ES2135415T5 - Metodo para la seleccion de celulas transformadas geneticamente y compuestos para uso en el metodo. - Google Patents

Metodo para la seleccion de celulas transformadas geneticamente y compuestos para uso en el metodo. Download PDF

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Abstract

Un método para seleccionar células vegetales transformadas genéticamente a partir de una población de células, en el que las células vegetales genéticamente transformadas se transforman con una secuencia de nucleótidos expresable deseada que contiene una secuencia reguladora que permite su expresión en las células transformadas y una secuencia de nucleótidos expresable co-introducida que también contiene una secuencia reguladora que permite su expresión en las células transformadas, método que comprende suministrar a dicha población un compuesto que puede ser metabolizado por el producto de expresión de la secuencia de nucleótidos expresable co-introducida que se ha introducido con la secuencia de nucleótidos expresable deseada en dichas células transformadas, a fin de proporcionar a las células transformadas una ventaja fisiológica cuando se comparan con las células no transformadas, en el cual el compuesto no es un antibiótico o herbicida, y no tiene efecto desfavorable directo alguno sobre las células no transformadas.

Description

Método para la selección de células transformadas genéticamente y compuestos para uso en el método.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a un método para seleccionar células vegetales transformadas genéticamente en las cuales se ha incorporado una secuencia de nucleótidos deseada proporcionando a las células transformadas una ventaja selectiva sin deterioro de las células no transformadas, así como a nuevos compuestos para uso en el método.
Fundamentos de la invención
Es bien sabido que cuando debe introducirse nuevo material genético en una población de células por transformación, únicamente cierto número de las células se transforman con éxito, es decir, reciben el nuevo material genético. Es entonces necesario identificar las células transformadas genéticamente a fin de que estas células puedan separarse de las células no transformadas contenidas en la población. La identificación y separación de las células transformadas se han realizado tradicionalmente utilizando lo que puede denominarse "selección negativa", en otros términos, mediante el uso de un método por el cual las células transformadas son capaces de sobrevivir y desarrollarse, en tanto que las células no transformadas se ven sometidas a inhibición del crecimiento o quizás incluso son destruidas por una sustancia que las células transformadas son capaces de tolerar.
Por ejemplo, cuando una población de células vegetales se somete a transformación genética, la selección de las células transformadas tiene lugar típicamente utilizando un gen de selección que codifica resistencia a un antibiótico o un herbicida. El gen de selección - que en sí mismo no tiene generalmente función útil alguna en la planta transformada genéticamente, y de hecho puede ser indeseable en la planta - está acoplado a o co-introducido con el gen a incorporar en la planta en cuestión, de tal modo que ambos genes se incorporan en la población de células, o más bien en algunas de las células de la población, dado que no es posible en la práctica transformar todas o ni siquiera una mayoría de las células. Las células se cultivan luego sobre o en el interior de un medio que contiene el antibiótico o herbicida al cual son resistentes las células transformadas genéticamente en virtud del gen de selección, permitiendo con ello la identificación de las células transformadas, dado que las células no transformadas - que no contienen el gen de resistencia al antibiótico o herbicida en cuestión - se ven sometidas a inhibición del crecimiento o se destruyen.
Estos métodos de selección negativa tienen, sin embargo, ciertas desventajas. Ante todo, las células no transformadas pueden morir debido a la presencia de, v.g. antibióticos en el medio de crecimiento. Como resultado, cuando la población de células es un tejido coherente existe un riesgo claro de que no sólo las células no transformadas sino también las células transformadas puedan morir, debido al hecho de que la muerte de las células no transformadas puede interrumpir el suministro de nutrientes a las células transformadas o debido a que las células no transformadas lesionadas o moribundas pueden excretar compuestos tóxicos.
Otra desventaja significativa de la selección negativa es que la presencia de un gen innecesario para, v.g., resistencia a los antibióticos puede ser indeseable. Por ejemplo, existe preocupación entre los grupos ecologistas y las autoridades de los gobiernos acerca de si es segura la incorporación de genes codificantes de resistencia a los antibióticos en plantas y microorganismos. Esta preocupación tiene una significación particular para las plantas alimenticias y para aquellos microorganismos que no están diseñados para ser utilizados en un ambiente cerrado (v.g. microorganismos para uso en agricultura), así como para microorganismos que están diseñados para uso en un ambiente cerrado, pero que accidentalmente pueden liberarse desde el ambiente cerrado. Si bien puede demostrarse que estas preocupaciones carecen de fundamento, las mismas pueden conducir sin embargo a restricciones gubernamentales en cuanto al uso de genes de resistencia a los antibióticos, v.g., en las plantas, y por consiguiente es deseable desarrollar nuevos métodos para selección de células transformadas genéticamente que no sean dependientes de tales genes.
Una desventaja adicional de la selección negativa es que los tejidos o células vegetales tratados con sustancias tóxicas se hacen más sensibles a la infección bacteriana. Esto constituye un problema cuando se utiliza Agrobacterium como vector de transformación, dado que los tejidos o células tratados llegan a veces a cubrirse de bacterias, aun cuando se utilicen antibióticos para prevenir el crecimiento bacteriano.
Adicionalmente, la selección de células o tejidos utilizando selección negativa requiere una temporización muy precisa de la expresión de los genes introducidos en relación con el proceso de selección. Si las células transgénicas se tratan con un compuesto tóxico antes que se exprese el gen destoxificante o antes que se haya producido una cantidad suficiente de productos génicos para antagonizar la acción del compuesto tóxico, las células transgénicas serán destruidas junto con las células no transgénicas. Si la selección se realiza demasiado tarde, la selección de células o tejidos transgénicos puede verse impedida, v.g. por formación de brotes de las células o tejidos no transgénicos.
Las desventajas anteriores se eliminan por el método de acuerdo con la presente invención (denominado "selección positiva"), que, por primera vez, hace posible identificar y aislar células vegetales transformadas genéticamente sin deterioro o destrucción de las células no transformadas contenidas en la población y sin co-introducción de genes de resistencia a antibióticos o herbicidas. Adicionalmente al hecho de que se elimina la necesidad de genes de resistencia a antibióticos o herbicidas, se ha demostrado que el método de selección positiva de acuerdo con la presente invención es a menudo mucho más eficiente que la selección negativa tradicional. Como se describe más adelante en los ejemplos, el número de brotes transgénicos seleccionados de discos de hoja de tabaco utilizando selección positiva es, v.g., del orden de 30 veces mayor que el número de brotes seleccionados utilizando un método tradicional de selección negativa basado en kanamicina, y una combinación de selección positiva y negativa dio una frecuencia de selección de brotes transgénicos aproximadamente diez veces mayor que la obtenida utilizando selección negativa sola (véase el Ejemplo 11). Adicionalmente, el uso de selección positiva proporciona la ventaja de que puede utilizarse un solo gen como gen informador y como gen de selección, dando como resultado una simplificación de las construcciones de vectores, construcciones más estables y una correlación de 100% entre la expresión de los genes informador y de selección. La selección positiva elimina también los problemas mencionados anteriormente en lo referente a temporización, dado que los compuestos que resultan de la selección se producirán siempre como consecuencia de la expresión génica. Así pues, el compuesto selectivo se acumulará cuando se expresa el gen de selección, apareciendo el efecto de selección cuando se ha producido una cantidad suficiente del compuesto selectivo.
Métodos de observación de la actividad génica en el interior de células transformadas se han dado a conocer previamente en la técnica anterior.
Jefferson R.A. (1989) Nature, Vol. 342, 837-838, expone el uso de GUS y el sistema de glucuronido-permeasa como sistema de observación para células vegetales transformadas. Jefferson se refiere específicamente a la hidrólisis del sustrato X-Gluc y la detección del producto del colorante azul índigo en células vegetales transformadas que contienen el constructo génico promotor 35S-gus A.
La Patente de EE.UU. 4.857.467 expone la transformación de cepas de levadura del género Pichia con fragmentos de DNA que codifican funciones génicas de las que carece el huésped o en las cuales es deficiente el huésped. Las células de levadura transformadas son capaces de desarrollarse sobre una fuente de carbono y energía, lo que requiere la expresión de la función génica proporcionada por el fragmento de DNA.
El documento WO 89/03880 expone la transfección de células huésped con un gen codificante de la glucuronido-permeasa. El sistema puede utilizarse junto con fusiones del gen GUS.
Ninguno de los documentos de la técnica citados expone da a conocer un método para selección de células vegetales transformadas sobre la base de la presencia de una secuencia de nucleótidos particular introducida como la propuesta dentro del alcance de la presente invención.
Breve exposición de la invención
Un aspecto de la presente invención se refiere a un método para seleccionar células vegetales transformadas genéticamente a partir de una población de células, en el que las células vegetales genéticamente transformadas se transforman con una secuencia de nucleótidos expresable deseada que contiene una secuencia reguladora que permite su expresión en las células transformadas y una secuencia de nucleótidos expresable co-introducida que también contiene una secuencia reguladora que permite su expresión en las células transformadas, método que comprende suministrar a dicha población un compuesto que puede ser metabolizado por el producto de expresión de la secuencia de nucleótidos expresable co-introducida que se ha introducido con la secuencia de nucleótidos expresable deseada en dichas células transformadas, a fin de proporcionar a las células transformadas una ventaja fisiológica cuando se comparan con las células no transformadas, en el cual el compuesto no es un antibiótico o herbicida, y no tiene efecto desfavorable directo alguno sobre las células no transformadas.
En una realización, el método se lleva a cabo cultivando la población de células sobre o en el interior de un medio que contiene al menos un compuesto inactivo o nutriente que está activado directa o indirectamente en las células que contienen la secuencia de nucleótidos co-introducida y la secuencia de nucleótidos deseada, siendo el compuesto o nutriente inactivo en las células no transformadas o menos activo en las células no transformadas que en las células transformadas, de tal manera que se proporciona a las células transformadas una ventaja selectiva que permite que las mismas se seleccionen a partir de la población de células.
En otra realización, el método se lleva a cabo cultivando la población de células sobre o en el interior de un medio que contiene al menos un compuesto o nutriente que se pone a disposición de las células transformadas por expresión o transcripción de la secuencia de nucleótidos co-introducida o la secuencia de nucleótidos deseada, no estando disponible el compuesto o nutriente para las células no transformadas o estando menos disponible para las células no transformadas que para las células transformadas, de tal manera que se proporciona a las células transformadas una ventaja selectiva que permite que las mismas se seleccionen a partir de la población de células.
En una realización adicional, la expresión de la secuencia de nucleótidos co-introducida conduce a un aumento en la actividad de una enzima que se encuentra endógenamente en la población de células, de tal manera que la actividad de la enzima en las células transformadas es mayor que la actividad de la enzima en las células no transformadas.
Compuestos que son adecuados para uso en el método anterior son aquéllos que tienen la fórmula general I
1
en la cual
R^{2}
es H, CH_{3}, S-CH_{3}, SO_{2}-CH_{3}, SCH_{2}-fenilo, SH, OH, Cl o un grupo -S-R^{10}, -NH-R^{10} o -O-R^{10}, donde
R^{10}
es un grupo \beta-D-glucopiranuronosilo [cuya estructura resulta evidente a partir de los ejemplos prácticos dados en esta memoria] o una de sus sales o derivado éster o amida del mismo en la función ácido carboxílico,
R^{6}
es bencilo que puede estar sustituido en el anillo fenilo con OH, alcoxi C_{1-6}, halógeno, alquilo C_{1-4}, NH_{2} o CF_{3}, o con -O-R^{10}, -S-R^{10}, o -NH-R^{10}, donde
R^{10}
es como se ha definido anteriormente; alquilo C_{1-8} o alquenilo C_{2-8} que puede estar sustituido con 1 a 3 grupos hidroxi, glucosiloxi o alcoxi C_{1-6}, con fenilo y/o con -O-R^{10}, -S-R^{10} o -NH-R^{10}, donde R^{10} es como se ha definido anteriormente; alquilo C_{1-6} o alquenilo C_{2-6} esterificados; furfurilo, o ciclohexilureído, fenilureído o tolilureído;
o bien \hskip0,5cm i)
R^{7} e Y son semienlaces que forman juntos un enlace,
ii)
uno de R^{3} y R^{9} es H o un grupo R^{10} como se ha definido anteriormente, y el otro es un semi-enlace que junto con un semi-enlace X forma un enlace, o R^{9} es ribosilo, 5'-fosforribosilo, glucosilo o -CH_{2}CH(NH_{2})COOH y R^{3} es semi enlace que junto con el semi-enlace X forma un enlace, y
iii)
R^{8} es H, CH_{3}, S-CH_{3}, SO_{2}-CH_{3}, SCH_{2}-fenilo, SH, OH, Cl o un grupo S-R^{10}, -NH-R^{10}, o -O-R^{10}, donde R^{10} es como se ha definido anteriormente,
o bien \hskip0,5cm iv)
R^{7} es ribosilo, 5'-fosforribosilo o glucosilo, R^{8} es H, R^{9} e Y son semi-enlaces que forman juntos un enlace y R^{3} es un semi-enlace que junto con el semi-enlace X forma un enlace;
con la condición de que uno de R^{2}, R^{3}, R^{6}, R^{8} y R^{9} es o comprende un grupo \beta-D-glucopiranuronosilo, o una de sus sales o un derivado éster o amida del mismo en la función ácido carboxílico.
Compuestos adicionales que pueden utilizarse en el método anterior son los de la fórmula general II
2
en la cual
R^{1}
es cis -CH=CH-COOH, una de sus sales o un derivado éster del mismo en la función ácido carboxílico, o el derivado amida de cis y/o trans -CH=CH-COOH, y
R^{10}
es como se ha definido anteriormente.
Adicionalmente, en esta memoria se dan a conocer células transformadas genéticamente que han sido seleccionadas de acuerdo con el método anterior, en particular células vegetales, así como plantas, progenie y semillas derivadas de dichas células vegetales transformadas genéticamente.
Exposición detallada de la invención
El término "células" en el contexto de la presente invención tiene por objeto hacer referencia a cualquier tipo de células a partir del cual puedan identificarse y aislarse células individuales transformadas genéticamente utilizando el método de la invención, con inclusión de células vegetales, células animales y microorganismos tales como bacterias, hongos, levaduras, etc. Adicionalmente, el término "células" tiene por objeto también abarcar protoplastos, es decir, el protoplasma de una célula encerrado en una membrana pero sin pared celular. Si bien se contempla que el principio general de la presente invención puede emplearse en cualquier tipo de células, se ha encontrado que el método es particularmente adecuado para la selección de células vegetales transformadas genéticamente.
La expresión "población de células" hace referencia a cualquier grupo de células que se ha sometido a transformación genética y a partir del cual se desea identificar aquellas células que se han transformado genéticamente y aislar las células genéticamente transformadas de las células no transformadas genéticamente. La población puede ser, v.g., un tejido, un órgano o una porción del mismo, una población de células individuales en o sobre un sustrato, v.g., una población de células en solución o suspensión, o un organismo completo, v.g. una planta entera.
El término "selección" se refiere al procedimiento de identificar y/o aislar las células transformadas genéticamente con respecto a las células no transformadas genéticamente, utilizando el método expuesto en esta memoria.
La "secuencia de nucleótidos deseada" puede ser cualquier secuencia de nucleótidos que deba incorporarse en las células en cuestión para producir células transformadas genéticamente. La introducción de secuencias de nucleótidos en vegetales, microorganismos y animales se practica extensamente, y no existe limitación alguna en cuanto a las secuencias de nucleótidos cuya presencia pueda ser detectada por el uso del método de selección positiva descrito en esta memoria. Por el uso de este método, la presencia de la secuencia de nucleótidos deseada en las células transformadas genéticamente puede determinarse sin las desventajas mencionadas anteriormente asociadas a los sistemas tradicionales de selección negativa.
El hecho de que una secuencia de nucleótidos se "co-introduce con" la secuencia de nucleótidos deseada se refiere al hecho de que las dos secuencias de nucleótidos están acopladas una a otra o se introducen juntas por otro modo de tal manera que la presencia de la secuencia de nucleótidos co-introducida en una célula indica que la secuencia de nucleótidos deseada se ha introducido en la célula, es decir si se demuestra que una de las secuencias de nucleótidos se ha introducido, la probabilidad de que la otra se hay introducido también se ve incrementada significativamente. Las dos secuencias de nucleótidos son, así pues, típica aunque no necesariamente, parte del mismo constructo genético y son v.g. introducidas por el mismo vector.
Los métodos descritos en esta memoria pueden utilizarse también cuando la secuencia de nucleótidos co-introducida y la secuencia de nucleótidos deseada se introducen independientemente. Esto puede realizarse, v.g. por utilización de las mismas bacterias para incorporación de ambos genes e incorporación de un número relativamente grande de copias de la secuencia de nucleótidos deseada en las células, por lo cual existe una probabilidad relativamente alta de que las células que se demuestra expresan la secuencia de nucleótidos co-introducida contengan y expresen también la secuencia de nucleótidos deseada. Se espera generalmente que la introducción independiente de dos o más genes que da como resultado la co-expresión de los genes en la misma célula tenga una probabilidad baja, y por consiguiente se espera que las frecuencias de selección mejoradas obtenidas por el método de selección positiva sean especialmente ventajosas en dichos sistemas.
Dado que es necesario que las secuencias de nucleótidos introducidas se expresen en las células transformadas, un constructo genético que contenga las dos secuencias de nucleótidos contendrá típicamente, pero no de manera necesaria, secuencias reguladoras que permitan la expresión de las secuencias de nucleótidos, v.g. promotores y terminadores de la transcripción conocidos. Así pues, la secuencia de nucleótidos co-introducida estará asociada típicamente con un promotor, que puede ser un promotor constitutivo o regulable, y la secuencia de nucleótidos deseada estará asociada también típicamente con un promotor constitutivo o regulable.
Como se ha mencionado anteriormente, el método es particularmente adecuado para la selección de células vegetales transformadas genéticamente, permitiendo por ello la identificación y el aislamiento de dichas células sin el uso de genes de selección codificantes de resistencia a antibióticos o herbicidas. Como en el caso de los métodos de selección negativa tradicionales, el método de selección positiva descrito en esta memoria puede utilizarse para seleccionar células in vitro. Sin embargo, el método de selección positiva puede emplearse también in vivo. El uso del método de selección positiva in vivo es particularmente importante, v.g. en conexión con la transformación genética realizada sobre plantas enteras o sobre partes de plantas, en las cuales las plantas o partes de plantas comprenden células tanto transformadas como no transformadas, dado que la selección de las células transformadas se realiza sin dañar directamente las células no transformadas vecinas. Las células transformadas tienen por tanto una "ventaja" selectiva comparada con las células no transformadas (v.g. la capacidad de formar brotes), pero las células no transformadas no presentan ninguna desventaja grave en el sentido de resultar dañadas o destruidas, como sucede con la selección negativa que utiliza antibióticos o herbicidas.
El "compuesto o nutriente inactivo" puede ser cualquier compuesto o nutriente en forma inactiva o precursora, es decir que en ausencia de la expresión de la secuencia de nucleótidos co-introducida existe en una forma que es en esencia biológicamente inactiva con respecto a las células en cuestión, pero que, cuando la secuencia de nucleótidos co-introducida se expresa o transcribe, se hidroliza o se activa o metaboliza de algún otro modo a fin de proporcionar a las células transformadas genéticamente que contienen la secuencia de nucleótidos deseada una ventaja selectiva, permitiendo con ello que las mismas sean identificadas y aisladas. Así pues, el compuesto o nutriente inactivo puede ser v.g. un regulador del crecimiento vegetal inactivo, por ejemplo una citoquinina, auxina, o giberelina inactivada, una vitamina, v.g. tiamina inactivada, un carbohidrato (v.g. manosa, cuando la secuencia de nucleótidos co-introducida codifica manosa-6-fosfato-isomerasa, o galactosa o un compuesto que contiene galactosa, cuando la secuencia de nucleótidos co-introducida codifica UDP-galactosa-4-epimerasa), un compuesto nitrogenado (v.g. una opina, cuando la secuencia de nucleótidos co-introducida codifica una enzima de metabolismo o transporte de opina), almidón, una proteína, u otro nutriente en forma inactiva, o un compuesto que tiene una función esencial durante la diferenciación y desdiferenciación de células y tejidos. El tratamiento de células y tejidos con compuestos que inducen dependencia de la adición suplementaria de compuestos esenciales puede utilizarse también junto con los compuestos inactivos correspondientes. Este método puede, v.g., utilizarse cuando se inhibe la síntesis de esterol o saponina y se añaden esteroles o saponinas inactivos. El compuesto inactivo puede ser adicionalmente v.g. un mineral que se encuentra en forma de quelato y por consiguiente está disponible para las células transformadas genéticamente.
En contraste con la selección negativa tradicional, en la que las células no transformadas son dañadas o destruidas debido a la presencia de un antibiótico, herbicida o toxina en el sustrato, los compuestos o nutrientes inactivos utilizados en el método de selección positiva de la presente invención no tienen ningún efecto desfavorable directo sobre las células no transformadas. En lugar de ello, se confiere a las células transformadas una ventaja fisiológica que permite que las mismas sean identificadas y aisladas, mientras que las células no transformadas no se ven afectadas como tales o son menos afectadas por la presencia del compuesto o nutriente inactivo utilizado para fines de selección.
Los métodos tradicionales de "selección negativa" se caracterizan, así pues, por el uso de un gen de selección que reduce el efecto negativo de un compuesto añadido sobre las células transformadas. En contraste, la expresión "selección positiva" tal como se utiliza en el contexto de la presente invención, se refiere al uso de un gen de selección que produce o aumenta un efecto positivo de un compuesto añadido sobre las células transformadas.
La selección con empleo de este método se realiza por consiguiente haciendo que un compuesto esté disponible para las células transformadas, mientras que el compuesto no está disponible o está menos disponible para las células no transformadas. El compuesto o nutriente en cuestión puede ser del mismo tipo que cualquiera de los mencionados anteriormente, consistiendo la diferencia en que el compuesto o nutriente en este caso es transportado en el interior de las células transformadas además de ser activado en las células transformadas.
Ejemplos de compuestos que pueden ejercer un efecto fisiológico después de su entrada en la célula, pero que no son absorbidos fácilmente en la célula o en un compartimiento celular, son compuestos fuertemente hidrófilos o hidrófobos, en particular compuestos cargados, moléculas grandes tales como polímeros, en particular proteínas, péptidos, oligo- y polisacáridos, con inclusión de hormonas vegetales, metabolitos fosforilados tales como carbohidratos fosforilados, vitaminas fosforiladas, nucleósidos fosforilados, con inclusión de citoquininas, y compuestos que están conjugados con carbohidratos o aminoácidos que contienen ácido carboxílico, con inclusión de conjugados de hormonas vegetales.
