ES2135415T5 - Metodo para la seleccion de celulas transformadas geneticamente y compuestos para uso en el metodo. - Google Patents
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Abstract
Un método para seleccionar células vegetales transformadas genéticamente a partir de una población de células, en el que las células vegetales genéticamente transformadas se transforman con una secuencia de nucleótidos expresable deseada que contiene una secuencia reguladora que permite su expresión en las células transformadas y una secuencia de nucleótidos expresable co-introducida que también contiene una secuencia reguladora que permite su expresión en las células transformadas, método que comprende suministrar a dicha población un compuesto que puede ser metabolizado por el producto de expresión de la secuencia de nucleótidos expresable co-introducida que se ha introducido con la secuencia de nucleótidos expresable deseada en dichas células transformadas, a fin de proporcionar a las células transformadas una ventaja fisiológica cuando se comparan con las células no transformadas, en el cual el compuesto no es un antibiótico o herbicida, y no tiene efecto desfavorable directo alguno sobre las células no transformadas.
Description
Método para la selección de células
transformadas genéticamente y compuestos para uso en el método.
La presente invención se refiere a un método
para seleccionar células vegetales transformadas genéticamente en
las cuales se ha incorporado una secuencia de nucleótidos deseada
proporcionando a las células transformadas una ventaja selectiva
sin deterioro de las células no transformadas, así como a nuevos
compuestos para uso en el método.
Es bien sabido que cuando debe introducirse
nuevo material genético en una población de células por
transformación, únicamente cierto número de las células se
transforman con éxito, es decir, reciben el nuevo material genético.
Es entonces necesario identificar las células transformadas
genéticamente a fin de que estas células puedan separarse de las
células no transformadas contenidas en la población. La
identificación y separación de las células transformadas se han
realizado tradicionalmente utilizando lo que puede denominarse
"selección negativa", en otros términos, mediante el uso de un
método por el cual las células transformadas son capaces de
sobrevivir y desarrollarse, en tanto que las células no
transformadas se ven sometidas a inhibición del crecimiento o
quizás incluso son destruidas por una sustancia que las células
transformadas son capaces de tolerar.
Por ejemplo, cuando una población de células
vegetales se somete a transformación genética, la selección de las
células transformadas tiene lugar típicamente utilizando un gen de
selección que codifica resistencia a un antibiótico o un herbicida.
El gen de selección - que en sí mismo no tiene generalmente función
útil alguna en la planta transformada genéticamente, y de hecho
puede ser indeseable en la planta - está acoplado a o
co-introducido con el gen a incorporar en la planta
en cuestión, de tal modo que ambos genes se incorporan en la
población de células, o más bien en algunas de las células de la
población, dado que no es posible en la práctica transformar todas
o ni siquiera una mayoría de las células. Las células se cultivan
luego sobre o en el interior de un medio que contiene el
antibiótico o herbicida al cual son resistentes las células
transformadas genéticamente en virtud del gen de selección,
permitiendo con ello la identificación de las células transformadas,
dado que las células no transformadas - que no contienen el gen de
resistencia al antibiótico o herbicida en cuestión - se ven
sometidas a inhibición del crecimiento o se destruyen.
Estos métodos de selección negativa tienen, sin
embargo, ciertas desventajas. Ante todo, las células no
transformadas pueden morir debido a la presencia de, v.g.
antibióticos en el medio de crecimiento. Como resultado, cuando la
población de células es un tejido coherente existe un riesgo claro
de que no sólo las células no transformadas sino también las
células transformadas puedan morir, debido al hecho de que la
muerte de las células no transformadas puede interrumpir el
suministro de nutrientes a las células transformadas o debido a que
las células no transformadas lesionadas o moribundas pueden
excretar compuestos tóxicos.
Otra desventaja significativa de la selección
negativa es que la presencia de un gen innecesario para, v.g.,
resistencia a los antibióticos puede ser indeseable. Por ejemplo,
existe preocupación entre los grupos ecologistas y las autoridades
de los gobiernos acerca de si es segura la incorporación de genes
codificantes de resistencia a los antibióticos en plantas y
microorganismos. Esta preocupación tiene una significación
particular para las plantas alimenticias y para aquellos
microorganismos que no están diseñados para ser utilizados en un
ambiente cerrado (v.g. microorganismos para uso en agricultura), así
como para microorganismos que están diseñados para uso en un
ambiente cerrado, pero que accidentalmente pueden liberarse desde el
ambiente cerrado. Si bien puede demostrarse que estas
preocupaciones carecen de fundamento, las mismas pueden conducir sin
embargo a restricciones gubernamentales en cuanto al uso de genes
de resistencia a los antibióticos, v.g., en las plantas, y por
consiguiente es deseable desarrollar nuevos métodos para selección
de células transformadas genéticamente que no sean dependientes de
tales genes.
Una desventaja adicional de la selección
negativa es que los tejidos o células vegetales tratados con
sustancias tóxicas se hacen más sensibles a la infección
bacteriana. Esto constituye un problema cuando se utiliza
Agrobacterium como vector de transformación, dado que los
tejidos o células tratados llegan a veces a cubrirse de bacterias,
aun cuando se utilicen antibióticos para prevenir el crecimiento
bacteriano.
Adicionalmente, la selección de células o
tejidos utilizando selección negativa requiere una temporización
muy precisa de la expresión de los genes introducidos en relación
con el proceso de selección. Si las células transgénicas se tratan
con un compuesto tóxico antes que se exprese el gen destoxificante o
antes que se haya producido una cantidad suficiente de productos
génicos para antagonizar la acción del compuesto tóxico, las
células transgénicas serán destruidas junto con las células no
transgénicas. Si la selección se realiza demasiado tarde, la
selección de células o tejidos transgénicos puede verse impedida,
v.g. por formación de brotes de las células o tejidos no
transgénicos.
Las desventajas anteriores se eliminan por el
método de acuerdo con la presente invención (denominado "selección
positiva"), que, por primera vez, hace posible identificar y
aislar células vegetales transformadas genéticamente sin deterioro
o destrucción de las células no transformadas contenidas en la
población y sin co-introducción de genes de
resistencia a antibióticos o herbicidas. Adicionalmente al hecho de
que se elimina la necesidad de genes de resistencia a antibióticos
o herbicidas, se ha demostrado que el método de selección positiva
de acuerdo con la presente invención es a menudo mucho más eficiente
que la selección negativa tradicional. Como se describe más
adelante en los ejemplos, el número de brotes transgénicos
seleccionados de discos de hoja de tabaco utilizando selección
positiva es, v.g., del orden de 30 veces mayor que el número de
brotes seleccionados utilizando un método tradicional de selección
negativa basado en kanamicina, y una combinación de selección
positiva y negativa dio una frecuencia de selección de brotes
transgénicos aproximadamente diez veces mayor que la obtenida
utilizando selección negativa sola (véase el Ejemplo 11).
Adicionalmente, el uso de selección positiva proporciona la ventaja
de que puede utilizarse un solo gen como gen informador y como gen
de selección, dando como resultado una simplificación de las
construcciones de vectores, construcciones más estables y una
correlación de 100% entre la expresión de los genes informador y de
selección. La selección positiva elimina también los problemas
mencionados anteriormente en lo referente a temporización, dado que
los compuestos que resultan de la selección se producirán siempre
como consecuencia de la expresión génica. Así pues, el compuesto
selectivo se acumulará cuando se expresa el gen de selección,
apareciendo el efecto de selección cuando se ha producido una
cantidad suficiente del compuesto selectivo.
Métodos de observación de la actividad génica en
el interior de células transformadas se han dado a conocer
previamente en la técnica anterior.
Jefferson R.A. (1989) Nature, Vol. 342,
837-838, expone el uso de GUS y el sistema de
glucuronido-permeasa como sistema de observación
para células vegetales transformadas. Jefferson se refiere
específicamente a la hidrólisis del sustrato X-Gluc
y la detección del producto del colorante azul índigo en células
vegetales transformadas que contienen el constructo génico promotor
35S-gus A.
La Patente de EE.UU. 4.857.467 expone la
transformación de cepas de levadura del género Pichia con
fragmentos de DNA que codifican funciones génicas de las que carece
el huésped o en las cuales es deficiente el huésped. Las células de
levadura transformadas son capaces de desarrollarse sobre una fuente
de carbono y energía, lo que requiere la expresión de la función
génica proporcionada por el fragmento de DNA.
El documento WO 89/03880 expone la transfección
de células huésped con un gen codificante de la
glucuronido-permeasa. El sistema puede utilizarse
junto con fusiones del gen GUS.
Ninguno de los documentos de la técnica citados
expone da a conocer un método para selección de células vegetales
transformadas sobre la base de la presencia de una secuencia de
nucleótidos particular introducida como la propuesta dentro del
alcance de la presente invención.
Un aspecto de la presente invención se refiere a
un método para seleccionar células vegetales transformadas
genéticamente a partir de una población de células, en el que las
células vegetales genéticamente transformadas se transforman con
una secuencia de nucleótidos expresable deseada que contiene una
secuencia reguladora que permite su expresión en las células
transformadas y una secuencia de nucleótidos expresable
co-introducida que también contiene una secuencia
reguladora que permite su expresión en las células transformadas,
método que comprende suministrar a dicha población un compuesto que
puede ser metabolizado por el producto de expresión de la secuencia
de nucleótidos expresable co-introducida que se ha
introducido con la secuencia de nucleótidos expresable deseada en
dichas células transformadas, a fin de proporcionar a las células
transformadas una ventaja fisiológica cuando se comparan con las
células no transformadas, en el cual el compuesto no es un
antibiótico o herbicida, y no tiene efecto desfavorable directo
alguno sobre las células no transformadas.
En una realización, el método se lleva a cabo
cultivando la población de células sobre o en el interior de un
medio que contiene al menos un compuesto inactivo o nutriente que
está activado directa o indirectamente en las células que contienen
la secuencia de nucleótidos co-introducida y la
secuencia de nucleótidos deseada, siendo el compuesto o nutriente
inactivo en las células no transformadas o menos activo en las
células no transformadas que en las células transformadas, de tal
manera que se proporciona a las células transformadas una ventaja
selectiva que permite que las mismas se seleccionen a partir de la
población de células.
En otra realización, el método se lleva a cabo
cultivando la población de células sobre o en el interior de un
medio que contiene al menos un compuesto o nutriente que se pone a
disposición de las células transformadas por expresión o
transcripción de la secuencia de nucleótidos
co-introducida o la secuencia de nucleótidos
deseada, no estando disponible el compuesto o nutriente para las
células no transformadas o estando menos disponible para las
células no transformadas que para las células transformadas, de tal
manera que se proporciona a las células transformadas una ventaja
selectiva que permite que las mismas se seleccionen a partir de la
población de células.
En una realización adicional, la expresión de la
secuencia de nucleótidos co-introducida conduce a un
aumento en la actividad de una enzima que se encuentra
endógenamente en la población de células, de tal manera que la
actividad de la enzima en las células transformadas es mayor que la
actividad de la enzima en las células no transformadas.
Compuestos que son adecuados para uso en el
método anterior son aquéllos que tienen la fórmula general I
en la
cual
- R^{2}
- es H, CH_{3}, S-CH_{3}, SO_{2}-CH_{3}, SCH_{2}-fenilo, SH, OH, Cl o un grupo -S-R^{10}, -NH-R^{10} o -O-R^{10}, donde
- R^{10}
- es un grupo \beta-D-glucopiranuronosilo [cuya estructura resulta evidente a partir de los ejemplos prácticos dados en esta memoria] o una de sus sales o derivado éster o amida del mismo en la función ácido carboxílico,
- R^{6}
- es bencilo que puede estar sustituido en el anillo fenilo con OH, alcoxi C_{1-6}, halógeno, alquilo C_{1-4}, NH_{2} o CF_{3}, o con -O-R^{10}, -S-R^{10}, o -NH-R^{10}, donde
- R^{10}
- es como se ha definido anteriormente; alquilo C_{1-8} o alquenilo C_{2-8} que puede estar sustituido con 1 a 3 grupos hidroxi, glucosiloxi o alcoxi C_{1-6}, con fenilo y/o con -O-R^{10}, -S-R^{10} o -NH-R^{10}, donde R^{10} es como se ha definido anteriormente; alquilo C_{1-6} o alquenilo C_{2-6} esterificados; furfurilo, o ciclohexilureído, fenilureído o tolilureído;
- o bien \hskip0,5cm i)
- R^{7} e Y son semienlaces que forman juntos un enlace,
- ii)
- uno de R^{3} y R^{9} es H o un grupo R^{10} como se ha definido anteriormente, y el otro es un semi-enlace que junto con un semi-enlace X forma un enlace, o R^{9} es ribosilo, 5'-fosforribosilo, glucosilo o -CH_{2}CH(NH_{2})COOH y R^{3} es semi enlace que junto con el semi-enlace X forma un enlace, y
- iii)
- R^{8} es H, CH_{3}, S-CH_{3}, SO_{2}-CH_{3}, SCH_{2}-fenilo, SH, OH, Cl o un grupo S-R^{10}, -NH-R^{10}, o -O-R^{10}, donde R^{10} es como se ha definido anteriormente,
- o bien \hskip0,5cm iv)
- R^{7} es ribosilo, 5'-fosforribosilo o glucosilo, R^{8} es H, R^{9} e Y son semi-enlaces que forman juntos un enlace y R^{3} es un semi-enlace que junto con el semi-enlace X forma un enlace;
con la condición de que uno de
R^{2}, R^{3}, R^{6}, R^{8} y R^{9} es o comprende un grupo
\beta-D-glucopiranuronosilo, o
una de sus sales o un derivado éster o amida del mismo en la función
ácido
carboxílico.
Compuestos adicionales que pueden utilizarse en
el método anterior son los de la fórmula general II
en la
cual
- R^{1}
- es cis -CH=CH-COOH, una de sus sales o un derivado éster del mismo en la función ácido carboxílico, o el derivado amida de cis y/o trans -CH=CH-COOH, y
- R^{10}
- es como se ha definido anteriormente.
Adicionalmente, en esta memoria se dan a conocer
células transformadas genéticamente que han sido seleccionadas de
acuerdo con el método anterior, en particular células vegetales, así
como plantas, progenie y semillas derivadas de dichas células
vegetales transformadas genéticamente.
El término "células" en el contexto de la
presente invención tiene por objeto hacer referencia a cualquier
tipo de células a partir del cual puedan identificarse y aislarse
células individuales transformadas genéticamente utilizando el
método de la invención, con inclusión de células vegetales, células
animales y microorganismos tales como bacterias, hongos, levaduras,
etc. Adicionalmente, el término "células" tiene por objeto
también abarcar protoplastos, es decir, el protoplasma de una
célula encerrado en una membrana pero sin pared celular. Si bien se
contempla que el principio general de la presente invención puede
emplearse en cualquier tipo de células, se ha encontrado que el
método es particularmente adecuado para la selección de células
vegetales transformadas genéticamente.
La expresión "población de células" hace
referencia a cualquier grupo de células que se ha sometido a
transformación genética y a partir del cual se desea identificar
aquellas células que se han transformado genéticamente y aislar las
células genéticamente transformadas de las células no transformadas
genéticamente. La población puede ser, v.g., un tejido, un órgano o
una porción del mismo, una población de células individuales en o
sobre un sustrato, v.g., una población de células en solución o
suspensión, o un organismo completo, v.g. una planta entera.
El término "selección" se refiere al
procedimiento de identificar y/o aislar las células transformadas
genéticamente con respecto a las células no transformadas
genéticamente, utilizando el método expuesto en esta memoria.
La "secuencia de nucleótidos deseada" puede
ser cualquier secuencia de nucleótidos que deba incorporarse en las
células en cuestión para producir células transformadas
genéticamente. La introducción de secuencias de nucleótidos en
vegetales, microorganismos y animales se practica extensamente, y no
existe limitación alguna en cuanto a las secuencias de nucleótidos
cuya presencia pueda ser detectada por el uso del método de
selección positiva descrito en esta memoria. Por el uso de este
método, la presencia de la secuencia de nucleótidos deseada en las
células transformadas genéticamente puede determinarse sin las
desventajas mencionadas anteriormente asociadas a los sistemas
tradicionales de selección negativa.
El hecho de que una secuencia de nucleótidos se
"co-introduce con" la secuencia de nucleótidos
deseada se refiere al hecho de que las dos secuencias de
nucleótidos están acopladas una a otra o se introducen juntas por
otro modo de tal manera que la presencia de la secuencia de
nucleótidos co-introducida en una célula indica que
la secuencia de nucleótidos deseada se ha introducido en la célula,
es decir si se demuestra que una de las secuencias de nucleótidos
se ha introducido, la probabilidad de que la otra se hay introducido
también se ve incrementada significativamente. Las dos secuencias
de nucleótidos son, así pues, típica aunque no necesariamente,
parte del mismo constructo genético y son v.g. introducidas por el
mismo vector.
Los métodos descritos en esta memoria pueden
utilizarse también cuando la secuencia de nucleótidos
co-introducida y la secuencia de nucleótidos
deseada se introducen independientemente. Esto puede realizarse,
v.g. por utilización de las mismas bacterias para incorporación de
ambos genes e incorporación de un número relativamente grande de
copias de la secuencia de nucleótidos deseada en las células, por lo
cual existe una probabilidad relativamente alta de que las células
que se demuestra expresan la secuencia de nucleótidos
co-introducida contengan y expresen también la
secuencia de nucleótidos deseada. Se espera generalmente que la
introducción independiente de dos o más genes que da como resultado
la co-expresión de los genes en la misma célula
tenga una probabilidad baja, y por consiguiente se espera que las
frecuencias de selección mejoradas obtenidas por el método de
selección positiva sean especialmente ventajosas en dichos
sistemas.
Dado que es necesario que las secuencias de
nucleótidos introducidas se expresen en las células transformadas,
un constructo genético que contenga las dos secuencias de
nucleótidos contendrá típicamente, pero no de manera necesaria,
secuencias reguladoras que permitan la expresión de las secuencias
de nucleótidos, v.g. promotores y terminadores de la transcripción
conocidos. Así pues, la secuencia de nucleótidos
co-introducida estará asociada típicamente con un
promotor, que puede ser un promotor constitutivo o regulable, y la
secuencia de nucleótidos deseada estará asociada también
típicamente con un promotor constitutivo o regulable.
Como se ha mencionado anteriormente, el método
es particularmente adecuado para la selección de células vegetales
transformadas genéticamente, permitiendo por ello la identificación
y el aislamiento de dichas células sin el uso de genes de selección
codificantes de resistencia a antibióticos o herbicidas. Como en el
caso de los métodos de selección negativa tradicionales, el método
de selección positiva descrito en esta memoria puede utilizarse
para seleccionar células in vitro. Sin embargo, el método de
selección positiva puede emplearse también in vivo. El uso
del método de selección positiva in vivo es particularmente
importante, v.g. en conexión con la transformación genética
realizada sobre plantas enteras o sobre partes de plantas, en las
cuales las plantas o partes de plantas comprenden células tanto
transformadas como no transformadas, dado que la selección de las
células transformadas se realiza sin dañar directamente las células
no transformadas vecinas. Las células transformadas tienen por
tanto una "ventaja" selectiva comparada con las células no
transformadas (v.g. la capacidad de formar brotes), pero las
células no transformadas no presentan ninguna desventaja grave en el
sentido de resultar dañadas o destruidas, como sucede con la
selección negativa que utiliza antibióticos o herbicidas.
El "compuesto o nutriente inactivo" puede
ser cualquier compuesto o nutriente en forma inactiva o precursora,
es decir que en ausencia de la expresión de la secuencia de
nucleótidos co-introducida existe en una forma que
es en esencia biológicamente inactiva con respecto a las células en
cuestión, pero que, cuando la secuencia de nucleótidos
co-introducida se expresa o transcribe, se hidroliza
o se activa o metaboliza de algún otro modo a fin de proporcionar a
las células transformadas genéticamente que contienen la secuencia
de nucleótidos deseada una ventaja selectiva, permitiendo con ello
que las mismas sean identificadas y aisladas. Así pues, el
compuesto o nutriente inactivo puede ser v.g. un regulador del
crecimiento vegetal inactivo, por ejemplo una citoquinina, auxina,
o giberelina inactivada, una vitamina, v.g. tiamina inactivada, un
carbohidrato (v.g. manosa, cuando la secuencia de nucleótidos
co-introducida codifica
manosa-6-fosfato-isomerasa,
o galactosa o un compuesto que contiene galactosa, cuando la
secuencia de nucleótidos co-introducida codifica
UDP-galactosa-4-epimerasa),
un compuesto nitrogenado (v.g. una opina, cuando la secuencia de
nucleótidos co-introducida codifica una enzima de
metabolismo o transporte de opina), almidón, una proteína, u otro
nutriente en forma inactiva, o un compuesto que tiene una función
esencial durante la diferenciación y desdiferenciación de células y
tejidos. El tratamiento de células y tejidos con compuestos que
inducen dependencia de la adición suplementaria de compuestos
esenciales puede utilizarse también junto con los compuestos
inactivos correspondientes. Este método puede, v.g., utilizarse
cuando se inhibe la síntesis de esterol o saponina y se añaden
esteroles o saponinas inactivos. El compuesto inactivo puede ser
adicionalmente v.g. un mineral que se encuentra en forma de quelato
y por consiguiente está disponible para las células transformadas
genéticamente.
En contraste con la selección negativa
tradicional, en la que las células no transformadas son dañadas o
destruidas debido a la presencia de un antibiótico, herbicida o
toxina en el sustrato, los compuestos o nutrientes inactivos
utilizados en el método de selección positiva de la presente
invención no tienen ningún efecto desfavorable directo sobre las
células no transformadas. En lugar de ello, se confiere a las
células transformadas una ventaja fisiológica que permite que las
mismas sean identificadas y aisladas, mientras que las células no
transformadas no se ven afectadas como tales o son menos afectadas
por la presencia del compuesto o nutriente inactivo utilizado para
fines de selección.
Los métodos tradicionales de "selección
negativa" se caracterizan, así pues, por el uso de un gen de
selección que reduce el efecto negativo de un compuesto añadido
sobre las células transformadas. En contraste, la expresión
"selección positiva" tal como se utiliza en el contexto de la
presente invención, se refiere al uso de un gen de selección que
produce o aumenta un efecto positivo de un compuesto añadido sobre
las células transformadas.
