildung in Blattscheiben, weder mit oder ohne ein eingeführtes β-Glucuronidasegen. Jedoch wurde gefunden, dass das Cytokininglucuronamid BA3GNamid, das, wie in Beispiel 2 gezeigt, nicht als Substrat für β-Glucuronidase von E. coli wirkte, Keimbildung sowohl in GUS-positiven als auch in GUS-negativen Blattscheiben induzierte, was zeigt, dass Cytokininglucuronamide in Pflanzengewebe in die entsprechenden Cytokininglucuronsäuren umgewandelt werden. So scheint es, dass Vorläuferverbindungen für Cytokininglucuronide in vivo auf die gleiche Weise wirken können wie die Cytokininglucuronide selbst.
  • Diese Ergebnisse zeigen, dass höhere Pflanzen, in diesem Fall Tabak, endogene β-Glucuronidaseaktivität besitzen. Dieser Befund ist mit dem kürzlich durch Hu et al. (Plant Cell Reports 9, S. 1-5, 1990) berichteten, der das Auftreten GUS-ähnlicher Aktivität in 52 Arten von Samenpflanzen untersuchte, und mit den Befunden von Hodal et al. (im Druck in Plant Science) in Einklang. Hu et al. fanden heraus, dass Arten, die positive GUS-ähnliche Aktivitäten exprimieren, in jeder Schlüsselgruppe von Angiospermen, sowie in einigen der Gymnospermen verteilt sind. (Während Hu et al. keine GUS-Aktivität in Tabak feststellten, kann dieses Ergebnis durch die Tatsache erklärt werden, dass ihr Assay in vitro bei pH 7 durchgeführt wurde. Wie unten gezeigt, scheint das Enzym, das für die ursprüngliche GUS-Aktivität in Tabak verantwortlich ist, bei pH 7 nicht aktiv zu sein, aber es wurde gefunden, dass es bei pH 4-5 aktiv ist.).
  • Diese Befunde stehen im Gegensatz zu dem, der in GB 2 197 653 A offenbart ist, der feststellt, dass höhere Pflanzen, einschließlich Tabak, keine nachweisbare β-Glucuronidaseaktivität enthalten. GB 2 197 653 A , das sich unter anderem auf ein Verfahren bezieht, um Expression eines interessierenden Gens unter Verwendung des GUS-Gens zu überwachen, erklärt, dass das Vorkommen von GUS-Aktivität die Expression eines interessierenden Gens anzeigt, und impliziert damit, dass, da GUS-Aktivität in höheren Pflanzen nicht gefunden wird, es eine relativ einfache Sache ist, die Expression eines interessierenden Gens unter Verwendung des GUS-Gens zu überwachen. Jedoch zeigen die obigen Ergebnisse, dass dies nicht der Fall ist, und dass die Verwendung eines GUS-Gens zur Überwachung der Anwesenheit eines interessierenden Gens überhaupt nicht einfach oder klar ist, wegen der Tatsache, dass höhere Pflanzen tatsächlich eine bedeutende intrinsische (Hintergrund-) β-Glucuronidaseaktivität enthalten.
  • Um die Natur der beobachteten GUS-Aktivität in Pflanzenmaterial mit und ohne ein eingeführtes β-Glucuronidasegen zu untersuchen, wurde die pH-Abhängigkeit der GUS-Aktivität bestimmt, indem man einen standardisierten histochemischen GUS-Assay mit "X-gluc" (5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-glucuronid) verwendete.
  • Der X-gluc-Assay kann durchgeführt werden, indem man zuerst ein Assaymedium herstellt, indem man 50 mg X-gluc in einer Lösung, die 25 ml 0,2 M NaPO4-Puffer, typischerweise pH 7,0, 24 ml destilliertes Wasser, 0,25 ml 0,1 M K3(Fe(CN)6), 0,25 ml 0,1 M K4(Fe(CN)6) und 0,5 ml 1,0 M Na2EDTA enthält, löst und anschließend bis zur Auflösung rührt (ungefähr 30 min). Frischgeschnittene oder formaldehydfixierte Gewebeabschnitte (Dicke kleiner 0,5 mm) oder Gewebe bei 37 °C werden dann in dem X-gluc-Medium für einige Minuten bis 24 Stunden inkubiert. Nach der Inkubation werden die Abschnitte in Natriumphosphatpuffer oder Wasser gespült und mikroskopisch untersucht. GUS-Aktivität zeigt sich als blaue Einfärbung des behandelten Pflanzenmaterials an der Stelle der Enzymaktivität (Jefferson, Plant Molecular Biology Reporter, Vol. 5, Nr. 4, S. 387-405, 1987). Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung wurden typischerweise Assayzeiten von 20 Stunden angewendet. Nach der Inkubation wurden die Scheiben mit 96%igem Ethanol behandelt, um Chlorophyll zu entfernen.
  • Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle gezeigt:
  • TABELLE 3
    Figure 00630001
  • Man kann sehen, dass das Enzym, das für die Hintergrund-β-Glucuronidaseaktivität in Tabakblattscheiben ohne ein eingeführtes β-Glucuronidasegen verantwortlich ist, nur innerhalb eines engen pH-Bereichs, der dem inneren pH der Pflanzen entspricht (ungefähr pH 5), aktiv ist, während die β-Glucuronidase, die durch das eingeführte Gen exprimiert wird, über einen großen pH-Bereich von 4 bis 8 aktiv ist. Diese pH-Abhängigkeit kann erklären, warum frühere Versuche, GUS-Aktivität in Pflanzen festzustellen, zum größten Teil nicht erfolgreich waren und zu der fälschlichen Annahme (z.B. in GB 2 197 653 A ) führten, dass Pflanzen keine intrinsische GUS-Aktivität besitzen.
  • Die Tatsache, dass die oben für das Pflanzenmaterial ohne ein eingeführtes GUS-Gen gezeigte β-Glucuronidaseaktivität wirklich das Ergebnis der Hydrolyse des Cytokininglucuronidsubstrats durch β-Glucuronidase ist, und nicht das Ergebnis einer nichtspezifischen Reaktion, die das Substrat spaltet, z.B. eine nichtenzymatische saure Hydrolyse von Glucuroniden (die bekanntermaßen bei niedrigen pH-Werten gespalten werden), wurde gezeigt, indem die Wirkung von Inhibitoren verschiedener Enzyme bei pH 5 in nicht genetisch transformiertem Pflanzenmaterial (d.h. in Pflanzenmaterial, das nur ursprüngliche GUS-Aktivität besaß) getestet wurde. Der Test wurde unter Verwendung des oben beschriebenen X-gluc-Assays bei pH 5,0 für 20 Stunden durchgeführt.
  • TABELLE 4
    Figure 00640001
  • Die sechs getesteten Inhibitoren haben die folgenden Wirkungen:
    Saccharo-1,4-lacton ist ein Inhibitor, der spezifisch für β-Glucuronidaseenzyme ist (mit anderen Worten, er hemmt nur β-Glucuronidasen, und er hemmt alle β-Glucuronidasen). Es ist allgemein anerkannt, dass GUS-Aktivität, die durch diese Verbindung gehemmt werden kann, aus der Wirkung eines β-Glucuronidaseenzyms herrührt.
  • Gluconolacton ist ein Inhibitor von β-Glucuronidasen. Er entspricht Saccharo-1,4-lacton mit der Ausnahme, dass er spezifisch für β-Glucosidasen ist.
  • UDP-Glucuronid ist ein Substrat für UDP-Glucuronidtransferasen.
  • Glucuronsäure ist das Produkt jeder β-Glucuronidasereaktion und deshalb ein Produktinhibitor von β-Glucuronidasen und anderen glucuronsäurebildenden Enzymen.
  • Galaktose ist ein Inhibitor von UDP-glucuronidtransferase-abhängigen Reaktionen.
  • Methylumbellipherylglucuronid ist ein Substrat für alle β-Glucuronidasen, die bis jetzt untersucht sind, und ist so ein konkurrierender Inhibitor von GUS-Enzymen.
  • Da auch gefunden wurde, dass EDTA (das UDP-Glucuronidtransferasen inhibiert) keine Wirkung hat, ist es unwahrscheinlich, dass solche Transferasen in die beobachtete GUS-Aktivität einbezogen sind. Die obige Tabelle zeigt, dass jene Verbindungen, die ein Transferaseenzym inhibieren sollten, keine Wirkung, selbst bei sehr hohen Konzentrationen, haben. Es kann weiterhin gesehen werden, dass Gluconolacton keine hemmende Wirkung hat, und es ist deshalb unwahrscheinlich, dass die GUS-Aktivität mit einer β-Glucosidaseaktivität zusammenhängt.
  • Weiterhin ist zu sehen, dass der GUS-spezifische Inhibitor Saccharo-1,4-lacton ein starker Inhibitor ist, dass Glucuronsäure (Produktinhibierung von β-Glucuronidase) ein mittelstarker Inhibitor ist, und dass Methylumbellipherylglucuronid (ein GUS-Substrat und deshalb ein konkurrierendes Substrat zu X-gluc, wenn ein β-Glucuronidaseenzym für die Hydrolyse von X-gluc verantwortlich ist) ein schwacher Inhibitor ist. Die GUS-Aktivität in Tabak erfüllt deshalb alle nötigen Kriterien, um als Folge eines β-Glucuronidaseenzyms eingestuft zu werden. Es kann deshalb die Schlussfolgerung gezogen werden, dass die Pflanzen ein β-Glucuronidaseenzym enthalten.
  • Eine entsprechende Reihe von Versuchen wurde durchgeführt, um sicherzustellen, dass die Wirkung der Inhibitoren ausreichend schnell war, um alle Enzyme hemmen zu können. In dieser Reihe wurde das Pflanzenmaterial in den Testverbindungen (Inhibitoren) 24 Stunden lang vorinkubiert, bevor der X-gluc-Assay mit denselben Testverbindungen durchgeführt wurde. Die erhaltenen Ergebnisse waren identisch mit denen, die ohne Vorinkubation erhalten worden waren, was darauf hinweist, dass die Inhibitoren schnell genug in das Pflanzengewebe eindringen, um den X-gluc-Assay zu hemmen, bevor die blaue Einfärbung erscheinen kann.
  • Ergebnisse ähnlich den oben beschriebenen wurden in einer anderen Untersuchung des Auftretens von GUS-Aktivität in Pflanzen erhalten. In diesem Fall wurde die pH-Abhängigkeit der histologischen GUS-Reaktion in einer Anzahl von Pflanzenspezies bei pH-Werten zwischen 3 und 8 sowohl mit als auch ohne den GUS-spezifischen Inhibitor Saccharo-1,4-lacton getestet.
  • Der angewendete Assay war der oben beschriebene X-gluc-Assay. Der Assay wurde bei 37 °C 20 Stunden lang durchgeführt. Blätter wurden zerlegt (mit sterilen Rasierklingen), so dass jedes Blatt bei einer Anzahl verschiedener pH-Werte getestet wurde.
  • Wie in der Tabelle unten gezeigt, bestätigte diese Untersuchung, dass Pflanzen in der Tat eine ursprüngliche GUS-Aktivität besitzen, dass diese Aktivität das Ergebnis einer enzymatischen Reaktion ist (keine Reaktion in Gegenwart des GUS-spezifischen Inhibitors) und dass das Enzym in erster Linie bei pH-Werten von ungefähr 4-5 aktiv ist.
  • TABELLE 5
    Figure 00670001
  • Die Tatsache, dass Pflanzen eine allgemeine intrinsische GUS-Aktivität haben, macht es möglich, ein Gen, das Glucuronidpermease codiert, als positives Selektionsgen zu verwenden, ohne irgendein anderes Selektionsgen zu verwenden, indem man einen Vorteil aus der gesteigerten Aufnahme einer Glucuronidverbindung durch transformierte Zellen zieht. Es wurde beispielsweise gefunden, dass Glucuronide nicht einfach durch Plasmamembranen hindurch in Pflanzenzellen aufgenommen werden. Wenn ein Glucuronidpermeasegen in eine Zelle eingeführt wird, werden die Glucuronide jedoch einfacher die Plasmamembran durchdringen und in die Zelle eindringen können. Die Glucuronide sind dann für Spaltung durch das intrinsische GUS-Enzym in den transformierten Zellen verfügbar. Im Gegensatz dazu ist das fragliche Glucuronid nicht für nichttransformierte Zellen verfügbar, wodurch eine positive Selektionswirkung erzielt wird. Ähnlich kann positive Selektion auch durchgeführt werden, indem man andere Permeasen und andere Verbindungstypen verwendet, die entweder in den transformierten Zellen durch ein intrinsisches Enzym aktiviert werden, oder die anders eine biologische Wirkung in den transformierten Zellen, in die sie transportiert werden, ausüben.
  • BEISPIEL 4
  • CYTOKININGLUCURONIDE SIND STABIL UND INAKTIV
  • Die Wirkung des Natriumsalzes des Cytokininglucuronids BA3GN ist blockiert, wenn die GUS-Aktivität in dem Pflanzengewebe, das dieses Cytokininglucuronid enthält, gehemmt ist. In anderen Worten, das Cytokininglucuronid selbst ist inaktiv. Weiterhin wurde gezeigt, dass das Cytokininglucuronid sowohl in dem Wachstumsmedium als auch in Pflanzengewebe stabil ist, wenn β-Glucuronidase nicht anwesend ist, wie durch die Tatsache gezeigt wird, dass der spezifische GUS-Inhibitor, Saccharo-1,4-lacton (SL), Keimbildung, die durch das Cytokininglucuronid BA3GN-Natriumsalz hervorgerufen wird, stark hemmt, aber durch das freie Cytokinin BA hervorgerufene Keimbildung nur schwach hemmt (unter Verwendung der grundlegenden Methode, die oben in Beispiel 3 beschrieben ist):