La "ventaja selectiva" poseída por las células transformadas puede ser cualquier diferencia o ventaja con relación a las células no transformadas que permita que las células transformadas sean identificadas y aisladas fácilmente a partir de las células no transformadas. Esto representará típicamente una diferencia o ventaja que permite que las células transformadas se identifiquen por medios visuales sencillos, es decir, sin el empleo de un ensayo separado para determinar la presencia de un gen marcador.
Cuando un polipéptido codificado por la secuencia de nucleótidos co-introducida activa directamente un compuesto inactivo o nutriente en las células transformadas, las células no transformadas pueden contener o producir en ciertos casos una determinada cantidad del polipéptido en cuestión. Por ejemplo, cuando el polipéptido de activación es una enzima, las células no transformadas pueden contener cierta actividad de la enzima nativa, siendo la enzima nativa del mismo tipo que la enzima de activación introducida. En tales casos, el "compuesto inactivo o nutriente" no precisa ser de modo necesario completamente inactivo en las células no transformadas, dado que puede ser suficiente que el compuesto o nutriente sea sencillamente menos activo en un grado sustancial en las células no transformadas que en las células transformadas. Dicho de otro modo, una diferencia cualitativa entre las células transformadas y las células no transformadas con relación a la activación del compuesto inicialmente inactivo o nutriente puede ser suficiente en ciertos casos para propósitos de selección. En dichos casos, pueden añadirse inhibidores o sustratos que compitan con las enzimas nativas. Son especialmente adecuados inhibidores activados por la enzima nativa, dando como resultado la producción autocatalítica del inhibidor activo a un nivel para el cual la enzima nativa está inhibida prácticamente por completo.
El polipéptido de activación codificado por la secuencia de nucleótidos co-introducida no está limitado a ningún polipéptido particular, y será por supuesto uno que es activo, directa o indirectamente, en relación con el compuesto o nutriente particular a activar en las células transformadas genéticamente. El polipéptido es particularmente a menudo una enzima.
Una enzima que se ha encontrado adecuada para la selección de células vegetales transformadas genéticamente es la \beta-glucuronidasa ("GUS"), realizándose la selección utilizando un compuesto glucurónido que comprende un regulador de crecimiento de las plantas que es escindido por la \beta-glucuronidasa, v.g. un glucurónido de citoquinina (cuyo significado será evidente a partir de los ejemplos dados en esta memoria). Es sorprendente que la selección de células vegetales transformadas genéticamente pueda conseguirse utilizando un gen GUS, dado que se ha encontrado en conexión con la presente invención que las plantas superiores poseen actividad de GUS nativa. Este descubrimiento está en contraste con lo que se ha publicado previamente. Así, el documento GB 2 197 653-A afirma que las plantas superiores no contienen actividad detectable alguna de \beta-glucuronidasa e implica por consiguiente que, dado que no se encuentra actividad de GUS en las plantas superiores, es una cuestión relativamente sencilla controlar la expresión de una construcción génica de interés utilizando el gen GUS. Sin embargo, como se explica más adelante (véanse los ejemplos), esto no es cierto, y el uso de un gen GUS para observar la presencia de un gen de interés no es en absoluto simple o sencillo, debido al hecho de que las plantas superiores contienen realmente una actividad intrínseca significativa (de fondo) de \beta-glucuronidasa.
Así, para la selección de células vegetales transformadas genéticamente, la población de células puede cultivarse sobre o en el interior de un medio que contiene un glucurónido de citoquinina que en las células transformadas es escindido por la \beta-glucuronidasa, liberando con ello citoquinina libre y conduciendo a la inducción de brotes y/o callo en las células transformadas.
Se han desarrollado cierto número de nuevos compuestos glucurónidos de citoquinina para los propósitos de la presente invención. La preparación de estos compuestos, así como su uso para selección positiva de células transformadas genéticamente se describe en detalle más adelante.
En ciertos casos puede ser deseable modificar el método básico descrito en esta memoria, v.g. para proporcionar una selección más eficaz o simplificar el procedimiento de selección. Cuando el compuesto inactivo utilizado para el procedimiento de selección positiva es uno que es escindido por la \beta-glucuronidasa, el método básico puede modificarse por diversos medios para producir un mejor resultado. Uno de estos medios es el uso de ciertos compuestos glucurónidos de esterol, v.g. colesteril-\beta-D-glucurónido o \beta-sitosteril-\beta-D-glucurónido, junto con un compuesto inhibidor de la síntesis de esteroles tal como tridemorf (4-tridecil-2,6-dimetil-morfolina). Los Ejemplos 5 y 6 siguientes describen el uso de tales compuestos. Se cree que por el uso de un inhibidor de la síntesis de esteroles junto con glucurónidos de esterol que contrarrestan el efecto del inhibidor de la síntesis de esteroles sobre la hidrólisis por la \beta-glucuronidasa, puede evitarse la denominada "alimentación cruzada" (es decir, la difusión del compuesto activado desde la célula en la que está activado a otra célula) durante el proceso de selección, dado que los compuestos esterólicos no se difunden de célula a célula cuando se escinde el resto hidrófilo del glucurónido. Así, se obtiene un efecto más localizado. Pueden obtenerse resultados correspondientes con un gran número de otros glucurónidos que contienen una aglicona hidrófoba.
Como se ha explicado con anterioridad, se ha encontrado que, en contraste con lo que ha sido publicado previamente, las plantas superiores poseen de hecho actividad de GUS nativa. Por esta razón, la mera introducción de un gen GUS en una planta puede no ser necesariamente suficiente para obtener la selección deseada de las células transformadas genéticamente, y puede ser necesario o deseable reducir cualquier actividad de \beta-glucuronidasa nativa en la población de células. Dado que una \beta-glucuronidasa introducida puede tener propiedades diferentes que una \beta-glucuronidasa nativa, una reducción de cualquier actividad de \beta-glucuronidasa nativa puede realizarse de maneras diferentes, v.g. por adición al medio de cultivo de un compuesto inhibidor de \beta-glucuronidasa que tenga más efecto inhibidor sobre la \beta-glucuronidasa nativa que sobre la \beta-glucuronidasa codificada por el nucleótido o subsecuencia del mismo. Un tipo de compuesto de esta clase es una sal de amonio.
La actividad de \beta-glucuronidasa nativa en la población de células puede reducirse también sustancialmente por adición al medio de cultivo de un compuesto que, por hidrólisis, da como resultado un producto que inhibe la actividad de la \beta-glucuronidasa nativa, y que inhibe preferiblemente la actividad de la \beta-glucuronidasa nativa más de lo que es inhibida la actividad de la \beta-glucuronidasa introducida. Esto puede realizarse de una manera autorregulada o localizada, v.g. localizada a compartimientos específicos en los cuales el gen GUS introducido está localizado o no está localizado. Un ejemplo de un producto de hidrólisis que inhibe la \beta-glucuronidasa nativa es el ácido glucurónico, v.g. resultante de la hidrólisis del ácido glucirricínico o de esteril-glucurónidos.
La actividad de \beta-glucuronidasa nativa en la población de células puede reducirse ulteriormente por adición al medio de cultivo de un inhibidor de \beta-glucuronidasa, en particular un b-glucurónido que en las células sin un gen de \beta-glucuronidasa introducido inhibe la actividad de \beta-glucuronidasa más que en las células que tienen un gen de \beta-glucuronidasa introducido. Este puede ser, v.g., un sustrato pobre en \beta-glucuronidasa (un glucurónido) que tenga una afinidad mayor para la \beta-glucuronidasa nativa que para la \beta-glucuronidasa introducida.
La \beta-glucuronidasa codificada por el gen de \beta-glucuronidasa introducido utilizado para los propósitos de la presente invención es activa en un intervalo de pH relativamente amplio, mientras que la \beta-glucuronidasa nativa encontrada en una diversidad de especies de plantas diferentes es únicamente activa dentro de un intervalo de valores de pH relativamente estrecho, que de manera típica es aproximadamente pH 4-5 (véase el Ejemplo 3 más adelante). La actividad de \beta-glucuronidasa nativa puede reducirse por consiguiente en este caso por adición al medio de cultivo de un glucurónido que es susceptible de ser hidrolizado por la \beta-glucuronidasa nativa y que, por hidrólisis, da como resultado un aumento de pH, v.g. o-cumaril-glucurónido.
Dado que se ha encontrado que la \beta-glucuronidasa nativa de las plantas es generalmente activa a un pH de aproximadamente 4-5, la actividad de \beta-glucuronidasa nativa puede reducirse también por adición al medio de cultivo de un compuesto regulador del pH que proporcione al medio de cultivo un pH comprendido entre aproximadamente 5,5 y 8,5, de modo preferible entre aproximadamente 6,0 y 8,0, v.g. entre aproximadamente 6,5 y 7,5, o un compuesto regulador del pH que eleve el pH en las células o en compartimientos de las células a un valor de pH comprendido dentro de estos intervalos. A estos valores de pH, la \beta-glucuronidasa codificada por gen GUS introducido es activa, pero la \beta-glucuronidasa nativa es sustancialmente inactiva. Un ejemplo de un compuesto regulador del pH que puede utilizarse es una sal de amonio o un compuesto liberador de amonio, v.g., nitrato de amonio.
Por último, la actividad de \beta-glucuronidasa nativa puede reducirse o eliminarse sustancialmente por un tratamiento físico tal como un tratamiento térmico, v.g. utilizando una temperatura comprendida en el intervalo de 50-65ºC en forma de un tratamiento mediante pulsos breves de aproximadamente 1-2 días antes de la transferencia al sustrato de selección y/o la utilización de una temperatura comprendida en el intervalo de 30-45ºC durante la selección (véase el Ejemplo 10).
La transformación genética de células vegetales se realiza a menudo utilizando cepas de Agrobacterium, en particular cepas de Agrobacterium tumefaciens. Se ha encontrado que ciertas cepas desarmadas de Agrobacterium inducen la formación de brotes debido a la producción de sustancias inductoras de brotes durante el co-cultivo, y cepas de este tipo deberían evitarse normalmente cuando vaya a emplearse la hidrólisis por GUS de los glucurónidos de citoquinina para propósitos de selección de células transformadas genéticamente. Así pues, la transformación genética de las células utilizando un glucurónido de citoquinina como compuesto inactivo se realiza preferiblemente utilizando una cepa de Agrobacterium que no produce citoquininas u otros compuestos inductores de brotes (crecimiento), o que produce solamente una cantidad insustancial de dichos compuestos, eliminando o reduciendo sustancialmente por ello la inducción del crecimiento de brotes debido a la presencia de bacterias vivas sobre o en el interior de las células.
En ciertos casos, v.g. cuando se desea una frecuencia de selección incrementada, puede ser ventajoso que la secuencia de nucleótidos deseada se introduzca conjuntamente con al menos dos genes de selección diferentes. El gen de selección adicional puede ser un gen adicional que codifique una enzima (u otro polipéptido o proteína) adecuada para selección positiva de acuerdo con la presente invención, o puede ser un gen que codifique una enzima (u otra proteína o polipéptido) adecuada para selección negativa tradicional, v.g. que codifique resistencia a una toxina, antibiótico o herbicida. De este modo, pueden seleccionarse células transformadas genéticamente utilizando una combinación de selección positiva y selección negativa, co-introduciéndose adicionalmente la secuencia de nucleótidos deseada en las células transformadas genéticamente con una subsecuencia que codifique resistencia al menos a una toxina, antibiótico o herbicida, comprendiendo el medio al menos un tóxico, antibiótico o herbicida al cual son resistentes las células transformadas.
Como se ha mencionado anteriormente, en un aspecto de la presente invención se dan a conocer células transformadas genéticamente que se han seleccionado de acuerdo con el método anterior, en particular células vegetales, así como plantas, progenie o semillas derivadas de dichas células vegetales transformadas genéticamente. En particular, es a menudo ventajoso que estas células son células vegetales transformadas genéticamente cuyo genoma no contiene como marcador de selección una secuencia de nucleótidos introducida (es decir no nativa) codificante de resistencia a toxinas, antibióticos o herbicidas. Como se ha explicado anteriormente, existen preocupaciones acerca de si es seguro incorporar genes codificantes de v.g. resistencia a los antibióticos, v.g., en las plantas alimenticias. Las células vegetales transformadas genéticamente seleccionadas por el método de la presente invención que no contienen genes de selección para v.g. resistencia a antibióticos, así como plantas, progenie y semillas derivadas de dichas células, son por consiguiente claramente ventajosas desde este punto de vista.
Síntesis de compuestos de la fórmula general I de acuerdo con la invención
Diversos métodos de mayor o menor generalidad están disponibles para la síntesis de los glucurónidos de citoquinina abarcados por la fórmula general I, y a continuación se describen dos de los que se consideran como los mejores de dichos métodos:
A) Oxidación del D-glucosido de citoquinina correspondiente. En este método, el grupo -CH_{2}OH unido al anillo de piranosa del \beta-D-glucosido correspondiente al glucurónido en cuestión se oxida a una función carboxilo en condiciones apropiadas. Probablemente, el mejor método de conseguir esta reacción de oxidación de una manera directa y altamente selectiva es la oxidación catalítica por el oxígeno, utilizando convenientemente negro de platino o platino sobre carbono como catalizador y empleando un medio de reacción débilmente básico (pH 8-10) acuoso o acuoso-alcohólico (por ejemplo acuoso-etanólico); la reacción puede llevarse a cabo adecuadamente a una temperatura comprendida en el intervalo de 60-100ºC durante un período de tiempo de 2 a 24 horas. Puede ser también aplicable la oxidación (generalmente no catalítica) por agentes oxidantes convencionales distintos del oxígeno, pero se prevé que las reacciones de oxidación resultantes darán, en general, rendimientos más bajos y tendrán una especificidad más deficiente; [es decir, conducirán a mezclas de productos de oxidación - a no ser que se tomen particularmente medidas para proteger otras funcionalidades oxidables del material de partida glucosídico por la introducción de grupos protectores apropiados (véase más adelante)].
Un ejemplo del método de oxidación catalítica es proporcionado por el Método 1 del Ejemplo 1C en la presente solicitud, en el cual N^{6}-benciladenina-9-\beta-D-glucopiranosido (BA9G) se oxida a ácido N^{6}-benziladenina-9-\beta-D-glucopiranurónico (que se aísla subsiguientemente como la sal de sodio) por oxidación con oxígeno en presencia de negro de platino. Este método parece ser de aplicabilidad bastante general para la síntesis de 9-glucurónidos de citoquinina a partir de los 9-glucosidos correspondientes. Se ha encontrado también satisfactorio para la síntesis de, por ejemplo, zeatin-o-glucurónido (véase el Ejemplo 1G de esta memoria) a partir del zeatin-O-glucosido correspondiente; el zeatin-O-glucurónido es un ejemplo de un compuesto de fórmula I de acuerdo con la invención en el cual el resto glucurónido es un sustituyente en un resto R^{6} - como se define en esta memoria - del tipo alquenilo C_{2-8}, y se cree que el método en cuestión tiene una aplicabilidad bastante amplia para otros glucurónidos de citoquinina de acuerdo con la invención en los cuales un resto O-glucurónido se encuentra como sustituyente en un grupo R^{6} que es uno de los tipos siguientes que se definen en conexión con la fórmula general I: un grupo bencilo; un grupo alquilo C_{1-8} o alquilo C_{1-8} sustituido; un grupo alquenilo C_{2-8} o un grupo alquenilo C_{2-8} sustituido.
Este método no parece, sin embargo, ser aplicable generalmente, por ejemplo, a la síntesis de 3-glucurónidos de citoquinina.
Como ya se ha indicado, está claro que cuando se aplica un método que implica oxidación de un glucosido de citoquinina, cualesquiera otros grupos funcionales oxidables (en las condiciones de oxidación de que se trate) que pueden estar presentes en el glucosido de citoquinina de partida y que deban permanecer inalterados en el glucurónido final de fórmula I tienen que ser protegidos por el establecimiento previo de grupos protectores adecuados. Ejemplos de grupos potencialmente oxidables que pueden estar presentes en compuestos comprendidos dentro de la definición de la fórmula I son [con referencia a sus posiciones como se especifican en conexión con la fórmula general I (véase anteriormente)]: un grupo -SH que puede estar presente como un grupo R^{2} y/o R^{8}; grupos hidroxi o glucosiloxi que pueden estar presentes como sustituyentes en los grupos R^{6} del tipo alquilo C_{1-8} sustituido o del tipo alquenilo C_{2-8} sustituido; y grupos ribosilo, 5'-fosforribosilo o glucosilo que pueden estar presentes como grupos R^{9} o R^{7}. Si, por ejemplo, es necesario proteger grupos hidroxi alifáticos (alcohólicos), tales como grupos hidroxi en átomos de carbono secundarios en los grupos ribosilo, 5'-fosforribosilo o glucosilo, grupos protectores adecuados serán a menudo, v.g., grupos acetilo que pueden introducirse por métodos que son bien conocidos por los expertos en la técnica y que pueden eliminarse, después del procedimiento de oxidación, por hidrólisis alcalina.
Sin embargo, cuando se utiliza el método de oxidación catalítica suave descrito anteriormente, los grupos hidroxi en átomos de carbono alifáticos primarios son, en general, susceptibles de oxidación, mientras que los grupos hidroxi en átomos de carbono secundarios (y terciarios) generalmente no lo son; así, en la oxidación del resto -CH_{2}OH en la posición 5 del anillo de glucopiranosa de un \beta-D-glucosido de citoquinina de esta manera, los grupos hidroxi existentes en las posiciones 2, 3 y 4 del anillo de glucopiranosa no requerirán generalmente protección. Un grupo -SH que deba estar presente como grupo R^{2} o R^{8} requerirá, en cambio, protección durante esta oxidación catalítica, y un grupo -SH de este tipo puede protegerse adecuadamente como el derivado de bencilo (véase más adelante en conexión con el método B descrito posteriormente).
Numerosos glucosidos de citoquinina apropiados para uso como materiales de partida en este método están disponibles comercialmente; por ejemplo, una gran diversidad de éstos pueden obtenerse de Apex Organics Ltd., Leicester, Inglaterra, y algunos 9-glucosidos de citoquinina pueden obtenerse de Sigma Chemical Company, P.O. Box 14508, St. Louis, MO 63178, EE.UU. Los glucosidos de citoquinina pueden prepararse también por métodos establecidos publicados en la bibliografía. Por ejemplo, la síntesis de una diversidad de 9-glucosidos de citoquinina apropiados que tienen grupos R^{6} abarcados dentro de la presente definición de los mismos puede lograrse por extensión directa del método publicado por Cowley et al. [Aust. J. Chem. 31 (1978) 1095] para la síntesis de 9-\beta-D-glucopiranosidos de zeatina y N^{6}-benciladenina.
B) Síntesis del tipo Koenigs-Knorr. Este método, que está basado en el método original de W. Koenigs y E. Knorr [Chem. Ber. 34 (1901) 957], implica la reacción de (2,3,4-tri-O-acetil-\alpha-D-glucopiranosil-bromuro)uronato de metilo [abreviado MBTG; un método adecuado para su preparación ha sido descrito por Bollenback et al., J. Amer. Chem. Soc. 77 (1955) 3310] con un grupo hidroxi alcohólico o fenólico, un grupo mercapto (-SH) o un átomo de nitrógeno en el anillo en un resto aromático o heterocíclico insaturado.
Este enfoque proporciona probablemente el método de aplicación más general para la síntesis de glucurónidos de citoquinina de acuerdo con la invención (o de glucurónidos de precursores que pueden convertirse después fácilmente en los glucurónidos de citoquinina deseados), partiendo de citoquininas apropiadas [o precursores de citoquinina (véase más adelante)], y se cree que es de aplicabilidad muy general en la preparación de los compuestos abarcados dentro de la fórmula general I.
El procedimiento general es como sigue: la citoquinina o el precursor de citoquinina apropiado(a) (véase más adelante), disuelto(a) en un disolvente tal como N,N-dimetilformamida (DMF), quinolina, carbonato de propileno, metanol o éter dietílico, se deja reaccionar con 1,25-2 equivalentes molares de MBTG a una temperatura comprendida en el intervalo de 25-100ºC durante un período de 3 a 96 horas, preferiblemente en presencia de un agente de barrido de haluro (bromuro) añadido tal como óxido de plata o carbonato de plata (cuando se emplea, por ejemplo, DMF como disolvente, el propio disolvente funciona a menudo adecuadamente como agente de barrido de haluro, en cuyo caso no es esencial la adición de un agente de barrido ulterior). Esta reacción produce el éster metílico del glucurónido peracetilado intermedio, que generalmente se aísla y se purifica; esto puede realizarse convenientemente, por ejemplo, (i) por evaporación del disolvente, seguida por extracción del residuo con un disolvente tal como cloroformo, eliminación del último disolvente del extracto y purificación del compuesto intermedio bruto resultante por técnicas de recristalización y/o cromatografía en columna convencionales; o, por ejemplo, (ii) por separación del compuesto intermedio a partir de la mezcla de reacción mediante cromatografía en columna convencional realizada directamente sobre la mezcla de reacción, seguido por eliminación del disolvente de elución a partir de la o las fracciones eluidas de interés y recristalización del producto bruto.
En los casos en que el producto final de fórmula I deseado debe tener el resto glucurónido en la forma amida (glucuronamida), la conversión de la forma de éster metílico peracetilado del resto glucurónido en la forma amida se realiza adecuadamente en esta etapa, y esto puede realizarse generalmente por tratamiento del éster metílico peracetilado (preferiblemente purificado, v.g. de la manera expuesta anteriormente) con una solución de amoníaco anhidro en metanol anhidro a temperatura baja, v.g. una temperatura comprendida entre 0ºC y -10ºC, o - como una posibilidad alternativa - con una solución acuosa concentrada (convenientemente saturada) de amoníaco aproximadamente a la temperatura ambiente, durante un período de 0,5-4 horas. La glucuronamida puede aislarse luego por evaporación de la solución de amoníaco, v.g. a vacío, y recristalización en un disolvente o mezcla de disolventes apropiado(a), tal como etanol acuoso al 90%. Un ejemplo de esta conversión se proporciona en el Ejemplo 1B de esta memoria, en el cual se prepara N^{6}-benciladenina-3-glucuronamida (BA3GNamida) a partir del éster metílico correspondiente.
