DE69229556T2 - Verfahren zur selektion genetisch transformierter zellen und dafür verwendbare verbindungen - Google Patents

Verfahren zur selektion genetisch transformierter zellen und dafür verwendbare verbindungen

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Description

    GEBIET DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren, um genetisch transformierte Pflanzenzellen, in die eine erwünschte Nukleotidsequenz eingeführt wurde, zu selektieren, indem man die transformierten Zellen mit einem selektiven Vorteil versieht, ohne die nichttransformierten Zellen zu schädigen, sowie auf in dem Verfahren verwendbare neuartige Verbindungen.
    • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Es ist wohl bekannt, daß, wenn neues genetisches Material durch Transformation in eine Zellpopulation eingeführt werden soll, nur eine bestimmte Anzahl der Zellen erfolgreich transformiert werden, d. h. das neue genetische Material erhalten. Es ist dann notwendig, die genetisch transformierten Zellen zu identifizieren, damit diese Zellen von den nichttransformierten Zellen in der Population abgetrennt werden können. Identifizierung und Abtrennung der transformierten Zellen wurden herkömmlicherweise erreicht, indem etwas verwendet wurde, was als "negative Selektion" bezeichnet werden kann, mit anderen Worten, durch Verwendung eines Verfahrens, bei dem die transformierten Zellen überleben und wachsen können, während die nichttransformierten Zellen einer Wachstumshemmung unterliegen oder vielleicht sogar durch eine Substanz abgetötet werden, die die transformierten Zellen aushalten können.
  • Wenn zum Beispiel eine Population von Pflanzenzellen einer genetischen Transformation unterzogen wird, findet die Selektion der transformierten Zellen typischerweise statt, indem man ein Selektionsgen verwendet, das Antibiotika- oder Herbizidresistenz codiert. Das Selektionsgen - das selbst im allgemeinen keine nützliche Funktion in der genetisch transformierten Pflanze hat, und eigentlich in der Pflanze unerwünscht sein kann - wird mit dem Gen, das in die in Frage kommende Pflanze eingeführt werden soll, gekoppelt oder miteingeführt, so daß beide der zwei Gene in die Zellpopulation eingeführt werden, oder eher in bestimmte Zellen in der Population, da es in der Praxis nicht möglich ist, alle oder sogar eine Mehrzahl der Zellen zu transformieren. Die Zellen werden dann auf oder in einem Medium, das das Antibiotikum oder Herbizid enthält, gegen das die genetisch transformierten Zellen mittels des Selektionsgens resistent sind, kultiviert, wodurch die transformierten Zellen identifiziert werden können, da die nichttransformierten Zellen - die das infrage kommende Antibiotika- oder Herbizidresistenzgen nicht enthalten - einer Wachstumshemmung unterliegen oder abgetötet werden.
  • Diese negativen Selektionsverfahren haben jedoch bestimmte Nachteile. Erstens können die nichttransformierten Zellen wegen der Anwesenheit von beispielsweise Antibiotika im Wachstumsmedium absterben. Wenn die Zellpopulation ein zusammenhängendes Gewebe ist, besteht infolgedessen ein klares Risiko, daß nicht nur die nichttransformierten Zellen, sondern auch die transformierten Zellen absterben können, wegen der Tatsache, daß das Absterben der nichttransformierten Zellen die Nährstoffversorgung der transformierten Zellen unterbrechen kann oder weil die geschädigten oder absterbenden nichttransformierten Zellen giftige Verbindungen absondern können.
  • Ein anderer bedeutender Nachteil der negativen Selektion ist der, daß die Anwesenheit eines unnötigen Gens für beispielsweise Antibiotikaresistenz unerwünscht sein kann. Es gibt zum Beispiel unter Umweltschutzgruppen und Regierungsstellen Bedenken, ob es sicher ist, Gene, die eine Antibiotikaresistenz codieren, in Pflanzen und Mikroorganismen einzuführen. Diese Bedenken sind von besonderer Bedeutung für Nahrungspflanzen und Mikroorganismen, die nicht dafür bestimmt sind, in einer abgeschlossenen Umgebung verwendet zu werden (z. B. Mikroorganismen für die Verwendung in der Landwirtschaft), sowie für Mikroorganismen, die zur Verwendung in einer abgeschlossenen Umgebung vorgesehen sind, die aber versehentlich aus der abgeschlossenen Umgebung freigesetzt werden können. Während sich diese Bedenken als unbegründet erweisen können, können solche Bedenken dennoch zu Einschränkungen von Seiten der Regierung für die Verwendung von Genen für Antibiotikaresistenz in beispielsweise Pflanzen führen, und es ist deshalb wünschenswert, neue Methoden zur Selektion genetisch transformierter Zellen, die nicht von solchen Genen abhängig sind, zu entwickeln.
  • Ein weiterer Nachteil der negativen Selektion ist, daß Pflanzengewebe oder -zellen, die mit giftigen Substanzen behandelt werden, für bakterielle Infektionen anfälliger werden. Das ist ein Problem, wenn Agrobacterium als Transformationsvektor verwendet wird, weil die behandelten Gewebe oder Zellen manchmal von dem Bakterium überwuchert werden, obwohl Antibiotika verwendet werden, um Bakterienwachstum zu verhindern.
  • Außerdem erfordert die Selektion von Zellen oder Geweben unter Verwendung negativer Selektion sehr genaue Wahl des richtigen Zeitpunkts der Expression der eingeführten Gene in Bezug auf den Selektionsprozeß. Wenn die transgenen Zellen mit einer giftigen Substanz behandelt werden, bevor das entgiftende Gen exprimiert wird, oder bevor genug Genprodukte hergestellt sind, um die Wirkung der giftigen Verbindung zu antagonisieren, werden die transgenen Zellen zusammen mit den nichttransgenen Zellen abgetötet. Wenn die Selektion zu spät erfolgt, kann die Selektion der transgenen Zellen oder Gewebe behindert sein, beispielsweise durch Keimbildung aus nichttransgenen Zellen oder Geweben.
  • Die obigen Nachteile werden durch das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung (genannt "positive Selektion") beseitigt, das es zum ersten Mal ermöglicht, genetisch transformierte Pflanzenzellen zu identifizieren und zu isolieren, ohne die nichttransformierten Zellen in der Population zu schädigen oder abzutöten, und ohne Coeinführung von Antibiotika- oder Herbizidresistenzgenen. Zusätzlich zu der Tatsache, daß die Notwendigkeit von Antibiotika- oder Herbizidresistenzgenen beseitigt wird, wurde gezeigt, daß das Verfahren der positiven Selektion gemäß der vorliegenden Erfindung oft weitaus effizienter als die herkömmliche negative Selektion ist. Wie unten in den Beispielen beschrieben, ist die Anzahl transgener Keime, die von Tabakblattscheiben unter Verwendung der positiven Selektion selektiert wurden, beispielsweise in der Größenordnung von 30mal höher als die Anzahl an Keimen, die unter Verwendung eines herkömmlichen Kanamycinbasierten negativen Selektionssystems selektiert wurden, und eine Kombination aus positiver und negativer Selektion gab eine Auslesehäufigkeit an transgenen Keimen von etwa 10mal derjenigen, die unter Verwendung von nur negativer Selektion erhalten wurde (siehe Beispiel 1I). Außerdem liefert die Anwendung der positiven Selektion den Vorteil, daß ein einzigen Gen sowohl als Reportergen als auch als Selektionsgen verwendet werden kann, was in einer Vereinfachung der Vektorkonstruktionen, stabileren Konstruktionen und 100%igen Korrelation zwischen der Expression von Reporter- und Selektionsgenen resultiert. Positive Selektion beseitigt auch die oben genannten Probleme bezüglich Wahl des Zeitpunkts, da die Verbindungen, die zur Selektion führen, immer als Folge von Genexpression erzeugt werden. So reichert sich die selektive Verbindung an, wenn das Selektionsgen exprimiert wird, und der Selektionseffekt wird offensichtlich, wenn eine genügend große Menge der selektiven Verbindung erzeugt worden ist.
  • Methoden, die Genaktivität innerhalb transformierter Zellen zu überwachen, wären im Stand der Technik bereits vorher bekannt.
  • Jefferson RA (1989) Nature Vol 342, 837-838 offenbaren die Verwendung von GUS und des Glucuronidpermeasesystems als Überwachungssystem für transformierte Pflanzenzellen. Jefferson bezieht sich insbesondere auf die Hydrolyse des X-Gluc- Substrats und die Detektion des blauen Indigofarbstoff-Produkts in transformierten Pflanzenzellen, die die 35S Promoter-gus A Gen-Konstruktion enthalten.
  • US-P 4,857,467 offenbart die Transformation von Hefestämmen der Gattung Pichia mit DNA-Fragmenten, die Genfunktionen codieren, die die Wirtspflanze nicht hat, oder nur unzulänglich hat. Die transformierten Hefezellen können auf einer Kohlenstoff- und Energiequelle wachsen, was die Expression der vom DNA- Fragment bereitgestellten Genfunktion erforderlich macht.
  • WO 89/03880 offenbart die Transfektion von Wirtszellen mit einem Gen, das Glucuronid-Permease codiert. Das System kann zusammen mit GUS-Gen-Fusionen verwendet werden.
  • Keine der zitierten Fachschriften offenbart ein Verfahren zur Selektion transformierter Pflanzenzellen, das auf der Anwesenheit einer bestimmten eingeführten Nukleotidsequenz basiert, wie es im Rahmen der vorliegenden Erfindung mitgeteilt wird.
    • KURZE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Selektion genetisch transformierter Pflanzenzellen aus einer Population von Zellen, welches umfaßt, besagte Population mit einer Verbindung zu versehen, die durch das Expressionsprodukt einer Nukleotidsequenz, die in besagte transformierte Zellen eingeführt wurde, metabolisiert werden kann, um die transformierten Zellen mit einem physiologischen Vorteil im Vergleich zu den nichttransformierten Zellen zu versehen, wobei diese Verbindung kein Antibiotikum oder Herbizid ist und keine direkte nachteilige Wirkung auf die nichttransformierten Zellen hat.
  • In einer Ausführung wird das Verfahren durchgeführt, indem man die Zellpopulation auf oder in einem Medium kultiviert, das wenigstens einem inaktive Verbindung oder Nährstoff enthält, die/der in Zellen, die die miteingeführte Nukleotidsequenz oder die gewünschte Nukleotidsequenz enthalten, direkt oder indirekt aktiviert wird, wobei die Verbindung oder der Nährstoff in nichttransformierten Zellen inaktiv ist, oder in nichttransformierten Zellen weniger aktiv als in transformierten Zellen ist, so daß die transformierten Zellen mit einem selektiven Vorteil versehen sind, der es erlaubt, sie von der Zellpopulation zu selektieren.
  • In einer anderen Ausführungsform wird das Verfahren durchgeführt, indem man die Zellpopulation auf oder in einem Medium kultiviert, das wenigstens einen Verbindung oder Nährstoff enthält, die/der für die transformierten Zellen durch Expression oder Transkription der miteingeführten Nukleotidsequenz oder der gewünschten Nukleotidsequenz verfügbar gemacht wird, wobei die Verbindung oder der Nährstoff für nichttransformierte Zellen nicht verfügbar ist oder für nichttransformierte Zellen weniger verfügbar ist als für die transformierten Zellen, so daß die transformierten Zellen mit einem selektiven Vorteil ausgestattet sind, der es erlaubt, sie von der Zellpopulation zu selektieren.
  • In einer weiteren Ausführungsform führt die Expression der miteingeführten Nukleotidsequenz zu einer Zunahme der Aktivität eines Enzyms, das in der Zellpopulation endogen vorhanden war, so daß die Aktivität des Enzyms in transformierten Zellen größer ist als die Aktivität des Enzyms in nichttransformierten Zellen.
  • In noch einer weiteren Ausführungsform resultiert die Expression oder Transkription der miteingeführten Nukleotidsequenz oder der gewünschten Nukleotidsequenz in einer Blockade des Metabolismus einer Verbindung mit der die Zellpopulation versehen ist, oder der Blockade der Synthese einer Verbindung in den transformierten Zellen, wodurch die transformierten Zellen identifiziert oder von den nichttransformierten Zellen selektiert werden können.
  • Verbindungen, die für die Verwendung in dem obigen Verfahren geeignet sind, sind die der allgemeinen Formel I
  • worin
  • R² H, CH&sub3;, S-CH&sub3;, SO&sub2;-CH&sub3;, SCHrphenyl, SH, OH, Cl oder eine Gruppe -S-R¹&sup0;, -NH-R¹&sup0; oder -O-R¹&sup0; ist, worin
  • R¹&sup0; eine β-D-Glucopyranuronosylgruppe [deren Struktur aus den hier enthaltenen Arbeitsbeispielen offensichlich ist] oder ein Salz davon oder ein Ester- oder Amidderivat davon an der Carbonsäurefunktion ist,
  • R&sup6; Benzyl ist, das am Phenylring substituiert sein kann mit OH, C&sub1;&submin;&sub6;- Alkoxy, Halogen, C&sub1;&submin;&sub4;-Alkyl, NH&sub2; oder CF&sub3;, oder mit -O-R¹&sup0;, -S-R¹&sup0; oder -NH-R¹&sup0;, worin R¹&sup0; wie oben definiert ist C&sub1;&submin;&sub4;-Alkyl oder C&sub2;&submin;&sub6;-Alkenyl, das mit 1 bis 3 Hydroxy-, Glucosyloxy- der C&sub1;&submin;&sub8;-Alkoxygruppen, mit Phenyl, und/oder mit -O-R¹&sup0;, -S-R¹&sup0; oder -NH-R¹&sup0;, worin R¹&sup0; wie oben definiert ist, substituiert sein kann; verestertes C&sub1;&submin;&sub4;-Alkyl oder C&sub2;&submin;&sub6;- Alkenyl; Furfuryl; oder Cyclohexylureido, Phenylureido oder Tolylureido;
  • entweder i) R&sup7; und Y halbe Bindungen sind, die zusammen eine Bindung bilden
  • ii) eines von R³ und R&sup9; H oder eine Gruppe R¹&sup0; wie oben definiert ist, und das andere eine halbe Bindung, ist, die zusammen mit einer halben Bindung X eine Bindung bildet, oder R&sup9; Ribosyl, 5'- Phosphoribosyl, Glucosyl oder -CH&sub2;CH(NH&sub2;)COOH ist und R³ eine halbe Bindung ist, die zusammen mit der halben Bindung X eine Bindung bildet, ist, und
  • iii) R&sup8; H, CH&sub3;, S-CH&sub3;, SO&sub2;-CH&sub3;, SCH&sub2;-phenyl, SH, OH, Cl oder eine Gruppe -S-R¹&sup0;, -NH-R¹&sup0; oder -O- R¹&sup0; ist, worin R¹&sup0; wie oben definiert ist,
  • oder iv) R&sup7; Ribosyl, 5'-Phosphoribosyl oder Glucosyl ist, R&sup8; H ist, R&sup9; und Y halbe Bindungen sind, die zusammen eine Bindung bilden, und R³ eine halbe Bindung ist, die zusammen mit der halben Bindung X eine Bindung bildet;
  • unter der Maßgabe, daß eines von R², R³, R&sup5;, R&sup5; und R&sup9; eine β-D-Glucopyranuronosylgruppe oder ein Salz davon oder ein Ester- oder Amidderivat davon an der Carbonsäurefunktion ist oder enthält.
  • Weitere Verbindungen die in dem obengenannten Verfahren verwendet werden können, sind die der allgemeinen Formel II
  • worin
  • R¹ cis- -CH=CH-COOH, ein Salz davon oder ein Esterderivat davon an der Carbonsäurefunktion oder das Amidderivat von cis- und/oder trans- -CH=CH-COOH ist und
  • R¹&sup0; wie oben definiert ist.
  • Außerdem werden hierin genetisch transformierte Zellen offenbart, die nach dem obengenannten Verfahren selektiert wurden, insbesondere Pflanzenzellen, sowie Pflanzen, Nachkommen und Samen, die sich von solchen genetisch transformierten Pflanzenzellen ableiten.
    • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Der Begriff "Zellen" im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung soll sich auf jeglichen Typ Zellen beziehen, aus denen unter Verwendung des Verfahrens der Erfindung individuelle genetisch transformierte Zellen identifiziert und isoliert werden können, wobei Pflanzenzellen, tierische Zellen und Mikroorganismen wie Bakterien, Pilze, Hefen etc. eingeschlossen sind. Außerdem soll der Begriff "Zelle" auch Protoplasten umfassen, d. h. das Protoplasma einer Zelle, das in eine Membran eingeschlossen ist, aber ohne Zellwand. Während man erwägt, daß das allgemeine Prinzip der vorliegenden Erfindung auf jegliche Typen von Zellen angewendet werden kann, hat es sich herausgestellt, daß das Verfahren besonders geeignet ist für die Selektion genetisch transformierter Pflanzenzellen.
  • Der Begriff "Zellpopulation" bezieht sich auf jegliche Gruppe von Zellen, die einer genetischen Transformation unterzogen worden ist, und von der jene Zellen, die genetisch transformiert wurden, identifiziert werden sollen, und die genetisch transformierten Zellen von den nicht genetisch transformierten Zellen isoliert werden sollen. Die Population kann z. B. ein Gewebe sein, ein Organ oder ein Teil davon, eine Population individueller Zellen in oder auf einem Substrat, so wie eine Kultur von Mikroorganismenzellen, z. B. eine Zellpopulation in einer Lösung oder Suspension, oder ein ganzer Organismus, z. B. eine ganze Pflanze.
  • Der Begriff "Selektieren" bezieht sich auf den Prozeß, die genetisch transformierten Zellen zu identifizieren und/oder von den nicht genetisch transformierten Zellen zu isolieren, wobei das hier offenbarte Verfahren verwendet wird.
  • Die "gewünschte Nukleotidsequenz" kann jegliche Nukleotidsequenz sein, die in die infrage kommenden Zellen eingeführt werden soll, um genetisch transformierte Zellen herzustellen. Einführung von Nukleotidsequenzen in Pflanzen, Mikroorganismen und Tiere wird weithin praktiziert, und es gibt keine Einschränkungen bezüglich der Nukleotidsequenzen, deren Anwesenheit durch Anwendung der hier beschriebenen positiven Selektionsmethode nachgewiesen werden kann. Durch Verwendung dieser Methode kann die Anwesenheit der gewünschten Nukleotidsequenz in die genetisch transformierten Zellen ohne die oben erwähnten Nachteile, die mit herkömmlichen negativen Selektionssystemen einhergehen, bestimmt werden.
  • Die Tatsache, daß eine Nukleotidsequenz "miteingeführt wird mit" der gewünschten Nukleotidsequenz bezieht sich auf die Tatsache, daß die beiden Nukleotidsequenzen aneinander gekoppelt sind oder anders zusammen auf solche Weise eingeführt werden, daß die Anwesenheit der miteingeführten Nukleotidsequenz in eine Zelle anzeigt, daß die die gewünschte Nukleotidsequenz in die Zelle eingeführt wurde, d. h., wenn gezeigt wird, daß eine der Nukleotidsequenzen eingeführt wurde, ist die Wahrscheinlichkeit, daß die andere ebenso eingeführt wurde, deutlich größer. Die beiden Nukleotidsequenzen sind deshalb typischer-, aber nicht notwendiger weise Teil derselben genetischen Konstruktion und werden z. B. durch denselben Vektor eingeführt.
  • Die hierin beschriebenen Methoden können ebenso verwendet werden, wenn die miteingeführte Nukleotidsequenz und die gewünschte Nukleotidsequenz unabhängig voneinander eingeführt werden. Das kann beispielsweise durchgeführt werden, indem man dieselben Bakterien für die Einführung beider Gene verwendet und eine relativ große Anzahl Kopien der gewünschten Nukleotidsequenz in die Zellen einführt, wodurch die Wahrscheinlichkeit relativ hoch ist, daß Zellen, die nachweislich die miteingeführte Nukleotidsequenz exprimieren, auch die gewünschte Nukleotidsequenz enthalten und exprimieren. Es ist zu erwarten, daß die unabhängige Einführung von zwei oder mehr Genen, die in einer Co-Expression der Gene in der gleichen Zelle resultiert, allgemein eine geringe Wahrscheinlichkeit hat, und es wird deshalb erwartet, daß die verbesserten Selektionshäufigkeiten, die durch das positive Selektionsverfahren erzielt werden, in solchen Systemen besonders vorteilhaft sind.
  • Da es notwendig ist, daß die eingeführten Nukleotidsequenzen in den transformierten Zellen exprimiert werden, enthält ein genetisches Gebilde, das die beiden Nukleotidsequenzen enthält, typischer-, aber nicht notwendigerweise Regulationssequenzen, die die Expression der Nukleotidsequenzen ermöglichen, z. B. bekannte Promoteren und Transkriptionsterminatoren. Somit ist die miteingeführte Nukleotidsequenz typischerweise mit einem Promoter verbunden, der ein konstitutiver oder regulierbarer Promoter sein kann, und die gewünschte Nukleotidsequenz ist typischerweise auch mit einem konstitutiven oder regulierbaren Promoter verbunden sein.
  • Wie oben erwähnt, ist das Verfahren besonders geeignet für die Selektion genetisch transformierter Pflanzenzellen, wodurch die Identifikation und Isolation solcher Zellen ohne die Verwendung von Selektionsgenen, die Antibiotika- oder Herbizidresistenz codieren, ermöglicht wird. Wie bei herkömmlichen negativen Selektionsverfahren kann das hier beschriebene positive Selektionsverfahren für die Selektion von Zellen in vitro verwendet werden. Jedoch kann das positive Selektionsverfahren auch in vivo verwendet werden. Die Verwendung des positiven Selektionsverfahrens in vivo ist von besonderer Bedeutung, z. B. im Zusammenhang mit genetischer Transformation an ganzen Pflanzen oder an Pflanzenleilen, in denen die Pflanzen oder Pflanzenteile sowohl transformierte als auch nichttransformierte Zellen enthalten, da die Selektion der transformierten Zellen erreicht wird, ohne die benachbarten nichttransformierten Zellen direkt zu schädigen. Die transformierten Zellen haben so einen selektiven "Vorteil" verglichen mit den nichttransformierten Zellen (z. B. die Fähigkeit, Keime zu bilden), aber die nichttransformierten Zellen erleiden keinen ernsten Nachteil in dem Sinne, daß sie geschädigt oder abgetötet werden, wie in dem Falle der negativen Selektion unter Verwendung von Antibiotika oder Herbiziden.
  • Die/der "inaktive Verbindung oder Nährstoff" kann jegliche/r Verbindung oder Nährstoff in inaktiver oder Vorläuferform sein, d. h. die/der in Abwesenheit der Expression der miteingeführten Nukleotidsequenz in einer Form vorliegt, die im wesentlichen bezüglich der infrage kommenden Zellen biologisch inaktiv ist, die/der aber, wenn die miteingeführte Nukleotidsequenz exprimiert oder transkribiert wird, hydrolisiert oder anderswie aktiviert oder metabolisiert wird, um so die genetisch transformierten Zellen, die die gewünschte Nukleotidsequenz enthalten, mit einem selektiven Vorteil versieht, und sie dadurch identifiziert und isoliert werden können. Die/der inaktive Verbindung oder Nährstoff kann also z. B. ein inaktiver Pflanzenwachstumsregulator sein, beispielsweise ein inaktiviertes Cytokinin, Auxin oder Gibberellin, ein Vitamin, z. B. inaktiviertes Thiamin, ein Kohlenhydrat (z. B. Mannose, wenn die miteingeführte Nukleotidsequenz Mannose-6-phosphat- Isomerase codiert, oder Galaktose oder eine galaktoseenthaltende Verbindung, wenn die miteingeführte Nukleotidsequenz UDP-Galaktose-4-Epimerase codiert), eine stickstoffhaltige Verbindung (z. B. ein Opin, wenn die miteingeführte Nukleotidsequenz ein Opinmetabolismus- oder -transportenzym codiert), Stärke, ein Protein, oder ein anderer Nährstoff in inaktiver Form, oder eine Verbindung, die eine wesentliche Funktion während der Differenzierung und Dedifferenzierung von Zellen und Geweben hat. Die Behandlung von Zellen und Geweben mit Verbindungen, die die Abhängigkeit von weiterer Zugabe wesentlicher Verbindungen bewirken, kann ebenso zusammen mit den entsprechenden inaktiven Verbindungen angewendet werden. Dieser Weg kann beispielsweise angewendet werden, wenn die Sterol- oder Saponinsynthese gehemmt ist und inaktive Sterole oder Saponine zugegeben werden. Die inaktive Verbindung kann darüberhinaus z. B. ein Mineral sein, das chelatisiert ist und dadurch für die genetisch transformierten Zellen verfügbar gemacht wird.
  • Im Gegensatz zur herkömmlichen negativen Selektion, bei der die nichttransformierten Zellen aufgrund der Anwesenheit eines Antibiotikums, Herbizids oder Giftstoffes im Substrat geschädigt oder abgetötet werden, haben inaktive Verbindungen oder Nährstoffe, die in dem positiven Selektionsverfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden, keinen direkten nachteiligen Effekt auf die nichttransformierten Zellen. Stattdessen werden die transformierten Zellen mit einem physiologischen Vorteil ausgestattet, der es ermöglicht, sie zu identifizieren und zu isolieren, während die nichttransformierten Zellen durch die Anwesenheit der/s inaktiven Verbindung oder Nährstoffs, der zu Selektionszwecken verwendet wird, als solche nicht oder weniger angegriffen werden.
  • Die herkömmlichen Verfahren der "negativen Selektion" sind also gekennzeichnet durch die Verwendung eines Selektionsgens, daß die negative Wirkung einer zugegebenen Verbindung auf die transformierten Zellen reduziert. Im Gegensatz dazu bezieht sich der Begriff "positive Selektion", wie er im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung verwendet wird, auf die Verwendung eines Selektionsgens, das einen positive Wirkung einer zugegebenen Verbindung auf die transformierten Zellen erzeugt oder steigert.
  • Eine Verbindung, die für Selektionszwecke verwendet wird, kann zusätzlich sowohl eine positive als auch eine negative Wirkung haben. Zum Beispiel ist Mannose für fast alle Pflanzenzellen giftig, aber in Zellen, die Mannose-6-phosphat-Isomerase enthalten, ist die negative Wirkung beseitigt und die Zellen erhalten zusätzlich den Vorteil, Mannose als Kohlenhydratquelle nutzen zu können. In diesem Fall sind eine einzelne Verbindung und ein einzelnes Gen Bestandteile eines kombinierten positiven und negativen Selektionssystems, obwohl solch ein kombiniertes positives und negatives Selektionssystem auch gebildet werden kann, indem man zwei oder mehr Gene verwendet werden, die zusammen für die Hemmung der negativen Effekte einer Verbindung und das Zutagetreten der positiven Effekte der Verbindung in den transformierten Zellen verantwortlich sind.
  • Die/der inaktive Verbindung oder Nährstoff, die/der für das Verfahren der positiven Selektion verwendet wird, muß keine/r sein, die/der direkt durch ein Polypeptid, das durch die der miteingeführten Nukleotidsequenz codiert wird, aktiviert wird. Es kann ebenso einer sein, die/der indirekt aktiviert wird, z. B. wobei die miteingeführte Nukleotidsequenz einen indirekten Effekt auf die/den inaktive/n Verbindung oder Nährstoff in den genetisch transformierten Zellen, nicht aber in den nichttransformierten Zellen hat. So kann die miteingeführte Nukleotidsequenz eine sein, die bei Expression in den transformierten Zellen beispielsweise indirekt die Aktivität eines Enzyms, das der Zellpopulation endogen ist, steigert und dadurch zu einer größeren Enzymaktivität und Aktivierung der/s infrage kommenden inaktiven Verbindung oder Nährstoffs in den genetisch transformierten Zellen führt.