  • TABELLE 6
    Figure 00690001
  • Durch Vergleich der Ergebnisse der obigen Tabelle mit den oben in Tabelle 2 angegebenen kann man sehen, dass das BA3GN-Natriumsalz, das Keimbildung sowohl in GUS-positiven als auch GUS-negativen Tabakblattscheiben induziert, keine Keimbildung in entsprechenden Blattscheiben in Gegenwart des β-Glucuronidase-spezifischen Inhibitors Saccharo-1,4-lacton induziert.
  • Saccharo-1,4-lacton (SL) ist bei dem in diesem Beispiel verwendeten pH keine stabile Verbindung. Es besteht ein Gleichgewicht zwischen SL und Zuckersäure (SA). Dieses Gleichgewicht wird nur langsam erreicht, und der Umwandlung von SL zu SA folgt ein Abfall im pH. Der pH muß deshalb vor der Verwendung von SL mehrmals während der Dauer einer Woche eingestellt werden, bis sich der pH in dem SL-enthaltenden Substrat stabilisiert hat.
  • Die Tatsache, dass Cytokininglucuronide stabil und inaktiv sind, wenn keine β-Glucuronidase zugegen ist, wird weiterhin durch die Tatsache gezeigt, dass BA9GN, das nicht durch β-Glucuronidase hydrolisiert werden kann, keine Keimbildung in Pflanzenmaterial induzieren kann, das β-Glucuronidaseaktivität enthält (siehe Beispiele 2 und 3).
  • Es ist wichtig, dass die Cytokininglucuronidverbindungen in Substraten, die kein β-Glucuronidaseenzym enthalten, inaktiv und stabil sind, da diese Stabilität eine Voraussetzung für das richtige Funktionieren des positiven Selektionssystems ist, das sie benutzt.
  • Man kann jedoch nicht von allen Glucuronsäurederivaten erwarten, dass sie stabil sind. Beispielsweise werden Esterglucuronide in Pflanzengewebe, das nichtspezifische Esterasen enthält, nicht stabil sein. Das heißt, dass die Cytokininglucuronidverbindungen, die gemäß der vorliegenden Erfindung dargestellt und angewendet werden, (β-D-Glucuronide, gekoppelt an das Aglykon über glycosidische O-, S- und N-Atome) die Voraussetzung für Stabilität erfüllen. Auf der anderen Seite kann man von Verbindungen, die andere Typen von Glucuronidbindungen haben, z.B. Amid- oder Ester-β-D-glucuroniden, wegen des Auftretens nichtspezifischer Esterasen und Amidasen in Pflanzen nicht erwarten, dass sie selektiv durch β-Glucuronidasen hydrolisiert werden.
  • Unter Bezug auf Beispiel 3 oben wurde so gezeigt, dass die getesteten Cytokininglucuronide, die, wie in diesem Beispiel gezeigt, selbst keine Cytokininaktivität besitzen, in vivo durch das Wirken von β-Glucuronidase – entweder in Form von endogener Hintergrund-β-Glucuronidase oder als Ergebnis eines eingeführten β-Glucuronidasegens – gespalten werden, wodurch freies Cytokinin freigesetzt wird.
  • BEISPIEL 5
  • INDUKTION VON KEIMBILDUNG AUS PFLANZENGEWEBE, DAS EIN EINGEFÜHRTES β-GLUCURONIDASEGEN ENTHÄLT, UNTER VERWENDUNG VON STEROLGLUCURONIDEN
  • Es wurde gezeigt, dass andere Glucuronide, einschließlich Glucuronide von Sterolen, Glycyrrhizinsäure und Hydroxychinolin, durch β-Glucuronidase hydrolisiert werden und zu einer Keimbildung auf modifizierten Substraten, in denen die Hydrolyseprodukte für Keimbildung wesentlich sind, führen. Das ist in den Beispielen 5 und 6 gezeigt.
  • Es wurden Versuche durchgeführt, um die keimauslösende Wirkung zweier Sterolglucuronide, β-Sitosteryl-β-D-glucuronid (SG) und Cholesteryl-β-D-glucuronid (CG) zu bestimmen, wenn die Sterolsynthese in den Geweben gehemmt ist. Die angewandten grundlegenden Verfahren entsprechen im Wesentlichen denen, die für Beispiel 3 oben beschrieben sind. Zusätzlich zu einem oder beiden der oben erwähnten Sterolglucuronide enthielt das Substrat jedoch 0,1 mM Tridemorph und 5 mg/l BA3GN-Natriumsalz. Die Anzahl der Keime wurde nach 30 Tagen erfasst.
  • Tridemorph (4-Tridecyl-2,6-dimethylmorpholin) ist ein Fungizid, das die Synthese von Sterolen und ähnlichen Verbindungen hemmt. Tridemorph hat eine hemmende Wirkung auf die Neubildung von Keimen (obwohl es keine tödliche Wirkung auf die Explantate hat), wenn das Pflanzengewebe nicht mit Sterolen versorgt wird. So sollte Keimbildung, in Abwesenheit freier Sterole, wirkungsvoll verhindert werden.
  • CG wurde von Sigma, USA, bezogen, und SG wurde nach dem Verfahren, das durch Ando et al. in J. Antibiotics 73, S. 408, 1970, beschrieben ist, dargestellt.
  • Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle gezeigt:
  • TABELLE 7
    Figure 00710001
  • Die obige Tabelle zeigt, dass Sitosteryl-β-D-glucuronid der keimhemmenden Wirkung von Tridemorph entgegenwirken kann und dass die Kombination von Sitosteryl-β-D-glucuronid und Cholsteryl-β-D-glucuronid die stärkste Keimbildung ergibt. So ist positive Selektion gemäß Erfindung unter Verwendung eines eingeführten β-Glucuronidasegens möglich, wenn man beispielsweise eine oder beide der obigen Sterolglucuronidverbindungen zusammen mit einer keimhemmenden Verbindung wie Tridemorph verwendet. Dies Ergebnisse zeigen, dass auch andere Sterole und sterolähnliche Verbindungen für die positive Selektion aus Gewebe, das ein eingeführtes β-Glucuronidasegen enthält, verwendet werden können.
  • Ein Vorteil der Verwendung dieser sehr schwach löslichen Verbindungen für positive Selektion ist, dass ihre Wirkung vermutlich sehr lokal sein wird, da die Verbindungen nicht von Zelle zu Zelle diffundieren, wenn die hydrophile Glucuronideinheit durch ein β-Glucuronidaseenzym abgespalten wird. In anderen Worten, diese Verbindungen können verwendet werden, um "cross feeding" während des Selektionsprozesses zu verhindern.
  • Dieser Versuch zeigt weiterhin, dass dem keimhemmenden Effekt von Tridemorph, und so auch anderer Verbindungen, die die Sterolsynthese hemmen, durch Zugabe von Sterolen und Sterolderivaten zum Substrat entgegengewirkt werden kann, wodurch ein Selektionssystem, das darauf basiert, dass transgene Zellen mit Sterolen und sterolähnlichen Verbindungen versorgt werden, mit den oben erwähnten Vorteilen hergestellt werden kann.
  • BEISPIEL 6
  • INDUKTION VON KEIMBILDUNG AUS PFLANZENGEWEBE MIT UND OHNE EIN EINGEFÜHRTES β-GLUCURONIDASEGEN UNTER VERWENDUNG VON SITOSTERYL-β-D-GLUCURONID
  • Ein Versuch, ähnlich dem in Beispiel 5 beschriebenen, wurde sowohl an transformierten als auch an nichttransformierten Tabakblattscheiben unter Verwendung von Sitosteryl-β-D-glucuronid und entweder BA oder BA3GN-Natriumsalz durchgeführt.
  • Die verwendeten Verfahren waren im Wesentlichen die oben in Beispiel 5 beschriebenen. In diesem Versuch wurde dem Substrat Tridemorph in einer Konzentration von 0,1 mM zugegeben, und Sitosteryl-β-D-glucuronid wurde in einer Konzentration von 121 mg/l zugegeben. Das Substrat enthielt zusätzlich entweder 1,88 mg/l BA3GN-Natriumsalz oder 0,1 mg/l BA. Die Anzahl der Keime wurde nach 40 Tagen festgestellt.
  • Die Anzahl der erhaltenen Keime war wie folgt:
    Figure 00720001
  • Man kann sehen, dass, wie es auch in Beispiel 5 oben der Fall war, die Gegenwart von Sitosteryl-β-D-glucuronid der keimhemmenden Wirkung von Tridemorph entgegenwirken konnte. Weiterhin wurde, wenn Sitosteryl-β-D-glucuronid und Tridemorph zusammen mit dem BA3GN-Natriumsalz verwendet wurden, eine selektive Keimbildung in den GUS-positiven Blattscheiben erreicht, während die GUS-negativen Blattscheiben auf dem Substrat, das BA3GN-Natriumsalz enthielt, nahezu keine Keimbildung hatten.
  • Diese Ergebnisse zeigen auch, dass die Verwendung einer Kombination verschiedener Glucuronide (hier BA3GN und SG anstelle von BA und SG) die selektive Reaktion von den transgenen Geweben verbessern kann.
  • Da Sterole und Steroide auch wichtige Wachstumsregulatoren in tierischen Zellen sind, können entsprechende Selektionsverfahren auch für die Selektion von tierischen Zellen, die β-Glucuronide exprimieren, verwendet werden.
  • BEISPIEL 7
  • ENTWAFFNETE AGROBACTERIUMSTÄMME PRODUZIEREN CYTOKININE
  • Es wurde gefunden, dass bestimmte Agrobacterium-Stämme Keimbildung durch die Produktion keimbildender Substanzen während der Cokultivierung induzieren können. Solche Stämme sollten normalerweise vermieden werden, wenn GUS-Hydrolyse von Cytokininglucuroniden für die Zwecke der Selektion genetisch transformierter Zellen verwendet werden soll, da diese Stämme allein Keimbildung hervorrufen können und deshalb den Selektionsprozeß stören.
  • Als Beispiel zeigt die Tabelle unten die Ergebnisse eines Versuchs mit zwei verschiedenen Agrobacterium-Stämmen, von denen einer Keimbildung auf Tabakblattscheiben nach Cokultivierung induziert.
  • Die verwendeten Methoden entsprechen im Wesentlichen den in Beispiel 13 beschriebenen, aber nach Cokultivierung wurden die Blattscheiben auf MSO-Substrat ohne Hormone übertragen, das 300 mg/l Cefotaxim und 300 mg/l Carbenicillin enthielt.
  • Die Anzahl neugebildeter Keime wurde 4 Wochen nach Cokultivierung festgestellt.
  • TABELLE 8
    Figure 00740001
  • Man kann sehen, dass die keimauslösenden Eigenschaften einiger der Agrobacterium-Stämme nicht abhängig von den Genen sind, die in der T-DNA enthalten sind. Das heißt, dass Gene außerhalb der T-DNA-Region für die Keimauslösung verantwortlich sind.
  • Ein Gen außerhalb der T-DNA-Region, das für die Cytokininproduktion verantwortlich ist, wurde tzs genannt (Morris, R.O. Ann. Rev. Plant Physiol. 37, pp 509-538, 1986). Stamm C58 enthält das tzs-Gen, ein nichttransferierbares Gen, das für die Synthese von Zeatin während Cokultivierung codiert. Stamm LBA4404 enthält das tzs-Gen nicht. Die Tatsache, dass die keimauslösenden Stämme ein Plasmid enthalten, das das tzs-Gen enthält, zeigt, dass dieses Gen für die keiminduzierenden Eigenschaften verantwortlich sein kann, die in diesen Untersuchungen beobachtet wurden, und dass Stämme von Agrobacterium, die das tzs-Gen enthalten, in Cytokininbasierten Selektionssystemen vermieden werden sollten. Jegliche andere Agrobacterium-Stämme, die Keimbildung hervorrufen, sollten normalerweise auch vermieden werden.
  • BEISPIEL 8
  • POSITIVE SELEKTION TRANSGENER KEIME UNTER VERWENDUNG DES CYTOKININGLUCURONIDS BA3GN-NATRIUMSALZES
  • Genetisch transformierte Keime können unter Verwendung von Cytokininglucuroniden selektiert werden.
  • Eine Reihe von Versuchen wurde durchgeführt, um die Wirksamkeit des positiven Selektionssystems unter Verwendung des Cytokininglucuronids BA3GN-Natriumsalz in Konzentrationen von 7,5 und 15 mg/l zu testen. Die Versuche wurden an Wildtyp-Tabakblattscheiben durchgeführt unter Verwendung zweier verschiedener Agrobacterium-Stämme und auch verschiedener Cokultivierungssubstrate. Die verwendete Transformationsmethode war die, die unten in Beispiel 13 beschrieben ist, mit der Ausnahme, dass Gamborg B5 Substrat (Gamborg et al., Exp. Cell Res. 50: 151-158, 1968; erhältlich von Sigma, USA) anstelle von MSO verwendet wurde. Die unten angegebenen Ergebnisse sind Durchschnittswerte, die auf zwei unabhängigen Versuchen basieren, von denen jeder an 27 Blattscheiben pro Behandlung durchgeführt wurde.
  • TABELLE 9
    Figure 00760001