Adicionalmente, en el caso de procedimientos que parten de ciertos tipos de precursores de citoquinina, una transformación química que es necesaria a fin de convertir el resto precursor de citoquinina en el resto de citoquinina apropiado puede realizarse a menudo sobre el éster metílico antes de proceder a liberar el glucurónido libre. Como ejemplo, la síntesis de citoquinina-9-glucurónidos (cuya síntesis por un método de oxidación catalítica ha sido ya descrita anteriormente) puede realizarse normalmente de manera satisfactoria partiendo de una purina sustituida o no sustituida que tiene un átomo de cloro en la posición 6; el compuesto final clorado en la posición 6 puede convertirse por regla general en el éster metílico del 9-glucurónido peracetilado correspondiente por medio del procedimiento general descrito anteriormente con empleo de MBTG, y el grupo cloro de la posición 6 puede convertirse luego convenientemente en el resto -NH-R^{6} dejando que el producto de la última reacción reaccione con la amina correspondiente (R^{6}-NH_{2}), que por lo general puede generarse adecuadamente in situ a partir del hidrocloruro de amina (R^{6}-NH_{2}\cdotHCl) y un exceso (convenientemente un exceso molar de 2-4 veces) de una base apropiada, v.g. una amina alifática terciaria tal como trietilamina, en un disolvente polar adecuado, tal como un alcohol alifático C_{1-4}, a una temperatura comprendida en el intervalo de 65 a 120ºC. Esto se ilustra por el Método 2 del Ejemplo 1C de esta memoria, en el cual se describe la síntesis de N^{6}-benciladenina-9-glucurónido (BA9GN) (en forma de su sal de sodio) por este método.
Los grupos acetilo en el resto glucurónido se eliminan luego por hidrólisis en medio básico utilizando una base tal como hidróxido de sodio acuoso, hidróxido de sodio acuoso metanólico o etanólico, o amoníaco metanólico a una temperatura comprendida en el intervalo de 0 a 25ºC durante un período de 0,5 a 6 horas. Utilizando una base tal como una de las soluciones de hidróxido de sodio acuosas o alcohólicas mencionadas anteriormente, este procedimiento da - después de neutralización del exceso de base - la forma de sal del glucurónido de citoquinina correspondiente, mientras que el uso de un reactivo tal como amoníaco metanólico y la eliminación subsiguiente del amoníaco en exceso por evaporación conduce a la forma amida del glucurónido. La última se purifica convenientemente por medios convencionales, tales como cromatografía, particularmente cromatografía en fase inversa, y/o recristalización en un disolvente adecuado, tal como un disolvente acuoso orgánico, v.g. etanol acuoso al 80-90%.
Evidentemente, si la citoquinina de partida o el precursor de citoquinina contiene una o más funcionalidades que son capaces de reaccionar con MBTG en las condiciones de reacción en cuestión, y que deben estar presentes inalterados en el glucurónido final de fórmula I, entonces dichas funcionalidades tienen que protegerse por el establecimiento previo de grupos protectores adecuados; ejemplos de dichas funcionalidades reactivas que pueden estar presentes en las citoquininas de partida que conducen a compuestos comprendidos dentro de la definición de la fórmula I son [con referencia a su posición tal como se especifica en conexión con la fórmula general I (véase anteriormente)]: -OH o -SH presente como un grupo R^{2}; -OH o -SH presente como un grupo R^{8}; -OH o -NH_{2} presente como sustituyente en el anillo fenilo de un grupo R^{6} del tipo bencilo sustituido; -OH o grupos glucosiloxi presente(s) como sustituyente(s)
en un grupo R^{6} del tipo alquilo C_{1-8} sustituido o tipo alquenilo C_{2-8} sustituido; grupos ribosilo, 5'-fosforribosilo o glucosilo que pueden estar presentes como grupos R^{9} o R^{7}; y -NH_{2} en un grupo -CH_{2}CH(NH_{2})COOH presente como un grupo R^{9}.
Con respecto a los grupos protectores adecuados para la protección de los ejemplos mencionados anteriormente de funcionalidades reactivas que pueden estar presentes en las citoquininas de partida, un grupo -OH puede protegerse adecuadamente por regla general por introducción de un grupo acetilo (véase anteriormente en conexión con el método de preparación por oxidación de compuestos de fórmula I) a fin de formar el grupo acetoxi (-OOCCH_{3}) correspondiente. Un grupo -SH puede protegerse por regla general muy convenientemente como el derivado benciltioéter (-SCH_{2}C_{6}H_{5}) por introducción de un grupo bencilo [v.g. por reacción con cloruro de bencilo de manera similar a la descrita con mayor detalle más adelante en conexión con los precursores de citoquinina que contienen, al menos formalmente, grupos oxo (=O) o tioxo (=S) en la posición 2, y un grupo oxo en la posición 6 (véase más adelante)]. Un grupo -NH_{2} puede protegerse por regla general convenientemente por conversión en un grupo ftalimido como sigue: la citoquinina o el precursor de citoquinina se calienta con un exceso de anhídrido ftálico en un disolvente relativamente inerte, tal como cloroformo o 1,2-dimetoxietano, a una temperatura comprendida en la región de 70-100ºC durante un período de horas, a menudo de manera conveniente aproximadamente 4 horas. El grupo -NH_{2} puede, después de la realización de la reacción de tipo Koenigs-Knorr, regenerarse subsiguientemente por tratamiento con una solución acuoso-alcohólica (tal como una solución acuoso- etanólica) de hidrazina.
Un grupo de precursores de citoquinina que son particularmente adecuados para uso en la síntesis de glucurónidos de citoquinina de acuerdo con la invención que tienen el resto glucurónido (correspondiente a R^{10} en la fórmula general I) unido como -O-R^{10} o -S-R^{10} en la posición 2 del sistema de anillos de la purina son precursores de citoquinina que contienen, al menos formalmente, grupos oxo (=O) o tioxo (=S) en la posición 2, y un grupo oxo en la posición 6; aquí debería mencionarse que los compuestos de los tipos en cuestión que tienen grupos 2-oxo y 2-tioxo se encontrarán generalmente, al menos en solución, en equilibrio tautómero con los compuestos 2-hidroxi y 2-mercapto correspondientes (estando presente entonces el grupo 6-oxo como un grupo 6-hidroxi), y las formas tautómeras últimas estarán presentes, en general, en una proporción significativa.
El grupo hidroxi o mercapto mencionado últimamente en la posición 2, se convierte, en la fase final del procedimiento de síntesis global, por medio del procedimiento de tipo Koenigs-Knorr, en el grupo -O-R^{10} o -S-R^{10} correspondiente, respectivamente; sin embargo, antes de realizar la secuencia de reacciones del tipo Koenigs-Knorr, el grupo 6-hidroxi se convierte adecuadamente, pasando por su conversión intermedia en un grupo 6-halo (preferiblemente 6-cloro) en el resto -NH-R^{6} que se muestra en la fórmula I, y esto requiere generalmente que el grupo hidroxi o mercapto de la posición 2 se proteja por medio de un grupo protector adecuado durante esta secuencia de conversión. Para estos dos grupos citados, el grupo protector de elección es un grupo bencilo, que puede introducirse normalmente de manera directa por una reacción que implica la adición gradual de un ligero exceso de cloruro de bencilo a una solución o suspensión agitada del precursor de citoquinina en cuestión en una base acuosa (pH típico, aproximadamente 12-13), tal como hidróxido de sodio o de potasio acuoso, aproximadamente a la temperatura ambiente. Después de agitación continuada durante un período de, típicamente, 1-2 horas, la mezcla de reacción se neutraliza por adición de, v.g., ácido acético glacial, y el producto insoluble protegido con bencilo se aísla por filtración.
El grupo 6-hidroxi del derivado de 2-benciloxi- o 2-benciltio-6-purinol resultante se convierte luego en un grupo 6-cloro, utilizando convenientemente un exceso de un reactivo de cloración tal como oxicloruro de fósforo (cloruro de fosforilo) en presencia de una base orgánica, tal como N,N-dietilanilina; la última reacción se realizará normalmente en condiciones de reflujo durante un período comprendido entre aproximadamente 10 minutos y aproximadamente 3 horas.
El grupo 6-cloro puede convertirse luego convenientemente en el resto -NH-R^{6} deseado dejando que el producto de la última reacción reaccione con la amina correspondiente, R^{6}-NH_{2}, que por regla general se generará convenientemente in situ a partir del hidrocloruro de amina (R^{6}-NH_{2}\cdotHCl) y un exceso (convenientemente un exceso molar de 2-4 veces) de una base apropiada, v.g. una amina alifática terciaria tal como trietilamina, en un disolvente polar adecuado, tal como un alcohol alifático C_{1-4} (v.g. 1-butanol), a una temperatura comprendida en el intervalo de 65-120ºC.
Después de aislar el producto, el grupo protector se separa para regenerar el grupo 2-hidroxi o 2-mercapto libre; en el caso de un grupo protector bencilo, esto puede realizarse convenientemente, por ejemplo, por tratamiento del producto con un exceso de sodio en amoníaco líquido.
En el caso de productos que tengan un grupo 2-mercapto en esta etapa, se cree que será generalmente ventajoso convertir el grupo 2-mercapto en una forma de sal (-S^{-}), v.g. la forma de sal de potasio, antes de proceder a introducir el resto glucurónido por medio del procedimiento de tipo Koenigs-Knorr descrito anteriormente. Un ejemplo de un procedimiento adecuado para este propósito se describe en el paso 4 del Ejemplo práctico 1E de esta memoria, y se considera que las condiciones descritas en el mismo son de aplicabilidad bastante general. No obstante, puede ser posible en algunos casos realizar la reacción de tipo Koenigs-Knorr con MBTG (véase más adelante) directamente sin conversión previa del grupo 2-mercapto en la forma de sal.
Por último, el resto glucurónido se introduce por reacción con MBTG como se ha descrito anteriormente en conexión con el procedimiento de tipo Koenigs-Knorr.
Un ejemplo que ilustra la secuencia de los pasos de síntesis descritos anteriormente se da en el Ejemplo 1E para la síntesis de la sal de sodio de N^{6}-(2'-isopentenil)adenina-2-tioglucurónido (IP2SGN) a partir de 2-tioxantina, y se considera que gran parte de la información adicional proporcionada en dicho lugar con relación a la elección de los disolventes para recristalización y extracción, elección de concentraciones y cantidades de reactivos, etc., es de aplicabilidad más general en la realización de la secuencia de reacciones expuestas anteriormente a partir de un precursor de citoquinina que tenga un grupo "2-tioxo" (es decir un grupo 2-mercapto) y un grupo "6-oxo" (es decir, un grupo 6-hidroxi).
Análogamente, un grupo de precursores de citoquinina que son particularmente muy adecuados para uso en la síntesis de glucurónidos de citoquinina de acuerdo con la invención que tienen el resto glucurónido (correspondiente a R^{10} en la fórmula general I) unido como -O-R^{10} o -S-R^{10} en la posición 8 del sistema de anillos de la purina, son precursores de citoquinina que contienen, al menos formalmente (por razones similares a las expuestas anteriormente en conexión con los precursores de citoquinina que tienen un grupo formal 2-oxo o 2-tioxo y un grupo formal 6-oxo), un grupo oxo (=O) o tioxo (=S) en la posición 8, y que tienen adicionalmente un grupo hidroxi en la posición 6. Estos pueden, por regla general, convertirse en el producto final deseado de fórmula I utilizando una secuencia de reacciones (protección, introducción de un grupo cloro en posición 6, introducción del resto -N-R^{6}, desprotección, y por último reacción con MBTG) análogamente a lo expuesto con anterioridad para los glucurónidos de citoquinina que tienen el resto glucurónido unido como -O-R^{10} o -S-R^{10} en la posición 2 del sistema de anillos de la purina. Un ejemplo de esto se proporciona por el Ejemplo 1F de esta memoria para la síntesis de N^{6}-(2'-isopentenil)-adenina-8-tioglucurónido (como la forma de sal de sodio del mismo).
Los compuestos de la fórmula I en al cual el resto glucurónido se encuentra en la forma de ácido carboxílico, pueden, en general, prepararse a partir de la forma de sal correspondiente, v.g. la forma de sal de sodio (preparada de manera ya expuesta anteriormente) por acidificación de una solución agitada o solución/suspensión de la forma de sal en un disolvente apropiado (v.g. un alcohol acuoso, tal como etanol acuoso), preferiblemente a una temperatura inferior a 25ºC, con un ácido mineral tal como ácido clorhídrico a un pH de aproximadamente 2,5. Después de agitar durante unos cuantos minutos, se separa luego el disolvente a vacío. El residuo bruto puede someterse ventajosamente a un tratamiento cromatográfico para separar las sales inorgánicas (véase, v.g., el Ejemplo 1I de esta memoria para detalles de un procedimiento típico y un sustrato cromatográfico adecuado para este propósito), después de lo cual el producto puede recristalizarse en un disolvente apropiado, típicamente un disolvente polar tal como metanol o etanol.
Los compuestos de la fórmula I en la cual el resto glucurónido se encuentra en la forma de éster metílico o éster etílico pueden prepararse generalmente de manera muy conveniente, y con alto rendimiento, por reacción de la forma correspondiente de ácido carboxílico del glucurónido de citoquinina (preparado, por ejemplo, como se ha descrito anteriormente) con diazometano o diazoetano, respectivamente, utilizando condiciones de reacción que son normales para este tipo de reacción y que serán bien conocidas para una persona experta en la técnica.
Numerosas citoquininas y numerosos precursores de citoquinina apropiados para uso como materiales de partida en conexión con el método B) anterior están disponibles comercialmente, en tanto que otros pueden sintetizarse por métodos establecidos publicados en la bibliografía. Por ejemplo, la síntesis de una diversidad de adeninas sustituidas en N^{6} apropiadas que tienen grupos R^{6} abarcados dentro de la presente definición de los mismos pueden producirse por métodos de la bibliografía consignados por Iwamura et al. [Phytochemistry 19 (1980) 1309], y numerosas N^{6}-(2'-isopentenil)adeninas sustituidas en posición 2, 8 y 2,8 que tienen grupos R^{2} y/o R^{8} abarcados dentro de la presente definición de los mismos pueden prepararse como ha sido descrito por Dammann et al. [Phytochemistry 13 (1974) 329].
Compuestos de fórmula I preferidos actualmente son los siguientes:
un compuesto de fórmula I en la cual R^{2} es H, R^{3} es un grupo \beta-D-glucopiranuronosilo o una sal del mismo en la función ácido carboxílico, R^{9} y X son semienlaces que forman juntos en enlace, R^{6} es bencilo, R^{7} e Y son semienlaces que forman juntos un enlace, y R^{8} es H;
un compuesto de fórmula I en la cual R^{2} es H, R^{3} es el derivado amida de un \beta-D-glucopiranuronosilo en la función ácido carboxílico del mismo, R^{9} y X son semienlaces que forman juntos un enlace, R^{6} es bencilo, R^{7} e Y son semienlaces que forman juntos un enlace, y R^{8} es H;
un compuesto de fórmula I en la cual R^{2} es H, R^{3} y X son semienlaces que forman juntos un enlace, R^{9} es un grupo \beta-D-glucopiranuronosilo o una sal del mismo en la posición ácido carboxílico, R^{6} es bencilo, R^{7} e Y son semienlaces que forman juntos un enlace, y R^{8} es H;
un compuesto de fórmula I en la cual R^{2} es H, R^{3} es un grupo \beta-D-glucopiranuronosilo o una sal del mismo en la función ácido carboxílico, R^{9} y X son semienlaces que forman juntos un enlace, R^{6} es 2-isopentenilo, R^{7} e Y son semienlaces que forman juntos un enlace, y R^{8} es H;
un compuesto de fórmula I en la cual R^{2} es un grupo -S-\beta-D-glucopiranuronosilo o una sal del mismo en la función ácido carboxílico, R^{9} es H, R^{3} y X son semienlaces que forman juntos un enlace, R^{6} es 2-isopentenilo, R^{7} e Y son semienlaces que forman juntos un enlace, y R^{8} es H;
un compuesto de fórmula I en la cual R^{2} es H, R^{9} es H, R^{3} y X son semienlaces que forman juntos un enlace, R^{6} es 2-isopentenilo, R^{7} e Y son semienlaces que forman juntos un enlace, y R^{8} es un grupo -S-\beta-D-glucopiranuronosilo o una sal del mismo en la función ácido carboxílico; y
un compuesto de fórmula I en la cual R^{2} es H, R^{3} y X son semienlaces que forman juntos un enlace, R^{9} es H, R^{6} es un grupo de la fórmula
3
o una sal del mismo, R^{7} e Y son semienlaces que forman juntos un enlace, y R^{8} es H.
Síntesis de los compuestos de la fórmula general II de acuerdo con la invención
Los compuestos de fórmula II pueden prepararse directamente utilizando como material de partida el éster metílico de ácido o-cumárico (es decir ácido 3-(2-hidroxifenil)-2-propenoico) preparado fácilmente. El último éster se puede preparar por calentamiento del ácido libre (obtenido, por ejemplo, de Aldrich Chemical Company, Gillingham, Dorset, Inglaterra, bajo el número de catálogo H2,280-9) a reflujo en metanol en presencia de ácido sulfúrico. Debe indicarse aquí que se obtiene una mezcla de las formas cis y trans (con respecto al doble enlace etilénico) del resto. Se cree que la forma trans predomina por regla general inicialmente, con indiferencia del método de preparación. Sin embargo, esto carece de importancia, dado que se ha encontrado que tanto los glucurónidos cis (cumarinilo) como trans (cumarilo) se convierten finalmente en cumarina después de la hidrólisis por GUS, debido al hecho de que el ácido cumárico se convierte lentamente (por medios no enzimáticos; presumiblemente por la acción catalítica de la luz) en cumarina a lo largo de un período de unos cuantos días.
Procedimientos eficientes para la síntesis de los compuestos de fórmula II en la cual (a) R^{1} y R^{10} se encuentran en la forma de ácido carboxílico y (b) R^{1} y R^{10} se encuentran en la forma de amida se describen en detalle en los Ejemplos 1H y 1I, respectivamente, de esta memoria. El o los compuestos de fórmula II en la cual tanto R^{1} como R^{10} se encuentran en la forma de sal de sodio pueden obtenerse adecuadamente por hidrólisis en medio básico del éster metílico del glucurónido peracetilado [preparado (a partir de o-cumarato de metilo) y aislado como en la primera parte del procedimiento de síntesis descrito en el Ejemplo 1I] utilizando hidróxido de sodio metanólico de la manera descrita al comienzo de la segunda parte del procedimiento de síntesis descrito en el Ejemplo 1I; en lugar de ajustar el pH del hidrolizado a 2,5 con ácido clorhídrico como se describe en el Ejemplo 1I, la mezcla se neutraliza sencillamente (a pH aprox. 7) con ácido clorhídrico. La forma de sal de sodio se aísla convenientemente de la mezcla por cromatografía v.g. sobre resina no iónica Amberlite XAD-2, lavando la columna con agua para separar las sales inorgánicas y eluyéndola después, típicamente con metanol. La forma de sal de sodio del glucurónido bruta obtenida por separación del metanol puede recristalizarse luego convenientemente por ejemplo en metanol absoluto. La forma de sal de potasio podrá prepararse también claramente por un procedimiento estrictamente análogo, utilizando, v.g., hidróxido de potasio metanólico en el procedimiento de hidrólisis.
Los compuestos de fórmula II en la cual R^{1} y R^{10} se encuentran ambos en la forma de éster metílico o ambos en la forma de éster etílico se pueden preparar convenientemente por reacción entre diazometano o diazoetano, respectivamente, y el o los compuestos de fórmula II en la cual tanto R^{1} como R^{10} se encuentran en la forma de ácido carboxílico. Las condiciones de reacción para ello serán convenientemente como las descritas con anterioridad para la preparación análoga de las formas éster metílico o etílico de los glucurónidos de citoquinina.
Compuestos preferidos actualmente de la fórmula general II son los siguientes:
un compuesto de fórmula II en la cual R^{1} es cis- y/o trans-2-amidoetenil-[cis- y/o trans-CH=CHCONH_{2}], y R^{10} es el derivado amida de \beta-D-glucopiranuronosilo en la función ácido carboxílico de la misma (2-hidroxicinamil-\beta-D-glucopiranuronamida);
un compuesto de fórmula II en la cual R^{1} es cis-2-carboxi-etenil-[cis -CH=CHCOOH], y R^{10} es un grupo \beta-D-glucopiranuronosilo (ácido 2-hidroxicinamil-\beta-D-glucopiranurónico).
Los ejemplos siguientes ilustran los principios generales de la presente invención en las plantas, utilizando en particular una \beta-glucuronidasa como gen de selección y empleando nuevos sustratos de glucurónido que son susceptibles de ser hidrolizados por este gen. Sobre la base de este trabajo, se considera que genes tales como el gen de \beta-glucuronidasa pueden utilizarse para cierto número de propósitos afines. Así, el gen de \beta-glucuronidasa puede emplearse en un método para obtener un efecto regulador del crecimiento en plantas localizado o específico de los tejidos en una parte de una planta o un tejido de una planta que expresa un gen de \beta-glucuronidasa introducido a un nivel mayor que otras partes o tejidos en la misma planta, comprendiendo el método someter la planta a un compuesto que es susceptible de ser hidrolizado por el gen de \beta-glucuronidasa introducido, de tal manera que el compuesto se hidroliza en la parte o tejido que contiene el gen de \beta-glucuronidasa introducido, liberando de este modo un compuesto regulador del crecimiento en el tejido y conduciendo a un efecto regulador del crecimiento únicamente en esta parte o tejido o conduciendo a un efecto regulador del crecimiento en esta parte o tejido que es mayor que el efecto obtenido en otras partes o tejidos de la planta. Se considera también que puede ser ventajoso emplear reguladores del crecimiento de las plantas tales como citoquininas en la forma de glucurónidos o derivados de glucurónidos en vez de citoquininas libres, v.g. para aprovechar la ventaja del hecho de que aquéllos se transportarían y distribuirían presumiblemente de manera diferente en las plantas en comparación, v.g., con las citoquininas libres o ribosiladas correspondientes.
Análogamente, los ejemplos que siguen sugieren ciertos otros usos para la \beta-glucuronidasa. Uno de éstos es un método in vitro para escrutar e identificar compuestos de la clase de los glucurónidos de citoquinina (o compuestos glucurónidos de otros reguladores del crecimiento de las plantas) que son susceptibles de ser hidrolizados in vivo por un gen de \beta-glucuronidasa introducido. La \beta-glucuronidasa puede utilizarse también en un sistema para escrutinio de compuestos que sean adecuados para uso como agentes de selección en el método de selección positiva expuesto en esta memoria (véase el Ejemplo 2). En los Ejemplos 3 y 12 se describen sistemas que pueden utilizarse para escrutinio de compuestos que inhiban selectivamente una enzima \beta-glucuronidasa nativa en células vegetales sin afectar sustancialmente a la actividad de una enzima codificada por un gen de \beta-glucuronidasa introducido.