La selección con empleo de este método se
realiza por consiguiente haciendo que un compuesto esté disponible
para las células transformadas, mientras que el compuesto no está
disponible o está menos disponible para las células no
transformadas. El compuesto o nutriente en cuestión puede ser del
mismo tipo que cualquiera de los mencionados anteriormente,
consistiendo la diferencia en que el compuesto o nutriente en este
caso es transportado en el interior de las células transformadas
además de ser activado en las células transformadas.
Ejemplos de compuestos que pueden ejercer un
efecto fisiológico después de su entrada en la célula, pero que no
son absorbidos fácilmente en la célula o en un compartimiento
celular, son compuestos fuertemente hidrófilos o hidrófobos, en
particular compuestos cargados, moléculas grandes tales como
polímeros, en particular proteínas, péptidos, oligo- y
polisacáridos, con inclusión de hormonas vegetales, metabolitos
fosforilados tales como carbohidratos fosforilados, vitaminas
fosforiladas, nucleósidos fosforilados, con inclusión de
citoquininas, y compuestos que están conjugados con carbohidratos o
aminoácidos que contienen ácido carboxílico, con inclusión de
conjugados de hormonas vegetales.
La "ventaja selectiva" poseída por las
células transformadas puede ser cualquier diferencia o ventaja con
relación a las células no transformadas que permita que las células
transformadas sean identificadas y aisladas fácilmente a partir de
las células no transformadas. Esto representará típicamente una
diferencia o ventaja que permite que las células transformadas se
identifiquen por medios visuales sencillos, es decir, sin el empleo
de un ensayo separado para determinar la presencia de un gen
marcador.
Cuando un polipéptido codificado por la
secuencia de nucleótidos co-introducida activa
directamente un compuesto inactivo o nutriente en las células
transformadas, las células no transformadas pueden contener o
producir en ciertos casos una determinada cantidad del polipéptido
en cuestión. Por ejemplo, cuando el polipéptido de activación es
una enzima, las células no transformadas pueden contener cierta
actividad de la enzima nativa, siendo la enzima nativa del mismo
tipo que la enzima de activación introducida. En tales casos, el
"compuesto inactivo o nutriente" no precisa ser de modo
necesario completamente inactivo en las células no transformadas,
dado que puede ser suficiente que el compuesto o nutriente sea
sencillamente menos activo en un grado sustancial en las células no
transformadas que en las células transformadas. Dicho de otro modo,
una diferencia cualitativa entre las células transformadas y las
células no transformadas con relación a la activación del compuesto
inicialmente inactivo o nutriente puede ser suficiente en ciertos
casos para propósitos de selección. En dichos casos, pueden
añadirse inhibidores o sustratos que compitan con las enzimas
nativas. Son especialmente adecuados inhibidores activados por la
enzima nativa, dando como resultado la producción autocatalítica del
inhibidor activo a un nivel para el cual la enzima nativa está
inhibida prácticamente por completo.
El polipéptido de activación codificado por la
secuencia de nucleótidos co-introducida no está
limitado a ningún polipéptido particular, y será por supuesto uno
que es activo, directa o indirectamente, en relación con el
compuesto o nutriente particular a activar en las células
transformadas genéticamente. El polipéptido es particularmente a
menudo una enzima.
Una enzima que se ha encontrado adecuada para la
selección de células vegetales transformadas genéticamente es la
\beta-glucuronidasa ("GUS"), realizándose la
selección utilizando un compuesto glucurónido que comprende un
regulador de crecimiento de las plantas que es escindido por la
\beta-glucuronidasa, v.g. un glucurónido de
citoquinina (cuyo significado será evidente a partir de los ejemplos
dados en esta memoria). Es sorprendente que la selección de células
vegetales transformadas genéticamente pueda conseguirse utilizando
un gen GUS, dado que se ha encontrado en conexión con la presente
invención que las plantas superiores poseen actividad de GUS
nativa. Este descubrimiento está en contraste con lo que se ha
publicado previamente. Así, el documento GB 2 197
653-A afirma que las plantas superiores no contienen
actividad detectable alguna de \beta-glucuronidasa
e implica por consiguiente que, dado que no se encuentra actividad
de GUS en las plantas superiores, es una cuestión relativamente
sencilla controlar la expresión de una construcción génica de
interés utilizando el gen GUS. Sin embargo, como se explica más
adelante (véanse los ejemplos), esto no es cierto, y el uso de un
gen GUS para observar la presencia de un gen de interés no es en
absoluto simple o sencillo, debido al hecho de que las plantas
superiores contienen realmente una actividad intrínseca
significativa (de fondo) de
\beta-glucuronidasa.
Así, para la selección de células vegetales
transformadas genéticamente, la población de células puede
cultivarse sobre o en el interior de un medio que contiene un
glucurónido de citoquinina que en las células transformadas es
escindido por la \beta-glucuronidasa, liberando
con ello citoquinina libre y conduciendo a la inducción de brotes
y/o callo en las células transformadas.
Se han desarrollado cierto número de nuevos
compuestos glucurónidos de citoquinina para los propósitos de la
presente invención. La preparación de estos compuestos, así como su
uso para selección positiva de células transformadas genéticamente
se describe en detalle más adelante.
En ciertos casos puede ser deseable modificar el
método básico descrito en esta memoria, v.g. para proporcionar una
selección más eficaz o simplificar el procedimiento de selección.
Cuando el compuesto inactivo utilizado para el procedimiento de
selección positiva es uno que es escindido por la
\beta-glucuronidasa, el método básico puede
modificarse por diversos medios para producir un mejor resultado.
Uno de estos medios es el uso de ciertos compuestos glucurónidos de
esterol, v.g.
colesteril-\beta-D-glucurónido
o
\beta-sitosteril-\beta-D-glucurónido,
junto con un compuesto inhibidor de la síntesis de esteroles tal
como tridemorf
(4-tridecil-2,6-dimetil-morfolina).
Los Ejemplos 5 y 6 siguientes describen el uso de tales compuestos.
Se cree que por el uso de un inhibidor de la síntesis de esteroles
junto con glucurónidos de esterol que contrarrestan el efecto del
inhibidor de la síntesis de esteroles sobre la hidrólisis por la
\beta-glucuronidasa, puede evitarse la denominada
"alimentación cruzada" (es decir, la difusión del compuesto
activado desde la célula en la que está activado a otra célula)
durante el proceso de selección, dado que los compuestos esterólicos
no se difunden de célula a célula cuando se escinde el resto
hidrófilo del glucurónido. Así, se obtiene un efecto más localizado.
Pueden obtenerse resultados correspondientes con un gran número de
otros glucurónidos que contienen una aglicona hidrófoba.
Como se ha explicado con anterioridad, se ha
encontrado que, en contraste con lo que ha sido publicado
previamente, las plantas superiores poseen de hecho actividad de
GUS nativa. Por esta razón, la mera introducción de un gen GUS en
una planta puede no ser necesariamente suficiente para obtener la
selección deseada de las células transformadas genéticamente, y
puede ser necesario o deseable reducir cualquier actividad de
\beta-glucuronidasa nativa en la población de
células. Dado que una \beta-glucuronidasa
introducida puede tener propiedades diferentes que una
\beta-glucuronidasa nativa, una reducción de
cualquier actividad de \beta-glucuronidasa nativa
puede realizarse de maneras diferentes, v.g. por adición al medio
de cultivo de un compuesto inhibidor de
\beta-glucuronidasa que tenga más efecto
inhibidor sobre la \beta-glucuronidasa nativa que
sobre la \beta-glucuronidasa codificada por el
nucleótido o subsecuencia del mismo. Un tipo de compuesto de esta
clase es una sal de amonio.
La actividad de
\beta-glucuronidasa nativa en la población de
células puede reducirse también sustancialmente por adición al
medio de cultivo de un compuesto que, por hidrólisis, da como
resultado un producto que inhibe la actividad de la
\beta-glucuronidasa nativa, y que inhibe
preferiblemente la actividad de la
\beta-glucuronidasa nativa más de lo que es
inhibida la actividad de la \beta-glucuronidasa
introducida. Esto puede realizarse de una manera autorregulada o
localizada, v.g. localizada a compartimientos específicos en los
cuales el gen GUS introducido está localizado o no está localizado.
Un ejemplo de un producto de hidrólisis que inhibe la
\beta-glucuronidasa nativa es el ácido
glucurónico, v.g. resultante de la hidrólisis del ácido
glucirricínico o de esteril-glucurónidos.
La actividad de
\beta-glucuronidasa nativa en la población de
células puede reducirse ulteriormente por adición al medio de
cultivo de un inhibidor de \beta-glucuronidasa, en
particular un b-glucurónido que en las células sin
un gen de \beta-glucuronidasa introducido inhibe
la actividad de \beta-glucuronidasa más que en las
células que tienen un gen de \beta-glucuronidasa
introducido. Este puede ser, v.g., un sustrato pobre en
\beta-glucuronidasa (un glucurónido) que tenga
una afinidad mayor para la \beta-glucuronidasa
nativa que para la \beta-glucuronidasa
introducida.
La \beta-glucuronidasa
codificada por el gen de \beta-glucuronidasa
introducido utilizado para los propósitos de la presente invención
es activa en un intervalo de pH relativamente amplio, mientras que
la \beta-glucuronidasa nativa encontrada en una
diversidad de especies de plantas diferentes es únicamente activa
dentro de un intervalo de valores de pH relativamente estrecho, que
de manera típica es aproximadamente pH 4-5 (véase el
Ejemplo 3 más adelante). La actividad de
\beta-glucuronidasa nativa puede reducirse por
consiguiente en este caso por adición al medio de cultivo de un
glucurónido que es susceptible de ser hidrolizado por la
\beta-glucuronidasa nativa y que, por hidrólisis,
da como resultado un aumento de pH, v.g.
o-cumaril-glucurónido.
Dado que se ha encontrado que la
\beta-glucuronidasa nativa de las plantas es
generalmente activa a un pH de aproximadamente 4-5,
la actividad de \beta-glucuronidasa nativa puede
reducirse también por adición al medio de cultivo de un compuesto
regulador del pH que proporcione al medio de cultivo un pH
comprendido entre aproximadamente 5,5 y 8,5, de modo preferible
entre aproximadamente 6,0 y 8,0, v.g. entre aproximadamente 6,5 y
7,5, o un compuesto regulador del pH que eleve el pH en las células
o en compartimientos de las células a un valor de pH comprendido
dentro de estos intervalos. A estos valores de pH, la
\beta-glucuronidasa codificada por gen GUS
introducido es activa, pero la
\beta-glucuronidasa nativa es sustancialmente
inactiva. Un ejemplo de un compuesto regulador del pH que puede
utilizarse es una sal de amonio o un compuesto liberador de amonio,
v.g., nitrato de amonio.
Por último, la actividad de
\beta-glucuronidasa nativa puede reducirse o
eliminarse sustancialmente por un tratamiento físico tal como un
tratamiento térmico, v.g. utilizando una temperatura comprendida en
el intervalo de 50-65ºC en forma de un tratamiento
mediante pulsos breves de aproximadamente 1-2 días
antes de la transferencia al sustrato de selección y/o la
utilización de una temperatura comprendida en el intervalo de
30-45ºC durante la selección (véase el Ejemplo
10).
La transformación genética de células vegetales
se realiza a menudo utilizando cepas de Agrobacterium, en
particular cepas de Agrobacterium tumefaciens. Se ha
encontrado que ciertas cepas desarmadas de Agrobacterium
inducen la formación de brotes debido a la producción de sustancias
inductoras de brotes durante el co-cultivo, y cepas
de este tipo deberían evitarse normalmente cuando vaya a emplearse
la hidrólisis por GUS de los glucurónidos de citoquinina para
propósitos de selección de células transformadas genéticamente. Así
pues, la transformación genética de las células utilizando un
glucurónido de citoquinina como compuesto inactivo se realiza
preferiblemente utilizando una cepa de Agrobacterium que no
produce citoquininas u otros compuestos inductores de brotes
(crecimiento), o que produce solamente una cantidad insustancial de
dichos compuestos, eliminando o reduciendo sustancialmente por ello
la inducción del crecimiento de brotes debido a la presencia de
bacterias vivas sobre o en el interior de las células.
En ciertos casos, v.g. cuando se desea una
frecuencia de selección incrementada, puede ser ventajoso que la
secuencia de nucleótidos deseada se introduzca conjuntamente con al
menos dos genes de selección diferentes. El gen de selección
adicional puede ser un gen adicional que codifique una enzima (u
otro polipéptido o proteína) adecuada para selección positiva de
acuerdo con la presente invención, o puede ser un gen que codifique
una enzima (u otra proteína o polipéptido) adecuada para selección
negativa tradicional, v.g. que codifique resistencia a una toxina,
antibiótico o herbicida. De este modo, pueden seleccionarse células
transformadas genéticamente utilizando una combinación de selección
positiva y selección negativa, co-introduciéndose
adicionalmente la secuencia de nucleótidos deseada en las células
transformadas genéticamente con una subsecuencia que codifique
resistencia al menos a una toxina, antibiótico o herbicida,
comprendiendo el medio al menos un tóxico, antibiótico o herbicida
al cual son resistentes las células transformadas.
Como se ha mencionado anteriormente, en un
aspecto de la presente invención se dan a conocer células
transformadas genéticamente que se han seleccionado de acuerdo con
el método anterior, en particular células vegetales, así como
plantas, progenie o semillas derivadas de dichas células vegetales
transformadas genéticamente. En particular, es a menudo ventajoso
que estas células son células vegetales transformadas genéticamente
cuyo genoma no contiene como marcador de selección una secuencia de
nucleótidos introducida (es decir no nativa) codificante de
resistencia a toxinas, antibióticos o herbicidas. Como se ha
explicado anteriormente, existen preocupaciones acerca de si es
seguro incorporar genes codificantes de v.g. resistencia a los
antibióticos, v.g., en las plantas alimenticias. Las células
vegetales transformadas genéticamente seleccionadas por el método
de la presente invención que no contienen genes de selección para
v.g. resistencia a antibióticos, así como plantas, progenie y
semillas derivadas de dichas células, son por consiguiente
claramente ventajosas desde este punto de vista.
Diversos métodos de mayor o menor generalidad
están disponibles para la síntesis de los glucurónidos de
citoquinina abarcados por la fórmula general I, y a continuación se
describen dos de los que se consideran como los mejores de dichos
métodos:
A) Oxidación del D-glucosido
de citoquinina correspondiente. En este método, el grupo
-CH_{2}OH unido al anillo de piranosa del
\beta-D-glucosido correspondiente
al glucurónido en cuestión se oxida a una función carboxilo en
condiciones apropiadas. Probablemente, el mejor método de conseguir
esta reacción de oxidación de una manera directa y altamente
selectiva es la oxidación catalítica por el oxígeno, utilizando
convenientemente negro de platino o platino sobre carbono como
catalizador y empleando un medio de reacción débilmente básico (pH
8-10) acuoso o acuoso-alcohólico
(por ejemplo acuoso-etanólico); la reacción puede
llevarse a cabo adecuadamente a una temperatura comprendida en el
intervalo de 60-100ºC durante un período de tiempo
de 2 a 24 horas. Puede ser también aplicable la oxidación
(generalmente no catalítica) por agentes oxidantes convencionales
distintos del oxígeno, pero se prevé que las reacciones de
oxidación resultantes darán, en general, rendimientos más bajos y
tendrán una especificidad más deficiente; [es decir, conducirán a
mezclas de productos de oxidación - a no ser que se tomen
particularmente medidas para proteger otras funcionalidades
oxidables del material de partida glucosídico por la introducción
de grupos protectores apropiados (véase más adelante)].
Un ejemplo del método de oxidación catalítica es
proporcionado por el Método 1 del Ejemplo 1C en la presente
solicitud, en el cual
N^{6}-benciladenina-9-\beta-D-glucopiranosido
(BA9G) se oxida a ácido
N^{6}-benziladenina-9-\beta-D-glucopiranurónico
(que se aísla subsiguientemente como la sal de sodio) por oxidación
con oxígeno en presencia de negro de platino. Este método parece
ser de aplicabilidad bastante general para la síntesis de
9-glucurónidos de citoquinina a partir de los
9-glucosidos correspondientes. Se ha encontrado
también satisfactorio para la síntesis de, por ejemplo,
zeatin-o-glucurónido (véase el
Ejemplo 1G de esta memoria) a partir del
zeatin-O-glucosido correspondiente;
el zeatin-O-glucurónido es un
ejemplo de un compuesto de fórmula I de acuerdo con la invención en
el cual el resto glucurónido es un sustituyente en un resto R^{6}
- como se define en esta memoria - del tipo alquenilo
C_{2-8}, y se cree que el método en cuestión tiene
una aplicabilidad bastante amplia para otros glucurónidos de
citoquinina de acuerdo con la invención en los cuales un resto
O-glucurónido se encuentra como sustituyente en un
grupo R^{6} que es uno de los tipos siguientes que se definen en
conexión con la fórmula general I: un grupo bencilo; un grupo
alquilo C_{1-8} o alquilo
C_{1-8} sustituido; un grupo alquenilo
C_{2-8} o un grupo alquenilo
C_{2-8} sustituido.
Este método no parece, sin embargo, ser
aplicable generalmente, por ejemplo, a la síntesis de
3-glucurónidos de citoquinina.
Como ya se ha indicado, está claro que cuando se
aplica un método que implica oxidación de un glucosido de
citoquinina, cualesquiera otros grupos funcionales oxidables (en las
condiciones de oxidación de que se trate) que pueden estar
presentes en el glucosido de citoquinina de partida y que deban
permanecer inalterados en el glucurónido final de fórmula I tienen
que ser protegidos por el establecimiento previo de grupos
protectores adecuados. Ejemplos de grupos potencialmente oxidables
que pueden estar presentes en compuestos comprendidos dentro de la
definición de la fórmula I son [con referencia a sus posiciones como
se especifican en conexión con la fórmula general I (véase
anteriormente)]: un grupo -SH que puede estar presente como un grupo
R^{2} y/o R^{8}; grupos hidroxi o glucosiloxi que pueden estar
presentes como sustituyentes en los grupos R^{6} del tipo alquilo
C_{1-8} sustituido o del tipo alquenilo
C_{2-8} sustituido; y grupos ribosilo,
5'-fosforribosilo o glucosilo que pueden estar
presentes como grupos R^{9} o R^{7}. Si, por ejemplo, es
necesario proteger grupos hidroxi alifáticos (alcohólicos), tales
como grupos hidroxi en átomos de carbono secundarios en los grupos
ribosilo, 5'-fosforribosilo o glucosilo, grupos
protectores adecuados serán a menudo, v.g., grupos acetilo que
pueden introducirse por métodos que son bien conocidos por los
expertos en la técnica y que pueden eliminarse, después del
procedimiento de oxidación, por hidrólisis alcalina.
Sin embargo, cuando se utiliza el método de
oxidación catalítica suave descrito anteriormente, los grupos
hidroxi en átomos de carbono alifáticos primarios son, en general,
susceptibles de oxidación, mientras que los grupos hidroxi en átomos
de carbono secundarios (y terciarios) generalmente no lo son; así,
en la oxidación del resto -CH_{2}OH en la posición 5 del anillo de
glucopiranosa de un
\beta-D-glucosido de citoquinina
de esta manera, los grupos hidroxi existentes en las posiciones 2, 3
y 4 del anillo de glucopiranosa no requerirán generalmente
protección. Un grupo -SH que deba estar presente como grupo R^{2}
o R^{8} requerirá, en cambio, protección durante esta oxidación
catalítica, y un grupo -SH de este tipo puede protegerse
adecuadamente como el derivado de bencilo (véase más adelante en
conexión con el método B descrito posteriormente).
Numerosos glucosidos de citoquinina apropiados
para uso como materiales de partida en este método están disponibles
comercialmente; por ejemplo, una gran diversidad de éstos pueden
obtenerse de Apex Organics Ltd., Leicester, Inglaterra, y algunos
9-glucosidos de citoquinina pueden obtenerse de
Sigma Chemical Company, P.O. Box 14508, St. Louis, MO 63178, EE.UU.
Los glucosidos de citoquinina pueden prepararse también por métodos
establecidos publicados en la bibliografía. Por ejemplo, la
síntesis de una diversidad de 9-glucosidos de
citoquinina apropiados que tienen grupos R^{6} abarcados dentro
de la presente definición de los mismos puede lograrse por extensión
directa del método publicado por Cowley et al. [Aust. J.
Chem. 31 (1978) 1095] para la síntesis de
9-\beta-D-glucopiranosidos
de zeatina y N^{6}-benciladenina.
B) Síntesis del tipo
Koenigs-Knorr. Este método, que está basado en
el método original de W. Koenigs y E. Knorr [Chem. Ber.
34 (1901) 957], implica la reacción de
(2,3,4-tri-O-acetil-\alpha-D-glucopiranosil-bromuro)uronato
de metilo [abreviado MBTG; un método adecuado para su preparación
ha sido descrito por Bollenback et al., J. Amer. Chem.
Soc. 77 (1955) 3310] con un grupo hidroxi alcohólico o
fenólico, un grupo mercapto (-SH) o un átomo de nitrógeno en el
anillo en un resto aromático o heterocíclico insaturado.
Este enfoque proporciona probablemente el método
de aplicación más general para la síntesis de glucurónidos de
citoquinina de acuerdo con la invención (o de glucurónidos de
precursores que pueden convertirse después fácilmente en los
glucurónidos de citoquinina deseados), partiendo de citoquininas
apropiadas [o precursores de citoquinina (véase más adelante)], y se
cree que es de aplicabilidad muy general en la preparación de los
compuestos abarcados dentro de la fórmula general I.
El procedimiento general es como sigue: la
citoquinina o el precursor de citoquinina apropiado(a) (véase
más adelante), disuelto(a) en un disolvente tal como
N,N-dimetilformamida (DMF), quinolina, carbonato de
propileno, metanol o éter dietílico, se deja reaccionar con
1,25-2 equivalentes molares de MBTG a una
temperatura comprendida en el intervalo de 25-100ºC
durante un período de 3 a 96 horas, preferiblemente en presencia de
un agente de barrido de haluro (bromuro) añadido tal como óxido de
plata o carbonato de plata (cuando se emplea, por ejemplo, DMF como
disolvente, el propio disolvente funciona a menudo adecuadamente
como agente de barrido de haluro, en cuyo caso no es esencial la
adición de un agente de barrido ulterior). Esta reacción produce el
éster metílico del glucurónido peracetilado intermedio, que
generalmente se aísla y se purifica; esto puede realizarse
convenientemente, por ejemplo, (i) por evaporación del disolvente,
seguida por extracción del residuo con un disolvente tal como
cloroformo, eliminación del último disolvente del extracto y
purificación del compuesto intermedio bruto resultante por técnicas
de recristalización y/o cromatografía en columna convencionales; o,
por ejemplo, (ii) por separación del compuesto intermedio a partir
de la mezcla de reacción mediante cromatografía en columna
convencional realizada directamente sobre la mezcla de reacción,
seguido por eliminación del disolvente de elución a partir de la o
las fracciones eluidas de interés y recristalización del producto
bruto.