  • Stamm BS10 führt ein GUS-Gen ein, das von einem modifizierten 35S-Promoter gesteuert wird, der in Agrobacterium nicht aktiv ist, wie von Janssen & Gardner in Plant Molecular Biology, 14, pp. 61-72, 1989, beschrieben. Stamm LDH1 führt ein GUS-Gen ein, das von dem nichtmodifizierten 35S-Promoter gesteuert wird.
  • Die Ergebnisse in Tabelle 9 zeigen, dass positive Selektion transgener Keime, die ein eingeführtes β-Glucuronidasegen exprimieren, unter Verwendung von BA3GN-Natriumsalz möglich ist. Diese Ergebnisse sind sehr bedeutend und waren unerwartet, da, wie in Beispiel 3 beschrieben, gefunden wurde, dass Cytokininglucuronide Keimbildung in Blattscheiben, die kein eingeführtes β-Glucuronidasegen enthalten, induzieren konnten. Die verschiedenen Behandlungen während der Cokultivierung scheinen keinen bedeutende Wirkung auf die Selektion zu haben.
  • Die oben gezeigten Ergebnisse zeigen auch, dass die Verwendung eines Agrobacterium-Stamms mit einem aktiven β-Glucuronidasegen (Stamm LDH1 exprimiert GUS-Aktivität in Bakterien) das Transformationssystem nicht beeinträchtigt verglichen mit einem Stamm, der kein aktives β-Glucuronidasegen hat (Stamm BS10 exprimiert keine GUS-Aktivität in Bakterien).
  • BEISPIEL 9
  • SELEKTION GENETISCH TRANSFORMIERTER KEIME UNTER VERWENDUNG DES CYTOKININGLUCURONIDS ZEATIN-O-β-GLUCURONSÄURE
  • Unter Anwendung des im wesentlichen gleichen Verfahrens wie in Beispiel 13 beschrieben, wurden transgene Tabakkeime präpariert und unter Verwendung des Cytokininglucuronids Zeatin-O-β-glucuronsäure (ZOGN) als positives Selektionsreagens selektiert.
  • Cokultivierung wurde 3 Tage lang durchgeführt, wobei die Impfkulturdichte einer OD von 1,5 bei 660 nm entsprach. Das nach der Cokultivierung verwendete Substrat war MSO, das 300 mg/l Carbenicillin, 300 mg/l Cefotaxim und 0,1 mg/l Indolessigsäure (IAA) enthielt. Die Subkultivierung nach 3 Wochen erfolgte auf das gleiche Substrat, aber ohne IAA. Der pH in allen Substraten in diesem Beispiel war 8,0. 18 Blattscheiben wurden für jede Behandlung verwendet.
  • Fünf Wochen nach der Cokultivierung wurden die Keime auf ein MSO-Substrat übertragen, das 200 mg/l Kanamycinsulfat, 32 mM Zuckersäure, 300 mg/l Cefotaxim und 300 mg/l Carbenicillin enthielt, pH 8,0. Zuckersäure, ein Inhibitor von β-Glucuronidaseenzymen, wurde zugegeben, um weitere Umwandlung von Zeatinglucuronid in Zeatin zu stoppen. Zusammen mit dem β-Glucuronidasegen wurde ein NPT-Gen mitübertragen, das Resistenz auf Kanamycin verleiht. Nichttransformierte Keime (negative Kontrollen) überlebten, aber das Wachstum dieser Keime war auf diesem Substrat verzögert, während alle transformierten Keime (positive Kontrollen), die ein aktives NPT-Gen enthielten, ohne jede Wachstumsverzögerung überlebten.
  • Die Anzahl an Keimen wurde festgestellt und die Anzahl GUS-positiver Keime unter der Gesamtzahl von Keimen wurde durch den X-gluc-Assay (Beispiel 3) 3 Wochen nach der letzen Subkultivierung (8 Wochen nach Cokultivierung) bestimmt. Die Ergebnisse sind unten gezeigt: TABELLE 10
    Figure 00780001
    • * SL: 2 mM Saccharo-1,4-lacton
  • Die in der obigen Tabelle angegebenen Ergebnisse zeigen, dass eine erfolgreiche positive Selektion genetisch transformierter Keime unter Verwendung von ZOGN erreicht wurde. Die Induktion transgener Keime wurde gehemmt, wenn der β-glucuronidasespezifische Inhibitor Saccharo-1,4-lacton dem Substrat zugegeben wurde, was zeigt, dass das Wachstum transgener Keime und damit der Erfolg der positiven Selektion von der β-glucuronidasekatalysierten Umwandlung von ZOGN in Zeatin abhängig war.
  • BEISPIEL 10
  • SELEKTION GENETISCH TRANSFORMIERTER KEIME UNTER VERWENDUNG VON ZEATIN-O-β-GLUCURONSÄURE BEI VERSCHIEDENEN TEMPERATUREN
  • Die Temperaturabhängigkeit des positiven Selektionssystems unter Verwendung von Cytokininglucuroniden wurde unter Verwendung von Zeatin-O-β-glucuronsäure (ZOGN) als positivem Selektionsreagenz bei 25 °C, 30 °C und 35 °C untersucht.
  • Transgene Tabakkeime wurden unter Verwendung des im wesentlichen gleichen Verfahrens wie unten in Beispiel 13 beschrieben, präpariert. Cokultivierung wurde drei Tage lang ausgeführt, wobei die Impfkulturdichte einer OD von 1,5 bei 660 nm entsprach. Das Substrat, das nach Cokultivierung verwendet wurde, war MSO, das 10 mg/l 2-(2-Hydroxyethylamino)-6-benzylamino-9-methylpurin (9-met), 350 mg/l Carbenicillin, 350 mg/l Cefotaxim und 0,1 mg/l Indolessigsäure (IAA) und ZOGN-Natriumsalz wie angegeben enthielt. 9-met (bezogen von Apex Organics Ltd., UK) wurde zugegeben, um Glycosylierung von Zeatin und Zeatinderivaten zu hemmen. 18 Blattscheiben wurden für jede Behandlung verwendet.
  • Sieben Wochen nach der Cokultivierung wurden die Keime auf ein MSO-Substrat übertragen, das 300 mg/l Kanamycinsulfat, 350 mg/l Cefotaxim, 350 mg/l Carbenicillin, 0,1 mg/l IAA und 10 mg/l 6-(m-Hydroxybenzylamino)purin (OH-BA) enthielt und bei einer Temperatur von 25 °C stehengelassen. OH-BA kann wie von Kaminek et al. (Plant Growth Reg. 6, pp 113-120, 1987) beschrieben, dargestellt werden.
  • Nach sechs Wochen auf dem kanamycinhaltigen Substrat wurde die Anzahl grüner Keime festgestellt. Resistenz gegen Kanamycin zeigt an, dass der Keim transgen ist, weil zusammen mit dem β-Glucuronidasegen ein NPT-Gen, das Kanamycinresistenz verleiht, mitübertragen wurde. Keine nichttransformierten Keime (negative Kontrollen) überlebten auf diesem Substrat, während alle transformierten Keime (positive Kontrollen), die ein aktives NPT-Gen enthielten, überlebten.
  • Der Prozentanteil kanamycinresistenter Keime unter der Gesamtzahl neugebildeter Keime wurde berechnet als Anzahl grüner Keime, die auf dem kanamycinhaltigen Substrat überlebten, dividiert durch die Anzahl an Keimen, die auf das kanamycinhaltige Substrat übertragen worden waren. Die Ergebnisse sind in der Tabelle unten gezeigt:
  • TABELLE 11
    Figure 00800001
  • Der Bioassay, der in diesem Beispiel beschrieben ist, wurde an einem verknüpften, mitübertragenen Gen durchgeführt. Das heißt, dass das β-Glucuronidasegen für die Selektion verwendet wird, während die Resistenz, die das Ergebnis des eingeführten, mitübertragenen NPT-Gens (Kanamycinresistenzgen) ist, geprüft wird.
  • Die Ergebnisse oben zeigen, dass zusätzlich zu dem β-Glucuronidasegen ein mitübertragenes Gen auch exprimiert wird, wenn die Selektion unter Verwendung des β-Glucuronidasegens durchgeführt wird. Zusätzlich kann man sehen, dass Selektion bei erhöhten Temperaturen (d. h. ungefähr 30-35 °C) die Selektion von transgenen Keimen pro Blattscheibe und auch den Anteil transgener Keime pro Blattscheibe unter der Gesamtzahl neugebildeter Keime verbessert.
  • Durch Durchführung des X-gluc-Assays bei verschiedenen Temperaturen wurde in Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung beobachtet, dass die intrinsische β-Glucuronidaseaktivität, die in Pflanzen auftritt, bei hohen Temperaturen gehemmt ist, während die eingeführte β-Glucuronidaseaktivität nicht betroffen ist. Es wurde so herausgefunden, dass die intrinsische β-Glucuronidaseaktivität mit zunehmender Temperatur bis zu etwa 60 °C allmählich abnahm, wobei es bei dieser Temperatur im wesentlichen keine intrinsische β-Glucuronidaseaktivität (wie mittels X-gluc-Assay bestimmt) gab. Dies kann die Verbesserung des Selektionsverfahrens bei erhöhten Temperaturen erklären.
  • BEISPIEL 11
  • POSITIVE SELEKTION VERGLICHEN UND KOMBINIERT MIT NEGATIVER SELEKTION
  • Es konnte gezeigt werden, das das hierin beschriebene positive Selektionssystem sehr leistungsfähig und vorteilhaft ist verglichen mit herkömmlicher Kanamycinbasierter negativer Selektion. Es werden jedoch auch gute Ergebnisse erzielt, wenn das positive Selektionssystem zusammen mit herkömmlicher negativer Selektion angewandt wird.
  • So zeigt die Tabelle unten die Ergebnisse, ausgedrückt als Anzahl GUS-positiver Tabakkeime pro Blattscheibe und des Prozentanteils GUS-positiver Keime unter der Gesamtzahl von Keimen, für positive Selektion unter Verwendung des BA3GN-Natriumsalzes, herkömmliche negative Selektion unter Verwendung von Kanamycin und BA, sowie positive Selektion und negative Selektion in Kombination. Zusätzlich umfasste der Versuch Selektion unter Verwendung des BA3GN-Natriumsalzes zusammen mit Saccharo-1,4-lacton (SL) (ein stark spezifischer Inhibitor der eingeführten β-Glucuronidase).
  • Die verwendeten Verfahren waren im wesentlichen die gleichen wie unten in Beispiel 13 beschrieben, aber es wurde Gamborg B5 Substrat anstelle von MSO-Substrat verwendet. TABELLE 12
    Figure 00820001
    • * Natriumsalz
    • ** Konzentrationen in mg/l
  • Der Versuch mit BA zusammen mit Kanamycin, welches das herkömmliche negative Selektionssystem ist, wurde als zwei unabhängige Versuche mit 54 Blattscheiben pro Versuch wiederholt. Ein einziger GUS-positiver Keim wurde unter einer Gesamtzahl von 23 selektierten Keimen gefunden. Die Ergebnisse für das BA3GN-Natriumsalz wurden unter Verwendung von 324 Blattscheiben erhalten. Der Versuch mit SL (Saccharo-1,4-lacton) wurde einmal mit insgesamt 162 Blattscheiben durchgeführt.
  • Die obige Tabelle zeigt, dass positive Selektion unter Verwendung von 15 mg/l BA3GN-Natriumsalz (ohne Kanamycin) 30mal mehr GUS-positive Keime pro Blattscheibe ergab als das herkömmliche negative Selektionssystem unter Verwendung von 1 mg/l BA und 300 mg/l Kanamycinsulfat. Weiterhin war ein größerer Prozentanteil der Gesamtzahl an Keimen GUS-positiv, wenn positive Selektion angewendet wurde (7,4%), als wenn negative Selektion angewendet wurde (4,3%).
  • Vorteilhafte Ergebnisse wurden auch erhalten, wenn eine Kombination von positiver und negativer Selektion angewendet wurde, d.h. indem ein Cytokinin in dem herkömmlichen kanamycinbasierten negativen Selektionssystem durch ein Cytokininglucuronid (BA3GN-Natriumsalz) ersetzt wurde. So war, wenn 15 mg/l BA3GN-Natriumsalz mit 300 mg/l Kanamycinsulfat kombiniert wurden, der Prozentanteil GUS-positiver Keime 11 mal so groß wie der, der unter Verwendung von BA und Kanamycin erhalten wurde, und wenn 15 mg/l BA3GN-Natriumsalz mit 33 mg/l Kanamycinsulfat kombiniert wurden, war die Anzahl GUS-positiver Keime pro Blattscheibe 40mal so groß wie die, die unter Verwendung von BA und Kanamycin erhalten wurde.
  • Wenn 15 mg/l BA3GN-Natriumsalz mit 10 mM des GUS-Inhibitors SL kombiniert wurden, waren sowohl die Anzahl GUS-positiver Keime pro Blattscheibe als auch der Prozantanteil GUS-positiver Keime drastisch vermindert, verglichen damit, wenn nur 15 mg/l BA3GN-Natriumsalz verwendet wurden. Das zeigt, dass das eingeführte GUS-Gen für die vorteilhaften Ergebnisse verantwortlich ist, die unter Verwendung des positiven Selektionssystems erhalten wurden, da die Zugabe von SL zum Wachstumsmedium die β-glucuronidasekatalysierte Umwandlung von inaktivem Cytokininglucuronid (BA3GN-Natriumsalz) zu aktivem Cytokinin in Zellen, die auf diesem Substrat gewachsen sind, stark hemmt und dadurch zu dem beobachteten Rückgang in der Anzahl induzierter Keime führt. Das positive Selektionssystem funktioniert also wie beabsichtigt, d.h. unter Verwendung einer eingeführten β-Glucuronidase, um ein Cytokininglukuronid in genetisch transformierten Zellen zu spalten und dabei freies Cytokinin in diesen Zellen freizusetzen und zu Keimbildung zu führen.