Ejemplo 1 Síntesis de compuestos glucurónidos
A continuación se describe la síntesis de cierto número de nuevos compuestos glucurónidos Además de las abreviaturas dadas para cada uno de los compuestos sintetizados individuales, se utilizan las abreviaturas siguientes:
BA
N^{6}-benciladenina
AcOH
ácido acético
DMF
N,N-dimetilformamida
IP
N^{6}-(2-isopentenil)adenina
MBTG
(2,3,4-tri-O-acetil-\alpha-D-glucopiranosil-bromuro)uronato de metilo
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Ejemplo 1A
3-\beta-D-glucopiranuronosil-6-bencilaminopurina, sal de sodio
Sinónimos:
ácido N^{6}-benciladenina-N^{3}-\beta-D-glucopiranurónico, sal de sodio,
\quad
N^{6}-benciladenina-3-glucurónido, sal de sodio
Abreviatura:
BA3GN, sal de sodio
4
Condensación de N^{6}-benciladenina (BA) y (2,3,4-tri-O-acetil-\alpha-D-glucopiranosil-bromuro)uronato de metilo (MBTG)
Se suspendieron BA (12,6 milimoles) y MBTG (15,1 milimoles) (Bollenback et al., 1955, J. Amer. Chem. Soc., Vol. 77, pp. 3310-3315) en N,N-dimetilformamida (DMF) anhidra (50 ml) y se calentaron a 100ºC durante aproximadamente 10 horas. Se separó la mayor parte de la DMF a vacío y el producto bruto se disolvió en cloroformo (300 ml) y se repartió con agua (3 x 300 ml). Después de secado sobre sulfato de magnesio anhidro, el extracto clorofórmico se evaporó a vacío y se recristalizó un jarabe oscuro en etanol. El producto bruto (una mezcla de BA, BA9GN y BA3GN como sus ésteres metílicos peracetilados) se purificó sobre 100 g de sílice compactada en cloroformo, eluyendo con un gradiente de 0-4% de etanol en cloroformo. El éster metílico de peracetil-BA3GN bruto se recristalizó en etanol. Rendimiento: 280 mg de un sólido amorfo incoloro.
El éster metílico de peracetil-BA3GN se hidrolizó por tratamiento con hidróxido de sodio al 5% en etanol acuoso al 50% a la temperatura ambiente. Cinco minutos después que se hubo disuelto el sólido, la mezcla de reacción se neutralizó cuidadosamente con ácido clorhídrico mientras que se enfriaba en hielo. Después de secado a vacío, la sal de sodio de BA3GN bruta se purificó por cromatografía en fase inversa (sobre 100 g de octadecil-sílice) eluyendo con agua (1 l) seguido por metanol acuoso al 20%, seguido a su vez por recristalización en etanol. La sal de sodio de BA3GN pura (150 mg) se obtuvo como un sólido microcristalino incoloro, que se secó a vacío hasta peso constante sobre cloruro de calcio.
Análisis
UV
Etanol A max 227 nm
Etanol/ácido acético A max 291 nm
Etanol/amoníaco A max 227 nm
Estos valores son idénticos a los valores de la bibliografía para BA-3-\beta-D-glucopiranosido y adenina disustituida en N^{3},N^{6}. (N J Leonard, K L Carraway y J P Helgeson, J. Heterocyclic Chem. 1965, 2, 291-297).
Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC, del inglés High Performance Liquid Chromatography)
Se realizó la HPLC utilizando una columna de 10 x 0,46 cm de octadecil-sílice, eluyendo isocráticamente con metanol al 60% que contenía 10% de ácido acético a 1 ml/min. La observación por UV se realizó a 290 nm.
La sal de sodio de BA3GN tenía una pureza de 95+% y un contenido de BA libre estimado como < 0,05%.
Hidrólisis por \beta-glucuronidasa (GUS)
Se incubó sal de sodio de BA3GN (500 \mug) en 500 \mul de tampón de fosfato de sodio 50 mM, pH 7,0, con \beta-glucuronidasa (GUS, Tipo Sigma G7896), 2500 unidades Sigma "Fishman" durante 18 horas a 37ºC. La HPLC (condiciones como las expuestas anteriormente) demostró una eliminación prácticamente completa del pico de BA3GN con producción de un pico que se cromatografiaba conjuntamente en mezcla 1:1 con la BA auténtica. Esto confirma la identidad del producto como un conjugado de BA y ácido \beta-D-glucurónico.
Se obtuvo el análisis siguiente para otra porción de sal de sodio de BA3GN preparada como se ha descrito anteriormente:
UV
Etanol A max 227 nm
HPLC
15 x 0,46 cm de octadecil-sílice, eluida con un gradiente de 20-60% metanol/10% ácido acético durante 30 min a 1 ml/min. Pureza por HPLC 99,5%. Contenido de BA libre < 0,05%.
Cromatografía en capa fina (TLC, del inglés Thin Layer Chromatography)
La sílice se reveló con 1-butanol/ácido acético/agua (12/3/5). Pureza por TLC, 99,5%. Contenido de BA libre < 0,05%.
Hidrólisis por \beta-glucuronidasa (GUS)
Se incubó sal de sodio de BA3GN (500 \mug) en 500 \mul de tampón de fosfato de sodio 50 mM, pH 7,0 con \beta-glucuronidasa (GUS, Tipo Sigma G7896), 2500 unidades Sigma "Fishman" durante 12 horas a 37ºC. La HPLC y la TLC demostraron la eliminación virtualmente completa (> 99%) de la BA3GN para dar un compuesto que se cromatografiaba conjuntamente en una mezcla 1:1 con BA auténtica.
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Ejemplo 1B
3-\beta-D-glucopiranuronamido-6-bencilaminopurina
Sinónimos:
N^{6}-benciladenina-N^{3}-\beta-D-glucopiranuronamida
\quad
N^{6}-benciladenina-3-glucuronamida
Abreviatura:
BA3GNamida
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5 
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Síntesis
El éster metílico de peracetil-BA3GN recristalizado (1,5 g) preparado como en el Ejemplo 1A, se suspendió en metanol anhidro (200 ml) y se enfrió a 0ºC. Se añadió una cantidad adicional de metanol anhidro (400 ml), saturado con amoníaco anhidro a -10ºC, y la mezcla se agitó en hielo. Se añadió una nueva cantidad de metanol anhidro enfriado en hielo hasta que el sólido se disolvió por completo. La mezcla de reacción se agitó en hielo durante 3 horas más. El exceso de amoníaco y el metanol se eliminaron a vacío y el producto se trituró concienzudamente con etanol caliente para dar un sólido incoloro (1,3 g).
La BA3GNamida, como ocurre con otros adenina-3-glicosidos, es sólo escasamente soluble en agua o alcohol, pero se disuelve a 2,4 mg/ml en metanol acuoso al 50% que contiene 25% de ácido acético.
Análisis
TLC (sílice-cloroformo/metanol/ácido acético glacial, 50/50/5)
Una sola mancha por UV (Rf 0,36) sin impureza detectable alguna para una carga de 50 \mug. Pureza 98+%. Presencia no detectable (< 1%) de éster metílico de peracetil-BA3GN (Rf 0,89) o BA3GN (Rf 0,02).
TLC (sílice-cloroformo/metanol, 9/1)
Utilizada para ensayar el contenido de BA. La BA3GNamida a 192 \mug de carga no demostró cantidad detectable alguna de 6-benciladenina. Por consiguiente, contenido de BA < 0,2%.
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Ejemplo 1C
9-\beta-D-glucopiranuronosil-6-bencilaminopurina, sal de sodio
Sinónimos:
Ácido N^{6}-benciladenina-N^{9}-\beta-D-glucopiranurónico, sal de sodio
\quad
N^{6}-Benciladenina-9-glucurónido, sal de sodio
Abreviatura:
BA9GN, sal de sodio
6
Síntesis
Método 1
Oxidación catalítica de N^{6}-benciladenina-9-\beta-D-glucopiranosido (BA9G)
Se suspendió BA9G (50 mg) en bicarbonato de sodio 50 mM (25 ml) con negro de platino (200 mg). La mezcla se calentó a 80ºC en un baño de agua mientras que se pasaba oxígeno vigorosamente a su través. Se añadió una cantidad adicional de 100 mg de catalizador de platino al cabo de 4 horas. Aproximadamente el 95+% de BA9G se convirtió en el ácido 9-\beta-D-glucopiranurónico correspondiente y algo de BA al cabo de 20 horas de tratamiento. Se neutralizó la mezcla y la sal de sodio de BA9GN producida se purificó por cromatografía en fase inversa (sobre 20 g de octadecil-sílice) eluyendo con 200 ml de agua seguida por MeOH al 20%.
La sal de sodio de BA9GN pura, exenta de glucosido y BA, se secó para dar un sólido incoloro sobre cloruro de calcio a vacío.
Método 2
Condensación de 6-cloropurina y (2,3,4-tri-O-acetil-\alpha-D-glucopiranosil-bromuro)uronato de metilo (MBTG)
6-Cloropurina (secada sobre pentóxido de fósforo, 1,13 g), MBTG (3,87 g) y carbonato de potasio recién secado (1,5 g) se agitaron en carbonato de propileno anhidro (30 ml) a la temperatura ambiente durante 24 horas. La mezcla de color oscuro se filtró y se purificó por cromatografía en columna sobre sílice (100 g) eluyendo con un gradiente 0-80% de acetato de etilo en cloroformo. La fracción principal (distinta de la 6-cloropurina sin reaccionar) se secó y se recristalizó en etanol hirviente para dar 6-cloropurina-9-(2',3',4'-tri-O-acetil-\beta-D-glucopiranuronato) de metilo como un sólido amarillo pálido (450 mg) que se secó sobre pentóxido de fósforo a vacío. La HPLC indicó una pureza de 95+%.
Se calentaron juntos 6-cloropurina-9-(2',3',4'-tri-O-acetil-\beta-D-glucopiranuronato) de metilo (312 g) y bencilamina (171 \mul) en 1-butanol (13,5 ml) a 100ºC durante 1 hora. El sólido se disolvió fácilmente para dar una solución de color amarillo claro. La mayor parte del butanol se separó a vacío para producir un sólido blanquecino que se agitó mediante sacudidas con hidróxido de sodio al 5% en etanol acuoso al 50% (25 ml) durante 1-2 horas a la temperatura ambiente. Después de neutralización, el producto se secó a vacío para separar las trazas de butanol y la sal de sodio de BA9GN bruta se purificó por cromatografía en fase inversa como en el Método 1.
El producto bruto se secó a vacío sobre cloruro de calcio y pentóxido de fósforo para dar un sólido incoloro (210 mg) que se cromatografiaba conjuntamente con BA9GN preparado por oxidación catalítica.
Análisis de la sal de sodio de BA9GN preparada por reacción de condensación, Método 2
UV
95% Etanol A max 270 nM (17.400)
95% Etanol/HCl 0,1M A max 270 nM (16.200)
95% Etanol/NaOH 0,1 M A max 270 nM (17.400)
Estos resultados son consistentes con la estructura de una adenina disustituida en N6,N9. Los coeficientes de extinción son prácticamente los mismos que los de BA9G pura, lo que indica la ausencia de contaminantes no absorbentes en UV. Pureza UV, 95+%.
HPLC
Una columna de 10 x 0,46 cm de octadecil-sílice, con monitor UV a 270 nM. La HPLC isocrática (50% metanol/ácido acético 0,2 M, 2 ml/min) y en gradiente (0-60% metanol/ácido acético 0,2 M, 2 ml/min) muestran un pico simétrico agudo para BA9GN, que se eluye inmediatamente antes del glucosido correspondiente. El BA9GN preparado por reacción de condensación se cromatografía conjuntamente en una mezcla 1:1 en HPLC (gradiente e isocrática) con BA9GN preparado por oxidación catalítica. Esto confirma que el BA9GN preparado por la reacción de condensación es el isómero \beta-D-glucopiranosilo. BA9GN no contiene cantidad alguna detectable (< 2%) de anómero \alpha u otras impurezas, con inclusión de BA. La pureza por HPLC de BA9GN es 98+%.
TLC (sílice-cloroformo/metanol, 9/1)
Utilizada para medir la contaminación con BA del producto BA9GN. BA9GN no se desplaza del origen en este sistema. Límite mínimo de detección de BA = 200 ng. El BA9GN a 200 \mug de carga no muestra BA detectable alguna u otros contaminantes. Pureza por TLC 98+%. Contenido de BA < 0,1%.
Hidrólisis con ácidos
Los ácidos minerales convierten los glucosidos de citoquinina en la base libre de citoquinina correspondiente. El tratamiento de la sal de sodio de BA9GN (1 mg/ml) con ácido clorhídrico 1 M a 100ºC durante una noche produjo una mancha simple en TLC que se cromatografiaba conjuntamente con BA auténtica. Este ensayo confirmó que BA9GN era un conjugado de BA lábil en medio ácido.
Hidrólisis enzimática
Se incubó la sal de sodio de BA9GN (500 \mug) en 500 \mul de tampón de fosfato de sodio 50 mM, pH 7,0, con \beta-glucuronidasa Sigma (GUS, Tipo G7896), 2500 unidades "Fishman" durante 18 horas a 37ºC. La HPLC y la TLC no mostraron producción detectable alguna de BA. La incubación ulterior a la temperatura ambiente durante 3 días no mostró hidrólisis alguna. Por consiguiente, el BA9GN no es susceptible de hidrólisis por \beta-glucuronidasa.
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Ejemplo 1D
3-\beta-D-glucopiranuronosil-6-(3-metil-but-2-enilamino)purina, sal de sodio
Sinónimos:
ácido N^{6}-(2'-isopentenil)adenina-N^{3}-\beta-D-glucopiranurónico, sal de sodio
\quad
N^{6}-(2'-isopentenil)adenina-3-glucurónido, sal de sodio
Abreviatura:
IP3GN, sal de sodio
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7
Síntesis
Se calentaron N^{6}-(2-isopentenil)adenina (9,48 g) y MBTG (22,1 g) en DMF anhidra (170 ml) a 100ºC durante 12 h. La mayor parte de la DMF se separó a vacío en un baño de agua hirviente y el jarabe enfriado se recogió en cloroformo (500 ml). La solución clorofórmica se extrajo con agua (3 x 500 ml) y el extracto orgánico se secó sobre sulfato de sodio anhidro. La mayor parte del cloroformo se separó a vacío y el jarabe se purificó cromatográficamente sobre sílice revelada con un gradiente de 0 a 3,75% de metanol en cloroformo. El éster metílico de peracetil-IP3GN bruto se recristalizó en metanol con decoloración por carbón vegetal para dar el éster metílico de peracetil-IP3GN incoloro puro (3,2 g) que se secó a vacío sobre cloruro de calcio. Una porción del éster metílico de peracetil y IP3GN (1,2 g) se hidrolizó por disolución en aproximadamente 1 l de metanol acuoso al 75% que contenía 5% de hidróxido de sodio y agitación de la mezcla durante 10 min a la temperatura ambiente. La mezcla se enfrió en hielo, se neutralizó cuidadosamente con ácido clorhídrico y se redujo a un jarabe a vacío. El producto bruto se purificó por cromatografía sucesiva sobre resina XAD-2 y octadecil-sílice para dar la sal de sodio de IP3GN como un sólido microcristalino incoloro que se secó sobre cloruro de calcio (810 mg).
La sal de sodio de IP3GN es soluble en agua a 2 mg/ml.
Análisis
TLC (sílice-1-butanol/AcOH glacial/agua, 12/3/5)
La sal de sodio de IP3GN da una sola mancha neta (Rf = 0,32) a 100 \mug de carga sin cantidad detectable alguna de N^{6}-(2-isopentenil)adenina (IP) (Rf = 0,66) u otros contaminantes. Pureza 99,5+%.
Hidrólisis por \beta-glucuronidasa (GUS)
La sal de sodio de IP3GN (500 \mug) en 500 \mul de tampón de fosfato de sodio 50 mM, pH 7,0, se incubó con \beta-glucuronidasa (GUS, Tipo Sigma G7896), 2500 unidades Sigma "Fishman" durante 12 horas a 37ºC. La TLC mostró la eliminación de la mancha UV correspondiente a IP3GN con la producción de una nueva mancha UV que se cromatografiaba conjuntamente con IP auténtica.
Ejemplo 1E
Ácido 6-(3-metil-but-2-enilamino)purina-2-il-1-tio-\beta-D-glucopiranurónico, sal de sodio
Sinónimos:
Ácido N^{6}-(2'-isopentenil)adenina-2-tioglicopiranurónico, sal de sodio
\quad
N^{6}-(2'-Isopentenil)adenina-2-tioglucurónido, sal de sodio
Abreviatura:
IP2SGN, sal de sodio
8
Síntesis 1. 2-Benciltio-6-purinol
Se añadió cloruro de bencilo (1,4 ml) gota a gota con agitación enérgica a una solución de 2 g de 2-tioxantina en 12 ml de hidróxido de sodio 1 M, diluido hasta 140 ml con agua. Una vez completada la adición, se formó un precipitado de color crema. La mezcla de reacción se agitó durante 1 hora adicional a la temperatura ambiente y se filtró. El sólido se lavó concienzudamente con agua y se secó durante una noche a vacío sobre cloruro de calcio y hasta peso constante sobre pentóxido de fósforo. El producto bruto (2 g) se utilizó directamente en el paso inmediatamente siguiente sin recristalización.
2. 2-Benciltio-6-cloropurina
Se cubrió 2-benciltio-6-purinol (2 g) con una mezcla de oxicloruro de fósforo (20 ml) y dietilanilina (2 ml). La mezcla se calentó a reflujo con agitación durante 1 hora, se enfrió y se vertió en hielo (100 g). Se formó un precipitado amarillo que se filtró, se lavó concienzudamente con agua y se secó a vacío. El producto bruto se recristalizó en metanol para dar un sólido de color crema claro (1,2 g) que se secó hasta peso constante sobre pentóxido de fósforo.
3. 2-Benciltio-N^{6}-(2-isopentenil)adenina
Una mezcla de 2-benciltio-6-cloropurina (1,2 g) e hidrocloruro de isopentenil- amina (1,04 g) en 1-butanol (25 ml) que contenía trietilamina (2,2 ml) se calentó en un tubo herméticamente cerrado a 110ºC durante 2 horas. El butanol se separó a vacío y la mezcla se agitó mediante sacudidas con agua y hielo (100 ml). El producto se filtró, se recristalizó en etanol con decoloración por carbón vegetal y se secó a vacío con pentóxido de fósforo. Rendimiento, 0,64 g. Rendimiento 1,3 g de 2-benciltio-N^{6}-(2-isopentenil)adenina como un sólido incoloro. El producto bruto se utilizó como tal en el paso inmediatamente siguiente.
4. 2-Tio-N^{6}-(2-isopentenil)adenina
Se disolvió 2-benciltio-N^{6}-(2'-isopentenil)adenina (0,64 g) en amoníaco líquido (62,5 ml) para dar una solución de color amarillo claro. Se añadió sodio (aproximadamente 200 mg) en pequeñas porciones hasta que persistió una coloración azul durante 10 min. Se añadió cuidadosamente una pequeña cantidad de cloruro de amonio sólido para separar el exceso de sodio y se dejó que se evaporara el amoníaco hasta un volumen pequeño. Se añadió éter dietílico (65,5 ml) y el extracto etéreo se extrajo con agua (62,5 ml). El extracto acuoso se ajustó a un pH comprendido entre 4 y 5 con ácido acético con lo cual se precipitó un sólido de aspecto cremoso. Después de enfriar, el producto se separó por filtración y se secó sobre pentóxido de fósforo a vacío. Rendimiento, 340 mg.
Se convirtió la 2-tio-N^{6}-(2-isopentenil)adenina bruta en la sal de potasio por suspensión en agua y adición de una cantidad equimolar de hidróxido de potasio junto con alcohol suficiente para efectuar la disolución. La solución se secó a vacío sobre pentóxido de fósforo.
5. N^{6}-(2-Isopentenil)adenina-2-tioglucupiranurónido
2-Tio-N^{6}-(2-isopentenil)adenina, sal de potasio (2,89 milimoles) se disolvió en metanol anhidro y se añadió MBTG (5 milimoles). La mezcla se agitó a la temperatura ambiente durante 24 horas, en cuyo transcurso se depositó un sólido blanco de aspecto cremoso. La mezcla de reacción se secó a vacío y se hidrolizó a la temperatura ambiente por tratamiento con hidróxido de sodio acuoso al 5% (50 ml) para dar el glucopiranurónido libre como la sal de sodio. La mezcla se neutralizó por adición cuidadosa de ácido clorhídrico concentrado con enfriamiento externo para dar un precipitado incoloro de sal de sodio de IP2SGN bruta.
El producto bruto se purificó por cromatografía en fase inversa, se recristalizó en etanol, y se secó a vacío sobre cloruro de calcio para dar un sólido amorfo incoloro (150 mg). El producto era escasamente soluble en alcohol acuoso al 50%.
Análisis
UV
agua, pH 1 A max 284, 241, 206 nm
agua, pH 7 278, 230 (meseta)
agua, pH 14 283, 227
La sal de sodio de IP2SGN mostraba el espectro UV característico de las citoquininas sustituidas con grupo tio en la posición 2, y el espectro era estrechamente similar al de la 2-metiltio-N^{6}-(2-isopentenil)adenina auténtica. El análisis UV confirmó que el producto era una adenina disustituida en 2 y N^{6}.
HPLC
La HPLC utilizó una columna de octadecil-sílice de 15 x 0,46 cm eluida con un gradiente 0-60% de metanol que contenía ácido acético 0,2 M durante 30 min a 1 ml/min. Monitor UV a 270 nm.
La sal de sodio de IP2SGN tenía una pureza de 98+% y no contenía cantidad detectable alguna de 2-tio-N^{6}-(2-isopentenil)adenina libre (< 0,1%).