  • Die miteingeführte Nukleotidsequenz kann auch beispielsweise einen Permease- oder einen anderen Transportfaktor codieren, der es der/m infrage kommenden Verbindung oder Nährstoff erlaubt, die Zellmembran zu durchqueren und in die transformierten Zellen einzudringen, oder eine andere (organelle) Membran zu durchqueren, so daß "Aktivierung" der/s inaktiven Verbindung/Nährstoffs in diesem Fall die selektive Aufnahme der Verbindung oder des Nährstoffs durch die transformierten Zellen einschließt, während Aufnahme der/s Verbindung oder Nährstoffs durch die nichttransformierten Zellen nicht möglich ist oder in einem geringerem Ausmaß stattfindet. Anstatt die Aufnahme einer Verbindung in die Zelle zu erleichtern, kann die miteingeführte Nukleotidsequenz alternativ dazu ihr Produkt in ein Kompartiment leiten, wo die inaktive Verbindung sitzt, z. B. außerhalb der Plasmamembran, oder in die Vakuole oder das endoplasmatische Reticulum.
  • Selektion, die diesen Ansatz verwendet, wird also erreicht, indem man eine Verbindung für die transformierten Zellen verfügbar macht, während die Verbindung für die nichttransformierten Zellen nicht oder weniger verfügbar ist. Die/der infrage kommende Verbindung oder Nährstoff, die/der in diesem Fall nicht als solcher "inaktiv" sein muß (d. h. die Verbindung oder der Nährstoff kann einer sein, dessen Aktivität ausgeübt wird, wenn er in die transformierten Zellen eindringt, ohne notwendigerweise beispielsweise einer Hydrolyse innerhalb der Zellen ausgesetzt gewesen zu sein), kann vom selben Typ sein, wie jeder der oben erwähnten, wobei der Unterschied darin besteht, daß die Verbindung oder der Nährstoff in diesem Fall in die transformierten Zellen transportiert wird anstelle (oder zusätzlich zu) einer Aktivierung in den transformierten Zellen.
  • Beispiele von Verbindungen, die eine physiologische Wirkung ausüben können, wenn sie in die Zelle eindringen, die aber nicht einfach in die Zelle oder ein Zellkompartiment aufgenommen werden, sind stark hydrophile oder hydrophobe Verbindungen, insbesondere geladene Verbindungen, große Moleküle, so wie Polymere, insbesondere Proteine, Peptide, Oligo- und Polysaccharide, einschließlich Pflanzenhormone, phosphorylierte Metabolite, wie phosphorylierte Kohlenhydrate, phosphorylierte Vitamine, phosphorylierte Nukleoside, einschließlich Cytokinine, und Verbindungen, die zu carboxylischen säureenthaltenden Kohlenhydraten oder Aminosäuren konjugiert sind, einschließlich Pflanzenhormonkonjugate.
  • Es wird außerdem erwogen, daß die grundlegende Methode der vorliegenden Erfindung modifiziert werden kann, so, daß, anstatt einen inaktiven Verbindung oder Nährstoff in den transformierten Zellen zu aktivieren, Selektion dadurch ausgeführt werden kann, daß man die Metabolismussynthese einer Verbindung in diesen Zellen blockiert. Beispielsweise kann der Metabolismus eines Cytokinins, das dem Substrat zugegeben wird, in den transformierten Zellen durch einen gegenteiligen Mechanismus blockiert werden. Die Erfinder haben so herausgefunden, daß, wenn die Glycosylierung von Zeatin gehemmt ist, die optimale keimauslösende Konzentration um einen Faktor von 5-100 verringert wird. Indem der Zeatinmetabolismus gehemmt wird, ist es so möglich, Keimbildung von Tabakblattscheiben bei Zeatinkonzentrationen zu erhalten, die in nichttransformierten Blattscheiben, die den normalen Zeatinmetabolismus haben, keine Keimbildung induzieren können. Es wurde außerdem gefunden, daß die Wirkungen von Indolessigsäure ((AA) erhöht werden können, wenn der Metabolismus dieser Verbindung gehemmt wird. So wurde, wenn der IAA- Metabolismus teilweise gehemmt war, gefunden, daß die Wirkung von IAA auf das Wachstum von Kalli um einen Faktor 5-100 erhöht wurde. Ähnlich kann die Hemmung des Kohlenhydrat- und Polysaccharidmetabolismus die Nutzung eines zugegebenen Kohlenhydrats beeinträchtigen und auf diese Weise weitere Möglichkeiten für positive Selektion schaffen.
  • Der "selektive Vorteil", den die transformierten Zellen besitzen, kann jeglicher Unterschied oder Vorteil hinsichtlich der nichttransformierten Zellen sein, der es ermöglicht, daß die transformierten Zellen leicht identifiziert und von den nichttransformierten Zellen isoliert werden. Dies ist typischerweise ein Unterschied oder Vorteil, der es ermöglicht, daß die transformierten Zellen durch einfache visuelle Mittel, d. h. ohne Anwendung eines speziellen Assays zur Bestimmung der Gegenwart eines Markergens identifiziert werden
  • Wenn ein Polypeptid, das durch die miteingeführte Nukleotidsequenz oder die gewünschte Nukleotidsequenz codiert ist, einen inaktive/n Verbindung oder Nährstoff in den transformierten Zellen direkt aktiviert, können die nichttransformierten Zellen in bestimmten Fällen eine bestimmte Menge des infrage kommenden Polypeptids enthalten oder produzieren Wenn beispielsweise das aktivierende Polypeptid ein Enzym ist, können die nichttransformierten Zellen eine bestimmte ursprüngliche Enzymaktivität enthalten, wobei das native Enzym vom selben Typ wie das eingeführte aktivierende Enzym ist. In solchen Fällen muß die/der "inaktive Verbindung oder Nährstoff" nicht notwendigerweise vollkommen inaktiv in den nichttransformierten Zellen sein, da es ausreichend sein kann, daß die Verbindung oder der Nährstoff lediglich wesentlich weniger aktiv in nichttransformierten Zellen als in transformierten Zellen ist. Mit anderen Worten, ein qualitativer Unterschied zwischen den transformierten Zellen und den nichttransformierten Zellen hinsichtlich der Aktivierung der/s anfänglich inaktiven Verbindung oder Nährstoffs kann in bestimmten Fällen für Selektionszwecke ausreichend sein. In solchen Fällen können Inhibitoren oder Substrate, die mit den nativen Enzymen konkurrieren, zugegeben werden. Besonders geeignet sind Inhibitoren, die vom nativen Enzym aktiviert werden, was zu einer selbstkatalysierten Produktion des aktiven Inhibitors auf ein Niveau führt, bei dem das native Enzym im wesentlichen vollständig gehemmt ist.
  • Das aktivierende Polypeptid, das durch die miteingeführte oder gewünschte Nukleotidsequenz codiert wird, ist nicht auf irgendein besonderes Polypeptid beschränkt und ist selbstverständlich eines, das entweder direkt oder indirekt aktiv ist, bezüglich der/m bestimmten Verbindung oder Nährstoff, die/der in den genetisch transformierten Zellen aktiviert werden soll. Das Polypeptid ist insbesondere oft ein Enzym.
  • Ein Enzym, das sich für die Selektion genetisch transformierter Pflanzenzelten als geeignet erwiesen hat, ist β-Glucuronidase ("GUS"), wobei die Selektion ausgeführt wird, indem man eine Glucuronidverbindung verwendet, die einen Pflanzenwachstumsregulator enthält, der durch β-Glucuronidase gespalten wird, z. B. ein Cytokininglucuronid (dessen Bedeutung aus den hier enthaltenen Beispielen klar wird). Es ist überraschend, daß Selektion genetisch transformierter Pflanzenzellen durch Verwendung eines GUS-Gens erreicht werden kann, da es sich im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung herausgestellt hat, daß höhere Pflanzen eine ursprüngliche GUS-Aktivität besitzen. Diese Erkenntnis steht im Gegensatz zu dem, was früher berichtet wurde. So stellt GB 2 197 653-A fest, daß höhere Pflanzen keine meßbare β-Glucuronidaseaktivität enthalten, und impliziert damit, daß, da GUS-Aktivität in höheren Pflanzen nicht gefunden wird, es eine relativ klare Sache ist, die Expression einer interessierenden Genkonstruktion unter Verwendung des GUS-Gens zu überwachen. Wie unten erklärt (siehe Beispiele) ist dies jedoch nicht der Fall, und die Verwendung eines GUS-Gens für die Überwachung der Gegenwart eines interessierenden Gens ist in keinster Weise einfach oder klar, wegen der Tatsache, daß höhere Pflanzen in Wirklichkeit eine bedeutende intrinsische (Hintergrund-) β-Glucuronidaseaktivität enthalten.
  • So kann für die Selektion genetisch transformierter Pflanzenzellen die Zellpopulation auf oder in einem Medium kultiviert werden, das ein Cytokininglucuronid enthält, das in den transformierten Zellen durch die β-Glucuronidase gespalten wird, wodurch freies Cytokinin freigesetzt und Keim- und/oder Kallusauslösung in den transformierten Zellen veranlaßt wird.
  • Eine Anzahl neuartiger Cytokininglucuronidverbindungen ist für die Zwecke der vorliegenden Erfindung entwickelt worden. Die Herstellung dieser Verbindungen sowie ihre Verwendung für positive Selektion von genetisch transformierten Zellen ist unten ausführlich beschrieben.
  • In bestimmten Fällen kann es wünschenswert sein, die hier offenbarte grundlegende Methode zu modifizieren, beispielsweise um eine effektivere Selektion zu liefern oder um das Selektionsverfahren zu vereinfachen. Wenn die inaktive Verbindung, die für das positive Selektionsverfahren verwendet wird, eine ist, die durch β-Glucuronidase gespalten wird, kann das grundlegende Verfahren durch verschiedene Möglichkeiten modifiziert werden, um ein besseres Ergebnis zu erzielen. Eine dieser Möglichkeiten ist die Verwendung bestimmter Sterolglucuronidverbindungen, z. B. Cholesteryl-β-D-glucuronid oder β-Sitosteryl-β-D-glucuronid, zusammen mit einer die Sterolsynthese hemmenden Verbindung wie Tridemorph (4-Tridecyl-2,6- dimethylmorpholin). Die Beispiele 5 und 6 unten beschreiben die Verwendung solcher Verbindungen. Man glaubt, daß durch Verwendung eines Sterolsyntheseinhibitors zusammen mit Sterolglucuroniden, die der Wirkung des Sterolsyntheseinhibitors auf die Hydrolyse durch β-Glucuronidase entgegenwirken, sogenanntes "cross feeding" (d. h. Diffusion der aktivierten Verbindung aus der Zelle, in der sie aktiviert wird, in eine andere Zelle) während des Selektionsverfahrens verhindert werden kann, da die Sterolverbindungen nicht von Zelle zu Zelle diffundieren, wenn der hydrophile Glucuronidteil abgespalten ist. So wird eine lokalisiertere Wirkung erreicht. Entsprechende Ergebnisse können mit einer großen Anzahl anderer Glucuronide, die ein hydrophobes Aglycon enthalten, erhalten werden.
  • Wie oben erklärt, wurde im Gegensatz zum dem, was vorher berichtet worden war, gefunden, daß höhere Pflanzen wirklich ursprüngliche GUS-Aktivität besitzen. Aus diesem Grund kann die bloße Einführung eines GUS-Gens in eine Pflanze nicht zwangsläufig ausreichend sein, um die gewünschte Selektion der genetisch transformierten Zellen zu erhalten, und es kann notwendig oder wünschenswert sein, jegliche ursprüngliche β-Glucuronidaseaktivität in der Zellpopulation zu vermindern. Da eine eingeführte β-Glucuronidase andere Eigenschaften als eine native β-Glucuronidase haben kann, kann eine Verminderung jeglicher ursprünglicher β-Glucuronidaseaktivität auf verschiedenen Wegen erreicht werden, z. B. durch Zugabe einer β-Glucuronidasehemmenden Verbindung zum Kulturmedium, die eine stärker hemmende Wirkung auf die ursprüngliche β-Glucuronidase hat als auf die β-Glucuronidase, die durch das Nukleotid oder eine Subsequenz davon codiert ist. Ein solcher Typ von Verbindung ist ein Ammoniumsalz.
  • Ursprüngliche β-Glucuronidaseaktivität in der Zellpopulation kann auch wesentlich reduziert werden durch Zugabe einer Verbindung zu dem Kulturmedium, die bei Hydrolyse zu einem Produkt führt, das die Aktivität der nativen β-Glucuronidase hemmt, und das vorzugsweise die Aktivität der nativen β-Glucuronidase mehr hemmt, als die Aktivität der eingeführten β-Glucuronidase gehemmt wird. Das kann in einer selbstregulierten oder lokalisierten Weise erfolgen, beispielsweise lokalisiert auf bestimmte Kompartimente, wo das eingeführte GUS-Gen lokalisiert oder nicht lokalisiert ist. Ein Beispiel für ein Hydrolyseprodukt, das native β-Glucuronidase hemmt, ist Glucuronsäure, die beispielsweise aus der Hydrolyse von Glycyrrhizinsäure oder Sterylglucuroniden stammt.
  • Ursprüngliche β-Glucuronidaseaktivität in der Zellpopulation kann weiterhin vermindert werden durch Zugabe eines β-Glucuronidaseinhibitors zum Kulturmedium, insbesondere β-Glucuronid, das in Zellen ohne ein eingeführtes β-Glucuronidase gen die β-Glucuronidaseaktivität mehr hemmt als in Zellen mit einem eingeführten β- Glucuronidasegen. Das kann z. B. ein schlecht oder wenig geeignetes Glucuronidasesubstrat (ein Glucuronid) sein, das eine höhere Affinität für die native β-Glucuronidase als für die eingeführte β-Glucuronidase hat.
  • β-Glucuronidase, die durch das eingeführte β-Glucurinidasegen codiert ist, das für die Zwecke der vorliegenden Erfindung verwendet wird, ist über einen relativ breiten pH-Bereich aktiv, während die native β-Glucuronidase, die in einer breiten Vielfalt von Pflanzenspezies gefunden wird, nur in einem relativ engen Bereich von pH- Werten aktiv ist, typischerweise etwa pH 4-5 (siehe Beispiel 3 unten). Ursprüngliche β-Glucuronidaseaktivität kann deshalb in diesem Fall durch Zugabe eines Glucuronids, das durch die native β-Glucuronidase hydrolisiert werden kann und das bei Hydrolyse zu einer pH-Zunahme führt, beispielsweise o-Cumarylglucuronid, zu dem Kulturmedium vermindert werden
  • Da herausgefunden wurde, daß β-Glucuronidase, die den Pflanzen ursprünglich ist, im allgemeinen bei einem pH von etwa 4-5 aktiv ist, kann dis ursprüngliche β-Glucuronidaseaktivität auch durch Zugabe einer pH-regulierenden Verbindung zum Kulturmedium vermindert werden, die das Kulturmedium mit einem pH zwischen ungefähr 5,5 und 8,5, vorzugsweise zwischen ungefähr 6,0 und 8,0, beispielsweise zwischen ungefähr 6,5 und 7,5 versieht, oder einer pH-regulierenden Verbindung, die den pH in den Zellen oder in Kompartimenten der Zellen auf einen pH innerhalb dieser Bereiche erhöht. Bei diesen pH-Werten ist β-Glucuronidase, die durch das eingeführte GUS-Gen codiert ist, aktiv, aber ursprüngliche β-Glucuronidase ist im wesentlichen inaktiv. Ein Beispiel einer pH-regulierenden Verbindung, die verwendet werden kann, ist ein Ammoniumsalz oder eine Ammonium freisetzende Verbindung, z. B. Ammoniumnitrat.
  • Letztendlich kann ursprüngliche β-Glucuronidaseaktivität vermindert oder im Wesentlichen beseitigt werden durch eine physikalische Behandlung, wie eine Hitzebehandlung, beispielsweise unter Verwendung einer Temperatur im Bereich von 50-65ºC in Form einer Behandlung mit kurzen Pulsen über ungefähr 1-2 Tage vor dem Transfer auf das Selektionssubstrat und/oder unter Verwengung einer Temperatur im Bereich von 30-45ºC während der Selektion (siehe Beispiel 10).
  • Genetische Transformation von Pflanzenzellen wird oft unter Verwendung von Agrobacterium-Stämmen, insbesondere Stämmen von Agrobacterium tumifaciens, durchgeführt. Es wurde gefunden, daß bestimmte entwaffnete Agrobacterium-Stämme Keimbildung durch die Produktion keimbildungsauslösender Substanzen während der Cokultivierung induzieren, und solche Stämme sollten normalerweise vermieden werden, wenn GUS-Hydrolyse von Cytokininglucuroniden für die Zwecke der Selektion genetisch transformierter Zellen verwendet werden soll. So wird genetische Transformation der Zellen unter Verwendung eines Cytokininglucuronids als inaktive Verbindung vorzugsweise durchgeführt unter Verwendung eines Agrobacterium-Stammes, der keine Cytokinine oder andere keim- (wachstums-) auslösenden Verbindungen produziert, oder der nur eine unwesentliche Menge solcher Verbindungen produziert, wodurch die Auslösung von Keimwachstum aufgrund der Gegenwart lebender Bakterien auf oder in den Zellen beseitigt oder wesentlich vermindert wird.
  • In besonderen Fällen, wenn beispielsweise eine verbesserte Selektionshäufigkeit erwünscht ist, kann es für die gewünschte Nukleotidsequenz vorteilhaft sein, mit wenigstens zwei verschiedenen Selektionsgenen miteingeführt zu werden. Das zusätzliche Selektionsgen kann ein zusätzlichen Gen sein, das ein Enzym (oder anderes Protein oder Polypeptid) codiert, das für positive Selektion gemäß der vorliegenden Erfindung geeignet ist, oder es kann ein Gen sein, das ein Enzym (oder anderes Protein oder Polypeptid) codiert, das für herkömmliche negative Selektion geeignet ist, d. h. das Resistenz gegen einen Giftstoff, ein Antibiotikum oder ein Herbizid codiert. So können genetisch transformierte Zellen selektiert werden, indem man eine Kombination von positiver und negativer Selektion anwendet, wobei die gewünschte Nukleotidsequenz in die genetisch transformierten Zellen weiterhin miteingeführt wird mit einer Subsequenz, die Resistenz gegenüber wenigstens einem Giftstoff, Antibiotikum oder Herbizid codiert, wobei das Medium wenigstens einen Giftstoff, ein Antibiotikum oder ein Herbizid enthält, gegen das die transformierten Zellen resistent sind.
  • Wie oben erwähnt, sind in einem Aspekt der vorliegenden Erfindung genetisch transformierte Zellen offenbart, die nach der oben genannten Methode selektiert wurden, insbesondere Pflanzenzellen, sowie Pflanzen, Nachfahren oder Samen, die von solchen genetisch transformierten Pflanzenzellen abgeleitet sind. Insbesondere ist es oft ein Vorteil, daß diese Zellen genetisch transformierte Pflanzenzellen sind, deren Genom als Selektionsmarker keine eingeführte (d. h. nicht-native) Nukleotidsequenz enthält, die Toxin-, Antibiotika- oder Herbizidresistenz codiert. Wie oben erklärt, gibt es Bedenken darüber, ob es sicher ist, Gene, die beispielsweise Antibiotikaresistenz in beispielsweise Nahrungspflanzen codieren, einzuführen. Genetisch transformierte Pflanzenzellen, die durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung selektiert werden, die keine Selektionsgene für beispielsweise Antibiotikaresistenz enthalten, sowie Pflanzen, Nachfahren und Samen, die von solchen Zellen abgeleitet werden, sind unter diesem Gesichtspunkt klar von Vorteil. Synthese von Verbindungen der allgemeinen Formel I gemäß der Erfindung Verschiedene Verfahren von mehr oder weniger großer Allgemeingültigkeit sind für die Synthese von Cytokininglucuroniden, die von der allgemeinen Formel I umfaßt werden, verfügbar, und zwei davon, die als beste dieser Verfahren betrachtet werden, sind im folgenden beschrieben:
  • A) Oxidation des entsprechenden Cytokinin-D-glucosids. In diesem Ansatz wird die -CH&sub2;-OH-Gruppe am Pyranosering des β-D-Glucosids, das dem infrage kommenden Glucuronid entspricht, unter geeigneten Bedingungen zu einer Carboxylfunktion oxidiert. Das wahrscheinlich beste Verfahren, diese Oxidationsreaktion in einer einfachen und hochselektiven Art zu erreichen, ist katalytische Oxidation durch Sauerstoff, geeigneterweise unter Verwendung von Platinmohr oder Platin auf Kohlenstoff als Katalysator und unter Verwendung eines schwach basischen (pH 8-10) wässrigen oder wässrig-alkoholischen (so wie wässrig-ethanolischen) Reaktionsmediums; die Reaktion kann geeigneterweise bei einer Temperatur im Bereich von 60-100ºC während einer Zeitdauer von 2 bis 24 Stunden durchgeführt werden. Oxidation (im allgemeinen nicht-katalytisch) durch herkömmliche Oxidationsmittel, die von Sauerstoff verschieden sind, können auch angewendet werden, aber voraussichtlich ergibt die sich ergebende Oxidationsreaktion im allgemeinen kleinere Ausbeuten und ist weniger spezifisch [d. h. führt zu Gemischen an Oxidationsprodukten - insbesondere wenn nicht Maßnahmen getroffen werden, um andere oxidierbare Funktionalitäten des Glucosid-Ausgangsmaterials durch Einführung geeigneter Schutzgruppen zu schützen (siehe unten)].
  • Ein Beispiel für den Ansatz der katalytischen Oxidation wird durch Verfahren 1 von Beispiel 1C in der vorliegenden Anwendung gegeben, in der N&sup6;-Benzyladenin-9-β- D-glucopyranosid (BA9G) zu N&sup6;-Benzyladenin-9-β-D-glucopyranuronsäure, (die anschließend als Natriumsalz isoliert wird) durch Oxidation mit Sauerstoff in Gegenwart von Platinmohr oxidiert wird.
  • Dieses Verfahren scheint von ziemlich allgemeiner Anwendbarkeit für die Synthese von Cytokinin-9-glucuroniden aus entsprechenden 9-Glucosiden zusein. Es hat sich auch als zufriedenstellend für die Synthese von beispielsweise Zeatin-O-glucuronid (vgl. Beispiel 1G hierin) aus den entsprechenden Zeatin-O-glucosiden erwiesen; Zeatin-O-glucuronid ist ein Beispiel für eine Verbindung der Formel I gemäß Erfindung, in der der Glucuronidteil ein Substituent an einem R&sup6;-Teil - wie hierin definiert - des C&sub2;&submin;&sub8;-Alkenyl-Typs ist, und das infrage kommende Verfahren wird als von ziemlich großer Allgemeingültigkeit für andere Cytokininglucuronide gemäß der Erfindung erachtet, in denen ein O-Glucuronid-Teil als Substituent an einer R&sup6;- Gruppe sitzt, die einer der folgenden Typen ist, wie in Zusammenhang mit der allgemeinen Formel I definiert: eine Benzylgruppe; ein C&sub1;&submin;&sub8;-Alkyl oder substituiertes C&sub1;&submin;&sub8;-Alkyl; ein C&sub2;&submin;&sub8;-Alkenyl oder substituiertes C&sub2;&submin;&sub8;-Alkenyl.
  • Dieser Ansatz scheint jedoch nicht allgemein anwendbar zu sein, beispielsweise für die Synthese von Cytokinin-3-glucuroniden.
  • Wie bereits angedeutet, ist es klar, daß, wenn man einen Ansatz macht, der die Oxidation eines Cytokininglucosides einschließt, jegliche anderen oxidierbaren (unter den infrage kommenden Oxidationsbedingungen) funktionellen Gruppen, die im Ausgangs-Cytokininglucosid vorhanden sein können und die im endgültigen Glucuronid der Formel I unverändert bleiben sollen, durch die vorherige Einführung geeigneter Schutzgruppen geschützt werden müssen. Beispiele möglicher oxidierbarer Gruppen, die in Verbindungen innerhalb der Definition der Formel I vorhanden sein können, sind [bezüglich ihrer Position wie im Zusammenhang mit der allgemeinen Formel I (siehe oben) aufgeführt]: eine SH-Gruppe, die als R²-und/oder R&sup8;-Gruppe vorliegen kann; Hydroxy- oder Glucosyloxygruppen, die als Substituenten an R&sup6;-Gruppen des substituierten C&sub1;&submin;&sub8;-Alkyltyps oder des substituierten C&sub2;&submin;&sub8;-Alkenyltyps vorliegen können; und Ribosyl-, 5'-Phosphoribosyl- oder Glucosylgruppen, die als R&sup9;- oder R&sup7;-Gruppen vorliegen können. Wenn es beispielsweise notwendig ist, aliphatische (alkoholische) Hydroxygruppen zu schützen, wie Hydroxygruppen an sekundären Kohlenstoffatomen in Ribosyl-, 5'-Phosphoribosyl- oder Glucosylgruppen, sind geeignete Schutzgruppen oft beispielsweise Acetylgruppen, die durch Verfahren eingeführt werden können, die einem Fachmann wohlbekannt sind, und die nach dem Oxidationsvorgang durch alkalische Hydrolyse entfernt werden können.
  • Verwendet man jedoch den Ansatz der milden katalytischen Oxidation, der oben beschrieben ist, sind Hydroxygruppen an primären aliphatischen Kohlenstoffatomen im allgemeinen oxidationsempfindlich, während Hydroxygruppen an sekundären (und tertiären) Kohlenstoffatomen dies im allgemeinen nicht sind; so erfordern, wenn man den -CH&sub2;-OH-Teil in der 5-Position des Glucopyranoserings eines Cytokinin-β- D-glucosids auf diese Weise oxidiert, die Hydroxygruppen an den 2-, 3- und 4- Positionen des Glucopyranoserings im allgemeinen keinen Schutz. Eine -SH- Gruppe, die als eine Gruppe R² oder R&sup8; vorliegt, erfordert jedoch im allgemeinen einen Schutz während dieser katalytischen Oxidation brauchen, und eine solche SH- Gruppe kann geeigneterweise als Benzylderivat (siehe hinten im Zusammenhang mit dem unten beschriebenen Verfahren B) geschützt werden.
  • Zahlreiche geeignete Cytokininglucoside zur Verwendung als Ausgangsmaterialien in diesem Verfahren sind kommerziell erhältlich; beispielsweise ist eine große Vielfalt davon von Apex Organics Ltd., Leicester, England, erhältlich, und einige Cytokinin-9-glucoside sind von Sigma Chemical Company, P. O. Box 14508, St. Louis, MO 63178, USA, erhältlich. Cytokininglucoside können auch durch bekannte Verfahren hergestellt werden, die in der Literatur beschrieben sind. Beispielsweise kann die Synthese einer Vielzahl geeigneter Cytokinin-9-glucoside, die R&sup6;-Gruppen tragen, die von deren hier vorliegender Definition umfaßt werden, durch einfache Ausweitung des Verfahrens erreicht werden, das durch Cowley et al. [Aust. J. Chem. 31 (1978) 1095] für die Synthese von 9-β-Glucopyranosiden des Zeatins und N&sup6;- Benzyladenins beschrieben ist.