  • BEISPIEL 12
  • MODIFIZIERUNG DES POSITIVEN SELEKTIONSSYSTEMS ZUR VERBESSERUNG DER SELEKTIVEN WIRKUNG DER CYTOKININGLUCURONIDE
  • Es ist bereits gezeigt worden (siehe Tabelle 3, Beispiel 3), dass die natürlich auftretende β-Glucuronidase in Pflanzen bei relativ hohen pH-Werten inaktiv ist, d.h. bei pH-Werten von ungefähr 6 oder mehr, während die eingeführte β-Glucuronidase bis zu pH 8 aktiv ist. Durch Zugabe einer Verbindung zum Wachstumsmedium, die die den inneren pH der Zellen erhöhen kann, beispielsweise Ammoniumnitrat, kann die selektive Keimbildung von GUS-positiven Zellen weiter verbessert werden, da es dadurch möglich wird, jegliche Hintergrund-β-Glucuronidaseaktivität, die die Folge natürlich auftretender β-Glucuronidase in den nichttransformierten Zellen ist, zu blockieren.
  • Die Tabelle unten zeigt die Anzahl an Keimen, die von GUS-positiven und GUS-negativen Tabakblattscheiben unter Verwendung verschiedener Konzentrationen von BA3GN-Natriumsalz und Ammoniumnitrat erhalten wurden. Die angewendeten Verfahren waren die gleichen wie die in Beispiel 3 beschriebenen, mit der Ausnahme, dass Gamborg B5-Substrat anstelle von MSO-Substrat verwendet wurde. TABELLE 13
    Figure 00840001
    • * der Selektivitätsfaktor ist die Anzahl GUS-positiver Keime dividiert durch die Anzahl GUS-negativer Keime und gibt so einen Hinweis auf die Selektivität einer gegebenen Behandlung
    • ** Natriumsalz
  • Man kann sehen, dass die Verwendung von sowohl BA3GN-Natriumsalz als auch Ammoniumnitrat in angemessenen Konzentrationen zu selektiver Keimbildung in den GUS-positiven Blattscheiben führt. Zum Beispiel ergab eine Kombination von 15 mg/l BA3GN-Natriumsalz und 55 mM Ammoniumnitrat 34 Keime von den GUS-positiven Blattscheiben, während an entsprechenden GUS-negativen Blattscheiben, die derselben Behandlung ausgesetzt waren, keine Keime gebildet wurden.
  • Eine andere Möglichkeit, die Selektivität des positiven Selektionssystems unter Verwendung von Cytokininglukuroniden zu verbessern, ist, zu dem Wachs tumsmedium ein Substrat zuzugeben, das nach Spaltung durch β-Glucuronidase zu einem pH-Anstieg führt und dadurch die Hydrolyse von Cytokininglucuroniden in den nichttransformierten Zellen hemmt, ohne die Wirkung von freiem Cytokinin zu hemmen.
  • Dieses Prinzip wurde in einem Versuch zur Wirkung verschiedener Konzentrationen von o-Cumaryl-β-D-glucopyranuronsäure (CouGN) auf die durch BA3GN-Natriumsalz oder BA induzierte Keimbildung von GUS-negativen Tabakblattscheiben veranschaulicht. Wenn o-Cumaryl-β-D-glucopyranuronsäure durch die Wirkung von β-Glucuronidase gespalten wird, wird o-Cumarsäure freigesetzt. Wie oben erwähnt (siehe Beispiel 1I), wird o-Cumarsäure spontan in Cumarin umgewandelt. Dies beinhaltet die Eliminierung einer Säuregruppe (siehe unten) und damit einen Anstieg des pH auf eine Höhe, bei der die Aktivität der nativen β-Glucuronidase der Pflanze vermutlich vermindert ist.
  • Figure 00850001
  • Der Versuch wurde unter Verwendung einer BA-Konzentration von 0,5 mg/l und einer Konzentration an BA3GN-Natriumsalz von 10,0 mg/l durchgeführt. Es gab pro Behandlung 12 Scheiben und die Anzahl an Keimen wurde nach 19 Tagen festgestellt. Die Ergebnisse sind unten gezeigt. TABELLE 14
    Figure 00860001
    • * Natriumsalz
  • Die obige Tabelle zeigt, dass die Gegenwart von o-Cumaryl-β-D-glucopyranuronsäure im Wachstumsmedium Keimneubildung hemmt, die durch BA3GN-Natriumsalz, nicht aber von BA induziert wird. Beste Ergebnisse wurden in diesem Versuch unter Verwendung einer o-Cumaryl-β-D-glucopyranuronsäurekonzentration von ungefähr 3-4 mM erhalten. Verschiedene Mechanismen könnten an der Verminderung der durch BA3GN induzierten Keimneubildung beteiligt sein, einschließlich der folgenden: 1) ein erhöhter pH infolge der Freisetzung von o-Cumarsäure, wie oben erklärt, 2) Substratkonkurrenz zwischen CouGN und BA3GN, die zu einer geringeren Hydrolyserate von BA3GN führt, und 3) ein verminderter Transport von BA3GN in die Zellen. Während die genauen Mechanismen, die an der beobachteten Verminderung der Keimbildung in Gegenwart von CouGN beteiligt sind, nicht bestimmt wurden, glaubt man, dass ein erhöhter pH wahrscheinlich zumindest teilweise verantwortlich war. In jedem Fall weist dieses Experiment darauf hin, dass die Selektivität des positiven Selektionssystems durch Verwendung des eingeführten β-Glucuronidasegens verbessert werden kann, um einen selbstregulierenden Mechanismus aufzubauen, der die Wirkung jedes Hintergrundenzyms bedeutend vermindern kann.
  • BEISPIEL 13
  • HERSTELLUNG GENETISCH TRANSFORMIERTER PFLANZEN
  • Das Folgende gibt eine allgemeine Methode an, die für die Herstellung genetisch transformierter Pflanzen angewendet werden kann.
  • Pflanzenmaterial
  • Blätter (Nicotiana tabacum 'Wisconsin 38') werden von Pflanzen erhalten, die in vitro oder in vivo gezogen wurden. Im letzteren Fall werden die Blätter vor der Transformation sterilisiert. Die Sterilisation kann durchgeführt werden, indem man die Blätter für 20 min. in eine Lösung aus 5%igem Calciumhypochlorit, die 0,1 ml Tween 80 pro Liter enthält, legt, gefolgt von 5maligem Waschen in sterilem Wasser. In vitro-Pflanzen werden in Gefäßen auf 1/2 MSO gezüchtet. (1/2 MSO ist dasselbe Substrat wie MSO in einer 50% Konzentration mit Ausnahme von Agar, Zucker und Vitaminen.)
  • Die Blätter werden einzeln in eine 14 cm Petrischale gelegt. Sie werden dann gestanzt oder in Stücke von ungefähr 1 cm2 geschnitten ohne eine Hauptblattrippe, wobei die Kanten der Stücke aus Gewebe bestehen, das geschnitten wurde. Jegliches geschnittenes Gewebe, das durch die Hypochloritsterilisation gebleicht wurde, wird entfernt.
  • Kultivierung von Bakterien
  • Einen Tag vor der Transformation wird eine Bakterienkultur gestartet, indem man 2-3 ml Bakterien zu 200 ml LB-Medium in einem Erlenmeyerkolben gibt. Die Bakterien werden bei 28 °C unter Bewegung (300 rpm) gezüchtet.
  • Transformation
  • Die Bakterienkultur wird mit 1/2 MSO 50x oder auf OD 0,1 (bei 660 nm) unmittelbar vor der Transformation verdünnt. Ungefähr 10 ml der verdünnten Bakteriensuspension wird in eine 9 cm Petrischale geschüttet, und die Blattstücke werden für 15 min. in diese Suspension getaucht. Die Blattstücke werden dann entfernt und überschüssige Bakteriensuspension wird mit sterilem Filterpapier entfernt.
  • Cokultivierung
  • Am Tag vor der Transformation wird ein Stück steriles Filterpapier auf Cokultivierungsschalen gelegt (die typischerweise MSO-Substrat enthalten) und die Blattstücke, die in die Bakteriensuspension getaucht worden waren, werden mit der Oberseite nach unten auf das Filterpapier gelegt. Die Blattstücke werden in einer Wachstumskammer mit einem Zyklus von 12 Stunden Licht und 12 Stunden Dunkelheit 2 Tage lang inkubiert.
  • Selektion/Neubildung
  • Die Blattstücke werden in Petrischalen übertragen, die Cytokininglucuronide wie angegeben und entweder 350 mg/l Carbenicillin + 350 mg/l Cefotoxim oder nur 800 mg/l Carbenicillin, in bestimmten Fällen in Kombination mit Kanamycinsulfat, enthalten. Die Blattstücke werden nach 3 Wochen auf das gleiche Medium subkultiviert, aber ohne Cytokininglucuronide.
  • Assay
  • Neugebildete Keime werden in Gefäße mit 1/2 MSO übertragen. Nach ungefähr 2 Wochen wird der X-gluc-Assay an den grünen Keimen durchgeführt. Die Keime werden nach Bedarf subkultiviert.
  • Auspflanzen
  • Genetisch transformierte Keime, die Wurzeln gebildet haben (und die GUS-positiv sind) werden in einer Wachstumskammer ausgepflanzt. Die Keime werden in ein geeignetes Wachstumsmedium gepflanzt, z.B. Sphagnum. Sie werden dann mit Plastiktüten bedeckt und ungefähr eine Woche wachsen gelassen, wonach die zwei Ecken der Plastiktüten abgeschnitten werden. Nach einer weiteren Woche werden die Plastiktüten entfernt.
  • BEISPIEL 14
  • INDUKTION VON KEIMBILDUNG VON PFLANZENGEWEBE MIT UND OHNE EIN EINGEFÜHRTES β-GLUCURONIDASEGEN UNTER VERWENDUNG VON STEROLEN UND EINES DI-β-D-GLUCURONIDS
  • Tests ähnlich den in Beispielen 5 und 6 beschriebenen wurden an GUS-positiven und GUS-negativen Tabakblattscheiben durchgeführt, unter Verwendung von Substraten, die 100 mg/l β-Sitosterol, 100 mg/l Cholesterol, 10 mg/l Campesterol, 1,88 mg/l BA3GN-Natriumsalz und verschiedene Konzentrationen der Di-β-D-glucuronidglycyrrhizinsäure in der Form eines Diammoniumsalzes enthielten. Zusätzlich enthielt die Hälfte der Substrate 0,1 mM Tridemorph. Die Anzahl an Keimen wurde nach 17 Tagen festgestellt.
  • Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle gezeigt. TABELLE 15
    Figure 00890001
    • * Diammoniumsalz
  • Man kann sehen, dass die Kombination von Sterolen und des Diammoniumsalzes von Glycyrrhizinsäure zu selektiver Keimbildung in Blattscheiben führt, die ein eingeführtes β-Glucuronidasegen enthalten. (Wie oben erwähnt (siehe Beispiel 5), hemmt Tridemorph die Synthese von Sterolen und hat so eine hemmende Wirkung auf Keimneubildung, wenn das Pflanzengewebe nicht mit Sterolen versorgt wird). Während die selektive Keimauslösungswirkung zu sehen ist, wenn man Substrate mit und ohne Tridemorph verwendet, wird die größte Anzahl an Keimen in den Substraten erhalten, die Tridemorph enthalten, und insbesondere mit einer Glycyrrhizinsäurediammoniumsalzkonzentration von 0,125 mM.
  • BEISPIEL 15
  • SELEKTIVE INHIBITION VON BA3GN-INDUZIERTER KEIMBILDUNG VON WILDTYP-(GUS-)TABAKBLATTSCHEIBEN
  • Es wurden Versuche durchgeführt wie in Beispiel 3 beschrieben unter Verwendung der Tabakvarietät 'Burley' anstelle von 'Wisconsin 38'. Methyl-β-D-glucuronid (MG), welches durch GUS zu Methanol und Glucuronsäure hydrolysiert wird, wurde dem Substrat in verschiedenen Konzentrationen zugegeben, zusammen mit entweder 1 mg/l BA oder 15 mg/l BA3GN-Natriumsalz. Es wurde gezeigt, dass Methanol das native GUS-Enzym hemmt, ohne das eingeführte E. coli-Enzym sehr stark zu beeinträchtigen (Kosugi et al., 1990, Plant Sci., 133-120), während Glucuronsäure, die aus Methyl-β-D-glucuronid freigesetzt wird, ein Produktinhibitor von GUS-Enzymen ist. Durch Zugabe von MG anstelle der unabhängigen Zugabe der beiden Verbindungen werden die Hydrolyseprodukte lokal produziert und in dem Kompartiment konzentriert, in dem das Enzym lokalisiert ist. Die erhaltenen Ergebnisse sind unten in Tabelle 16 gezeigt.
  • TABELLE 16
    Figure 00910001
  • Die obigen Ergebnisse zeigen, dass die Zugabe von entweder MG oder Glucuronsäure zu einer Verminderung der Anzahl an Keimen, die auf dem BA3GN-Substrat erhalten wurden, führt, verglichen mit der Anzahl an Keimen, die auf dem BA-Substrat erhalten wurden. Durch Behandlung des Gewebes mit MG vor der Expression des eingeführten GUS-Enzyms kann es deshalb möglich sein, die Aktivität oder Wirkung des nativen GUS-Enzyms während des Selektionsprozesses selektiv zu eliminieren oder zu vermindern. Unterschiede zwischen den eingeführten und den nativen GUS-Enzymen hinsichtlich Inhibition aufgrund von Substratkonkurrenz, Empfindlichkeit auf Substratinhibition, Menge an Enzym (Aktivität) und Empfindlichkeit auf Produktinhibition können auch die Wirkungen von MG und anderen Komponenten, die eine ähnliche Wirkung auf Wildtyp-Gewebe, die mit Glucuroniden behandelt wurden, haben, erklären.