En los casos en que el producto final de fórmula
I deseado debe tener el resto glucurónido en la forma amida
(glucuronamida), la conversión de la forma de éster metílico
peracetilado del resto glucurónido en la forma amida se realiza
adecuadamente en esta etapa, y esto puede realizarse generalmente
por tratamiento del éster metílico peracetilado (preferiblemente
purificado, v.g. de la manera expuesta anteriormente) con una
solución de amoníaco anhidro en metanol anhidro a temperatura baja,
v.g. una temperatura comprendida entre 0ºC y -10ºC, o - como una
posibilidad alternativa - con una solución acuosa concentrada
(convenientemente saturada) de amoníaco aproximadamente a la
temperatura ambiente, durante un período de 0,5-4
horas. La glucuronamida puede aislarse luego por evaporación de la
solución de amoníaco, v.g. a vacío, y recristalización en un
disolvente o mezcla de disolventes apropiado(a), tal como
etanol acuoso al 90%. Un ejemplo de esta conversión se proporciona
en el Ejemplo 1B de esta memoria, en el cual se prepara
N^{6}-benciladenina-3-glucuronamida
(BA3GNamida) a partir del éster metílico correspondiente.
Adicionalmente, en el caso de procedimientos que
parten de ciertos tipos de precursores de citoquinina, una
transformación química que es necesaria a fin de convertir el resto
precursor de citoquinina en el resto de citoquinina apropiado puede
realizarse a menudo sobre el éster metílico antes de proceder a
liberar el glucurónido libre. Como ejemplo, la síntesis de
citoquinina-9-glucurónidos (cuya
síntesis por un método de oxidación catalítica ha sido ya descrita
anteriormente) puede realizarse normalmente de manera satisfactoria
partiendo de una purina sustituida o no sustituida que tiene un
átomo de cloro en la posición 6; el compuesto final clorado en la
posición 6 puede convertirse por regla general en el éster metílico
del 9-glucurónido peracetilado correspondiente por
medio del procedimiento general descrito anteriormente con empleo de
MBTG, y el grupo cloro de la posición 6 puede convertirse luego
convenientemente en el resto -NH-R^{6} dejando que
el producto de la última reacción reaccione con la amina
correspondiente (R^{6}-NH_{2}), que por lo
general puede generarse adecuadamente in situ a partir del
hidrocloruro de amina (R^{6}-NH_{2}\cdotHCl) y
un exceso (convenientemente un exceso molar de 2-4
veces) de una base apropiada, v.g. una amina alifática terciaria tal
como trietilamina, en un disolvente polar adecuado, tal como un
alcohol alifático C_{1-4}, a una temperatura
comprendida en el intervalo de 65 a 120ºC. Esto se ilustra por el
Método 2 del Ejemplo 1C de esta memoria, en el cual se describe la
síntesis de
N^{6}-benciladenina-9-glucurónido
(BA9GN) (en forma de su sal de sodio) por este método.
Los grupos acetilo en el resto glucurónido se
eliminan luego por hidrólisis en medio básico utilizando una base
tal como hidróxido de sodio acuoso, hidróxido de sodio acuoso
metanólico o etanólico, o amoníaco metanólico a una temperatura
comprendida en el intervalo de 0 a 25ºC durante un período de 0,5 a
6 horas. Utilizando una base tal como una de las soluciones de
hidróxido de sodio acuosas o alcohólicas mencionadas anteriormente,
este procedimiento da - después de neutralización del exceso de base
- la forma de sal del glucurónido de citoquinina correspondiente,
mientras que el uso de un reactivo tal como amoníaco metanólico y la
eliminación subsiguiente del amoníaco en exceso por evaporación
conduce a la forma amida del glucurónido. La última se purifica
convenientemente por medios convencionales, tales como
cromatografía, particularmente cromatografía en fase inversa, y/o
recristalización en un disolvente adecuado, tal como un disolvente
acuoso orgánico, v.g. etanol acuoso al 80-90%.
Evidentemente, si la citoquinina de partida o el
precursor de citoquinina contiene una o más funcionalidades que son
capaces de reaccionar con MBTG en las condiciones de reacción en
cuestión, y que deben estar presentes inalterados en el glucurónido
final de fórmula I, entonces dichas funcionalidades tienen que
protegerse por el establecimiento previo de grupos protectores
adecuados; ejemplos de dichas funcionalidades reactivas que pueden
estar presentes en las citoquininas de partida que conducen a
compuestos comprendidos dentro de la definición de la fórmula I son
[con referencia a su posición tal como se especifica en conexión con
la fórmula general I (véase anteriormente)]: -OH o -SH presente
como un grupo R^{2}; -OH o -SH presente como un grupo R^{8};
-OH o -NH_{2} presente como sustituyente en el anillo fenilo de un
grupo R^{6} del tipo bencilo sustituido; -OH o grupos glucosiloxi
presente(s) como sustituyente(s)
en un grupo R^{6} del tipo alquilo C_{1-8} sustituido o tipo alquenilo C_{2-8} sustituido; grupos ribosilo, 5'-fosforribosilo o glucosilo que pueden estar presentes como grupos R^{9} o R^{7}; y -NH_{2} en un grupo -CH_{2}CH(NH_{2})COOH presente como un grupo R^{9}.
en un grupo R^{6} del tipo alquilo C_{1-8} sustituido o tipo alquenilo C_{2-8} sustituido; grupos ribosilo, 5'-fosforribosilo o glucosilo que pueden estar presentes como grupos R^{9} o R^{7}; y -NH_{2} en un grupo -CH_{2}CH(NH_{2})COOH presente como un grupo R^{9}.
Con respecto a los grupos protectores adecuados
para la protección de los ejemplos mencionados anteriormente de
funcionalidades reactivas que pueden estar presentes en las
citoquininas de partida, un grupo -OH puede protegerse
adecuadamente por regla general por introducción de un grupo acetilo
(véase anteriormente en conexión con el método de preparación por
oxidación de compuestos de fórmula I) a fin de formar el grupo
acetoxi (-OOCCH_{3}) correspondiente. Un grupo -SH puede
protegerse por regla general muy convenientemente como el derivado
benciltioéter (-SCH_{2}C_{6}H_{5}) por introducción de un
grupo bencilo [v.g. por reacción con cloruro de bencilo de manera
similar a la descrita con mayor detalle más adelante en conexión con
los precursores de citoquinina que contienen, al menos formalmente,
grupos oxo (=O) o tioxo (=S) en la posición 2, y un grupo oxo en la
posición 6 (véase más adelante)]. Un grupo -NH_{2} puede
protegerse por regla general convenientemente por conversión en un
grupo ftalimido como sigue: la citoquinina o el precursor de
citoquinina se calienta con un exceso de anhídrido ftálico en un
disolvente relativamente inerte, tal como cloroformo o
1,2-dimetoxietano, a una temperatura comprendida en
la región de 70-100ºC durante un período de horas, a
menudo de manera conveniente aproximadamente 4 horas. El grupo
-NH_{2} puede, después de la realización de la reacción de tipo
Koenigs-Knorr, regenerarse subsiguientemente por
tratamiento con una solución acuoso-alcohólica (tal
como una solución acuoso- etanólica) de hidrazina.
Un grupo de precursores de citoquinina que son
particularmente adecuados para uso en la síntesis de glucurónidos
de citoquinina de acuerdo con la invención que tienen el resto
glucurónido (correspondiente a R^{10} en la fórmula general I)
unido como -O-R^{10} o -S-R^{10}
en la posición 2 del sistema de anillos de la purina son
precursores de citoquinina que contienen, al menos formalmente,
grupos oxo (=O) o tioxo (=S) en la posición 2, y un grupo oxo en la
posición 6; aquí debería mencionarse que los compuestos de los tipos
en cuestión que tienen grupos 2-oxo y
2-tioxo se encontrarán generalmente, al menos en
solución, en equilibrio tautómero con los compuestos
2-hidroxi y 2-mercapto
correspondientes (estando presente entonces el grupo
6-oxo como un grupo 6-hidroxi), y
las formas tautómeras últimas estarán presentes, en general, en una
proporción significativa.
El grupo hidroxi o mercapto mencionado
últimamente en la posición 2, se convierte, en la fase final del
procedimiento de síntesis global, por medio del procedimiento de
tipo Koenigs-Knorr, en el grupo
-O-R^{10} o -S-R^{10}
correspondiente, respectivamente; sin embargo, antes de realizar la
secuencia de reacciones del tipo Koenigs-Knorr, el
grupo 6-hidroxi se convierte adecuadamente, pasando
por su conversión intermedia en un grupo 6-halo
(preferiblemente 6-cloro) en el resto
-NH-R^{6} que se muestra en la fórmula I, y esto
requiere generalmente que el grupo hidroxi o mercapto de la
posición 2 se proteja por medio de un grupo protector adecuado
durante esta secuencia de conversión. Para estos dos grupos
citados, el grupo protector de elección es un grupo bencilo, que
puede introducirse normalmente de manera directa por una reacción
que implica la adición gradual de un ligero exceso de cloruro de
bencilo a una solución o suspensión agitada del precursor de
citoquinina en cuestión en una base acuosa (pH típico,
aproximadamente 12-13), tal como hidróxido de sodio
o de potasio acuoso, aproximadamente a la temperatura ambiente.
Después de agitación continuada durante un período de, típicamente,
1-2 horas, la mezcla de reacción se neutraliza por
adición de, v.g., ácido acético glacial, y el producto insoluble
protegido con bencilo se aísla por filtración.
El grupo 6-hidroxi del derivado
de 2-benciloxi- o
2-benciltio-6-purinol
resultante se convierte luego en un grupo 6-cloro,
utilizando convenientemente un exceso de un reactivo de cloración
tal como oxicloruro de fósforo (cloruro de fosforilo) en presencia
de una base orgánica, tal como N,N-dietilanilina; la
última reacción se realizará normalmente en condiciones de reflujo
durante un período comprendido entre aproximadamente 10 minutos y
aproximadamente 3 horas.
El grupo 6-cloro puede
convertirse luego convenientemente en el resto
-NH-R^{6} deseado dejando que el producto de la
última reacción reaccione con la amina correspondiente,
R^{6}-NH_{2}, que por regla general se generará
convenientemente in situ a partir del hidrocloruro de amina
(R^{6}-NH_{2}\cdotHCl) y un exceso
(convenientemente un exceso molar de 2-4 veces) de
una base apropiada, v.g. una amina alifática terciaria tal como
trietilamina, en un disolvente polar adecuado, tal como un alcohol
alifático C_{1-4} (v.g.
1-butanol), a una temperatura comprendida en el
intervalo de 65-120ºC.
Después de aislar el producto, el grupo
protector se separa para regenerar el grupo
2-hidroxi o 2-mercapto libre; en el
caso de un grupo protector bencilo, esto puede realizarse
convenientemente, por ejemplo, por tratamiento del producto con un
exceso de sodio en amoníaco líquido.
En el caso de productos que tengan un grupo
2-mercapto en esta etapa, se cree que será
generalmente ventajoso convertir el grupo
2-mercapto en una forma de sal (-S^{-}), v.g. la
forma de sal de potasio, antes de proceder a introducir el resto
glucurónido por medio del procedimiento de tipo
Koenigs-Knorr descrito anteriormente. Un ejemplo de
un procedimiento adecuado para este propósito se describe en el paso
4 del Ejemplo práctico 1E de esta memoria, y se considera que las
condiciones descritas en el mismo son de aplicabilidad bastante
general. No obstante, puede ser posible en algunos casos realizar la
reacción de tipo Koenigs-Knorr con MBTG (véase más
adelante) directamente sin conversión previa del grupo
2-mercapto en la forma de sal.
Por último, el resto glucurónido se introduce
por reacción con MBTG como se ha descrito anteriormente en conexión
con el procedimiento de tipo Koenigs-Knorr.
Un ejemplo que ilustra la secuencia de los pasos
de síntesis descritos anteriormente se da en el Ejemplo 1E para la
síntesis de la sal de sodio de
N^{6}-(2'-isopentenil)adenina-2-tioglucurónido
(IP2SGN) a partir de 2-tioxantina, y se considera
que gran parte de la información adicional proporcionada en dicho
lugar con relación a la elección de los disolventes para
recristalización y extracción, elección de concentraciones y
cantidades de reactivos, etc., es de aplicabilidad más general en la
realización de la secuencia de reacciones expuestas anteriormente a
partir de un precursor de citoquinina que tenga un grupo
"2-tioxo" (es decir un grupo
2-mercapto) y un grupo "6-oxo"
(es decir, un grupo 6-hidroxi).
Análogamente, un grupo de precursores de
citoquinina que son particularmente muy adecuados para uso en la
síntesis de glucurónidos de citoquinina de acuerdo con la invención
que tienen el resto glucurónido (correspondiente a R^{10} en la
fórmula general I) unido como -O-R^{10} o
-S-R^{10} en la posición 8 del sistema de anillos
de la purina, son precursores de citoquinina que contienen, al menos
formalmente (por razones similares a las expuestas anteriormente en
conexión con los precursores de citoquinina que tienen un grupo
formal 2-oxo o 2-tioxo y un grupo
formal 6-oxo), un grupo oxo (=O) o tioxo (=S) en la
posición 8, y que tienen adicionalmente un grupo hidroxi en la
posición 6. Estos pueden, por regla general, convertirse en el
producto final deseado de fórmula I utilizando una secuencia de
reacciones (protección, introducción de un grupo cloro en posición
6, introducción del resto -N-R^{6}, desprotección,
y por último reacción con MBTG) análogamente a lo expuesto con
anterioridad para los glucurónidos de citoquinina que tienen el
resto glucurónido unido como -O-R^{10} o
-S-R^{10} en la posición 2 del sistema de anillos
de la purina. Un ejemplo de esto se proporciona por el Ejemplo 1F
de esta memoria para la síntesis de
N^{6}-(2'-isopentenil)-adenina-8-tioglucurónido
(como la forma de sal de sodio del mismo).
Los compuestos de la fórmula I en al cual el
resto glucurónido se encuentra en la forma de ácido carboxílico,
pueden, en general, prepararse a partir de la forma de sal
correspondiente, v.g. la forma de sal de sodio (preparada de manera
ya expuesta anteriormente) por acidificación de una solución agitada
o solución/suspensión de la forma de sal en un disolvente apropiado
(v.g. un alcohol acuoso, tal como etanol acuoso), preferiblemente a
una temperatura inferior a 25ºC, con un ácido mineral tal como ácido
clorhídrico a un pH de aproximadamente 2,5. Después de agitar
durante unos cuantos minutos, se separa luego el disolvente a vacío.
El residuo bruto puede someterse ventajosamente a un tratamiento
cromatográfico para separar las sales inorgánicas (véase, v.g., el
Ejemplo 1I de esta memoria para detalles de un procedimiento típico
y un sustrato cromatográfico adecuado para este propósito), después
de lo cual el producto puede recristalizarse en un disolvente
apropiado, típicamente un disolvente polar tal como metanol o
etanol.
Los compuestos de la fórmula I en la cual el
resto glucurónido se encuentra en la forma de éster metílico o
éster etílico pueden prepararse generalmente de manera muy
conveniente, y con alto rendimiento, por reacción de la forma
correspondiente de ácido carboxílico del glucurónido de citoquinina
(preparado, por ejemplo, como se ha descrito anteriormente) con
diazometano o diazoetano, respectivamente, utilizando condiciones de
reacción que son normales para este tipo de reacción y que serán
bien conocidas para una persona experta en la técnica.
Numerosas citoquininas y numerosos precursores
de citoquinina apropiados para uso como materiales de partida en
conexión con el método B) anterior están disponibles comercialmente,
en tanto que otros pueden sintetizarse por métodos establecidos
publicados en la bibliografía. Por ejemplo, la síntesis de una
diversidad de adeninas sustituidas en N^{6} apropiadas que tienen
grupos R^{6} abarcados dentro de la presente definición de los
mismos pueden producirse por métodos de la bibliografía consignados
por Iwamura et al. [Phytochemistry 19 (1980)
1309], y numerosas
N^{6}-(2'-isopentenil)adeninas sustituidas
en posición 2, 8 y 2,8 que tienen grupos R^{2} y/o R^{8}
abarcados dentro de la presente definición de los mismos pueden
prepararse como ha sido descrito por Dammann et al.
[Phytochemistry 13 (1974) 329].
Compuestos de fórmula I preferidos actualmente
son los siguientes:
un compuesto de fórmula I en la cual R^{2} es
H, R^{3} es un grupo
\beta-D-glucopiranuronosilo o una
sal del mismo en la función ácido carboxílico, R^{9} y X son
semienlaces que forman juntos en enlace, R^{6} es bencilo,
R^{7} e Y son semienlaces que forman juntos un enlace, y R^{8}
es H;
un compuesto de fórmula I en la cual R^{2} es
H, R^{3} es el derivado amida de un
\beta-D-glucopiranuronosilo en la
función ácido carboxílico del mismo, R^{9} y X son semienlaces que
forman juntos un enlace, R^{6} es bencilo, R^{7} e Y son
semienlaces que forman juntos un enlace, y R^{8} es H;
un compuesto de fórmula I en la cual R^{2} es
H, R^{3} y X son semienlaces que forman juntos un enlace, R^{9}
es un grupo
\beta-D-glucopiranuronosilo o una
sal del mismo en la posición ácido carboxílico, R^{6} es bencilo,
R^{7} e Y son semienlaces que forman juntos un enlace, y R^{8}
es H;
un compuesto de fórmula I en la cual R^{2} es
H, R^{3} es un grupo
\beta-D-glucopiranuronosilo o una
sal del mismo en la función ácido carboxílico, R^{9} y X son
semienlaces que forman juntos un enlace, R^{6} es
2-isopentenilo, R^{7} e Y son semienlaces que
forman juntos un enlace, y R^{8} es H;
un compuesto de fórmula I en la cual R^{2} es
un grupo
-S-\beta-D-glucopiranuronosilo
o una sal del mismo en la función ácido carboxílico, R^{9} es H,
R^{3} y X son semienlaces que forman juntos un enlace, R^{6} es
2-isopentenilo, R^{7} e Y son semienlaces que
forman juntos un enlace, y R^{8} es H;
un compuesto de fórmula I en la cual R^{2} es
H, R^{9} es H, R^{3} y X son semienlaces que forman juntos un
enlace, R^{6} es 2-isopentenilo, R^{7} e Y son
semienlaces que forman juntos un enlace, y R^{8} es un grupo
-S-\beta-D-glucopiranuronosilo
o una sal del mismo en la función ácido carboxílico; y
un compuesto de fórmula I en la cual R^{2} es
H, R^{3} y X son semienlaces que forman juntos un enlace, R^{9}
es H, R^{6} es un grupo de la fórmula
o una sal del mismo, R^{7} e Y
son semienlaces que forman juntos un enlace, y R^{8} es
H.
Los compuestos de fórmula II pueden prepararse
directamente utilizando como material de partida el éster metílico
de ácido o-cumárico (es decir ácido
3-(2-hidroxifenil)-2-propenoico)
preparado fácilmente. El último éster se puede preparar por
calentamiento del ácido libre (obtenido, por ejemplo, de Aldrich
Chemical Company, Gillingham, Dorset, Inglaterra, bajo el número de
catálogo H2,280-9) a reflujo en metanol en presencia
de ácido sulfúrico. Debe indicarse aquí que se obtiene una mezcla
de las formas cis y trans (con respecto al doble enlace etilénico)
del resto. Se cree que la forma trans predomina por regla general
inicialmente, con indiferencia del método de preparación. Sin
embargo, esto carece de importancia, dado que se ha encontrado que
tanto los glucurónidos cis (cumarinilo) como trans (cumarilo) se
convierten finalmente en cumarina después de la hidrólisis por GUS,
debido al hecho de que el ácido cumárico se convierte lentamente
(por medios no enzimáticos; presumiblemente por la acción
catalítica de la luz) en cumarina a lo largo de un período de unos
cuantos días.
Procedimientos eficientes para la síntesis de
los compuestos de fórmula II en la cual (a) R^{1} y R^{10} se
encuentran en la forma de ácido carboxílico y (b) R^{1} y R^{10}
se encuentran en la forma de amida se describen en detalle en los
Ejemplos 1H y 1I, respectivamente, de esta memoria. El o los
compuestos de fórmula II en la cual tanto R^{1} como R^{10} se
encuentran en la forma de sal de sodio pueden obtenerse
adecuadamente por hidrólisis en medio básico del éster metílico del
glucurónido peracetilado [preparado (a partir de
o-cumarato de metilo) y aislado como en la primera
parte del procedimiento de síntesis descrito en el Ejemplo 1I]
utilizando hidróxido de sodio metanólico de la manera descrita al
comienzo de la segunda parte del procedimiento de síntesis descrito
en el Ejemplo 1I; en lugar de ajustar el pH del hidrolizado a 2,5
con ácido clorhídrico como se describe en el Ejemplo 1I, la mezcla
se neutraliza sencillamente (a pH aprox. 7) con ácido clorhídrico.
La forma de sal de sodio se aísla convenientemente de la mezcla por
cromatografía v.g. sobre resina no iónica Amberlite
XAD-2, lavando la columna con agua para separar las
sales inorgánicas y eluyéndola después, típicamente con metanol. La
forma de sal de sodio del glucurónido bruta obtenida por separación
del metanol puede recristalizarse luego convenientemente por ejemplo
en metanol absoluto. La forma de sal de potasio podrá prepararse
también claramente por un procedimiento estrictamente análogo,
utilizando, v.g., hidróxido de potasio metanólico en el
procedimiento de hidrólisis.
Los compuestos de fórmula II en la cual R^{1}
y R^{10} se encuentran ambos en la forma de éster metílico o
ambos en la forma de éster etílico se pueden preparar
convenientemente por reacción entre diazometano o diazoetano,
respectivamente, y el o los compuestos de fórmula II en la cual
tanto R^{1} como R^{10} se encuentran en la forma de ácido
carboxílico. Las condiciones de reacción para ello serán
convenientemente como las descritas con anterioridad para la
preparación análoga de las formas éster metílico o etílico de los
glucurónidos de citoquinina.