Hidrólisis por \beta-glucuronidasa (GUS)
La sal de sodio de IP2SGN (500 \mug) en 500 \mul de tampón de fosfato de sodio 50 mM, pH 7,0, se incubó con \beta-glucuronidasa (GUS, Tipo Sigma G7896), 2500 unidades Sigma "Fishman" durante 48 horas a 37ºC. La HPLC (condiciones como las empleadas anteriormente) demostró la eliminación parcial (65%) de IP2SGN para producir un pico que se cromatografiaba conjuntamente en una mezcla 1:1 con 2-tio-N^{6}-(2-isopentenil)adenina. Este ensayo confirma la identidad de la sal de sodio de IP2SGN como un conjugado de 2-tio-N^{6}-(2-isopentenil)adenina y ácido \beta-D-glucurónico, parcialmente susceptible de hidrólisis por GUS.
Ejemplo 1F
Ácido 6-(3-metil-but-2-enilamino)purina-8-il-1-tio-\beta-D-glucopiranurónico, sal de sodio
Sinónimos:
ácido N^{6}-(2'-isopentenil)adenina-8-tioglucopiranurónico, sal de sodio
\quad
N^{6}-(2'-isopentenil)adenina-8-tioglucurónido, sal de sodio
Abreviatura:
IP8SGN, sal de sodio
9
Reacción 1
6-Hidroxi-8-tiopurina
Se molieron juntos sulfato de 4,5-diamino-6-hidroxipirimidina (25 g) y tiourea (100 g) y se calentaron en un baño de aceite a 200ºC durante 30 min. El producto solidificado enfriado se disolvió en NaOH 1 M caliente (500 ml), se hirvió con carbón vegetal y se filtró. El filtrado caliente se acidificó con HCl concentrado y la solución caliente se filtró para dar un sólido rojo que se reprecipitó en solución básica caliente, se lavó bien con agua y se secó a vacío a 80ºC. Rendimiento 5,28 g.
Análisis
UV
A max, pH 1 236, 292 nm (bibl. 234, 290 nm)
pH 11 234, 292 nm (bibl. 234, 290 nm)
Reacción 2
6-Hidroxi-8-benciltiopurina
Se suspendieron 5,28 de 6-hidroxi-8-tiopurina en 78,5 ml de NaOH 1 M y se diluyeron a 400 ml con agua. Se añadieron 3,7 ml de cloruro de bencilo y la mezcla de reacción se agitó enérgicamente durante tres horas a la temperatura ambiente, se ajustó a pH 5 con ácido acético glacial, y se filtró. El producto se lavó concienzudamente con agua y se secó durante una noche a vacío a 80ºC para dar 7,33 g de un sólido de color rosado-salmón que se utilizó sin purificación ulterior.
Reacción 3
6-Cloro-8-benciltiopurina
Se añadió 6-hidroxi-8-benciltiopurina (7,33 g) a una mezcla de oxicloruro de fósforo (70 ml) y N,N-dietilanilina (7,5 ml), y la mezcla se calentó a reflujo durante 2 horas para dar un producto de color rojo oscuro. La mezcla se concentró a vacío y el jarabe resultante se vertió lentamente con agitación sobre hielo (400 g). La mezcla se dejó en reposo durante 15 min, después de lo cual se alcalinizó fuertemente con KOH frío concentrado. La mezcla se trituró concienzudamente para disolver la mayor parte del jarabe y se acidificó a pH 1 por adición lenta de HCl concentrado frío, con exceso de hielo todavía presente.
Después de permanecer en reposo durante 1 hora a la temperatura ambiente, el producto se separó por filtración, se lavó concienzudamente con agua y se secó a vacío a 80ºC durante 2 horas para dar 7,8 g de producto.
Reacción 4
8-Benciltio-N^{6}-(2'-isopentenil)adenina
Una mezcla de 6-cloro-8-benciltiopurina (3,9 g) e hidrocloruro de isopentenil- amina (3,42 g) en 1-butanol (100 ml) que contenía trietilamina (7,5 ml) se calentó a reflujo durante 2 horas. La mayor parte del 1-butanol se separó a vacío, y la mezcla de reacción se enfrió en hielo y se agitó mediante sacudidas con agua (400 ml).
Después de refrigeración durante una noche, se filtró la mezcla para dar un producto bruto que se purificó por cromatografía sobre 100 g de gel de sílice, eluyendo con un gradiente de 0-2,5% de MeOH en cloroformo. El producto cromatográficamente puro se recristalizó en metanol para dar 1,18 g de un sólido amorfo incoloro.
Análisis
TLC (sílice-2,5% metanol/cloroformo)
Pureza 98+%. Ausencia de impurezas detectables.
UV
95% Etanol/HCl 307 nm
95% Etanol 291 nm
95% Etanol/amoníaco 298 nm
Reacción 5
8-Tio-N^{6}-(2'-isopentenil)adenina
Se disolvió 8-benciltio-N^{6}-(2'-isopentenil)adenina (1,18 g) en amoníaco líquido (125 ml) para dar una solución de color amarillo claro. Se añadió sodio en pequeñas porciones hasta que persistió una coloración azul durante 15 min. Se añadió cuidadosamente una pequeña cantidad de cloruro de amonio sólido para separar el exceso de sodio. El amoníaco se evaporó hasta un volumen pequeño sobre una placa caliente y se añadió éter (125 ml).
Después que la mayoría del amoníaco remanente se había desprendido, el extracto etéreo se extrajo con agua (2 x 65 ml). El extracto acuoso (a pH 12-13) se enfrió sobre hielo y se ajustó a pH 5 con ácido acético glacial. Precipitó un sólido blanco de aspecto cremoso que se filtró, se lavó concienzudamente con agua y se secó durante una noche sobre cloruro de calcio para dar un polvo muy claro, prácticamente blanco. Rendimiento, 760 mg.
Nota: La 8-tio-N^{6}-(2'-isopentenil)adenina se oxida fácilmente en solución alcalina.
Análisis
HPLC
(15 cm octadecil-sílice, 0-80% metanol/ácido acético glacial 0,2 M, 30 min, 1 ml/min, monitor UV a 300 nm)
Pico simétrico neto sin impurezas detectables.
Pureza 98+%.
UV
95% Etanol/HCl 245, 307 (meseta), 315 nm
95% Etanol 241, 305, 313 nm
Reacción 6
IP8SGN, sal de sodio
Se suspendió 8-tio-N^{6}-(2'-isopentenil)adenina (600 mg) en hidróxido de potasio 50 mM (102 ml), que contenía 1% de 2-mercaptoetanol como antioxidante. Se añadió etanol suficiente para disolver el sólido. La solución se secó a vacío, sobre cloruro de calcio, seguido por pentóxido de fósforo. El producto seco se disolvió en metanol anhidro (100 ml) que contenía 2-mercaptoetanol (50 \mul) y se añadió MBTG (2 g). La mezcla se agitó durante 24 horas a la temperatura ambiente y se secó a vacío sobre cloruro de calcio y pentóxido de fósforo. El éster protegido se hidrolizó durante 1 hora a la temperatura ambiente en 50 ml de hidróxido de sodio al 5%.
Después de neutralización con ácido clorhídrico concentrado, el producto bruto se purificó por cromatografía en fase inversa y en fase normal para dar un sólido incoloro que se secó hasta peso constante sobre cloruro de calcio. Rendimiento, 190 mg.
Análisis de la sal de sodio de IP8SGN
UV
A max Etanol/pH 1 300 nm
Etanol/neutro 285 (meseta pronunciada), 291, 301 nm
Etanol/ pH 12 283 (meseta), 290, 300 nm
TLC (sílice-cloroformo/metanol, 1/1)
La sal de sodio de IP8SGN a cargas de 34, 68, 102 y 134 \mug mostraba una mancha neta simple sin contaminantes detectables. Pureza 99,5+%. Contenido de base citoquinina libre, 8-tio-N^{6}-(2'-isopentenil)adenina < 0,1%.
HPLC (15 cm octadecil-sílice, 0-80% metanol/ácido acético glacial 0,2 M, 30 min, 1 ml, 300 nm)
Pico ancho simple, tR 18,2 min. Ausencia de contaminantes detectables. Pureza 99,5+%.
Hidrólisis por GUS
La sal de sodio de IP8SGN a 1 mg/ml se incubó con 2500 unidades de GUS (Sigma) en tampón de fosfato 50 mM, pH 7 a 37ºC durante 24 horas. La TLC (1/1, metanol/cloroformo) mostró una conversión completa (> 95%) de la sal de sodio de IP8SGN para dar un compuesto que se cromatografiaba conjuntamente con 8-tio-(2'-isopentenil)adenina. La sal de sodio de IP8SGN es por consiguiente susceptible de hidrólisis por GUS.
Ejemplo 1G
O-\beta-D-glucopiranuronosilzeatina, sal de sodio
Sinónimos:
ácido zeatin-O-\beta-D-glucopiranurónico, sal de sodio
\quad
zeatin-O-glucurónido, sal de sodio
Abreviatura:
ZOGN, sal de sodio
10
Síntesis Éster metílico del ácido trans-2-metil-4-ftalimidobut-2-enil-(2',3',4'-tri-O-acetil-\beta-D-glucopiranurónico
Se suspendieron trans-1-hidroxi-2-metil-4-ftalimido-but-2-eno (1,87 g, Corse & Kuhnle, 1972, Synthesis, pp. 618-619) y carbonato de plata recientemente activado (9 g) en éter anhidro (300 ml) que contenía tamices moleculares (9 g). Después de agitar durante 30 min a la temperatura ambiente, se añadió MBTG (3,24 g) y la mezcla se agitó en la oscuridad durante 2 días a la temperatura ambiente. Se añadió una cantidad adicional de MBTG (1,62 g) y la mezcla se agitó durante 2 días más. La mezcla de reacción se filtró y se secó a vacío para dar un jarabe incoloro que se secó ulteriormente a vacío sobre cloruro de calcio para dar una espuma incolora pulverizable. El producto bruto se liberó de impurezas de azúcares por cromatografía sobre sílice (200 g), eluyendo con cloroformo. El rendimiento de producto puro fue 2,45 g (55,4%).
Trans-2-metil-4-amino-but-2-enil-\beta-D-glucopiranosiluronamida
Se disolvió trans-2-metil-4-ftalimidobut-2-enil-(2',3',4'-tri-O-acetil-\beta-D-glucopiranuronato de metilo (2,45 g) en metanol anhidro (150 ml), se enfrió en hielo, y se paso a amoníaco a través de la solución enfriada con hielo durante 6 horas. Después de la separación del metanol a vacío, el producto bruto se purificó por cromatografía sobre celulosa (200 g) y se reveló con butanol-etanol-ácido acético-agua (8:2:1:3 vol/vol). El producto eluido se secó a vacío para dar un jarabe de color pardo que se utilizó en el paso de condensación sin purificación ulterior.
Ácido zeatin-O-\beta-D-glucurónico, sal de sodio
El jarabe procedente del paso anterior se calentó en un tubo herméticamente cerrado con 6-cloropurina (0,8 g) y trietilamina (1,5 ml) en metanol (25 ml) a 90ºC durante 4 horas para producir la amida. Para convertir la amida en el ácido, el metanol se separó a vacío y se añadió hidróxido de sodio acuoso al 5% (25 ml). Después de agitar a la temperatura ambiente durante 6 horas, la mezcla se neutralizó cuidadosamente con ácido clorhídrico 2 M y se purificó por cromatografía en fase inversa sobre octadecil-sílice (100 g), eluyendo con agua. La sal de sodio de ZOGN bruta que contenía 6-cloropurina sin reaccionar se secó a vacío y se purificó por cromatografía sobre sílice (50 g) eluyendo con un gradiente 0-100% de metanol en cloroformo. Después de la separación del disolvente a vacío, el producto se secó como un sólido amorfo a vacío sobre cloruro de calcio. Rendimiento 158 mg.
Análisis
UV
A max etanol acuoso 276 nm, 270 nm (meseta),
283 nm (meseta)
etanol acuoso/HCl 279 nm
etanol acuoso/amoníaco 276 nm, 270 nm (meseta),
283 nm (meseta)
TLC (sílice-1-butanol/ácido acético glacial/agua, 12/3/5)
La sal de sodio de ZOGN a 50 \mug de carga mostraba una mancha simple (Rf 0,16) sin impureza detectable alguna. No era detectable cantidad alguna de zeatina (0,66) o 6-cloropurina (Rf 0,70). Pureza global 98+%.
HPLC (columna de octadecil-sílice de 15 x 0,46 cm, monitor UV a 270 nm)
Elución en gradiente (0-100% metanol durante 30 min a 1 ml/min)
La sal de sodio de ZOGN se eluye como un pico moderadamente ancho (tR 10,0 min) con una pequeña cantidad de impureza inorgánica presente con el pico de disolvente. Pureza global 97+%.
Elución isocrática (metanol acuoso al 50%, 1 ml/min)
Se utilizó elución isocrática para medir el contenido de zeatina. La sal de sodio de ZOGN tenía un tiempo de retención (tR) de 1,1 min, comparado con el valor tR de la zeatina trans auténtica de 2,2 min. La HPLC de hasta 96 \mug de sal de sodio de ZOGN no mostró zeatina detectable alguna. El contenido de zeatina era por consiguiente < 0,1%. Esto se confirmó por TLC con gel de sílice en cloroformo/metanol 9/1. La sal de sodio de ZOGN no se desplazaba del origen en este sistema, pero cualquier zeatina contaminante se separaba claramente a Rf 0,39. No se detectó cantidad alguna de zeatina cuando se hicieron pasar 200 \mug de sal de sodio de ZOGN. El límite de detección para la zeatina trans en la TLC era 200 ng; por consiguiente, se confirmó que la contaminación con zeatina trans era < 0,1%.
Hidrólisis enzimática
Se incubó una muestra de sal de sodio de ZOGN con \beta-glucuronidasa (Sigma G9387) en tampón de fosfato de sodio 50 mM a pH 7,0 a 37ºC. La HPLC (metanol isocrático al 50%) demostró una conversión virtualmente completa en zeatina trans. La identidad de la zeatina trans en el hidrolizado enzimático se confirmó por cromatografía conjunta de una mezcla 1:1 del hidrolizado y zeatina trans auténtica en 3 sistemas cromatográficos diferentes.
Ejemplo 1H
2-Hidroxicinamil-\beta-D-glucopiranuronamida
Sinónimos:
o-cumaril-\beta-D-glucopiranuronamida
\quad
O-cumaril-glucuronamida
Abreviatura:
CouGNamida
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11 
\vskip1.000000\baselineskip
Síntesis
Se molieron o-cumarato de metilo (15 g) y MBTG (16,8 g) junto con quinolina (25 ml) para producir una pasta homogénea. Se añadió óxido de plata(I) (10,7 g) en porciones, con mezcla concienzuda, mientras que la mezcla se enfriaba en hielo. Una vez completada la adición, la mezcla de reacción se mantuvo a la temperatura ambiente durante 3 h. Se extrajo la mezcla con éter (1 l) y el extracto etéreo se lavó con agua (1 l). El extracto etéreo se secó sobre sulfato de sodio anhidro y se secó a vacío para dar un jarabe de color rojo. El jarabe bruto se extrajo con éter de petróleo (300 ml) para separar el o-cumarato de metilo que no había reaccionado, y se secó luego a vacío para separar trazas de éter de petróleo. El producto bruto se recristalizó en etanol con decoloración por medio de carbón vegetal para dar 2-hidroxicinamil-O-\beta-D-glucopiranuronato de metilo peracetilado puro (3,5 g).
El éster metílico peracetilado (3,5 g) se disolvió en metanol anhidro (250 ml) y se hidrolizó por agitación a 0ºC durante 3 h con una nueva cantidad de metanol anhidro (250 ml) que se había saturado con amoníaco seco a -10ºC. El amoníaco y el metanol se separaron a vacío y el producto bruto se recristalizó en etanol y se secó a vacío sobre cloruro de calcio para dar CouGNamida pura como un sólido esponjoso incoloro (1,7 g).
Análisis
TLC (sílice-cloroformo/metanol, 1/1)
Mancha simple neta a Rf 0,63. No se detectó contaminante alguno para una carga de hasta 50 \mug, pureza 98+%. Impurezas, menores que 0,5% de o-cumarato de metilo; o cumarina.
TLC (sílice-cloroformo/metanol/ácido acético glacial, 50/50/5)
Mancha simple neta a Rf 0,68. Pureza 98+%. Ausencia (< 0,5%) de ácido o-cumárico detectable (Rf 0,80).
\newpage
Ejemplo 1I
Ácido 2-hidroxicinamil-\beta-D-glucopiranurónico
Sinónimos:
ácido o-cumaril-\beta-D-glucopiranurónico
\quad
o-cumaril-glucurónido
Abreviatura:
CouGN
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12 
\vskip1.000000\baselineskip
Síntesis
Se molieron o-cumarato de metilo (17,8 g) y MBTG (20 g) junto con quinolina (20 ml) para dar una pasta uniforme. Se añadió óxido de plata(I) (13 g) en porciones, con mezcla concienzuda, mientras que la mezcla se enfriaba en hielo. Una vez completada la adición, se dejó la mezcla de reacción en reposo a la temperatura ambiente durante 3 h. Se extrajo la mezcla con éter (1 l) y el extracto etéreo se lavó con agua (1 l). El extracto etéreo se secó sobre sulfato de sodio anhidro y se secó a vacío para dar un jarabe de color rojo. El jarabe bruto se extrajo con éter de petróleo (300 ml) para separar el o-cumarato de metilo que no había reaccionado, y se secó luego a vacío para separar trazas de éter de petróleo. El producto bruto se recristalizó en etanol con decoloración por medio de carbón vegetal para dar metil-CouGN peracetilado puro (2,9 g).
El éster metílico peracetilado (2,9 g) se suspendió en metanol (250 ml) y se añadió hidróxido de sodio 2 M (250 ml) con agitación mientras que la mezcla de reacción se enfriaba en hielo. Se agitó la mezcla a la temperatura ambiente durante 1,5 h y se ajustó a pH 2,5 con ácido clorhídrico. El metanol se separó a vacío y el producto bruto se purificó por cromatografía con XAD-2. La resina cromatográfica se lavó primeramente con agua para separar las sales inorgánicas y el producto se eluyó con metanol. Después de secado a vacío, el producto se recristalizó en etanol y se secó a vacío sobre cloruro de calcio para dar CouGN puro como un sólido amorfo incoloro (1,5 g).
CouGN es soluble a 5 mg/ml en tampón acuoso, pH 7, y en alcohol acuoso al 50% para dar una solución incolora y transparente.
Análisis
TLC (sílice-cloroformo/metanol/ácido acético glacial, 50/50/1)
Mancha principal, Rf 0,12 con una impureza menor a Rf 0,24. Pureza 90+%. Ausencia detectable (< 1%) de cumarina (Rf 0,90), o-cumarato de metilo (Rf 0,91) o ácido o-cumárico (Rf 0,80). El producto principal se cromatografiaba conjuntamente con CouGN auténtico preparado por oxidación catalítica de 2-hidroxicinamil-o- -D-glucopiranosido.
Hidrólisis por GUS
Se disolvió CouGN (5 mg) en tampón de fosfato de sodio 50 mM, pH 7,0 (1 ml) y se incubó con GUS (1000 unidades Tipo Sigma G5897) durante 12 horas a 37ºC. La TLC mostró 93,4% de conversión en un compuesto que se cromatografiaba conjuntamente con ácido o-cumárico. El ácido o-cumárico se convierte lentamente (por un proceso no enzimático) en cumarina a lo largo de un período de unos cuantos días.
Ejemplo 2 Los glucurónidos de citoquinina son hidrolizados por la \beta-glucuronidasa, liberando citoquininas no modificadas
Se desarrolló un ensayo para identificar aquellos glucurónidos de citoquinina que pueden ser hidrolizados por \beta-glucuronidasa de E. coli. (Diversas características de la enzima y el gen de \beta-glucuronidasa se describen, v.g., en los documentos siguientes: Blanco & Nemoz, Biochimie 69, pp. 157-161, 1987; Jefferson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 83, pp. 8447-8451, 1986; Levy & Marsh, Advan. Carbohydrate Chem. 14, pp. 381-428; US 4.721.671).
El compuesto a ensayar se incuba en tampón de fosfato de sodio 50 mM, pH 7,0 (generalmente 500 \mug del compuesto en 500 \mul del tampón) con \beta-glucuronidasa (generalmente de Tipo Sigma G7896, 2500 unidades Sigma "Fishman") durante 12-24 h a 37ºC. La presencia de productos de hidrólisis se determina luego utilizando HPLC y TLC.
La tabla siguiente muestra los resultados del ensayo descrito anteriormente sobre varios \beta-D-glucurónidos de citoquinina y una citoquinin-\beta-D-glucuronamida.
TABLA 1 \beta-D-Glucurónidos de citoquinina (y una citoquinin-\beta-d-glucuronamida) como sustratos de \beta-glucuronidasa de E. coli
14
Dado que los únicos sustratos que se han utilizado para ensayar la enzima GUS de E. coli en organismos transgénicos son O-glucurónidos, y puesto que había sido comunicado previamente (Jefferson, "The GUS reporter gene system", Nature, vol. 342, pp. 837-838, 1989) que los sustratos de \beta-glucuronidasa están constituidos por ácido D-glucurónico conjugado a través de un enlace b-O-glicosídico con una aglicona, resultó sorprendente que se encontrase también que ciertos N-glucurónidos y S-glucurónidos son sustratos satisfactorios para esta enzima. Por consiguiente, se contempla también que tales compuestos de N- y S-glucurónido pueden utilizarse en ensayos para la enzima \beta-glucuronidasa de E. coli y plantas, v.g. análogamente a la prueba X-gluc a que se hace referencia más adelante.
En el documento GB 2 197 653 A se expone que utilizando el sistema \beta-glucuronidasa y nuevos sustratos, puede ser posible una selección positiva y negativa utilizando la actividad de GUS. Esta hipótesis, sin embargo, no se ha investigado nunca, y nunca se ha demostrado que la hidrólisis enzimática de dichos compuestos sea probable incluso sobre la base de consideraciones teóricas relacionadas con las características químicas de los sustratos para \beta-glucuronidasa de E. coli. Como se demuestra aquí, no todos los glucurónidos son sustratos para la enzima \beta-glucuronidasa de E. coli, y no es de esperar que la mayoría de los glucurónidos sean sustratos para la enzima GUS.