  • Es ist auch möglich, dass MG dadurch wirkt, dass es mit der Aufnahme anderer Glucuronide wie BA3GN konkurriert. Wenn das der Fall ist, könnte MG verwendet werden, um die Aufnahme anderer Glucuronide in Wildtyp-Zellen zu vermindern oder zu eliminieren. Einführung eines Gens, das ein GUS-Gen codiert, das abgesondert wird, oder eines Gens, das eine Glucuronidpermease codiert, könnte verwendet werden, um transgene Zellen zu selektieren, wenn die Aufnahme durch beispielsweise Zugabe von MG zum Substrat gehemmt wird. Im Falle von Glucuronidpermease würden nur transgene Zellen das Glucuronid (z.B. BA3GN) aufnehmen und wegen des allgemeinen Vorkommens des nativen Enzyms in Pflanzen (siehe z.B. Beispiel 3) würde die Verbindung innerhalb der Zellen aktiviert werden und die Permease (oder ein anderes Protein, das die Aufnahme von Glucuroniden erleichtert) exprimieren.
  • Es ist auch interessant, dass Glucuronsäure selbst selektiv die Wirkung von BA3GN hemmen kann, vermutlich indem es die Wirkung von BA, das durch Spaltung von BA3GN durch GUS freigesetzt wurde, blockiert.
  • BEISPIEL 16
  • VERWENDUNG POSITIVER SELEKTION UND EINER KOMBINATION VON POSITIVER UND NEGATIVER SELEKTION ZUR VERBESSERUNG DER WIRKSAMKEIT DER SELEKTION VON TRANSGENEN ZELLEN, GEWEBEN ODER KEIMEN VON WIDERSPENSTIGEN ARTEN
  • Zuckerrübe ist eine sehr widerspenstige Art hinsichtlich der Produktion transgener Pflanzen. Viele untransformierte Keime werden „selektiert" unter Bedingungen, die in gewöhnlichen Transformationssystemen transgene Keime ergeben. Es wurde gefunden, dass das auch der Fall ist, wenn positive Selektionsversuche (ohne Zugabe von Kanamycin) unter Verwendung von 5-15 mg/l BA3GN-Natriumsalz unter den im folgenden beschriebenen Bedingungen durchgeführt wurden.
  • In Beispiel 11 (siehe Tabelle 12) wurde gefunden, dass die Kombination von positiver und negativer Selektion die Anzahl „selektierter" nichttransformierter Keime vermindert. Deshalb wurde die Kombination von positiver und negativer Selektion an Zuckerrüben getestet, und es wurde gefunden, dass dies vorteilhafte Ergebnisse ergibt.
  • Transformation wurde durchgeführt unter Verwendung von Kotyledonen-Explantaten wie unten beschrieben.
  • Samen wurden 4 Tage lang in Dunkelheit auf einem Substrat, das 0,7 g/l Agarose und 2 g/l Saccharose enthielt, gekeimt. Die Sämlinge wurden dann in einen Nunc- Behälter übertragen, der 1/2 × MSO Substrat enthielt, und drei Tage lang im Licht kultiviert. Die Kotyledonen wurden von den Sämlingen entfernt, und die Kotyledonen-Explantate am Petiolus mit einer kleinen Bürste gebürstet, die eine Agrobacterium-Suspension enthielt, wobei das Agrobacterium 35S-NPTII und 35S-GUS (OD 660 = 0,1) enthielt. Die Kotyledonen wurden dann 4 Tage lang auf einem Substrat, das 1/10 MSO-Substrat und 200 μM Acetosyringon enthielt, cokultiviert. Die transformierten Explantate wurden auf ein MSO-Substrat übertragen, das mit 0,25 mg/l BA oder 15 mg/l BA3GN-Natriumsalz (anstelle von BAP), 0,025 mg/l Naphthylessigsäure, 400 mg/l Kanamycin, 800 mg/l Carbenicillin und 25 mg/l Vancomycin ausgestattet war, und die Explantate wurden 21 Tage lang auf diesem Substrat inkubiert. Die neugebildeten Keime wurden dann in Gefäße übertragen, die dasselbe Substrat enthielten. Nach 52 Tagen auf diesem Substrat wurden alle Keime auf MSO-Substrat übertragen, das mit 800 mg/l Carbenicillin, 25 mg/l Vancomycin und 0,1 mg/l BA ausgestattet war. Nach 14 Tagen wurden GUS-Assays wie in Beispiel 3 beschrieben an dem selektierten Pflanzenmaterial durchgeführt.
  • Die Ergebnisse sind in der Tabelle unten gezeigt
  • TABELLE 17
    Figure 00930001
  • Man kann sehen, dass mit der Kombination von positiver und negativer Selektion transgene Keime unter Bedingungen produziert werden, in denen unter Verwendung des herkömmlichen negativen Selektionssystems keine transgenen Keime produziert werden. Das zeigt, dass bei Zuckerrüben die Verwendung des positiven Selektionssystems sehr vorteilhaft ist verglichen zur Verwendung des reinen negativen Selektionssystems.
  • Das wiederum zeigt, dass es die Anwendung der positiven Selektion (allein in Kombination mit negativer Selektion) möglich machen kann, transgene Pflanzen in anderen widerspenstigen Arten zu produzieren, in denen nur niedrige Transformations/Selektionsraten erreicht werden, oder in denen unter Verwendung negativer Selektionssysteme überhaupt keine transgenen Pflanzen selektiert werden können.
  • BEISPIEL 17
  • POSITIVE SELEKTIONSSYSTEME AUF DER BASIS DER VERWENDUNG INAKTIVER N-QUELLEN, ERHÄLTLICH DURCH DIE EINFÜHRUNG METABOLISIERENDER GENE
  • Es wurden Versuche wie in Beispiel 3 beschrieben durchgeführt, aber der normale Stickstoffgehalt des MSO-Substrates wurde auf 0 erniedrigt. Stattdessen wurden die in Tabelle 18 angegebenen Stickstoffverbindungen zugegeben. Das Substrat enthielt 1 mg/l BA. Substrate, die Ammoniumnitrat enthielten, wurden als positive Kontrolle verwendet.
  • Diese Versuche wurden durchgeführt, um zu untersuchen, ob Opine inaktiv sind, oder ob sie von Pflanzenzellen als Stickstoffquellen in Substraten, die keine andere Stickstoffquelle enthalten, genutzt werden können. Weil Gene, die Enzyme codieren, die Opine metabolisieren, wohlbekannt sind, ist die Hauptvoraussetzung für die Verwendung von Opinen in einem positiven Selektionssystem die Identifizierung von Opinen, die nicht als Stickstoffquelle für Pflanzengewebe und Zellen verwendet werden können, die keine eingeführten Gene enthalten, die die Pflanzenzellen befähigen, die fraglichen Opine zu nutzen. Die Ergebnisse sind unten angegeben.
  • TABELLE 18
    Figure 00950001
  • In getesteten Substraten, die keinen Stickstoff enthielten, wurden ein paar Keime gebildet. Das kann möglich gewesen sein, weil Stickstoff aus dem Gewebe in dem Explantat mobilisiert werden kann. Um jegliche Keimbildung in den Behandlungen ohne jeden Stickstoff zu vermeiden, können die Explantate an Stickstoff ausgehungert werden, indem man die Vorläuferkulturen vor der Verwendung auf stickstofffreien Substraten züchtet oder indem man die Explantate auf einem stickstofffreien Substrat, beispielsweise ohne keimauslösende Hormone, vorbehandelt.
  • Es wurde überraschenderweise gefunden, dass Octopin und Nopalin Keimbildung nicht unterstützen können, während Mannopin als gute Stickstoffquelle wirken und Keimbildung aus den Blattscheiben unterstützen kann.
  • Es ist wahrscheinlich, dass der Grund, warum Nopalin und Oktopin nicht als Stickstoffquelle wirken können, der ist, dass diese Verbindungen nicht aufgenommen, metabolisiert oder hydrolisiert werden zu nutzbaren Verbindungen.
  • Es ist wohl bekannt, dass Organismen, die Gene enthalten, die am Transport und Metabolismus von Opinen beteiligt sind, beispielsweise Agrobacterium, Opine als Stickstoffquelle nutzen können, während Agrobacterium oder andere Bakterienstämme, die keine Gene enthalten, die Opinmetabolismus codieren, auf Substraten, die nur Opine als Stickstoffquelle enthalten, nicht wachsen können.
  • Basierend auf diesen Ergebnissen können positive Selektionssysteme durch Einführung von einem oder mehreren Opinmetabolismus- oder -transportgenen in transgene Pflanzenzellen unter Verwendung von Selektionssubstraten, die keine oder nur in geringem Maße Stickstoffquellen enthalten, die von beispielsweise Nopalin oder Octopin verschieden sind, aufgebaut werden. Die Identifizierung und Isolierung von Genen und genetischen Material, das dem Empfänger die Fähigkeit verleiht, Octopin und Nopalin zu nutzen, wurde in der Literatur beschrieben: siehe z.B. C. Beaulieu et al., 1988, Can. J. Microbiol., 38: 843-49; P. M. Klapwijk et al. 1976, J. Gen. Microbiol., 96: 155-163; C. L. Schardl und C. I. Kado, 1983, Mol. Gen. Genet., 191: 10-16 oder H. Wabiko et al., 1990, J. Gen. Microbiol. 136: 97-103. Bei Isolierung von genetischem Material, das Opinmetabolismus codiert, können eukaryontische Organismen gemäß den Standardverfahren, die in der Literatur beschrieben sind, mit entsprechenden Sequenzen, die für das Funktionieren der Gene für Opinmetabolismus nötig sind, transformiert werden.
  • Basierend auf den obigen Ergebnissen ist es wahrscheinlich, dass andere Opine und entsprechende katabolisierende Gene in ähnlicher Weise verwendet werden können, und es erscheint weiterhin wahrscheinlich, dass andere inaktive N-Quellen, die durch ähnliche Mittel identifiziert werden, und ihre entsprechenden Gene ähnlich verwendet werden können, z.B. Amide in Kombination mit Amidasen, Peptide in Kombination mit spezifischen Peptidasen, usw.
  • BEISPIEL 18
  • PRODUKTION VON TRANSGENEM KALLUS AUS WIDERSPENSTIGEN ARTEN UNTER VERWENDUNG VON POSITIVER SELEKTION IN KOMBINATION MIT NEGATIVER SELEKTION
  • Es wurden Versuche durchgeführt wie in Beispiel 11 beschrieben, aber mit gewissen Veränderungen. Die verwendeten Pflanzenarten waren die sehr widerspenstigen Zuchtlinien „V486" von Winterölraps und „S487" von Sommerölraps. Samen wurden sterilisiert und gekeimt wie in Beispiel 16 beschrieben. Hypokotyle wurden als Explantate verwendet und geimpft und cokultiviert wie in Beispiel 11 beschrieben. Nach Cokultivierung wurden die Explantate auf MSO-Substrat übertragen, das 0,1 mg/l Naphthylessigsäure, 0,01 mg/l Gibberellinsäure (GA3), 500 mg/l Carbenicillin, 50 mg/l Kanamycinsulfat und 6,0 mg/l Agarose enthielt. Das Substrat enthielt zusätzlich entweder 1 mg/l BA oder 3,75, 7,5, oder 15,0 mg/l BA3GN-Natriumsalz. Der pH wurde auf 5,8 eingestellt. Das verwendete Agrobacterium enthielt in seiner T-DNA ein GUS-Gen und ein Neomycinphosphotransferase-II-Gen, das von 35S-Promotoren gesteuert wurde. GUS-Assays wurden nach 8 Wochen durchgeführt und Kalli, die eine intensive blaue Einfärbung in den meisten Kalluszellen zeigten, wurden als GUS+ aufgezeichnet.
  • TABELLE 19
    Figure 00970001
  • Diese Versuche zeigen, dass bei diesen sehr widerspenstigen Typen von Ölraps nur positive Selektion in Kombination mit negativer Selektion die Selektion transgener Kalli erlaubte, während kein GUS-positiver Kallus mit herkömmlicher negativer Selektion (Substrat mit BA anstelle von BA3GN-Natriumsalz) erhalten wurde.
  • Das zeigt, dass die Einführung der positiven Selektionssysteme sehr vorteilhaft ist, verglichen mit den reinen negativen Selektionssystemen, auch in Kallussystemen. Es zeigt auch, dass die Verwendung positiver Selektion (allein oder in Kombination mit negativer Selektion) es möglich machen kann, transgene Pflanzen in anderen widerspenstigen Arten, in denen nur niedrige Transformations/Selektionsraten erzielt werden, oder in denen überhaupt keine transgenen Pflanzen unter Verwendung negativer Selektionssysteme erhalten werden, hergestellt werden können.
  • Nachdem transgener Kallus selektiert wurde, kann er in transgene Keime neugebildet werden, beispielsweise auf einem Substrat, das ein Cytokinin in Kombination mit einer niedrigen Konzentration an Auxinen enthält. Bei diesem Prozess ist keine Selektion erforderlich.