Compuestos preferidos actualmente de la fórmula
general II son los siguientes:
un compuesto de fórmula II en la cual R^{1} es
cis- y/o trans-2-amidoetenil-[cis-
y/o trans-CH=CHCONH_{2}], y R^{10} es el
derivado amida de
\beta-D-glucopiranuronosilo en la
función ácido carboxílico de la misma
(2-hidroxicinamil-\beta-D-glucopiranuronamida);
un compuesto de fórmula II en la cual R^{1} es
cis-2-carboxi-etenil-[cis
-CH=CHCOOH], y R^{10} es un grupo
\beta-D-glucopiranuronosilo (ácido
2-hidroxicinamil-\beta-D-glucopiranurónico).
Los ejemplos siguientes ilustran los principios
generales de la presente invención en las plantas, utilizando en
particular una \beta-glucuronidasa como gen de
selección y empleando nuevos sustratos de glucurónido que son
susceptibles de ser hidrolizados por este gen. Sobre la base de este
trabajo, se considera que genes tales como el gen de
\beta-glucuronidasa pueden utilizarse para cierto
número de propósitos afines. Así, el gen de
\beta-glucuronidasa puede emplearse en un método
para obtener un efecto regulador del crecimiento en plantas
localizado o específico de los tejidos en una parte de una planta o
un tejido de una planta que expresa un gen de
\beta-glucuronidasa introducido a un nivel mayor
que otras partes o tejidos en la misma planta, comprendiendo el
método someter la planta a un compuesto que es susceptible de ser
hidrolizado por el gen de \beta-glucuronidasa
introducido, de tal manera que el compuesto se hidroliza en la
parte o tejido que contiene el gen de
\beta-glucuronidasa introducido, liberando de
este modo un compuesto regulador del crecimiento en el tejido y
conduciendo a un efecto regulador del crecimiento únicamente en
esta parte o tejido o conduciendo a un efecto regulador del
crecimiento en esta parte o tejido que es mayor que el efecto
obtenido en otras partes o tejidos de la planta. Se considera
también que puede ser ventajoso emplear reguladores del crecimiento
de las plantas tales como citoquininas en la forma de glucurónidos
o derivados de glucurónidos en vez de citoquininas libres, v.g. para
aprovechar la ventaja del hecho de que aquéllos se transportarían y
distribuirían presumiblemente de manera diferente en las plantas en
comparación, v.g., con las citoquininas libres o ribosiladas
correspondientes.
Análogamente, los ejemplos que siguen sugieren
ciertos otros usos para la \beta-glucuronidasa.
Uno de éstos es un método in vitro para escrutar e
identificar compuestos de la clase de los glucurónidos de
citoquinina (o compuestos glucurónidos de otros reguladores del
crecimiento de las plantas) que son susceptibles de ser hidrolizados
in vivo por un gen de \beta-glucuronidasa
introducido. La \beta-glucuronidasa puede
utilizarse también en un sistema para escrutinio de compuestos que
sean adecuados para uso como agentes de selección en el método de
selección positiva expuesto en esta memoria (véase el Ejemplo 2).
En los Ejemplos 3 y 12 se describen sistemas que pueden utilizarse
para escrutinio de compuestos que inhiban selectivamente una enzima
\beta-glucuronidasa nativa en células vegetales
sin afectar sustancialmente a la actividad de una enzima codificada
por un gen de \beta-glucuronidasa introducido.
A continuación se describe la síntesis de cierto
número de nuevos compuestos glucurónidos Además de las abreviaturas
dadas para cada uno de los compuestos sintetizados individuales, se
utilizan las abreviaturas siguientes:
- BA
- N^{6}-benciladenina
- AcOH
- ácido acético
- DMF
- N,N-dimetilformamida
- IP
- N^{6}-(2-isopentenil)adenina
- MBTG
- (2,3,4-tri-O-acetil-\alpha-D-glucopiranosil-bromuro)uronato de metilo
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1A
- Sinónimos:
- ácido N^{6}-benciladenina-N^{3}-\beta-D-glucopiranurónico, sal de sodio,
- \quad
- N^{6}-benciladenina-3-glucurónido, sal de sodio
- Abreviatura:
- BA3GN, sal de sodio
Se suspendieron BA (12,6 milimoles) y MBTG (15,1
milimoles) (Bollenback et al., 1955, J. Amer. Chem.
Soc., Vol. 77, pp. 3310-3315) en
N,N-dimetilformamida (DMF) anhidra (50 ml) y se
calentaron a 100ºC durante aproximadamente 10 horas. Se separó la
mayor parte de la DMF a vacío y el producto bruto se disolvió en
cloroformo (300 ml) y se repartió con agua (3 x 300 ml). Después de
secado sobre sulfato de magnesio anhidro, el extracto clorofórmico
se evaporó a vacío y se recristalizó un jarabe oscuro en etanol. El
producto bruto (una mezcla de BA, BA9GN y BA3GN como sus ésteres
metílicos peracetilados) se purificó sobre 100 g de sílice
compactada en cloroformo, eluyendo con un gradiente de
0-4% de etanol en cloroformo. El éster metílico de
peracetil-BA3GN bruto se recristalizó en etanol.
Rendimiento: 280 mg de un sólido amorfo incoloro.
El éster metílico de
peracetil-BA3GN se hidrolizó por tratamiento con
hidróxido de sodio al 5% en etanol acuoso al 50% a la temperatura
ambiente. Cinco minutos después que se hubo disuelto el sólido, la
mezcla de reacción se neutralizó cuidadosamente con ácido
clorhídrico mientras que se enfriaba en hielo. Después de secado a
vacío, la sal de sodio de BA3GN bruta se purificó por cromatografía
en fase inversa (sobre 100 g de octadecil-sílice)
eluyendo con agua (1 l) seguido por metanol acuoso al 20%, seguido a
su vez por recristalización en etanol. La sal de sodio de BA3GN
pura (150 mg) se obtuvo como un sólido microcristalino incoloro, que
se secó a vacío hasta peso constante sobre cloruro de calcio.
UV
Etanol | A max | 227 nm | |
Etanol/ácido acético | A max | 291 nm | |
Etanol/amoníaco | A max | 227 nm |
Estos valores son idénticos a los valores de la
bibliografía para
BA-3-\beta-D-glucopiranosido
y adenina disustituida en N^{3},N^{6}. (N J Leonard, K L
Carraway y J P Helgeson, J. Heterocyclic Chem. 1965, 2,
291-297).
Se realizó la HPLC utilizando una columna de 10
x 0,46 cm de octadecil-sílice, eluyendo
isocráticamente con metanol al 60% que contenía 10% de ácido
acético a 1 ml/min. La observación por UV se realizó a 290 nm.
La sal de sodio de BA3GN tenía una pureza de
95+% y un contenido de BA libre estimado como < 0,05%.
Se incubó sal de sodio de BA3GN (500 \mug) en
500 \mul de tampón de fosfato de sodio 50 mM, pH 7,0, con
\beta-glucuronidasa (GUS, Tipo Sigma G7896), 2500
unidades Sigma "Fishman" durante 18 horas a 37ºC. La HPLC
(condiciones como las expuestas anteriormente) demostró una
eliminación prácticamente completa del pico de BA3GN con producción
de un pico que se cromatografiaba conjuntamente en mezcla 1:1 con la
BA auténtica. Esto confirma la identidad del producto como un
conjugado de BA y ácido
\beta-D-glucurónico.
Se obtuvo el análisis siguiente para otra
porción de sal de sodio de BA3GN preparada como se ha descrito
anteriormente:
UV
Etanol | A max | 227 nm |
HPLC
15 x 0,46 cm de
octadecil-sílice, eluida con un gradiente de
20-60% metanol/10% ácido acético durante 30 min a 1
ml/min. Pureza por HPLC 99,5%. Contenido de BA libre < 0,05%.
La sílice se reveló con
1-butanol/ácido acético/agua (12/3/5). Pureza por
TLC, 99,5%. Contenido de BA libre < 0,05%.
Se incubó sal de sodio de BA3GN (500 \mug) en
500 \mul de tampón de fosfato de sodio 50 mM, pH 7,0 con
\beta-glucuronidasa (GUS, Tipo Sigma G7896), 2500
unidades Sigma "Fishman" durante 12 horas a 37ºC. La HPLC y la
TLC demostraron la eliminación virtualmente completa (> 99%) de
la BA3GN para dar un compuesto que se cromatografiaba conjuntamente
en una mezcla 1:1 con BA auténtica.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1B
- Sinónimos:
- N^{6}-benciladenina-N^{3}-\beta-D-glucopiranuronamida
- \quad
- N^{6}-benciladenina-3-glucuronamida
- Abreviatura:
- BA3GNamida
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
El éster metílico de
peracetil-BA3GN recristalizado (1,5 g) preparado
como en el Ejemplo 1A, se suspendió en metanol anhidro (200 ml) y
se enfrió a 0ºC. Se añadió una cantidad adicional de metanol anhidro
(400 ml), saturado con amoníaco anhidro a -10ºC, y la mezcla se
agitó en hielo. Se añadió una nueva cantidad de metanol anhidro
enfriado en hielo hasta que el sólido se disolvió por completo. La
mezcla de reacción se agitó en hielo durante 3 horas más. El exceso
de amoníaco y el metanol se eliminaron a vacío y el producto se
trituró concienzudamente con etanol caliente para dar un sólido
incoloro (1,3 g).
La BA3GNamida, como ocurre con otros
adenina-3-glicosidos, es sólo
escasamente soluble en agua o alcohol, pero se disuelve a 2,4 mg/ml
en metanol acuoso al 50% que contiene 25% de ácido acético.
TLC
(sílice-cloroformo/metanol/ácido acético glacial,
50/50/5)
Una sola mancha por UV (Rf 0,36) sin impureza
detectable alguna para una carga de 50 \mug. Pureza 98+%.
Presencia no detectable (< 1%) de éster metílico de
peracetil-BA3GN (Rf 0,89) o BA3GN (Rf 0,02).
TLC
(sílice-cloroformo/metanol, 9/1)
Utilizada para ensayar el contenido de BA. La
BA3GNamida a 192 \mug de carga no demostró cantidad detectable
alguna de 6-benciladenina. Por consiguiente,
contenido de BA < 0,2%.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1C
- Sinónimos:
- Ácido N^{6}-benciladenina-N^{9}-\beta-D-glucopiranurónico, sal de sodio
- \quad
- N^{6}-Benciladenina-9-glucurónido, sal de sodio
- Abreviatura:
- BA9GN, sal de sodio
Método
1
Se suspendió BA9G (50 mg) en bicarbonato de
sodio 50 mM (25 ml) con negro de platino (200 mg). La mezcla se
calentó a 80ºC en un baño de agua mientras que se pasaba oxígeno
vigorosamente a su través. Se añadió una cantidad adicional de 100
mg de catalizador de platino al cabo de 4 horas. Aproximadamente el
95+% de BA9G se convirtió en el ácido
9-\beta-D-glucopiranurónico
correspondiente y algo de BA al cabo de 20 horas de tratamiento. Se
neutralizó la mezcla y la sal de sodio de BA9GN producida se
purificó por cromatografía en fase inversa (sobre 20 g de
octadecil-sílice) eluyendo con 200 ml de agua
seguida por MeOH al 20%.
La sal de sodio de BA9GN pura, exenta de
glucosido y BA, se secó para dar un sólido incoloro sobre cloruro
de calcio a vacío.
Método
2
6-Cloropurina (secada sobre
pentóxido de fósforo, 1,13 g), MBTG (3,87 g) y carbonato de potasio
recién secado (1,5 g) se agitaron en carbonato de propileno anhidro
(30 ml) a la temperatura ambiente durante 24 horas. La mezcla de
color oscuro se filtró y se purificó por cromatografía en columna
sobre sílice (100 g) eluyendo con un gradiente
0-80% de acetato de etilo en cloroformo. La fracción
principal (distinta de la 6-cloropurina sin
reaccionar) se secó y se recristalizó en etanol hirviente para dar
6-cloropurina-9-(2',3',4'-tri-O-acetil-\beta-D-glucopiranuronato)
de metilo como un sólido amarillo pálido (450 mg) que se secó sobre
pentóxido de fósforo a vacío. La HPLC indicó una pureza de 95+%.
Se calentaron juntos
6-cloropurina-9-(2',3',4'-tri-O-acetil-\beta-D-glucopiranuronato)
de metilo (312 g) y bencilamina (171 \mul) en
1-butanol (13,5 ml) a 100ºC durante 1 hora. El
sólido se disolvió fácilmente para dar una solución de color
amarillo claro. La mayor parte del butanol se separó a vacío para
producir un sólido blanquecino que se agitó mediante sacudidas con
hidróxido de sodio al 5% en etanol acuoso al 50% (25 ml) durante
1-2 horas a la temperatura ambiente. Después de
neutralización, el producto se secó a vacío para separar las trazas
de butanol y la sal de sodio de BA9GN bruta se purificó por
cromatografía en fase inversa como en el Método 1.
El producto bruto se secó a vacío sobre cloruro
de calcio y pentóxido de fósforo para dar un sólido incoloro (210
mg) que se cromatografiaba conjuntamente con BA9GN preparado por
oxidación catalítica.
UV
95% Etanol | A max | 270 nM | (17.400) | |
95% Etanol/HCl 0,1M | A max | 270 nM | (16.200) | |
95% Etanol/NaOH 0,1 M | A max | 270 nM | (17.400) |
Estos resultados son consistentes con la
estructura de una adenina disustituida en N6,N9. Los coeficientes
de extinción son prácticamente los mismos que los de BA9G pura, lo
que indica la ausencia de contaminantes no absorbentes en UV.
Pureza UV, 95+%.
HPLC
Una columna de 10 x 0,46 cm de
octadecil-sílice, con monitor UV a 270 nM. La HPLC
isocrática (50% metanol/ácido acético 0,2 M, 2 ml/min) y en
gradiente (0-60% metanol/ácido acético 0,2 M, 2
ml/min) muestran un pico simétrico agudo para BA9GN, que se eluye
inmediatamente antes del glucosido correspondiente. El BA9GN
preparado por reacción de condensación se cromatografía
conjuntamente en una mezcla 1:1 en HPLC (gradiente e isocrática)
con BA9GN preparado por oxidación catalítica. Esto confirma que el
BA9GN preparado por la reacción de condensación es el isómero
\beta-D-glucopiranosilo. BA9GN no
contiene cantidad alguna detectable (< 2%) de anómero \alpha u
otras impurezas, con inclusión de BA. La pureza por HPLC de BA9GN
es 98+%.
TLC
(sílice-cloroformo/metanol, 9/1)
Utilizada para medir la contaminación con BA del
producto BA9GN. BA9GN no se desplaza del origen en este sistema.
Límite mínimo de detección de BA = 200 ng. El BA9GN a 200 \mug de
carga no muestra BA detectable alguna u otros contaminantes. Pureza
por TLC 98+%. Contenido de BA < 0,1%.
Los ácidos minerales convierten los glucosidos
de citoquinina en la base libre de citoquinina correspondiente. El
tratamiento de la sal de sodio de BA9GN (1 mg/ml) con ácido
clorhídrico 1 M a 100ºC durante una noche produjo una mancha simple
en TLC que se cromatografiaba conjuntamente con BA auténtica. Este
ensayo confirmó que BA9GN era un conjugado de BA lábil en medio
ácido.
Se incubó la sal de sodio de BA9GN (500 \mug)
en 500 \mul de tampón de fosfato de sodio 50 mM, pH 7,0, con
\beta-glucuronidasa Sigma (GUS, Tipo G7896), 2500
unidades "Fishman" durante 18 horas a 37ºC. La HPLC y la TLC no
mostraron producción detectable alguna de BA. La incubación
ulterior a la temperatura ambiente durante 3 días no mostró
hidrólisis alguna. Por consiguiente, el BA9GN no es susceptible de
hidrólisis por \beta-glucuronidasa.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1D
- Sinónimos:
- ácido N^{6}-(2'-isopentenil)adenina-N^{3}-\beta-D-glucopiranurónico, sal de sodio
- \quad
- N^{6}-(2'-isopentenil)adenina-3-glucurónido, sal de sodio
- Abreviatura:
- IP3GN, sal de sodio
\vskip1.000000\baselineskip
Se calentaron
N^{6}-(2-isopentenil)adenina (9,48 g) y
MBTG (22,1 g) en DMF anhidra (170 ml) a 100ºC durante 12 h. La
mayor parte de la DMF se separó a vacío en un baño de agua hirviente
y el jarabe enfriado se recogió en cloroformo (500 ml). La solución
clorofórmica se extrajo con agua (3 x 500 ml) y el extracto orgánico
se secó sobre sulfato de sodio anhidro. La mayor parte del
cloroformo se separó a vacío y el jarabe se purificó
cromatográficamente sobre sílice revelada con un gradiente de 0 a
3,75% de metanol en cloroformo. El éster metílico de
peracetil-IP3GN bruto se recristalizó en metanol con
decoloración por carbón vegetal para dar el éster metílico de
peracetil-IP3GN incoloro puro (3,2 g) que se secó a
vacío sobre cloruro de calcio. Una porción del éster metílico de
peracetil y IP3GN (1,2 g) se hidrolizó por disolución en
aproximadamente 1 l de metanol acuoso al 75% que contenía 5% de
hidróxido de sodio y agitación de la mezcla durante 10 min a la
temperatura ambiente. La mezcla se enfrió en hielo, se neutralizó
cuidadosamente con ácido clorhídrico y se redujo a un jarabe a
vacío. El producto bruto se purificó por cromatografía sucesiva
sobre resina XAD-2 y
octadecil-sílice para dar la sal de sodio de IP3GN
como un sólido microcristalino incoloro que se secó sobre cloruro de
calcio (810 mg).
La sal de sodio de IP3GN es soluble en agua a 2
mg/ml.
TLC
(sílice-1-butanol/AcOH glacial/agua,
12/3/5)
La sal de sodio de IP3GN da una sola mancha neta
(Rf = 0,32) a 100 \mug de carga sin cantidad detectable alguna de
N^{6}-(2-isopentenil)adenina (IP) (Rf =
0,66) u otros contaminantes. Pureza 99,5+%.
La sal de sodio de IP3GN (500 \mug) en 500
\mul de tampón de fosfato de sodio 50 mM, pH 7,0, se incubó con
\beta-glucuronidasa (GUS, Tipo Sigma G7896), 2500
unidades Sigma "Fishman" durante 12 horas a 37ºC. La TLC mostró
la eliminación de la mancha UV correspondiente a IP3GN con la
producción de una nueva mancha UV que se cromatografiaba
conjuntamente con IP auténtica.
Ejemplo
1E
- Sinónimos:
- Ácido N^{6}-(2'-isopentenil)adenina-2-tioglicopiranurónico, sal de sodio
- \quad
- N^{6}-(2'-Isopentenil)adenina-2-tioglucurónido, sal de sodio
- Abreviatura:
- IP2SGN, sal de sodio
Se añadió cloruro de bencilo (1,4 ml) gota a
gota con agitación enérgica a una solución de 2 g de
2-tioxantina en 12 ml de hidróxido de sodio 1 M,
diluido hasta 140 ml con agua. Una vez completada la adición, se
formó un precipitado de color crema. La mezcla de reacción se agitó
durante 1 hora adicional a la temperatura ambiente y se filtró. El
sólido se lavó concienzudamente con agua y se secó durante una noche
a vacío sobre cloruro de calcio y hasta peso constante sobre
pentóxido de fósforo. El producto bruto (2 g) se utilizó
directamente en el paso inmediatamente siguiente sin
recristalización.
Se cubrió
2-benciltio-6-purinol
(2 g) con una mezcla de oxicloruro de fósforo (20 ml) y
dietilanilina (2 ml). La mezcla se calentó a reflujo con agitación
durante 1 hora, se enfrió y se vertió en hielo (100 g). Se formó un
precipitado amarillo que se filtró, se lavó concienzudamente con
agua y se secó a vacío. El producto bruto se recristalizó en
metanol para dar un sólido de color crema claro (1,2 g) que se secó
hasta peso constante sobre pentóxido de fósforo.
Una mezcla de
2-benciltio-6-cloropurina
(1,2 g) e hidrocloruro de isopentenil- amina (1,04 g) en
1-butanol (25 ml) que contenía trietilamina (2,2
ml) se calentó en un tubo herméticamente cerrado a 110ºC durante 2
horas. El butanol se separó a vacío y la mezcla se agitó mediante
sacudidas con agua y hielo (100 ml). El producto se filtró, se
recristalizó en etanol con decoloración por carbón vegetal y se secó
a vacío con pentóxido de fósforo. Rendimiento, 0,64 g. Rendimiento
1,3 g de
2-benciltio-N^{6}-(2-isopentenil)adenina
como un sólido incoloro. El producto bruto se utilizó como tal en
el paso inmediatamente siguiente.
Se disolvió
2-benciltio-N^{6}-(2'-isopentenil)adenina
(0,64 g) en amoníaco líquido (62,5 ml) para dar una solución de
color amarillo claro. Se añadió sodio (aproximadamente 200 mg) en
pequeñas porciones hasta que persistió una coloración azul durante
10 min. Se añadió cuidadosamente una pequeña cantidad de cloruro de
amonio sólido para separar el exceso de sodio y se dejó que se
evaporara el amoníaco hasta un volumen pequeño. Se añadió éter
dietílico (65,5 ml) y el extracto etéreo se extrajo con agua (62,5
ml). El extracto acuoso se ajustó a un pH comprendido entre 4 y 5
con ácido acético con lo cual se precipitó un sólido de aspecto
cremoso. Después de enfriar, el producto se separó por filtración y
se secó sobre pentóxido de fósforo a vacío. Rendimiento, 340 mg.
Se convirtió la
2-tio-N^{6}-(2-isopentenil)adenina
bruta en la sal de potasio por suspensión en agua y adición de una
cantidad equimolar de hidróxido de potasio junto con alcohol
suficiente para efectuar la disolución. La solución se secó a vacío
sobre pentóxido de fósforo.