  • B) Synthesen des Koenicis-Knorr-Typs. Dieser Ansatz, der auf dem Originalverfahren von W. Koenigs und E. Knorr [Chem. Ber. 34 (1901) 957] beruht, beinhaltet die Reaktion von Methyl-(2, 3, 4-tri-O-acetyl-α-D-glucopyranosylbromid)- uronat [abgekürzt MBTG; eine geeignete Methode für dessen Herstellung ist durch Bollenback et al., J. Amer. Chem. Soc. 77 (1955) 3310, beschrieben] mit einer alkoholischen oder phenolischen Hydroxygruppe, einer Mercapto-(-SH-)Gruppe) oder einem Ring-Stickstoffatom in einem aromatischen oder ungesättigten heterocyclischen Teil.
  • Dieser Ansatz liefert wahrscheinlich das am allgemeinsten anwendbare Verfahren für die Synthese von Cytokininglucuroniden gemäß der Erfindung (oder von Glucuroniden von Vorläuferverbindungen, die anschließend einfach zu den gewünschten Cytokininglucuroniden umgewandelt werden können), indem man von geeigneten Cytokininen [oder Cytokininvorläuferverbindungen (siehe unten)] ausgeht, und man glaubt, daß dies von sehr großer Anwendbarkeit bei der Herstellung von Verbindungen, die von der allgemeinen Formel I umfaßt werden, ist.
  • Das allgemeine Verfahren ist wie folgt: Das geeignete Cytokinin oder die Cytokininvorläuferverbindung (siehe unten), gelöst in einem Lösungsmittel wie N,N-Dimethyl formamid (DMF), Chinolin, Propylencarbonat, Methanol oder Diethylether, läßt man mit 1,25-2 molaren Äquivalenten MBTG bei einer Temperatur im Bereich von 25-100ºC während einer Zeit von 3 bis 96 Stunden reagieren gelassen, vorzugsweise in Gegenwart eines zugegebenen Halid- (Bromid-)fängers wie Silberoxid oder Silbercarbonat (verwendet man beispielsweise DMF als Lösungsmittel, wirkt das Lösungsmittel selbst oft hinreichend als Halidfänger, wobei in dem Fall die Zugabe eines zusätzlichen Fängers nicht wesentlich ist). Diese Reaktion ergibt einen Methylester des Zwischenprodukts peracetyliertes Glucuronid, das im allgemeinen isoliert und gereinigt wird; das kann geeigneterweise durchgeführt werden durch beispielsweise (i) Verdampfen des Lösungsmittels, gefolgt von einer Extraktion des Rückstands mit einem Lösungsmittel wie Chloroform, Entfernung des letzteren Lösungsmittels aus dem Extrakt und Reinigung der sich ergebenden rohen Zwischenverbindung durch Umkristallisieren und/oder herkömmliche Säulenchromatographie-Techniken; oder, beispielsweise, (ii) durch Abtrennung des Zwischenprodukts aus dem Reaktionsgemisch durch herkömmliche Säulenchromatographie, die direkt an dem Reaktionsgemisch ausgeführt wird, gefolgt von einer Entfernung des Eluierungslösungsmittels aus der/den interessierenden eluierten Fraktionen und Umkristallisation des Rohprodukts.
  • In Fällen, in denen das gewünschte Endprodukt der Formel I den Glucuronidteil in der Amidform (Glucuronamid) haben soll, wird die Umwandlung der peracetylierten Methylesterform des Glucuronidteils in die Amidform geeigneterweise in dieser Stufe ausgeführt, und das kann im allgemeinen erreicht werden, indem man den peracetylierten Methylester (vorzugsweise gereinigt, z. B. in der oben ausgeführten Weise) mit einer Lösung von wasserfreiem Ammoniak in wasserfreiem Methanol bei geringer Temperatur, beispielsweise einer Temperatur zwischen 0ºC und -10ºC, oder - als alternative Möglichkeit - mit einer konzentrierten (geeigneterweise gesättigten) wässrigen Lösung von Ammoniak bei ungefähr Raumtemperatur über eine Zeitdauer von 0,5-4 Stunden behandelt. Das Glucuronamid kann dann isoliert werden durch Verdampfen der Ammoniaklösung, beispielsweise unter Vakuum, und Umkristallisieren aus einem geeigneten Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemisch, wie 90%iges wässriges Ethanol. Ein Beispiel dieser Umwandlung wird durch Beispiel 1B hierin gegeben, in dem N&sup6;-Benzyladenin-3-glucuronamid (BA3Gnamid) aus dem entsprechenden Methylester dargestellt wird.
  • Weiterhin kann, im Falle von Verfahren, die von bestimmten Typen an Cytokininvorläuferverbindungen ausgehen, eine chemische Transformation, die notwendig ist, um den Cytokininvorläuferteil zu dem geeigneten Cytokininteil umzuwandeln, oft am Methylester vorgenommen werden, bevor man dazu übergeht, das freie Glucuronid freizusetzen. Als Beispiel kann die Synthese von Cytokinin-9- glucuroniden (deren Synthese durch den Ansatz der katalytischen Oxidation schon oben beschrieben wurde) normalerweise zufriedenstellend erreicht werden, indem man von einem substituierten oder unsubstituierten Purin ausgeht, das in der 6- Position ein Chloratom trägt; letztere 6-Chlorverbindung kann im allgemeinen in den Methylester des entsprechenden peracetylierten 9-Glucuronids umgewandelt werden mittels des oben beschriebenen allgemeinen Verfahrens unter Verwendung von MBTG, und die 6-Chlorgruppe kann dann geeigneterweise zum gewünschten -NH-R&sup6;-Teil umgewandelt werden, indem man das Produkt aus letzterer Reaktion mit dem entsprechenden Amin (R&sup6;-NH&sub2;) reagieren läßt, das im allgemeinen geeigneterweise in situ aus dem Aminhydrochlorid (R&sup6;-NH&sub2;·HCl) und einem Überschuß (geeigneterweise ein 2-4facher molarer Überschuß) einer geeigneten Base, z. B. eines tertiären aliphatischen Amins, wie Triethylamin, in einem geeigneten polaren Lösungsmittel, wie einem C&sub1;&submin;&sub4;-aliphatischen Alkohol, bei einer Temperatur im Bereich von 65-120ºC, erzeugt wird. Dies wird durch Verfahren 2 des Beispiels 1C hierin veranschaulicht, in dem die Synthese von N&sup6;-Benzyladenin-9- glucuronid (BA9GN) (als sein Natriumsalz) durch dieses Verfahren beschrieben ist.
  • Die Acetylgruppen am Glucuronidteil werden dann durch basische Hydrolyse entfernt, indem man eine Base, wie wässriges Natriumhydroxid, wässriges methanolisches oder ethanolisches Natriumhydroxid oder methanolischen Ammoniak, bei einer Temperatur im Bereich 0-25ºC über eine Zeitdauer von 0,5 bis 6 Stunden, verwendet. Verwendet man eine Base wie eine der oben erwähnten wässrigen oder alkoholischen Natriumhydroxidlösungen, ergibt dieses Verfahren - nach Neutralisation der überschüssigen Base - die Salzform des entsprechenden Cytokininglucuronids, während die Verwendung eines Reagens wie methanolischem Ammoniak und anschließende Entfernung von überschüssigem Ammoniak durch Verdampfen zu der Amidform des Glucuronids führt. Letzeres wird geeigneterweise durch herkömmliche Methoden gereinigt, wie Chromatographie, insbesondere Reversed-phase-Chromatographie, und/oder Umkristallisation aus einem geeigneten Lösungsmittel, wie einem wässrigen organischen Lösungsmittel, z. B. 80-90%iges wässriges Ethanol.
  • Wenn das Ausgangscytokinin oder die Cytokininvorläuferverbindung eine oder mehr Funktionalitäten enthält, die mit MBTG unter den infrage kommenden Bedingungen reagieren können, und die im Endglucuronid der Formel I unverändert vorliegen müssen, dann müssen natürlich solche Funktionalitäten durch vorherigen Aufbau geeigneter Schutzgruppen geschützt werden; Beispiele für solche reaktive Funktionalitäten, die in Ausgangscytokininen vorkommen können, die zu Produkten innerhalb der Definition von Formel I führen, sind [unter Bezug auf ihre Position wie im Zusammenhang mit der allgemeinen Formel I (siehe oben) spezifiziert]: -OH oder -SH, vorliegend als eine R²-Gruppe; -OH oder -SH, vorliegend als eine R&sup8;-Gruppe; -OH oder -NH&sub2;, vorliegend als ein Substituent am Phenylring einer R&sup6;-Gruppe des substituierten Benzyltyps; -OH- oder Glucosyloxygruppen, vorliegend als Substituent(en) an einer R&sup6;-Gruppe des substituierten C&sub1;&submin;&sub8;-Alkyltyps oder substituierten C&sub2;&submin;&sub8;- Alkenyltyps; Ribosyl-, 5'-Phosphoribosyl- oder Glucosylgruppen, die als R&sup9;- oder R&sup7;- Gruppen vorliegen können; und NH&sub2; in einer -CHZCH(NH&sub2;)COOH-Gruppe, die als R&sup9;-Gruppe vorliegt.
  • In Bezug auf Schutzgruppen, die für den Schutz der oben genannten Beispiele an reaktiven Funktionalitäten, die in Ausgangscytokininen vorliegen können, geeignet sind, kann eine -OH-Gruppe im allgemeinen geeigneterweise geschützt werden durch Einführung einer Acetylgruppe (siehe unten im Zusammenhang mit dem oxidativen Verfahren zur Darstellung von Verbindungen der Formel 1), um die entsprechende Acetoxygruppe (-OOCCH&sub3;) zu bilden. Eine -SH-Gruppe kann im allgemeinen sehr geeignet als Benzylthioetherderivat (-SCH&sub2;C&sub6;H&sub5;) durch die Einführung einer Benzylgruppe [beispielsweise durch Reaktion mit Benzylchlorid in einer ähnlichen Weise wie die, die unten im Zusammenhang mit Cytokininvorläuferverbindungen, die, zumindest formal, Oxo- (=O) oder Thioxo- (=S) Gruppen an der 2-Position und eine Oxogruppe an der 6-Position enthalten (siehe unten), genauer beschrieben ist] geschützt werden. Eine NH&sub2;-Gruppe kann im allgemeinen geeigneterweise durch Umwandlung in eine Phthalimidogruppe wie folgt geschützt werden: Das Cytokinin oder die Cytokininvorläuferverbindung wird mit einem Überschuß an Phthalsäureanhydrid in einem relativ inerten Lösungsmittel, wie Chloroform oder 1,2-Dimethoxethan, bei einer Temperartur im Bereich von 70-100ºC über Stunden, oft geeigneterweise ungefähr 4 Stunden, erhitzt. Die NH&sub2;-Gruppe kann, nach Durchführung der Koenigs-Knorr-Typ-Reaktion, nachfolgend durch Behandlung mit einer wässrigen alkoholischen (so wie einer wässrigen ethanolischen) Lösung von Hydrazin wiederhergestellt werden.
  • Eine Gruppe von Cytokininvorläuferverbindungen, die besonders gut geeignet sind für die Verwendung in der Synthese von Cytokininglucuroniden gemäß der Erfindung und die den Glucuronidteil (der R¹&sup0; in der allgemeinen Formel 1 entspricht) als -O-R¹&sup0; oder -S-R¹&sup0; an der 2-Position des Purinringsystems angelagert haben, sind Cytokininvorläuferverbindungen, die, wenigstens formal, Oxo- (=O) oder Thioxo- (=S) gruppen an der 2-Position und eine Oxogruppe an der 6-Position enthalten; es sollte an dieser Stelle erwähnt werden, daß Verbindungen der infrage kommenden Typen, die 2-Oxo- und 2-Thioxogruppen haben, zumindest in Lösung, im allgemeinen im tautomeren Gleichgewicht mit den entsprechenden 2-Hydroxy- und 2-Mercaptoverbindungen sind (wobei die 6-Oxogruppe dann als eine 6-Hydroxygruppe vorliegt), und die letzteren tautomeren Formen liegen, im allgemeinen, in bedeutendem Anteil vor.
  • Die zuletztgenannte Hydroxy- oder Mercaptogruppe an der 2-Position wird in der letzten Phase des gesamten Syntheseverfahrens mittels des Koenig-Knorr-Typ- Verfahrens zu der entsprechenden -O-R¹&sup0;- beziehungsweise -S-R¹&sup0;-Gruppe umgewandelt; bevor man die Koenigs-Knorr-Typ-Reaktionsfolge durchführt, wird jedoch geeigneterweise die 6-Hydroxygruppe umgewandelt, und zwar über ihre zwischenzeitliche Umwandlung zu einer C-Halo- (vorzugsweise 6-Chlor-)gruppe in den -NH-R&sup6;-Teil, der in Formel I gezeigt ist, und das macht es im allgemeinen erforderlich, daß die Hydroxy- oder Mercaptogruppe an der 2-Position durch eine geeignete Schutzgruppe während dieser Umwandlungsfolge geschützt wird. Für beide dieser Gruppen ist die Schutzgruppe der Wahl eine Benzylgruppe, die normalerweise direkt eingeführt werden kann durch eine Reaktion, die die allmähliche Zugabe eines leichten Überschusses an Benzylchlorid zu einer gerührten Lösung oder Suspension der infrage kommenden Cytokininvorläuferverbindung in wässriger Base (pH typischerweise ungefähr 12-13), so wie wässriges Natrium- oder Kaliumhydroxid, bei ungefähr Raumtemperatur, beinhaltet. Nach weiterem Rühren für, typischerweise, 1-2 Stunden, wird das Reaktionsgemisch durch Zugabe von beispielsweise Eisessig neutralisiert, und das unlösliche, benzylgeschützte Produkt wird durch Filtration isoliert.
  • Die 6-Hydroxygruppe des resultierenden 2-Benzyloxy- oder 2-Benzylthio-6- purinolderivates wird dann in eine 6-Chlorgruppe umgewandelt, geeigneterweise unter Verwendung eines Überschusses an einem chlorierenden Reagens, so wie Phosphoroxychlorid (Phosphorylchlorid), in Gegenwart einer organischen Base, so wie N,N-Diethylanilin; letztere Reaktion wird normalerweise geeigneterweise unter Rückflußbedingungen über eine Zeitdauer von ungefähr 10 Minuten bis ungefähr 3 Stunden durchgeführt.
  • Die 6-Chlorgruppe kann dann geeigneterweise in den gewünschte -NH-R&sup6;-Teil umgewandelt werden, indem man das Produkt aus der letzten Reaktion mit dem entsprechenden Amin, R&sup6;-NH&sub2;, reagieren läßt, das im allgemeinen geeigneterweise in situ aus dem Aminhydrochlorid (R&sup5;-NH&sub2;·HCl) und einem Überschuß (geeigneterweise ein 2-4facher molarer Überschuß) einer geeigneten Base, z. B. eines tertiären aliphatischen Amins, wie Triethylamin, in einem geeigneten polaren Lösungsmittel, wie einem C&sub1;&submin;&sub8;-aliphatischen Alkohol (z. B. 1-Butanol), bei einer Temperatur im Bereich von 65-120ºC, erzeugt wird.
  • Nach der Isolierung des Produkts wird die Schutzgruppe entfernt, um die freie 2-Hydroxy- oder 2-Mercaptogruppe wiederherzustellen; im Falle einer Benzylschutz gruppe kann dies geeigneterweise durch, beispielsweise, Behandlung des Produkts mit einem Überschuß von Natrium in flüssigem Ammoniak durchgeführt werden.
  • Im Falle von Produkten, die auf dieser Stufe eine 2-Mercaptogruppe haben, glaubt man, daß es allgemein vorteilhaft ist, die 2-Mercaptogruppe in eine Salzform (-S&supmin;), beispielsweise die Kaliumsalzform umzuwandeln, bevor man damit weitermacht, den Glucuronidteü mittels des oben beschriebenen Koenigs-Knorr-Typ-Verfahrens einzuführen. Ein Beispiel eines geeigneten Verfahrens für diesen Zweck ist in Schritt 4 des hier enthaltenen Arbeitsbeispiels 1E beschrieben, und die dort beschriebenen Bedingungen werden als von ziemlich großer allgemeiner Anwendbarkeit erachtet. Es kann jedoch in manchen Fällen möglich sein, die Koenigs-Knorr-Typ-Reaktion mit MBTG (siehe unten) direkt ohne vorherige Umwandlung der 2-Mercaptogruppe in die Salzform durchzuführen.
  • Schließlich wird der Glucuronidteil durch Reaktion mit MBTG eingeführt, wie oben in Zusammenhang mit dem Koenigs-Knorr-Typ-Verfahren beschrieben.
  • Ein Beispiel, das die oben beschriebene Abfolge von Syntheseschritten veranschaulicht, ist in Beispiel 1E für die Synthese des Natriumsalzes von N&sup6;-(2'-Isopentenyl)adenin-2-thioglucuronid (IP2SGN), ausgehend von 2-Thioxanthin, beschrieben, und man glaubt, daß viele der darin gegebenen weiteren Informationen hinsichtlich der Wahl der Umkristallisations- und Extraktionslösungsmittel, Wahl an Konzentrationen und Mengen an Reagentien, usw., von allgemeinerer Anwendbarkeit sind bei der Durchführung der oben umrissenen Reaktionsabfolge, in der man von einer Cytokininvorläuferverbindung, die eine "2-Thioxo"-Gruppe (d. h. eine 2-Mercaptogruppe) und eine "6-Oxo"-Gruppe (d. h. eine 6-Hydroxygruppe) hat, ausgeht.
  • Ähnlich sind eine Gruppe von Cytokininvorläuferverbindungen, die besonders gut geeignet sind für die Anwendung in der Synthese von Cytokininglukuroniden gemäß der Erfindung, die den Cytokininglucuronidteil (entsprechend R¹&sup0; in der allgemeinen Formel I) als -O-R¹&sup0; oder -S-R¹&sup0; in der 8-Position des Purinringsystems gebunden haben, Cytokininvorläuferverbindungen, die, wenigstens formal (aus Gründen ähnlich den oben im Zusammenhang mit Cytokininvorläuferverbindungen, die eine formale 2-Oxo- oder 2-Thioxogruppe und eine formale 6-Oxogruppe haben, umrissenen), eine Oxo- (=O) oder Thioxo-(=S) Gruppe an der 8-Position haben, und die weiterhin eine Hydroxygruppe an der 6-Position haben. Diese können im allgemeinen in das gewünschte Endprodukt der Formel I umgewandelt werden, indem man eine Abfolge von Reaktionen (Schutz, Einführung einer 6-Chlorgruppe, Einführung des -N-R&sup6;-Teils, Entfernung der Schutzgruppen und schließlich Reaktion mit MBTG) verwendet, die analog zu der oben für Cytokiniglucuronide, die den Glucuronidteil als -O-R¹&sup0; oder -S-R¹&sup0; in der 2-Position des Purinringsystems gebunden haben, umrissenen ist. Ein Beispiel dafür ist hierin in Beispiel 1F für die Synthese von N&sup6;-(2'isopentenyl)adenin-8-thioglucuronid (als dessen Natriumsalz) gegeben.
  • Verbindungen der Formel I, in denen der Glucuronidteil in der Carbonsäureform vorliegt, können im allgemeinen aus der entsprechenden Salzform, beispielsweise Natriumsalzform, dargestellt werden (die auf eine bereits oben umrissene Art hergestellt werden), indem man eine gerührte Lösung oder Lösung/Suspension der Salzform in einem geeigneten Lösungsmittel (z. B. einem wässrigen Alkohol, wie wässriges Ethanol), vorzugsweise bei einer Temperatur unter 25ºC mit einer Mineralsäure, wie Salzsäure, auf einen pH von ungefähr 2,5 ansäuert. Nachdem man für einige Minuten gerührt hat, wird das Lösungsmittel dann unter Vakuum entfernt. Der rohe Rückstand kann vorzugsweise einer chromatographischen Behandlung unterzogen werden, um anorganische Salze zu entfernen (siehe z. B. Beispiel 1I hierin für Details eines typischen Verfahrens und ein geeignetes chromatographisches Substrat für diesen Zweck), nach der das Produkt aus einem geeigneten Lösungsmittel, typischerweise einem polaren Lösungsmittel, wie Methanol oder Ethanol, umkristallisiert werden kann.
  • Verbindungen der Formel I, in denen der Glucuronidteil in der Methylester- oder Ethylesterform vorliegt, können im allgemeinen sehr geeignet, in hoher Ausbeute, durch Reaktion der entsprechenden Carbonsäureform des Cytokininglucuronids (das beispielsweise wie oben beschrieben hergestellt wurde) mit Diazomethan beziehungsweise Diazoethan dargestellt werden, indem man Reaktionsbedingungen anwendet, die für diesen Reaktionstyp normal sind und die einem Fachmann gut bekannt sein werden. Zahlreiche Cytokinine und Cytokininvorläuferverbindungen, die für eine Verwendung als Ausgangsmaterialien im Zusammenhang mit Verfahren B), oben, geeignet sind, sind kommerziell erhältlich, während andere nach herkömmlichen Verfahren, die in der Literatur beschrieben sind, synthetisiert werden können. Beispielsweise kann eine Anzahl geeigneter N&sup6;-substituierter Adenine, die R&sup6;-Gruppen haben, die von deren vorliegender Definition umfaßt werden, durch Literaturverfahren erzielt werden, auf die Iwamura et al. [Phytochemistry 19 (1980) 1309] hinweisen, und zahlreiche 2-, 8- und 2,8-substituierte N&sup6;-(2'-Isoperitenyl)- adenine mit R²- und/oder R&sup8;-Gruppen haben, die durch deren vorliegende Definition umfaßt werden, können wie von Dammann et al. [Phytochemistry 13 (1974) 329] beschrieben, hergestellt werden.
  • Gegenwärtig bevorzugte Verbindungen der Formel I sind die folgenden:
  • eine Verbindung der Formel I, worin R² H ist, R³ eine β-D-Glucopyranuronosylgruppe oder ein Salz davon an deren Carbonsäurefunktion ist, R&sup9; und X halbe Bindungen sind, die zusammen eine Bindung bilden, R&sup6; Benzyl ist, und R&sup7; und Y halbe Bindungen sind, die zusammen eine Bindung bilden, und Ra H ist;
  • eine Verbindung der Formel I, worin R² H ist, R³ das Amidderivat von β-D-Glucopyranuronosyl an dessen Carbonsäurefunktion ist, R&sup9; und X halbe Bindungen sind, die zusammen eine Bindung bilden, R&sup6; Benzyl ist, R&sup7; und Y halbe Bindungen sind, die zusammen eine Bindung bilden, und R&sup8; H ist;
  • eine Verbindung der Formel I, worin R² H ist, R³ und X halbe Bindungen sind, die zusammen eine Bindung bilden, R&sup9; eine β-D-Glucopyranuronosylgruppe oder ein Salz davon an der Carbonsäurefunktion ist, R&sup6; Benzyl ist, R&sup7; und Y halbe Bindungen sind, die zusammen eine Bindung bilden, und R&sup8; H ist;
  • eine Verbindung der Formel I, worin R² H ist, R³ eine β-D-Glucopyranuronosylgruppe oder ein Salz davon an der Carbonsäurefunktion ist, R&sup9; und X halbe Bindungen sind, die zusammen eine Bindung bilden, R&sup6; 2-Isopentenyl ist, R&sup7; und Y halbe Bindungen sind, die zusammen eine Bindung bilden, und R&sup8; H ist;
  • eine Verbindung der Formel I, worin R² eine -S-β-D-Glucopyranuronosylgruppe oder ein Salz davon an der Carbonsäurefunktion ist, R&sup9; H ist, R³ und X halbe Bindungen sind, die zusammen eine Bindung bilden, R&sup6; 2-Isopentenyl ist, R&sup7; und Y halbe Bindungen sind, die zusammen eine Bindung bilden, und R&sup8; H ist
  • eine Verbindung der Formel 1, worin R² H ist, R&sup9; H ist, R³ und X halbe Bindungen sind, die zusammen eine Bindung bilden, R&sup6; 2-Isopentenyl ist, R&sup7; und Y halbe Bindungen sind, die zusammen eine Bindung bilden, und R&sup8; eine -S-β-D- Glucopyranuronosylgruppe oder ein Salz davon an der Carbonsäurefunktion ist; und
  • eine Verbindung der Formel 1, worin R² H ist, R³ und X halbe Bindungen sind, die zusammen eine Bindung bilden, R&sup9; H ist, R&sup6; eine Gruppe der Formel
  • oder ein Salz davon ist, R&sup7; und Y halbe Bindungen sind, die zusammen eine Bindung bilden, und R&sup8; H ist.
    • Synthese von Verbindungen der allgemeinen Formel II gemäß der Erfindung
  • Verbindungen der Formel II können einfach dargestellt werden, indem man den leicht darzustellenden Methylester von o-Cumarsäure (d. h. 3-(2-Hydroxyphenyl)-2- propensäure) als Ausgangsmaterial verwendet. Der letztgenannte Ester kann durch Erhitzen der freien Säure (beispielsweise bezogen von Aldrich Chemical Company, Gillingham, Dorset, England, unter Katalognummer H2,280-9) unter Rückfluß in Methanol in Gegenwart von Schwefelsäure hergestellt werden. Es sollte hier angemerkt werden, daß ein Gemisch der cis- und trans-Formen (hinsichtlich der ethylenischen Doppelbindung) der Baueinheit erhalten wird. Man glaubt, daß die trans-Form, unabhängig vom Darstellungsverfahren, anfangs generell vorherrschend ist. Das macht jedoch nichts, da man gefunden hat, daß sowohl die cis- (Cumarinyl-) als auch die trans- (Cumaryl-)glucuronide nach der GUS-Hydrolyse letztlich in Cumann umgewandelt werden, wegen der Tatsache, daß Cumarsäure über einen Zeitraum von einigen Tagen (nichtenzymatisch, vermutlich durch Lichtkatalyse) langsam in Cumann umgewandelt wird.
  • Wirksame Verfahren für die Synthese der Verbindungen der Formel II, in denen (a) R¹ und R¹&sup0; in der Carbonsäureform und (b) R&sup7; und R¹&sup0; in der Amidform vorliegen, sind im Detail in den hier enthaltenen Beispielen 1H beziehungsweise 1I beschrieben. Die Verbindung(en) der Formel II, in der(denen) sowohl R¹ als auch R¹&sup0; in der Natriumsalzform vorliegen, kann(können) geeigneterweise durch basische Hydrolyse des Methylesters des peracetylierten Glucuronids (hergestellt (aus Methyl-o-cumarat) und isoliert wie im ersten Teil des in Beispiel 1I beschriebenen Herstellungsverfahrens unter Verwendung von methanolischem Natriumhydroxid auf die Weise, die am Anfang des zweiten Teils des in Beispiel 1I beschriebenen Herstellungsverfahrens beschrieben ist, erhalten werden; anstatt den pH des Hydrolysats mit Salzsäure auf 2,5 einzustellen, wie in Beispiel 1I beschrieben, wird das Gemisch einfach mit Salzsäure neutralisiert (auf einen pH ungefähr 7). Die Natriumsalzform wird geeigneterweise aus dem Gemisch durch Chromatographie über, beispielsweise nichtionisches Harz Amberlit XAD-2, isoliert, wobei die Säule mit Wasser gewaschen wird, um anorganische Salze zu entfernen, und dann typischerweise mit Methanol eluiert. Die rohe Glucuronid-Natriumsalzform, die durch Entfernen des Methanols erhalten wird, kann dann geeigneterweise aus beispielsweise absolutem Methanol umkristallisiert werden. Die Kaliumsalzform ist natürlich durch ein sehr analoges Verfahren darstellbar, indem man im Hydrolyseverfahren beispielsweise methanolisches Kaliumhydroxid verwendet.