Claims (4)

  1. Ein Verfahren zur Selektion genetisch transformierter Pflanzenzellen aus einer Zellpopulation, worin die genetisch transformierten Pflanzenzellen mit einer erwünschten exprimierbaren Nukleotidsequenz, die eine regulatorische Sequenz enthält, die ihre Expression in den transformierten Zellen ermöglicht, und einer mit-eingeführten exprimierbaren Nukleotidsequenz, die ebenfalls eine regulatorische Sequenz enthält, die ihre Expression in den transformierten Pflanzenzellen ermöglicht, transformiert sind, welches Verfahren umfasst, besagte Population mit einer Verbindung zu versehen, die durch das Expressionsprodukt der mit-eingeführten exprimierbaren Nukleotidsequenz, die mit der erwünschten exprimierbaren Nukleotidsequenz in besagte transformierte Zellen eingeführt wurde, metabolisiert werden kann, um so die transformierten Zellen verglichen mit den nicht transformierten Zellen mit einem physiologischen Vorteil zu versehen, wobei die Verbindung kein Antibiotikum oder Herbizid ist und keine direkte nachteilige Wirkung auf die nicht transformierten Zellen hat.
  2. Verfahren gemäß Anspruch 1, in dem die Verbindung ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus Cytokinen, Auxinen, Gibberellinen, Vitaminen, Kohlenhydraten, Opinen, Proteinen, Sterolen und Saponinen besteht.
  3. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2, worin besagte mit-eingeführte exprimierbare Nukleotidsequenz β-Glucuronidase codiert, wenn die Verbindung ein Cytokinglucuronid ist.
  4. Verfahren gemäß dem vorhergehenden Anspruch, worin die ursprüngliche β-Glucuronidaseaktivität reduziert wird, indem man das Kulturmedium mit einer pH-regulierenden Verbindung versieht, die das Kulturmedium, die Zellen oder Kompartimente der Zellen mit einem pH zwischen 5,5 und 8,5 versieht.
DE69229556T 1991-08-28 1992-08-27 Verfahren zur selektion genetisch transformierter zellen und dafür verwendbare verbindungen Expired - Lifetime DE69229556T3 (de)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DK152291 1991-08-28
DK911522A DK152291D0 (da) 1991-08-28 1991-08-28 Fremgangsmaade og kemiske forbindelser
PCT/DK1992/000252 WO1993005163A1 (en) 1991-08-28 1992-08-27 Method for the selection of genetically transformed cells and compounds for use in the method