2-Tio-N^{6}-(2-isopentenil)adenina,
sal de potasio (2,89 milimoles) se disolvió en metanol anhidro y se
añadió MBTG (5 milimoles). La mezcla se agitó a la temperatura
ambiente durante 24 horas, en cuyo transcurso se depositó un sólido
blanco de aspecto cremoso. La mezcla de reacción se secó a vacío y
se hidrolizó a la temperatura ambiente por tratamiento con
hidróxido de sodio acuoso al 5% (50 ml) para dar el
glucopiranurónido libre como la sal de sodio. La mezcla se
neutralizó por adición cuidadosa de ácido clorhídrico concentrado
con enfriamiento externo para dar un precipitado incoloro de sal de
sodio de IP2SGN bruta.
El producto bruto se purificó por cromatografía
en fase inversa, se recristalizó en etanol, y se secó a vacío sobre
cloruro de calcio para dar un sólido amorfo incoloro (150 mg). El
producto era escasamente soluble en alcohol acuoso al 50%.
UV
agua, pH 1 | A max | 284, 241, 206 nm | |
agua, pH 7 | 278, 230 (meseta) | ||
agua, pH 14 | 283, 227 |
La sal de sodio de IP2SGN mostraba el espectro
UV característico de las citoquininas sustituidas con grupo tio en
la posición 2, y el espectro era estrechamente similar al de la
2-metiltio-N^{6}-(2-isopentenil)adenina
auténtica. El análisis UV confirmó que el producto era una adenina
disustituida en 2 y N^{6}.
HPLC
La HPLC utilizó una columna de
octadecil-sílice de 15 x 0,46 cm eluida con un
gradiente 0-60% de metanol que contenía ácido
acético 0,2 M durante 30 min a 1 ml/min. Monitor UV a 270 nm.
La sal de sodio de IP2SGN tenía una pureza de
98+% y no contenía cantidad detectable alguna de
2-tio-N^{6}-(2-isopentenil)adenina
libre (< 0,1%).
La sal de sodio de IP2SGN (500 \mug) en 500
\mul de tampón de fosfato de sodio 50 mM, pH 7,0, se incubó con
\beta-glucuronidasa (GUS, Tipo Sigma G7896), 2500
unidades Sigma "Fishman" durante 48 horas a 37ºC. La HPLC
(condiciones como las empleadas anteriormente) demostró la
eliminación parcial (65%) de IP2SGN para producir un pico que se
cromatografiaba conjuntamente en una mezcla 1:1 con
2-tio-N^{6}-(2-isopentenil)adenina.
Este ensayo confirma la identidad de la sal de sodio de IP2SGN como
un conjugado de
2-tio-N^{6}-(2-isopentenil)adenina
y ácido \beta-D-glucurónico,
parcialmente susceptible de hidrólisis por GUS.
Ejemplo
1F
- Sinónimos:
- ácido N^{6}-(2'-isopentenil)adenina-8-tioglucopiranurónico, sal de sodio
- \quad
- N^{6}-(2'-isopentenil)adenina-8-tioglucurónido, sal de sodio
- Abreviatura:
- IP8SGN, sal de sodio
Reacción
1
Se molieron juntos sulfato de
4,5-diamino-6-hidroxipirimidina
(25 g) y tiourea (100 g) y se calentaron en un baño de aceite a
200ºC durante 30 min. El producto solidificado enfriado se disolvió
en NaOH 1 M caliente (500 ml), se hirvió con carbón vegetal y se
filtró. El filtrado caliente se acidificó con HCl concentrado y la
solución caliente se filtró para dar un sólido rojo que se
reprecipitó en solución básica caliente, se lavó bien con agua y se
secó a vacío a 80ºC. Rendimiento 5,28 g.
UV
A max, pH 1 | 236, 292 nm | (bibl. 234, 290 nm) | |
pH 11 | 234, 292 nm | (bibl. 234, 290 nm) |
Reacción
2
Se suspendieron 5,28 de
6-hidroxi-8-tiopurina
en 78,5 ml de NaOH 1 M y se diluyeron a 400 ml con agua. Se
añadieron 3,7 ml de cloruro de bencilo y la mezcla de reacción se
agitó enérgicamente durante tres horas a la temperatura ambiente,
se ajustó a pH 5 con ácido acético glacial, y se filtró. El producto
se lavó concienzudamente con agua y se secó durante una noche a
vacío a 80ºC para dar 7,33 g de un sólido de color
rosado-salmón que se utilizó sin purificación
ulterior.
Reacción
3
Se añadió
6-hidroxi-8-benciltiopurina
(7,33 g) a una mezcla de oxicloruro de fósforo (70 ml) y
N,N-dietilanilina (7,5 ml), y la mezcla se calentó
a reflujo durante 2 horas para dar un producto de color rojo oscuro.
La mezcla se concentró a vacío y el jarabe resultante se vertió
lentamente con agitación sobre hielo (400 g). La mezcla se dejó en
reposo durante 15 min, después de lo cual se alcalinizó fuertemente
con KOH frío concentrado. La mezcla se trituró concienzudamente
para disolver la mayor parte del jarabe y se acidificó a pH 1 por
adición lenta de HCl concentrado frío, con exceso de hielo todavía
presente.
Después de permanecer en reposo durante 1 hora a
la temperatura ambiente, el producto se separó por filtración, se
lavó concienzudamente con agua y se secó a vacío a 80ºC durante 2
horas para dar 7,8 g de producto.
Reacción
4
Una mezcla de
6-cloro-8-benciltiopurina
(3,9 g) e hidrocloruro de isopentenil- amina (3,42 g) en
1-butanol (100 ml) que contenía trietilamina (7,5
ml) se calentó a reflujo durante 2 horas. La mayor parte del
1-butanol se separó a vacío, y la mezcla de
reacción se enfrió en hielo y se agitó mediante sacudidas con agua
(400 ml).
Después de refrigeración durante una noche, se
filtró la mezcla para dar un producto bruto que se purificó por
cromatografía sobre 100 g de gel de sílice, eluyendo con un
gradiente de 0-2,5% de MeOH en cloroformo. El
producto cromatográficamente puro se recristalizó en metanol para
dar 1,18 g de un sólido amorfo incoloro.
TLC (sílice-2,5%
metanol/cloroformo)
Pureza 98+%. Ausencia de impurezas
detectables.
UV
95% Etanol/HCl | 307 nm | |
95% Etanol | 291 nm | |
95% Etanol/amoníaco | 298 nm |
Reacción
5
Se disolvió
8-benciltio-N^{6}-(2'-isopentenil)adenina
(1,18 g) en amoníaco líquido (125 ml) para dar una solución de
color amarillo claro. Se añadió sodio en pequeñas porciones hasta
que persistió una coloración azul durante 15 min. Se añadió
cuidadosamente una pequeña cantidad de cloruro de amonio sólido para
separar el exceso de sodio. El amoníaco se evaporó hasta un volumen
pequeño sobre una placa caliente y se añadió éter (125 ml).
Después que la mayoría del amoníaco remanente se
había desprendido, el extracto etéreo se extrajo con agua (2 x 65
ml). El extracto acuoso (a pH 12-13) se enfrió sobre
hielo y se ajustó a pH 5 con ácido acético glacial. Precipitó un
sólido blanco de aspecto cremoso que se filtró, se lavó
concienzudamente con agua y se secó durante una noche sobre cloruro
de calcio para dar un polvo muy claro, prácticamente blanco.
Rendimiento, 760 mg.
Nota: La
8-tio-N^{6}-(2'-isopentenil)adenina
se oxida fácilmente en solución
alcalina.
HPLC
(15 cm octadecil-sílice,
0-80% metanol/ácido acético glacial 0,2 M, 30 min, 1
ml/min, monitor UV a 300 nm)
Pico simétrico neto sin impurezas
detectables.
Pureza 98+%.
UV
95% Etanol/HCl | 245, 307 (meseta), 315 nm | |
95% Etanol | 241, 305, 313 nm |
Reacción
6
Se suspendió
8-tio-N^{6}-(2'-isopentenil)adenina
(600 mg) en hidróxido de potasio 50 mM (102 ml), que contenía 1% de
2-mercaptoetanol como antioxidante. Se añadió etanol
suficiente para disolver el sólido. La solución se secó a vacío,
sobre cloruro de calcio, seguido por pentóxido de fósforo. El
producto seco se disolvió en metanol anhidro (100 ml) que contenía
2-mercaptoetanol (50 \mul) y se añadió MBTG (2 g).
La mezcla se agitó durante 24 horas a la temperatura ambiente y se
secó a vacío sobre cloruro de calcio y pentóxido de fósforo. El
éster protegido se hidrolizó durante 1 hora a la temperatura
ambiente en 50 ml de hidróxido de sodio al 5%.
Después de neutralización con ácido clorhídrico
concentrado, el producto bruto se purificó por cromatografía en
fase inversa y en fase normal para dar un sólido incoloro que se
secó hasta peso constante sobre cloruro de calcio. Rendimiento, 190
mg.
UV
A max | Etanol/pH 1 | 300 nm | |
Etanol/neutro | 285 (meseta pronunciada), 291, 301 nm | ||
Etanol/ pH 12 | 283 (meseta), 290, 300 nm |
TLC
(sílice-cloroformo/metanol, 1/1)
La sal de sodio de IP8SGN a cargas de 34, 68,
102 y 134 \mug mostraba una mancha neta simple sin contaminantes
detectables. Pureza 99,5+%. Contenido de base citoquinina libre,
8-tio-N^{6}-(2'-isopentenil)adenina
< 0,1%.
HPLC (15 cm
octadecil-sílice, 0-80%
metanol/ácido acético glacial 0,2 M, 30 min, 1 ml, 300 nm)
Pico ancho simple, tR 18,2 min. Ausencia de
contaminantes detectables. Pureza 99,5+%.
La sal de sodio de IP8SGN a 1 mg/ml se incubó
con 2500 unidades de GUS (Sigma) en tampón de fosfato 50 mM, pH 7 a
37ºC durante 24 horas. La TLC (1/1, metanol/cloroformo) mostró una
conversión completa (> 95%) de la sal de sodio de IP8SGN para
dar un compuesto que se cromatografiaba conjuntamente con
8-tio-(2'-isopentenil)adenina.
La sal de sodio de IP8SGN es por consiguiente susceptible de
hidrólisis por GUS.
Ejemplo
1G
- Sinónimos:
- ácido zeatin-O-\beta-D-glucopiranurónico, sal de sodio
- \quad
- zeatin-O-glucurónido, sal de sodio
- Abreviatura:
- ZOGN, sal de sodio
Se suspendieron
trans-1-hidroxi-2-metil-4-ftalimido-but-2-eno
(1,87 g, Corse & Kuhnle, 1972, Synthesis, pp.
618-619) y carbonato de plata recientemente activado
(9 g) en éter anhidro (300 ml) que contenía tamices moleculares (9
g). Después de agitar durante 30 min a la temperatura ambiente, se
añadió MBTG (3,24 g) y la mezcla se agitó en la oscuridad durante 2
días a la temperatura ambiente. Se añadió una cantidad adicional de
MBTG (1,62 g) y la mezcla se agitó durante 2 días más. La mezcla de
reacción se filtró y se secó a vacío para dar un jarabe incoloro
que se secó ulteriormente a vacío sobre cloruro de calcio para dar
una espuma incolora pulverizable. El producto bruto se liberó de
impurezas de azúcares por cromatografía sobre sílice (200 g),
eluyendo con cloroformo. El rendimiento de producto puro fue 2,45 g
(55,4%).
Se disolvió
trans-2-metil-4-ftalimidobut-2-enil-(2',3',4'-tri-O-acetil-\beta-D-glucopiranuronato
de metilo (2,45 g) en metanol anhidro (150 ml), se enfrió en hielo,
y se paso a amoníaco a través de la solución enfriada con hielo
durante 6 horas. Después de la separación del metanol a vacío, el
producto bruto se purificó por cromatografía sobre celulosa (200 g)
y se reveló con butanol-etanol-ácido
acético-agua (8:2:1:3 vol/vol). El producto eluido
se secó a vacío para dar un jarabe de color pardo que se utilizó en
el paso de condensación sin purificación ulterior.
El jarabe procedente del paso anterior se
calentó en un tubo herméticamente cerrado con
6-cloropurina (0,8 g) y trietilamina (1,5 ml) en
metanol (25 ml) a 90ºC durante 4 horas para producir la amida. Para
convertir la amida en el ácido, el metanol se separó a vacío y se
añadió hidróxido de sodio acuoso al 5% (25 ml). Después de agitar a
la temperatura ambiente durante 6 horas, la mezcla se neutralizó
cuidadosamente con ácido clorhídrico 2 M y se purificó por
cromatografía en fase inversa sobre octadecil-sílice
(100 g), eluyendo con agua. La sal de sodio de ZOGN bruta que
contenía 6-cloropurina sin reaccionar se secó a
vacío y se purificó por cromatografía sobre sílice (50 g) eluyendo
con un gradiente 0-100% de metanol en cloroformo.
Después de la separación del disolvente a vacío, el producto se
secó como un sólido amorfo a vacío sobre cloruro de calcio.
Rendimiento 158 mg.
UV
A max | etanol acuoso | 276 nm, 270 nm (meseta), | |
283 nm (meseta) | |||
etanol acuoso/HCl | 279 nm | ||
etanol acuoso/amoníaco | 276 nm, 270 nm (meseta), | ||
283 nm (meseta) |
TLC
(sílice-1-butanol/ácido acético
glacial/agua, 12/3/5)
La sal de sodio de ZOGN a 50 \mug de carga
mostraba una mancha simple (Rf 0,16) sin impureza detectable alguna.
No era detectable cantidad alguna de zeatina (0,66) o
6-cloropurina (Rf 0,70). Pureza global 98+%.
HPLC (columna de
octadecil-sílice de 15 x 0,46 cm, monitor UV a 270
nm)
Elución en gradiente
(0-100% metanol durante 30 min a 1 ml/min)
La sal de sodio de ZOGN se eluye como un pico
moderadamente ancho (tR 10,0 min) con una pequeña cantidad de
impureza inorgánica presente con el pico de disolvente. Pureza
global 97+%.
Elución isocrática (metanol acuoso al
50%, 1 ml/min)
Se utilizó elución isocrática para medir el
contenido de zeatina. La sal de sodio de ZOGN tenía un tiempo de
retención (tR) de 1,1 min, comparado con el valor tR de la zeatina
trans auténtica de 2,2 min. La HPLC de hasta 96 \mug de sal de
sodio de ZOGN no mostró zeatina detectable alguna. El contenido de
zeatina era por consiguiente < 0,1%. Esto se confirmó por TLC
con gel de sílice en cloroformo/metanol 9/1. La sal de sodio de
ZOGN no se desplazaba del origen en este sistema, pero cualquier
zeatina contaminante se separaba claramente a Rf 0,39. No se
detectó cantidad alguna de zeatina cuando se hicieron pasar 200
\mug de sal de sodio de ZOGN. El límite de detección para la
zeatina trans en la TLC era 200 ng; por consiguiente, se confirmó
que la contaminación con zeatina trans era < 0,1%.
Se incubó una muestra de sal de sodio de ZOGN
con \beta-glucuronidasa (Sigma G9387) en tampón de
fosfato de sodio 50 mM a pH 7,0 a 37ºC. La HPLC (metanol isocrático
al 50%) demostró una conversión virtualmente completa en zeatina
trans. La identidad de la zeatina trans en el hidrolizado enzimático
se confirmó por cromatografía conjunta de una mezcla 1:1 del
hidrolizado y zeatina trans auténtica en 3 sistemas cromatográficos
diferentes.
Ejemplo
1H
- Sinónimos:
- o-cumaril-\beta-D-glucopiranuronamida
- \quad
- O-cumaril-glucuronamida
- Abreviatura:
- CouGNamida
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se molieron o-cumarato de metilo
(15 g) y MBTG (16,8 g) junto con quinolina (25 ml) para producir una
pasta homogénea. Se añadió óxido de plata(I) (10,7 g) en
porciones, con mezcla concienzuda, mientras que la mezcla se
enfriaba en hielo. Una vez completada la adición, la mezcla de
reacción se mantuvo a la temperatura ambiente durante 3 h. Se
extrajo la mezcla con éter (1 l) y el extracto etéreo se lavó con
agua (1 l). El extracto etéreo se secó sobre sulfato de sodio
anhidro y se secó a vacío para dar un jarabe de color rojo. El
jarabe bruto se extrajo con éter de petróleo (300 ml) para separar
el o-cumarato de metilo que no había reaccionado, y
se secó luego a vacío para separar trazas de éter de petróleo. El
producto bruto se recristalizó en etanol con decoloración por medio
de carbón vegetal para dar
2-hidroxicinamil-O-\beta-D-glucopiranuronato
de metilo peracetilado puro (3,5 g).
El éster metílico peracetilado (3,5 g) se
disolvió en metanol anhidro (250 ml) y se hidrolizó por agitación a
0ºC durante 3 h con una nueva cantidad de metanol anhidro (250 ml)
que se había saturado con amoníaco seco a -10ºC. El amoníaco y el
metanol se separaron a vacío y el producto bruto se recristalizó en
etanol y se secó a vacío sobre cloruro de calcio para dar
CouGNamida pura como un sólido esponjoso incoloro (1,7 g).
TLC
(sílice-cloroformo/metanol, 1/1)
Mancha simple neta a Rf 0,63. No se detectó
contaminante alguno para una carga de hasta 50 \mug, pureza 98+%.
Impurezas, menores que 0,5% de o-cumarato de metilo;
o cumarina.
TLC
(sílice-cloroformo/metanol/ácido acético glacial,
50/50/5)
Mancha simple neta a Rf 0,68. Pureza 98+%.
Ausencia (< 0,5%) de ácido o-cumárico detectable
(Rf 0,80).
\newpage
Ejemplo
1I
- Sinónimos:
- ácido o-cumaril-\beta-D-glucopiranurónico
- \quad
- o-cumaril-glucurónido
- Abreviatura:
- CouGN
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se molieron o-cumarato de metilo
(17,8 g) y MBTG (20 g) junto con quinolina (20 ml) para dar una
pasta uniforme. Se añadió óxido de plata(I) (13 g) en
porciones, con mezcla concienzuda, mientras que la mezcla se
enfriaba en hielo. Una vez completada la adición, se dejó la mezcla
de reacción en reposo a la temperatura ambiente durante 3 h. Se
extrajo la mezcla con éter (1 l) y el extracto etéreo se lavó con
agua (1 l). El extracto etéreo se secó sobre sulfato de sodio
anhidro y se secó a vacío para dar un jarabe de color rojo. El
jarabe bruto se extrajo con éter de petróleo (300 ml) para separar
el o-cumarato de metilo que no había reaccionado, y
se secó luego a vacío para separar trazas de éter de petróleo. El
producto bruto se recristalizó en etanol con decoloración por medio
de carbón vegetal para dar metil-CouGN peracetilado
puro (2,9 g).
El éster metílico peracetilado (2,9 g) se
suspendió en metanol (250 ml) y se añadió hidróxido de sodio 2 M
(250 ml) con agitación mientras que la mezcla de reacción se
enfriaba en hielo. Se agitó la mezcla a la temperatura ambiente
durante 1,5 h y se ajustó a pH 2,5 con ácido clorhídrico. El metanol
se separó a vacío y el producto bruto se purificó por cromatografía
con XAD-2. La resina cromatográfica se lavó
primeramente con agua para separar las sales inorgánicas y el
producto se eluyó con metanol. Después de secado a vacío, el
producto se recristalizó en etanol y se secó a vacío sobre cloruro
de calcio para dar CouGN puro como un sólido amorfo incoloro (1,5
g).
CouGN es soluble a 5 mg/ml en tampón acuoso, pH
7, y en alcohol acuoso al 50% para dar una solución incolora y
transparente.
TLC
(sílice-cloroformo/metanol/ácido acético glacial,
50/50/1)
Mancha principal, Rf 0,12 con una impureza menor
a Rf 0,24. Pureza 90+%. Ausencia detectable (< 1%) de cumarina
(Rf 0,90), o-cumarato de metilo (Rf 0,91) o ácido
o-cumárico (Rf 0,80). El producto principal se
cromatografiaba conjuntamente con CouGN auténtico preparado por
oxidación catalítica de
2-hidroxicinamil-o-
-D-glucopiranosido.
Se disolvió CouGN (5 mg) en tampón de fosfato de
sodio 50 mM, pH 7,0 (1 ml) y se incubó con GUS (1000 unidades Tipo
Sigma G5897) durante 12 horas a 37ºC. La TLC mostró 93,4% de
conversión en un compuesto que se cromatografiaba conjuntamente con
ácido o-cumárico. El ácido
o-cumárico se convierte lentamente (por un proceso
no enzimático) en cumarina a lo largo de un período de unos cuantos
días.
Se desarrolló un ensayo para identificar
aquellos glucurónidos de citoquinina que pueden ser hidrolizados
por \beta-glucuronidasa de E. coli.
(Diversas características de la enzima y el gen de
\beta-glucuronidasa se describen, v.g., en los
documentos siguientes: Blanco & Nemoz, Biochimie 69, pp.
157-161, 1987; Jefferson et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, vol. 83, pp. 8447-8451,
1986; Levy & Marsh, Advan. Carbohydrate Chem. 14, pp.
381-428; US 4.721.671).
El compuesto a ensayar se incuba en tampón de
fosfato de sodio 50 mM, pH 7,0 (generalmente 500 \mug del
compuesto en 500 \mul del tampón) con
\beta-glucuronidasa (generalmente de Tipo Sigma
G7896, 2500 unidades Sigma "Fishman") durante
12-24 h a 37ºC. La presencia de productos de
hidrólisis se determina luego utilizando HPLC y TLC.
La tabla siguiente muestra los resultados del
ensayo descrito anteriormente sobre varios
\beta-D-glucurónidos de
citoquinina y una
citoquinin-\beta-D-glucuronamida.
Dado que los únicos sustratos que se han
utilizado para ensayar la enzima GUS de E. coli en organismos
transgénicos son O-glucurónidos, y puesto que había
sido comunicado previamente (Jefferson, "The GUS reporter gene
system", Nature, vol. 342, pp. 837-838,
1989) que los sustratos de \beta-glucuronidasa
están constituidos por ácido D-glucurónico
conjugado a través de un enlace b-O-glicosídico con una
aglicona, resultó sorprendente que se encontrase también que
ciertos N-glucurónidos y S-glucurónidos son sustratos
satisfactorios para esta enzima. Por consiguiente, se contempla
también que tales compuestos de N- y S-glucurónido
pueden utilizarse en ensayos para la enzima
\beta-glucuronidasa de E. coli y plantas,
v.g. análogamente a la prueba X-gluc a que se hace
referencia más adelante.