  • Verbindungen der Formel II, in denen R¹ und R¹&sup0; beide in der Methylesterform vorliegen, oder beide in der Ethylesterform vorliegen, können geeigneterweise durch Reaktion zwischen Diazomethan beziehungsweise Diazoethan und der(den) Verbindung(en) der Formel II, in der(denen) sowohl R¹ als auch R¹&sup0; in der Carbonsäureform vorliegt(en), hergestellt werden. Die Reaktionsbedingungen hierfür sind geeigneterweise wie oben für die analoge Herstellung der Methyl- oder Ethylesterformen von Cytokininglucuroniden beschrieben.
  • Gegenwärtig bevorzugte Verbindungen der allgemeinen Formel II sind die folgenden:
  • eine Verbindung der Formel II, worin R¹ cis- und/oder trans-2-Amidoethenyl [cis und/oder trans-CH=CHCONH&sub2;] ist und R¹&sup0; das Amidderivat von β-D- Glucopyranuronosyl an deren Carbonsäurefunktion ist (2-Hydroxycinnamyl-β-Dglucopyranuronamid).
  • eine Verbindung der Formel II, worin R¹ cis-2-Carboxyethenyl [cis-CH=CHCOOH] ist, und R¹&sup0; eine β-D-Glucopyranuronosylgruppe (2-Hydroxycinnamyl-β-D-glucopyranuronsäure) ist.
  • Die Beispiele unten veranschaulichen die allgemeinen Prinzipien der vorliegenden Erfindung in Pflanzen, insbesondere unter Verwendung einer β-Glucuronidase als ein Selektionsgen und unter Verwendung neuartiger Glucuronidsubstrate, die durch dieses Gen hydrolisiert werden können. Auf der Basis dieser Arbeit wird erwogen, daß Gene wie das β-Glucuronidasegen für eine Anzahl verwandter Zwecke verwendet werden können. So kann das β-Glucuronidasegen in einem Verfahren zum Erhalt eines lokalisierten oder gewebetypischen Pflanzenwachstumsregulationseffekts in einem Pflanzenteil oder Pflanzengewebe, das ein eingeführtes β-Glucuronidasegen auf höherer Stufe als andere Teile oder Gewebe in derselben Pflanze exprimiert, angewendet Werden, wobei das Verfahren umfaßt, daß man die Pflanze einer Verbindung aussetzt, die durch das eingeführte β-Glucuronidasegen hydrolisiert werden kann, so daß die Verbindung in dem Teil oder Gewebe, das das eingeführte β-Glucuronidasegen enthält, hydrolysiert wird, wodurch eine Wachstumsregulierungsverbindung in dem Gewebe freigesetzt und nur in diesem Teil oder Gewebe eine Wachstumsregulierungswirkung herbeigeführt wird oder in diesem Teil oder Gewebe eine Wachstumsregulierungswirkung herbeigeführt wird die größer ist als die Wirkung, die in anderen Teilen oder Geweben in der Pflanze erhalten wird. Es wird ebenso erwogen, daß es vorteilhaft sein kann, Pflanzenwachstumsregulatoren wie Cytokinine eher in Form von Glucuroniden oder Glucuronidderivaten denn als freie Cytokinine zu verwenden, beispielsweise um aus der Tatsache Vorteil zu ziehen, daß sie, verglichen mit beispielsweise den entsprechenden freien oder ribosylierten Cytokininen, in Pflanzen vermutlich anders transportiert und verteilt würden.
  • Ähnlich schlagen die Beispiele unten bestimmte andere Verwendungen für β-Glucuronidase vor. Eine davon ist ein in vitro-Verfahren, um Cytokininglucuronidverbindungen (oder Glucuronidverbindungen anderer Pflanzenwachstumsreguiatoren), die in vivo durch ein eingeführtes β-Glucuronidasegen hydrolisiert werden können, zu screenen und zu identifizieren. β-Glucuronidase kann auch in einem System zum Screenen von Verbindungen verwendet werden, die für die Verwendung als Selektionsreagentien in dem hier offenbarten positiven Selektionsverfahren geeignet sind (siehe Beispiel 2). In den Beispielen 3 und 12 sind Systeme beschrieben, die für das Screenen von Verbindungen verwendet werden können, die selektiv ein natives β-Glucuronidaseenzym in Pflanzenzellen hemmen, ohne die Aktivität eines Enzyms, das durch ein eingeführtes β-Glucuronidasegen codiert ist, zu beeinträchtigen.
    • BEISPIEL 1 SYNTHESE VON GLUCURONIDVERBINDUNGEN
  • Die Synthese einer Anzahl neuartiger Glucuronidverbindungen ist im folgenden beschrieben. Zusätzlich zu den Abkürzungen, die für jede der einzelnen synthetisierten Verbindungen angegeben sind, werden die folgenden Abkürzungen verwendet:
  • BA N&sup6;-Benzyladenin
  • AcOH Essigsäure
  • DMF N,N-Dimethylformamid
  • IP N&sup6;-(2-Isopentenyl)adenin
  • MBTG Methyl-(2,3,4-tri-O-acetyl-α-D-glucopyranosylbromid)uronat
    • BEISPIEL 1A 3-β-Glucopyranuronosyl-6-benzylaminopurin-Natriumsalz
  • Synonyme: N&sup6;-Benzyladenin-N³-β-D-glucopyranuronsäure-Natriumsalz, N&sup6;-Benzyladenin-3-glucuronid-Natriumsalz
  • Abkürzung: BA3GN-Natriumsalz
    • Kondensation von N&sup6;-Benzyladenin (BA) und Methyl-(2.3.4-tri-O-acetyl-α-D-glucopyranosylbromid)uronat (MBTG)
  • BA (12,6 mmol) und MBTG (15,1 mmol) (Bollenback et al., 1955, J. Amer. Chem. Soc., Vol. 77, S. 3310-3315) wurden in wasserfreiem N,N-Dimethylformamid (DMF) (50 ml) suspendiert und für ungefähr 10 Stunden auf 100ºC erhitzt. Das meiste DMF wurde unter Vakuum entfernt, und das Rohprodukt in Chloroform (300 ml) gelöst und mit Wasser (3 · 300 ml) verteilt. Nach dem Trocknen über wasserfreiem Magnesiumsulfat wurde der Chloroformextrakt unter Vakuum eingedampft und eine dunkle sirupartige Flüssigkeit aus Ethanol umkristallisiert. Das Rohprodukt (ein Gemisch aus BA, BA9GN und BA3GN als deren peracetylierte Methylester) wurde gereinigt über 100 g Kieselgel, gepackt in Chloroform, eluiert mit einem Gradienten von 0-4% Ethanol in. Der rohe Peracetyl-BA3GN-methylester wurde aus Ethanol umkristallisiert. Ausbeute: 280 mg eines farblosen, amorphen Feststoffs.
  • Peracetyl-BA3GN-methylester wurde durch Behandlung mit 5%igem Natriumhydroxid in 50%igem wässrigen Ethanol bei Raumtemperatur hydrolysiert. Fünf Minuten, nachdem der Feststoff sich gelöst hatte, wurde das Reaktionsgemisch vorsichtig mit Salzsäure unter Eiskühlung neutralisiert. Nach dem Trocknen unter Vakuum wurde das rohe BA3GN-Natriumsalz durch Reversed-phase-Chromatographie (über 100 g Octadecylkieselgel) gereinigt, indem mit Wasser (1 l) und anschließend mit 20%igem wässrigen Methanol eluiert wurde, anschließend aus Ethanol umkristallisiert wurde. Reines BA3GN-Natriumsalz (150 mg) wurde als farbloser, mikrokristalliner Feststoff erhalten, der bis zur Gewichtskonstanz über Calciumchlorid unter Vakuum getrocknet wurde.
    • Analyse UV
  • Ethanol A max 297 nm
  • Ethanol/Essigsäure A max 291 nm
  • Ethanol/Ammoniak A max 297 nm
  • Diese Werte sind mit den Literaturwerten für BA-3-β-D-glucuropyranosid und N³,N&sup6;- disubstituierte Adenine identisch (N J Leonard, K L Carraway und J P Helgeson, J. Heterocyclic Chem. 1965, 2, 291-297).
    • HPLC
  • HPLC wurde durchgeführt unter Verwendung einer 10 · 0,46 cm Säule mit Octadecylkieselgel, isokratischer Eluierung mit 60%igem Methanol, das 10% Essigsäure enthielt, bei 1 ml/min. UV-Überwachung bei 290 nm.
  • BA3GN-Natriumsalz hatte eine Reinheit von 95+% und einen auf < 0,05% geschätzten Gehalt an freiem BA.
    • Hydrolyse durch &beta;-Glucuronidase (GUS)
  • Das BA3GN-Natriumsalz (500 ug) in 500 ul eines 50 mM Natriumphosphatpuffers, pH 7,0, wurde mit &beta;-Glucuronidase (GUS, Sigma Typ G7896), 2500 Sigma "Fishman"-Einheiten 18 Stunden lang bei 37ºC inkubiert. HPLC (Bedingungen wie oben) zeigte nahezu vollständiges Verschwinden des BA3GN-Peaks bei gleichzeitigem Erscheinen eines Peaks, der in einem 1 : 1-Gemisch mit authentischem BA cochromatographierte. Das bestätigt die Identität des Produktes als Konjugat aus BA und &beta;-D-Glucuronsäure.
  • Die folgende Analyse wurde für einen anderen Anteil des BA3GN-Natriumsalzes erhalten, das wie oben beschrieben hergestellt wurde:
    • UV
  • Ethanol A max 297 nm
    • HPLC
  • 15 · 0,46 cm Octadecylkieselgel, eluiert mit einem Gradienten von 20-60% Methanol/10% Essigsäure über 30 min. bei 1 ml/min. HPLC-Reinheit 99,5%. Gehalt an freiem BA < 0,05%.
    • DC
  • Kieselgel, entwickelt mit 1-Butanol/Essigsäure/Wasser (12/3/5). DC-Reinheit 99,5%, Gehalt an freiem BA < 0,05%.
    • Hydrolyse durch &beta;-Glucuronidase (GUS)
  • BA3GN-Natriumsalz (500 ug) in 500 ul eines 50 mM Natriumphosphatpuffers, pH 7,0, wurde mit &beta;-Glucuronidase (GUS, Sigma Typ G7896), 2500 Sigma "Fishman"- Einheiten 12 Stunden lang bei 37ºC inkubiert. HPLC und DC zeigten nahezu vollständiges (> 99%) Verschwinden des BA3GN, wobei sich eine Verbindung ergibt, die in einem 1 : 1-Gemisch mit authentischem BA cochromatographierte.
    • BEISPIEL 1B 3-&beta;-D-Glucopyranuronamido-6-benzylaminopurin
  • Synonyme: N&sup6;-Benzyladenin-N³-&beta;-D-glucopyranuronamid N&sup6;-Benzyladenin-3-glucuronamid
  • Abkürzung: BA3GNamid
    • Synthese
  • Umkristallisierter Peracetyl-BA3GN-methylester (1,5 g), der wie in Beispiel 1A hergestellt wurde, wurde in wasserfreiem Methanol (200 ml) suspendiert und auf 0 ºC abgekühlt. Weiteres wasserfreies Methanol (400 ml), gesättigt mit wasserfreiem Ammoniak bei -10ºC, wurde zugegeben, und das Gemisch wurde auf Eis gerührt. Weiteres eiskaltes wasserfreies Methanol wurde zugegeben, bis sich der Feststoff vollständig löste. Das Reaktionsgemisch wurde weitere 3 h auf Eis gerührt. Überschüssiger Ammoniak und Methanol wurden unter Vakuum entfernt, und das Produkt wurde gründlich mit heißem Ethanol verrieben, wobei sich ein farbloser Feststoff ergibt (1,3 g).
  • BA3GNamid ist, genauso wie andere Adenin-3-glycoside, nur spärlich in Wasser oder Alkohol löslich, aber löst sich zu 2,4 mg/ml in 50%igem wässrigem Methanol, das 25% Essigsäure enthält.
    • Analyse DC (Kieselgel-Chloroform/Methanol/Eisessig, 50/50/5)
  • Einzelner UV-Spot (Rf 0,36) ohne nachweisbare Verunreinigungen bei 50 ug Beladung. Reinheit 98+%. Kein nachweisbarer (< 1%) Peracetyl-BA3GN-methylester (Rf 0,89) oder BA3GN (Rf 0,02).
  • DC (Kieselgel-Chloroform/Methanol, 9/1)
  • Angewendet, um auf BA-Gehait zu testen. BA3GNamid bei 129 ug Beladung zeigte kein nachweisbares 6-Benzyladenin. BA-Gehalt deshalb < 0,2%.
    • BEISPIEL 1C
  • 9-&beta;-D-Glucopyranuronosyl-6-benzylaminopurin-Natriumsalz
  • Synonyme: N&sup6;-Benzyladenin-N&sup9;-&beta;-D-glucopyranuronsäure-Natriumsalz N&sup6;-Benzyladenin-9-glucuronid-Natriumsalz
  • Abkürzung: BA9GN-Natriumsalz
    • Synthese Verfahren 1 Katalytische Oxidation von N&sup6;-Benzyladenin-9-&beta;-D-glucopyranosid (BA9G)
  • BA9G (50 mg) wurde in 50 mM Natriumbicarbonat (25 ml) mit Platinmohr (200 mg) suspendiert. Die Mischung wurde auf einem Wasserbad auf 80ºC erhitzt, während ein kräftiger Sauerstoffstrom durchgeleitet wurde. Nach 4 Stunden wurden weitere 100 mg Platinkatalysator zugegeben. Nach 20 Stunden Behandlung waren ungefähr 95+% des BA9G in die entsprechende 9-&beta;-D-Glucopyranuronsäure und etwas BA Behandlung umgewandelt. Das Gemisch wurde neutralisiert, und das Produkt BA9GN-Natriumsalz wurde durch Reversed-phase-Chromatographie gereinigt (über 20 g Octadecylkieselgel), indem mit 200 ml Wasser und anschließend 20%igem MeOH eluiert wurde.
  • Reines BA9GN-Natriumsalz, frei von Glucosid und BA, wurde über Calciumchlorid unter Vakuum zu einem farblosen Feststoff getrocknet.
    • Verfahren 2 Kondensation von 6-Chlorpurin und Methyl-(2,3,4-tri-O-acetyl-&alpha;-D-Glucopyranosylbromid)uronat (MBTG)
  • 6-Chlorpurin (getrocknet über Phosphorpentoxid, 1,13 g), MBTG (3,87 g) und frisch getrocknetes Kaliumcarbonat (1,5 g) wurden in wasserfreiem Propylencarbonat (30 ml) bei Raumtemperatur 24 Stunden lang gerührt. Das dunkle Gemisch wurde filtriert und durch Säulenchromatographie über Kieselgel (100 g) gereinigt, indem mit einem 0-80% Gradienten von Ethylacetat in Chloroform eluiert wurde. Die Hauptfraktion (von nicht umgesetztem 6-Chlorpurin verschieden) wurde getrocknet und aus kochendem Ethanol umkristallisiert, wobei sich Methyl-6-chlorpurin-9-(2',3',4'-tri- O-acetyl-&beta;-D-glucopyranuronat) als schwachgelber Feststoff (450 mg) ergab, der über Phosphorpentoxid unter Vakuum getrocknet wurde. HPLC zeigte eine Reinheit von 95+%.
  • Methyl-6-chlorpurin-9-(2',3',4'-tri-O-acetyl-&beta;-D-glucopyranuronat) (312 mg) und Benzylamin (171 ul) wurden zusammen in 1-Butanol (13,5 ml) bei 100ºC 1 Stunde lang erhitzt. Der Feststoff löste sich einfach, wobei sich eine klare gelbe Flüssigkeit ergab. Das meiste Butanol wurde unter Vakuum entfernt, um einen weißlichen Feststoff zu ergeben, der mit 5%igem Natriumhydroxid in 50%igem wässrigem Ethanol (25 ml) 1-2 Stunden lang bei Raumtemperatur geschüttelt wurde. Nach Neutralisation wurde das Produkt unter Vakuum getrocknet, um Spuren von Butanol zu entfernen, und das rohe BA9GN-Natriumsalz wurde durch Reversed-phase-Chromatographie wie in Verfahren 1 gereinigt.
  • Das reine Produkt wurde unter Vakuum über Calciumchlorid und Phosphorpentoxid getrocknet, um einen farblosen Feststoff zu ergeben (210 mg), der mit BA9GN, das durch katalytische Oxidation dargestellt worden war, cochromatographierte.
  • Analyse von BA9GN-Natriumsalz, hergestellt durch Kondensationsreaktion von Verfahren 2
    • UV
  • 95% Ethanol A max 270 nm (17 400)
  • 95% Ethanol/0,1 M HCl A max 270 nm (16 200)
  • 95% Ethanol/0,1 M NaOH A max 270 nm (17 400)
  • Diese Ergebnisse stimmen überein mit der Struktur eines N&sup5;,N&sup9;-disubstituierten Adenins. Die Extinktionskoeffizienten sind nahezu die gleichen wie für reines BA9G, was Abwesenheit nicht-UV-absorbierender Verunreinigungen anzeigt. UV-Reinheit 95+%.
    • HPLC
  • 10 · 0,46 cm Octadecylkieselgelsäule, UV-Monitor bei 270 nm. Isokratische (50% Methanol/0,2 M Essigsäure, 2 ml/min.) und Gradienten-HPLC (0-60% Methanol/0,2 M Essigsäure, 2 ml/mm.) zeigen einen scharfen, symmetrischen Peak für BA9GN, das genau vor dem entsprechenden Glucosid eluiert wird. BA9GN, das durch Kondensationsreaktion hergestellt wurde, cochromatographiert bei der HPLC (Gradienten- und isokratische) in einem 1 : 1-Gemisch mit BA9GN, das durch katalytische Oxidation hergestellt wurde. Dies bestätigt, daß BA9GN, das durch die Kondensationsreaktion hergestellt wurde, das &beta;-D-Glucopyranosylisomer ist.
  • BA9GN enthält kein nachweisbares (< 2%) &alpha;-Anomer oder andere Verunreinigungen, einschließlich BA. HPLC-Reinheit des BA9GN 98+%.
    • DC (Kieselgel-Chloroform/Methanol, 9/1)
  • Wurde angewendet, um BA-Verunreinigung des BA9GN-Produkts zu messen.
  • BA9GN bewegt sich in diesem System nicht vom Ausgangsfleck. Mindestnachweisgrenze von BA = 200 ng. BA9GN bei 200 ug Beladung zeigt kein nachweisbares BA oder andere Verunreinigungen. DC-Reinheit 98+%. BA-Gehalt < 0,1%.
    • Saure Hydrolyse
  • Mineralsäure wandelt Cytokininglucoside in die entsprechende freie Cytokininbase um. Behandlung von BA9GN-Natriumsalz (1 mg/ml) mit 1 M Salzsäure bei 100ºC über Nacht ergab einen einzigen Spot bei der DC, der mit authentischem BA cochromatographierte. Dieser Test bestätigte, daß BA9GN ein säureempfindliches Konjugat von BA ist.
    • Enzymatische Hydrolyse
  • BA9GN-Natriumsalz (500 ug) in 500 ul eines 50 mM Natriumphosphatpuffers, pH 7,0, wurde mit Sigma &beta;-Glucuronidase (GUS, Typ G7896), 2500 "Fishman"-Einheiten 18 Stunden lang bei 37ºC inkubiert. HPLC und DC zeigten keine nachweisbare Herstellung von BA. Weitere Inkubierung bei Raumtemperatur für 3 Tage zeigte keine Hydrolyse. BA9GN ist deshalb nicht empfänglich für Hydrolyse durch &beta;-Glucuronidase.
    • BEISPIEL 1 D 3-&beta;-D-Glucopyranuronosyl-6-(3-methyl-but-2-enylamino)purin-Natriumsalz
  • Synonyme: N&sup6;-(2'-Isopentenyl)adenin-N3-&beta;-D-glucopyranuronsäure-Natriumsalz N&sup6;-(2'-Isopentenyl)adenin-3-glucuronid-Natriumsalz
  • Abkürzung: IP3GN-Natriumsalz
    • Synthese
  • N&sup6;-(2-Isopentenyl)adenin (9,48 g) und MBTG (22,1 g) wurden in wasserfreiem DMF (179 ml) 12 Stunden lang auf 100ºC erhitzt. Das meiste DMF wurde auf einem siedenden Wasserbad unter Vakuum entfernt, und die abgekühlte sirupartige Flüssigkeit wurde in Chloroform (500 ml) aufgenommen. Die Chloroformlösung wurde mit Wasser extrahiert (3 · 500 ml) und der organische Extrakt über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Das meiste Chloroform wurde unter Vakuum entfernt und die sirupartige Flüssigkeit wurde chromatographisch über Kieselgel, das mit einem Gradienten von 0 bis 3,75% Methanol in Chloroform entwickelt wurde, gereinigt. Der rohe Peracetyl-IP3GN-methylester wurde aus Methanol mit Aktivkohleentfärbung umkristallisiert, um reinen, farblosen Peracetyl-IP3GNmethylester (3,2 g) zu erhalten, der unter Vakuum über Calciumchlorid getrocknet wurde. Ein Teil des Peracetyl-IP3GN-methylesters (1,2 g) wurde durch Auflösen in ungefähr 1 l 75%igem wässrigem Methanol, das 5% Natriumhydroxid enthielt, und Rühren des Gemisches für 10 min bei Raumtemperatur hydrolysiert. Das Gemisch wurde auf Eis gekühlt, vorsichtig mit Salzsäure neutralisiert und unter Vakuum auf eine sirupartige Flüssigkeit eingeengt. Das Rohprodukt wurde durch aufeinanderfolgende Chromatographie über XAD-2 Harz und Octadecylkieselgel gereinigt, um IP3GN-Natriumsalz als farblosen, mikrokristallinen Feststoff zu ergeben, der über Calciumchlorid (810 mg) getrocknet wurde.
  • IP3GN-Natriumsalz ist in Wasser zu 2 mg/ml löslich.
    • Analyse DC (Kieselgel-1-Butanol/Eisessig/Wasser, 12/3/5)
  • IP3GN-Natriumsalz gibt einen einzelnen, scharfen Spot (Rf = 0,32) bei 100 ug Beladung ohne nachweisbares N&sup6;-(2-Isopentenyl)adenin (IP) (Rf = 0,66) oder andere Verunreinigungen. Reinheit 99,5+%.
    • Hydrolyse durch &beta;-Glucuronidase tGUS)
  • IP3GN-Natriumsalz (500 ug) in 500 ul eines 50 mM Natriumphosphatpuffers, pH 7,0, wurde mit &beta;-Glucuronidase (GUS, Sigma Typ G7896), 2500 Sigma "Fishman"- Einheiten 12 Stunden lang bei 37ºC inkubiert. DC zeigte das Verschwinden des UV- Spots von IP3GN bei gleichzeitigem Auftreten eines neuen UV-Spots, der mit authentischem IP cochromatographierte.
    • BEISPIEL 1E 6-(3-Methyl-but-2-enylamino)purin-2-yl-1-thio-&beta;-D-glucopyranuronsäure-Natriumsalz
  • Synonyme: N&sup6;-(2'-Isopentenyl)adenin-2-thioglucopyranuronsäure-Natriumsalz N&sup6;-(2'-Isopentenyl)adenin-2-thioglucuronid-Natriumsalz
  • Abkürzung: IP2SGN-Natriumsalz
    • Synthese 1.2-Benzylthio-6-purinol
  • Benzylchlorid (1,4 ml) wurde tropfenweise unter starkem Rühren zu einer Lösung von 2 g 2-Thioxanthin in 12 ml 1 M Natriumhydroxid, das mit Wasser auf 140 ml verdünnt war, zugefügt. Nachdem alles zugegeben war, bildete sich ein creme farbener Niederschlag. Das Reaktionsgemisch wurde eine weitere Stunde bei Raumtemperatur gerührt und filtriert. Der Feststoff wurde gründlich mit Wasser gewaschen und über Nacht unter Vakuum über Calciumchlorid, und bis zur Gewichtskonstanz über Phosphorpentoxid getrocknet. Das Rohprodukt (2 g) wurde im nächsten Schritt direkt ohne Umkristallisieren verwendet.
    • 2.2-Benzylthio-6-chlorpurin
  • 2-Benzylthio-6-purinol (2 g) wurde mit einem Gemisch aus Phosphoroxychlorid (20 ml) und Diethylanilin (2 ml) bedeckt. Das Gemisch wurde unter Rühren für 1 Stunde am Rückfluß gekocht, abgekühlt und auf Eis (100 g) geschüttet. Es bildete sich ein gelber Niederschlag, der filtriert, gründlich mit Wasser gewaschen und unter Vakuum getrocknet wurde. Das Rohprodukt wurde aus Methanol umkristallisiert, um einen leicht cremen Feststoff zu ergeben (1,2 g), der auf Gewichtskonstanz über Phosphorpentoxid getrocknet wurde.
    • 3.2-Benzylthio-N&sup6;-(2-isopentenyl)adenin
  • Eine Mischung aus 2-Benzylthio-6-chlorpurin (1,2 g) und Isopentenylaminhydrochlorid (1,04 g) in 1-Butanol (25 ml), das Triethylamin (2,2 ml) enthielt, wurde in einem verschlossenen Rohr bei 110ºC 2 Stunden lang erhitzt. Das Butanol wurde unter Vakuum entfernt und die Mischung mit Eiswasser (100 ml) geschüttelt. Das Produkt wurde filtriert, aus Ethanol mit Aktivkohleentfärbung umkristallisiert und unter Vakuum mit Phosphorpentoxid getrocknet. Ausbeute 0,64 g. Ausbeute 1,3 g 2-Benzylthio-N&sup6;-(2-isopentenyl)adenin als farbloser Feststoff. Das Rohprodukt wurde direkt im nächsten Schritt weiterverwendet.
    • 4.2-Thio-N&sup6;-(2-isopentenyl)adenin
  • 2-Benzylthio-N&sup6;-(2'-isopentenyl)adenin (0,64 g) wurden in flüssigem Ammoniak (62,5 ml) gelöst, um eine klare gelbe Lösung zu ergeben. Natrium (ungefähr 200 mg) wurde in kleinen Stücken zugegeben, bis eine blaue Färbung für 10 min bestehen blieb. Eine kleine Menge festes Ammoniumchlorid wurde vorsichtig zugegeben, um überschüssiges Natrium zu entfernen, und man ließ den Ammoniak bis auf ein kleines Volumen verdampfen. Diethylether (65,5 ml) wurde zugegeben und der Etherextrakt wurde mit Wasser (62,5 ml) extrahiert. Der wässrige Extrakt wurde mit Essigsäure auf einen pH zwischen 4 und 5 eingestellt, wo sich ein cremiger Feststoff abschied. Nach Kühlung wurde das Produkt abfiltriert und unter Vakuum über Phosphorpentoxid getrocknet. Ausbeute 340 mg.
  • Rohes 2-Thio-N&sup6;-(2-isopentenyl)adenin wurde in das Kaliumsalz umgewandelt durch Suspension in Wasser und Zugabe einer äquimolaren Menge von Kaliumhydroxid zusammen mit ausreichend Alkohol, um sie Auflösung zu bewirken. Die Lösung wurde unter Vakuum und über Phosphorpentoxid getrocknet.