Se han utilizado las respuestas en tejido vegetal que expresa el gen de \beta-glucuronidasa de E. coli como método para evaluar si ciertos glucurónidos (con inclusión de precursores de hormonas vegetales) pueden ser hidrolizados por la enzima in vivo (Jefferson, "The GUS gene fusion system as a versatile tool for agricultural molecular biology", resumen del Congreso Internacional sobre Manipulación Genética en la Reproducción Vegetal, celebrado en Elsinore, Dinamarca, 11-16 de septiembre de 1988). Desafortunadamente, este enfoque no es factible debido a la existencia de una fuerte actividad endógena de \beta-glucuronidasa en el tejido vegetal (véase v.g., el Ejemplo 3 más adelante, así como Hodal et al., "Detection, expression and specific elimination of endogenous \beta-glucuronidase activity in transgenic and non-transgenic plants", que se imprimirá en Plant Science). La existencia de esta actividad endógena de \beta-glucuronidasa significa también que, por el uso del procedimiento descrito por Jefferson, es imposible determinar si los efectos producidos por el glucurónido son debidos realmente a hidrólisis del compuesto o si pueden ser explicados por el hecho de que el glucurónido propiamente dicho es activo. Para que un compuesto sea adecuado para propósitos de selección, el compuesto tiene que ser activado por la enzima GUS y carecer además de actividad significativa en la forma de glucurónido.
El ensayo descrito anteriormente puede utilizarse para seleccionar glucurónidos de citoquinina que sean susceptibles de ser hidrolizados por una enzima \beta-glucuronidasa dada, ilustrada aquí por la enzima \beta-glucuronidasa de
E. coli.
Se determinó ulteriormente, utilizando HPLC y TLC, que las citoquininas activas no modificadas son el producto de la hidrólisis por GUS (véanse los ejemplos anteriores relativos a la preparación y el análisis de nuevos compuestos glucurónidos de citoquinina). Así, se encontró, v.g., que la hidrólisis de la sal de sodio de BA3GN por \beta-glucuronidasa de E. coli daba como resultado una eliminación virtualmente completa (>99%) de la sal de sodio de BA3GN para dar un compuesto que se cromatografiaba conjuntamente en una mezcla 1:1 con BA auténtica. Análogamente, se demostró por HPLC (metanol isocrático al 50%) que la incubación de la sal de sodio de ZOGN con \beta-glucuronidasa de E. coli proporcionaba una conversión virtualmente completa en zeatina trans; y se demostró por TLC (MeOH/cloroformo 1:1) que la incubación de la sal de sodio de IP8SGN con \beta-glucuronidasa durante 24 horas daba una conversión prácticamente completa (> 95%) de IP8SGN en un compuesto que se cromatografía conjuntamente con 8-tio-(2-isopentenil)adenina.
Análogamente, otros tipos de glucurónidos pueden seleccionarse por su susceptibilidad de ser hidrolizados por una \beta-glucuronidasa dada. Por ejemplo, se demostró por TLC que la incubación de o-cumaril-\beta-D-glucurónido (5 mg en 1 ml de tampón) durante 12 h con \beta-glucuronidasa (Tipo Sigma G5897, 1000 unidades) daba una conversión de 93,4% en un compuesto que se cromatografiaba conjuntamente con ácido o-cumárico. La incubación de los otros compuestos enumerados en la Tabla 1 (con excepción de los dos compuestos que no actuaban como sustratos para \beta-glucuronidasa de E. coli) daba resultados similares, es decir daba productos de hidrólisis correspondientes a aquéllos que podían esperarse después de la hidrólisis por \beta-glucuronidasa (véanse los ejemplos anteriores relativos a la preparación de diversos compuestos glucurónidos). Por el contrario, BA9GN, que como se muestra anteriormente en la Tabla 1 no es un sustrato para \beta-glucuronidasa de E. coli, y que no exhibía producción detectable alguna (< 1%) de BA después de incubación durante 18 h a 37ºC con \beta-glucuronidasa, no induce la formación de brotes en discos de hojas de tabaco (Tabla 2 más adelante).
Ejemplo 3 Inducción de formación de brotes a partir de tejido vegetal con y sin un gen de \beta-glucuronidasa introducido por glucurónidos de citoquinina
Se realizaron experimentos para determinar si los glucurónidos de citoquinina (así como una citoquinin-glucuronamida) son capaces de inducir formación de brotes in vivo en material vegetal con y sin, respectivamente, un gen de \beta-glucuronidasa introducido.
Semillas de una planta de tabaco GUS-negativa y una GUS-positiva (Nicotiana tabacum "Wisconsin 38") se hicieron germinar sobre sustrato MSO (sustrato Murashige & Skoog sin hormonas, descrito en Murashige & Skoog, Physiol. Plant. 15: 473-497, 1962, que puede obtenerse de Sigma, EE.UU.). El material vegetal GUS-positivo contenía un gen de \beta-glucuronidasa introducido de E. coli (uidA) activado por el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor como ha sido descrito v.g. por Jefferson et al., The EMBO Journal, vol. 6, Nº 13, pp. 3901-3907, 1987. Las plantas transgénicas originales GUS-positivas se produjeron utilizando el sistema tradicional de selección negativa basado en kanamicina como ha sido descrito v.g. por Burow et al., Plant Molecular Biology Reporter, vol. 8(2), pp. 124-139, 1990. Las plantas jóvenes GUS-positivas se identificaron utilizando la prueba X-gluc como se describe más adelante en este ejemplo.
Después de 4-5 semanas, las partes superiores de las plantas o brotes se transfirieron a un sustrato MSO nuevo, y se repitió este procedimiento en caso necesario. De este modo, el material vegetal (tanto GUS-positivo como GUS-negativo) se mantuvo como cultivos de brotes estériles (véase Burow et al., Plant Molecular Biology Reporter, vol 8(2), pp. 124-139, 1190). Se taladraron con punzón discos a partir de las hojas mayores (3-5 semanas de edad) y se transfirieron a los sustratos indicados más adelante (Tabla 2). El sustrato básico utilizado era MSO, añadiéndose los diversos compuestos de ensayo a varias concentraciones hasta 250 \muM. Se utilizaron cápsulas Petri pequeñas (\diameter = 5 cm) que contenían aproximadamente 6 ml de sustrato, colocándose tres discos de hoja en cada cápsula Petri. Cada tratamiento se repitió al menos 4 veces.
Se encontró que varios glucurónidos de citoquinina inducen formación de brotes en tejidos vegetales que contienen la enzima \beta-glucuronidasa. Los resultados se muestran en la tabla siguiente:
TABLA 2 Formación de brotes inducida por \beta-D-glucurónidos de citoquinina (y una citoquinin-glucuronamida) sobre discos de hojas de tabaco con (GUS+) o sin (GUS-) genes de \beta-glucuronidasa introducidos
15
"+" significa formación de brotes a concentraciones inferiores a 250 \muM
"-" significa ausencia de formación de brotes a concentraciones inferiores a 250 \muM (250 \muM corres-
ponde aproximadamente 100 mg/ml).
Puede observarse por la tabla anterior, que la totalidad de los glucurónidos de citoquinina que inducían formación de brotes a una concentración inferior a 250 \muM en discos de hojas de tabaco que contenían un gen de \beta-glucuronidasa introducido eran también capaces de inducir la formación de brotes utilizando una concentración similar en discos de hojas correspondientes que no contenían un gen de \beta-glucuronidasa introducido. Por otra parte, el glucurónido de citoquinina BA9GN, que se demostró no actuaba como sustrato para \beta-glucuronidasa de E. coli (véase el Ejemplo 2) no daba como resultado formación de brotes en discos de hojas con o sin un gen de \beta-glucuronidasa introducido. En cambio, se encontró que la citoquinin-glucuronamida BA3GNamida, que como se muestra en el Ejemplo 2 no actuaba como sustrato para la \beta-glucuronidasa de E. coli, inducía la formación de brotes en discos de hojas tanto GUS-positivos como GUS-negativos, lo que indica que las citoquinin-glucuronamidas se convierten en los correspondientes ácidos citoquinin-glucurónicos en los tejidos vegetales. Así pues, parece ser que los precursores de glucurónidos de citoquinina pueden funcionar in vivo de la misma manera que los glucurónidos de citoquinina propiamente
dichos.
Estos resultados indican que las plantas superiores, en este caso el tabaco, poseen actividad endógena de \beta-glucuronidasa. Este descubrimiento está de acuerdo con lo que ha sido publicado recientemente por Hu et al. (Plant Cell Reports 9, pp. 1-5, 1990), que investigaron la existencia de actividad afín a GUS en 52 especies de plantas de siembra, y con los descubrimientos de Hodal et al., (que se imprimirán en Plant Science). Hu et al. encontraron que especies que expresan actividades positivas afines a gus están distribuidas en todos los grupos fundamentales de angiospermas y en algunos de las gimnospermas. (Si bien Hu et al. no detectaron actividad de GUS en el tabaco, este resultado puede explicarse por el hecho de que su ensayo se realizó in vitro a pH 7. Como se demuestra más adelante, la enzima responsable de la actividad nativa de GUS en el tabaco no parece ser activa a pH 7, pero se ha encontrado que es activa a pH 4-5).
\newpage
Estos descubrimientos están en contraposición con lo que se expone en el documento GB 2 197 653 A, que expone que las plantas superiores, con inclusión del tabaco, no contienen actividad detectable alguna de \beta-glucuronidasa. El documento GB 2 197 653 A, que se refiere entre otras cosas a un método de controlar la expresión de un gen de interés utilizando el gen GUS, explica que la presencia de activada de GUS indica la expresión del gen de interés y por consiguiente implica que, dado que no se encuentra actividad de GUS en las plantas superiores, es una cuestión relativamente sencilla controlar la expresión de un gen de interés utilizando el gen GUS. Sin embargo, los resultados anteriores demuestran que esto no es cierto, y que el uso de un gen GUS para observar la presencia de un gen de interés no es en absoluto simple o sencillo, debido al hecho de que las plantas superiores contienen realmente una actividad intrínseca significativa (de fondo) de \beta-glucuronidasa.
Para estudiar la naturaleza de la actividad de GUS observada en material vegetal con y sin un gen de \beta-glucuronidasa introducido, se determinó la dependencia del pH de la actividad de GUS utilizando un ensayo histoquímico estándar de GUS con "X-gluc" (5-bromo-4-cloro-3-indolil-\beta-glucurónido).
La prueba X-gluc puede llevarse a cabo preparando primeramente un medio de ensayo por disolución de 50 mg de X-gluc en una solución que contiene 25 ml de tampón NaPO_{4} 0,2 M, típicamente pH 7,0, 24 ml de agua destilada, 0,25 ml de K_{3}(Fe(CN)_{6}) 0,1 M, 0,25 ml de K_{4}(Fe(CN)_{6}) 0,1 M y 0,5 ml de Na_{2}EDTA 1,0 M, seguido por agitación hasta disolución (aproximadamente 30 min). Secciones recién cortadas o fijadas con formaldehído (espesor menor que 0,5 mm) o tejidos a 37ºC se incuban luego en el medio X-gluc durante unos cuantos minutos hasta 24 horas. Después de la incubación, las secciones se enjuagan en tampón de fosfato de sodio o agua y se examinan al microscopio. La actividad de GUS se aprecia como una tinción azul del material vegetal tratado en el sitio de la actividad de la enzima (Jefferson, Plant Molecular Biology Reporter, vol. 5, Nº 4, pp. 387-405, 1987). Para los propósitos de la presente invención, se utilizaron típicamente tiempos de ensayo de 20 horas. Después de la incubación, los discos se trataron con etanol al 96% para separar la clorofila.
Los resultados se muestran en la tabla siguiente:
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TABLA 3 Dependencia del pH de la actividad de GUS en discos de hojas de tabaco con (+) y sin (-) genes GUS introducidos
16
0: ausencia de reacción en la prueba X-gluc
+: reacción azul en la prueba X-gluc.
Puede verse que la enzima responsable de la actividad de \beta-glucuronidasa subyacente en los discos de hojas de tabaco sin un gen de \beta-glucuronidasa introducido es únicamente activa dentro de un estrecho intervalo de pH que corresponde al pH interno de las plantas (aproximadamente pH 5), mientras que la \beta-glucuronidasa expresada por el gen introducido es activa a lo largo de un amplio intervalo de pH que va desde 4 a 8. Esta dependencia del pH puede explicar por qué intentos previos para detectar actividad de GUS en plantas han sido en gran parte infructuosos, conduciendo a la conclusión errónea (v.g. en el documento GB 2 197 653 A) de que las plantas no poseen actividad de GUS intrínseca.
El hecho de que la actividad de \beta-glucuronidasa demostrada anteriormente para el material vegetal sin un gen GUS introducido es realmente resultado de la hidrólisis del sustrato glucurónido de citoquinina por \beta-glucuronidasa, y no resultado de una reacción inespecífica que escinde el sustrato, v.g. una hidrólisis ácida no enzimática de glucurónidos (que como es sabido se escinden a valores de pH bajos) se demostró ensayando el efecto de inhibidores de diversas enzimas a pH 5 en material vegetal no transformado genéticamente (es decir material vegetal que tenía sólo actividad de GUS nativa). La investigación se realizó utilizando la prueba X-gluc descrita anteriormente a pH 5,0 durante 20 horas.
TABLA 4 Ensayo de inhibidores a pH = 5,0. Material no transformado
17
0 = ausencia de reacción, es decir disco de hoja completamente blanco
+ = tinción azul con X-gluc.
Los seis inhibidores ensayados tienen los efectos siguientes:
la sacaro-1,4-lactona es un inhibidor que es específico para enzimas de \beta-glucuronidasa (dicho de otro modo, inhibe únicamente \beta-glucuronidasas e inhibe todas las \beta-glucuronidasas). Está aceptado generalmente que la actividad de GUS que puede ser inhibida por este compuesto es resultado de la acción de una enzima \beta-glucuronidasa.
La gluconolactona es un inhibidor de \beta-glucosidasas. Corresponde a la sacaro-1,4-lactona, con la excepción de que es específica para \beta-glucosidasas.
El UDP-glucurónido es un sustrato para UDP-glucuronido-transferasas.
El ácido glucurónico es el producto de cualquier reacción de \beta-glucuronidasa y por consiguiente un inhibidor del producto de las \beta-glucuronidasas y otras enzimas formadoras de ácido glucurónico.
La galactosa es un inhibidor de las reacciones dependientes de UDP-glucuronido-transferasas.
El metilumbeliferil-glucurónido es un sustrato para todas las \beta-glucuronidasas investigadas hasta ahora, y es por consiguiente un inhibidor competitivo de las enzimas GUS.
Dado que se encontró también que EDTA (que inhibe las UDP-glucuronido-transferasas) no produce efecto alguno, es improbable que dichas transferasas estén involucradas en la actividad de GUS observada. La tabla anterior muestra que aquellos compuestos que deberían inhibir una enzima transferasa no tienen efecto alguno ni siquiera a concentraciones muy altas. Ulteriormente, puede verse que la gluconolactona no tiene efecto inhibidor alguno, y es por consiguiente improbable que la actividad de GUS esté relacionada con una actividad de \beta-glucosidasa.
Adicionalmente, puede observarse que el inhibidor específico de GUS sacaro-1,4-lactona es un inhibidor potente, que el ácido glucurónido (producto de inhibición de la \beta-glucuronidasa) es un inhibidor de fuerza intermedia y que el metilumbeliferil-glucurónido (un sustrato GUS y por consiguiente un sustrato competitivo para X-gluc si una enzima \beta-glucuronidasa es responsable de la hidrólisis de X-gluc) es un inhibidor débil. La actividad de GUS en el tabaco satisface por consiguiente todos los criterios necesarios para ser clasificada como resultante de una enzima \beta-glucuronidasa. Por tanto, puede llegarse a la conclusión de que las plantas contienen una enzima \beta-glucuronidasa.
Se llevó a cabo una serie correspondiente de experimentos para comprobar si el efecto de los inhibidores era suficientemente rápido para poder inhibir la enzima. En esta serie, el material vegetal se preincubó en los compuestos de ensayo (inhibidores) durante 24 horas antes de la realización de la prueba X-gluc con los mismos compuestos de ensayo. Los resultados obtenidos fueron idénticos a los obtenidos sin preincubación, lo que indica que los inhibidores penetran en el tejido vegetal con rapidez suficiente para inhibir la prueba X-gluc antes que pueda producirse la tinción azul.
Se obtuvieron resultados similares a los descritos anteriormente en otra investigación en cuanto a la existencia de actividad de GUS en las plantas. En este caso, se ensayó la dependencia del pH de la reacción histológica de GUS en varias especies de plantas a valores de pH comprendidos entre 3 y 8, con y sin el inhibidor específico de GUS sacaro-1,4-lactona.
La prueba utilizada fue la prueba X-gluc descrita anteriormente. La prueba se realizó a 37ºC durante 20 horas. Se cortaron hojas (con cuchillas de afeitar esterilizadas) de tal manera que cada hoja se ensayó a varios valores de pH diferentes.
Como se muestra por la tabla siguiente, esta investigación confirmó que las plantas poseen de hecho actividad de GUS nativa, que esta actividad es el resultado de una reacción enzimática (ausencia de reacción en presencia del inhibidor específico de GUS) y que la enzima es fundamentalmente activa a valores de pH de aproximadamente 4-5.
TABLA 5 Reacción histológica de GUS a diferentes valores de pH
18
1) Tejido de hoja que expresa el gen GUS de E. coli
2) Tejido de hoja transgénica que contiene únicamente un gen de resistencia a la kanamicina (NPT),
sin un gen GUS introducido
3) Tejido del tallo o del peciolo
4) Tejido de callo embriogénico
+ Reacción azul
(+) Baja frecuencia de actividad de GUS (reacción azul débil)
0 Ausencia de reacción
n No determinada.
El hecho de que las plantas tienen una actividad general GUS intrínseca hace que sea posible utilizar un gen codificante de glucuronido-permeasa como gen de selección positiva sin el uso de ningún otro gen de selección aprovechando la ventaja de una absorción incrementada de un compuesto glucurónido por las células transformadas. Por ejemplo, se ha encontrado que los glucurónidos no son absorbidos fácilmente en las células vegetales a través de las membranas plasmáticas. No obstante, si se introduce un gen de glucuronido-permeasa en una célula, los glucurónidos podrán atravesar más fácilmente la membrana plasmática y entrar en la célula. Los glucurónidos estarán entonces disponibles para ser escindidos por la encima GUS intrínseca en las células transformadas. En contraste, el glucurónido en cuestión no estará disponible para las células no transformadas, por lo cual se conseguirá un efecto de selección positiva. Análogamente, puede realizarse también una selección positiva utilizando otras permeasas y otros tipos de compuestos que o bien son activados en las células transformadas por una enzima intrínseca o que, de cualquier otro modo, ejerzan un efecto biológico en las células transformadas a las que se transporten.
Ejemplo 4 Los glucurónidos de citoquinina son estables e inactivos
El efecto de la sal de sodio del glucurónido de citoquinina BA3GN se bloquea cuando se inhibe la actividad de GUS en el tejido vegetal que contiene este glucurónido de citoquinina Dicho de otro modo, el glucurónido de citoquinina es inactivo en sí mismo. Adicionalmente, se ha demostrado que el glucurónido de citoquinina es estable en el medio de crecimiento así como en el tejido vegetal cuando no está presente \beta-glucuronidasa, como se muestra por el hecho de que el inhibidor específico de GUS, sacaro-1,4-lactona (SL), inhibe fuertemente la formación de brotes inducida por la sal de sodio del glucurónido de citoquinina BA3GN, pero inhibe sólo débilmente la formación de brotes inducida por la citoquinina BA libre (utilizando el método básico descrito anteriormente en el Ejemplo 3):
TABLA 6 Inhibición por sacaro-1,4-lactona (SL) de la formación de brotes inducida por BA (0,5 mg/l) y sal de sodio de BA3GN (15 mg/l)
19
Por comparación de los resultados de la tabla anterior con los dados anteriormente en la Tabla 2, se puede ver que la sal de sodio de BA3GN, que induce la formación de brotes en los discos de hojas de tabaco tanto GUS-positivos como GUS-negativos, no induce formación de brotes en discos de hojas correspondientes en presencia del inhibidor específico de \beta-glucuronidasa sacaro-1,4-lactona.
La sacaro-1,4-lactona (SL) no es un compuesto estable al pH utilizado en este ejemplo. Existe un equilibrio entre SL y ácido sacárico (SA). Este equilibrio se alcanza sólo lentamente, y la conversión de SL en SA va seguida por una disminución del pH. El pH tiene que ajustarse por consiguiente varias veces durante un período de una semana antes de utilizar la SL hasta que se ha estabilizado el pH en el sustrato que contiene SL.
El hecho de que los glucurónidos de citoquinina son estables e inactivos cuando no están en presencia de \beta-glucuronidasa se demuestra ulteriormente por el hecho de que BA9GN, que no puede ser hidrolizado por \beta-glucuronidasa, no puede inducir la formación de brotes en material vegetal que contenga actividad de \beta-glucuronidasa (véanse los Ejemplos 2 y 3).
Es importante el hecho de que los compuestos glucurónidos de citoquinina sean inactivos y estables en sustratos que no contienen una enzima \beta-glucuronidasa, dado que esta estabilidad es un requisito previo para el funcionamiento apropiado del sistema de selección positiva que los utiliza.
Sin embargo, puede esperarse que no todos los derivados de ácido glucurónico sean estables. Por ejemplo, los glucurónidos-éster no serán estables en tejido vegetal que contenga esterasas inespecíficas. Esto significa que los compuestos glucurónidos de citoquinina preparados y utilizados de acuerdo con la presente invención (\beta-D-glucurónidos acoplados a la aglicona por átomos O, S y N glicosídicos) satisfacen el requisito previo de estabilidad. Por otra parte, no es de esperar que compuestos que tienen otros tipos de enlaces glucurónidos, v.g. amida- o éster-\beta-D-glucurónidos, sean hidrolizados selectivamente por las \beta-glucuronidasas, debido a la existencia de esterasas y amidasas inespecíficas en las plantas.
Haciendo referencia al Ejemplo 3 anterior, se ha demostrado así que los glucurónidos de citoquinina ensayados, que como se muestra en este ejemplo no poseen en sí mismos actividad de citoquinina, son escindidos in vivo por la acción de \beta-glucuronidasa - sea en la forma de \beta-glucuronidasa sustrato endógena o como resultado de un gen de \beta-glucuronidasa introducido - por lo cual se libera citoquinina libre.
Ejemplo 5 Inducción de la formación de brotes a partir de tejido vegetal que contiene un gen de B-glucuronidasa introducido utilizando esterol-glucurónidos
Se ha demostrado que otros glucurónidos, con inclusión de glucurónidos de esteroles, ácido glicirricínico e hidroxiquinolina, son hidrolizados por \beta-glucuronidasa y dan como resultado formación de brotes sobre sustratos modificados en los cuales los productos de hidrólisis son necesarios para la formación de brotes. Esto se muestra en los Ejemplos 5 y 6.