En el documento GB 2 197 653 A se expone que
utilizando el sistema \beta-glucuronidasa y nuevos
sustratos, puede ser posible una selección positiva y negativa
utilizando la actividad de GUS. Esta hipótesis, sin embargo, no se
ha investigado nunca, y nunca se ha demostrado que la hidrólisis
enzimática de dichos compuestos sea probable incluso sobre la base
de consideraciones teóricas relacionadas con las características
químicas de los sustratos para
\beta-glucuronidasa de E. coli. Como se
demuestra aquí, no todos los glucurónidos son sustratos para la
enzima \beta-glucuronidasa de E. coli, y no
es de esperar que la mayoría de los glucurónidos sean sustratos
para la enzima GUS.
Se han utilizado las respuestas en tejido
vegetal que expresa el gen de \beta-glucuronidasa
de E. coli como método para evaluar si ciertos glucurónidos
(con inclusión de precursores de hormonas vegetales) pueden ser
hidrolizados por la enzima in vivo (Jefferson, "The GUS
gene fusion system as a versatile tool for agricultural molecular
biology", resumen del Congreso Internacional sobre Manipulación
Genética en la Reproducción Vegetal, celebrado en Elsinore,
Dinamarca, 11-16 de septiembre de 1988).
Desafortunadamente, este enfoque no es factible debido a la
existencia de una fuerte actividad endógena de
\beta-glucuronidasa en el tejido vegetal (véase
v.g., el Ejemplo 3 más adelante, así como Hodal et al.,
"Detection, expression and specific elimination of endogenous
\beta-glucuronidase activity in transgenic and
non-transgenic plants", que se imprimirá en
Plant Science). La existencia de esta actividad endógena de
\beta-glucuronidasa significa también que, por el
uso del procedimiento descrito por Jefferson, es imposible
determinar si los efectos producidos por el glucurónido son debidos
realmente a hidrólisis del compuesto o si pueden ser explicados por
el hecho de que el glucurónido propiamente dicho es activo. Para
que un compuesto sea adecuado para propósitos de selección, el
compuesto tiene que ser activado por la enzima GUS y carecer además
de actividad significativa en la forma de glucurónido.
El ensayo descrito anteriormente puede
utilizarse para seleccionar glucurónidos de citoquinina que sean
susceptibles de ser hidrolizados por una enzima
\beta-glucuronidasa dada, ilustrada aquí por la
enzima \beta-glucuronidasa de
E. coli.
E. coli.
Se determinó ulteriormente, utilizando HPLC y
TLC, que las citoquininas activas no modificadas son el producto de
la hidrólisis por GUS (véanse los ejemplos anteriores relativos a la
preparación y el análisis de nuevos compuestos glucurónidos de
citoquinina). Así, se encontró, v.g., que la hidrólisis de la sal de
sodio de BA3GN por \beta-glucuronidasa de E.
coli daba como resultado una eliminación virtualmente completa
(>99%) de la sal de sodio de BA3GN para dar un compuesto que se
cromatografiaba conjuntamente en una mezcla 1:1 con BA auténtica.
Análogamente, se demostró por HPLC (metanol isocrático al 50%) que
la incubación de la sal de sodio de ZOGN con
\beta-glucuronidasa de E. coli
proporcionaba una conversión virtualmente completa en zeatina trans;
y se demostró por TLC (MeOH/cloroformo 1:1) que la incubación de la
sal de sodio de IP8SGN con \beta-glucuronidasa
durante 24 horas daba una conversión prácticamente completa (>
95%) de IP8SGN en un compuesto que se cromatografía conjuntamente
con
8-tio-(2-isopentenil)adenina.
Análogamente, otros tipos de glucurónidos pueden
seleccionarse por su susceptibilidad de ser hidrolizados por una
\beta-glucuronidasa dada. Por ejemplo, se demostró
por TLC que la incubación de
o-cumaril-\beta-D-glucurónido
(5 mg en 1 ml de tampón) durante 12 h con
\beta-glucuronidasa (Tipo Sigma G5897, 1000
unidades) daba una conversión de 93,4% en un compuesto que se
cromatografiaba conjuntamente con ácido o-cumárico.
La incubación de los otros compuestos enumerados en la Tabla 1 (con
excepción de los dos compuestos que no actuaban como sustratos para
\beta-glucuronidasa de E. coli) daba
resultados similares, es decir daba productos de hidrólisis
correspondientes a aquéllos que podían esperarse después de la
hidrólisis por \beta-glucuronidasa (véanse los
ejemplos anteriores relativos a la preparación de diversos
compuestos glucurónidos). Por el contrario, BA9GN, que como se
muestra anteriormente en la Tabla 1 no es un sustrato para
\beta-glucuronidasa de E. coli, y que no
exhibía producción detectable alguna (< 1%) de BA después de
incubación durante 18 h a 37ºC con
\beta-glucuronidasa, no induce la formación de
brotes en discos de hojas de tabaco (Tabla 2 más adelante).
Se realizaron experimentos para determinar si
los glucurónidos de citoquinina (así como una
citoquinin-glucuronamida) son capaces de inducir
formación de brotes in vivo en material vegetal con y sin,
respectivamente, un gen de \beta-glucuronidasa
introducido.
Semillas de una planta de tabaco
GUS-negativa y una GUS-positiva
(Nicotiana tabacum "Wisconsin 38") se hicieron germinar
sobre sustrato MSO (sustrato Murashige & Skoog sin hormonas,
descrito en Murashige & Skoog, Physiol. Plant. 15:
473-497, 1962, que puede obtenerse de Sigma,
EE.UU.). El material vegetal GUS-positivo contenía
un gen de \beta-glucuronidasa introducido de E.
coli (uidA) activado por el promotor 35S del virus del mosaico
de la coliflor como ha sido descrito v.g. por Jefferson et
al., The EMBO Journal, vol. 6, Nº 13, pp.
3901-3907, 1987. Las plantas transgénicas
originales GUS-positivas se produjeron utilizando el
sistema tradicional de selección negativa basado en kanamicina como
ha sido descrito v.g. por Burow et al., Plant Molecular
Biology Reporter, vol. 8(2), pp.
124-139, 1990. Las plantas jóvenes
GUS-positivas se identificaron utilizando la prueba
X-gluc como se describe más adelante en este
ejemplo.
Después de 4-5 semanas, las
partes superiores de las plantas o brotes se transfirieron a un
sustrato MSO nuevo, y se repitió este procedimiento en caso
necesario. De este modo, el material vegetal (tanto
GUS-positivo como GUS-negativo) se
mantuvo como cultivos de brotes estériles (véase Burow et
al., Plant Molecular Biology Reporter, vol 8(2),
pp. 124-139, 1190). Se taladraron con punzón discos
a partir de las hojas mayores (3-5 semanas de edad)
y se transfirieron a los sustratos indicados más adelante (Tabla 2).
El sustrato básico utilizado era MSO, añadiéndose los diversos
compuestos de ensayo a varias concentraciones hasta 250 \muM. Se
utilizaron cápsulas Petri pequeñas (\diameter = 5 cm) que
contenían aproximadamente 6 ml de sustrato, colocándose tres discos
de hoja en cada cápsula Petri. Cada tratamiento se repitió al menos
4 veces.
Se encontró que varios glucurónidos de
citoquinina inducen formación de brotes en tejidos vegetales que
contienen la enzima \beta-glucuronidasa. Los
resultados se muestran en la tabla siguiente:
"+" | significa formación de brotes a concentraciones inferiores a 250 \muM | |
"-" | significa ausencia de formación de brotes a concentraciones inferiores a 250 \muM (250 \muM corres- | |
ponde aproximadamente 100 mg/ml). |
Puede observarse por la tabla anterior, que la
totalidad de los glucurónidos de citoquinina que inducían formación
de brotes a una concentración inferior a 250 \muM en discos de
hojas de tabaco que contenían un gen de
\beta-glucuronidasa introducido eran también
capaces de inducir la formación de brotes utilizando una
concentración similar en discos de hojas correspondientes que
no contenían un gen de \beta-glucuronidasa
introducido. Por otra parte, el glucurónido de citoquinina BA9GN,
que se demostró no actuaba como sustrato para
\beta-glucuronidasa de E. coli (véase el
Ejemplo 2) no daba como resultado formación de brotes en discos de
hojas con o sin un gen de \beta-glucuronidasa
introducido. En cambio, se encontró que la
citoquinin-glucuronamida BA3GNamida, que como se
muestra en el Ejemplo 2 no actuaba como sustrato para la
\beta-glucuronidasa de E. coli, inducía la
formación de brotes en discos de hojas tanto
GUS-positivos como GUS-negativos, lo
que indica que las citoquinin-glucuronamidas se
convierten en los correspondientes ácidos
citoquinin-glucurónicos en los tejidos vegetales.
Así pues, parece ser que los precursores de glucurónidos de
citoquinina pueden funcionar in vivo de la misma manera que
los glucurónidos de citoquinina propiamente
dichos.
dichos.
Estos resultados indican que las plantas
superiores, en este caso el tabaco, poseen actividad endógena de
\beta-glucuronidasa. Este descubrimiento está de
acuerdo con lo que ha sido publicado recientemente por Hu et
al. (Plant Cell Reports 9, pp. 1-5,
1990), que investigaron la existencia de actividad afín a GUS en 52
especies de plantas de siembra, y con los descubrimientos de Hodal
et al., (que se imprimirán en Plant Science). Hu
et al. encontraron que especies que expresan actividades
positivas afines a gus están distribuidas en todos los grupos
fundamentales de angiospermas y en algunos de las gimnospermas. (Si
bien Hu et al. no detectaron actividad de GUS en el tabaco,
este resultado puede explicarse por el hecho de que su ensayo se
realizó in vitro a pH 7. Como se demuestra más adelante, la
enzima responsable de la actividad nativa de GUS en el tabaco no
parece ser activa a pH 7, pero se ha encontrado que es activa a pH
4-5).
\newpage
Estos descubrimientos están en contraposición
con lo que se expone en el documento GB 2 197 653 A, que expone que
las plantas superiores, con inclusión del tabaco, no contienen
actividad detectable alguna de
\beta-glucuronidasa. El documento GB 2 197 653 A,
que se refiere entre otras cosas a un método de controlar la
expresión de un gen de interés utilizando el gen GUS, explica que
la presencia de activada de GUS indica la expresión del gen de
interés y por consiguiente implica que, dado que no se encuentra
actividad de GUS en las plantas superiores, es una cuestión
relativamente sencilla controlar la expresión de un gen de interés
utilizando el gen GUS. Sin embargo, los resultados anteriores
demuestran que esto no es cierto, y que el uso de un gen GUS para
observar la presencia de un gen de interés no es en absoluto simple
o sencillo, debido al hecho de que las plantas superiores contienen
realmente una actividad intrínseca significativa (de fondo) de
\beta-glucuronidasa.
Para estudiar la naturaleza de la actividad de
GUS observada en material vegetal con y sin un gen de
\beta-glucuronidasa introducido, se determinó la
dependencia del pH de la actividad de GUS utilizando un ensayo
histoquímico estándar de GUS con "X-gluc"
(5-bromo-4-cloro-3-indolil-\beta-glucurónido).
La prueba X-gluc puede llevarse
a cabo preparando primeramente un medio de ensayo por disolución de
50 mg de X-gluc en una solución que contiene 25 ml
de tampón NaPO_{4} 0,2 M, típicamente pH 7,0, 24 ml de agua
destilada, 0,25 ml de K_{3}(Fe(CN)_{6}) 0,1
M, 0,25 ml de K_{4}(Fe(CN)_{6}) 0,1 M y 0,5
ml de Na_{2}EDTA 1,0 M, seguido por agitación hasta disolución
(aproximadamente 30 min). Secciones recién cortadas o fijadas con
formaldehído (espesor menor que 0,5 mm) o tejidos a 37ºC se incuban
luego en el medio X-gluc durante unos cuantos
minutos hasta 24 horas. Después de la incubación, las secciones se
enjuagan en tampón de fosfato de sodio o agua y se examinan al
microscopio. La actividad de GUS se aprecia como una tinción azul
del material vegetal tratado en el sitio de la actividad de la
enzima (Jefferson, Plant Molecular Biology Reporter, vol. 5,
Nº 4, pp. 387-405, 1987). Para los propósitos de la
presente invención, se utilizaron típicamente tiempos de ensayo de
20 horas. Después de la incubación, los discos se trataron con
etanol al 96% para separar la clorofila.
Los resultados se muestran en la tabla
siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
0: | ausencia de reacción en la prueba X-gluc | |
+: | reacción azul en la prueba X-gluc. |
Puede verse que la enzima responsable de la
actividad de \beta-glucuronidasa subyacente en los
discos de hojas de tabaco sin un gen de
\beta-glucuronidasa introducido es únicamente
activa dentro de un estrecho intervalo de pH que corresponde al pH
interno de las plantas (aproximadamente pH 5), mientras que la
\beta-glucuronidasa expresada por el gen
introducido es activa a lo largo de un amplio intervalo de pH que va
desde 4 a 8. Esta dependencia del pH puede explicar por qué
intentos previos para detectar actividad de GUS en plantas han sido
en gran parte infructuosos, conduciendo a la conclusión errónea
(v.g. en el documento GB 2 197 653 A) de que las plantas no poseen
actividad de GUS intrínseca.
El hecho de que la actividad de
\beta-glucuronidasa demostrada anteriormente para
el material vegetal sin un gen GUS introducido es realmente
resultado de la hidrólisis del sustrato glucurónido de citoquinina
por \beta-glucuronidasa, y no resultado de una
reacción inespecífica que escinde el sustrato, v.g. una hidrólisis
ácida no enzimática de glucurónidos (que como es sabido se escinden
a valores de pH bajos) se demostró ensayando el efecto de
inhibidores de diversas enzimas a pH 5 en material vegetal no
transformado genéticamente (es decir material vegetal que tenía
sólo actividad de GUS nativa). La investigación se realizó
utilizando la prueba X-gluc descrita anteriormente
a pH 5,0 durante 20 horas.
0 = | ausencia de reacción, es decir disco de hoja completamente blanco | |
+ = | tinción azul con X-gluc. |
Los seis inhibidores ensayados tienen los
efectos siguientes:
la
sacaro-1,4-lactona es un inhibidor
que es específico para enzimas de
\beta-glucuronidasa (dicho de otro modo, inhibe
únicamente \beta-glucuronidasas e inhibe todas las
\beta-glucuronidasas). Está aceptado generalmente
que la actividad de GUS que puede ser inhibida por este compuesto
es resultado de la acción de una enzima
\beta-glucuronidasa.
La gluconolactona es un inhibidor de
\beta-glucosidasas. Corresponde a la
sacaro-1,4-lactona, con la excepción
de que es específica para \beta-glucosidasas.
El UDP-glucurónido es un
sustrato para
UDP-glucuronido-transferasas.
El ácido glucurónico es el producto de cualquier
reacción de \beta-glucuronidasa y por consiguiente
un inhibidor del producto de las
\beta-glucuronidasas y otras enzimas formadoras de
ácido glucurónico.
La galactosa es un inhibidor de las reacciones
dependientes de
UDP-glucuronido-transferasas.
El metilumbeliferil-glucurónido
es un sustrato para todas las \beta-glucuronidasas
investigadas hasta ahora, y es por consiguiente un inhibidor
competitivo de las enzimas GUS.
Dado que se encontró también que EDTA (que
inhibe las
UDP-glucuronido-transferasas) no
produce efecto alguno, es improbable que dichas transferasas estén
involucradas en la actividad de GUS observada. La tabla anterior
muestra que aquellos compuestos que deberían inhibir una enzima
transferasa no tienen efecto alguno ni siquiera a concentraciones
muy altas. Ulteriormente, puede verse que la gluconolactona no tiene
efecto inhibidor alguno, y es por consiguiente improbable que la
actividad de GUS esté relacionada con una actividad de
\beta-glucosidasa.
Adicionalmente, puede observarse que el
inhibidor específico de GUS
sacaro-1,4-lactona es un inhibidor
potente, que el ácido glucurónido (producto de inhibición de la
\beta-glucuronidasa) es un inhibidor de fuerza
intermedia y que el metilumbeliferil-glucurónido
(un sustrato GUS y por consiguiente un sustrato competitivo para
X-gluc si una enzima
\beta-glucuronidasa es responsable de la
hidrólisis de X-gluc) es un inhibidor débil. La
actividad de GUS en el tabaco satisface por consiguiente todos los
criterios necesarios para ser clasificada como resultante de una
enzima \beta-glucuronidasa. Por tanto, puede
llegarse a la conclusión de que las plantas contienen una enzima
\beta-glucuronidasa.
Se llevó a cabo una serie correspondiente de
experimentos para comprobar si el efecto de los inhibidores era
suficientemente rápido para poder inhibir la enzima. En esta serie,
el material vegetal se preincubó en los compuestos de ensayo
(inhibidores) durante 24 horas antes de la realización de la prueba
X-gluc con los mismos compuestos de ensayo. Los
resultados obtenidos fueron idénticos a los obtenidos sin
preincubación, lo que indica que los inhibidores penetran en el
tejido vegetal con rapidez suficiente para inhibir la prueba
X-gluc antes que pueda producirse la tinción
azul.
Se obtuvieron resultados similares a los
descritos anteriormente en otra investigación en cuanto a la
existencia de actividad de GUS en las plantas. En este caso, se
ensayó la dependencia del pH de la reacción histológica de GUS en
varias especies de plantas a valores de pH comprendidos entre 3 y 8,
con y sin el inhibidor específico de GUS
sacaro-1,4-lactona.
La prueba utilizada fue la prueba
X-gluc descrita anteriormente. La prueba se realizó
a 37ºC durante 20 horas. Se cortaron hojas (con cuchillas de
afeitar esterilizadas) de tal manera que cada hoja se ensayó a
varios valores de pH diferentes.
Como se muestra por la tabla siguiente, esta
investigación confirmó que las plantas poseen de hecho actividad de
GUS nativa, que esta actividad es el resultado de una reacción
enzimática (ausencia de reacción en presencia del inhibidor
específico de GUS) y que la enzima es fundamentalmente activa a
valores de pH de aproximadamente 4-5.
1) | Tejido de hoja que expresa el gen GUS de E. coli | |
2) | Tejido de hoja transgénica que contiene únicamente un gen de resistencia a la kanamicina (NPT), | |
sin un gen GUS introducido | ||
3) | Tejido del tallo o del peciolo | |
4) | Tejido de callo embriogénico | |
+ | Reacción azul | |
(+) | Baja frecuencia de actividad de GUS (reacción azul débil) | |
0 | Ausencia de reacción | |
n | No determinada. |
El hecho de que las plantas tienen una actividad
general GUS intrínseca hace que sea posible utilizar un gen
codificante de glucuronido-permeasa como gen de
selección positiva sin el uso de ningún otro gen de selección
aprovechando la ventaja de una absorción incrementada de un
compuesto glucurónido por las células transformadas. Por ejemplo,
se ha encontrado que los glucurónidos no son absorbidos fácilmente
en las células vegetales a través de las membranas plasmáticas. No
obstante, si se introduce un gen de
glucuronido-permeasa en una célula, los
glucurónidos podrán atravesar más fácilmente la membrana plasmática
y entrar en la célula. Los glucurónidos estarán entonces
disponibles para ser escindidos por la encima GUS intrínseca en las
células transformadas. En contraste, el glucurónido en cuestión no
estará disponible para las células no transformadas, por lo cual se
conseguirá un efecto de selección positiva. Análogamente, puede
realizarse también una selección positiva utilizando otras
permeasas y otros tipos de compuestos que o bien son activados en
las células transformadas por una enzima intrínseca o que, de
cualquier otro modo, ejerzan un efecto biológico en las células
transformadas a las que se transporten.
El efecto de la sal de sodio del glucurónido de
citoquinina BA3GN se bloquea cuando se inhibe la actividad de GUS
en el tejido vegetal que contiene este glucurónido de citoquinina
Dicho de otro modo, el glucurónido de citoquinina es inactivo en sí
mismo. Adicionalmente, se ha demostrado que el glucurónido de
citoquinina es estable en el medio de crecimiento así como en el
tejido vegetal cuando no está presente
\beta-glucuronidasa, como se muestra por el hecho
de que el inhibidor específico de GUS,
sacaro-1,4-lactona (SL), inhibe
fuertemente la formación de brotes inducida por la sal de sodio del
glucurónido de citoquinina BA3GN, pero inhibe sólo débilmente la
formación de brotes inducida por la citoquinina BA libre (utilizando
el método básico descrito anteriormente en el Ejemplo 3):
Por comparación de los resultados de la tabla
anterior con los dados anteriormente en la Tabla 2, se puede ver
que la sal de sodio de BA3GN, que induce la formación de brotes en
los discos de hojas de tabaco tanto GUS-positivos
como GUS-negativos, no induce formación de brotes en
discos de hojas correspondientes en presencia del inhibidor
específico de \beta-glucuronidasa
sacaro-1,4-lactona.
La
sacaro-1,4-lactona (SL) no es un
compuesto estable al pH utilizado en este ejemplo. Existe un
equilibrio entre SL y ácido sacárico (SA). Este equilibrio se
alcanza sólo lentamente, y la conversión de SL en SA va seguida por
una disminución del pH. El pH tiene que ajustarse por consiguiente
varias veces durante un período de una semana antes de utilizar la
SL hasta que se ha estabilizado el pH en el sustrato que contiene
SL.
El hecho de que los glucurónidos de citoquinina
son estables e inactivos cuando no están en presencia de
\beta-glucuronidasa se demuestra ulteriormente
por el hecho de que BA9GN, que no puede ser hidrolizado por
\beta-glucuronidasa, no puede inducir la
formación de brotes en material vegetal que contenga actividad de
\beta-glucuronidasa (véanse los Ejemplos 2 y
3).
Es importante el hecho de que los compuestos
glucurónidos de citoquinina sean inactivos y estables en sustratos
que no contienen una enzima \beta-glucuronidasa,
dado que esta estabilidad es un requisito previo para el
funcionamiento apropiado del sistema de selección positiva que los
utiliza.