    • 5. N&sup6;-(2-isopentenyl)adenin-2-thioglucopyranuronid
  • Das Kaliumsalz von 2-Thio-N&sup6;-(2-isopentenyl)adenin (2,89 mmol) wurde in wasserfreiem Methanol gelöst und MBTG (5 mM) wurde zugegeben. Das Gemisch wurde 24 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt, währenddessen sich ein cremiger weißer Feststoff niederschlug. Das Reaktionsgemisch wurde unter Vakuum getrocknet und bei Raumtemperatur durch Behandlung mit 5%igem wässrigen Natriumhydroxid (50 ml) hydrolysiert, um das freie Glucopyranuronid als Natriumsalz zu ergeben. Das Gemisch wurde durch die vorsichtige Zugabe von konzentrierter Salzsäure mit Kühlung von außen neutralisiert, um einen farblosen Niederschlag des rohen IP2SGN-Natriumsalzes zu ergeben.
  • Das Rohprodukt wurde durch Reversed-phase-Chromatographie gereinigt, aus Ethanol umkristallisiert und unter Vakuum über Calciumchlorid getrocknet, um einen farblosen, amorphen Feststoff (150 mg) zu ergeben. Das Produkt war in 50%igem wässrigen Alkohol spärlich löslich.
    • Analyse UV
  • Wasser, pH 1 A max 284, 241, 206 nm
  • Wasser, pH 7 278, 230 (Schulter)
  • Wasser, pH 14 283, 227
  • IP2SGN-Natriumsalz zeigte das charakteristische UV-Spektrum von 2-thiosubstituierten Cytokininen, und das Spektrum war sehr ähnlich dem von authentischem 2-Methylthio-N&sup6;-(2-isopentenyl)adenin. UV-Analyse bestätigte das Produkt als ein 2-N&sup6;-disubstituiertes Adenin.
    • HPLC
  • Für HPLC wurde eine 15 · 0,46 Octadecylkieselgelsäule verwendet, die mit einem Gradienten von 0-60% Methanol, das 0,2 M Essigsäure enthielt, über 30 min bei 1 ml/min eluiert wurde. UV-Überwachung bei 270 nm.
  • IP2SGN-Natriumsalz hatte eine Reinheit von 98+% und enthielt kein nachweisbares freies 2-Thio-N&sup6;-(2-isopentenyl)adenin (< 0,1%).
    • Hydrolyse durch &beta;-Glucuronidase (GUS)
  • IP2SGN-Natriumsalz (500 ug) in 500 ul eines 50 mM Natriumphosphatpuffers, pH 7,0, wurde mit &beta;-Glucuronidase (GUS, Sigma Typ G7896), 2500 Sigma "Fishman"- Einheiten 48 Stunden lang bei 37ºC inkubiert. HPLC (Bedingungen wie oben) zeigte teilweises Verschwinden (65%) von IP2SGN, wobei ein Peak entstand, der in einem 1 : 1-Gemisch mit 2-Thio-N&sup6;-(2-pentenyl)adenin cochromatographierte. Dieser Test bestätigt die Identität von IP2SGN-Natriumsalz als Konjugat von 2-Thio-N&sup6;-(2- isopentenyl)-adenin und &beta;-D-Glucuronsäure, teilweise empfänglich für GUS- Hydrolyse.
    • BEISPIEL 1F 6-(3-Methyl-but-2-enylamino)purin-8-yl-1-thio-&beta;-D-glucopyranuronsäure-Natriumsalz
  • Synonyme: N&sup6;-(2'-ilsopentenyl)adenin-8-thioglucopyranuronsäure-Natriumsalz N&sup6;-(2'-ilsopentenyl)adenin-8-thioglucuronid-Natriumsalz
  • Abkürzung: IPBSGN-Natriumsalz
    • Reaktion 1 6-Hydroxy-8-thiopurin
  • 4,5-Diamino-6-hydroxypyrimidinsulfat (25 g) und Thioharnstoff (100 g) wurden zusammen gemahlen und auf einem Ölbad 30 min lang bei 200ºC erhitzt. Das abgekühlte, verfestigte Produkt wurde in heißer 1 m NaOH (500 ml) gelöst, mit Aktivkohle aufgekocht und filtriert. Das heiße Filtrat wurde mit cHCl angesäuert, und die heiße Lösung wurde abfiltriert, um einen roten Feststoff zu ergeben, der aus einer heißen basischen Lösung nochmals ausgefällt, gut mit Wasser gewaschen und unter Vakuum bei 80ºC getrocknet wurde. Ausbeute 5,28 g.
    • Analyse UV
  • A max, pH 1 236, 292 nm (Lit. 234, 290 nm)
  • pH 11 234, 292 nm (Lit. 234, 290 nm)
    • Reaktion 2 6-Hydroxy-8-benzylthiopurin
  • 5,28 g 6-Hydroxy-8-thiopurin wurden in 78,5 ml 1 M NaOH suspendiert und auf 400 ml mit Wasser verdünnt. 3,7 ml Benzylchlorid wurden zugegeben, und das Reaktionsgemisch wurde 3 Stunden bei Raumtemperatur kräftig gerührt, mit Eisessig auf pH 5 eingestellt und filtriert. Das Produkt wurde gründlich mit Wasser gewaschen und über Nacht unter Vakuum bei 80ºC getrocknet, um 7,33 g eines lachsrosa Feststoffs zu ergeben, der ohne weitere Reinigung weiterverwendet wurde.
    • Reaktion 3 6-Chlor-8-benzyithiopurin
  • 6-Hydroxy-8-benzylthiopurin (7,33 g) wurde zu einer Mischung von Phosphoroxychlorid (70 ml) und N,N-Diethylanilin (7,5 ml) zugegeben, und das Gemisch wurde 2 Stunden am Rückfluß gekocht, um ein dunkelrotes Produkt zu ergeben. Das Gemisch wurde unter Vakuum aufkonzentriert, und die sich ergebende sirupartige Flüssigkeit wurde langsam unter Rühren auf Eis (400 g) geschüttet. Das Gemisch wurde 15 min stehen gelassen, dann mit kalter konzentrierter KOH stark alkalisch gemacht. Die Mischung wurde gründlich verrieben, um das meiste der sirupartigen Flüssigkeit zu lösen, und auf pH 1 durch langsame Zugabe kalter konzentrierter HCl gesäuert, wobei immer noch überschüssiges Eis vorhanden war.
  • Nach Stehen für 1 Stunde bei Raumtemperatur wurde das Produkt abfiltriert, gründlich mit Wasser gewaschen und unter Vakuum bei 80ºC für 2 Stunden getrocknet, um 7,8 g Produkt zu ergeben.
    • Reaktion 4 8-Benzylthio-N&sup6;-(2'-isopentenyl)adenin
  • Ein Gemisch aus 6-Chlor-8-benzylthiopurin (3,9 g) und Isopentenylaminhydrochlorid (3,42 g) in 1-Butanol (100 ml), das Triethylamin enthielt (7,5 ml), wurde 2 Stunden lang am Rückfluß gekocht. Das meiste Butanol wurde unter Vakuum entfernt, und das Reaktionsgemisch wurde auf Eis gekühlt und mit Wasser (400 ml) geschüttelt.
  • Nach Kühlung über Nacht wurde das Gemisch filtriert, um ein Rohprodukt zu ergeben, das durch Chromatographie über 100 g Kieselgel, das mit einem Gradienten von 0-2,5% MeOH in Chloroform eluiert wurde, gereinigt wurde. Das chromatographisch reine Produkt wurde aus Methanol umkristallisiert, um 1,18 g eines farblosen, amorphen Feststoffs zu ergeben.
    • Analyse
  • DC (Kieselgel-2, 5% Methanol/Chloroform)
  • Reinheit 98+%. Keine nachweisbaren Verunreinigungen.
    • UV
  • 95% Ethanol/HCl 307 nm
  • 95% Ethanol 291 nm
  • 95% Ethanol/Ammoniak 298 nm
    • Reaktion 5 8-Thio-N&sup6;-(2'-isopentenyl)adenin
  • 8-Benzylthio-N&sup6;-(2'-isopentenyl)adenin (1,18 g) wurde in flüssigem Ammoniak (125 ml) gelöst, um eine klare gelbe Lösung zu ergeben. Natrium wurde in kleinen Stücken zugegeben, bis eine blaue Färbung für 15 min bestehen blieb. Eine kleine Menge festes Ammoniumchlorid wurde vorsichtig zugegeben, um überschüssiges Natrium zu entfernen. Der Ammoniak wurde auf einer heißen Platte auf ein kleines Volumen abgedampft und Ether (125 ml) wurde zugegeben.
  • Nachdem das meiste des verbliebenen Ammoniaks sich verflüchtigt hatte, wurde der Etherextrakt mit Wasser (2 · 65 ml) extrahiert. Der wässrige Extrakt (bei pH 12-13) wurde auf Eis gekühlt und mit Eisessig auf pH 5 eingestellt. Ein cremiger weißer Feststoff schied sich ab, der filtriert, gründlich mit Wasser gewaschen und über Nacht über Calciumchlorid getrocknet wurde, um ein nahezu weißes, sehr leichtes Pulver zu ergeben. Ausbeute 760 mg.
  • Anmerkung: 8-Thio-N&sup6;-(2'-isopentenyl)adenin wird in alkalischer Lösung leicht oxidiert.
    • Analyse
  • HPLC (15 cm Oktadecylkieselgel, 0-80% Methanol/0,2 M Eisessig, 30 min., 1 ml/min., UV-Überwachung bei 300 nm)
  • Scharfer, symmetrischer Peak ohne nachweisbare Verunreinigungen. Reinheit 98+%.
    • UV
  • 95% Ethanol/HCl 245, 307 (sh), 315 nm
  • 95% Ethanol 241, 305, 313 nm
    • Reaktion 6 IPBSGN-Natriumsalz
  • 8-Thio-N&sup6;-(2'-isopentenyl)adenin (600 mg) wurden in 50 mM Kaliumhydroxid (102 ml), das 1% 2-Mercaptoethanol als Oxidationsmittel enthielt, suspendiert. Ausreichend Alkohol wurde zugegeben, um den Feststoff zu lösen. Die Lösung wurde unter Vakuum über Calciumchlorid, gefolgt von Phosphorpentoxid getrocknet. Das trockene Produkt wurde in wasserfreiem Methanol (100 ml), das 2-Mercaptoethanol (50 ul) enthielt, gelöst, und MBTG (2 g) wurde zugegeben. Das Gemisch wurde 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und unter Vakuum über Calciumchlorid und Phosphorpentoxid getrocknet. Der geschützte Ester wurde 1 Stunde lang bei Raumtemperatur in 50 ml 5%igem Natriumhydroxid hydrolisiert.
  • Nach Neutralisation mit konzentrierter Salzsäure wurde das Rohprodukt durch Reversed-phase- und Normalphase-Chromatographie gereinigt, um einen farblosen Feststoff zu ergeben, der auf Gewichtskonstanz über Calciumchlorid getrocknet wurde. Ausbeute 190 mg.
  • Analyse von IPBSGN-Natriumsalz
    • UV
  • A max Ethanol/pH 1 300 nm
  • Ethanol/neutral 285 (ausgeprägte Schulter), 291, 301 nm
  • Ethanol/pH 12 283 (Schulter), 290, 300 nm
  • DC (Kieselgel-Chloroform/Methanol, 1/1)
  • Das IPBSGN-Natriumsalz zeigte bei Beladungen von 34, 68, 102 und 134 ug einen einzelnen scharfen Spot ohne nachweisbare Verunreinigungen. Reinheit 99,5+%. Gehalt an freier Cytokininbase, 8-Thio-N&sup6;-(2'-isopentenyi)adenin < 0,1%.
  • HPLC (15 cm Oktadecylkieselgel, 0-80% Methanol/0,2 M Eisessig, 30 min. 1 ml, 300 nm)
  • Einzelner, breiter Peak, tR 18,2 min. Keine Verunreinigungen nachweisbar. Reinheit 99, 5+%.
    • GUS Hydrolyse
  • IPBSGN-Natriumsalz zu 1 mg/ml wurde mit 2500 Einheiten GUS (Sigma) in 50 mM Phosphatpuffer, pH 7, bei 37ºC 24 Stunden lang inkubiert. DC (1/1, Methanol/Chloroform) zeigte vollständige (> 95%) Umwandlung des IPBSGN-Natriumsalzes in eine Verbindung, die mit 8-Thio-(2'-isopentenyl)adenin cochromatographierte. IPBSGN-Natriumsalz ist deshalb empfänglich für GUS-Hydrolyse.
    • BEISPIEL 1G O-&beta;-D-Glucopyranuronosylzeatin-Natriumsalz
  • Synonyme: Zeatin-O-&beta;-D-glucopyranuronsäure-Natriumsalz Zeatin-O-Glucuronid-Natriumsalz
  • Abkürzung: ZOGN-Natriumsalz
    • Synthese Trans-2-Methyl-4-phthalimidobut-2-enyl-(2',3',4'-tri-O-acetyl-&beta;-D-glucopyranuronsäuremethylester
  • Trans-1-Hydroxy-2-methyl-4-phthalimidobut-2-en (1,87 g, Corse & Kuhnle, 1972, Synthesis, S. 618-619) und frisch aktiviertes Silbercarbonat (9 g) wurden in wasserfreiem Ether (300 ml), der Molekularsieb enthielt (9 g), suspendiert. Nach Rühren für 30 min bei Raumtemperatur wurde MBTG (3,24 g) zugegeben, und das Gemisch wurde im Dunkeln 2 Tage bei Raumtemperatur gerührt. Weiteres MBTG (1,62 g) wurde zugegeben und das Gemisch wurde für weitere 2 Tage gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde filtriert, unter Vakuum zu einer farblosen sirupartigen Flüssigkeit getrocknet, die weiter unter Vakuum über Calciumchlorid getrocknet wurde, um einen farblosen, pulverisierbaren Schaum zu ergeben. Das Rohprodukt wurde durch Chromatographie über Kieselgel (200 g) befreit, das mit Chloroform eluiert wurde, von Zuckerverunreinigungen befreit. Ausbeute an reinem Produkt war 2,45 g (55,4%).
    • Trans-2-Methyl-4-amino-but-2-enyl-&beta;-D-glucopyranosyluronamid
  • Methyl-trans-2-methyl-4-phthalimidobut-2-enyl-(2',3',4'-tri-O-acetyl-&beta;-Dglucopyranuronat (2,45 g) wurde in wasserfreiem Methanol (150 ml) gelöst, auf Eis gekühlt, und Ammoniak wurde 6 Stunden lang durch das eisgekühlte Gemisch durchgeleitet. Nach Entfernen des Methanols unter Vakuum wurde das Rohprodukt durch Chromatographie über Zellulose (200 g) gereinigt und mit Butanol-Ethanol- Essigsäure-Wasser (8 : 2 : 1 : 3 v/v) entwickelt. Das Eluat wurde unter Vakuum getrocknet, um eine braune sirupartige Flüssigkeit zu ergeben, die im Kondensationsschritt ohne weitere Reinigung eingesetzt wurde.
    • Zeatin-O-&beta;-glucuronsäure-Natriumsalz
  • Die sirupartige Flüssigkeit aus dem vorherigen Schritt wurde in einem abgeschlossenen Rohr mit 6-Chlorpurin (0,8 g) und Triethylamin (1,5 ml) in Methanol (25 ml) bei 90ºC 4 Stunden lang erhitzt, um das Amid zu ergeben. Um das Amid in die Säure umzuwandeln, wurde das Methanol unter Vakuum entfernt, und 5%iges wässriges Natriumhydroxid (25 ml) wurde zugegeben. Nach Rühren bei Raumtemperatur für 6 Stunden wurde das Gemisch vorsichtig mit 2 M Salzsäure neutralisiert und durch Reversed-phase-Chromatographie über Oktadecylkieselgel (100 g) und Elution mit Wasser gereinigt. Rohes ZOGN-Natriumsalz, das nicht umgesetztes 6-Chlorpurin enthielt, wurde unter Vakuum getrocknet und durch Chromatographie über Kieselgel (50 g) und Elution mit einem 0-100%-Gradienten von Methanol in Chloroform gereinigt. Nach Entfernen des Lösungsmittels unter Vakuum wurde das Produkt als amorpher Feststoff unter Vakuum über Calciumchlorid getrocknet. Ausbeute 158 g.
    • Analyse UV
  • DC (Kieselgel-1-Butanol/Eisessig/Wasser, 12/3/5)
  • ZOGN-Natriumsalz zeigte bei einer Beladung von 50 ug einen einzelnen Spot (Rf 0,16) ohne nachweisbare Verunreinigungen. Zeatin (0,66) oder 6-Chlorpurin (Rf 0,70) waren nicht nachweisbar. Reinheit insgesamt 98+%.
  • HPLC (15 · 0,46 cm Oktadecylkieselgelsäule, UV-Überwachung bei 270 nm)
    • Gradientenelution (0-100% Methanol über 30 min bei 1 ml/min.)
  • ZOGN-Natriumsalz eluiert als recht breiter Peak (tR 10,0 min.) mit einer kleinen Menge einer anorganischen Verunreinigung, die mit dem Lösungsmittelpeak zusammen vorkommt. Reinheit insgesamt 97+%.
    • Isokratische Elution (50%ige wässriges Methanol, 1 ml/min)
  • Isokratische Elution wurde angewendet, um den Zeatingehalt zu bestimmen. ZOGN- Natriumsalz hatte eine Retentionszeit (tR) von 1,1 min. verglichen mit tR von authentischem trans-Zeatin von 2,2 min. HPLC von bis zu 96 ug ZOGN-Natriumsalz zeigte kein nachweisbares Zeatin. Der Zeatingehalt war deshalb < 0,1%. Dies wurde durch DC auf Kieselgel in Chloroform/Methanol 9/l bestätigt. ZOGN-Natriumsalz bewegte sich in diesem System nicht vom Ausgangspunkt, aber jegliche Zeatinverunreinigung wurde bei Rf 0,39 klar abgetrennt. Es wurde kein Zeatin nachgewiesen, wenn 200 ug ZOGN-Natriumsalz laufen gelassen wurde. Die Nachweisgrenze für trans-Zeatin in der DC war 200 ng; deshalb bestätigte sich die Verunreinigung mit trans-Zeatin als < 0,1%.
    • Enzymatische Hydrolyse
  • Eine Probe ZOGN-Natriumsalz wurde mit &beta;-Glucuronidase (Sigma G9387) in 50 mM Natriumphosphatpuffer bei pH 7,0 bei 37ºC inkubiert. HPLC (50% isokratisches Methanol) zeigte nahezu vollständige Umwandlung zu trans-Zeatin. Die Identität von trans-Zeatin in dem Enzymhydrolysat wurde durch Cochromatographie eines 1 : 1 - Gemischs des Hydrolysats und authentischem trans-Zeatin in 3 verschiedenen chromatographischen Systemen nachgewiesen.
    • BEISPIEL 1H 2-Hydroxycinnamyl-&beta;-D-glucuropyranuronamid
  • Synonyme: o-Cumaryl-&beta;-D-Glucopyranuronamid o-Cumarylglucuronamid
  • Abkürzung: CouGNamid
    • Synthese
  • Methyl-o-cumarat (15 g) und MBTG (16,8 g) wurden zusammen mit Chinolin (25 ml) gemahlen, um eine homogene Paste zu ergeben. Silber(I)-oxid (10,7 g) wurde in mehreren Portionen mit gründlichem Mischen zugegeben, während das Gemisch auf Eis gekühlt wurde. Nach vollendeter Zugabe wurde das Reaktionsgemisch 3 h auf Raumtemperatur gehalten. Das Gemisch wurde mit Ether (1 l) extrahiert und der Etherextrakt mit Wasser (1 l) gewaschen. Der Etherextrakt wurde über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und zu einer roten sirupartigen Flüssigkeit unter Vakuum getrocknet. Die rohe sirupartige Flüssigkeit wurde mit Petrolether (300 ml) extrahiert, um nicht umgesetztes Methyl-o-cumarat zu entfernen, dann unter Vakuum getrocknet, um Spuren von Petrolether zu entfernen. Das Rohprodukt wurde aus Ethanol mit Aktivkohleentfärbung umkristallisiert, um reines peracetyliertes Methyl-2- hydroxycinnamyl-O-&beta;-glucopyranuronat (3,5 g) zu ergeben.
  • Der Peracetylmethylester (3,5 g) wurde in wasserfreiem Methanol (250 ml) gelöst und durch Rühren bei 0ºC über 3 h mit weiterem wasserfreiem Methanol (250 ml), das mit trockenem Ammoniak bei -10ºC gesättigt worden war, hydrolisiert.
  • Ammoniak und Methanol wurden unter Vakuum entfernt, und das Rohprodukt aus Ethanol umkristallisiert und unter Vakuum über Calciumchlorid getrocknet, um reines CouGNamid als farblosen, fedrigen Feststoff zu ergeben (1,7 g).
    • Analyse DC (Kieselgel-Chloroform/Methanol, 1/1)
  • Einzelner, scharfer Spot bei Rf 0,63. Keine Verunreinigungen wurden bei einer Beladung von bis zu 50 ug nachgewiesen, Reinheit 98+%. Verunreinigungen, weniger als 0,5% Methyl-o-cumarat; oder Cumann.
    • DC (Kieselgel-Chloroform/Methanol/Eisessig, 50/50/5)
  • Einzelner, scharfer Spot bei Rf 0,68. Reinheit 98+%. Keine nachweisbare (< 0,5%) o-Cumarsäure (Rf 0,80).
    • BEISPIEL 11 2-Hydroxycinnamyl-&beta;-D-glucopyranuronsäure
  • Synonyme: o-Cumaryl-&beta;-D-glucopyranuronsäure o-Cumarylglucuronid
  • Abkürzung: CouGN
  • Synthese
  • Methyl-o-cumarat (17,8 g) und MBTG (20 g) wurden zusammen mit Chinolin (20 ml) zu einer einheitlichen Paste gemahlen. Silber(1)-oxid (13 g) wurde unter gründlichem Mischen in Teilen zugegeben, während das Gemisch auf Eis gekühlt wurde. Nach vollendeter Zugabe wurde das Reaktionsgemisch bei Raumtemperatur 3 h lang stehengelassen. Das Gemisch wurde mit Ether (1 l) extrahiert, und der Etherextrakt wurde mit Wasser (1 l) gewaschen. Der Etherextrakt wurde über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und unter Vakuum zu einer roten sirupartigen Flüssigkeit getrocknet. Die rohe sirupartige Flüssigkeit wurde mit Petrolether (300 ml) extrahiert, um nicht umgesetztes Methyl-o-cumarat zu entfernen, dann unter Vakuum getrocknet, um Spuren von Petrolether zu entfernen. Das Rohprodukt wurde aus Ethanol mit Aktivkohleentfärbung umkristallisiert, um reines peracetyliertes Methyl- CouGN (2,9 g) zu ergeben.
  • Der Peracetylmethylester (2,9 g) wurde in Methanol (250 ml) suspendiert, und 2 M Natriumhydroxid (250 ml) wurde unter Rühren zugegeben, während das Reaktionsgemisch auf Eis gekühlt wurde. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur 1,5 h lang gerührt und mit Salzsäure auf pH 2,5 eingestellt. Das Methanol wurde unter Vakuum entfernt und das Rohprodukt durch XAD-2-Chromatographie gereinigt. Das chromatographische Harz wurde zuerst mit Wasser gewaschen, um anorganische Salze zu entfernen, und das Produkt wurde mit Methanol eluiert. Nach Trocknung unter Vakuum wurde das Produkt aus Ethanol umkristallisiert und unter Vakuum über Calciumchlorid getrocknet, um reines CouGN als farblosen, amorphen Feststoff (1, 5 g) zu ergeben.
  • CouGN ist zu 5 mg/ml in wässrigem Puffer, pH 7, löslich und in 50%igem wässrigem Alkohol als klare, farblose Lösung.
    • Analyse DC (Kieselgel-Chloroform/Methanol/Eisessig, 50/50/1)
  • Hauptspot Rf 0,12 mit einer winzigen Verunreinigung bei Rf 0,24. Reinheit 90+%. Kein nachweisbares (< 1%) Cumann (Rf 0,90), Methyl-o-cumarat (Rf 0,91) oder o-Cumarsäure (Rf 0,80). Das Hauptprodukt cochrornatographierte mit authentischer CouGN, die durch die katalytische Oxidation von 2-Hydroxycinnamyl-O-&beta;-Dglucopyranosid hergestellt worden war.
    • GUS-Hydrolyse
  • CouGN (5 mg) wurde in 50 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,0 (1 ml) gelöst und mit GUS (1000 Einheiten Sigma Typ G5897) 12 Stunden lang bei 37ºC inkubiert. DC zeigte 93,4% Umwandlung zu einer Verbindung, die mit o-Cumarsäure cochromatographierte. o-Cumarsäure wird über einen Zeitraum von einigen Tagen langsam (nichtenzymatisch) in Cumann umgewandelt.
    • BEISPIEL 2 CYTOKININGLUCURONIDE WERDEN DURCH &beta;-GLUCURONIDASE HYDRO- LYSIERT UND SETZEN DABEI UNVERÄNDERTE CYTOKININE FREI
  • Ein Assay wurde entwickelt, um jene Cytokininglucuronide zu identifizieren, die durch &beta;-Glucuronidase von E. coli hydrolysiert werden können. (Verschiedene Merkmale des &beta;-Glucuronidaseenzyms und -gens sind beispielsweise im folgenden beschrieben: Blanco & Nemoz, Biochimie 69, S. 157-161, 1987; Jefferson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 83, S. 8447-8451, 1986; Levvy & Marsh, Advan. Carbohydrate Chem. 14, S. 381-428; US 4,721,671).
  • Die Verbindung, die getestet werden soll, wird in 5U mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,0, (im allgemeinen 500 ug der Verbindung in 500 ul Puffer) mit &beta;-Glucuronidase (im allgemeinen Sigma Typ G7896, 2500 "Fishman"-Einheiten) 12-24 h lang bei 37ºC inkubiert. Die Gegenwart von Hydrolyseprodukten wird dann unter Verwendung von HPLC und DC bestimmt.
  • Die Tabelle unten zeigt die Ergebnisse des oben beschriebenen Assays an einer Anzahl von Cytokinin-&beta;--D-glucuroniden und einem Cytokinin-&beta;-D-glucuronamid.
    • TABELLE 1 Cytokinin-&beta;-D-glucuronide (und ein Cytokinin-&beta;-C)-glucuronamid) als Substrate &beta;-Glucuronidase von E. coli Hydrolyse Verbindung
  • + BA3GN-Natriumsalz
  • - BA3GNamid
  • - BA9GN-Natriumsalz
  • + ZOGN-Natriumsalz
  • + IP3GN-Natriumsalz
  • + IP2SGN-Natriumsalz
  • + IPBSGN-Natriumsalz
  • Weil die einzigen Substrate, die verwendet wurden, um das GUS-Enzym von E. coli in transgenen Organismen zu testen, O-Glucuronide waren, und weil früher berichtet worden war (Jefferson, "The GUS reporter gene system", Nature, Vol. 342, S. 837- 838, 1989), daß die Substrate von &beta;-Glucuronidase aus D-Glucuronsäure bestehen, die durch eine &beta;-O-glykosidische Verknüpfung an ein Aglykon gebunden ist, war es überraschend, daß gefunden wurde, daß auch bestimmte N-Glucuronide und S- Glucuronide gute Substrate für dieses Enzym sind. Es wird deshalb auch erwogen, daß solche N- und S-Glucuronidverbindungen in Assays für das &beta;-Glucuronidaseenzym von E. coli und Pflanzen, z. B. ähnlich dem X-gluc-Assay, auf den man sich unten bezieht, verwendet werden können.