Se realizaron experimentos para determinar el efecto inductor de brotes de dos esterol-glucurónidos, \beta-sitosteril-\beta-D-glucurónido (SG) y colesteril-\beta-D-glucurónido (CG), cuando la síntesis de esterol está inhibida en los tejidos. Los métodos básicos empleados corresponden esencialmente a los descritos para el Ejemplo 3 anterior. Sin embargo, además de uno o los dos esterol-glucurónidos mencionados anteriormente, el sustrato contenía tridemorf 0,1 mM y 5 mg/l de sal de sodio de BA3GN. Se registró el número de brotes al cabo de 30 días.
El tridemorf (4-tridecil-2,6-dimetil-morfolina) es un fungicida que inhibe la síntesis de esteroles y compuestos similares. El tridemorf tiene un efecto inhibidor sobre la regeneración de los brotes (aunque no un efecto fatal en los explantes) cuando el tejido vegetal no está suministrado de esteroles. Así, en ausencia de esteroles libres, debería prevenirse eficazmente la formación de brotes.
El CG se obtuvo de Sigma, EE.UU., y el SG se sintetizó de acuerdo con el procedimiento descrito por Ando et al. en J. Antibiotics 73, p. 408, 1970.
Los resultados obtenidos se muestran en la tabla siguiente:
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TABLA 7 Brotes regenerados por disco de hoja de tabaco sobre sustratos suministrados con tridemorf (0,1 mM) y sal de sodio de BA3GN (5 mM)
20
La tabla anterior muestra que el sitosteril-\beta-D-glucurónido es capaz de contrarrestar el efecto inhibidor de los brotes de tridemorf y que la combinación de sitosteril-\beta-D-glucurónido y colesteril-\beta-D-glucurónido proporciona la formación de brotes máxima. Así pues, la sección positiva de acuerdo con la invención utilizando un gen de \beta-glucuronidasa introducido es posible utilizando v.g. uno o los dos compuestos esterol-glucurónidos anteriores junto con un compuesto inhibidor de brotes tal como tridemorf. Estos resultados indican que también pueden utilizarse otros esteroles y compuestos afines a los esteroles para selección positiva a partir de tejidos que contengan un gen de \beta-glucuronidasa introducido.
Una ventaja de la utilización de estos compuestos muy ligeramente solubles para selección positiva es que su efecto será presumiblemente muy local, dado que los compuestos no se difunden de célula a célula cuando el resto hidrófilo del glucurónido es escindido por una enzima \beta-glucuronidasa. Dicho de otro modo, estos compuestos pueden utilizarse para prevenir la alimentación cruzada durante el procedimiento de selección.
Este experimento indica adicionalmente que el efecto inhibidor de brotes del tridemorf, y por consiguiente también de otros compuestos que inhiben la síntesis de esteroles, puede contrarrestarse por adición de esteroles y derivados de esterol al sustrato, con lo cual puede establecerse un sistema de selección basado en proporcionar esteroles y compuestos afines a esteroles a células transgénicas, con las ventajas mencionadas anteriormente.
Ejemplo 6 Inducción de la formación de brotes a partir de tejido vegetal con y sin un gen de \beta-glucuronidasa introducido utilizando sitosteril-B-D-glucurónido
Se realizó un experimento similar al descrito en el Ejemplo 5 sobre discos de hojas de tabaco tanto transformadas como no transformadas utilizando sitosteril-\beta-D-glucurónido y BA o sal de sodio de BA3GN.
Los métodos empleados fueron en esencia los descritos anteriormente en el Ejemplo 5. En este experimento, se añadió tridemorf al sustrato a una concentración de 0,1 mM y se añadió sitosteril-\beta-D-glucurónido a una concentración de 121 mg/l. El sustrato contenía además 1,88 mg/l de sal de sodio de BA3GN o 0,1 mg/l de BA. Se registró el número de brotes al cabo de 40 días.
El número de brotes obtenido fue como sigue:
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Brotes regenerados por disco de hoja
21
Puede verse que, como sucedía en el Ejemplo 5 anterior, la presencia de sitosteril-\beta-D-glucurónido era capaz de contrarrestar el efecto inhibidor de brotes del tridemorf. Adicionalmente, cuando se utilizaron sitosteril-\beta-D-glucurónido y tridemorf junto con la sal de sodio de BA3GN, se obtuvo una formación selectiva de brotes en los discos de hojas GUS-positivos, mientras que los discos de hojas GUS-negativos en el sustrato que contenía sal de sodio de BA3GN no exhibían virtualmente formación alguna de brotes.
Estos resultados indican también que el uso de una combinación de diferentes glucurónidos (en este caso BA3GN y SG en lugar de BA y SG) puede mejorar la respuesta selectiva de los tejidos transgénicos.
Dado que los esteroles y esteroides son también reguladores importantes del crecimiento en las células animales, pueden utilizarse también procedimientos de selección correspondientes para la selección de células animales que expresen \beta-glucuronidasa.
Ejemplo 7 Las cepas de Agrobacterium desarmadas producen citoquininas
Se ha encontrado que ciertas cepas de Agrobacterium inducen formación de brotes debido a la producción de sustancias inductoras de brotes durante el co-cultivo. Tales cepas deberían evitarse normalmente cuando va a emplearse la hidrólisis por GUS de glucurónidos de citoquinina para los fines de selección de células transformadas genéticamente, dado que estas cepas pueden inducir por sí solas formación de brotes e interferir por ello en el proceso de selección.
Como ejemplo, la tabla siguiente muestra los resultados de un experimento con dos cepas de Agrobacterium diferentes, una de las cuales induce formación de brotes sobre discos de hojas de tabaco después del co-cultivo.
Los métodos utilizados corresponden esencialmente a los descritos en el Ejemplo 13, pero después del co-cultivo, los discos de hojas se transfirieron a sustrato MSO sin hormonas que contenía 300 mg/l de cefotaxima y 300 mg/l de carbenicilina.
El número de brotes regenerados se registró cuatro semanas después del co-cultivo.
TABLA 8 Inducción de la función de brotes en discos de hojas de tabaco sobre un sustrato exento de hormonas después de co-cultivo con Agrobacterium desarmado 
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Se ve que las propiedades de inducción de brotes de algunas de las cepas de Agrobacterium no son dependientes de los genes contenidos en el T-DNA. Esto significa que genes exteriores a la región T-DNA son responsables de la inducción de brotes.
Un gen exterior a la región T-DNA responsable de la producción de citoquinina ha sido denominado tzs (Morris, R.O. Ann. Rev. Plant Physiol. 37, pp. 509-538, 1986). La cepa C58 contiene el gen tzs, un gen no transferible que codifica la síntesis de zeatina durante el co-cultivo. La cepa LBA4404 no contiene el gen tzs. El hecho de que las cepas inductoras de brotes contienen un plásmido que contiene el gen tzs indica que este gen puede ser responsable de las propiedades de inducción de brotes observadas en estas investigaciones y que las cepas de Agrobacterium que contienen el gen tzs deberían evitarse en los sistemas de selección basados en citoquinina. Cualesquiera otras cepas de Agrobacterium que induzcan formación de brotes deberían ser evitadas también normalmente.
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Ejemplo 8 Selección positiva de brotes transgénicos utilizando la sal de sodio del glucurónido de citoquinina BA3GN
Brotes transformados genéticamente pueden seleccionarse utilizando glucurónidos de citoquinina.
Se llevó a cabo una serie de experimentos para ensayar la eficacia del sistema de selección positiva utilizando la sal de sodio del glucurónido de citoquinina BA3GN en concentraciones de 7,5 y 15 mg/l. Los experimentos se realizaron sobre discos de hojas de tabaco de tipo salvaje en los que se emplearon 2 cepas diferentes de Agrobacterium así como diversos sustratos de co-cultivo. El método de transformación utilizado fue el descrito más adelante en el Ejemplo 13, con la excepción de que se utilizo el sustrato Gamborg B5 (Gamborg et al., Exp. Cell Res. 50: 151-158, 1968; obtenible de Sigma, EE.UU.) en lugar de MSO. Los resultados dados a continuación son valores medios basados en dos experimentos independientes, cada uno de los cuales se realizó sobre 27 discos de hoja por
tratamiento.
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TABLA 9 Selección positiva de brotes transformados genéticamente utilizando la sal de sodio del glucurónido de citoquinina BA3GN
Sal de sodio de BA3GN, 7,5 mg/l
23 
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Sal de sodio de BA3GN, 15 mg/l
24
B5: Sustrato Gamborg B5, pH 5,4
Amón.: Sustrato de co-cultivo con nitrato de amonio 75 mM
SL: Sustrato de co-cultivo con ácido sacárico 25 mM + sacaro-1,4-lactona 25 mM a partir de una
solución estabilizada
GUS+: Brotes que expresaban actividad de GUS cuando se ensayaron a pH 7 como se describe en el
Ejemplo 3
La cepa BS10 introduce un gen GUS activado por un promotor modificado 35S no activo en Agrobacterium, como ha sido descrito por Janssen & Gardner en Plant Molecular Biology, 14, pp. 61-72, 1989. La cepa LDH1 introduce un gen GUS activado por el promotor 35S sin modificar.
Los resultados de la Tabla 9 muestran que la selección positiva de brotes transgénicos que expresan un gen de \beta-glucuronidasa introducido es posible empleando sal de sodio de BA3GN. Estos resultados son muy significativos, y eran inesperados, dado que se encontró como se describe en el Ejemplo 3 que los glucurónidos de citoquinina eran capaces de inducir la formación de brotes en discos de hojas que no contenían un gen de \beta-glucuronidasa introducido. Los diferentes tratamientos utilizados durante el co-cultivo no parecen tener ningún efecto significativo en la
selección.
Los resultados mostrados anteriormente indican también que el uso de una cepa de Agrobacterium con un gen de \beta-glucuronidasa activo (la cepa LDH1 expresa actividad de GUS en bacterias) no afecta al sistema de transformación en comparación con una cepa que no tiene un gen de \beta-glucuronidasa activo (la cepa BS10 no expresa actividad de GUS en bacterias).
Ejemplo 9 Selección de brotes transformados geneticamente utilizando el glucurónido de citoquinina ácido zeatin-o-\beta-glucurónico
Se prepararon brotes de hojas de tabaco transgénicas empleando esencialmente el mismo procedimiento que se describe en el Ejemplo 13, y se seleccionaron utilizando el glucurónido de citoquinina ácido zeatin-o-\beta-glucurónico (ZOGN) como el agente de selección positiva.
Se llevó a cabo el co-cultivo durante tres días, correspondiendo la densidad de inoculante a un valor DO de 1,5 a 660 nm. El sustrato utilizado después del co-cultivo era MSO que contenía 300 mg/l de carbenicilina, 300 mg/l de cefotaxima y 0,1 mg/l de ácido indol-acético (IAA). El subcultivo se realizó después de tres semanas en el mismo sustrato pero sin IAA. El pH en todos los sustratos utilizados en este ejemplo era 8,0. Se utilizaron 18 discos de hoja para cada tratamiento.
Cinco semanas después del co-cultivo, los brotes se transfirieron a un sustrato MSO que contenía 200 mg/l de sulfato de kanamicina, ácido sacárico 32 mM, 300 mg/l de cefotaxima y 300 mg/l de carbenicilina, pH 8,0. Se añadió ácido sacárico, un inhibidor de las enzimas \beta-glucuronidasa, para detener la conversión ulterior del glucurónido de zeatina en zeatina. Junto con el gen de \beta-glucuronidasa, se transfirió conjuntamente un gen NPT que proporcionaba resistencia a la kanamicina. Los brotes no transformados (controles negativos) sobrevivieron, pero el crecimiento de dichos brotes se retardaba en este sustrato, mientras que la totalidad de los brotes transformados (controles positivos) que contenían un gen NPT activo sobrevivían sin ningún retardo del crecimiento.
Se registró el número de brotes, y se determinó el número de brotes GUS-positivos entre el número total de brotes por la prueba X-gluc (Ejemplo 3) tres semanas después del último subcultivo (8 semanas después del co-cultivo). Los resultados se muestran a continuación:
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TABLA 10 Selección positiva de brotes transformados genéticamente utilizando sal de sodio de ZOGN
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* SL: sacaro-1,4-lactona 2 mM
Los resultados dados en la tabla anterior muestran que se consiguió una selección positiva satisfactoria de brotes transformados genéticamente utilizando ZOGN. La inducción de brotes transgénicos se inhibía cuando se añadió el inhibidor específico de \beta-glucuronidasa sacaro-1,4-lactona al sustrato, lo que muestra que el crecimiento de brotes transgénicos y por consiguiente el éxito de la selección positiva dependía de la conversión catalizada por \beta-glucuronidasa de ZOGN en zeatina.
Ejemplo 10 Selección de brotes transformados genéticamente utilizando ácido zeatin-o-\beta-glucurónico a diversas temperaturas
La dependencia de la temperatura del sistema de selección positiva utilizando glucurónidos de citoquinina se investigó utilizando ácido zeatin-o-\beta-glucurónico (ZOGN) como el agente de selección positiva a 25ºC, 30ºC y
35ºC.
Se prepararon brotes de tabaco transgénicos utilizando esencialmente el mismo procedimiento que se describe más adelante en el Ejemplo 13. Se llevó a cabo el co-cultivo durante 3 días, correspondiendo la densidad de inoculante a una DO de 1,5 a 660 nm. El sustrato utilizado después del co-cultivo era MSO que contenía 10 mg/l de 2-(2-hidroxietilamino)-6-bencilamino-9-metilpurina (9-met), 350 mg/l de carbenicilina, 350 mg/l de cefotaxima y 0,1 mg/l de ácido indolacético (IAA) y sal de sodio de ZOGN como se indica. Se añadió 9-met (obtenida de Apex Organics Ltd., Reino Unido) para inhibir la glicosilación de la zeatina y los derivados de zeatina. Se utilizaron 18 discos de hoja para cada tratamiento.
Siete semanas después del co-cultivo, se transfirieron los brotes a un sustrato MSO que contenía 300 mg/l de sulfato de kanamicina, 350 mg/l de cefotaxima, 350 mg/l de carbenicilina, 0,1 mg/l de IAA y 10 mg/l de 6-(m-hidroxibencilamino)-purina (OH-BA) y se dejaron a una temperatura de 25ºC. La OH-BA puede prepararse como ha sido descrito por Kaminek et al. (Plant Growth Reg. 6, pp. 113-120, 1987).
Después de seis semanas en el sustrato que contenía kanamicina, se registró el número de brotes verdes. La resistencia a la kanamicina indica que el brote es transgénico, dado que junto con el gen de \beta-glucuronidasa se co-transfería un gen NPT que proporcionaba resistencia a la kanamicina. No sobrevivía brote alguno sin transformar (controles negativos) en este sustrato, mientras que sobrevivieron la totalidad de los brotes transformados (controles positivos) que contenían un gen NPT activo.
Se calculó el porcentaje de brotes resistentes a la kanamicina entre el número total de brotes regenerados como el número de brotes verdes que sobrevivían en el sustrato que contenía kanamicina dividido por el número de brotes transferidos al sustrato que contenía kanamicina. Los resultados se muestran en la tabla siguiente:
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TABLA 11 Selección positiva de brotes transformados genéticamente utilizando sal de sodio de ZOGN a diferentes temperaturas
26
El bioensayo descrito en este ejemplo se realizó sobre un gen co-transferido enlazado. Esto significa que el gen de \beta-glucuronidasa se utiliza para selección, mientras que se ensaya la resistencia resultante del gen NPT co-transferido introducido (gen de resistencia a la kanamicina).
Los resultados anteriores muestran que, además del gen de \beta-glucuronidasa, se expresa también un gen co-transferido cuando se realiza la selección utilizando el gen de \beta-glucuronidasa. Adicionalmente, puede verse que la selección a temperaturas elevadas (es decir, aproximadamente 30-35ºC) mejora la selección de brotes por disco de hoja y también la fracción de brotes transgénicos entre el número total de brotes regenerados.
Realizando la prueba X-gluc a diferentes temperaturas, se ha observado en conexión con la presente invención, que la actividad intrínseca de \beta-glucuronidasa que existe en las plantas se inhibe a temperaturas altas, mientras que no se ve afectada la actividad de \beta-glucuronidasa introducida. Así, se encontró que la actividad de \beta-glucuronidasa intrínseca decrecía gradualmente con las temperaturas crecientes hasta aproximadamente 60ºC, a cuya temperatura no se observaba esencialmente actividad de \beta-glucuronidasa intrínseca alguna (como se determina por la prueba X-gluc). Esto puede explicar la mejora del procedimiento de selección a temperaturas elevadas.
Ejemplo 11 Selección positiva comparada y combinada con la seleccion negativa
Se ha observado que el sistema de selección positiva descrito en esta memoria es muy eficiente y ventajoso en comparación con la selección negativa tradicional basada en kanamicina. Sin embargo, se obtienen también resultados satisfactorios cuando se emplea el sistema de selección positiva junto con la selección negativa tradicional.
Así, la tabla siguiente muestra los resultados, en términos del número de brotes de tabaco GUS-positivos por disco de hoja y el porcentaje de brotes GUS-positivos entre el número total de brotes, para selección positiva con empleo de sal de sodio de BA3GN, selección negativa tradicional utilizando kanamicina y BA, y selección positiva y negativa en combinación. Adicionalmente, el experimento incluía selección utilizando sal de sodio de BA3GN junto con sacaro-1,4-lactona (SL) (un inhibidor específico potente de la \beta-glucuronidasa introducida).
Los métodos utilizados fueron esencialmente como los descritos más adelante en el Ejemplo 13, pero se utilizó el sustrato Gamborg B5 en lugar de sustrato MSO.
TABLA 12 Selección positiva combinada con selección negativa
27
* Sal de sodio
** Concentraciones en mg/l.
El experimento con BA junto con kanamicina, que es el sistema de selección negativa tradicional, se repitió como dos experimentos diferentes con 54 discos de hoja por experimento. Se detectó un solo brote GUS-positivo entre un total de 23 brotes seleccionados. Los resultados para la sal de sodio de BA3GN se obtuvieron utilizando 324 discos de hoja. El experimento con SL (sacaro-1,4-lactona) se realizó una sola vez con un total de 162 discos de hoja.
La tabla anterior muestra que la selección positiva utilizando 15 mg/l de sal de sodio de BA3GN (sin kanamicina) dio 30 veces más brotes GUS-positivos por disco de hoja que el sistema de selección negativa tradicional utilizando 1 mg/l de BA y 300 mg/l de sulfato de kanamicina. Adicionalmente, un porcentaje mayor del número total de brotes eran GUS-positivos cuando se utilizó sección positiva (7,4%) que cuando se utilizó selección negativa (4,3%).
Se obtuvieron también resultados ventajosos utilizando una combinación de selección positiva y negativa, es decir sustituyendo una citoquinina en el sistema de selección negativa tradicional basado en kanamicina con un glucurónido de citoquinina (sal de sodio de BA3GN). Así, cuando se combinaron 15 mg/l de sal de sodio de BA3GN con 300 mg/l de sulfato de kanamicina, el porcentaje de brotes GUS-positivos era 11 veces mayor que el obtenido utilizando BA y kanamicina, y cuando se combinaron 15 mg/l de sal de sodio de BA3GN con 33 mg/l de sulfato de kanamicina, el número de brotes GUS-positivos por disco de hoja era 40 veces mayor que el obtenido utilizando BA y kanamicina.
Cuando se combinaron 15 mg/l de sal de sodio de BA3GN con una concentración 10 mM del inhibidor de GUS SL, tanto el número de brotes GUS-positivos por disco de hoja como el porcentaje de brotes GUS-positivos se redujeron drásticamente en comparación con el caso en que se utilizaron 15 mg/l de sal de sodio de BA3GN solos. Esto demuestra que el gen GUS introducido es responsable de los resultados ventajosos obtenidos utilizando el sistema de selección positiva, dado que la adición de SL al medio de crecimiento inhibe fuertemente la conversión catalizada por \beta-glucuronidasa del glucurónido de citoquinina inactivo (sal de sodio de BA3GN) en citoquinina activa en las células desarrolladas en este sustrato, conduciendo con ello a la reducción observada en el número de brotes inducido. Así pues, el sistema de selección positiva funciona tal como se desea, es decir, utilizando un gen de \beta-glucuronidasa introducido para escindir un glucurónido de citoquinina en células transformadas genéticamente, liberándose con ello citoquinina libre en estas células y conduciendo a la formación de brotes.
Ejemplo 12 Modificación del sistema de selección positiva para mejorar el efecto selectivo de los glucurónidos de citoquinina
Se ha mostrado ya (véase Tabla 3, Ejemplo 3) que la \beta-glucuronidasa existente naturalmente en las plantas es inactiva a valores de pH relativamente altos, es decir, a valores de pH de aproximadamente 6 o mayores, en tanto que la \beta-glucuronidasa introducida es activa hasta pH 8. Por adición al medio de crecimiento de un compuesto que pueda elevar el pH interno de las células, v.g. nitrato de amonio, puede mejorarse ulteriormente la formación selectiva de brotes a partir de las células GUS-positivas, dado que de este modo se hace posible bloquear cualquier actividad de fondo de \beta-glucuronidasa resultante de la \beta-glucuronidasa existente naturalmente en las células no transformadas.
La tabla siguiente muestra el número de brotes obtenidos a partir de discos de hoja de tabaco GUS-positivos y GUS-negativos utilizando diversas concentraciones de sal de sodio de BA3GN y nitrato de amonio. Los métodos utilizados fueron los mismos que los descritos en el Ejemplo 3, con la excepción de que se utilizó sustrato Gamborg B5 en lugar del sustrato MSO.
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(Tabla pasa a página siguiente)
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TABLA 13 Efecto del nitrato de amonio sobre la formación de brotes selectiva a partir de discos de hoja tratados con sal de sodio de BA3GN (pH = 7)
Formación de brotes (número de brotes y factor de selectividad*) en discos de hojas GUS+ Y GUS-
28
* El factor de selectividad es el número de brotes GUS-positivos dividido por el número de brotes
GUS-negativos, y por consiguiente da una indicación de la selectividad de un tratamiento dado
** Sal de sodio. 
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Puede verse que el uso tanto de sal de sodio de BA3GN como de nitrato de amonio en concentraciones apropiadas conduce a la formación selectiva de brotes en los discos de hoja GUS-positivos. Por ejemplo, una combinación de 15 mg/l de sal de sodio de BA3GN y nitrato de amonio 55 mM daba 34 brotes a partir de los discos de hojas GUS-positivos, mientras que no se formó brote alguno en los discos de hojas GUS-negativos correspondientes sometidos al mismo tratamiento.