Sin embargo, puede esperarse que no todos los
derivados de ácido glucurónico sean estables. Por ejemplo, los
glucurónidos-éster no serán estables en tejido vegetal que contenga
esterasas inespecíficas. Esto significa que los compuestos
glucurónidos de citoquinina preparados y utilizados de acuerdo con
la presente invención
(\beta-D-glucurónidos acoplados a
la aglicona por átomos O, S y N glicosídicos) satisfacen el
requisito previo de estabilidad. Por otra parte, no es de esperar
que compuestos que tienen otros tipos de enlaces glucurónidos, v.g.
amida- o
éster-\beta-D-glucurónidos,
sean hidrolizados selectivamente por las
\beta-glucuronidasas, debido a la existencia de
esterasas y amidasas inespecíficas en las plantas.
Haciendo referencia al Ejemplo 3 anterior, se ha
demostrado así que los glucurónidos de citoquinina ensayados, que
como se muestra en este ejemplo no poseen en sí mismos actividad de
citoquinina, son escindidos in vivo por la acción de
\beta-glucuronidasa - sea en la forma de
\beta-glucuronidasa sustrato endógena o como
resultado de un gen de \beta-glucuronidasa
introducido - por lo cual se libera citoquinina libre.
Se ha demostrado que otros glucurónidos, con
inclusión de glucurónidos de esteroles, ácido glicirricínico e
hidroxiquinolina, son hidrolizados por
\beta-glucuronidasa y dan como resultado formación
de brotes sobre sustratos modificados en los cuales los productos
de hidrólisis son necesarios para la formación de brotes. Esto se
muestra en los Ejemplos 5 y 6.
Se realizaron experimentos para determinar el
efecto inductor de brotes de dos
esterol-glucurónidos,
\beta-sitosteril-\beta-D-glucurónido
(SG) y
colesteril-\beta-D-glucurónido
(CG), cuando la síntesis de esterol está inhibida en los tejidos.
Los métodos básicos empleados corresponden esencialmente a los
descritos para el Ejemplo 3 anterior. Sin embargo, además de uno o
los dos esterol-glucurónidos mencionados
anteriormente, el sustrato contenía tridemorf 0,1 mM y 5 mg/l de
sal de sodio de BA3GN. Se registró el número de brotes al cabo de 30
días.
El tridemorf
(4-tridecil-2,6-dimetil-morfolina)
es un fungicida que inhibe la síntesis de esteroles y compuestos
similares. El tridemorf tiene un efecto inhibidor sobre la
regeneración de los brotes (aunque no un efecto fatal en los
explantes) cuando el tejido vegetal no está suministrado de
esteroles. Así, en ausencia de esteroles libres, debería prevenirse
eficazmente la formación de brotes.
El CG se obtuvo de Sigma, EE.UU., y el SG se
sintetizó de acuerdo con el procedimiento descrito por Ando et
al. en J. Antibiotics 73, p. 408, 1970.
Los resultados obtenidos se muestran en la tabla
siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
La tabla anterior muestra que el
sitosteril-\beta-D-glucurónido
es capaz de contrarrestar el efecto inhibidor de los brotes de
tridemorf y que la combinación de
sitosteril-\beta-D-glucurónido
y
colesteril-\beta-D-glucurónido
proporciona la formación de brotes máxima. Así pues, la sección
positiva de acuerdo con la invención utilizando un gen de
\beta-glucuronidasa introducido es posible
utilizando v.g. uno o los dos compuestos
esterol-glucurónidos anteriores junto con un
compuesto inhibidor de brotes tal como tridemorf. Estos resultados
indican que también pueden utilizarse otros esteroles y compuestos
afines a los esteroles para selección positiva a partir de tejidos
que contengan un gen de \beta-glucuronidasa
introducido.
Una ventaja de la utilización de estos
compuestos muy ligeramente solubles para selección positiva es que
su efecto será presumiblemente muy local, dado que los compuestos no
se difunden de célula a célula cuando el resto hidrófilo del
glucurónido es escindido por una enzima
\beta-glucuronidasa. Dicho de otro modo, estos
compuestos pueden utilizarse para prevenir la alimentación cruzada
durante el procedimiento de selección.
Este experimento indica adicionalmente que el
efecto inhibidor de brotes del tridemorf, y por consiguiente
también de otros compuestos que inhiben la síntesis de esteroles,
puede contrarrestarse por adición de esteroles y derivados de
esterol al sustrato, con lo cual puede establecerse un sistema de
selección basado en proporcionar esteroles y compuestos afines a
esteroles a células transgénicas, con las ventajas mencionadas
anteriormente.
Se realizó un experimento similar al descrito en
el Ejemplo 5 sobre discos de hojas de tabaco tanto transformadas
como no transformadas utilizando
sitosteril-\beta-D-glucurónido
y BA o sal de sodio de BA3GN.
Los métodos empleados fueron en esencia los
descritos anteriormente en el Ejemplo 5. En este experimento, se
añadió tridemorf al sustrato a una concentración de 0,1 mM y se
añadió
sitosteril-\beta-D-glucurónido
a una concentración de 121 mg/l. El sustrato contenía además 1,88
mg/l de sal de sodio de BA3GN o 0,1 mg/l de BA. Se registró el
número de brotes al cabo de 40 días.
El número de brotes obtenido fue como sigue:
\vskip1.000000\baselineskip
Brotes regenerados por disco de
hoja
Puede verse que, como sucedía en el Ejemplo 5
anterior, la presencia de
sitosteril-\beta-D-glucurónido
era capaz de contrarrestar el efecto inhibidor de brotes del
tridemorf. Adicionalmente, cuando se utilizaron
sitosteril-\beta-D-glucurónido
y tridemorf junto con la sal de sodio de BA3GN, se obtuvo una
formación selectiva de brotes en los discos de hojas
GUS-positivos, mientras que los discos de hojas
GUS-negativos en el sustrato que contenía sal de
sodio de BA3GN no exhibían virtualmente formación alguna de
brotes.
Estos resultados indican también que el uso de
una combinación de diferentes glucurónidos (en este caso BA3GN y SG
en lugar de BA y SG) puede mejorar la respuesta selectiva de los
tejidos transgénicos.
Dado que los esteroles y esteroides son también
reguladores importantes del crecimiento en las células animales,
pueden utilizarse también procedimientos de selección
correspondientes para la selección de células animales que expresen
\beta-glucuronidasa.
Se ha encontrado que ciertas cepas de
Agrobacterium inducen formación de brotes debido a la
producción de sustancias inductoras de brotes durante el
co-cultivo. Tales cepas deberían evitarse
normalmente cuando va a emplearse la hidrólisis por GUS de
glucurónidos de citoquinina para los fines de selección de células
transformadas genéticamente, dado que estas cepas pueden inducir
por sí solas formación de brotes e interferir por ello en el proceso
de selección.
Como ejemplo, la tabla siguiente muestra los
resultados de un experimento con dos cepas de Agrobacterium
diferentes, una de las cuales induce formación de brotes sobre
discos de hojas de tabaco después del
co-cultivo.
Los métodos utilizados corresponden
esencialmente a los descritos en el Ejemplo 13, pero después del
co-cultivo, los discos de hojas se transfirieron a
sustrato MSO sin hormonas que contenía 300 mg/l de cefotaxima y 300
mg/l de carbenicilina.
El número de brotes regenerados se registró
cuatro semanas después del co-cultivo.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se ve que las propiedades de inducción de brotes
de algunas de las cepas de Agrobacterium no son dependientes
de los genes contenidos en el T-DNA. Esto significa
que genes exteriores a la región T-DNA son
responsables de la inducción de brotes.
Un gen exterior a la región
T-DNA responsable de la producción de citoquinina ha
sido denominado tzs (Morris, R.O. Ann. Rev. Plant
Physiol. 37, pp. 509-538, 1986). La cepa C58
contiene el gen tzs, un gen no transferible que codifica la
síntesis de zeatina durante el co-cultivo. La cepa
LBA4404 no contiene el gen tzs. El hecho de que las cepas
inductoras de brotes contienen un plásmido que contiene el gen
tzs indica que este gen puede ser responsable de las
propiedades de inducción de brotes observadas en estas
investigaciones y que las cepas de Agrobacterium que
contienen el gen tzs deberían evitarse en los sistemas de
selección basados en citoquinina. Cualesquiera otras cepas de
Agrobacterium que induzcan formación de brotes deberían ser
evitadas también normalmente.
\vskip1.000000\baselineskip
Brotes transformados genéticamente pueden
seleccionarse utilizando glucurónidos de citoquinina.
Se llevó a cabo una serie de experimentos para
ensayar la eficacia del sistema de selección positiva utilizando la
sal de sodio del glucurónido de citoquinina BA3GN en concentraciones
de 7,5 y 15 mg/l. Los experimentos se realizaron sobre discos de
hojas de tabaco de tipo salvaje en los que se emplearon 2 cepas
diferentes de Agrobacterium así como diversos sustratos de
co-cultivo. El método de transformación utilizado
fue el descrito más adelante en el Ejemplo 13, con la excepción de
que se utilizo el sustrato Gamborg B5 (Gamborg et al.,
Exp. Cell Res. 50: 151-158, 1968; obtenible
de Sigma, EE.UU.) en lugar de MSO. Los resultados dados a
continuación son valores medios basados en dos experimentos
independientes, cada uno de los cuales se realizó sobre 27 discos de
hoja por
tratamiento.
tratamiento.
\newpage
Sal de sodio de BA3GN, 7,5
mg/l
\vskip1.000000\baselineskip
Sal de sodio de BA3GN, 15
mg/l
B5: | Sustrato Gamborg B5, pH 5,4 | |
Amón.: | Sustrato de co-cultivo con nitrato de amonio 75 mM | |
SL: | Sustrato de co-cultivo con ácido sacárico 25 mM + sacaro-1,4-lactona 25 mM a partir de una | |
solución estabilizada | ||
GUS+: | Brotes que expresaban actividad de GUS cuando se ensayaron a pH 7 como se describe en el | |
Ejemplo 3 |
La cepa BS10 introduce un gen GUS activado por
un promotor modificado 35S no activo en Agrobacterium, como
ha sido descrito por Janssen & Gardner en Plant Molecular
Biology, 14, pp. 61-72, 1989. La cepa LDH1
introduce un gen GUS activado por el promotor 35S sin
modificar.
Los resultados de la Tabla 9 muestran que la
selección positiva de brotes transgénicos que expresan un gen de
\beta-glucuronidasa introducido es posible
empleando sal de sodio de BA3GN. Estos resultados son muy
significativos, y eran inesperados, dado que se encontró como se
describe en el Ejemplo 3 que los glucurónidos de citoquinina eran
capaces de inducir la formación de brotes en discos de hojas que no
contenían un gen de \beta-glucuronidasa
introducido. Los diferentes tratamientos utilizados durante el
co-cultivo no parecen tener ningún efecto
significativo en la
selección.
selección.
Los resultados mostrados anteriormente indican
también que el uso de una cepa de Agrobacterium con un gen
de \beta-glucuronidasa activo (la cepa LDH1
expresa actividad de GUS en bacterias) no afecta al sistema de
transformación en comparación con una cepa que no tiene un gen de
\beta-glucuronidasa activo (la cepa BS10 no
expresa actividad de GUS en bacterias).
Se prepararon brotes de hojas de tabaco
transgénicas empleando esencialmente el mismo procedimiento que se
describe en el Ejemplo 13, y se seleccionaron utilizando el
glucurónido de citoquinina ácido
zeatin-o-\beta-glucurónico
(ZOGN) como el agente de selección positiva.
Se llevó a cabo el co-cultivo
durante tres días, correspondiendo la densidad de inoculante a un
valor DO de 1,5 a 660 nm. El sustrato utilizado después del
co-cultivo era MSO que contenía 300 mg/l de
carbenicilina, 300 mg/l de cefotaxima y 0,1 mg/l de ácido
indol-acético (IAA). El subcultivo se realizó
después de tres semanas en el mismo sustrato pero sin IAA. El pH en
todos los sustratos utilizados en este ejemplo era 8,0. Se
utilizaron 18 discos de hoja para cada tratamiento.
Cinco semanas después del
co-cultivo, los brotes se transfirieron a un
sustrato MSO que contenía 200 mg/l de sulfato de kanamicina, ácido
sacárico 32 mM, 300 mg/l de cefotaxima y 300 mg/l de carbenicilina,
pH 8,0. Se añadió ácido sacárico, un inhibidor de las enzimas
\beta-glucuronidasa, para detener la conversión
ulterior del glucurónido de zeatina en zeatina. Junto con el gen de
\beta-glucuronidasa, se transfirió conjuntamente
un gen NPT que proporcionaba resistencia a la kanamicina. Los
brotes no transformados (controles negativos) sobrevivieron, pero
el crecimiento de dichos brotes se retardaba en este sustrato,
mientras que la totalidad de los brotes transformados (controles
positivos) que contenían un gen NPT activo sobrevivían sin ningún
retardo del crecimiento.
Se registró el número de brotes, y se determinó
el número de brotes GUS-positivos entre el número
total de brotes por la prueba X-gluc (Ejemplo 3)
tres semanas después del último subcultivo (8 semanas después del
co-cultivo). Los resultados se muestran a
continuación:
\vskip1.000000\baselineskip
* SL: | sacaro-1,4-lactona 2 mM |
Los resultados dados en la tabla anterior
muestran que se consiguió una selección positiva satisfactoria de
brotes transformados genéticamente utilizando ZOGN. La inducción de
brotes transgénicos se inhibía cuando se añadió el inhibidor
específico de \beta-glucuronidasa
sacaro-1,4-lactona al sustrato, lo
que muestra que el crecimiento de brotes transgénicos y por
consiguiente el éxito de la selección positiva dependía de la
conversión catalizada por \beta-glucuronidasa de
ZOGN en zeatina.
La dependencia de la temperatura del sistema de
selección positiva utilizando glucurónidos de citoquinina se
investigó utilizando ácido
zeatin-o-\beta-glucurónico
(ZOGN) como el agente de selección positiva a 25ºC, 30ºC y
35ºC.
35ºC.
Se prepararon brotes de tabaco transgénicos
utilizando esencialmente el mismo procedimiento que se describe más
adelante en el Ejemplo 13. Se llevó a cabo el
co-cultivo durante 3 días, correspondiendo la
densidad de inoculante a una DO de 1,5 a 660 nm. El sustrato
utilizado después del co-cultivo era MSO que
contenía 10 mg/l de
2-(2-hidroxietilamino)-6-bencilamino-9-metilpurina
(9-met), 350 mg/l de carbenicilina, 350 mg/l de
cefotaxima y 0,1 mg/l de ácido indolacético (IAA) y sal de sodio de
ZOGN como se indica. Se añadió 9-met (obtenida de
Apex Organics Ltd., Reino Unido) para inhibir la glicosilación de la
zeatina y los derivados de zeatina. Se utilizaron 18 discos de hoja
para cada tratamiento.
Siete semanas después del
co-cultivo, se transfirieron los brotes a un
sustrato MSO que contenía 300 mg/l de sulfato de kanamicina, 350
mg/l de cefotaxima, 350 mg/l de carbenicilina, 0,1 mg/l de IAA y 10
mg/l de
6-(m-hidroxibencilamino)-purina
(OH-BA) y se dejaron a una temperatura de 25ºC. La
OH-BA puede prepararse como ha sido descrito por
Kaminek et al. (Plant Growth Reg. 6, pp.
113-120, 1987).
Después de seis semanas en el sustrato que
contenía kanamicina, se registró el número de brotes verdes. La
resistencia a la kanamicina indica que el brote es transgénico, dado
que junto con el gen de \beta-glucuronidasa se
co-transfería un gen NPT que proporcionaba
resistencia a la kanamicina. No sobrevivía brote alguno sin
transformar (controles negativos) en este sustrato, mientras que
sobrevivieron la totalidad de los brotes transformados (controles
positivos) que contenían un gen NPT activo.
Se calculó el porcentaje de brotes resistentes a
la kanamicina entre el número total de brotes regenerados como el
número de brotes verdes que sobrevivían en el sustrato que contenía
kanamicina dividido por el número de brotes transferidos al
sustrato que contenía kanamicina. Los resultados se muestran en la
tabla siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
El bioensayo descrito en este ejemplo se realizó
sobre un gen co-transferido enlazado. Esto significa
que el gen de \beta-glucuronidasa se utiliza para
selección, mientras que se ensaya la resistencia resultante del gen
NPT co-transferido introducido (gen de resistencia a
la kanamicina).
Los resultados anteriores muestran que, además
del gen de \beta-glucuronidasa, se expresa también
un gen co-transferido cuando se realiza la
selección utilizando el gen de
\beta-glucuronidasa. Adicionalmente, puede verse
que la selección a temperaturas elevadas (es decir, aproximadamente
30-35ºC) mejora la selección de brotes por disco de
hoja y también la fracción de brotes transgénicos entre el número
total de brotes regenerados.
Realizando la prueba X-gluc a
diferentes temperaturas, se ha observado en conexión con la presente
invención, que la actividad intrínseca de
\beta-glucuronidasa que existe en las plantas se
inhibe a temperaturas altas, mientras que no se ve afectada la
actividad de \beta-glucuronidasa introducida. Así,
se encontró que la actividad de
\beta-glucuronidasa intrínseca decrecía
gradualmente con las temperaturas crecientes hasta aproximadamente
60ºC, a cuya temperatura no se observaba esencialmente actividad de
\beta-glucuronidasa intrínseca alguna (como se
determina por la prueba X-gluc). Esto puede
explicar la mejora del procedimiento de selección a temperaturas
elevadas.
Se ha observado que el sistema de selección
positiva descrito en esta memoria es muy eficiente y ventajoso en
comparación con la selección negativa tradicional basada en
kanamicina. Sin embargo, se obtienen también resultados
satisfactorios cuando se emplea el sistema de selección positiva
junto con la selección negativa tradicional.
Así, la tabla siguiente muestra los resultados,
en términos del número de brotes de tabaco
GUS-positivos por disco de hoja y el porcentaje de
brotes GUS-positivos entre el número total de
brotes, para selección positiva con empleo de sal de sodio de
BA3GN, selección negativa tradicional utilizando kanamicina y BA, y
selección positiva y negativa en combinación. Adicionalmente, el
experimento incluía selección utilizando sal de sodio de BA3GN
junto con sacaro-1,4-lactona (SL)
(un inhibidor específico potente de la
\beta-glucuronidasa introducida).
Los métodos utilizados fueron esencialmente como
los descritos más adelante en el Ejemplo 13, pero se utilizó el
sustrato Gamborg B5 en lugar de sustrato MSO.
* | Sal de sodio | |
** | Concentraciones en mg/l. |
El experimento con BA junto con kanamicina, que
es el sistema de selección negativa tradicional, se repitió como
dos experimentos diferentes con 54 discos de hoja por experimento.
Se detectó un solo brote GUS-positivo entre un
total de 23 brotes seleccionados. Los resultados para la sal de
sodio de BA3GN se obtuvieron utilizando 324 discos de hoja. El
experimento con SL
(sacaro-1,4-lactona) se realizó una
sola vez con un total de 162 discos de hoja.
La tabla anterior muestra que la selección
positiva utilizando 15 mg/l de sal de sodio de BA3GN (sin
kanamicina) dio 30 veces más brotes GUS-positivos
por disco de hoja que el sistema de selección negativa tradicional
utilizando 1 mg/l de BA y 300 mg/l de sulfato de kanamicina.
Adicionalmente, un porcentaje mayor del número total de brotes eran
GUS-positivos cuando se utilizó sección positiva
(7,4%) que cuando se utilizó selección negativa (4,3%).
Se obtuvieron también resultados ventajosos
utilizando una combinación de selección positiva y negativa, es
decir sustituyendo una citoquinina en el sistema de selección
negativa tradicional basado en kanamicina con un glucurónido de
citoquinina (sal de sodio de BA3GN). Así, cuando se combinaron 15
mg/l de sal de sodio de BA3GN con 300 mg/l de sulfato de
kanamicina, el porcentaje de brotes GUS-positivos
era 11 veces mayor que el obtenido utilizando BA y kanamicina, y
cuando se combinaron 15 mg/l de sal de sodio de BA3GN con 33 mg/l
de sulfato de kanamicina, el número de brotes
GUS-positivos por disco de hoja era 40 veces mayor
que el obtenido utilizando BA y kanamicina.
Cuando se combinaron 15 mg/l de sal de sodio de
BA3GN con una concentración 10 mM del inhibidor de GUS SL, tanto el
número de brotes GUS-positivos por disco de hoja
como el porcentaje de brotes GUS-positivos se
redujeron drásticamente en comparación con el caso en que se
utilizaron 15 mg/l de sal de sodio de BA3GN solos. Esto demuestra
que el gen GUS introducido es responsable de los resultados
ventajosos obtenidos utilizando el sistema de selección positiva,
dado que la adición de SL al medio de crecimiento inhibe fuertemente
la conversión catalizada por \beta-glucuronidasa
del glucurónido de citoquinina inactivo (sal de sodio de BA3GN) en
citoquinina activa en las células desarrolladas en este sustrato,
conduciendo con ello a la reducción observada en el número de
brotes inducido. Así pues, el sistema de selección positiva funciona
tal como se desea, es decir, utilizando un gen de
\beta-glucuronidasa introducido para escindir un
glucurónido de citoquinina en células transformadas genéticamente,
liberándose con ello citoquinina libre en estas células y
conduciendo a la formación de brotes.
Se ha mostrado ya (véase Tabla 3, Ejemplo 3) que
la \beta-glucuronidasa existente naturalmente en
las plantas es inactiva a valores de pH relativamente altos, es
decir, a valores de pH de aproximadamente 6 o mayores, en tanto que
la \beta-glucuronidasa introducida es activa hasta
pH 8. Por adición al medio de crecimiento de un compuesto que pueda
elevar el pH interno de las células, v.g. nitrato de amonio, puede
mejorarse ulteriormente la formación selectiva de brotes a partir
de las células GUS-positivas, dado que de este modo
se hace posible bloquear cualquier actividad de fondo de
\beta-glucuronidasa resultante de la
\beta-glucuronidasa existente naturalmente en las
células no transformadas.