  • In GB 2 197 653 A wird festgestellt, daß durch Verwendung des &beta;-Glucuronidasesystems und neuartiger Substanzen positive und negative Selektion unter Verwendung der GUS-Aktivität möglich sein kann. Diese Hypothese ist jedoch nie untersucht worden, und enzymatische Hydrolyse solcher Verbindungen hat sich nie als wahrscheinlich gezeigt, selbst auf der Grundlage theoretischer Überlegungen, die die chemischen Eigenschaften von Substraten für &beta;-Glucuronidase von E-coli berücksichtigen. Wie hier gezeigt, sind nicht alle Glucuronide Substrate für das &beta;-Glucuronidaseenzym von E. coli, und es wird nicht erwartet, daß die meisten Glucuronide Substrate für das GUS-Enzym sind.
  • Reaktionen im Pflanzengewebe, die das &beta;-Glucuronidasegen von E.coli exprimieren, wurden bereits als Verfahren zur Bewertung, ob bestimmte Glucuronide (einschließlich Pflanzenhormonvorläuferverbindungen) durch das Enzym in vivo hydrolysiert werden können (Jefferson, "The GUS gene fusion system as a versatile tool for agricultural molecular biology", Abstract aus International Congress on Genetic Manipulation in Plant Breeding, gehalten in Elsinore, Dänemark, 11.-16. September 1988), verwendet. Unglücklicherweise ist dieser Ansatz nicht möglich, wegen des Auftretens von starker endogener &beta;-Glucuronidaseaktivität in Pflanzengewebe (siehe z. B. Beispiel 3 unten, ebenso wie Hodal et al., "Detection, expression and specific elimination of endogenous &beta;-glucuronidase activity in transgenic and non-transgenic plants", im Druck in Plant Science). Das Auftreten dieser endogenen &beta;-Glucuronidaseaktivität bedeutet auch, daß es durch Anwendung des von Jefferson beschriebenen Verfahrens unmöglich ist zu bestimmen, ob die durch das Glucuronid verursachten Wirkungen auf Hydrolyse der Verbindung beruhen, oder ob sie durch die Tatsache erklärt werden können, daß das Glucuronid selbst aktiv ist. Um eine geeignete Verbindung für Selektionszwecke zu sein, muß eine Verbindung durch das GUS-Enzym aktiviert werden und auch ohne jegliche bedeutende Aktivität in der Glucuronidform sein.
  • Der oben beschriebene Assay kann verwendet werden, um auf Cytokininglucuronide zu durchsuchen, die durch ein gegebenes &beta;-Glucuronidaseenzym hydrolysiert werden können, hier am Beispiel des &beta;-Glucuronidaseenzyms von E. coli.
  • Es war ferner unter Verwendung von HPLC und DC festgestellt worden, daß unmodifizierte aktive Cytokinine das Produkt der GUS-Hydrolyse sind (siehe die Beispiele oben, die sich auf die Herstellung und Analyse neuartiger Cytokininglucuronidverbindungen beziehen). So wurde beispielsweise gefunden, daß die Hydrolyse von BA3GN-Natriumsalz durch &beta;-Glucuronidase von E. coli zu nahezu vollständiger (> 99%) Verschwinden des BA3GN-Natriumsalzes führte, wobei sich eine Verbindung ergab, die in einem 1 : 1-Gemisch mit authentischem BA cochromatographierte. Ähnlich konnte durch HPLC (50%iges isokratisches Methanol) gezeigt werden, daß Inkubation von ZOGN-Natriumsalz mit &beta;-Glucuronidase von E. coli eine nahezu vollständige Umwandlung zu trans-Zeatin ergibt; und es konnte durch DC (1 : 1, MeOH/Chloroform) gezeigt werden, daß Inkubation von IPBSGN- Natriumsalz mit &beta;-Glucuronidase für 24 Stunden fast vollständige (> 95%) Umwandlung von IPBSGN in eine Verbindung ergibt, die mit 8-Thio-(2-isopentenyl)adenin cochromatographiert.
  • Ähnlich können andere Arten von Glucuroniden auf ihre Fähigkeit, durch eine gegebene &beta;-Glucuronidase hydrolysiert zu werden, abgesucht werden. Beispielsweise konnte durch DC gezeigt werden, daß Inkubation von o-Cumaryl-&beta;-Dglucuronid (5 mg in 1 ml Puffer) für 12 Stunden mit &beta;-Glucuronidase (Sigma Typ G5897, 1000 Einheiten) eine 93,4%ige Umwandlung in eine Verbindung ergibt, die mit o-Cumarsäure cochromatographierte. Inkubation der anderen in Tabelle 1 aufgelisteten Verbindungen (mit Ausnahme der zwei Verbindungen, die nicht als Substrate für &beta;-Glucuronidase von E-coli wirkten) ergab ähnliche Ergebnisse, d. h. ergab Hydrolyseprodukte, die denen entsprachen, die nach der Hydrolyse durch &beta;-Glucuronidase zu erwarten waren (siehe die Beispiele oben, die sich auf die Herstellung verschiedener Glucuronidverbindungen beziehen). Auf der anderen Seite bewirkt BA9GN, das, wie in Tabelle 1 gezeigt, kein Substrat für &beta;-Glucuronidase von E-coli ist und keine nachweisbare (< 1%) Produktion von BA nach Inkubation für 18 h bei 37ºC mit &beta;-Glucuronidase zeigte, keine Keimbildung in Tabakblattscheiben (Tabelle 2 unten).
    • BEISPIEL 3 INDUKTION VON KEIMBILDUNG AUS PFLANZENIGEWEBE MIT UND OHNE EIN EINGEFÜHRTES &beta;-GLUCURONIDASEGEN DURCH CYTOKININGLUCURONIDE
  • Es wurden Experimente durchgeführt, um zu bestimmen, ob Cytokininglucuronide (sowie Cytokininglucuronamid) Keimbildung in vivo in Pflanzenmaterial mit beziehungsweise ohne ein eingeführtes &beta;-Glucuronidasegen bewirken können. Samen von einer GUS-negativen und einer GUS-positiven Tabakpflanze (Nicotiana tabacum 'Wisconsin 38') wurden auf MSO-Substrat (Murashige & Skoog Substrat ohne Hormone, beschrieben in Murashige & Skoog, Phvsiol. Plant. 15: 473497, 1962, erhältlich von Sigma, USA) gekeimt. Das GUS-positive Pflanzenmateriäl enthielt ein eingeführtes &beta;-Glucuronidasegen von E. coli (uidA), das durch den 35S Promoter des Blumenkohlmosaikvirus gesteuert wird, wie beispielweise von Jefferson et al., The EMBO Journal, Vol. 6, Nr. 13, S. 3901-3907, 1987 beschrieben. Die originalen, transgenen GUS-positiven Pflanzen wurden hergestellt unter Verwendung des herkömmlichen kanamycinbasierten negativen Selektionssystems, wie beispielweise durch Burow et al., Plant Molecular Bioloqy Reporter, Vol. 8(2), S. 124-139, 1990 beschrieben. GUS-positive Sämlinge wurden mittels des X-gluc- Assays wie unten in diesem Beispiel beschrieben, identifiziert.
  • Nach 4-5 Wochen wurden die oberen Teile der Pflanzen oder Keime auf ein neues MSO-Substrat übertragen, und dieses Vorgehen wurde bei Bedarf wiederholt. Auf diese Weise wurde das Pflanzenmaterial (sowohl das GUS-positive als auch das GUS-negative) als sterile Keimkultur aufrechterhalten (siehe Burow et al., Plant Molecular Bioloqy Reporter, Vol 8(2), S. 124-139, 1990). Aus den größten Blättern (3-5 Wochen alt) wurden Scheiben ausgestanzt und auf die unten angegebenen Substrate (Tabelle 2) übertragen. Das grundlegende verwendete Substrat war MSO, die verschiedenen Testverbindungen wurden bei verschiedenen Konzentrationen bis hin zu 250 uM zugegeben. Kleine Petrischalen ( = 5 cm), die 6 ml Substrat enthielten, wurden verwendet, auf jede Petrischale wurden 3 Blattscheiben gelegt. Jede Behandlung wurde mindestens 4mal wiederholt.
  • Es wurde gefunden, daß mehrere Cytokininglucuronide Keimbildung in Pflanzengewebe, das das &beta;-Glucuronidaseenzym enthält, induzieren. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle gezeigt: TABELLE 2 Keimbildung, herbeigeführt durch Cytokinin-&beta;-D-glucuronide (und ein Cytokininglucuronamid) auf Blattscheiben von Tabak mit (GUS+) oder ohne (GUS-) eingeführte &beta;-Glucuronidasegene
  • "+" bedeutet Keimbildung bei Konzentrationen unter 250 uM
  • "-" bedeutet keine Keimbildung bei Konzentrationen unter 250 uM (250 uM entspricht etwa 100 mg/ml)
  • Aus der obigen Tabelle kann ersehen werden, daß alle Cytokininglucuronide, die Keimbildung bei einer Konzentration unter 250 mM in Blattscheiben von Tabak, der ein eingeführtes &beta;-Glucuronidasegen enthielt, induzieren, auch Keimbildung bei Verwendung einer ähnlichen Konzentration in entsprechenden Blattscheiben, die kein eingeführtes &beta;-Glucuronidasegen enthielten, induzieren konnten. Auf der anderen Seite führte das Cytokininglucuronid BA9GN, von dem gezeigt wurde, daß es nicht als Substrat für &beta;-Glucuronidase von E. coli (siehe Beispiel 2) wirkt, nicht zu einer Keimbildung in Blattscheiben, entweder mit oder ohne ein eingeführtes &beta;-Glucuronidasegen. Jedoch wurde gefunden, daß das Cytokininglucuronamid BA3GNamid, das, wie in Beispiel 2 gezeigt, nicht als Substrat für &beta;-Glucuronidase von E. coli wirkte, Keimbildung sowohl in GUS-positiven als auch in GUS-negativen Blattscheiben induzierte, was zeigt, daß Cytokininglucuronamide in Pflanzengewebe in die entsprechenden Cytokininglucuronsäuren umgewandelt werden. So scheint es, daß Vorläuferverbindungen für Cytokininglucuronide in vivo auf die gleiche Weise wirken können wie die Cytokininglucuronide selbst.
  • Diese Ergebnisse zeigen, daß höhere Pflanzen, in diesem Fall Tabak, endogene &beta;-Glucuronidaseaktivität besitzen. Dieser Befund ist mit dem kürzlich durch Hu et al. (Plant Cell Reports 9, S. 1-5, 1990) berichteten, der das Auftreten GUS-ähnlicher Aktivität in 52 Arten von Samenpflanzen untersuchte, und mit den Befunden von Hodal et al. (im Druck in Plant Science) im Einklang. Hu et al. fanden heraus, daß Arten, die positive GUS-ähnliche Aktivitäten exprimieren, in jeder Schlüsselgruppe von Angiospermen, sowie in einigen der Gymnospermen verteilt sind. (Während Hu et al. keine GUS-Aktivität in Tabak feststellten, kann dieses Ergebnis durch die Tatsache erklärt werden, daß ihr Assay in vitro bei pH 7 durchgeführt wurde. Wie unten gezeigt, scheint das Enzym, das für die ursprüngliche GUS-Aktivität in Tabak verantwortlich ist, bei pH 7 nicht aktiv zu sein, aber es wurde gefunden, daß es bei pH 4-5 aktiv ist).
  • Diese Befunde stehen im Gegensatz zu dem, der in GB 2 197 653 A offenbart ist, der feststellt, daß höhere Pflanzen, einschließlich Tabak, keine nachweisbare &beta;-Glucuronidaseaktivität enthalten. GB 2 197 653 A, das sich unter anderem auf ein Verfahren bezieht, um Expression eines interessierenden Gens unter Verwendung des GUS-Gens zu überwachen, erklärt, daß das Vorkommen von GUS-Aktivität die Expression eines interessierenden Gens anzeigt, und impliziert damit, daß, da GUS- Aktivität in höheren Pflanzen nicht gefunden wird, es eine relativ einfache Sache ist, die Expression eines interessierenden Gens unter Verwendung des GUS-Gens zu überwachen. Jedoch zeigen die obigen Ergebnisse, daß dies nicht der Fall ist, und saß die Verwendung eines GUS-Gens zur Überwachung der Anwesenheit eines interessierenden Gens überhaupt nicht einfach oder klar ist, wegen der Tatsache, daß höhere Pflanzen tatsächlich eine bedeutende intrinsische (Hintergrund-) &beta;-Glucuronidaseaktivität enthalten.
  • Um die Natur der beobachteten GUS-Aktivität in Pflanzenmaterial mit und ohne ein eingeführtes &beta;-Glucuronidasegen zu untersuchen, wurde die pH-Abhängigkeit der GUS-Aktivität bestimmt, indem man einen standardisierten histochemischen GUS- Assay mit "X-gluc" (5-Brom-4-chlor-3-indolyl-&beta;-glucuronid) verwendete.
  • Der X-gluc-Assay kann durchgeführt werden, indem man zuerst ein Assaymedium herstellt, indem man 50 mg X-gluc in einer Lösung, die 25 ml 0,2 M NaPO&sub4;-Puffer, typischerweise pH 7,0, 24 ml destilliertes Wasser, 0,25 ml 0,1 M K&sub3;(Fe(CN)&sub6;), 0,25 ml 0,1 M K&sub4;(Fe(CN)&sub6;) und 0,5 ml 1,0 M Na&sub2;EDTA enthält, löst und anschließend bis zur Auflösung rührt (ungefähr 30 min). Frischgeschnittene oder formaldehydfixierte Abschnitte (Dicke kleiner 0,5 mm) oder Gewebe bei 37ºC werden dann in dem X-gluc-Medium für einige Minuten bis 24 Stunden inkubiert. Nach der Inkubation werden die Abschnitte in Natriumphosphatpuffer oder Wasser gespült und mikroskopisch untersucht. GUS-Aktivität zeigt sich als blaue Einfärbung des behandelten Pflanzenmaterials an der Stelle der Enzymaktivität (Jefferson, Plant Molecular Biology Reporter, Vol. 5, Nr. 4, S. 387-405, 1987). Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung wurden typischerweise Assayzeiten von 20 Stunden angewendet. Nach der Inkubation wurden die Scheiben mit 96%igem Ethanol behandelt, um Chlorophyll zu entfernen.
  • Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle gezeigt:
  • TABELLE 3
  • pH-Abhängigkeit der GUS-Aktivität in Tabakblattscheiben mit (+) und ohne (-) eingeführte GUS-Gene
  • 0: keine Reaktion im X-gluc-Assay
  • +: blaue Reaktion im X-gluc-Assay
  • Man kann sehen, daß das Enzym, das für die Hintergrund-&beta;-Glucuronidaseaktivität in den Tabakblattscheiben ohne ein eingeführtes &beta;-Glucuronidasegen verantwortlich ist, nur innerhalb eines engen pH-Bereichs, der dem inneren pH der Pflanzen entspricht (ungefähr pH 5), aktiv ist, während die &beta;-Glucuronidase, die durch das eingeführte Gen exprimiert wird, über einen großen pH-Bereich von 4 bis 8 aktiv ist. Diese pH-Abhängigkeit kann erklären, warum frühere Versuche, GUS-Aktivität in Pflanzen festzustellen, zum größten Teil nicht erfolgreich waren und zu der fälschlichen Annahme (z. B. in GB 2 197 653 A) führten, daß Pflanzen keine intrinsische GUS-Aktivität besitzen.
  • Die Tatsache, daß die oben für das Pflanzenmaterial ohne ein eingeführtes GUS- Gen gezeigte &beta;-Glucuronidaseaktivität wirklich das Ergebnis der Hydrolyse des Cytokininglucuronidsubstrats durch &beta;-Glucuronidase ist, und nicht das Ergebnis einer nichtspezifischen Reaktion, die das Substrat spaltet, z. B. eine nichtenzymatische saure Hydrolyse von Glucuroniden (die bekanntermaßen bei niedrigen pH-Werten gespalten werden), wurde gezeigt, indem die Wirkung von Inhibitoren verschiedener Enzyme bei pH 5 in nicht genetisch transformiertem Pflanzenmaterial (d. h. in Pflanzenmaterial, das nur ursprüngliche GUS-Aktivität besaß) getestet wurde. Der Test wurde unter Verwendung des oben beschriebenen X-gluc-Assays bei pH 5,0 für 20 Stunden durchgeführt.
  • TABELLE 4
  • Test von Inhibitoren bei pH = 5,0. Nichttransformiertes Material
  • 0 = keine Reaktion, d. h. vollständig weiße Blattscheibe
  • + = blaue Einfärbung mit X-gluc
  • Die sechs getesteten Inhibitoren haben die folgenden Wirkungen:
  • Saccharo-1,4-lacton ist ein Inhibitor, der spezifisch für &beta;-Glucuronidaseenzyme ist (mit anderen Worten, er hemmt nur &beta;-Glucuronidasen, und er hemmt alle &beta;-Glucuronidasen). Es ist allgemein anerkannt, daß GUS-Aktivität, die durch diese Verbindung gehemmt werden kann, aus der Wirkung eines &beta;-Glucuronidaseenzyms herrührt.
  • Gluconolacton ist ein Inhibitor von &beta;-Glucuronidasen. Er entspricht Saccharo-1,4- lacton mit der Ausnahme, daß er spezifisch für &beta;-Glucosidasen ist.
  • UDP-Glucuronid ist ein Substrat für UDP-Glucuronidtransferasen.
  • Glucuronsäure ist das Produkt jeder &beta;-Glucuronidasereaktion und deshalb ein Produktinhibitor von &beta;-Glucuronidasen und anderen glucuronsäurebildenden Enzymen.
  • Galaktose ist ein Inhibitor von UDP-glucuronidtransferase-abhängigen Reaktionen. Methylumbellipherylglucuronid ist ein Substrat für alle &beta;-Glucuronidasen, die bis jetzt untersucht sind, und ist so ein konkurrierender Inhibitor von GUS-Enzymen.
  • Da auch gefunden wurde, daß EDTA (das UDP-Glucuronidtransferasen inhibiert) keine Wirkung hat, ist es unwahrscheinlich, daß solche Transferasen in die beobachtete GUS-Aktivität einbezogen sind. Die obige Tabelle zeigt, daß jene Verbindungen, die ein Transferaseenzym inhibieren sollten, keine Wirkung, selbst bei sehr hohen Konzentrationen, haben. Es kann weiterhin gesehen werden, daß Gluconolacton keine hemmende Wirkung hat, und es ist deshalb unwahrscheinlich, daß die GUS-Aktivität mit einer &beta;-Glucosidaseaktivität zusammenhängt.
  • Weiterhin ist zu sehen, daß der GUS-spezifische Inhibitor Saccharo-1,4-lacton ein starker Inhibitor ist, daß Glucuronsäure (Produktinhibierung von &beta;-Glucuronidase) ein mittelstarker Inhibitor ist, und daß Methylumbellipherylglucuronid (ein GUS- Substrat und deshalb ein konkurrierendes Substrat zu X-gluc, wenn ein &beta;-Glucuronidaseenzym für die Hydrolyse von X-gluc verantwortlich ist) ein schwacher inhibitor ist. Die GUS-Aktivität in Tabak erfüllt deshalb alle nötigen Kriterien, um als Folge eines &beta;-Glucuronidaseenzyms eingestuft zu werden. Es kann deshalb die Schlußfolgerung gezogen werden, daß die Pflanzen ein &beta;-Glucuronidaseenzym enthalten.
  • Eine entsprechende Reihe von Versuchen wurde durchgeführt, um sicherzustellen, daß die Wirkung der Inhibitoren ausreichend schnell war, um das Enzym hemmen zu können. In dieser Reihe wurde das Pflanzenmaterial in den Testverbindungen (Inhibitoren) 24 Stunden lang vorinkubiert, bevor der X-gluc-Assay mit denselben Testverbindungen durchgeführt wurde. Die erhaltenen Ergebnisse waren identisch mit denen, die ohne Vorinkubation erhalten worden waren, was darauf hinweist, daß die Inhibitoren schnell genug in das Pflanzengewebe eindringen, um den X-gluc- Assay zu hemmen, bevor die blaue Einfärbung erscheinen kann.
  • Ergebnisse ähnlich den oben beschriebenen wurden in einer anderen Untersuchung des Auftretens von GUS-Aktivität in Pflanzen erhalten. In diesem Fall wurde die pH- Abhängigkeit der histologischen GUS-Reaktion in einer Anzahl von Pflanzenspezies bei pH-Werten zwischen 3 und 8, sowohl mit als auch ohne den GUS-spezifischen Inhibitor Saccharo-1,4-lacton, getestet.
  • Der angewendete Assay war der oben beschriebene X-gluc-Assay. Der Assay wurde bei 37ºC 20 Stunden lang durchgeführt. Blätter wurden zerlegt (mit sterilen Rasierklingen), so daß jedes Blatt bei einer Anzahl verschiedener pH-Werte getestet wurde.
  • Wie in der Tabelle unten gezeigt, bestätigte diese Untersuchung, daß Pflanzen in der Tat eine ursprüngliche GUS-Aktivität besitzen, daß diese Aktivität das Ergebnis einer enzymatischen Reaktion ist (keine Reaktion in Gegenwart des GUSspezifischen Inhibitors) und daß das Enzym in erster Linie bei pH-Werten von ungefähr 4-5 aktiv ist. TABELLE 5 Histologische GUS-Reaktion bei verschiedenen pH-Werten
  • 1) Blattgewebe, das das GUS-Gen von E. coli exprimiert
  • 2) Transgenes Blattgewebe, das nur Kanamycinresistenz enthält
  • 3) Halm- oder Stengelgewebe
  • 4) Embryogenes Kallusgewebe
  • + Blaue Reaktion
  • (+) Geringe Häufigkeit der GUS-Aktivität (schwache blaue Reaktion)
  • 0 keine Reaktion
  • n nicht bestimmt
  • Die Tatsache, daß Pflanzen eine allgemeine intrinsische GUS-Aktivität haben, macht es möglich, ein Gen, das Glucuronidpermease codiert, als positives Selektionsgen zu verwenden, ohne irgendein anderes Selektionsgen zu verwenden, indem man einen Vorteil aus der gesteigerten Aufnahme einer Glucuronidverbindung durch transformierte Zellen zieht. Es wurde beispielsweise gefunden, daß Glucuronide nicht einfach durch Plasmamembranen hindurch in Pflanzenzellen aufgenommen werden. Wenn ein Glucuronidpermeasegen in eine Zelle eingeführt wird, werden die Glucuronide jedoch einfacher die Plasmamembran durchdringen und in die Zelle eindringen können. Die Glucuronide sind dann für Spaltung durch das intrinsische GUS-Enzym in den transformierten Zellen verfügbar. Im Gegensatz dazu ist das fragliche Glucuronid nicht für nichttransformierte Zellen verfügbar, wodurch eine positive Selektionswirkung erzielt wird. Ähnlich kann positive Selektion auch durchgeführt werden, indem man andere Permeasen und andere Verbindungstypen verwendet, die entweder in den transformierten Zellen durch ein intrinsisches Enzym aktiviert werden, oder die anders eine biologische Wirkung in den transformierten Zellen, in die sie transportiert werden, ausüben.
    • BEISPIEL 4 CYTOKININGLUCURONIDE SIND STABIL UND INAKTIV
  • Die Wirkung des Cytokininglucuronids BA3GN-Natriumsalzen ist blockiert, wenn die GUS-Aktivität in dem Pflanzengewebe, das dieses Cytokininglucuronid enthält, gehemmt ist. Mit anderen Worten, das Cytokininglucuronid ist selbst inaktiv. Weiterhin wurde gezeigt, daß das Cytokininglucuronid sowohl in dem Wachstumsmedium als auch in Pflanzengewebe stabil ist, wenn &beta;-Glucuronidase nicht anwesend ist, wie durch die Tatsache gezeigt wird, daß der spezifische GUS-Inhibitor, Saccharo-1,4- lacton (SL), Keimbildung, die durch das Cytokininglucuronid BA3GN-Natriumsalz hervorgerufen wird, stark hemmt, Keimbildung durch das freie Cytokinin BA (unter Verwendung der grundlegenden Methode, die oben in Beispiel 3 beschrieben ist), aber nur schwach hemmt: TABELLE 6 Hemmung der Keimbildung, induziert durch BA (0,5 mg/l) und BA3GN-Natriumsalz (15 mg/l) durch Saccharo-1,4-lacton
  • Durch Vergleich der Ergebnisse der obigen Tabelle mit den oben in Tabelle 2 angegebenen kann man sehen, daß das BA3GN-Natriumsalz, das Keimbildung sowohl in GUS-positiven als auch GUS-negativen Tabakblattscheiben induziert, keine Keimbildung in entsprechenden Blattscheiben in Gegenwart des &beta;-glucuronidasespezifischen Inhibitors Saccharo-1,4-lacton induziert.
  • Saccharo-1,4-lacton (SL) ist bei dem in diesem Beispiel verwendeten pH keine stabile Verbindung. Es besteht ein Gleichgewicht zwischen SL und Zuckersäure (SA). Dieses Gleichgewicht wird nur langsam erreicht, und der Umwandlung von SL zu SA folgt ein Abfall im pH. Der pH muß deshalb vor der Verwendung von SL während der Dauer einer Woche mehrmals eingestellt werden, bis sich der pH in dem SL-enthaltenden Substrat stabilisiert hat.
  • Die Tatsache, daß Cytokininglucuronide stabil und inaktiv sind, wenn keine &beta;-Glucuronidase anwesend ist, wird weiter durch die Tatsache gezeigt, daß BA9GN, das nicht durch &beta;-Glucuronidase hydrolysiert werden kann, keine Keimbildung in Pflanzenmaterial induzieren kann, das &beta;-Glucuronidaseaktivität enthält (siehe Beispiele 2 und 3).
  • Es ist wichtig, daß die Cytokininglucuronidverbindungen in Substraten, die kein &beta;-Glucuronidaseenzym enthalten, inaktiv und stabil sind, da diese Stabilität eine Voraussetzung für das richtige Funktionieren des positiven Selektionssystems, das sie benutzt, ist.
  • Man kann jedoch nicht von allen Glucuronsäurederivaten erwarten, daß sie stabil sind. Beispielsweise sind Esterglucuronide in Pflanzengewebe, das nichtspezifische Esterasen enthält, nicht stabil. Das heißt, daß die Cytokininglucuronidverbindungen, die gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt und verwendet werden (&beta;- Glucuronide, gekoppelt an das Aglykon über glycosidische O-, S- und N-Atome), die Voraussetzung für Stabilität erfüllen. Auf der anderen Seite kann man von Verbindungen, die andere Typen von Glucuronidbindungen haben, z. B. Amid- oder Ester-&beta;-D-glucuronide, wegen des Auftretens nichtspezifischer Esterasen und Amidasen in Pflanzen nicht erwarten, daß sie selektiv durch &beta;-Glucuronidasen hydrolysiert werden.
  • Unter Bezug auf Beispiel 3 oben wurde so gezeigt, daß die getesteten Cytokininglucuronide, die, wie in diesem Beispiel gezeigt, selbst keine Cytokininaktivität besitzen, in vivo durch das Wirken von &beta;-Glucuronidase - entweder in Form von endogener Hintergrund-&beta;-Glucuronidase oder als Ergebnis eines eingeführten &beta;-Glucuronidasegens - gespalten werden, wodurch freies Cytokinin freigesetzt wird.
    • BEISPIEL 5 INDUKTION VON KEIMBILDUNG AUS PFLANZENGEWEBE, DAS EIN EINGEFÜHRTES &beta;-GLUCURONIDASEGEN ENTHÄLT, UNTER VERWENDUNG VON STEROLGLUCURONIDEN
  • Es wurde gezeigt, daß andere Glucuronide, einschließlich Glucuronide von Sterolen, Glycyrrhizinsäure und Hydroxychinolin, durch &beta;-Glucuronidase hydrolysiert werden und zu einer Keimbildung auf modifizierten Substraten, in denen die Hydrolyseprodukte für Keimbildung wesentlich sind, führen. Dies ist in den Beispielen 5 und 6 gezeigt.