Publications (3)

Publication Number Publication Date
DE69229556D1 DE69229556D1 (de) 1999-08-12
DE69229556T2 DE69229556T2 (de) 1999-11-11
DE69229556T3 true DE69229556T3 (de) 2007-09-20

Family

ID=8105710

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE69233771T Expired - Lifetime DE69233771D1 (de) 1991-08-28 1992-08-27 Verfahren zur Selektion genetisch transformierter Zellen und dafür verwendbare Verbindungen
DE69229556T Expired - Lifetime DE69229556T3 (de) 1991-08-28 1992-08-27 Verfahren zur selektion genetisch transformierter zellen und dafür verwendbare verbindungen

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE69233771T Expired - Lifetime DE69233771D1 (de) 1991-08-28 1992-08-27 Verfahren zur Selektion genetisch transformierter Zellen und dafür verwendbare Verbindungen

Country Status (16)

Country Link
EP (3) EP0601092B2 (de)
JP (1) JPH06511146A (de)
AT (2) ATE181963T1 (de)
AU (1) AU664200B2 (de)
CA (1) CA2110401C (de)
CY (1) CY2217B1 (de)
CZ (2) CZ284828B6 (de)
DE (2) DE69233771D1 (de)
DK (2) DK152291D0 (de)
ES (1) ES2135415T5 (de)
GR (1) GR3031279T3 (de)
HU (1) HU227979B1 (de)
NZ (1) NZ244135A (de)
RU (1) RU2126834C1 (de)
SK (1) SK280639B6 (de)
WO (1) WO1993005163A1 (de)