La tabla siguiente muestra el número de brotes
obtenidos a partir de discos de hoja de tabaco
GUS-positivos y GUS-negativos
utilizando diversas concentraciones de sal de sodio de BA3GN y
nitrato de amonio. Los métodos utilizados fueron los mismos que los
descritos en el Ejemplo 3, con la excepción de que se utilizó
sustrato Gamborg B5 en lugar del sustrato MSO.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
\newpage
Formación de brotes (número de
brotes y factor de selectividad*) en discos de hojas GUS+ Y
GUS-
* | El factor de selectividad es el número de brotes GUS-positivos dividido por el número de brotes | |
GUS-negativos, y por consiguiente da una indicación de la selectividad de un tratamiento dado | ||
** | Sal de sodio. |
\vskip1.000000\baselineskip
Puede verse que el uso tanto de sal de sodio de
BA3GN como de nitrato de amonio en concentraciones apropiadas
conduce a la formación selectiva de brotes en los discos de hoja
GUS-positivos. Por ejemplo, una combinación de 15
mg/l de sal de sodio de BA3GN y nitrato de amonio 55 mM daba 34
brotes a partir de los discos de hojas
GUS-positivos, mientras que no se formó brote alguno
en los discos de hojas GUS-negativos
correspondientes sometidos al mismo tratamiento.
Otra posibilidad de mejorar la selectividad del
sistema de selección positiva utilizando glucurónidos de citoquinina
consiste en añadir al medio de crecimiento un sustrato que, después
de escisión por \beta-glucuronidasa da como
resultado un aumento de pH, inhibiendo de este modo la hidrólisis de
los glucurónidos de citoquinina en las células no transformadas sin
inhibir el efecto de la citoquinina libre.
Este principio se ilustró en un experimento
sobre el efecto de diversas concentraciones de ácido
o-cumaril-\beta-D-glucopiranurónico
(CouGN) sobre la formación de brotes a partir de discos de hojas de
tabaco GUS-negativas inducida por la sal de sodio
de BA3GN o BA. Cuando el ácido
o-cumaril-\beta-D-glucopiranurónico
es escindido por la acción de \beta-glucuronidasa,
se libera ácido o-cumárico. Como se ha mencionado
anteriormente (véase el Ejemplo 1I), el ácido
o-cumárico se convierte espontáneamente en
cumarina. Esto implica la eliminación de un grupo ácido (véase más
adelante) y por consiguiente un aumento de pH hasta un nivel para
el cual se presume que la actividad de la
\beta-glucuronidasa nativa de la planta sea
reducida.
\vskip1.000000\baselineskip
El experimento se realizó utilizando una
concentración de BA de 0,5 mg/l y una concentración de sal de sodio
de BA3GN de 10,0 mg/l. Se utilizaron 12 discos por tratamiento, y se
registró el número de brotes al cabo de 19 días. Los resultados se
muestran a continuación.
\vskip1.000000\baselineskip
* | Sal de sodio. |
La tabla anterior muestra que la presencia de
ácido
o-cumaril-\beta-D-glucopiranurónico
en el medio de crecimiento inhibe la regeneración de brotes
inducida por la sal de sodio de BA3GN, pero no por BA. Los
resultados óptimos en este experimento se obtuvieron utilizando una
concentración de ácido
o-cumaril-\beta-D-glucopiranurónico
de aproximadamente 3-4 mM. En la reducción de la
formación de brotes inducida por BA3GN podrían estar implicados
varios mecanismos, con inclusión de los siguientes: 1) un pH
incrementado debido a la liberación de ácido
o-cumárico, como se ha explicado anteriormente; 2)
competición de sustratos entre CouGN y BA3GN, conduciendo a una
frecuencia menor de hidrólisis de BA3GN, y 3) un transporte reducido
de BA3GN a las células. Si bien los mecanismos exactos involucrados
en la reducción observada de la formación de brotes en presencia de
CouGN no se determinaron, se cree que un pH incrementado es
probable que haya sido al menos parcialmente responsable. En
cualquier caso, este experimento indica que la selectividad del
sistema de selección positiva puede mejorarse utilizando el gen de
\beta-glucuronidasa introducido para establecer un
mecanismo de auto-regulación que puede reducir
significativamente el efecto de cualquier enzima sustrato.
A continuación se da un método general que puede
utilizarse para la preparación de plantas transformadas
genéticamente.
Se obtienen hojas (Nicotiana tabacum
"Wisconsin 38") de plantas cultivadas in vitro o in
vivo. En el último caso, las hojas se esterilizan antes de la
transformación. La esterilización puede realizarse poniendo las
hojas durante 20 min en una solución de hipoclorito de calcio al 5%
que contiene 0,1 ml de Tween 80 por litro, seguido por lavado cinco
veces en agua estéril. Las plantas in vitro se cultivan en
recipientes sobre 1/2 MSO. (1/2 MSO es el mismo sustrato que MSO en
concentración 50%, excepto en lo referente a agar, azúcar y
vitaminas).
Las hojas se ponen de una en una en cápsulas
Petri de 14 cm. Se taladran con punzón las hojas o se cortan en
trozos de aproximadamente 1 cm^{2} sin un nervio principal,
estando constituido los bordes de los trozos por tejido que ha sido
cortado. Cualquier tejido cortado que haya sido blanqueado por la
esterilización con hipoclorito se elimina.
Un día antes de la transformación, se inicia un
cultivo de bacterias por adición de 2-3 ml de
bacterias a 200 ml de medio LB en un matraz Erlenmeyer. La bacteria
se cultiva a 28ºC con agitación (300 rpm).
El cultivo de bacterias se diluye 50 veces o
hasta DO 0,1 (a 660 nm) con 1/2 MSO inmediatamente antes de la
transformación. Se vierten en una cápsula Petri de 9 cm
aproximadamente 10 ml de la suspensión diluida de bacterias, y los
trozos de hojas se sumergen en esta suspensión durante
aproximadamente 15 min. Los trozos de hojas se retiran luego y el
exceso de suspensión de bacterias se elimina utilizando papel de
filtro estéril.
El día antes de la transformación, se coloca una
pieza de papel de filtro estéril sobre cápsulas de
co-cultivo (que contienen típicamente sustrato MSO)
y los trozos de hojas que se han sumergido en la suspensión de
bacterias se colocan invertidos sobre el papel de filtro. Los
trozos de hojas se incuban en una cámara de crecimiento con un
ciclo de 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad durante 2 días.
Los trozos de hojas se transfieren a cápsulas
Petri que contienen glucurónidos de citoquinina como se indica y
350 mg/l de carbenicilina + 350 mg/l de cefotoxima o 800 mg/l de
carbenicilina, en ciertos casos en combinación con sulfato de
kanamicina. Los trozos de hojas se sub-cultivan
después de tres semanas en el mismo medio, pero sin glucurónidos de
citoquinina.
Se transfieren los brotes regenerados a
recipientes con 1/2 MSO. Después de aproximadamente 2 semanas, se
realiza la prueba X-gluc sobre los brotes verdes.
Los brotes se sub-cultivan en caso necesario.
Los brotes genéticamente transformados que han
formado raíces (y que son GUS-positivos) se plantan
en una cámara de crecimiento. Los brotes se plantan en un medio de
crecimiento adecuado, v.g. esfagno. Se cubren luego con bolsas de
material plástico y se dejan crecer durante aproximadamente 1
semana, después de lo cual se cortan las dos esquinas de las bolsas
de plástico. Al cabo de otra semana se retiran las bolsas de
plástico.
Se realizaron ensayos similares a los descritos
en los Ejemplos 5 y 6 sobre discos de hojas de tabaco
GUS-positivas y GUS-negativas
utilizando sustratos que contenían 100 mg/l de
\beta-sitosterol, 100 mg/l de colesterol, 10 mg/l
de campesterol, 1,88 mg/l de sal de sodio de BA3GN y diversas
concentraciones del ácido
di-\beta-D-glucuronido-glicirricínico
en la forma de una sal diamónica. Adicionalmente, la mitad de los
sustratos contenían tridemorf 0,1 mM. Se registró el número de
brotes al cabo de 17 días.
Los resultados se muestran en la tabla
siguiente.
\vskip1.000000\baselineskip
* | sal diamónica. |
Puede verse que la combinación de esteroles y la
sal diamónica de ácido glicirricínico conduce a formación selectiva
de brotes en discos de hojas que contienen un gen de
\beta-glucuronidasa introducido. (Como se ha
mencionado anteriormente (véase el Ejemplo 5) el tridemorf inhibe
la síntesis de esteroles y por consiguiente tiene un efecto
inhibidor sobre la regeneración de brotes cuando el tejido vegetal
no está provisto de esteroles). Si bien el efecto de inducción
selectiva de brotes se aprecia utilizando sustratos tanto con como
sin tridemorf, el número máximo de brotes se obtiene en los
sustratos que contienen tridemorf, y en particular con una
concentración de sal diamónica de ácido glicirricínico de 0,125
mM.
Se realizaron experimentos como los descritos en
el Ejemplo 3 utilizando la variedad de tabaco "Burley" en
lugar de "Wisconsin 38". Se añadió en diversas concentraciones
al sustrato
metil-\beta-D-glucurónido
(MG), que es hidrolizado a metanol y ácido glucurónico por GUS,
junto con 1 mg/l de BA o 15 mg/l de sal de sodio de BA3GN. Se ha
demostrado que el metanol inhibe la enzima GUS nativa sin afectar
mucho a la enzima de E. coli introducida (Kosugi et
al., 1990, Plant Sci., 133-120), mientras
que el ácido glucurónico liberado del
metil-\beta-D-glucurónido
es un producto inhibidor de las enzimas GUS. Por adición de MG en
lugar de los dos compuestos independientemente, los productos de
hidrólisis se producen localmente y se concentran en el
compartimiento en el que está localizada la enzima. Los resultados
obtenidos se muestran a continuación en la Tabla 16.
BA | 1 mg/l | |
BA3GN | 15 mg/l. |
Los resultados anteriores muestran que la
adición de MG o ácido glucurónico conduce a una reducción del número
de brotes obtenidos en el sustrato BA3GN en comparación con el
número de brotes obtenidos en el sustrato BA. Por consiguiente, por
tratamiento del tejido con MG antes de la expresión de la enzima GUS
introducida puede ser posible eliminar o reducir selectivamente la
actividad o el efecto de la enzima GUS nativa durante el
procedimiento de selección. Diferencias entre las enzimas GUS
introducida y nativa con relación a la inhibición debida a la
competición por el sustrato, sensibilidad a la inhibición del
sustrato, cantidad de enzima (actividad), y sensibilidad a la
inhibición del producto pueden justificar también los efectos de MG
y otros compuestos que tengan un efecto similar sobre los tejidos
de tipo salvaje tratados con glucurónidos.
Es también posible que MG funcione por
competición con la absorción de otros glucurónidos tales como BA3GN.
Si es cierto esto, podría utilizarse MG para reducir o eliminar la
absorción de otros glucurónidos en células de tipo salvaje. La
introducción de un gen codificante de una enzima GUS que es
secretada o un gen codificante de una
glucuronido-permeasa podría utilizarse para
seleccionar células transgénicas si se inhibe la absorción
mediante, v.g., adición de MG al sustrato. En el caso de la
glucuronido-permeasa, únicamente las células
transgénicas absorberían el glucurónido (v.g. BA3GN) y debido a la
existencia general de la enzima nativa en las plantas (véase, v.g.,
Ejemplo 3), el compuesto podría activarse en el interior de las
células que expresen la permeasa (u otra proteína que facilite la
absorción de glucurónidos).
Es también interesante el hecho de que el ácido
glucurónico propiamente dicho es capaz de inhibir selectivamente el
efecto de BA3GN, probablemente por bloquear el efecto de la BA
liberada por escisión de BA3GN por GUS.
La remolacha azucarera es una especie muy
recalcitrante con relación a la producción de plantas transgénicas.
Muchos brotes no transformados se "seleccionan" en condiciones
que dan lugar a brotes transgénicos en sistemas de transformación
ordinarios. Se encontró que sucedía lo mismo cuando se realizaron
experimentos de selección positiva (sin adición de kanamicina)
utilizando 5-15 mg/l de sal de sodio de BA3GN en las
condiciones descritas a continuación.
En el Ejemplo 11 (véase Tabla 12), se encontró
que la combinación de selección positiva y negativa reduce el
número de brotes "seleccionados" no transformados. Por esta
razón, se ensayó la combinación de selección positiva y negativa
sobre remolacha azucarera, y se encontró que esto producía
resultados ventajosos.
La transformación se llevó a cabo utilizando
explantes de cotiledones como se describe a continuación.
Se dejaron germinar semillas durante 4 días en
la oscuridad sobre un sustrato que contenía 0,7 g/l de agarosa y 2
g/l de sacarosa. Las plantas jóvenes se transfirieron luego a un
recipiente Nunc que contenía sustrato 1/2 x MSO y se cultivaron
durante 3 días a la luz. Se separaron los cotiledones de las plantas
jóvenes, y los explantes de cotiledones se pincelaron sobre el
peciolo con un pequeño pincel que contenía una suspensión de
Agrobacterium, conteniendo el Agrobacterium 35
S-NPTII y 35 S-GUS (DO_{660} =
0,1). Los cotiledones se co-cultivaron luego durante
4 días sobre un sustrato que contenía sustrato 1/10 MSO y
acetosiringona 200 \muM. Los explantes transformados se
transfirieron a un sustrato de MSO suplementado con 0,25 mg/l de BA
o 15 mg/l de sal de sodio de BA3GN (en lugar de BAP), 0,025 mg/l de
ácido naftil-acético, 400 mg/l de kanamicina, 800
mg/l de carbenicilina y 25 mg/l de vancomicina, y los explantes se
incubaron durante 21 días sobre este sustrato. Los brotes
regenerados se transfirieron luego a recipientes que contenían el
mismo sustrato. Al cabo de 52 días en este sustrato, todos los
brotes se transfirieron a sustrato MSO suplementado con 800 mg/l de
carbenicilina, 25 mg/l de vancomicina y 0,1 mg/l de BA. Al cabo de
14 días se realizaron ensayos GUS como los descritos en el Ejemplo
3 sobre el material vegetal seleccionado.
Los resultados se muestran en la tabla
siguiente.
\vskip1.000000\baselineskip
Transformación de remolacha
azucarera Combinación de selección positiva y
negativa
Selección negativa: | 400 mg/l sulfato de kanamicina + 1mg/l BAP | |
Selección positiva y negativa: | 400 mg/l sulfato de kanamicina + 15 mg/l BA3GN. |
Puede verse que, con la combinación de selección
positiva y negativa, se producen brotes transgénicos en condiciones
en las que no se produce brote transgénico alguno utilizando el
sistema tradicional de selección negativa. Esto demuestra que el
uso del sistema de selección positiva es muy ventajoso en
comparación con el uso de sistemas de selección negativa puros en
la remolacha azucarera.
A su vez, esto indica que el uso de selección
positiva (sola o en combinación con selección negativa) puede
permitir la producción de plantas transgénicas en otras especies
recalcitrantes en las cuales se obtienen únicamente frecuencias de
transformación/selección bajas, o en las cuales no es posible
seleccionar en absoluto planta transgénica alguna utilizando
sistemas de selección negativa.
Se realizaron experimentos como los descritos en
el Ejemplo 3, pero el contenido normal de nitrógeno del sustrato
MSO se redujo a cero. En lugar de ello, se añadieron los compuestos
de nitrógeno indicados en la Tabla 18. El sustrato contenía 1 mg/l
de BA. Se utilizaron sustratos que contenían nitrato de amonio como
controles positivos.
Estos experimentos se realizaron para investigar
si las opinas son inactivas o si las mismas pueden ser utilizadas
por las células vegetales como fuentes de nitrógeno en sustratos que
no contienen ninguna otra fuente de nitrógeno. Dado que los genes
que codifican enzimas que metabolizan las opinas son bien conocidos,
el requisito previo principal para la utilización de opinas en un
sistema de selección positiva es la identificación de las opinas
que no pueden ser utilizadas como fuente de nitrógeno por los
tejidos y células vegetales que no contienen genes introducidos que
permitan que las células vegetales utilicen las opinas en cuestión.
Los resultados se dan a continuación.
En los sustratos ensayados que no contenían
cantidad alguna de nitrógeno, se regeneraron un pequeño número de
brotes. Esto puede haber sido posible debido a que el nitrógeno
puede movilizarse a partir del tejido en el explante. Para evitar
cualquier formación de brotes en los tratamientos que carecían por
completo de nitrógeno, los explantes pueden privarse de nitrógeno
dejando crecer los cultivos originarios sobre sustratos exentos de
nitrógeno antes de su empleo o por pretratamiento de los explantes
en un sustrato exento de nitrógeno, v.g. sin hormonas inductoras de
brotes.
Sorprendentemente, se encontró que la octopina y
la nopalina no pueden soportar la formación de brotes, en tanto que
la manopina puede funcionar como una fuente satisfactoria de
nitrógeno y soportar la formación de brotes a partir de los discos
de hojas.
Es probable que la razón por la cual la nopalina
y la octopina no puedan funcionar como fuentes de nitrógeno sea que
estos compuestos no son absorbidos, metabolizados o hidrolizados
para dar compuestos utilizables. Es bien sabido que los organismos
que contienen genes implicados en el transporte y metabolismo de las
opinas, v.g. Agrobacterium, son capaces de utilizar opinas
como fuente de nitrógeno, en tanto que Agrobacterium u otras
cepas de bacterias que no contienen genes codificantes del
metabolismo de las opinas no son capaces de crecer sobre sustratos
que contienen únicamente opinas como fuente de nitrógeno.
Sobre la base de estos resultados, pueden
establecerse sistemas de selección positiva por introducción de uno
o más genes de metabolismo o transporte de opinas en células de
plantas transgénicas utilizando sustratos de selección que no
contengan o que contengan un nivel reducido de fuentes de nitrógeno
distintas de v.g. nopalina u octopina. La identificación o el
aislamiento de genes o material genético que confiera al receptor
la capacidad de utilizar octopina y nopalina ha sido descrita en la
bibliografía: véase, v.g. C. Beaulieu et al., 1988, Can.
J. Microbiol., 38: 843-49; P.M. Klapwijk et
al., 1976, J. Gen. Microbiol., 96:
155-163; C.L. Schardl y C.I. Kado, 1983, Mol.
Gen. Genet., 191: 10-16 o H. Wabiko et
al., 1990, J. Gen. Microbiol. 136:
97-103. Después del aislamiento del material
genético codificante del metabolismo de las opinas, pueden
transformarse organismos eucariotas de acuerdo con procedimientos
estándar descritos en la bibliografía con las secuencias apropiadas
necesarias para el funcionamiento de los genes del metabolismo de
las opinas.
Sobre la base de los resultados anteriores, es
probable que otras opinas y los genes catabolizantes
correspondientes puedan utilizarse de manera similar, y parece
adicionalmente probable que otras fuentes de N inactivas
identificadas por medios similares y sus genes correspondientes
puedan utilizarse análogamente, v.g. amidas en combinación con
amidasas, péptidos en combinación con peptidasas específicas,
etc.
Se llevaron a cabo experimentos como los
descritos en el Ejemplo 11, aunque con ciertas modificaciones. Las
especies vegetales utilizadas fueron las líneas de reproducción muy
recalcitrantes "V486" de colza oleaginosa de invierno y
"S487" de colza oleaginosa de verano. Las semillas se
esterilizaron y germinaron como se describe en el Ejemplo 16. Se
utilizaron hipocótilos como explantes y se inocularon y
co-cultivaron como se describe en el Ejemplo 11.
Después del co-cultivo, los explantes se
transfirieron a sustrato MSO que contenía 0,1 mg/l de ácido
naftilacético, 0,01 mg/l de ácido giberélico (GA3), 500 mg/l de
carbenicilina, 50 mg/l de sulfato de kanamicina y 6,0 g/l de
agarosa. El sustrato contenía adicionalmente 1 mg/l de BA o 3,75,
7,5 o 15,0 mg/l de sal de sodio de BA3GN. El pH se ajustó a 5,8. El
Agrobacterium utilizado contenía en su T-DNA
un gen GUS y un gen de neomicinfosfotransferasa II activado por
promotores 35S. Se realizaron ensayos GUS al cabo de 8 semanas y se
registró la formación de callo que exhibía una tinción azul intensa
en la mayoría de las células del callo como GUS+.
Estos experimentos muestran que, con estos tipos
de colza oleaginosa muy recalcitrantes, únicamente la selección
positiva en combinación con selección negativa permitía la selección
de callo transgénico, mientras que no se obtuvo callo
GUS-positivo alguno utilizando la selección negativa
tradicional (sustratos con BA en lugar de sal de sodio de
BA3GN).
Esto demuestra que la introducción de los
sistemas de selección positiva es muy ventajosa en comparación con
los sistemas de selección negativa puros, asimismo en sistemas de
callo. Demuestra también que el uso de selección positiva (sola o
en combinación con selección negativa) puede permitir producir
plantas transgénicas en otras especies recalcitrantes en las cuales
se obtienen únicamente frecuencias de transformación/selección bajas
o en las cuales no se selecciona en absoluto planta transgénica
alguna utilizando sistemas de selección negativa.
Una vez que se ha seleccionado un callo
transgénico, el mismo puede regenerarse en brotes transgénicos, v.g.
sobre un sustrato que contenga una citoquinina en combinación con
una concentración baja de auxinas. No es necesaria selección alguna
durante este proceso.
Claims (4)
1. Un método para seleccionar células
vegetales transformadas genéticamente a partir de una población de
células, en el que las células vegetales genéticamente transformadas
se transforman con una secuencia de nucleótidos expresable deseada
que contiene una secuencia reguladora que permite su expresión en
las células transformadas y una secuencia de nucleótidos expresable
co-introducida que también contiene una secuencia
reguladora que permite su expresión en las células transformadas,
método que comprende suministrar a dicha población un compuesto que
puede ser metabolizado por el producto de expresión de la secuencia
de nucleótidos expresable co-introducida que se ha
introducido con la secuencia de nucleótidos expresable deseada en
dichas células transformadas, a fin de proporcionar a las células
transformadas una ventaja fisiológica cuando se comparan con las
células no transformadas, en el cual el compuesto no es un
antibiótico o herbicida, y no tiene efecto desfavorable directo
alguno sobre las células no transformadas.
2. Un método de acuerdo con la reivindicación
1, en el cual el compuesto se selecciona del grupo constituido por
citoquininas, auxinas, giberelinas, vitaminas, carbohidratos,
opinas, proteínas, esteroles y saponinas.
3. Un método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 ó 2, en el cual dicha secuencia de nucleótidos
expresable co-introducida codifica
\beta-glucuronidasa cuando el compuesto es un
glucurónido de citoquinina.
4. Un método de acuerdo con la reivindicación
anterior, en el cual la actividad de
\beta-glucuronidasa nativa se reduce
suministrando al medio de cultivo un compuesto regulador del pH que
proporciona al medio de cultivo, las células o compartimientos de
las células, un pH comprendido entre 5,5 y 8,5.
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