  • Es wurden Versuche durchgeführt, um die keimauslösende Wirkung zweier Sterolglucuronide, &beta;-Sitosteryl-&beta;-D-glucuronid (SG) und Cholesteryl-&beta;-D-glucuronid (CG) zu bestimmen, wenn die Sterolsynthese in den Geweben gehemmt ist. Die grundlegenden angewendeten Verfahren entsprechen im wesentlichen denen, die für Beispiel 3 oben beschrieben sind. Zusätzlich zu einem oder beiden der oben erwähnten Sterolglucuronide enthielt das Substrat jedoch 0,1 mM Tridemorph und 5 mg/l BA3GN-Natriumsalz. Die Anzahl der Keime wurde nach 30 Tagen erfaßt. Tridemorph (4-Tridecyl-2,6-dimethylmorpholin) ist ein Fungizid, das die Synthese von Sterolen und ähnlichen Verbindungen hemmt. Tridemorph hat eine hemmende Wirkung auf die Neubildung von Keimen (obwohl es keine verheerenden Wirkung auf die Explantate hat), wenn das Pflanzengewebe nicht mit Sterolen versorgt wird. So sollte, in Abwesenheit freier Sterole, Keimbildung wirkungsvoll verhindert werden.
  • CG wurde von Sigma, USA, bezogen, und SG wurde nach der Vorgehensweise, die durch Ando et al. in J. Antibiotics 73, S. 408, 1970, beschrieben ist, dargestellt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle gezeigt: TABELLE 7 Neugebildete Keime pro Tabakblattscheibe auf Substraten, die mit Tridemorph (0,1 mM) und BA3GN-Natriumsalz (5 mM) versehen wurden
  • Die obige Tabelle zeigt, daß Sitosteryl-&beta;-D-glucuronid der keimhemmenden Wirkung von Tridemorph entgegenwirken kann und daß die Kombination von Sitosteryl-&beta;-Dglucuronid und Cholsteryl-&beta;-D-glucuronid die stärkste Keimbildung ergibt. So ist positive Selektion gemäß der Erfindung unter Verwendung eines eingeführten &beta;-Glucuronidasegens möglich, wenn man beispielsweise eine oder beide der obigen Sterolglucuronidverbindungen zusammen mit einer keimhemmenden Verbindung wie Tridemorph verwendet. Diese Ergebnisse zeigen an, daß auch andere Sterole und sterolähnliche Verbindungen für die positive Selektion von Gewebe, das ein eingeführtes &beta;-Glucuronidasegen enthält, verwendet werden können.
  • Ein Vorteil der Verwendung dieser sehr schwach löslichen Verbindungen für positive Selektion ist, daß ihre Wirkung vermutlich sehr lokal ist, da die Verbindungen nicht von Zelle zu Zelle diffundieren, wenn der hydrophile Glucuronidteil durch ein &beta;-Glucuronidaseenzym abgespalten wird. Mit anderen Worten, diese Verbindungen können verwendet werden, um 'cross feeding' während des Selektionsvorgangs zu verhindern.
  • Dieser Versuch zeigt weiterhin, daß dem keimhemmenden Effekt von Tridemorph, und so auch anderer Verbindungen, die Sterolsynthese hemmen, durch Zugabe von Sterolen und Sterolderivaten zu dem Substrat entgegengewirkt werden kann, wodurch ein Selektionssystem, das darauf basiert, daß transgene Zellen mit Sterolen und sterolähnlichen Verbindungen versehen werden, mit den oben erwähnten Vorteilen hergestellt werden kann.
    • BEISPIEL 6 INDUKTION VON KEIMBILDUNG VON PFLANZENGEWEBE MIT UND OHNE EIN EINGEFÜHRTES &beta;-GLUCURONIDASEGEN UNTER VERWENDUNG VON SITOSTERYL-&beta;-D-GLUCURONID
  • Ein Versuch, ähnlich dem in Beispiel 5 beschriebenen, wurde sowohl an transformierten als auch an nichttransformierten Tabakblattscheiben unter Verwendung von Sitosteryl-&beta;-D-glucuronid und entweder BA oder BA3GN-Natriumsalz durchgeführt.
  • Die verwendeten Verfahren waren im wesentlichen die oben in Beispiel 5 beschriebenen. In diesem Versuch wurde dem Substrat Tridemorph in einer Konzentration von 0,1 mM zugegeben, und Sitosteryl-&beta;-D-glucuronid wurde in einer Konzentration von 121 mg/l zugegeben. Das Substrat enthielt zusätzlich entweder 1,88 mg/l BA3GN-Natriumsalz oder 0,1 mg/l BA. Die Anzahl Keime wurde nach 40 Tagen festgestellt.
  • Die Anzahl der erhaltenen Keime war wie folgt:
  • Neugebildete Keime pro Blattscheibe
  • Man kann sehen, daß, wie es auch in Beispiel 5 oben der Fall war, die Gegenwart von Sitosteryl-&beta;-D-glucuronid der keimhemmenden Wirkung von Tridemorph entgegenwirken konnte. Weiterhin wurde, wenn Sitosteryl-&beta;-D-glucuronid und Tridemorph zusammen mit dem BA3GN-Natriumsalz verwendet wurden, eine selektive Keimbildung in den GUS-positiven Blattscheiben erhalten, während die GUS-negativen Blattscheiben auf dem Substrat, das BA3GN-Natriumsalz enthielt, nahezu keine Keimbildung hatten.
  • Diese Ergebnisse zeigen auch, daß die Verwendung einer Kombination verschiedener Glucuronide (hier BA3GN und SG anstelle von BA und SG) die selektive Reaktion von den transgenen Geweben verbessern kann.
  • Da Sterole und Steroide auch wichtige Wachstumsregulatoren in tierischen Zellen sind, können entsprechende Selektionsvorgänge auch für die Selektion von tierischen Zellen, die &beta;-Glucuronide exprimieren, verwendet werden.
    • BEISPIEL 7 ENTWÄFFNETE AGROBACTERIUMSTÄMME PRODUZIEREN CYTOKININE
  • Es wurde gefunden, daß bestimmte Agrobacterium-Stämme Keimbildung durch die Produktion keimbildender Substanzen während der Cokultivierung induzieren können. Solche Stämme sollten normalerweise vermieden werden, wenn GUS- Hydrolyse von Cytokininglucuroniden für die Zwecke der Selektion genetisch transformierter Zellen verwendet werden soll, da diese Stämme allein Keimbildung hervorrufen können und deshalb mit dem Selektionsprozeß interferieren.
  • Als Beispiel zeigt die Tabelle unten die Ergebnisse eines Versuchs mit zwei verschiedenen Agrobacterium-Stämmen, von denen einer Keimbildung auf Tabakblattscheiben nach Cokultivierung induziert.
  • Die verwendeten Methoden entsprechen im wesentlichen den in Beispiel 13 beschriebenen, aber nach Cokultivierung wurden die Blattscheiben auf MSO- Substrat ohne Hormone, das 300 mg/l Cefotaxim und 300 mg/l Carbenicillin enthielt, übertragen.
  • Die Anzahl neugebildeter Keime wurde 4 Wochen nach Cokultivierung festgestellt. TABELLE 8 Induktion von Keimbildung auf Tabakblattscheiben auf einem hormonfreien Substrat nach Cokultivierung mit entwaffnetem Agrobacterium
  • Man sieht, daß die keimauslösenden Eigenschaften einiger der Agrobakterium- Stämme von den Genen, die in der T-DNA enthalten sind, nicht abhängig sind. Das heißt, daß Gene außerhalb der T-DNA-Region für die Keimauslösung verantwortlich sind.
  • Ein Gen außerhalb der T-DNA-Region, das für die Cytokininproduktion verantwortlich ist, wurde tzs genannt (Morris, R. O. Ann. Rev. Plant Physiol. 37, S 509-538, 1986). Stamm C58 enthält das tzs-Gen, ein nichttransferierbares Gen, das für die Synthese von Zeatin während Cokultivierung codiert. Stamm LBA4404 enthält das tzs-Gen nicht. Die Tatsache, daß die keimauslösenden Stämme ein Plasmid enthalten, das das tzs-Gen enthält, zeigt, daß dieses Gen für die keiminduzierenden Eigenschaften, die in diesen Untersuchungen beobachtet wurden, verantwortlich sein kann und daß Stämme von Agrobacterium, die das tzs-Gen enthalten, in cytokininbasierten Selektionssystemen vermieden werden sollten. Jegliche anderen Aarobacterium-Stämme, die Keimbildung hervorrufen, sollten normalerweise auch vermieden werden.
    • BEISPIEL 8 POSITIVE SELEKTION TRANSGENER KEIME UNTER VERWENDUNG DES CYTOKININGLUCURONIDS BA3GN-NATRIUMSALZ
  • Genetisch transformierte Keime können unter Verwendung von Cytokininglucuroniden selektiert werden.
  • Eine Reihe von Versuchen wurde durchgeführt, um die Wirksamkeit des positiven Selektionssystems unter Verwendung des Cytokininglucuronids BA3GN-Natriumsalz in Konzentrationen von 7,5 und 15 mg/l zu testen. Die Versuche wurden an Wildtyp- Tabakblattscheiben durchgeführt unter Verwendung von 2 verschiedenen Agrobacterium-Stämmen sowie verschiedener Cokultivierungssubstrate. Das verwendete Transformationsverfahren war das, das unten in Beispiel 13 beschrieben ist, mit der Ausnahme, daß Gamborg B5 Substrat (Gamborg et al., Exp. Cell Res. 50 : 151-158, 1968; erhältlich von Sigma, USA) anstelle von MSO verwendet wurde. Die unten angegebenen Ergebnisse sind Durchschnittswerte, die auf zwei unabhängigen Experimenten basieren, von denen jedes an 27 Blattscheiben pro Behandlung durchgeführt wurde. TABELLE 9 Positive Selektion genetisch transformierter Keime unter Verwendung von Cytokininglucuronid BA3GN-Natriumsalz 7,5 mg/l Natriumsalz von BA3GN 15 mg/l BA3GN-Natriumsalz
  • B5: Gamborg B5-Substrat, pH 5,4
  • Ammon.: Cokultivierungssubstrat mit 75 mmol Ammoniumnitrat
  • SL Cokultivierung mit 25 mmol Zuckersäure + 25 mmol Saccharo-1,4- lacton aus einer stabilisierten Lösung
  • GUS+: Keime, die GUS-Aktivität exprimieren, wenn bei pH 7 wie in Beispiel 3 beschrieben getestet
  • Stamm BS10 führt ein GUS-Gen ein, das von einem modifizierten 35S-Promoter gesteuert wird, der in Agrobacterium nicht aktiv ist, wie von Janssen & Gardner in Plant Molecular Biolociv, 14, S. 61-72, 1989, beschrieben. Stamm LDH1 führt ein GUS-Gen ein, das von dem nichtmodifizierten 35S-Promoter gesteuert wird.
  • Die Ergebnisse in Tabelle 9 zeigen, daß positive Selektion transgener Keime, die ein eingeführtes &beta;-Glucuronidasegen exprimieren, unter Verwendung von BA3GN- Natriumsalz möglich ist. Diese Ergebnisse sind sehr bedeutend und waren unerwartet, da man, wie in Beispiel 3 beschrieben, gefunden hatte, daß Cytokininglucuronide Keimbildung in Blattscheiben, die kein eingeführtes &beta;-Glucuronidasegen enthalten, induzieren können. Die verschiedenen Behandlungen während der Kokulvierung scheinen keinen bedeutende Wirkung auf die Selektion zu haben.
  • Die oben gezeigten Ergebnisse zeigen auch, daß die Verwendung eines Agrobacterium-Stamms mit einem aktiven &beta;-Glucuronidasegen (Stamm LDH1 exprimiert GUS-Aktivität in Bakterien) das Transformationssystem nicht beeinträchtigt, verglichen mit einem Stamm, der kein aktives &beta;-Glucuronidasegen hat (Stamm BS10 exprimiert keine GUS-Aktivität in Bakterien).
    • BEISPIEL 9 SELEKTION GENETISCH TRANSFORMIERTER KEIME UNTER VERWENDUNG DES CYTOKININGLUCURONIDS ZEATIN-O-&beta;-GLUCURONSÄURE
  • Unter Anwendung des im wesentlichen gleichen Verfahrens wie in Beispiel 13 beschrieben, wurden transgene Tabakkeime präpariert und unter Verwendung des Cytokininglucuronids Zeatin-O-&beta;-glucuronsäure (ZOGN) als positives Selektionsreagens selektiert.
  • Cokultivierung wurde 3 Tage lang durchgeführt, wobei die Impfkulturdichte einer OD von 1,5 bei 660 nm entsprach. Das nach der Cokultivierung verwendete Substrat war MSO, das 300 mg/l Carbenicillin, 300 mg/l Cefotaxim und 0,1 mg/l Indolessigsäure (IAA) enthielt. Die Subkultivierung nach 3 Wochen erfolgte auf das gleiche Substrat, aber ohne IAA. Der pH in allen Substraten in diesem Beispiel war 8,0. 18 Blattscheiben wurden für jede Behandlung verwendet.
  • Fünf Wochen nach der Cokultivierung wurden die Keime auf ein MSO-Substrat übertragen, das 200 mg/l Kanamycinsulfat, 32 mM Zuckersäure, 300 mg/l Cefotaxim und 300 mg/l Carbenicillin enthielt, pH 8,0. Zuckersäure, ein Inhibitor von &beta;-Glucuronidaseenzymen, wurde zugegeben, um weitere Umwandlung von Zeatinglucuronid in Zeatin zu stoppen. Zusammen mit dem &beta;-Glucuronidasegen wurde ein NPT-Gen, das Resistenz auf Kanamycin liefert, mitübertragen.
  • Nichttransformierte Keime (negative Kontrollen) überlebten, aber das Wachstum dieser Keime war auf diesem Substrat verzögert, während alle transformierten Keime (positive Kontrollen), die ein aktives NPT-Gen enthielten, ohne jede Wachstumsverzögerung überlebten.
  • Die Anzahl an Keimen wurde festgestellt, und die Anzahl GUS-positiver Keime unter der Gesamtzahl von Keimen wurde durch den X-gluc-Assay (Beispiel 3) 3 Wochen nach der letzten Subkultivierung (8 Wochen nach Cokultivierung) bestimmt. Die Ergebnisse sind unten gezeigt: TABELLE 10 Positive Selektion genetisch transformierter Keime unter Verwendung des ZOGN- Natriumsalzes
  • * SL: 2 mM Saccharo-1,4-lacton
  • Die in der obigen Tabelle angegebenen Ergebnisse zeigen, daß eine erfolgreiche positive Selektion genetisch transformierter Keime unter Verwendung von ZOGN erreicht wurde. Die Induktion transgener Keime wurde gehemmt, wenn dem Substrat der &beta;-glucuronidasespezifische Inhibitor Saccharo-1,4-lacton zugegeben wurde, was zeigt, daß das Wachstum transgener Keime und somit der Erfolg der positiven Selektion von der &beta;-glucuronidasekatalysierten Umwandlung von ZOGN in Zeatin abhängig war.
    • BEISPIEL 10 SELEKTION GENETISCH TRANSFORMIERTER KEIME UNTER VERWENDUNG VON ZEATIN-O-&beta;-GLUCURONSÄURE BEI VERSCHIEDENEN TEMPERATUREN
  • Die Temperaturabhängigkeit des positiven Selektionssystems unter Verwendung von Cytokininglucuroniden wurde unter Verwendung von Zeatin-O-&beta;-glucuronsäure (ZOGN) als positives Selektionsreagens bei 25ºC, 30ºC und 35ºC untersucht.
  • Transgene Tabakkeime wurden unter Verwendung des im wesentlichen gleichen Verfahrens wie unten in Beispiel 13 beschriebenen, präpariert. Cokultivierung wurde 3 Tage lang ausgeführt, wobei die Impfkulturdichte einer OD von 1,5 bei 660 nm entsprach. Das Substrat, das nach Cokultivierung verwendet wurde, war MSO, das 10 mg/l 2-(2-Hydroxyethylamino)-6-benzylamino-9-methylpurin (9-met), 350 mg/l Carbenicillin, 350 mg/l Cefotaxim und 0,1 mg/l, Indolessigsäure (IAA) und ZOGN- Natriumsalz wie angegeben enthielt. 9-met (bezogen von Apex Organics Ltd., UK) wurde zugegeben, um Glycosylierung von Zeatin und Zeatinderivaten zu hemmen. 18 Blattscheiben wurden für jede Behandlung verwendet.
  • Sieben Wochen nach der Cokultivierung wurden die Keime auf ein MSO-Substrat, das 300 mg/l Kanamycinsulfat, 350 mg/l, Cefotaxim, 350 mg/l Carbenicillin, 0,1 mg/l IAA und 10 mg/l 6-(m-Hydroxybenzylamino)purin (OH-BA) enthielt, übertragen und bei einer Temperatur von 25ºC stehengelassen. OH-BA kann wie von Kaminek et al. (Plant Growth Rep. 6, S. 113-120, 1987) beschrieben, hergestellt werden.
  • Nach sechs Wochen auf dem kanamycinhaltigen Substrat wurde die Anzahl grüner Keime festgestellt. Resistenz auf Kanamycin zeigt an, daß der Keim transgen ist, weil zusammen mit dem &beta;-Glucuronidasegen ein NPT-Gen, das Kanamycinresistenz liefert, mitübertragen wurde. Keine nichttransformierten Keime (negative Kontrollen) überlebten auf diesem Substrat, während alle transformierten Keime (positive Kontrollen), die ein aktives NPT-Gen enthielten, überlebten.
  • Der Prozentanteil kanamycinresistenter Keime unter der Gesamtzahl neugebildeter Keime wurde berechnet als Anzahl grüner Keime, die auf dem kanamycinhaltigen Substrat überlebten, dividiert durch die Anzahl an Keimen, die auf das kanamycinhaltige Substrat übertragen wurden. Die Ergebnisse sind in der Tabelle unten gezeigt: TABELLE 11 Positive Selektion genetisch transformierter Keime unter Verwendung von ZOGN- Natriumsalz bei verschiedenen Temperaturen
  • Der Bioassay, der in diesem Beispiel beschrieben ist, wurde an einem verknüpften, mitübertragenen Gen durchgeführt. Das heißt, daß das &beta;-Glucuronidasegen für die Selektion verwendet wird, während die Resistenz, die das Ergebnis des eingeführten, mitübertragenen NPT-Gens (Kanamycinresistenzgen) ist, geprüft wird. Die Ergebnisse oben zeigen, daß zusätzlich zu dem &beta;-Glucuronidasegen ein mitübertragenes Gen auch exprimiert wird, wenn die Selektion unter Verwendung des &beta;-Glucuronidasegens durchgeführt wird. Zusätzlich kann man sehen, daß Selektion bei erhöhten Temperaturen (d. h. ungefähr 30-35ºC) die Selektion von Keimen pro Blattscheibe und auch den Anteil transgener Keime pro Blattscheibe unter der Gesamtzahl neugebildeter Keime verbessert.
  • Durch Durchführung des X-gluc-Assays bei verschiedenen Temperaturen wurde im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung beobachtet, daß die intrinsische &beta;-Glucuronidaseaktivität, die in Pflanzen auftritt, bei hohen Temperaturen gehemmt ist, während die eingeführte &beta;-Glucuronidaseaktivität nicht betroffen ist. Es wurde so herausgefunden, daß die intrinsische &beta;-Glucuronidaseaktivität mit zunehmenden Temperaturen bis zu etwa 60ºC allmählich abnahm, wobei bei dieser Temperatur im wesentlichen keine intrinsische &beta;-Glucuronidaseaktivität (wie mittels X-gluc-Assay bestimmt) da war. Dies kann die Verbesserung des Selektionsverfahrens bei erhöhten Temperaturen erklären.
    • BEISPIEL 11 POSITIVE SELEKTION VERGLICHEN UND KOMBINIERT MIT NEGATIVER SELEKTION
  • Es konnte gezeigt werden, das das hierin beschriebene positive Selektionssystem verglichen mit herkömmlicher kanamycinbasierter negativer Selektion sehr leistungsfähig und vorteilhaft ist. Es werden jedoch auch gute Ergebnisse erzielt, wenn das positive Selektionssystem zusammen mit herkömmlicher negativer Selektion angewendet wird.
  • So zeigt die Tabelle unten die Ergebnisse ausgedrückt als Anzahl GUS-positiver Tabakkeime pro Blattscheibe und als Prozentanteil GUS-positiver Keime unter der Gesamtzahl von Keimen, für positive Selektion unter Verwendung des BA3GN- Natriumsalzes, herkömmliche negative Selektion unter Verwendung von Kanamycin und BA, sowie positive Selektion und negative Selektion in Kombination. Zusätzlich beinhaltete der Versuch Selektion unter Verwendung des BA3GN-Natriumsalzes zusammen mit Saccharo-1,4-lacton (SL) (ein stark spezifischer Inhibitor der eingeführten &beta;-Glucuronidase).
  • Die verwendeten Verfahren waren im wesentlichen die gleichen wie unten in Beispiel 13 beschrieben, aber es wurde Gamborg B5 Substrat anstelle von MSO- Substrat verwendet. TABELLE 12 Positive Selektion kombiniert mit negativer Selektion
  • * Natriumsalz
  • ** Konzentrationen in mg/l
  • Der Versuch mit BA zusammen mit Kanamycin, welches das herkömmliche negative Selektionssystem ist, wurde als zwei unabhängige Versuche mit 54 Blattscheiben pro Versuch wiederholt. Ein einziger GUS-positiver Keim wurde unter einer Gesamtzahl von 23 selektierten Keimen gefunden. Die Ergebnisse für das BA3GN- Natriumsalz wurden unter Verwendung von 324 Blattscheiben erhalten. Der Versuch mit SL (Saccharo-1,4-lacton) wurde einmal mit insgesamt 162 Blattscheiben durchgeführt.
  • Die obige Tabelle zeigt, daß positive Selektion unter Verwendung von 15 mg/l BA3GN-Natriumsalz (ohne Kanamycin) 30mal mehr GUS-positive Keime pro Blattscheibe ergab als das herkömmliche negative Selektionssystem unter Verwendung von 1 mg/l BA und 300 mg/l Kanamycinsulfat. Weiterhin war ein größerer Prozentanteil der Gesamtzahl an Keimen GUS-positiv, wenn positive Selektion angewendet wurde (7,4%), als wenn negative Selektion angewendet wurde (4,3%).
  • Vorteilhafte Ergebnisse wurden auch erhalten, wenn eine Kombination von positiver und negativer Selektion angewendet wurde, d. h. indem ein Cytokinin in dem herkömmlichen kanamycinbasierten negativen Selektionssystem durch ein Cytokininglucuronid (BA3GN-Natriumsalz) ersetzt wurde. So war, wenn 15 mg/l BA3GN-Natriumsalz mit 300 mg/l Kanamycinsulfat kombiniert wurden, der Prozentanteil GUS-positiver Keime 11 mal so groß wie der, der unter Verwendung von BA und Kanamycin erhalten wurde, und wenn 15 mg/l BA3GN-Natriumsalz mit 33 mg/l Kanamycinsulfat kombiniert wurden, war die Anzahl GUS-positiver Keime pro Blattscheibe 40mal so groß wie die, die unter Verwendung von BA und Kanamycin erhalten wurde.
  • Wenn 15 mg/l, BA3GN-Natriumsalz mit 10 mM des GUS-Inhibitors SL kombiniert wurden, waren sowohl die Anzahl GUS-positiver Keime pro Blattscheibe als auch der Prozantanteil GUS-positiver Keime drastisch vermindert, verglichen damit, wenn nur 15 mg/l BA3GN-Natriumsalz verwendet wurden. Das zeigt, daß das eingeführte GUS-Gen für die vorteilhaften Ergebnisse verantwortlich ist, die unter Verwendung des positiven Selektionssystems erhalten wurden, da die Zugabe von SL zum Wachstumsmedium die &beta;-glucuronidasekatalysierte Umwandlung von inaktivem Cytokininglucuronid (BA3GN-Natriumsalz) in aktives Cytokinin in Zellen, die auf diesem Substrat gewachsen sind, stark hemmt und dadurch zu dem beobachteten Rückgang in der Anzahl induzierter Keime führt. Das positive Selektionssystem funktioniert also wie beabsichtigt, d. h. unter Verwendung einer eingeführten &beta;- Glucuronidase, um ein Cytokininglukuronid in genetisch transformierten Zellen zu spalten und dabei freies Cytokinin in diesen Zellen freizusetzen und zu Keimbildung zu führen.
    • BEISPIEL 12 MODIFIZIERUNG DES POSITIVEN SELEKTIONSSYSTEMS ZUR VERBESSERUNG DER SELEKTIVEN WIRKUNG DER CYTOKININGLUCURONIDE
  • Es wurde bereits gezeigt (siehe Tabelle 3, Beispiel 3), daß die natürlich auftretende &beta;-Glucuronidase in Pflanzen bei relativ hohen pH-Werten inaktiv ist, d. h. bei pH- Werten von ungefähr 6 oder mehr, während die eingeführte &beta;-Glucuronidase bis zu pH 8 aktiv ist. Durch Zugabe einer Verbindung, die die den inneren pH der Zellen erhöhen kann, beispielsweise Ammoniumnitrat, zum Wachstumsmedium kann die selektive Keimbildung der GUS-positiven Zellen weiter verbessert werden, da es dadurch möglich wird, jegliche Hintergrund-&beta;-Glucuronidaseaktivität, die die Folge natürlich auftretender &beta;-Glucuronidase in den nichttransformierten Zellen ist, zu blockieren.
  • Die Tabelle unten zeigt die Anzahl an Keimen, die von GUS-positiven und GUSnegativen Tabakblattscheiben unter Verwendung verschiedener Konzentrationen von BA3GN-Natriumsalz und Ammoniumnitrat erhalten wurden. Die verwendeten Verfahren waren die gleichen wie die in Beispiel 3 beschriebenen, mit der Ausnahme, daß Gamborg B5-Substrat anstelle von MSO-Substrat verwendet wurde. TABELLE 13 Wirkung von Ammoniumnitrat auf selektive Keimbildung von mit BA3GN-Natriumsalz behandelten Blattscheiben (pH = 7) Keimbildung (Anzahl an Keimen und Selektivitätsfaktor*) in GUS+ und GUS- Blattscheiben
  • * Der Selektivitätsfaktor ist die Anzahl GUS-positiver Keime dividiert durch die Anzahl GUS-negativer Keime und gibt so einen Hinweis auf die Selektivität einer gegebenen Behandlung.
  • ** Natriumsalz
  • Man kann sehen, daß die Verwendung von sowohl BA3GN-Natriumsalz als auch Ammoniumnitrat in entsprechenden Konzentrationen zu selektiver Keimbildung in den GUS-positiven Blattscheiben führt. Zum Beispiel ergab eine Kombination von 15 mg/l BA3GN-Natriumsalz und 55 mM Ammoniumnitrat 34 Keime von den GUSpositiven Blattscheiben, während an entsprechenden GUS-negativen Blattscheiben, die derselben Behandlung ausgesetzt waren, keine Keime gebildet wurden.