Families Citing this family (61)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9304200D0 (en) † 1993-03-02 1993-04-21 Sandoz Ltd Improvements in or relating to organic compounds
US5994629A (en) * 1991-08-28 1999-11-30 Novartis Ag Positive selection
DE4305295B4 (de) * 1992-03-04 2006-05-18 Volkswagen Ag Kraftfahrzeug mit einem Sitz, der zumindest eine zwischen einer Ruhestellung und einer Betriebsstellung bewegbare Seitenwange besitzt
US5608147A (en) * 1994-01-11 1997-03-04 Kaphammer; Bryan J. tfdA gene selectable markers in plants and the use thereof
CN1155713C (zh) * 1995-04-06 2004-06-30 塞迷尼思蔬菜种子公司 选择转基因植物细胞的方法
GB9702592D0 (en) * 1997-02-07 1997-03-26 Danisco Selection method
ATE226255T1 (de) * 1997-07-07 2002-11-15 Pioneer Hi Bred Int Fumonisinentgiftungszusammensetzungen und verfahren
US6641996B1 (en) 1997-09-09 2003-11-04 Cambia Microbial β-glucuronidase genes, gene products and uses thereof
US7087420B1 (en) 1997-07-17 2006-08-08 Cambia Microbial β-glucuronidase genes, gene products and uses thereof
US6586658B1 (en) 1998-03-06 2003-07-01 Metabolix, Inc. Modification of fatty acid metabolism in plants
GB9817465D0 (en) * 1998-08-11 1998-10-07 Danisco Selection method
US7026526B2 (en) 2000-02-11 2006-04-11 Metabolix, Inc. Multi-gene expression constructs containing modified inteins
EP1780283A1 (de) * 2000-04-21 2007-05-02 Martek Biosciences Corporation Trophische Umwandlung von obligat phototropischen Algen durch metabolische Manipulation
ATE373098T1 (de) 2000-04-21 2007-09-15 Martek Biosciences Corp Trophische umwandlung von obligat phototropischen algen durch metabolische manipulation
WO2001096383A2 (en) 2000-06-16 2001-12-20 Martek Biosciences Corporation High fluorescent intensity cross-linked allophycocyanin
EP1334181B1 (de) 2000-11-17 2010-03-17 Metabolix, Inc. Herstellung von polyhydroxyalkanoaten mittlerer kettenlänge aus fettsäure-biosynthesewegen
WO2002081696A2 (en) 2001-04-06 2002-10-17 Syngenta Participations Ag Oryza sativa nuclear cap binding protein 80
US8022272B2 (en) 2001-07-13 2011-09-20 Sungene Gmbh & Co. Kgaa Expression cassettes for transgenic expression of nucleic acids
NL1019308C2 (nl) 2001-11-06 2003-05-07 Stichting Tech Wetenschapp Werkwijze voor het selecteren van genetisch getransformeerde cellen.
EP1527183B1 (de) 2002-07-26 2008-08-20 BASF Plant Science GmbH Neue selektionsverfahren
US20060253917A1 (en) 2002-12-26 2006-11-09 Bret Cooper Cell proliferation-related polypeptides and uses therefor
CN101001951B (zh) 2004-08-02 2011-06-15 巴斯福植物科学有限公司 分离转录终止序列的方法
EP2163632A1 (de) 2004-10-05 2010-03-17 SunGene GmbH Konstitutive Expressionskassetten zur Regulation der Pflanzenexpression
EP1655364A3 (de) 2004-11-05 2006-08-02 BASF Plant Science GmbH Expressionskassetten zur bevorzugten Expression in Pflanzensamen
EP1662000B1 (de) 2004-11-25 2011-03-30 SunGene GmbH Expressionskassetten zur bevorzugten Expression in pflanzlichen Schliesszellen
EP1666599A3 (de) 2004-12-04 2006-07-12 SunGene GmbH Expressionskassetten zur bevorzugten Expression in Mesophyll- und/oder Epidermiszellen in Pflanzen
EP2072620B1 (de) 2004-12-08 2013-05-08 SunGene GmbH Expressionskassetten für preferentiell vaskuläre Expression in Pflanzen
EP1669456A3 (de) 2004-12-11 2006-07-12 SunGene GmbH Expressionskasseten für meristembevorzugte Expression in Pflanzen
WO2006084868A2 (en) 2005-02-09 2006-08-17 Basf Plant Science Gmbh Expression cassettes for regulation of expression in monocotyledonous plants
WO2006089950A2 (en) 2005-02-26 2006-08-31 Basf Plant Science Gmbh Expression cassettes for seed-preferential expression in plants
ATE541043T1 (de) 2005-03-08 2012-01-15 Basf Plant Science Gmbh Expressionsverstärkende intron-sequenz
CA2800359A1 (en) 2005-03-16 2006-09-28 Metabolix, Inc. Chemically inducible expression of biosynthetic pathways
WO2006111512A1 (en) 2005-04-19 2006-10-26 Basf Plant Science Gmbh Improved methods controlling gene expression
US8034994B2 (en) 2005-04-19 2011-10-11 Basf Plant Science Gmbh Starchy-endosperm and/or germinating embryo-specific expression in mono-cotyledonous plants
US7790873B2 (en) 2005-05-10 2010-09-07 Basf Plant Science Gmbh Expression cassettes for seed-preferential expression in plants
US7994399B2 (en) 2005-06-23 2011-08-09 Basf Plant Science Gmbh Methods for the production of stably transformed, fertile Zea mays plants
CN101268194A (zh) 2005-09-20 2008-09-17 巴斯福植物科学有限公司 使用ta-siRNA调控基因表达的方法
CA2675926A1 (en) 2007-02-16 2008-08-21 Basf Plant Science Gmbh Nucleic acid sequences for regulation of embryo-specific expression in monocotyledonous plants
WO2010102293A1 (en) 2009-03-06 2010-09-10 Metabolix, Inc. Method of positive plant selection using sorbitol dehydrogenase
AU2010270309A1 (en) 2009-07-10 2012-02-02 Basf Plant Science Company Gmbh Expression cassettes for endosperm-specific expression in plants
EP2275564A1 (de) 2009-07-17 2011-01-19 Freie Universität Berlin Mittel und Verfahren zur Produktion von transgenen Pflanzen, die gegenüber Kohlhernie resistent sind
US20120174253A1 (en) 2009-09-15 2012-07-05 Nii Patterson Generation of high polyhydroxybutrate producing oilseeds
CA2781835A1 (en) 2009-11-27 2011-06-03 Basf Plant Science Company Gmbh Chimeric endonucleases and uses thereof
BR112012012747A2 (pt) 2009-11-27 2015-09-29 Basf Plant Science Co Gmbh "endonuclease quimérica, polinucleotídeo isolado, cassete de expressão, vetor célula hospedeira ou organismo não humano, método para fornecer a endonuclease quimérica, método para a recombinação homóloga dos polinucleotídeos e método para mutação direcionada de polinucleotídeos"
CA2782014C (en) 2009-11-27 2021-08-31 Basf Plant Science Company Gmbh Optimized endonucleases and uses thereof
CN102782141A (zh) 2009-12-03 2012-11-14 巴斯夫植物科学有限公司 用于在植物中胚-特异性表达的表达盒
US9598473B2 (en) 2011-06-10 2017-03-21 Keygene N.V. Trichome-specific transcription factor modulating terpene biosynthesis
WO2013014585A1 (en) 2011-07-22 2013-01-31 Basf Plant Science Company Gmbh Plant transformation method
EP2768952A2 (de) 2011-10-19 2014-08-27 Keygene N.V. Verfahren zur herstellung von cinnamolid und/oder drimendiol
US20140182011A1 (en) 2011-11-03 2014-06-26 The University Of Hong Kong Methods Using Acyl-Coenzyme A-Binding Proteins to Enchance Drought Tolerance in Genetically Modified Plants
WO2013184768A1 (en) 2012-06-05 2013-12-12 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Compositions and methods of gene silencing in plants
CA2881787A1 (en) 2012-08-13 2014-02-20 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Compositions and methods for increasing pest resistance in plants
CN104531656B (zh) * 2015-01-05 2018-02-09 安徽省农业科学院水稻研究所 一种来自小球藻的磷酸甘露糖异构酶基因及其应用
US11174467B2 (en) 2015-04-08 2021-11-16 Yield10 Bioscience, Inc. Plants with enhanced yield and methods of construction
US20190338302A1 (en) 2016-02-04 2019-11-07 Yield10 Bioscience, Inc. Transgenic land plants comprising a putative transporter protein of an edible eukaryotic algae
WO2018156686A1 (en) 2017-02-22 2018-08-30 Yield10 Bioscience, Inc. Transgenic land plants comprising enhanced levels of mitochondrial transporter protein
CA3111368A1 (en) 2018-09-04 2020-03-12 Yield10 Bioscience, Inc. Genetically engineered land plants that express an increased seed yield protein and/or an increased seed yield rna
CN114829612A (zh) 2019-12-16 2022-07-29 巴斯夫农业种子解决方案美国有限责任公司 使用配对切口酶的改进的基因组编辑
CA3161725A1 (en) 2019-12-16 2021-06-24 Timothy James Golds Precise introduction of dna or mutations into the genome of wheat
AU2021267373A1 (en) 2020-05-06 2022-12-08 Ajax Therapeutics, Inc. 6-heteroaryloxy benzimidazoles and azabenzimidazoles as JAK2 inhibitors
AU2022388555A1 (en) 2021-11-09 2024-05-02 Ajax Therapeutics, Inc. 6-he tero aryloxy benzimidazoles and azabenzimidazoles as jak2 inhibitors

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4857467A (en) * 1986-07-23 1989-08-15 Phillips Petroleum Company Carbon and energy source markers for transformation of strains of the genes Pichia
GB8725402D0 (en) * 1987-10-29 1987-12-02 Jefferson R A Gene fusion
GB8626862D0 (en) 1986-11-11 1986-12-10 Jefferson R A Gene fusion
DE3719053A1 (de) * 1987-06-06 1988-12-15 Hoechst Ag Verbesserte nutzung von pflanzenverwertbarem stickstoff durch kulturpflanzen mit ueberexpression der glutaminsynthetase

Also Published As

Publication number Publication date
ATE443771T1 (de) 2009-10-15
CA2110401C (en) 2006-02-21
JPH06511146A (ja) 1994-12-15
EP0601092A1 (de) 1994-06-15
EP0896063B1 (de) 2009-09-23
DK152291D0 (da) 1991-08-28
EP0601092B2 (de) 2006-11-15
EP0601092B1 (de) 1999-07-07
CZ292882B6 (cs) 2003-12-17
SK280639B6 (sk) 2000-05-16
SK22294A3 (en) 1994-07-06
WO1993005163A1 (en) 1993-03-18
HUT69606A (en) 1995-09-28
CY2217B1 (en) 2003-04-18
CZ44494A3 (en) 1994-06-15
EP0896063B9 (de) 2010-05-26
DK0601092T4 (da) 2007-02-26
DE69229556T2 (de) 1999-11-11
NZ244135A (en) 1995-04-27
HU227979B1 (en) 2012-07-30
DK0601092T3 (da) 2000-02-07
HU9400570D0 (en) 1994-05-30
GR3031279T3 (en) 1999-12-31
EP0896063A2 (de) 1999-02-10
DE69233771D1 (de) 2009-11-05
EP0896063A3 (de) 2000-02-09
CA2110401A1 (en) 1993-03-18
ES2135415T3 (es) 1999-11-01
RU2126834C1 (ru) 1999-02-27
ES2135415T5 (es) 2007-06-01
DE69229556D1 (de) 1999-08-12
ATE181963T1 (de) 1999-07-15
AU664200B2 (en) 1995-11-09
CZ284828B6 (cs) 1999-03-17
EP0530129A1 (de) 1993-03-03
AU2556792A (en) 1993-04-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE69229556T3 (de) Verfahren zur selektion genetisch transformierter zellen und dafür verwendbare verbindungen
US5994629A (en) Positive selection
DE69434744T3 (de) Positive selektion auf mannose oder xylose basierend
DE69733881T2 (de) Plastidtransformation in arabidopsis thaliana
EP0270496B1 (de) Verbessertes Verfahren zur Transformation von pflanzlichen Protoplasten
US5599670A (en) β-glucuronidase and glucuronide permease gene system
DE69434972T2 (de) Verfahren zur transformation von pflanzen und ein vektor dafür
DE69634875T2 (de) Kälteindusierbare promotorsequenzen
DE4013099A1 (de) Verfahren zur transformation somatischer embryonen von nutzpflanzen
DE69835672T2 (de) Methoden zur pflanzentransformation
EP0469273B1 (de) Fertile transgene Maispflanzen mit artfremdem Gen sowie Verfahren zu ihrer Herstellung
DE602004010682T2 (de) Verfahren zur entgiftung von mykotoxinen
DE4126414A1 (de) Deacetylasegene zur erzeugung von phosphinothricin oder phosphinothricyl-alanyl-alanin, verfahren zu ihrer isolierung und ihre verwendung
DE4444460A1 (de) Verfahren zur Steigerung des Ertrags sowie zur Veränderung des Blühverhaltens bei Pflanzen
DE2614115C2 (de) Echinatin-Glucoside und Verfahren zu ihrer Herstellung
DE4439748A1 (de) Verfahren zur Veränderung des Blühverhaltens bei Pflanzen
DE10115761A1 (de) Verfahren zur raschen Herstellung von transgenen, einkeimblättrigen Pflanzen
DE60209137T2 (de) Verfahren zur selektion von transformierten zellen
DE10063879B4 (de) Nucleinsäuren, die vacuoläre Invertasen codieren, Pflanzenzellen und Pflanzen, die diese enthalten sowie ihre Verwendung
WO1989006485A1 (en) Process for obtaining intact fertile arabidopsis plants from protoplasts
DE10201637A1 (de) Verfahren zur Herstellung einer Mais-Kalluskultur

Legal Events

Date Code Title Description
8363 Opposition against the patent
8328 Change in the person/name/address of the agent

Representative=s name: PFENNING MEINIG & PARTNER GBR, 80339 MUENCHEN

8366 Restricted maintained after opposition proceedings
8327 Change in the person/name/address of the patent owner

Owner name: SYNGENTA PARTICIPATIONS AG, BASEL, CH

8328 Change in the person/name/address of the agent

Representative=s name: MAIWALD PATENTANWALTSGESELLSCHAFT MBH, 80335 MUENC

R071 Expiry of right

Ref document number: 601092

Country of ref document: EP