Otra posibilidad de mejorar la selectividad del sistema de selección positiva utilizando glucurónidos de citoquinina consiste en añadir al medio de crecimiento un sustrato que, después de escisión por \beta-glucuronidasa da como resultado un aumento de pH, inhibiendo de este modo la hidrólisis de los glucurónidos de citoquinina en las células no transformadas sin inhibir el efecto de la citoquinina libre.
Este principio se ilustró en un experimento sobre el efecto de diversas concentraciones de ácido o-cumaril-\beta-D-glucopiranurónico (CouGN) sobre la formación de brotes a partir de discos de hojas de tabaco GUS-negativas inducida por la sal de sodio de BA3GN o BA. Cuando el ácido o-cumaril-\beta-D-glucopiranurónico es escindido por la acción de \beta-glucuronidasa, se libera ácido o-cumárico. Como se ha mencionado anteriormente (véase el Ejemplo 1I), el ácido o-cumárico se convierte espontáneamente en cumarina. Esto implica la eliminación de un grupo ácido (véase más adelante) y por consiguiente un aumento de pH hasta un nivel para el cual se presume que la actividad de la \beta-glucuronidasa nativa de la planta sea reducida.
13 
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El experimento se realizó utilizando una concentración de BA de 0,5 mg/l y una concentración de sal de sodio de BA3GN de 10,0 mg/l. Se utilizaron 12 discos por tratamiento, y se registró el número de brotes al cabo de 19 días. Los resultados se muestran a continuación.
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TABLA 14 Efecto del ácido o-cumaril-\beta-D-glucopiranurónico (CouGN) sobre la formación de brotes inducida por BA o sal de sodio de BA3GN
29
* Sal de sodio.
La tabla anterior muestra que la presencia de ácido o-cumaril-\beta-D-glucopiranurónico en el medio de crecimiento inhibe la regeneración de brotes inducida por la sal de sodio de BA3GN, pero no por BA. Los resultados óptimos en este experimento se obtuvieron utilizando una concentración de ácido o-cumaril-\beta-D-glucopiranurónico de aproximadamente 3-4 mM. En la reducción de la formación de brotes inducida por BA3GN podrían estar implicados varios mecanismos, con inclusión de los siguientes: 1) un pH incrementado debido a la liberación de ácido o-cumárico, como se ha explicado anteriormente; 2) competición de sustratos entre CouGN y BA3GN, conduciendo a una frecuencia menor de hidrólisis de BA3GN, y 3) un transporte reducido de BA3GN a las células. Si bien los mecanismos exactos involucrados en la reducción observada de la formación de brotes en presencia de CouGN no se determinaron, se cree que un pH incrementado es probable que haya sido al menos parcialmente responsable. En cualquier caso, este experimento indica que la selectividad del sistema de selección positiva puede mejorarse utilizando el gen de \beta-glucuronidasa introducido para establecer un mecanismo de auto-regulación que puede reducir significativamente el efecto de cualquier enzima sustrato.
Ejemplo 13 Preparación de plantas transformadas genéticamente
A continuación se da un método general que puede utilizarse para la preparación de plantas transformadas genéticamente.
Material vegetal
Se obtienen hojas (Nicotiana tabacum "Wisconsin 38") de plantas cultivadas in vitro o in vivo. En el último caso, las hojas se esterilizan antes de la transformación. La esterilización puede realizarse poniendo las hojas durante 20 min en una solución de hipoclorito de calcio al 5% que contiene 0,1 ml de Tween 80 por litro, seguido por lavado cinco veces en agua estéril. Las plantas in vitro se cultivan en recipientes sobre 1/2 MSO. (1/2 MSO es el mismo sustrato que MSO en concentración 50%, excepto en lo referente a agar, azúcar y vitaminas).
Las hojas se ponen de una en una en cápsulas Petri de 14 cm. Se taladran con punzón las hojas o se cortan en trozos de aproximadamente 1 cm^{2} sin un nervio principal, estando constituido los bordes de los trozos por tejido que ha sido cortado. Cualquier tejido cortado que haya sido blanqueado por la esterilización con hipoclorito se elimina.
Cultivo de bacterias
Un día antes de la transformación, se inicia un cultivo de bacterias por adición de 2-3 ml de bacterias a 200 ml de medio LB en un matraz Erlenmeyer. La bacteria se cultiva a 28ºC con agitación (300 rpm).
Transformación
El cultivo de bacterias se diluye 50 veces o hasta DO 0,1 (a 660 nm) con 1/2 MSO inmediatamente antes de la transformación. Se vierten en una cápsula Petri de 9 cm aproximadamente 10 ml de la suspensión diluida de bacterias, y los trozos de hojas se sumergen en esta suspensión durante aproximadamente 15 min. Los trozos de hojas se retiran luego y el exceso de suspensión de bacterias se elimina utilizando papel de filtro estéril.
Co-cultivo
El día antes de la transformación, se coloca una pieza de papel de filtro estéril sobre cápsulas de co-cultivo (que contienen típicamente sustrato MSO) y los trozos de hojas que se han sumergido en la suspensión de bacterias se colocan invertidos sobre el papel de filtro. Los trozos de hojas se incuban en una cámara de crecimiento con un ciclo de 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad durante 2 días.
Selección/regeneración
Los trozos de hojas se transfieren a cápsulas Petri que contienen glucurónidos de citoquinina como se indica y 350 mg/l de carbenicilina + 350 mg/l de cefotoxima o 800 mg/l de carbenicilina, en ciertos casos en combinación con sulfato de kanamicina. Los trozos de hojas se sub-cultivan después de tres semanas en el mismo medio, pero sin glucurónidos de citoquinina.
Prueba
Se transfieren los brotes regenerados a recipientes con 1/2 MSO. Después de aproximadamente 2 semanas, se realiza la prueba X-gluc sobre los brotes verdes. Los brotes se sub-cultivan en caso necesario.
Trasplante
Los brotes genéticamente transformados que han formado raíces (y que son GUS-positivos) se plantan en una cámara de crecimiento. Los brotes se plantan en un medio de crecimiento adecuado, v.g. esfagno. Se cubren luego con bolsas de material plástico y se dejan crecer durante aproximadamente 1 semana, después de lo cual se cortan las dos esquinas de las bolsas de plástico. Al cabo de otra semana se retiran las bolsas de plástico.
Ejemplo 14 Inducción de la formación de brotes a partir de tejido vegetal con y sin un gen de \beta-glucuronidasa introducido utilizando esteroles y un di-\beta-D-glucurónido
Se realizaron ensayos similares a los descritos en los Ejemplos 5 y 6 sobre discos de hojas de tabaco GUS-positivas y GUS-negativas utilizando sustratos que contenían 100 mg/l de \beta-sitosterol, 100 mg/l de colesterol, 10 mg/l de campesterol, 1,88 mg/l de sal de sodio de BA3GN y diversas concentraciones del ácido di-\beta-D-glucuronido-glicirricínico en la forma de una sal diamónica. Adicionalmente, la mitad de los sustratos contenían tridemorf 0,1 mM. Se registró el número de brotes al cabo de 17 días.
Los resultados se muestran en la tabla siguiente.
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 15 Brotes regenerados por disco de hoja
30
* sal diamónica.
Puede verse que la combinación de esteroles y la sal diamónica de ácido glicirricínico conduce a formación selectiva de brotes en discos de hojas que contienen un gen de \beta-glucuronidasa introducido. (Como se ha mencionado anteriormente (véase el Ejemplo 5) el tridemorf inhibe la síntesis de esteroles y por consiguiente tiene un efecto inhibidor sobre la regeneración de brotes cuando el tejido vegetal no está provisto de esteroles). Si bien el efecto de inducción selectiva de brotes se aprecia utilizando sustratos tanto con como sin tridemorf, el número máximo de brotes se obtiene en los sustratos que contienen tridemorf, y en particular con una concentración de sal diamónica de ácido glicirricínico de 0,125 mM.
Ejemplo 15 Inhibición selectiva de la formación de brotes inducida por BA3GN a partir de discos de hojas de tabaco de tipo salvaje (GUS-)
Se realizaron experimentos como los descritos en el Ejemplo 3 utilizando la variedad de tabaco "Burley" en lugar de "Wisconsin 38". Se añadió en diversas concentraciones al sustrato metil-\beta-D-glucurónido (MG), que es hidrolizado a metanol y ácido glucurónico por GUS, junto con 1 mg/l de BA o 15 mg/l de sal de sodio de BA3GN. Se ha demostrado que el metanol inhibe la enzima GUS nativa sin afectar mucho a la enzima de E. coli introducida (Kosugi et al., 1990, Plant Sci., 133-120), mientras que el ácido glucurónico liberado del metil-\beta-D-glucurónido es un producto inhibidor de las enzimas GUS. Por adición de MG en lugar de los dos compuestos independientemente, los productos de hidrólisis se producen localmente y se concentran en el compartimiento en el que está localizada la enzima. Los resultados obtenidos se muestran a continuación en la Tabla 16.
TABLA 16
31
BA 1 mg/l
BA3GN 15 mg/l.
Los resultados anteriores muestran que la adición de MG o ácido glucurónico conduce a una reducción del número de brotes obtenidos en el sustrato BA3GN en comparación con el número de brotes obtenidos en el sustrato BA. Por consiguiente, por tratamiento del tejido con MG antes de la expresión de la enzima GUS introducida puede ser posible eliminar o reducir selectivamente la actividad o el efecto de la enzima GUS nativa durante el procedimiento de selección. Diferencias entre las enzimas GUS introducida y nativa con relación a la inhibición debida a la competición por el sustrato, sensibilidad a la inhibición del sustrato, cantidad de enzima (actividad), y sensibilidad a la inhibición del producto pueden justificar también los efectos de MG y otros compuestos que tengan un efecto similar sobre los tejidos de tipo salvaje tratados con glucurónidos.
Es también posible que MG funcione por competición con la absorción de otros glucurónidos tales como BA3GN. Si es cierto esto, podría utilizarse MG para reducir o eliminar la absorción de otros glucurónidos en células de tipo salvaje. La introducción de un gen codificante de una enzima GUS que es secretada o un gen codificante de una glucuronido-permeasa podría utilizarse para seleccionar células transgénicas si se inhibe la absorción mediante, v.g., adición de MG al sustrato. En el caso de la glucuronido-permeasa, únicamente las células transgénicas absorberían el glucurónido (v.g. BA3GN) y debido a la existencia general de la enzima nativa en las plantas (véase, v.g., Ejemplo 3), el compuesto podría activarse en el interior de las células que expresen la permeasa (u otra proteína que facilite la absorción de glucurónidos).
Es también interesante el hecho de que el ácido glucurónico propiamente dicho es capaz de inhibir selectivamente el efecto de BA3GN, probablemente por bloquear el efecto de la BA liberada por escisión de BA3GN por GUS.
Ejemplo 16 Uso de selección positiva y una combinación de selección positiva y negativa para mejorar la eficiencia de selección de células, tejidos o brotes transgénicos a partir de especies recalcitrantes
La remolacha azucarera es una especie muy recalcitrante con relación a la producción de plantas transgénicas. Muchos brotes no transformados se "seleccionan" en condiciones que dan lugar a brotes transgénicos en sistemas de transformación ordinarios. Se encontró que sucedía lo mismo cuando se realizaron experimentos de selección positiva (sin adición de kanamicina) utilizando 5-15 mg/l de sal de sodio de BA3GN en las condiciones descritas a continuación.
En el Ejemplo 11 (véase Tabla 12), se encontró que la combinación de selección positiva y negativa reduce el número de brotes "seleccionados" no transformados. Por esta razón, se ensayó la combinación de selección positiva y negativa sobre remolacha azucarera, y se encontró que esto producía resultados ventajosos.
La transformación se llevó a cabo utilizando explantes de cotiledones como se describe a continuación.
Se dejaron germinar semillas durante 4 días en la oscuridad sobre un sustrato que contenía 0,7 g/l de agarosa y 2 g/l de sacarosa. Las plantas jóvenes se transfirieron luego a un recipiente Nunc que contenía sustrato 1/2 x MSO y se cultivaron durante 3 días a la luz. Se separaron los cotiledones de las plantas jóvenes, y los explantes de cotiledones se pincelaron sobre el peciolo con un pequeño pincel que contenía una suspensión de Agrobacterium, conteniendo el Agrobacterium 35 S-NPTII y 35 S-GUS (DO_{660} = 0,1). Los cotiledones se co-cultivaron luego durante 4 días sobre un sustrato que contenía sustrato 1/10 MSO y acetosiringona 200 \muM. Los explantes transformados se transfirieron a un sustrato de MSO suplementado con 0,25 mg/l de BA o 15 mg/l de sal de sodio de BA3GN (en lugar de BAP), 0,025 mg/l de ácido naftil-acético, 400 mg/l de kanamicina, 800 mg/l de carbenicilina y 25 mg/l de vancomicina, y los explantes se incubaron durante 21 días sobre este sustrato. Los brotes regenerados se transfirieron luego a recipientes que contenían el mismo sustrato. Al cabo de 52 días en este sustrato, todos los brotes se transfirieron a sustrato MSO suplementado con 800 mg/l de carbenicilina, 25 mg/l de vancomicina y 0,1 mg/l de BA. Al cabo de 14 días se realizaron ensayos GUS como los descritos en el Ejemplo 3 sobre el material vegetal seleccionado.
Los resultados se muestran en la tabla siguiente.
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 17
Transformación de remolacha azucarera Combinación de selección positiva y negativa
32
Selección negativa: 400 mg/l sulfato de kanamicina + 1mg/l BAP
Selección positiva y negativa: 400 mg/l sulfato de kanamicina + 15 mg/l BA3GN.
Puede verse que, con la combinación de selección positiva y negativa, se producen brotes transgénicos en condiciones en las que no se produce brote transgénico alguno utilizando el sistema tradicional de selección negativa. Esto demuestra que el uso del sistema de selección positiva es muy ventajoso en comparación con el uso de sistemas de selección negativa puros en la remolacha azucarera.
A su vez, esto indica que el uso de selección positiva (sola o en combinación con selección negativa) puede permitir la producción de plantas transgénicas en otras especies recalcitrantes en las cuales se obtienen únicamente frecuencias de transformación/selección bajas, o en las cuales no es posible seleccionar en absoluto planta transgénica alguna utilizando sistemas de selección negativa.
Ejemplo 17 Sistemas de selección positiva basados en el uso de fuentes de N inactivas se hacen posibles por la introducción de genes metabolizantes
Se realizaron experimentos como los descritos en el Ejemplo 3, pero el contenido normal de nitrógeno del sustrato MSO se redujo a cero. En lugar de ello, se añadieron los compuestos de nitrógeno indicados en la Tabla 18. El sustrato contenía 1 mg/l de BA. Se utilizaron sustratos que contenían nitrato de amonio como controles positivos.
Estos experimentos se realizaron para investigar si las opinas son inactivas o si las mismas pueden ser utilizadas por las células vegetales como fuentes de nitrógeno en sustratos que no contienen ninguna otra fuente de nitrógeno. Dado que los genes que codifican enzimas que metabolizan las opinas son bien conocidos, el requisito previo principal para la utilización de opinas en un sistema de selección positiva es la identificación de las opinas que no pueden ser utilizadas como fuente de nitrógeno por los tejidos y células vegetales que no contienen genes introducidos que permitan que las células vegetales utilicen las opinas en cuestión. Los resultados se dan a continuación.
TABLA 18 Efecto de las opinas sobre la formación de brotes a partir de discos de hojas de tabaco sobre sustratos sin nitrógeno (número de brotes por 9 discos de hojas)
33
En los sustratos ensayados que no contenían cantidad alguna de nitrógeno, se regeneraron un pequeño número de brotes. Esto puede haber sido posible debido a que el nitrógeno puede movilizarse a partir del tejido en el explante. Para evitar cualquier formación de brotes en los tratamientos que carecían por completo de nitrógeno, los explantes pueden privarse de nitrógeno dejando crecer los cultivos originarios sobre sustratos exentos de nitrógeno antes de su empleo o por pretratamiento de los explantes en un sustrato exento de nitrógeno, v.g. sin hormonas inductoras de brotes.
Sorprendentemente, se encontró que la octopina y la nopalina no pueden soportar la formación de brotes, en tanto que la manopina puede funcionar como una fuente satisfactoria de nitrógeno y soportar la formación de brotes a partir de los discos de hojas.
Es probable que la razón por la cual la nopalina y la octopina no puedan funcionar como fuentes de nitrógeno sea que estos compuestos no son absorbidos, metabolizados o hidrolizados para dar compuestos utilizables. Es bien sabido que los organismos que contienen genes implicados en el transporte y metabolismo de las opinas, v.g. Agrobacterium, son capaces de utilizar opinas como fuente de nitrógeno, en tanto que Agrobacterium u otras cepas de bacterias que no contienen genes codificantes del metabolismo de las opinas no son capaces de crecer sobre sustratos que contienen únicamente opinas como fuente de nitrógeno.
Sobre la base de estos resultados, pueden establecerse sistemas de selección positiva por introducción de uno o más genes de metabolismo o transporte de opinas en células de plantas transgénicas utilizando sustratos de selección que no contengan o que contengan un nivel reducido de fuentes de nitrógeno distintas de v.g. nopalina u octopina. La identificación o el aislamiento de genes o material genético que confiera al receptor la capacidad de utilizar octopina y nopalina ha sido descrita en la bibliografía: véase, v.g. C. Beaulieu et al., 1988, Can. J. Microbiol., 38: 843-49; P.M. Klapwijk et al., 1976, J. Gen. Microbiol., 96: 155-163; C.L. Schardl y C.I. Kado, 1983, Mol. Gen. Genet., 191: 10-16 o H. Wabiko et al., 1990, J. Gen. Microbiol. 136: 97-103. Después del aislamiento del material genético codificante del metabolismo de las opinas, pueden transformarse organismos eucariotas de acuerdo con procedimientos estándar descritos en la bibliografía con las secuencias apropiadas necesarias para el funcionamiento de los genes del metabolismo de las opinas.
Sobre la base de los resultados anteriores, es probable que otras opinas y los genes catabolizantes correspondientes puedan utilizarse de manera similar, y parece adicionalmente probable que otras fuentes de N inactivas identificadas por medios similares y sus genes correspondientes puedan utilizarse análogamente, v.g. amidas en combinación con amidasas, péptidos en combinación con peptidasas específicas, etc.
Ejemplo 18 Producción de callo transgénico a partir de especies recalcitrantes utilizando selección positiva en combinación con selección negativa
Se llevaron a cabo experimentos como los descritos en el Ejemplo 11, aunque con ciertas modificaciones. Las especies vegetales utilizadas fueron las líneas de reproducción muy recalcitrantes "V486" de colza oleaginosa de invierno y "S487" de colza oleaginosa de verano. Las semillas se esterilizaron y germinaron como se describe en el Ejemplo 16. Se utilizaron hipocótilos como explantes y se inocularon y co-cultivaron como se describe en el Ejemplo 11. Después del co-cultivo, los explantes se transfirieron a sustrato MSO que contenía 0,1 mg/l de ácido naftilacético, 0,01 mg/l de ácido giberélico (GA3), 500 mg/l de carbenicilina, 50 mg/l de sulfato de kanamicina y 6,0 g/l de agarosa. El sustrato contenía adicionalmente 1 mg/l de BA o 3,75, 7,5 o 15,0 mg/l de sal de sodio de BA3GN. El pH se ajustó a 5,8. El Agrobacterium utilizado contenía en su T-DNA un gen GUS y un gen de neomicinfosfotransferasa II activado por promotores 35S. Se realizaron ensayos GUS al cabo de 8 semanas y se registró la formación de callo que exhibía una tinción azul intensa en la mayoría de las células del callo como GUS+.
TABLA 19 Producción de callo transgénico a partir de colza oleaginosa utilizando selección positiva en combinación con selección negativa
34
Estos experimentos muestran que, con estos tipos de colza oleaginosa muy recalcitrantes, únicamente la selección positiva en combinación con selección negativa permitía la selección de callo transgénico, mientras que no se obtuvo callo GUS-positivo alguno utilizando la selección negativa tradicional (sustratos con BA en lugar de sal de sodio de BA3GN).
Esto demuestra que la introducción de los sistemas de selección positiva es muy ventajosa en comparación con los sistemas de selección negativa puros, asimismo en sistemas de callo. Demuestra también que el uso de selección positiva (sola o en combinación con selección negativa) puede permitir producir plantas transgénicas en otras especies recalcitrantes en las cuales se obtienen únicamente frecuencias de transformación/selección bajas o en las cuales no se selecciona en absoluto planta transgénica alguna utilizando sistemas de selección negativa.
Una vez que se ha seleccionado un callo transgénico, el mismo puede regenerarse en brotes transgénicos, v.g. sobre un sustrato que contenga una citoquinina en combinación con una concentración baja de auxinas. No es necesaria selección alguna durante este proceso.

Claims (4)

1. Un método para seleccionar células vegetales transformadas genéticamente a partir de una población de células, en el que las células vegetales genéticamente transformadas se transforman con una secuencia de nucleótidos expresable deseada que contiene una secuencia reguladora que permite su expresión en las células transformadas y una secuencia de nucleótidos expresable co-introducida que también contiene una secuencia reguladora que permite su expresión en las células transformadas, método que comprende suministrar a dicha población un compuesto que puede ser metabolizado por el producto de expresión de la secuencia de nucleótidos expresable co-introducida que se ha introducido con la secuencia de nucleótidos expresable deseada en dichas células transformadas, a fin de proporcionar a las células transformadas una ventaja fisiológica cuando se comparan con las células no transformadas, en el cual el compuesto no es un antibiótico o herbicida, y no tiene efecto desfavorable directo alguno sobre las células no transformadas.
2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el cual el compuesto se selecciona del grupo constituido por citoquininas, auxinas, giberelinas, vitaminas, carbohidratos, opinas, proteínas, esteroles y saponinas.
3. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en el cual dicha secuencia de nucleótidos expresable co-introducida codifica \beta-glucuronidasa cuando el compuesto es un glucurónido de citoquinina.
4. Un método de acuerdo con la reivindicación anterior, en el cual la actividad de \beta-glucuronidasa nativa se reduce suministrando al medio de cultivo un compuesto regulador del pH que proporciona al medio de cultivo, las células o compartimientos de las células, un pH comprendido entre 5,5 y 8,5.
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