  • Eine andere Möglichkeit, die Selektivität des positiven Selektionssystems unter Verwendung von Cytokininglucuroniden zu verbessern, ist, dem Wachstumsmedium ein Substrat hinzuzufügen, das nach Spaltung durch &beta;-Glucuronidase zu einem pH- Anstieg führt und dadurch die Hydrolyse von Cytokininglucuroniden in den nichttransformierten Zellen hemmt, ohne die Wirkung von freiem Cytokinin zu hemmen.
  • Dieses Prinzip wurde in einem Versuch zur Wirkung verschiedener Konzentrationen von o-Cumaryl-&beta;-D-glucopyranuronsäure (CouGN) auf Keimbildung von GUSnegativen Tabakblattscheiben, induziert durch BA3GN-Natriumsalz oder BA, veranschaulicht. Wenn o-Cumaryl-&beta;-D-Glucopyranuronsäure durch die Wirkung von &beta;-Glucuronidase gespalten wird, wird o-Cumarsäure freigesetzt. Wie oben erwähnt (siehe Beispiel 1I), wird o-Cumarsäure spontan in Cumann umgewandelt. Das beinhaltet die Eliminierung einer Säuregruppe (siehe unten) und damit einen Anstieg des pH auf eine Höhe, bei der die Aktivität der nativen &beta;-Glucuronidase der Pflanze vermutlich vermindert ist.
  • Der Versuch wurde durchgeführt unter Verwendung einer BA-Konzentration von 0,5 mg/l und einer Konzentration an BA3GN-Natriumsalz von 10,0 mg/l. Es gab pro Behandlung 12 Scheiben und die Anzahl an Keimen wurde nach 19 Tagen festgestellt. Die Ergebnisse sind unten gezeigt.
  • TABELLE 14
  • Wirkung von o-Cumaryl-&beta;-D-glucopyranuronsäure (CouGN) auf die durch BA oder BA3GN-Natriumsalz induzierte Keimbildung
  • * Natriumsalz
  • Die obige Tabelle zeigt, daß die Gegenwart von o-Cumaryl-&beta;-D-glucopyranuronsäure im Wachstumsmedium Keimneubildung hemmt, die durch BA3GN- Natriumsalz, nicht aber von BA induziert wird. Die besten Ergebnisse wurden in diesem Versuch unter Verwendung einer o-Cumaryl-&beta;-D-glucopyranuronsäurekonzentration von ungefähr 3-4 mM erhalten. Verschiedene Mechanismen könnten in die Verminderung der Keimneubildung, die durch BA3GN induziert wird, einbezogen sein, einschließlich der folgenden: 1) ein erhöhter pH wegen der Freisetzung von o-Cumarsäure, wie oben erklärt, 2) Substratkonkurrenz zwischen CouGN und BA3GN, die zu einer geringeren Hydrolyserate von BA3GN führt, und 3) ein verminderter Transport von BA3GN in die Zellen. Während die genauen Mechanismen, die in die beobachtete Verminderung der Keimbildung in Gegenwart von CouGN einbezogen sind, nicht bestimmt wurden, glaubt man, daß ein erhöhter pH wahrscheinlich zumindest teilweise verantwortlich war. In jedem Fall weist dieses Experiment darauf hin, daß die Selektivität des positiven Selektionssystems durch Verwendung des eingeführten &beta;-Glucuronidasegens verbessert werden kann, um einen selbstregulierenden Mechanismus aufzubauen, der die Wirkung jedes Hintergrundenzyms bedeutend vermindern kann.
    • BEISPIEL 13 HERSTELLUNG GENETISCH TRANSFORMIERTER PFLANZEN
  • Das folgende gibt eine allgemeine Methode an, die für die Herstellung genetisch transformierter Pflanzen angewendet werden kann.
    • Pflanzenmaterial
  • Blätter (Nicotiana tabacum 'Wisconsin 38') werden von Pflanzen erhalten, die in vitro oder in vivo gezogen wurden. Im letzteren Fall werden die Blätter vor der Transformation sterilisiert. Die Sterilisation kann durchgeführt werden, indem man die Blätter 20 min lang in eine Lösung aus 5%igem Calciumhypochlorit, das 0,1 ml Tween 80 pro I enthält, legt, gefolgt von 5maligem Waschen in sterilem Wasser. In vitro-Pflanzen werden in Gefäßen auf 1/2 MSO gezogen. (1/2 MSO ist dasselbe Substrat wie MSO in einer 50% Konzentration mit Ausnahme von Agar, Zucker und Vitaminen.)
  • Die Blätter werden einzeln in eine 14 cm Petrischale gelegt. Sie werden dann gestanzt oder in Stücke von ungefähr 1 cm² ohne eine Hauptblattrippe geschnitten, wobei die Kanten der Stücke aus Gewebe bestehen, das geschnitten wurde.
  • Jegliches geschnittenes Gewebe, das durch die Hypochloritsterilisation gebleicht wurde, wird entfernt.
    • Kultivierung von Bakterien
  • Einen Tag vor der Transformation wird eine Bakterienkultur gestartet, indem man 2-3 ml Bakterien zu 200 ml LB-Medium in einem Erlenmeyerkolben gibt. Die Bakterien werden bei 28ºC unter Bewegung (300 rpm) gezüchtet.
    • Transformation
  • Die Bakterienkultur wird mit 1/2 MSO 50x oder auf OD 0,1 (bei 660 nm) unmittelbar vor der Transformation verdünnt. Ungefähr 10 ml der verdünnten Bakteriensuspension wird in eine 9 cm Petrischale geschüttet, und die Blattstücke werden 15 min lang in diese Suspension getaucht. Die Blattstücke werden dann entfernt, und überschüssige Bakteriensuspension wird mit sterilem Filterpapier entfernt.
    • Cokultivierung
  • Am Tag vor der Transformation wird ein Stück steriles Filterpapier auf Cokultivierungsschalen (die typischerweise MSO-Substrat enthalten) gelegt, und die in die Bakteriensuspension getauchten Blattstücke werden mit der Oberseite nach unten auf das Filterpapier gelegt. Die Blattstücke werden in einer Wachstumskammer mit einem Zyklus von 12 Stunden Licht und 12 Stunden Dunkelheit 2 Tage lang inkubiert.
    • Selektion/Neubildung
  • Die Blattstücke werden in Petrischalen übertragen, die Cytokininglucuronide wie angegeben und entweder 350 mg/l Carbenicillin + 350 mg/l Cefotoxim oder nur 800 mg/l Carbenicillin, in bestimmten Fällen in Kombination mit Kanamycinsulfat, enthalten. Die Blattstücke werden nach 3 Wochen auf das gleiche Medium subkultiviert, aber ohne Cytokininglucuronide.
    • Assay
  • Neugebildete Keime werden in Gefäße mit 1/2 MSO übertragen. Nach ungefähr 2 Wochen wird der X-gluc-Assay an den grünen Keimen durchgeführt. Die Keime werden nach Bedarf subkultiviert.
    • Auspflanzen
  • Genetisch transformierte Keime, die Wurzeln gebildet haben (und die GUS-positiv sind werden in einer Wachstumskammer ausgepflanzt. Die Keime werden in ein geeignetes Wachstumsmedium gepflanzt, z. B. Sphagnum. Sie werden dann mit Plastiktüten bedeckt und etwa 1 Woche lang wachsen gelassen, danach werden die zwei Ecken der Plastiktüten abgeschnitten. Nach einer weiteren Woche werden die Plastiktüten entfernt.
    • BEISPIEL 14 INDUKTION VON KEIMBILDUNG VON PFLANZENGEWEBE MIT UND OHNE EIN EINGEFÜHRTES &beta;-GLUCURONIDASEGEN UNTER VERWENDUNG VON STEROLEN UND EINES DI-&beta;-D-GLUCURONIDS
  • Tests ähnlich den in den Beispielen 5 und 6 beschriebenen wurden an GUSpositiven und GUS-negativen Tabakblattscheiben durchgeführt unter Verwendung von Substraten, die 100 mg/l &beta;-Sitosterol, 100 mg/l, Cholesterol, 10 mg/l, Campesterol, 1,88 mg/l BA3GN-Natriumsalz und verschiedene Konzentrationen der Di-&beta;-Dglucuronidglycyrrhizinsäure in der Form eines Diammoniumsalzes enthielten. Zusätzlich enthielt die Hälfte der Substrate 0,1 mM Tridemorph. Die Anzahl an Keimen wurde nach 17 Tagen festgestellt.
  • Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle gezeigt. TABELLE 15 Neugebildete Keime pro Blattscheibe
  • * Diammoniumsalz
  • Man kann sehen, daß die Kombination von Sterolen und des Diammoniumsalzes von Glycyrrhizinsäure zu selektiver Keimbildung in Blattscheiben führt, die ein eingeführtes &beta;-Glucuronidasegen enthalten. (Wie oben erwähnt (siehe Beispiel 5) hemmt Tridemorph die Synthese von Sterolen und hat so eine hemmende Wirkung auf Keimneubildung, wenn das Pflanzengewebe nicht mit Sterolen versorgt wird.) Während die selektive Keimauslösungswirkung zu sehen ist, wenn man Substrate mit und ohne Tridemorph verwendet, wird die größte Anzahl an Keimen in den Substraten erhalten, die Tridemorph enthalten, und insbesondere mit einer Glycyrrhizinsäurediammoniumsalzkonzentration von 0,125 mM.
    • BEISPIEL 15 SELEKTIVE INHIBITION VON BA3GN-INDUZIERTER KEIMBILDUNG VON WILDTYP-(GUS-)TABAKBLATTSCHEIBEN
  • Es wurden Versuche durchgeführt wie in Beispiel 3 beschrieben unter Verwendung der Tabakvarietät 'Burley' anstelle von 'Wisconsin 38'. Methyl-&beta;-D-glucuronid (MG), welches durch GUS zu Methanol und Glucuronsäure hydrolysiert wird, wurde dem Substrat in verschiedenen Konzentrationen zugegeben, zusammen mit entweder 1 mg/l, BA oder 15 mg/l BA3GN-Natriumsalz. Es hat sich gezeigt, daß Methanol das native GUS-Enzym hemmt, ohne das eingeführte E. coli-Enzym sehr stark zu beeinträchtigen (Kosugi et al., 1990, Plant Sci., 133-120), während Glucuronsäure, die aus Methyl-&beta;-D-glucuronid freigesetzt wird, ein Produktinhibitor von GUS- Enzymen ist. Durch Zugabe von MG anstelle der unabhängigen Zugabe der beiden Verbindungen werden die Hydrolyseprodukte lokal hergestellt und in dem Kompartiment, wo das Enzym lokalisiert ist, konzentriert. Die erhaltenen Ergebnisse sind unten in Tabelle 16 gezeigt. TABELLE 16
  • BA 1 mg/l,
  • BA3GN 15 mg/l,
  • Die obigen Ergebnisse zeigen, daß die Zugabe von entweder MG oder Glucuronsäure zu einer Verminderung der Anzahl an Keimen, die auf dem BA3GN-Substrat erhalten wurden, führt, verglichen mit der Anzahl an Keimen, die auf dem BA- Substrat erhalten wurden. Durch Behandlung von Gewebe mit MG vor der Expression des eingeführten GUS-Enzyms kann es deshalb möglich sein, die Aktivität oder die Wirkung des nativen GUS-Enzyms während des Selektionsverfahrens selektiv zu eliminieren oder zu vermindern. Unterschiede zwischen den eingeführten und nativen GUS-Enzymen hinsichtlich Inhibition aufgrund von Substratkonkurrenz, Empfindlichkeit auf Substratinhibition, Menge an Enzym (Aktivität) und Empfindlichkeit auf Produktinhibition können auch die Wirkungen von MG und anderen Komponenten, die einen ähnliche Wirkung auf Wildtyp-Gewebe, die mit Glucuroniden behandelt wurden, haben, erklären.
  • Es ist auch möglich, daß MG dadurch wirkt, daß es mit der Aufnahme anderer Glucuronide wie BA3GN konkurriert. Wenn das der Fall ist, könnte MG verwendet werden, um Aufnahme anderer Glucuronide in Wildtyp-Zellen zu vermindern oder zu eliminieren. Einführung eines Gens, das ein GUS-Enzym codiert, das abgesondert wird, oder eines Gens, das eine Glucuronidpermease codiert, könnte verwendet werden, um transgene Zellen zu selektieren, wenn die Aufnahme durch beispielsweise Zugabe von MG zum Substrat gehemmt wird. Im Falle von Glucuronidpermease würden nur transgene Zellen das Glucuronid (z. B. BA3GN) aufnehmen, und wegen des allgemeinen Vorkommens des nativen Enzyms in Pflanzen (siehe z. B. Beispiel 3) würde die Verbindung innerhalb der Zellen aktiviert werden und die Permease (oder ein anderes Protein, das die Aufnahme von Glucuroniden erleichtert) exprimieren.
  • Es ist auch interessant, daß Glucuronsäure selbst selektiv die Wirkung von BA3GN hemmen kann, vermutlich indem es die Wirkung von BA, das durch Spaltung von BA3GN durch GUS freigesetzt wurde, blockiert.
    • BEISPIEL 16 VERWENDUNG POSITIVER SELEKTION UND EINER KOMBINATION VON POSITIVER UND NEGATIVER SELEKTION ZUR VERBESSERUNG DER WIRKSAMKEIT DER SELEKTION VON TRANSGENEN ZELLEN, GEWEBE ODER KEIMEN VON WIDERSPENSTIGEN ARTEN
  • Zuckerrübe ist eine sehr widerspenstige Art hinsichtlich der Produktion transgener Pflanzen. Viele untransformierte Keime werden "selektiert" unter Bedingungen, die in gewöhnlichen Transformationssystemen transgene Keime verursachen. Es wurde gefunden, daß das auch der Fall ist, wenn positive Selektionsversuche (ohne Zugabe von Kanamycin) unter Verwendung von 5-15 mg/l BA3GN-Natriumsalz unter den im folgenden beschriebenen Bedingungen durchgeführt wurden.
  • In Beispiel 1I (siehe Tabelle 12) wurde gefunden, daß die Kombination von positiver und negativer Selektion die Anzahl selektierter" nichttransformierter Keime vermindert. Deshalb wurde die Kombination von positiver und negativer Selektion an Zuckerrüben getestet, und es wurde gefunden, daß dies vorteilhafte Ergebnisse ergibt.
  • Transformation wurde durchgeführt unter Verwendung von Kotyledone-Explantaten wie unten beschrieben.
  • Samen wurden 4 Tage lang in Dunkelheit auf einem Substrat, das 0,7 g/l, Agarose und 2 g/l, Saccharose enthielt, gekeimt. Die Sämlinge wurden dann in einen Nung- Behälter übertragen, der 1/2 · MSO Substrat enthielt, und für drei Tage im Licht kultiviert. Die Kotyledonen wurden von den Sämlingen entfernt, und die Kotyledone- Explantate am Petiolus mit einer kleinen Bürste, die eine Agrobacterium-Suspension enthielt, gebürstet, wobei das Aarobacterium 35S-NPTII und 35S-GUS (OD 660 = 0,1) enthielt. Die Kotyledonen wurden dann 4 Tage lang auf einem Substrat, das 1/10 MSO-Substrat und 200 uM Acetosyringon enthielt, cokultiviert. Die transformierten Explantate wurden auf ein MSO-Substrat übertragen, das mit 0,25 mg/l BA oder 15 mg/l BA3GN-Natriumsalz (anstelle von BAP), 0,025 mg/l Naphthylessigsäure, 400 mg/l Kanamycin, 800 mg/l Carbenicillin und 25 mg/l Vancomycin ausgestattet war, und die Explantate wurden 21 Tage lang auf diesem Substrat inkubiert. Die neugebildeten Keime wurden in Gefäße übertragen, die dasselbe Substrat enthielten. Nach 52 Tagen auf diesem Substrat wurden alle Keime auf MSO- Substrat übertragen, das mit 800 mg/l Carbenicillin, 25 mg/l Vancomycin und 0,1 mg/l BA ausgestattet war. Nach 14 Tagen wurden GUS-Assays wie in Beispiel 3 beschrieben auf dem selektierten Pflanzenmaterial durchgeführt.
  • Die Ergebnisse sind in der Tabelle unten gezeigt TABELLE 17 Transformation von Zuckerrüben Kombination von positiver und negativer Selektion
  • Negative Selektion: 400 mg/l Kanamycinsulfat + 1 mg/l, BAP
  • Positive und Negative Selektion: 400 mg/l, Kanamycinsulfat + 15 mg/l BA3GN
  • Man kann sehen, daß mit der Kombination von positiver und negativer Selektion transgene Keime unter Bedingungen produziert werden, in denen unter Verwendung des herkömmlichen negativen Selektionssystems keine transgenen Keime produziert werden. Das zeigt, daß bei Zuckerrüben die Verwendung des positiven Selektionssystems sehr vorteilhaft ist, verglichen mit der Verwendung des reinen negativen Selektionssystems.
  • Das wiederum zeigt an, daß es die Anwendung der positiven Selektion (allein in Kombination mit negativer Selektion) möglich machen kann, transgene Pflanzen in anderen widerspenstigen Arten zu produzieren, in denen nur niedrige Transformations/Selektionssraten erreicht werden, oder in denen unter Verwendung negativer Selektionssysteme überhaupt keine transgenen Pflanzen selektiert werden können.
    • BEISPIEL 17 POSITIVE SELEKTIONSSYSTEME AUF DER BASIS DER VERWENDUNG INAKTIVER N-QUELLEN, ERHÄLTLICH DURCH DIE EINFÜHRUNG METABOLISIERENDER GENE
  • Es wurden Versuche wie in Beispiel 3 beschrieben durchgeführt, aber der normale Stickstoffgehalt des MSO-Substrates wurde auf 0 erniedrigt. Stattdessen wurden die in Tabelle 18 angegebenen Stickstoffverbindungen zugegeben. Das Substrat enthielt 1 mg/l BA. Substrate, die Ammoniumnitrat enthielten, wurden als positive Kontrollen verwendet.
  • Dies Versuche wurden durchgeführt, um zu untersuchen, ob Opine inaktiv sind, oder ob sie durch Pflanzenzellen als Stickstoffquellen in Substraten, die keine andere Stickstoffquelle enthalten, genutzt werden können. Weil Gene, die Enzyme codieren, die Opine metabolisieren, wohlbekannt sind, ist die Hauptvoraussetzung für die Verwendung von Opinen in einem positiven Selektionssystem die Identifizierung von Opinen, die nicht als Stickstoffquelle verwendet werden können für Pflanzengewebe und Zellen, die keine eingeführten Gene enthalten, die die Pflanzenzellen befähigen, die fraglichen Opine zu nutzen. Die Ergebnisse sind unten angegeben. TABELLE 18 Die Wirkung von Opinen auf Keimbildung von Tabakblattscheiben auf Substraten ohne Stickstoff (Zahl der Keime pro 9 Blattscheiben)
  • In getesteten Substraten, die keinen Stickstoff enthielten, wurden ein paar Keime gebildet. Das kann möglich gewesen sein, weil Stickstoff aus dem Gewebe in dem Explantat mobilisiert werden kann. Um jegliche Keimbildung in den Behandlungen ohne jeden Stickstoff zu vermeiden, können die Explantate an Stickstoff ausgehungert werden; indem man die Vorläuferkulturen vor der Verwendung auf stickstofffreien Substraten züchtet oder indem man die Explantate auf einem stickstofffreien Substrat, beispielsweise ohne keimauslösende Hormone, vorbehandelt.
  • Es wurde überraschenderweise gefunden, daß Octopin und Nopalin Keimbildung nicht unterstützen können, während Mannopin als gute Stickstoffquelle wirken und Keimbildung aus den Blattscheiben unterstützen kann.
  • Es ist wahrscheinlich, daß der Grund, warum Nopalin und Octopin nicht als Stickstoffquellen wirken können, der ist, daß diese Verbindungen nicht aufgenommen, metabolisiert oder hydrolisiert werden zu nutzbaren Verbindungen. Es ist wohl bekannt, daß Organismen, die Gene enthalten, die in den Transport und Metabolismus von Opinen einbezogen sind, beispielsweise Agrobacterium, Opine als Stickstoffquelle nutzen können, während Agrobacterium oder andere Bakterienstämme, die keine Gene enthalten, die Opinmetabolismus codieren, auf Substraten, die nur Opine als Stickstoffquelle enthalten, nicht wachsen können.
  • Basierend auf diesen Ergebnissen können positive Selektionssysteme durch Einführung von einem oder mehreren Opinmetabolismus- oder -transportgenen in transgene Pflanzenzellen unter Verwendung von Selektionssubstraten, die keine oder nur in geringem Maße Stickstoffquellen enthalten, die von beispielsweise Nopalin oder Octopin verschieden sind, aufgebaut werden. Die Identifizierung und Isolierung von Genen oder genetischem Material, das dem Empfänger die Fähigkeit verleiht, Octopin und Nopalin zu nutzen, wurde in der Literatur beschrieben: siehe z. B. C. Beaulieu et al., 1988, Can. J. Microbiol., 38: 84349; P. M. Klapwijk et al., 1976, J. Gen. Microbiol., 96: 155-163; C. L. Schardl und C. I. Kado, 1983, Mol. Gen. Genet., 191: 10-16 oder H. Wabiko et al., 1990, J. Gen. Microbiol. 136: 97-103. Bei Isolierung von genetischem Material, das Opinmetabolismus codiert, können eukaryontische Organismen gemäß den Standardverfahren, die in der Literatur beschrieben sind, mit entsprechenden Sequenzen, die für das Funktionieren der Gene für Opinmetabolismus nötig sind, transformiert werden.
  • Basierend auf den obigen Ergebnissen ist es wahrscheinlich, daß andere Opine und entsprechende katabolisierende Gene in ähnlicher Weise verwendet werden können, und es erscheint weiterhin wahrscheinlich, daß andere inaktive N-Quellen, die durch ähnliche Mittel identifiziert werden, und ihre entsprechenden Gene ähnlich verwendet werden können, z. B. Amide in Kombination mit Amidasen, Peptide in Kombination mit spezifischen Peptidasen, usw.
    • BEISPIEL 18 PRODUKTION VON TRANSGENEM KALLUS AUS WIDERSPENSTIGEN ARTEN UNTER VERWENDUNG VON POSITIVER SELEKTION IN KOMBINATION MIT NEGATIVER SELEKTION
  • Es wurden Versuche durchgeführt wie in Beispiel 1I beschrieben, aber mit gewissen Veränderungen. Die verwendeten Pflanzenarten waren die sehr widerspenstigen Zuchtlinien "V486" von Winterölraps und "S487" von Sommerölraps. Samen wurden sterilisiert und gekeimt wie in Beispiel 16 beschrieben. Hypokotyle wurden als Explantate verwendet und wurden geimpft und cokultiviert wie in Beispiel 1I beschrieben. Nach Cokultivierung wurden die Explantate auf MSO-Substrat, das 0,1 mg/l Naphthylessigsäure, 0,01 mg/l, Gibberellinsäure (GA3), 500 mg/l Carbenicillin, 50 mg/l Kanamycinsulfat und 6,0 mg/l Agarose enthielt, übertragen. Das Substrat enthielt zusätzlich entweder 1 mg/l BA oder 3,75, 7,5, oder 15,0 mg/l BA3GN-Natriumsalz. Der pH wurde auf 5,8 eingestellt. Das verwendete Agrobacterium enthielt in seiner T-DNA ein GUS-Gen und ein Neomycinphosphotransferase-II-Gen, das von 35S-Promotoren gesteuert wurde. GUS-Assays wurden nach 8 Wochen durchgeführt und Kalli, die eine intensive blaue Einfärbung in den meisten Kalluszellen zeigten, wurden als GUS+ aufgezeichnet. TABELLE 19 Herstellung transgener Kalli von Ölraps unter Verwendung von positiver Selektion in Kombination mit negativer Selektion Ölraps, Sommertyp "S487"
  • Diese Versuche zeigen, daß bei diesen sehr widerspenstigen Typen von Ölraps nur positive Selektion in Kombination mit negativer Selektion Selektion transgener Kalli erlaubte, während kein GUS-positiver Kallus mit herkömmlicher negativer Selektion (Substrat mit BA anstelle von BA3GN-Natriumsalz) erhalten wurde.
  • Das zeigt, daß die Einführung der positiven Selektionssysteme, verglichen mit den reinen negativen Selektionssystemen, sehr vorteilhaft ist, auch in Kallussystemen. Es zeigt auch, daß die Verwendung von positiver Selektion (allein oder in Kombination mit negativer Selektion) es möglich machen kann, transgene Pflanzen in anderen widerspenstigen Arten, in denen nur niedrige Transformations/Selektionsraten erhalten werden, oder in denen überhaupt keine transgenen Pflanzen unter Verwendung negativer Selektionssysteme erhalten werden, hergestellt werden können.
  • Nachdem transgener Kallus selektiert wurde, kann er in transgene Keime neugebildet werden, beispielsweise auf einem Substrat, das ein Cytokinin in Kombination mit einer niedrigen Konzentration an Auxinen enthält. Bei diesem Prozeß ist keine Selektion erforderlich.

Claims (7)

1. Ein Verfahren zur Selektion genetisch transformierter Pflanzenzellen aus einer Zellpopulation, welches umfaßt, besagte Population mit einer Verbindung zu versehen, die durch das Expressionsprodukt einer Nukleotidsequenz, die in besagte transformierte Zellen eingeführt wurde, metabolisiert werden kann, um so die transformierten Zellen mit einem physiologischen Vorteil verglichen mit den nichttransformierten Zellen zu versehen, wobei die Verbindung kein Antibiotikum oder Herbizid ist und keine direkt nachteilige Wirkung auf die nichttransformierten Zellen hat.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, in dem die Verbindung ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus den Cytokininen, Auxinen, Gibberellinen, Vitaminen, Kohlenhydraten, Opinen, Proteinen, Sterolen und Saponinen besteht.
3. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2, worin besagte Nukleotidsequenz
(i) &beta;-Glucuronidase, wenn die Verbindung ein Cytokininglucuronid ist;
(ii) Mannose-6-phosphat-Isomerase, wenn die Verbindung Mannose ist;
(iii) UDP-Galaktose-4-Epimerase, wenn die Verbindung Galaktose oder eine galaktoseenthaltende Verbindung ist;
(iv) eine Permease, codiert oder
(v) ein Opinmetabolismus- oder -transportgen ist.
4. Verfahren gemäß jeglichem vorhergehenden Anspruch, worin die transformierten Zellen eine weitere eingeführte Sequenz enthalten.
5. Verfahren gemäß dem vorhergehenden Anspruch, worin die ursprüngliche &beta;- Glucuronidaseaktivität reduziert wird, indem man das Kulturmedium mit einer pHregulierenden Verbindung versieht, die das Kulturmedium, die Zellen oder Kompartimente der Zellen mit einem pH zwischen 5,5 und 8,5 versieht.
6. Verfahren gemäß Anspruch 2, worin das Opin nicht oder nur unzureichend als Stickstoffquelle für nichttransformierte Zellen wirkt und die eingeführte Nukleotid sequenz ein Opinmetabolismus- oder -transportgen enthält, das bei Expression das Opin als eine Stickstoffquelle in transformierten Zellen wirken läßt.
7. Verfahren gemäß Anspruch 1, worin Expression oder Transkription der eingeführten Nukleotidsequenz zu einer Zunahme in der Aktivität eines Enzyms führt, das in der Zellpopulation endogen gefunden wird, so daß die Aktivität des Enzyms in transformierten Zellen größer ist als die Aktivität des Enzyms in nichttransformierten Zellen, oder worin Expression und Transkription der eingeführten Nukleotidsequenz zu einer Blockade des Metabolismus der Verbindung, mit der die Zellpopulation versehen wird, oder zu einer Blockade der Synthese einer Verbindung in den transformierten Zellen führt.
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